Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изыскание и разработка высокоэффективных диагностических препаратов для ускоренной индикации патогенных микроорганизмов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изыскание и разработка высокоэффективных диагностических препаратов для ускоренной индикации патогенных микроорганизмов"

п Ь

V»

-ж .?•

г г ^

За правах рукопига УДК 615.2:579.22 МОРАРУ НИКОЛАЙ НИКОЛАЕВИЧ

ИЗЫСКАНИЕ И РАЗРАБОТКА ВЫС0К03ФЕКТИВНЫХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ УСКОРЕННОЙ ИНДИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

03.00.07 -МИКРОБИОЛОГИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

С.-Петербург - 1999

Мота выполнена в Международном Независимом Университете Республики Молдова.

Научный консультант - Заслуженный деятель науки РМ

доктор медицинских наук профессор НИКИТИН В.М. Официальные оппоненты:

- доктор медицинских наук, профессор НОСКОВ Ф.С.

- доктор медицинских наук ДЬЯКОВ С.Й.

- доктор медицинских наук, профессор АФИНОГЕНОВ Г.Е. Ведущая организация:

ВОЕННО-МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ Защита диссертации состоится * ^ * 3 1999 г. в __/^^часов на заседании диссертационного совета Д 106.05.01 в НИИ военной медицины МО РФ (195043, СПб, улЛесопарковая,).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ военной медицины МО РФ.

Автореферат разослан " % ' О^_ 1999 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук профессор

Р.Б.ГОЛЬДИН

российская

:ударственная

библиотека

Ï43LI-CI

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы и темы диссертации. Эффективность борьбы с инфекционной заболеваемостью во многом зависит от своевременной расшифровки лабораториями этиологического диагноза и принятия соответствующих санитарно-гигиенических и противоэпидемических мероприятии. В спою очередь своевременная и точная постановка микробиологического диагноза напрямую зависит от имеющегося в арсенале лаборатории набора средств для быстрой и эффективной диагностики.

Развитые страны благодаря интенсивному развитию за последние десятилетия методов эксспрес-индикации добились ощутимых результатов и э том направлении. Диагностический арсенал практических лабораторий этих стран постоянно пополняется новыми современными средствами диагностики, что способствует постоянному снижению или сдерживанию роста заболеваемости.

Однако выпускаемые за рубежом диагностические препараты и тест-системы для ускоренной идентификации микроорганизмов остаются по-прежнему недоступными для отечественных лабораторий. Ситуация с инфекционной заболеваемостью в Республике Молдова далека от благополучной. В особенности она усугубилась в последние годы на фоне заметного экономического спада народного хозяйства. Отчасти, это является прямым следствием того, что микробиологическая диагностика большинства инфекционных заболеваний и ГВП в лабораториях среднего и нижнего звена проводится рутинными методами, которые характеризуются трудоемкостью, длительностью и относительной дороговизной.

Исходя из того, что данная ситуация не удовлетворяет современные требования клиницистов, вопросы скорейшего совершенствования методов лабораторной диагностики обретают все большую актуальность.

В ( 'еснублике Молдова и в ряде стран СНГ на протяжении ряда лет ведугся интенсивные научные исследования по разработке новых ускоренных и экономичных методов лабораторной диагностики. Уместно отметить вклад в развитие данной отрасли прикладной микробиологии Адамова А.К., Азаренкжа К.С., Акатова А.К., Блохиной И.Н., Генералова И.И., Георгица Ф.И., Гольдина Р.Б., Дьякова С.И., Каралышка Б.В., К.0(юлюка A.M., Кочеровеца В.И., Меджидова М.М., Никитина В.М., Плугару C.B., Сиволодского Г.Г1., Сичинского Л.А., Соколовой К.Я., Шамардина В.А., Йфаева Р.Х. и др.

Однако, не умаляя достоинств внушительного Числа диагностических препара юн и ме тодов исследования, разработанных указанными и другими

авторами, следует все же сказать, что из-за определенных недостатков далеко не все получили широкое практическое применение.

Таким образом, проблема разработки ускоренных методов индикации патогенных микроорганизмоь, п особенности простых и доступных для лабораторий среднего и нижнего звена остается по-прежнему актуальной и требует своего дальнейшего решения.

Целью настоящей работы явилось изыскание и разработка высокоэффективных и доступных диагностических препаратов, тест-систем и методов для ускоренной и экономичной индикации патогенных микроорганизмов, в частности, стафилококков.

Задачи исследования:

1. Изыскать, изучить и обосновать научные принципы, технологические приемы и параметры конструирования оригинальных диагностических препаратов, обладающих достаточной чувствительностью и специфичностью для ускоренного и экономичного определения основных ферментов патогенности микроорганизмов.

2. Изыскать новый универсальный носитель для ускоренной биохимической и иммунологической индикации микроорганизмов.

3. Разработать новый энзимосуснензнонный принцип определения ферментативной активности микроорганизмов и создать на его основе серию принципиально новых, высокоэффективных диагностических препаратов.

4. Разработать и сконструировать на основе созданных автономных фунгис-реагентов пластинчатые бумажные диагностические тест-системы для ускоренной й экономичной индикации и идентификации S. aureus.

5. Разработать набор энзимодиагностических препаратов в форме пишущих карандашей многократного применения для ускоренной и экономичной индикации основных маркеров патогенных стафилококков и других микроорганизмов.

6. Испытать и внедрить разработанные диагностические препараты и тест-системы, а также методы их применения для ускоренной индикации и идентификации золотис.ых стафилококков в лабораторную практику.

Научная новизна работы. В результате проведенных эксперимен-тально-ггаисксюых исследований получен универсальный носи гель — бисорбент МН и открыт новый энзимосуспензионный принцип определения биохимической активности микроорганизмов, на основе которых разработаны новые высокоэффективные диагностические препараты, тест-системы и методы их применения для ускоренной и экономичной энзимоиндикации микроорганизмов:

1. Изысканы и определены основные параметры и технология полумения нового униперсалыюго сорбента для определения ферментативной активности микроорганизмов. "Способ получения агента-индикатора для определения ферментативной активности микроорганизмов". (Пол. реш. на выдачу патента № 1430, 1998 г.).

2. Разработан и научно аргументирован новый энзимосуспензионный принцип определения ферментов, основанный на использовании в качестве носшеля и одновременно индикатора энзиматической активности микроор-ганизмои-суспензни частиц МП, полученной из хламидоспор пузырчатой головни кукурузы Ustilago maydis. Данный принцип был положен в основу нового направления ускоренной энзиминдикации микроорганизмов, названного нами "энзимосуспензионным".

Нд основе этого принципа были впервые разработаны следующие диагностические препараты и методы:

— метол определения дезоксирибонуюгеазной активности микроорганизмов, признанный изобретением (ПоА.реш. на выдачу патента № 1276, 1998);

— способ получения реагента для определения дезоксирибонук-леазной активности микроорганизмов, признанный изобретением (Пол.реш. на выдачу патента № 1453, 1998);

— метод определения дезоксирибонуклеазной активности микроорганизмов, признанный изобретением (Пол.реш. на выдачу патента № 1454,1998);

— метод определения плазмокоагулирующей активности стафилококков, признанный изобретением (Пол.реш. на выдачу патента No 1277, 1998);

— способ получения реагента для определений плазмокоагули-руюшей активности микроорганизмов, признанный изобретением (Пол.реш. на выдачу патента № 1455, 1998);

— метод определения леиитиназной активности микроорганизмов, признанный изобретением (Пол.реш. на выдачу патента № 1278, 1998);

— метод определения гиалуронидазной активности микроорганизмов, признанный изобретением (Пол.реш. на выдачу патента № 1451, 1998);

}. i }азработана технология и получены новые высокоэффективные пре-пар.п hi для определения белка Л и фибриноген-аффинитета стафилококков:

— реагент для определения стафилококкового белка А, признанный изобретением (Пол.реш. на выдачу патента № 1319, 1998);

— способ получения реагента для определения белка А стафилококков — подана заявка на изобретение (Депозитный № 980190,1998);

— реагент для определения фибриноген-аффинитета стафилококков, признанный изобретением (Пол.реш. на выдачу патента

№ 1320,1998);

— способ получения реагента для определения фибриноген-аффинитета стафилококков — подана заявка на изобретение (Депозитный № 980189 1998).

— комплексный суспензионныый диагностикум для одновременного определения белка А и фибриноген-аффинитета стафи^юкокков;

— твердофазный микрореагеНт для одновременного определения белка А и фибриноген-аффинитета стафилококков.

4. Изысканы и разработаны научные принципы, технологические приемы и на их основе созданы принципиально новые, оригинальные диагностические препараты в форме пишущих карандашей многократного применения:

— индикаторный карандаш для ускоренного определения фосфатазной активности микроорганизмов, признанный изобретением: "Способ определения фосфатазной активности микроорганизмов" (Ах. СССР № 1726516,1990);

— индикаторный карандаш для определения фибриноген-аффинитета стафилококков, признанный изобретением: "Способ определения хлопьеобразующего фактора стафилококков" (Патент МО

№ 728,1997);

— индикаторный карандаш для комплексного определения фибриноген-аффинитета и фосфатазной активности стафилококков (Удостоверение на рацпредложение № 2511, 1991);

— индикаторный карандаш для определения теллурит-редукта-зы микроорганизмов (Удостоверение на рацпредложение № 2439.1991);

— индикаторный карандаш для определения каталазы микроорганизмов, признанный изобретением: "Препарат для определения каталазы микроорганизмов" (Патент ДШ № 287, 1995).

5. Изучены варианты оптимальной интеграции основных маркеров патогенности стафилококков, которые были реализованы при создании высокоэффективных пластинчатых диагностических тест-систем, позволяющие быстро, экономично и с высокой степенью достоверности проводить индикацию и идентификацию золотистых стафилококков.

Практическое значение работы. Разработаны и предложены для практического Применения принципиально новые автономные высоко-

эффективные диагностические препараты многократного и одноразового использования, а также комплексные тест-системы, которые отличаются высокой эффективностью и доступностью для практических лабораторий всех уровней.

Суспензионные диапюстикумы и твердофазные микрореагенты, разработанные на основе нового принципа определения ферментов микробов с использованием в качестве индикаторного агента биохимической активности сенсибилизированных механических частиц, значительно упрощают, удешевляют и ускоряют процедуру идентификации микроорганизмов. Их отличает также широкая доступность, так как носитель (хлами-досиоры пузырчатой головни кукурузы) весьма распространен и имеет очень низкуют себестоимость.

Разработанные и предложенные энзймодиагностические препараты в виде пишущих карандашей многократного применения являются весьма удобными в работе и позволяют быстро, точно и экономично, без использования питательных сред и других стерильных материалов определить наиболее важные ферменты микроорганизмов.

Сконструированные и предложенные тест-системы для ускоренного скрининга золотистых стафилококков позволяют существенно упростить, удешевить и, главное, значительно ускорить получение результатов анализа. Следовательно, расширяются диагностические возможности лабораторий, что позволяет своевременно и оперативно осуществлять необходимые противоэпидемические и санитарно-гигиенические мероприятия. Это особенно актуально в настоящее время, когда резко обострилась проблема виутрибольничных инфекций, среди возбудителей которых одно из лидирующих мест занимает золотистый стафилококк.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Научно обоснованные технологические приемы получения нового универсального суспензионного бисорбента МИ из хламидоспор пузырчатой головни кукурузы Ustilago maydis.

2. Новый :-шзим<»суспензионный принцип определения ферментативной активности микроорганизмов с использованием п качестве Носителя и одновременно индикатора биохимической активности универсального суспензионного сорбента MI I с учетом результатов реакций по феноменам агрегации или дезагрегации частиц носителя.

3. Разработанный впервые комплекс новых высокоэффективных эн-зимодиагностических препаратов для ускоренного И экономичного определения ДНКазной, плазмокоагулаэной, лециТИнаэной и гиалуронидаэ-ной активности микроорганизмов.

4. Разработанный впервые на основе нового универсального носителя-бисорбента IVj Н комплекс диагностических препаратов для определения белка А и фибриноген-аффинитета стафилококков.

5. Разработанный набор принципиально новых автономных энзимо-диагностических препаратов в виде пишущих карандашей многократного применения для ускоренной индикации ферментов микроорганизмов без использования питательных сред.

6. Разработанные и сконструированные на основе использования Ключевых признаков патогенности золотистых стафилококков, новые оригинальные пластинчатые диагностические тест-системы, позволяющие провести быстрый и экономичный скрининг этих микроорганизмов, играющих в настоящий момент доминирующую роль в гнойно-воспалительной патологии человека.

Апробация работы. Основные результаты исследований были доложены и обсуждены на следующих научных форумах:

— научно-практических конференциях ГУМФ им. Тсстемииану (1992,1993,1994);

— научно-практических конференциях МНУМ (1997, 1998);

— всесоюзная конференция "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии" (Махачкала, 1990, 1992);

— III конференция инфекционистов Республики Молдова (Кишинев, 1991);

— III Съезд Гигиенистов Микробиологов и Эпидемиологов РМ (Кишинев, 1992);

— Съезд медико-биологических обществ Мол>ювы (Кишинев, 1993);

— XVIII Съезд Румынско-Американской Академии Науки и Искусств (Кишинев, 1993);

— III Национальная конференция с международным участием "Микроорганизмы и их метаболиты в национальной экономике" (Кишинев, 1996);

— Национальная конференция с международным участием "Актуальные проблемы железнодорожной медицины" (Кишинев, 1996);

— IV Съезд Гигиенистов, Микробиологов и Эпидемиологов РМ (Кишинев, 1997);

— Национальный симпозиум паразитологов Румынии (Крайова, 19Q8);

— IIнаучно-практическая конференции "Актуальные проблемы акушерского стационара" (Тольятти, 1998);

— Национальный Симпозиум "Вклад научных исследований в прогрессе ветеринарной медицины" (Бухарест, i998);

— специализированная вставка "Know-how Exc hange 1998" (Кишинев, 1998);

- На циональная конференция молодых микробиологов и биотехнологов "Микробиологические достижения и перспективы" (Кишинев, 1998) и на расширенном заседании кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии МНУ'М совместно с микробиологическим отделом НИИ ОЗМиР МЗ РМ.

Разработаннные в результате'исследования методы и диагностические препараты положены в основу законченной научно-исследовательской работы по теме "Разработка методов и средств ускоренного определения патогенности микроорганизмов регенерированных вод", выполненной для Института медико-биологических проблем Мо СССР по Хоздоговору № 27 от 25.12.1988 (1988—1993), в которой соискатель являлся ведущим научным сотрудником. Составлены "Методические рекомендации по применению диагностических тестов для экспресс-индикации патогенных стафилококков, выделенных из лекарственных средств фармацевтической промышленности" (утверждены Уч. Советом Центра Патологии АН РМ, 1992 год) и "Методические указания по проведению анализов с помощью диагностической тест-системы для экспресс-индикации стафилококков в средствах фармацевтической промышленности (утверждены Уч. Советом Центра Патологии АН РМ, 1993 год).

По теме диссертации опубликовано свыше 40 научных работ. Получены 3 авторских свидетельства на изобретения и 10 положительных решений на выдачу патента; 22 удостоверения на рационализаторские предложения и подано 2 заявки на изобретение в AGEPI Республики Молдова.

Результаты исследований используются в микробиологической лаборатории НИИ ОЗМ и РМЗ РМ и в ряде лабораторий ЦРБ.

Теоретические положения и практические рекомендации диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре микробиологии МНУМ, ГУМФ им. Тестемицану и Университета "Ovidius" (Констанца, Румыния).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы и приложения. Список литературы включает 479 источников. Работа изложена на 201 странице машинописного текста, содержит 30 таблиц, 12 рисунков, и 25 фотографий.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

2.1. Изыскание и технология получения нового универсального суспензионного носителя для ускоренной биохимической и иммунологической индикации микроорганизма.

Из обширного спектра носителей, предложенных различными исследователями, в настоящее время лишь эритроциты и частицы латекса получили широкое распространение, несмотря на то, что и им присущи определенные недостатки.

К примеру, эритроциты чувствительны к различным физико-химическим факторам, обладают собственной антигенностыо, которые порой влияет на специфичность реакций, имеют ограниченный срок хранения. Что касается латекса, то его основным недостатком является дорог овизна, связанная с трудоемкостью его получения и стандартизации. Основными требованиями к новым веществам, предлагаемым в качестве суспензионных носителей, является их высокая стабильность при хранении, отсутствие собственной антигенности, простота техники постановки реакций, их высокая демонстративность и экономичность в целом.

Наши долголетние исследования по поиску новых носителей позволяют утверждать, что весьма перспективными в этом плане являются хламидоспоры пузырчатой головни кукурузы, Ustilago mnyrlis, представляющие собой строго шаровидной формы частицы темно-коричневого цвета со средним диаметром 10+2,5 мкм.

Нативные хламидоспоры являются гидрофобными, но после специальной первичной обработки, процедура которой запатентована нами, эти хламидоспоры располагаются в суспензии изолировано друг от друга.

Для приготовления гидрофильной суспензии хламидоспор и колбу помещают 5-10 г пылевидной массы хламидоспор, равномерно распределяют ее на дне колбы и выдерживают при 120"С 45-60 минут с целью биологической инактивации. Затем в колбу добавляют 150-200 мл 0,5% раствора трилона Б, тщательно взбалтывают содержимое и устанавливают колбу на столик магнитной мешалки, перемешивая смесь в течение 1 часа. В результате этого хламидоспоры теряют свою гидрофобность и становятся гидрофильными. В дальнейшем, для освобождения суспензии хламидоспор от балластных веществ ее подвергают фильтрации через ватно-марлевые фильтры.

Затем отфильтрованную суспензию хламидоспор разливают по 10мл в центрифужные пробирки и промывают 2-3 раза физраствором с помощью центрифугирования при 3000 об/мин. Процедура считается эа-

вершенной, когда надосадочная жидкость полностью п|юсветляется. После промывания суспензию переносят и градуированные пробирки, центрифугируют и определяют объем образующегося осадка хламидоспор. Затем добавляют консервант (азид натрия или мертиолат (1:10000)), тщательно перемешивают и хранят в холодильнике при 4°С. По мере необходимости частицы используют в работе.

После танизации хламидоспоры способны адсорбировать на своей поверхности различные биомолекулы: антигены, антитела, фибриноген и др. На основе танизированных хламидоспор нами были получены алти-тельные диагностикумы для экспресс-индикации сальмонелл, эшерихий, диагностикумы для определения белка Л и фибриноген-аффинитета стафилококков.

Важным достоинством данного носителя является то, что частицы хламидоспор имеют более крупные размеры, чем другие носители и более высокую контрастность, в связи с чем иммунологические реакции с его использованием протекают быстрее и демонстративнее.

Другим преимуществом нового носителя является его общедоступность для практических лабораторий, так как пузырчатая головня кукурузы широко распространена в природе, паразитируя в стеблях и початках кукурузы. Из мицелия данного гриба развивается черная пылевидная масса монодисперсных хламидоспор, инкапсулированных в аски разных размеров, напоминающие маленькие мешочки, которых можно собрать с кукурузных полей осенью до уборки урожая.

Другой особенностью хламидоспор кукурузной плесени является чрезвычайно высокая устойчивость их к действию различных физических, химических и механических факторов.

Было установлено, что хламидоспоры стабильны при воздейс твии на них растворов стиральных порошков ("Лотос", "Планета" и др.), растворов каустической и кальцинированной соды, септабика, KOI I, MCI, уксусной кислоты, 96" и 70 ' этилового спирта, формалина, ацетона И др. химических веществ.

Они сохраняют также свою целостность при кипячении в течение 1-2 часов, при замораживании и опаивании, с трудом разрушаются при длительном растирании н фарфуровой ступке.

11ылевидпая масса хламидоспор может храниться в лаборатории неограничено долго (срок наблюдения — 10 лет).

Стабильными являю и:я хламидоспоры и при хранении их в различных жидкостях.

Важной положительной особенностью разработанных нами

диагностичеасих препаратов на основе частиц МЫ является возможность ресенсибклизации в случае снижения или полной потере aimiBi мсш i ipei iapa rn.

Но, главным свойством этих частиц, которое обуславливает их неоспоримое преимущество перед другими носителями, является возможност ь их использования для определения и биохимических свойств микроорганизмов.

В ходе наших экспериментов мы обнаружили высокую активность взаимодействия и селективность поведения хламидоспор в растворах различных высокомолекулярных веществ. В одних случаях они агрегируют, а в других остаются индиферентными.

В целях объяснения этого феномена были проведены аналогичные эксперименты с другими иммуносорбентами: эритроцитами, частицами латекса и нитроцеллюлозы.

Данные о характере поведения различных носителей-сорбентов в растворах ВМС представлены в таблицах № 1-5. Из указанных таблиц видно, что наиболее высокую активность взаимодействия с ВМС проявляют частицы бисорбента МН, что позволяет заключить, что этот феномен характерен в большой степени для них.

Наши теоретические предположения о механизме селективного поведения хламидоспор в слабоконцентрированных растворах различных ВМС мы решили использовать и найти этому феномену практическое применение. Толчком для этого послужил другой феномен, обнаруженный нами, а именно специфическая дезагрегация агрегатов хламидоспор при расщеплении ВМС, вызвавших их агрегацию. Другими словами, мы установили факт возможного применения суспензий частиц МН, в качестве механического индикаторного агента-свидетеля расщепления того или иного ВМС соответствующим ферментом. Аналогичные эксперименты, проведенные с другими широко распространенными иммуносорбентами, показали, что они не пригодны для этих целей из-за низкой активности взаимодействия с ВМС и слишком мелких размеров, образующихся агрегатов.

Так зародилась идея использования хламидоспор для определения биохимической активности микроорганизмов и, после серии экспериментов, мы окончательно убедились в реальности этой перспективы. В результате проведенных целенаправленных экспериментов нами был разработан новый принцип или подход определения ферментов микробов, основанный на использовании ь качестве индикаторного агента суспензии хламидоспор кукурузной плесени, Ustilago maydis, трансформированных физико-химической обработкой в частицы МН. В свою очередь этот принцип был положен в основу нового направления энзиминдикации микроорганизмов, названного нами энзимосуспензионным.

Та блииа 1

Поведение различных иммуиосорбентов в растворах ДНК

Иммуносорбент Концентрация раствора ДНК (в %) и наблюдаемый ( )еномен

0,1 0.05 0,025 0,015 0,005 0,0025 0.001 0,0005 0,00025 0.0001

Бисорбент МН ххх ххх xx xx x +++ +++ ++ ++ +

Частицы латекса Эритроциты ++ -Н- + +

Частицы целлюлозы -Н-+ ++ -н- + + + — — — —

1

Иммуносорбент Степень разведения гиалуроновой кислоты и наблюдаемый феномен

1:10 1:20 1:50 1:100 1:200 1:300 1:400 1:500 1:600 1:700

Бисорбент МН xx x x +-Н- +++ ++ ++ + + +

Частицы латекса + +

Эритроциты

Целлюлоза ++ + ■ +

Примечание: ' — — агрегаты полностью отсутствуют

и , и

+ — агрегаты видны под микроскопом

-Н- — агрегаты мелкие, трудноразличимые, видны под лупой

"+++" — агрегаты хорошо видны невооруженным глазом ** »

х — агрегаты крупные "хх" — агрегаты очень крупные "ххх" — полная агрегация частиц

Таблица 2

Поведение иммуиосорбентов в растворах гиалуроновой кислоты

Таблица 3

Поведение иммуносорбснтов в растворах крахмала

Иммуносорбент Концентрация раствора крахмала (в %) и наблюдаемый феномен

5% 3% 2% 1% 0,5% 0,25% 0,1% 0,05% 0,025%

Бисорбент МН xx x x +-н- +++ ++ ++ + +

Частицы латекса +

Эритроциты + +

Целлюлоза

Примечание: "—" — агрегаты полностью отсутствуют

" I w

+ — агрегаты видны под микроскопом

"-Н-" — агрегаты мелкие, трудноразличимые, видны под лупой " } II " — агрегаты хорошо видны невооруженным глазом "х" — агрегаты крупные "хх" — агрегаты очень крупные

Таблица 4

Поведение иммуносорбентов в растворах лепнтовнтеллина

Иммуносорбент Концентрация раствора лепитовителлина (в % ) и наблюдаемый феномен

10% 5% 2,5% 1,25% 0,63% 0,32% 0,16% 0,08%

Бисорбент МН ++ + — — — — — —

Латекс — — — — — — — —

Эритроциты — — — — — — — —

Целлюлоза — — — — — — — —

Примечание: "—" — агрегаты полностью отсутствуют **.п

I -г — агрегаты видны под микроскопом

и . . п «

^ ++ — агрегаты мелкие, трудноразличимые, видны под лупой

I

Таблица 5

Поведение иммуносорбентов в растворах ПВП

Иммуносорбент Концентрация ПВП (в %) и наблюдаемый феномен

2% 1% .0.5% 0.25% 0.1% 0.05% 0.025% 0.01%

Бисорбент МН ++ ++ — — — — — —

Латекс — — — — — — — —

Эритроциты — — — — — — — —

Целлюлоза + + — — — — — —

На основе этого принципа были разработаны оригинальные методы и препараты для ускоренного определения ДНКазы, гиалуронидпэы, плазмокоагулазы и лецитиназы, не имеющие аналогов в мире.

Таким образом, изыскан новый универсальный суспензионный сорбент (носитель) для экспресс-индикации микроорганизмов как по биохимическим, так и по антигенным свойствам.

В заключение следует отметить, что исходя именно из этих особенностей нового универсального сорбента, мы обозначили его термином

— "бисорбент МН", т.е. сорбент с двойным назначением: биохимическим и иммунологическим (МН — начальные буквы фамилии авторов Мораруи Никитин).

Иммунологические реакции с участием сенсибилизированных частиц бисорбента МН получили общее название — - реакции фунгис-агглютинации (РФА). Феномен слипания частиц в биохимических реакциях с образованием видимых темно-коричневых агрегатов назван нами как реакция фунгис-агрегация (РФАгр), а обратный этому феномен, т.е. распад агрегатов хламидоспор на отдельные частицы в результате энзи-матической активности микроорганизмов — как реакция фунгис-дезаг-регации (РФДагр.).

2.2. Разработка комплекса новых высокоэффективных диагностических препаратов для ускоренного и экономичного определения ДНКазной, плазмокоагулазнон, лецнтиназной и гиалуронидазной активности микроорганизмов

На базе нового носителя (бисорбента МН) были впервые разработаны следующие диагностические препараты:

А. Комплекс суспензионных (жидких) фунгис-диагностикумов:

1. Суспензионный диагностикум для ускоренного определения ДНКазной активности микроорганизмов, названный — ФДУ— "ДНКаза".

2. Суспензионный диагностикум для экспресс-индикации ДНКазы микроорганизмов, названный — ФДЭ—"ДНКаза".

3. Суспензионный диагностикум для ускоренного определения гиалуронидазной активности микроорганизмов, названный — ФД—"Риал".

4. Суспензионный диагностикум для ускоренного и экономичного определения связанной и свободной коагулазы стафилококков, названный

— ФД-" Коаг".

5. Суспензионный фунгис-желточный диагностикум для уско|млш< >т (наделения лецишназной активности микроорпи шзмов, назвш шый — ФД-"Лец".

Как указывалось выше, во всех этих диапюстикумах в качестве индикаторного агента используются частицы бисорбента ММ, однако принцип их действия разный. К примеру, принцип действия фунгис-диапюстнкумоп для определения ДI (Казной и гиалуронидазнои активности базируется на способности низкоконцентрированных растворов ДНК и гиалуроновой кислоты агрегировать частицы бисорбента МН с образованием хорошо видимых агрегатов, которые распадаются при расщеплении ДНК или гиалуроновой кислоты микробными культурами, обладающими ДНКазной или соответственно, гиалуронидазной активностью, т. е. учет результатов опыта ведется по ([kjhomci ty распада агрегатов частиц (фунгас-дезагрегапця).

Принцип действия фунгис - желточного диагностикума основан на способности ■ men in 61 icop6ei гга обвалаю ии'П)Ся лен! пч>., i (еллином, содержащимся в растворе яичного желтка и агрегироваться в последующем в присутствии ионов кальция, под влиянием коагулирующих метаболитов, образующихся в результате расщепления лецитовителлина микробной культурой, т.е. учет ведется ш>(})еномену агрегации частиц (фуигис-агрегация).

И, наконец, принцип действия суспензионного фунгис-диагностикума для угко{и_'(шого и экономичного определения связанной и свободной коагу-лазы основывается на способности частиц бисорбента МН сенсибилизироваться белками плазмы, п частности, фибриногеном, по отношению к которому стафилококки имеют аффинитет. Этот факт обуславливает немедленное агрегирование частиц при контакте с золотистыми стафилококками, 'гш свидетельствует о наличии у них clumping фактора (связанной коа-i-улазы). В последующем образовавшиеся темно-коричневые агрегаты служат в качестве индикаторного агента плазмокоагулирующей активности стафилококков, так как первоначально эти агрегаты подвижны, т.е. свободно плавают в капле, а чуть позже (в процессе инкубации при 37°С) они иммобилизируются, т.е. теряют полностью свою подвижность, вследствии повышения вязкости жидкости или желатинизации капли под воздействием илазмокоагулазы. В данном случае учет реакции проводится по феномену аг| 1РП1ШШ и иммобилизации частиц (фунпю-иммобилизация).

Описанные феномены (агрегации, дезагрегации и иммобилизации) являются очень демонстративными, т.к. между положительными и отрицательными результатами есть четкая грань, что позволяет заключить, что частицы бисорбента МН являются превосходными индикаторными агентами биохимической активности микроорганизмов.

Также следует отметит!», что все перечисленные выше препараты являются высокоэффективными и имеют целый ряд преимуществ перед традиционными методами и существующими аналогами.

В частности, они позволяют значительно ускорить время получения результатов, существенно упростить технику постановки опытов и, тем самым, удешевить исследование, так как отпадает необходимое! !) в питательных средах и стерильной лабораторной посуде.

Однако, несмотря на преимущества этих препаратов перед своими аналогами, всем им присущ один общий недостаток, каким является ограниченный срок годности и необходимые холодильные условия для храпения.

Поэтому в целях устранения указанного недостатка нами был разработан следующий комплекс твердофазных препаратов.

Б. Комплекс твердофазных фунгис-реагентов для ускоренной энзимоиндикации микроорганизмов

Твердофазные фунгис-реагенты имеют вид микропленки в форме бляшки,'фиксированной к поверхности гидро^юбной бумага, которая легко и быстро растворяется при добавлении микробной суспензии.

Созданию указанного комплекса препаратов предшествовали поисково-экспериментальные исследования с целью научного обоснования технологического принципа их получения и практической реализации.

На первом этапе была проведена селекция материалов и реактивов, пригодных для использования в качестве стабилизаторов, консервантов, связующих и фиксирующих компонентов. Из широкого спектра веществ мы остановили свой выбор на сахарозе, которую вводят в препараты в качестве стабилизатора и связывающего компонента, и Г11311 — в качестве консерванта и фиксатора реагентов.

На втором этапе для каждого препарата в отдельности определяли оптимальные количественные соотношения ингредиентов, входящих в его состав, при которых он имеет наилучшие характеристики.

Таким образом, твердофазные фунгис-реагенты, входящие в данный комплекс, были получены на основе соответствующих суспензионных фунгис-диагностикумов путем дополнительного введения в них сахарозы и ПВП в оптимальных количественных соотношениях.

На этом, научно обоснованном принципе были разработаны впервые:

1. Твердофазный фунгис-реагент для ускоренного и экономичного определения ДН Казной активности, названный — ФРУ—"ДНКаза".

2. Твердофазный фунгис-реагент для экспресс-индикации Д11Казм названный — ФРЭ—"ДНКаза".

3. Твердофазный фунгис-реагент для ускоренного и экономичного определения связанной и свободной коагулазы, названный — ФР—"Коаг".

4. Твердофазный фунгис-реагент для ускоренного определения ле-цитиназной активности микрорганизмов — ФР—"Лец".

5. Твердофазный фунгис-реагент для ускоренного определения гиа-луронидазной активности микроорганизмов — ФР~"Риал".

Г 1еречислеиные твердофазные фунгис-реагенты удобны в работе, обладают длительным сроком годности и не требуют холодильных условий для хранения.

Сравнительная опенка чувствительности препаратов данного комплекса представлена в таблицах № 6, 7, 8, 9.

Из представленных таблиц видно, что разработанные препараты являются достаточно чувствительными, они практически не уступают по этому параметру традиционным методам (Р>0,05).,

2.3. Разработка комплекса диагностических препаратов для определения белка А и фибриноген-аффинитета стафилококков

Для индикации указанных маркеров патогенности стафилококков в настоящее время используются, в основном, эритроцитарные и латексные диагностикумы.

Данные маркеры определяются в отдельности с монодиагностикумами или одновременное помощью комплексных диагностикумов.

Ввиду того, что доступность этих препаратов для лабораторий нашей республики является проблематичной, нами был разработан комплекс высокоэффективных препаратов для раздельного и одновременного определения этих маркеров, которые отличаются дешевизной и, следовательно, доступностью для практических лабораторий.

В упомянутый комплекс входят следующие препараты:

1. Суспензионный фунгис-диагностикум для определения белка А стафилококка, названный — ФД—"бА". Чувствительность и специфичность данного препарата представлена в таблице № 10.

2. Твердофазный фунгис-реагент для определения белка А стафилококков названный — ФР~"бА'.

3. Суспензионный фунгис-диагностикум для определения фибриноген-аффинитета стафилококков, названный — ФД—"Фген". Чувствительность различных серий диагностикумов представлена в таблице №11.

4. Твердофазный фунгис-реагент для определения фибриноген-аффинитета стафилококков названный — ФР—"Фген".

5. Комплексный суспензионный фунгис-диагностикум для одновременного определения белка А и фибриноген-аффинитета стафилококков — КФД—"бА/Фген".

Таблица 6

Определение чувствительности препаратов для определения ДНКазной активности микроорганизмов

Вид микроорганизма Количество штаммов Количествео положительных реакций Степень вероятностг безошиб. прогноза (Р)

Традицион. метод ФДУ-"ДНКаза" ФР "ДН У- Саза" ФДЭ-"ДНКаза" ФР "ДН Э- •Саза"

абс % абс % абс % абс % абс %

S. aureus S. поп aureus (КОС) 300 135 292 21 97,3 15,6 286 4 95,3 2,9 284 3 94,6 2,2 290 6 96,6 4,4 289 6 96,3 4,4 Р > 0,05

00

1

Таблица 7

Сравнительная оценка чувствительности препаратов для определения связанной и свободной коагулазы золотистых стафилококков

Вид никроорга низма Количество штаммов Количество положительных реакций Степень вероятности безошиб. пропюза(Р)

Градиционные методы ФД—"Коаг" ФР—" Коаг"

связанная свободная связанная :вободная связанная свободная

абс % абс % абс % абс % абс % абс %

3. aureus 300 273 91,0 28( .95.3 273 91,0 284 94,6 270 90,0 284 94,6 Р > 0.05

Сравнительная оценка чувствительности препаратов

для определения лецитиназной активности .микроорганизмов

Вид микроорганизма Кол-во штаммо! Результаты Степень вероятности безошибочного прогноза

Традиционный ФД-"Лец" ФР-"Лец"

абс % абс % абс %

S. aureus S. поп aureus (КОС) 300 135 272 28 90,7 20,7 269 25 89,6 18.5 265 23 88,3 17.0 Р > 0,05 Р > 0.05

Итого 435 300 70,0 294 67,6 288 66,2 Р > 0,05

Таблица 9 Сравнительная оценка чувствительности препаратов для определения гналуронидазной активности микроорганизмов

Вид микроорганизма Кол-во штаммо! Результаты Степень вероятности безошибочного прогноза(Р)

Традиционный ФД-'Тиал" ФР-" "иал"

абс % абс % абс %

S. aureus 5. поп aureus (КОС) 3. pyogenes 300 135 32 230 13 24 76,6 9,6 75,0 227 13 22 75.6 9,6 68.7 224 11 21 74,6 8,1 65,6 Р > 0,05 Р > 0,05 Р > 0,05

^iroro 467 267 57,2 262 56,1 257 55,0 Р > 0,05

Таблица 10

Чувствительность и специфичность суспензионного диагностнкума для определения белка А стафилококка

№ Исследуемая микробная Концентрация микробной взвеси (млн/мл)

п/п культура 64 32 16 8 4 2 1

1. S. aureus "12600" ++++ +++ ++ +

2. S. aureus "Wood-46"

3. S. aureus "209-P" ++++ ++++ +++ + — — —

4. S. aureus "B-243" +-H-+ ++++ ++++ ++ + — —

5. S. aureus "Иванов" ++++ +++ ++ + — — —

6. S. aureus "Королев" ++++ ++++ ++++ ++ + — —

7. S. aureus "Cowan-1" ++++ ++++ ++++ +++ ++ — —

8. S. epidermidis

9. S. saprophyticus

10. E. coli (055)

11. P. aeruginosa

12. S. aureus 53 ++++ ++++ ++++ ++ + — —

13. S. aureus 99 ++++ +++ ++ + — — —

14. S. aureus 202 +++ +++ +++ ++ + — —

15. S. aureus 114 +++ ++

16. S. epidermidis 67

17. S. epidermidis 87

18. S. epidermidis 112

19. S saprophyticus 39

20. S. saprophyticus 42

1 аблииа 11

Сравнительная оценка чувствительности различных препаратов для определения фибриноген-аффинитета стафилококков

\ч Концентрация

микробной 1 500 250 125 63 32 16 8 4 2 1

^sQycпeнзии Диагностический Препарат млрд. млн млн млн млн млн млн млн млн млн млн

1 (ч) И.1 адикаторный карандаш КИ—"Фген" ++++ +++ +

1 Суспензионные

фунгис-диагностикумы. Серия № 1 ФД-"Фген"-1 ++++ +++ + ++ ++

Серия № 2 ФД—"Фген"-2 ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++

Серия № 3 ФД—"Фген"-3 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ 4-++ +++ ++ — —

Примечание: Фген-фибриноген

Серия № 1—нативные (нетанизированные) хламидоспоры, сенсибилизировшшые 1% раствором фибриногена. Серия №2 — танизированные хламидоспоры, сенсибилизированные 1% раствором фибриногена. Серия № 3 — танизированные хламидоспоры, сенсибилизированные механическим способом лиофилизнрованным фибриногеном.

6. Комплексный твердофазный фунгис-реагент для одновременного определения белка А и фибриноген-аффинитета стафилококков — КФР-"бА/Фген".

Преимущества перечисленных выше диагностических препаратов достигнуты за счет двух определяющих моментов. Во-первых, благодаря использованию нового носителя-бисорбента МЫ, который является весьма стабильным и обладает высокими адсорбционными свойствами. Пластинчатая реакция фунгис-агглютинации с его использованием протекает быстро и демонстративно, так как размеры хламидоспор относительно больше, чем у других иммуносорбентон и контрастность их более высокая.

Во -вторых, этому способствовал механический способ сенсибилизации, который мы использовали вместо традиционного в жидкой фазе.

Из этой группы препаратов особенно следует отметить эЭДюктивность комплексных фунгис-диагностикумов в рамках ускоренного скрининга золотистых стафилококков (таб. 12). Данные из таблицы свидетельствуют о том, что самым информативным является ДНКазный тест (97,3%), за которым следует комплексный фунгис-диагностнкум, вернее дуплет тестов фибриноген-аффинитет + белок А (97,0%), далее незначительно отстает плазмокоагулазный тест (95, 3%), чуть больше фибриноген-аффинный тест (93, 6 %) и, наконец, тест па белок А (80,6%).

Приведенные данные позволяют заключить, что комплексный фунгис-диагностикум (КФД—"бА/Фген") позволяет всего за одну минуту Провести ускоренный скрининг золотистых стафилококков с достоверностью до 97 %.

2.4. Разработка набора принципиально новых автономных энзнмодиагностическнх препаратов в форме пишущих карандашей многократного применения для ускоренной индикации ферментов Микроорганизмов без использования питательных сред

Указанные препараты являются принципиально новыми, не имеющими аналогов за рубежом.

Действующим началом эПзиминдикаторных карандашей является соответствующий специфический субстрат. Остальные индиферентные ингредиенты вводятся В карандаш для придания им формы, пишущих свойств и консервации субстрата. Принцип конструирования такого рода препаратов бЫЛ ЙПерЬЫе разработан Нами (В.М. Никитин, Ф.И. Георгица и H.H. Мо-рару) и сводится К растиранию специфического субстрата в фарфоровой ступке

вместе с инертными носителями (ПЭГ, воск), связывающими, стабилизирующими и консервирующими компонентами (БСА, сахароза, глицерин, азид натрия), взятых в оптимальных количественных соотношениях, до образования гомогенной массы вязкой консистенции, которой придают затем форму карандаша и помещают в пластмассовый футляр.

На базе этих технологических принципов нами были разработаны впервые следующие препараты:

1. Индикаторный карандаш для ускоренного определения фосфатазной активности микроорганизмов, названный — КИ —"Фос".

2. Индикаторный карандаш для определения фибриноген-аффинитета стафилококков, названный — КИ—"Фген".

3. Индикаторный карандаш для комплексного определени фибриноген-аффинитета и фосфатазной активности стафилококков названный —

КИК-"ФФ".

4. Индикаторный карандаш для определения теллурит-редуктазы микроорганизмом названный — КИ —"ТР".

5. Индикаторный карандаш для определения каталазы микроорганизмов, названный — КИ—"Кат".

Сравнительное изучение специфичности и чувствительности, перечисленных препаратов на музейных и клинических штаммах микроорганизмов параллельно с традиционными методами, показало, что они практически не уступают по этим параметрам общепринятым методам.

(Таб. 13,14,15, 16, 17).

Основными достоинствами этих препаратов являются: длительный срок годности, удобства в работе, ускорение получения результатов, значительное снижение себестоимости анализов, за счет исключения использования питательных сред и стерильной лабораторной посуды, а также широкая доступность для практических лабораторий, так как для их изготовления не применяются дорогостоящие или дефицитные материалы и реактивы.

Из этой группы препаратов следует выделить комплексный индикаторный карандаш для одновременного определения фибриноген-аффинитета и фосфатазной активности микроорганизмов, достоинством которого является то, что он позволяет за 20-30 минут провести ориентировочную дифференциацию основных видов стафилококков.

2.5. Разработка тест-систем для ускоренной и экономичной индикации и идентификации патогенных стафилококков

Золотистый стафилококк продолжает доминировать как этиологический агент гнойно-воспалительных и гнойно-септических процессов в большинстве стран мира.

Таблица № 12

Сравнительная оценка эффективности КФД—"бА/Фген"в рамках ускоренного скрининга патогенных стафилококков

Количество штаммов S. aureus Количество п о л о ж.и те л ь н ы х результатов

ФД—"Фген" ФД—"бА" КФД—"бА/Фген" Плазмокоаг. ДНКаза

абс % абс % абс %■ абс % абс %

300 281 93,6 242 80,6 291 97,0 286 95,3 292 97,3

Таблица 13

Сравнительная оценка чувствительности КИ—"Фос" и традиционного методов при определении фосфатазной активности стафилококков

Вид микроорганизма Кол-во штаммов Количества положит, результатов Степень вероятности безошибочного прогноза(Р)

Традиционный метод Индикаторный карандаш

абс % абс %

S. aureus S. non aureus (КОС 222 166 222 91 100 54,8 219 90 98.6 54,2 Р > 0,05 Р > 0,05

Итого 388 313 80,6 309 79,6 Р > 0,05

Сравнительная оценка специфичности и чувствительности КИ—"Фген"

Вид микроорганизмов Кол-во штаммов Результаты

Традиционный метод КИ-"Фген"

абс % абс %

S. aureus S. поп aureus (КОС) 222 166 . 212 95.2 212 95,2

I

К Таблица 15

Сравнительная оценка специфичности и чувствительности комплексного индикаторного карандаша КИК-"ФФ" и монотестовых КИ-"Фос" и КИ—"Фген" для определения _ фибриноген-аффиннтета и фосфатазной активности микроорганизмов_

Вид Кол-во Результаты

микроорга- штаммов КИ- Фген" КИ-"Фос" кик- ."фф"

низмов фибриноген фосфатаза

абс . % абс % абс % абс %

Б. аиеш • 100 97 97 99 99 97 97 99 99

Б. ер1<1еггтс11з 50 — — 32 64 — — 32 64

Б. заргорЬуйсш 32

Таблица 16

Сравнительная оценка специфичности и чувствительности

индикаторного карандаша КИ—"TP"

Вид Кол-во Результаты Степень

микроорга- штаммов Традиционный Индикаторный вероятности

низма метод карандаш безошибочного

аос % аос % прогноза ("Р)

S. aureus 222 213 95,6 211 95,0 Р > 0,05

S. non aureus (КОС) 166 27 16,2 23 13,8 Р > 0,05

Итого 388 240 61,8 234 603 Р > 0,05

ю

f Таблица 17

Сравнительное изучение чувствительности КИ—"Кат"

Интервалы наблюдений Количество испытанных каталазо-положительных штаммов микробов Результаты

абс %

1 месяцев 54 54 100

2 месяцев 54 54 100

3 месяцев 54 54 100

6 месяцев 98 98 100

1 год 124 124 100

1.5 года 138 132 95.6

2 года 138 130 94.2

В развитых странах борьба с этими процессами основывается на своевременном выявлении, изоляции и санации источников инфекции. В этих целях разработаны и широко применяются многочисленные тест-системы для ускоренного скрининга золотистых стафилококков. Однако, эти тест-системы недоступны для лабораторий нашей республики, которые продолжают диагносцнровать эту инфекцию рутинными методами, характеризующимися трудоемкостью, длительностью и дороговизной.

Следует признать, что ситуация в нашей республике в отношении данной инфекции в последние годы еще больше усугубилась, что напрямую, на наш взгляд, связано с отменой исследований на стафилококковое носительство.

В связи с этим нами разработаны две принципиально новые пластинчатого типа диагностические тест-системы, имеющие бумажный носитель с гидрофобным покрытием, предназначенные для ускоренного и экономичного скрининга патогенных стафилококков по выявлению основных факторов патогенности.

На основе анализа литературных данных и результатов собственных исследований был научно определен и аргументирован минимальный набор тестов для включения в состав разработанных тест-систем.

Таким образом, набор тестов включенных в первую тест-систему (белок А, фибриноген-аффинитет, коагулаза и ДНКаза) позволяет провести окончательную идентификацию золотистых стафилококков в течение 1 часа со 100% достоверностью, и поэтому она названа RAPID ID S.aureus (таб. 18).

Принадлежность выделенного штамма стафилококка к виду S.aureus устанавливается с помощью предлагаемой схемы (таб. 19), которая включает все возможные варианты "поведения" золотистых стафилококков.

Вторая тест-система является более упрощенной и называется EXPRES IND S.aureus, поскольку набор тестов включенных в ней (белок А, фибрипопен-а<1>фишггети Д1^П^аза) позволяет провести экспресс-индикацию золотистых стафилококков всего за 5 минут с достоверностью до 98,7%.

Следовательно можно констатировать, что разработанные тест-системы не только не уступают зарубежным аналогам по диагностическим возможностям, но и превосходят их по скорости и демонстративности получаемых результатов.

Кроме того, следует подчеркнуть, что помимо высоких диагностических возможностей, предлагаемые тест-системы характеризуются широкой доступностью для лабораторий всех уровней, так как технология их приготовления весьма проста и не требует какой-либо специальной аппаратуры или условий.

Таблииа18

Сравнительная оценка идентификации золотистых стафилококков традиционным методом и с помощью тест-системы RAPID ID S. aureus

Вид Кол-во Количество положительных результатов 1ринадлежност1

микроорга- штаммо1 F/A РАС DNA к виду

низмов абс % абс % абс % S. aureus

S. aureus 300 291 97,0 284 94,6 289 96,3 300

S. non aureus (КОС) 135 — — — — 6 4,4 —

1 иили.1¿и IS

Предлагаемая схема идентификации золотистых стафилококков с помощью тест-системы RAPID ID S. aureus

ю ЧО

№ варианта Наличие факторов патогенности Принадлежность к виду S. aureus

Ле питии аз а F/A РАС DNA

1. + + + + да

2. + + + — да

3. + + — + да

4. + — + + да

5. + + — — да

6. + — + — да

7. + — — + да

8. + — — — нет

9. — + + + да

10. — — + + да

11. — + — + да

12. — — — + нет

13. — — + — }

14. — + — — }

15. — — — — нет

Выводы

1. Изыскан и экспериментально обоснованы научные принципы и технологические приемы получения нового носителя — бисорбента ММ — из широко распространенного и доступного натурального продукта каким являются хламидоспоры пузырчатой головни кукурузы Ustilago maydis.

Главной отличительной особенностью нового носителя от применяемых в настоящее время является его универсальность, т.е. возможность использования его не только в иммунологических, но и в биохимических реакциях в качестве индикаторного агента энзиматической активности, Бисорбент МН характеризуется монодисперсностыо частиц высокой стабильностью и неограниченным сроком годности.

2. Открыт и экспериментально обоснован новый — энзимосуспензионный принцип определения ферментативной активности микроорганизмов с использованием в качестве носителя и одновременно индикатора реакции бисорбента МН, который с помощью феноменов агрегации и дезагрегации частиц позволяет ускоренно определить биохимическую активность бактериальных культур. Бисорбент MI I, содержащий субстрат, под воздействием специфического |юрмента быстро реагирует путем перехода частиц из суспензионного состояния в arpera-тивную форму и наоборот. Разработанные диагностические препараты и методы энзимосуспензионной индикации микроорганизмов отличаются высокой специфичностью, чувствительностью, простотой в применении, экономичностью, так как расходуются минимальные количества реактивов, демонстративностью, обеспечиваемой естественной темно-коричневой окраской частиц и ускоренной регистрацией результатов биохимической активности.

3. На основе нового принципа определения энзиматической активности микроорганизмов с использованием бисорбента MI I впервые были разработаны следующие оригинальные высокоэффективные диагностические препараты для энзимосуспензионной индикации микрорганизмов:

а) фунгис-диагностикум для ускоренного определения ДЫ Казной активности (ФДУ—"ДМКаза") и фунгис-диагностикум для экспресс-индикации ДНКазы микроорганизмов (ФДЭ—"ДНКаза"), которые позволяют обнаружить данный фермент у чистой микробной культуры за 60 и 5 минут. 11ри этом чувствительность препаратов находится на уровне традиционных методов, а себестоимость анализа снижается в сотни раз;

б) фунгис-диагностикум для одновременного определения

:пязанной и свободной коагулазы стафилококков (ФД—"Коаг"), который помимо того, что позволяет одновременно определить указанные {»акторы патогенности, существенно снижает себестоимость анализа по сравнению с традиционным методом (минимум в 10 раз), упрощает технику постановки опыта и сокращает время получения результатов до 2-х часов, уступая в чувствительности традиционному методу лишь 0,7%.

в) фупгис-диагностикумы для определения лецитинаэной (ФД— "Лец") и гиалуронидазной (ФД— "Гнал") активности микроорганизмов, которые позволяют сократить время получения результатов до 1 часа, значительно удешевляют исследования и упрощают технику постановки :н1ыта, при этом практически не уступая в чувствительности традиционным методам определения указанных ферментов (Р > 0,05).

4. Разработаны технологические приемы и получены принципиально новые твердофазные фунгис-реагенты для ускоренного и экономичного определения энзиматической активности микроорганизмов: фунгис-реагент для ускоренного определения ДНКазной активности (ФРУ—"ДНКаза"), фунгис-реагент для экспресс-индикации ДНКазы (ФРЭ—"ДНКаза"), фунгис-реагент для одновременного определения связанной и свободной коагулазы стафилококков (ФР —"Коаг"), фунгис-реагент для определения лецнтиназной (ФР —"Лец") и гиалуронидазной (ФР —"Гиал") активности, которые отличаются от соответствующих жидких фунгис-циагностикумов значительно более длительным сроком годности, [юзможностыо храпения в обычных условиях и удобством в применении.

Разработанные технологические принципы перевода жидких диагносги-кумов в твердофазные реагенты являются адекватными, так как последние не уступая практически в специфичности и чувствительности жидким препаратам, превосходят их существенно подругам параметрам качества.

5. На основе универсальною бисорбента МН с использованием механического способа сенсибилизации носителя разработана группа новых высокоэффективных жидких диагностических препаратов для определения белка Л и фибриноген-аффинитета стафилококков: фунгис-диагностикумы для определения белка А (ФД—"бА"), фибриноген-аффинитета (ФД—"Фген") и комплексный фунгис-диагностикум для одновременного определения белка А и фибриноген-аффинитета (КФД— "бА/Фген"). Экспериментально доказано, что пластинчатая реакция :рунгис-агглютинацин обладает более высокой скоростью и демонстративностью среди аналогичных реакций с использованием других диагностикумов (латексных, эритроцитарных, целлюлозных и др.),

благодаря более крупным размерам частиц бисорбента Ml I, их боле высокой скорости реагирования и контрастности.

6. Сконструирована и получена новая группа высокоэффективнь твердофазных диагностических препаратов для определения белка Л фибриноген-аффинитета: фунгис-реагент для определения белка А (ФР "бА") , фунгис-реагент для определения фибриноген-аффинитета (ФР "Фген') и комплексный фунгис-реагент для одновременного определен! белка А и/или фибриноген-аффинитета (КФР—"бА/Фген"), которъ уступая незначительно в чувствительности аналогичным жидки препаратам, превосходят их по другим параметрам качества, таких кг срок годности, условия хранения, удобства в применении и др. Установлсч высокая эффективность разработанных препаратов, в частност! комплексного фунгис-реагента (КФР—"бА/Фген") в рамках ускоре! ного скрининга патогенных стафилококков, который позволяет выявит последних за 15-30 сек с достоверностью до 97%.

7. Изысканы, экспериментально изучены и определены научнь принципы и технологические приемы конструирования припциниалы новых твердофазных автономных энзимодиагностических препаратов форме пишущих карандашей многократного применений для ускоренно! и экономичного определения энзиматической активное! микроорганизмов. На этой основе впервые были разработан индикаторные карандаши для определения фосфатазной (КИ—"Фос" фибриназной (КИ—"Фген"), теллурит-редуктазной (КИ—"'1 Р") и к; талазной активности (КИ—"Кат"), а также комплексный индикаторнь карандаш для одновременного определения фосфатазной и фибриназнг активности (КИК—"ФФ"). Апробация указанных диагностическ> препаратов на клинических штаммах микроорганизмов показала 100' совпадение результатов, полученных с использованием разработанных традиционных методов. Основными достоинствами индикаторнь Карандашей являются: длительный срок годности, удобства в работ ускорение получения результатов и значительное снижение себестоимос анализов за счет исключения использования питательных сред стерильной лабораторной посуды.

Кроме того, они позволяют на их основе ex tempore готови пластинчатые тест-системы, причем разнообразные в зависимости диагностических нужд лаборатории.

8. На основе твердофазных фунгис-реагентов были изыска! новые диагностические возможности и разработаны оригиналын пластинчатые тест-системы "RAPID ID S. aureus" и "RX PR IIS IN

S. aureus" для ускоренного скрннинга золотистых стафилококков. Результате! клинической апробации показали, что тест-система "RAPID ID S. aureus" включающая тесты: белок А, фибриноген-аффинитет, коагулазу и ДНКазу, позволяет за 1 час провести окончательную идентификацию золотистых стафилококков со 100 % достоверностью вместо 48-72 часов с помощью общепринятых методов исследования на стафилококк. Тест-система "EXPRES IND S. aureus", включающая определение белка А и/или фибриноген-аффинитета и ДНКазу, позволяет всего за 5 мин провести экспресс-индикацию золотистых стафилококков с достоверностью до 98,7%. Кроме высокой скорости и достоверности диагностики, разработанные тест-системы отличаются дешевизной, а следовательно, доступностью для широкой сети практических лаборатоорий.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Рапид-микросистема для индикации каталазной активности микробов/ /Матер, науч. конф. КГМИ, Кишинев, — 1991, — С. 81. (Соавторы Никитин В.М., Георгица Ф.И.).

2. Метод экспресс-индикации хлопьеобразующего фактора золотистых стафилококков//там же. — С. 239. (Соавтор Никитин В.М.).

3. Способ определения теллуритредуктазы микроорганизмов/ /там же.

— С. 240. (Соавтор Ворожбит В.У.).

4. Диагностикум для ускоренного определения фосфатазной активности микроорганизмов //Матер. Всес. конф. "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии". Махачкала, — 1992. — С. 87. (Соавторы Никитин В.М., Олэреску В.Д.).

5. Модифицированный метод определения ХОФ золотистых стафилококков//Матер, науч. конф. КГМН, Кишинев, — 1992,

— С. 391. (Соавторы Георгица Ф.И., Олэреску В.Д.).

6. Ускоренней метод определения фосфатазной активности микроорганизмов //там же. — С. 392. (Соавтор Олэреску В.Д.).

7. Metodá complexá de determinare a fosfatazei fibrinogen-afinitá^ii stafilococilor //Матер. III Съезда Гигиен., Эпидем. и микробиол. РМ, Кишинев, — 1992, — С. 293-294 (Соавтор Никитин В.М.).

8. Microreagent pentru indicaba rapidá a proteinei A stafilococice. (там же

— С. 295-296. (Соавтор Тофан В.Ф.).

9. Indicajia rapidá a fibrinogen-afinitá^ii stafilococilor//Матер, науч. конф. ГУМФ им. Н. Тестемицану, Кишинев, — 1993, — С. 101-102 (соавт. Никитин В.М.).

10. Diagnosticul expres al infec|iilorodontogene stafilococice //Там же. — С. 103. (Соавтор Георгица Ф.И.).

11. Indicaba rapidá a S. aureus//Матер. Съезда медико-биолог. Обществ. РМ. — Кишинев, — 1993, — С. 96. (Соавтор Никитин В.М.).

Í2. £nzimoindica|ia rapidá a microorganismelor //XVIII Съезд Ромыно-Американской Академии Науки и Исскуств. — Кишинев, — 1993,

— С. 53. (Соавторы Никитин В.М., Георгица Ф.И.).

13. ОсНовйЫе направления экспресс-индикации микроорганизмов / / Анналы МНУМ, серия "Медицина". — 1996. — В I. — Стр. 712. (Соавторы Никитин В.М).

14. Determiíiarea rapidá a DNAzei stafilococilor patogeni// В сборнике "Актуальные проблемы железнодорожной медицины". — Кишинев, _ 1996. _ С. 134. (Соавторы Никитин В.М.).

15. Metodá rapidá de determinare a activitá^ii lecitinazice a stafilococilor// Матер. IV Съезда Гигиен., Эпидем. и микробиол. РМ, — Кишинэу. _ 1997. — С. 75-76. (Соавтор Никитин В.М.).

16. Metodá rapidá de determinare a portajului stafilococic//Матер, науч. конф. МНУМ. — Кишинэу. —1997. — С. 45-46. (СоавторТофан В.Ф.).

17. Preparat pentru determinarea rapidá a activilájii telurit-reductazice a microorganismeior// Гам же. — С. 46-47. (Соавтор Олэреску В.Д.).

18. Способ определения фосфатазной активности микроорганизмов// Кишинэу. — 1998. — 7с. — Деп. Молд. НИИТЭИ № 1564-М98. — Библиографический указатель ВИНИТИ "Депонированные научные работы" № 10. — 1998 г.

19. Новый оригинальный препарат для быстрого определения ДНКазной активности стафилококков//Матер. II Научно-практ. конф. "Актуальные проблемы акушерского стационара, Тольятти, — 1998. С. 56-59. (Соавтор Рощин Ю.Н.).

20. Простой способ ускоренного определения лецитиназной активности микроорганизмов //Кишинэу, 1998. — 7с. — Деп. Молд. НИИТЭИ № 1562-М98. — Библиографический указатель ВИНИТИ "Депонированные научные работы № 10,1998 г.

21. Препарат для определения белка А стафилококков//Кишинэу. — 1998. — Юс. — Деп. Молд. НИИТЭИ № 1563-М98. — Библиографический указатель ВИНИТИ "Депонированные научные работы. № 10,1998.

22. Metodá nouá pentru indicarea expresa a fosfatazei microorganismelor// Матер, научн. конф. МНУМ. — Кишинэу. — 1998. — С. 102104.

23. Preparat penlru determinarea fibrinogen-afinitá\ii stafilococilor //Матер, научи, конф. МНУМ. — Кишинэу. — 1998. — С. 111-113.

24. Простой качественный метод ускоренного определения гиалуронидазной активности микроорганизмов//Кишинэу. — 1998. - 6с. - Деп. Молд. НИИТЭИ № 1570-М98. — Бнблиогнрафический указатель ВИНИТИ "Депонированные научные работы", №11,1998 г.

25. Новый универсальный сорбент для экспресс-индикации микроорганизмов //Кишинэу, 1998. — 6с. — Деп. Молд. НИИТЭИ №1569-М98. — Библиографический указатель ВИНИТИ "Депонированные научные работы", №11,1998г.

26. Способ определения дезоксирибонуклеазной активности микроорганизмов //В журн: "Официальный Бюллетень Промышленной

собственности". — Кишинэу. — 1998. — №5. — С. 24 (Соавтор Никитин В.М.).

27.Способ определения плазмоюшулирующей активности стафилококков //В жури, "Официальный Бюллетень Пром. собств. — Кишинэу,

— 1998. — №5. — С. 24-25. (Соавтор Никитин В.М.).

28. Метод определения лецнтиназной активности микроорганизмов//В журнале "Официальный Бюллетень Пром. собств. —Кишинэу. — 1998. — №5. — С. 25. (Соавтор Никитин В.М.).

29. Modalitate nouá de determinare a enzimelor microbiene//Матер. Нац. Симпозиума "Вклад научных исследований в прогрессе ветеринарной медицины", — Бухарест.— 1998. — С. 38. (Соавторы 11икитин

B.М.,Рощин Ю.Н.).

30. Test-sistem pentru identificarea rapidá a S. aureus //Матер. lian. Конфер. с междунар. участием "Микробиология — достижения и перспективы" — Кишинэу. — 1998. — С. 25-26.

31. Principiu nou de determinare a enzimelor microbiene// Гам же. — С. 24-25.

32. Реагент для определения стафилококкового белка Л//В журн. "Официальный Бюллетень Пром. Собств." — Кшшшэу. — 1998.

— №8. — С. 108. (Соавтор Никитин В.М.).

33. Реагент для определения фибриноген-аффинитета стафилококков / /В журн. "Официальный Бюллетень Промышл. Собств. — Кишинэу. — 1998. — № 8. — С. 109. (Соавтор I Ь.кптин В.М.).

34. Sorbent corpuscular universal pentru indicaba expresa a microorganismelor // Матер. XXIV Симпозиума "Современные аспекты в инфекционной патологии домашних животных". 1^луж-11апока. —

1998, — С. 49-50.

35. Метод определения гиалуронидазной активности микроорганизмов //В журн. "Официальный Бюллетень Промыш. Собств. — Кишинэу. — 1998. -— №11. — С. 29. (Соавторы Никитин В.М., РощинЮ.Н.).

36. Preparat nou j>entru determinare fibñnogen-afini!á|ii stafilococilor//В журн. "Вестник перннашлопш". — Кишинэу. — 1998. — №3. — С. 38-41.

37. Мегод определи 0Ш дезокснрибонуклеазной активности мик^хх >рганизмов//

В журН. "Официальный Бюллетень 11|*)мышл. Собств. — Кишинэу. — 1998. — №11. — С. 30. (Соавтор 1 liiKirnni В.М.).

38. О metodá simplá accesibilá de determinare a DNAzei microbiene// "В Жури." Curierül medical". — Кишинэу. — 1998. — №7-8. —

C. 10-13.

39. Prepara! pentru determinarea factoruluide floculare a slafilococilor//Bursa ¡nvenjiilor. Кишинэу. — 1998. — №2. — С. 6-7.

40. Способ получения реагента для определения дезоксирибонуклеазнон активности микроорганизмов//В журн. Официальный Бюллетень Пром. Собстп. — Кишинэу. — 1998. — №11. — С. 30. (Соавтор Никитин В.М.).

41. Preparat complex pentru screeningul rapid al stafilococilor aurii//В журн. "Вестникперинатологии'. —Кишинэу. —1998. — №4. — С. 67-70.

42. Способ получения реагента для определения плазмокоагулнрующей активности микроорганизмов//В журн. "Официальный Бюллетень Пром. Собств." — Кишинэу. — 1998. —№11. —С. 31. (Соавтор Никитин В.М.).

43. О nouá direc|ie de dezvoltare a enzimoindica{iei microorganismelor //В журн. "Inteilectus"—Кишинэу. — 1998. — №4. —С. 66-68.

44. Реакция фунгис-агглютинации и ее применение для индикации патогенных микроорганизмов//Матер, научн. конф. МНУМ. — Кишинэу. — 1998. — С. 127. (Соавтор Никитин В.М.).

45. Ускоренное определение маннит-лецитиназной активности патогенных стафилококков// Гам же. — С. 128. (Соавторы В.М.Никитин, Тофан В.Ф.).

46. Melodá rapidá de determinare a ADNazeimicrobiene//Научн. анналы МНУМ. серия "Медицина". —Т.2. — Кишинэу. — 1999. — С. 34-37.

47. Metodá noua de determinare a proteinei a staillococice //Научн. анналы МНУМ серия "Медиуина". — Т.2. — Кишинэу. —1999. — С. 9-14.

ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ определения фосфатазной активности микроорганизмов/ /А.с. СССР № 1726516. — 1990 г. (соавтор Никитин В.М.).

2. Препарат для индикации каталазы микроорганизмов //Патент MD. — №278. — 1995 г. (Соавторы Никитин В.М., Олэреску В.Д.).

3. Препарат для определения хлопьеобразующего фактора стафилококков

//Патент MD. — №728. — 1997 г. (Соавторы Никитин В.М., Олэреску В.Д.).

4. Метод определения дезоксирибонуклеазной активности микроорганизмов//Патент MD. — №969. — 1998 г. (Соавтор Никитин В.М.).

5. Метод определения плазмокоагулирующей активности стафилококков/

/Патент MD. — № 970. — 1998. (соавтор Никитин В.М.).

6. Метод определения лецитинааной активности микроорганизмов// Патент MD. — № 971. — 1998 г. (соавтор Никитин В.М.).

7. Реагент для определения стафилококкового белка А//Патент MD. — № 1012. — 1998 г. (соавтор Никитин В.М.).

8. Реагент для определения фибриноген-аффинитета стафилококков// Патент MD. — №1013. — 1998 г. (соавтор Никитин В.М.).

9. Способ получения реагент а для определения дезоксирибонуклеазной активности микроорганизмов//Патент MD. — №. 1217. — 1998 г. (соавтор Никитин В.М.).

10. Метод определения дезоксирибонуклеазной активности микроорганизмов //Патент MD. — №. 1218. — 1998 г. (соавтор Никитин В.М.).

11 Способ получения реагента для определения плазмокоагулирующей активности микроорганизмов//Патент MD. — №.1223. — 1998 г. (соавтор Никитин В.М.).

12 Метод определения гиалуронидазной активности микроорганизмов //Патент MD. — №.1232. — 1998 г. (соавторы Никитин В.М., РощинЮ.Н.).

13 Способ получения агента-индикатора для определении (|)ерментатинной акпшности микроорганизмов //Пол. реш. на выдачу патента №1430 от 10.08.1998 г. (соавтор Никитин В.М.).

REZUMAT

Elaborarea preparatelor diagnostice înalt efective pentru indicajia rapidá a microorganismelor patogene

Au fost elaborate experimental arguméntate principiile çtiin^ifice çi trocedeul tehnologic de otyinere a unui purtâtor (sorbent) nou-bisorbent MN — din clilamidosporii táciunelui porumbului Ustilago maydis. Bisorbentul MN ;e caracterizeazâ prin monodispersitate, contrasticitate çi stabilitate Inaltâ a jarticulelor principalul, prin universalitate, adicâ prin posibilitatea utilizara jcestuia nu numai în reac^iile imunologice, dar çi în cele biochimice în calitate de agent indicator al activitäjii enzimatice. Aceasta a permis descoperirea çi fondarea unui principiu direc^ii noi de determinare a activitâjii enzimatice a microorganismelor. în baza noului principiu eu utilizarea bisorbentului MN pentru prima data a fost elaborat un çir întreg de preparate diagnostice înalt efective pentru indicarea enzimosuspenzionalâ a microorganismelor. La ultímele se refera fungis-diagnosticumurile fungis-reagentele pentru indicarea rapidá economä a ADNazei, plasmocoagulazei, lecitinazei çi hialuronidazei.

De asemenea pe baza bisorbentului MN a fost elaborat un set de preparate pentru determinarea proteinei A si fibrinogen-afinitàjii stafilococilor.

Prin integrarea optimalä a criteriilor dominante de patogenitate a stafilococilor au fost elaborate douá teste-sisteme originale RAPID ID S.aureus çi EXPRES IND S.aureus pentru screeningul rapid a stafilococilor aurii, care permit identificarea definitivä a acestora timp de 5-60 minute cu o preeizie de 98,7-100%.

Au fost determinate principiile çtiinjifice çi procedeele tehnologice de ob^inere a unor preparate autonome în forma de creioane pentru uz multiplu, destínate enzimondica^iei rapide a microorganismelor fárá utilizarea mediilor de cultura.

Aprobarea preparatelor elaborate pe tulpini clinice de microorganisme a demonstrat eficacitatea lor înaltà a confirmât oportunitatea utilizârii lor practice pentru enzimoindica|ia rapidá a microorganismelor.

SUMMARY

A research and elaboration of Highly Effective Diagnostic Preparations for the accelerated pathogenic microorganism indication

The scientific principles and techological methods of receiving a new carrier "bisorbent MN" from hlamidospores corn smut (Ustilago maydis) have been found and experimentally proved. Bisorbent MN is characterised by monodispersity and brightness of the particles, high stability and by universality i.e, possibility to use is as an indicative enzimatic activity agent not only in immunologic, but also in biochemical reaction as an enzimatic activity indicative agent. That has permitted to discover and prove experimentally a new enzimsuspensed principle of determining microorganism fermentation activity. According to the abovementioned principle with the usage of bisorbent MN for the first time a whole range of highly effective diagnostic preparation for enzimsuspension indication was elaborated. They include suspension fungious diagnostics, hard phase fungis-reagents for accelerated and economic DNAase, coagulase, lecithinase and hyaluronidase activity of microorganism.

On the basis of bisorbent MN for the first time a group of liquid and hard phase preparations was elaborated as well, to determine protein A and staphylococcic fibrinogen-affinity.

On the basis of the elaborated preparations by purposeful integration the main criteria of the staphylococcic pathogenity original lamellar "Rapid ID S. aureus" and "Expres IND S. aureus" test systems were cieated for the accelerated Staphylococcus aureus screening that make it possible in 5-60 minutes to perform the final identification with 98,7% of exactness.

There were determined new principles and tecnologieal methods of making absolutely new hartlphase autonomous enziindiagnostic preparations in the form of repeatedly used pencils the main merits of which ate long durability convlnience in work, quick results and considerable prime cost decrease of the analysis qiie to avoiding sterile laboratory equipment and feeding medium.

Clinical experiments have shown a high effectiveness of the elaborated pieparntiolis and have proved their necessity for piactical usage in older to acri?ii.'iittn inictrHUgatiisnicir/iniitHliiation.