Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка оптимальных условий глубинно-суспензионного способа культивирования Fusobacterium necrophorum
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Разработка оптимальных условий глубинно-суспензионного способа культивирования Fusobacterium necrophorum"
На правах рукописи
САБИРОВА ВАЛЕНТИНА ВАСИЛЬЕВНА
003058365
о з ¡ж ш
РАЗРАБОТКА ОПТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ ГЛУБИННО -СУСПЕНЗИОННОГО СПОСОБА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РивОВАСТЕШиМ NECROPHORUM
03 00 07 - микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Казань - 2007
003058385
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении
«Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных» (ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» г Казань)
Научный руководитель Заслуженный деятель науки РТ,
доктор ветеринарных наук, профессор Макаев Харис Нуртдинович
Официальные оппоненты
Ведущее учреждение
Доктор биологических наук Гильмутдинов Рустам Якубович
Заслуженный деятель науки РТ и РФ, доктор ветеринарных наук, профессор Госманов Рауис Госманович
Федеральное государственное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ»)
Защита состоится «//э » 2007г часов на заседании
диссертационного совета Д-220 012 01 при ФГУ «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных» (420075, г. Казань, Научный городок - 2)
С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ФГУ «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных» (г Казань)
Автореферат разослан «/У »
Ученый секретарь диссертационного
совета, кандидат ветеринарных наук^, ¿¿^
ст научный сотрудник В И Степанов
1. Общая характеристика работы
Актуальность темы. Некробактериоз крупного рогатого скота широко распространенное инфекционное заболевание, наносящее значительный экономический ущерб животноводству В связи с этим, предотвращение возникновения и распространения некробактериоза среди сельскохозяйственных животных является актуальной проблемой ветеринарной науки и практики
К Б песгорЬогиш наиболее восприимчивы высокопродуктивные животные, первотелки и бычки во второй половине откорма Заболеваемость крупного рогатого скота некробактериозом по РФ отмечается в среднем от 12 до 25 % от общего восприимчивого поголовья скота В отдельных хозяйствах этот показатель достигает до 40 % В неблагополучных по некробактериозу хозяйствах сохранность приплода не превышает 62-75 %, так как телята рождаются с первичным иммунодефицитом, вследствие внутриутробной интоксикации продуктами жизнедеятельности возбудителя некробактериоза (А.А Самоловов и др, 1977, 1998, И Г. Тириков, 1996, Т Е Какоулин, 1997; X Н Макаев, Д А Хузин и др., 2001)
Широкое применение в борьбе с некробактериозом в животноводстве нашли варианты вакцин, для изготовления которых необходимо значительное количество бактериальной массы, для чего широко используют питательные среды, приготовленные на основе отвара мышечной ткани (А А Самоловов, А А. Сидорчук, 1994, Г X Камалов, Д А Хузин, 1996,1997; X Н Макаев и др. 2001) Однако, мясо-сырье является ценным и дефицитным пищевым продуктом
Исследованиями В И Карабак и др (1985), В И Заерко, (1996), В В Меньшенина, (1997) показано, что для получения значительного количества бактериальной массы целесообразно использовать глубинно-суспензионный способ культивирования бактерий в условиях биореактора Однако, к настоящему времени технология крупномасштабного глубинно-суспензионного выращивания Б песгорЬогиш с использованием дешевой питательной среды из непищевого сырья не достаточно изучена. Не определен компонентный состав питательной среды, недостаточно данных о влиянии качества посевного инокулята и углеводного субстрата на рост и размножение Р. песгорЬогиш в условиях глубинно-суспензионного культивирования. Решение этих вопросов остается актуальной проблемой биологической науки и практики
Цель и задачи исследований. Целью наших исследований явился поиск дешевой питательной среды и разработка оптимальных условий крупномасштабного культивирования Р. песгорЬогиш для получения биомассы и экзотоксина при производстве вакцины против некробактериоза
В связи с этим перед нами были поставлены следующие задачи-1 Изготовить питательную среду на основе ферментативного гидролизата непищевого сырья - маточно-плацентарно-эмбриональной массы крупного рогатого скота (ФГМПЭМ) - для культивирования V песгорЬогиш и сравнительно изучить ее эффективность
2 Разработать технологию глубинно-суспензионного способа культивирования Р песгорЬогиш , изучив при этом влияние качества, количества посевного материала и углеводного субстрата на выход бакмассы и экзотоксина
3 Изучить возможное влияние среды на основе ФГМПЭМ на культурально-морфологические и биологические свойства Р. песгорЬогиш при выращивании глубинно-суспензионным способом
4, Изготовить и испытать вакцину против некробактериоза с использованием биомассы и экзотоксина ¥ песгорЬогиш, полученных глубинно-суспензионным способом культивирования данного микроба в среде на основе ФГМПЭМ
Научная новизна. Впервые разработана методика изготовления питательной среды на основе ферментативного гидролизата непищевого сырья -маточно-плацентарно-эмбриональной массы крупного рогатого скота - для выращивания Р песгорЬогиш
Отработан глубинно-суспензионный способ культивирования Б песгорЬогиш в реакторных условиях и изучена при этом роль качества, количества посевного материала и углеводов (глюкозы) на рост и развитие данных бактерий Установлено, что глубинно-суспензионный способ культивирования Р песгорЬогиш в реакторных условиях в среде на основе ФГМПЭМ не изменяет свойства данных бактерий, а вакцина изготовленная из биомассы и экзотоксина, полученных в этих условиях не уступает по иммуногенности вакцине, изготовленной из биомассы и экзотоксина, полученных в бульоне Хоттингера
Практическая значимость работы заключается в том, что разработанная нами питательная среда на основе ФГМПЭМ и отработанный режим крупномасштабного культивирования возбудителя некробактериоза в условиях биореактора значительно удешевляют получение биомассы и экзотоксина Р песгорЬогиш при производстве вакцины против некробактериоза животных
Разработанные «Методические рекомендации по изготовлению питательной среды для культивирования возбудителя некробактериоза» (2005) одобрены Научно-методическим советом, ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» и внедрены в технологию производства полиштаммовой формол-эмульсионной вакцины против некробактериоза животных
Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на ежегодных заседаниях ученого совета ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (1999-2005), Республиканских научно-производственных конференциях (Казань) Международной научной конференции, посвященной 125-летию Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н Э Баумана (Казань, 1998), Юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ «Биотехнология Ветеринария» (Киров, 1998), Всероссийской конференции молодых ученых «Молодые ученые -агропромышленному комплексу» (Казань), Международной научно-практической конференции «Ветеринарная биотехнология - настоящее и будущее (Щелково, 2004), Международного симпозиума, посвященного 45 летию ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (Казань, 2005)
Основные положения, выносимые на защиту:
-эффективность питательной среды, приготовленной на основе ФГМПЭМ, для культивирования Р. песгорЬогиш,
-оптимизация условий глубинно - суспензионного способа
культивирования возбудителя некробакгериоза с использованием питательной среды на основе ФГМПЭМ,
-культурально-морфологические и биологические свойства возбудителя некробактериоза при выращивании глубинно-суспензионным способом в среде на основе ФГМПЭМ,
-иммунологическая эффективность вакцины против некробактериоза рогатого скота, изготовленной из биомассы и экзотоксина, полученных при культивировании F necrophorum в питательной среде на основе ФГМПЭМ глубинно-суспензионным способом.
Публикация. По материалам диссертации опубликованы 11 работ
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 110 стр Состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений Иллюстрирована 15 таблицами Список использованной литературы включает 183 источников, в том числе 39 иностранных.
2. Материалы и методы исследований
Работа проводилась в период с 1999 по 2006 гг. в лаборатории биологического и технологического контроля ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» и хозяйствах Республики Татарстан, неблагополучных по некробактериозу крупного рогатого скота в соответствии с планами НИОКР Центра (№ гос регистрации 01200202602)
В опытах были использованы эпизоотические штаммы Fusobacterium necrophorum «ВУП» - полученные из ВГНКИ (Москва), «КОН», «8» spp necrophorum TS 630501 и «12» TSK 630501, выделенные из патологического материала от животных больных некробактериозом Штаммы «8» и «12» депонированы в ГНЦ ВБ «Вектор» и зарегистрированы под номерами В - 1075 и В - 1076. Штаммы сохраняли в лиофилизированном состоянии, а для текущей работы культуры поддерживали в среде Китг-Тароцци, периодически пересевая через каждые 7-10 дней. При необходимости их освежали пассажем через лабораторных животных
Выращивание F necrophorum осуществляли 2-х литровых колбах и 20 литровых бутылях в условиях термостата и в 36-ти, 100- литровых биореакторах с автоматизированной системой управления глубинно-суспензионным способом культивирования при температуре 37°С.
Эксперименты проведены с использованием 960 беспородных белых мышей живой массой 18-20,0, 86 кроликов живой массой 2-2,5 кг в лабораторных условиях и 250 коров в условиях хозяйств, неблагополучных по некробактериозу крупного рогатого скота Опытные и контрольные группы животных формировали по принципу аналогов, создавая одинаковые условия кормления и содержания, соответствующие зоотехническим нормам Клиническое наблюдение за подопытными животными вели в течение 30-180 дней, в зависимости от цели опыта
б
В исследованиях в качестве основы питательной среды использовали ФГМПЭМ, который готовили путем гидролиза маточно-плацентарно-эмбриональной массы крупного рогатого скота панкреатином (или использовали фарш поджелудочной железы свиньи), взяв за основу «Методические рекомендации по изготовлению гидролизата из мышечной ткани» (М ,1980), внеся свою модификацию
Наша модификация заключается в том, что мы изменили соотношение фарша маточно-плацентарно-эмбриональной массы и фарша поджелудочной железы (1:3), удлинили сроки гидролиза до 8 сут и отстаивания после окончания процесса гидролиза до 30 суток.
Питательную среду для выращивания Б. песгорЬогит на основе ФГМПЭМ готовили согласно разработанных нами «Методических рекомендаций по изготовлению питательной среды для культивирования возбудителя некробактериоза» (2005)
Содержание в гидролизате и питательной среде общего и аминного азота, пептидов и триптофана, стерильность приготовленной питательной среды определяли согласно «Методическому руководству по лабораторной оценке качества бактерийных и вирусных препаратов» (М, 1976)
Ростовые свойства оценивали через 18 ч культивирования Р песгорЬогит в среде определением концентрации м к в мл среды
При приготовлении посевного материала сухую культуру Б. песгорЬогит в ампулах суспензировали и разбавляли забуференным физраствором до концентрации 2,0-2,5 млрд микробных клеток в мл по ОСО мутности После тщательного перемешивания микробную взвесь высевали в пробирки со средой Китга-Тароцци и инкубировали при 37°С Суточную культуру Р. песгорЬогит из пробирок пересевали в производственную питательную среду в 2 литровых колбах Чистоту роста культуры проверяли микроскопией окрашенных по Граму мазков Затем из этих колб делали пересевы в 20 литровые бутыли, заполненные на 2/3 объема производственной питательной средой, и инкубировали при 37°С Через сутки выросшую культуру, после контроля чистоты и концентрации м к использовали для засева в реактор
При оценке эффективности питательной среды на основе ФГМПЭМ для культивирования Р. песгорЬогит контролем служили питательные среды на основе, гидролизата лактоальбулина (ГЛА) фирмы «Дифко» США; гидролизата мышечной ткани по Хоттингеру (БХ); триптического перевара сердца (ТПС) и гидролизата из маточной ткани яловых коров (ГМЯК)
Ростовые качества той или иной среды оценивали на основании данных скорости роста и количества конечной концентрации Р песгорЬогит в мл среды через 18 ч культивирования при 37°С Опыты имели трехкратную повторность
В опытах по изучению влияния глюкозы на рост Р песгорЬогит при глубинно-суспензионном способе культивирования оценивали по изменению концентрации м к в среде, а определение динамики ее содержания в среде проводили колориметрическим методом с антроновым реактивом в модификации П Бабаскина (1968). В первой серии опытов использовали среду концентрацией 0,4; 0,7 и 1,2% глюкозы в общем объеме, во второй - испытали режим двукратной подпитки среды глюкозой первоначально из расчета 0,2, 0,3 и
0,4% и через 5-6 часов культивирования из расчета 0,7, 0,9 и 1,0% к общему объему
При изучении зависимости выхода биомассы при реакторном культивировании F. necrophorum от концентрации м к в посевном материале использовали адаптированную односуточную культуру F necrophorum с таким расчетом, чтобы расчетная исходная концентрация м к в мл среды в биореакторе составляла 0,2-0,4, 0,3-0,5,0,5-0,7 и 0,7-0,9 млрд.
Изучение культурально-морфологических свойств использованных штаммов F necrophorum осуществляли по их росту в различных питательных средах в течение 18-24 ч культивирования и микроскопией окрашенных по Грамму мазков, а их биологических свойств - согласно «Определителю зоопатогенных микроорганизмов» (1995) Вирулентность штаммов определяли на белых мышах и кроликах подкожным или внутрибрюшинным введением различных их концентраций в объеме 0,1 и 0,2 мл Для заражения использовали по 3-5 животных на дозу По результатам гибели зараженных животных вычисляли LD50 по методу Кербера (1978)
Для определения способности микроорганизмов ферментировать углеводы использовали «пестрый» ряд, включающий среду Гисса, содержащую 1% моно-и дисахаридов, а в качестве индикатора - бромтимолблау
Об активности культуры по отношению того или иного углевода судили по изменению цвета среды и появлению пузырьков газа в «поплавке» при инкубировании при 37°С в течение 18-24 часов Образование индола штаммами F necrophorum определяли по способу Мореля; сероводорода - по изменению цвета укрепленной под пробкой пробирки фильтровальной бумаги, пропитанной раствором ацетата свинца, аммиака - по изменению цвета укрепленной под пробкой пробирки лакмусовой бумаги
Антигенные свойства взятых в опыт штаммов F necrophorum изучали в перекрестных реакциях иммунофлюоресценции (РНИФ), согласно «Методических рекомендаций по лабораторным методам диагностики некробактериоза сельскохозяйственных животных» (1987) и иммуноферментного анализа (ИФА), согласно «Методической рекомендации по оценке поствакционального иммунитета и диагностики некробактериоза животных» (1998)
Для лабораторных опытов и производственного испытания полиштаммовую формол-эмульсионную вакцину готовили согласно одобренных Методическим советом и утвержденных директором ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» «Инструкции по ее изготовлению» из антигена и экзотоксина, полученных при глубинно-суспензионном способе культивирования F necrophorum в питательной среде на основе ФГМПЭМ и бульоне Хоттингера
При определении стерильности, безвредности и иммуногенной активности из каждой серии вакцины готовили общую пробу, используя по три флакона вакцины. При этом из каждого флакона переносили по 20 см3 вакцины в стерильный флакон Стерильность вакцины контролировали по ГОСТу 28085-89, безвредность проверяли подкожным введением по 0,5 см3 вакцины десяти белым мышам, а иммуногенность - внутрибрюшинным заражением ЛДюо патогенного штамма F necrophorum №8 10 вакцинированных и 10 интактных белых мышей.
s
Иммунизацию белых мышей осуществляли подкожным введением вакцины в дозе 0,2 см3/гол. Летальную дозу контрольного штамма титровали на животных аналогах
После проверки безвредности, иммуногенности каждой серии вакцины на лабораторных животных, провели лабораторно - контролируемые опыты по испытанию их иммунологической эффективности в условиях 2 хозяйств, неблагополучных по некробактериозу на 250 головах крупного рогатого скота
За привитыми животными вели клиническое наблюдение в течение 6 месяцев С целью изучения динамики антителообразования через 21, 30, 40, 45 и 120 сут после вакцинации исследовали сыворотку крови в РНИФ и ИФА, используя «основной» антиген из штамма «8», входящего в состав вакцины Эффективность иммунизации оценивали по изменению эпизоотической ситуации по некробактериозу в хозяйстве до и после вакцинации
Статистическую обработку экспериментально полученного материла проводили общепринятыми методами вариационной статистики с помощью критерия Стьюдента с применением пакета прикладных программ Microsoft Excel 97.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Разработка технологии получения питательной среды на основе ферментативного гидролизата маточно — плацентарно - эмбриональной массы (ФГМПЭМ) крупного рогатого скота для культивирования
F. necrophorum
На первом этапе выполнения диссертационной работы в процессе изготовления ФГМПЭМ определили наиболее оптимальные условия его приготовления с варьированием срока гидролиза, соотношения фарша маточно-плацентарно-эмбриональной массы и фарша поджелудочной железы, режимов перемешивания и сроков отстоя. Введенные изменения способствовали улучшению качества гидролизата и ускорению первичной его фильтрации перед приготовлением питательной среды За время работы по модифицированной нами технологии изготовлено 10 серий гидролизата в объеме 2500 литров
При анализе качеств всех серий гидролизата установили у них следующие основные биохимические показатели общий азот колебался в пределах 700-750 мг%, аминный азот - 450-500 мг%, триптофан - 150-175 мг%, пептиды 1,1-1,5% Индол во всех сериях отсутствовал
Полученные данные указывают на возможность стандартизации получаемого гидролизата по этим показателям
Для выполнения поставленных задач изготовили 10 серий питательной среды на основе ФГМПЭМ в объеме 7500 литров
Результаты исследований качества и ростовых свойств изготовленных серий питательной среды в сравнении с ростовыми свойствами бульона Хотгингера при реакторном культивировании F necrophorum приведены в таблице 1
Таблица 1 Ростовые свойства изготовленных серий питательной среды
№№ серий Аминный азот в гидроли-зате мг% Аминный азот в среде мг% Концентрация млрд м к /мл рН
в начале культив. через 18 ч.
1 450 120 0,56±0,14 10,60±0,25 7,4
2 452 135 0,56±0,12 10,58±0,25 7,2
3 455 135 0,61±0,14 9,46±0,28 7,25
4 454 135 0,58±0,14 10,24±0,22 7,4
5 460 128 0,54±0,13 10,19±0,20 7,3
6 459 127 0,63±0,14 12,4±0,21 7,42
7 470 131 0,53±0,12 13,8±0,14 7,35
8 492 128 0,61±0,13 15,1±0,18 7,3
9 500 120 0,6б±0,15 15,0±0,17 7,3
10 480 130 0,58±0,13 10,27±0,21 7,4
Бульон Хоттингера 470 120 0,58±0,15 12,4±0,17 7,2
Все приготовленные среды были стерильными При контроле ростовых свойств питательной среды концентрация м к Р песгорЬогиш через 18 ч культивирования составляла от 9,46±0,28 до 15,1±0,18 млрд мк/мл, при начальной концентрации в пределах 0,53 - 0,66±0,15 млрд м к /мл.
По этим показателям питательная среда на основе ФГМПЭМ имеет сходство с питательной средой из гидролизата мышечной ткани по Хоттингеру, которая широко используется в микробиологии и биопромышленности
3.2. Сравнительная оценка эффективности питательной среды на основе ФГМПЭМ для получения биомассы Р. песгорЬогиш при различных условиях
культивирования
В опытах по сравнительной оценке эффективности питательной среды на основе ФГМПЭМ для культивирования песгорЬогиш установлено, что при стационарном культивировании (в 2-х литровых колбах) через 18 ч. культивирования возбудителя некробактериоза в питательной среде на основе ФГМПЭМ и бульоне Хоттингера концентрация м к в мл среды составили 5,69 и 5,7 млрд, а экзотоксина 5,51 и 5,5 мг/мл, что было выше в 9 раз, чем на средах ГЛА, 1,5 раза, чем в ТПС и 1,2 раза, чем в ГМЯК
В последующих опытах провели изучение динамики роста культуры некробактерий, накопления бактериальной массы и экзотоксина в питательных средах на основе ФГМПЭМ и Б X при отъемно-доливном методе культивирования в 36 литровом биореакторе в анаэробных условиях После коррегирования рН среды до 7,2-7,4, вносили адаптированный посевной материал культуры некробактерий из расчета 0,5-0,7 млрд м к на мл среды Результаты опытов обобщены и представлены в таблице 2
Таблица 2 Динамика роста культуры некробактерий при глубинно-
суспензионном способе культивирования
Время взятия проб, ч. рН среды Концентрация м к, млрд/мл Концентрация белка, мг/мл Температура, °С Скорость перемешивания, об/мин
Среда на основе ФГМПЭМ
0 7,25 ± 0,13 0,56 ±0,14 0,42 ±0,11
3 7,05 ±0,18 1,30 ±0,19 1,27 ±0,16
6 6,86 ± 0,20 3,20 ±0,31 4,10 ±0,19 00 о
9 6,52 ± 0,22 6,10 ± 0,24 6,26 ± 0,25 го ■ гл * о
12 6,37 ±0,21 8,80 ± 0,22 8,40 ± 0,23 О
16 6,31 ±0,19 9,80 ± 0,23 9,60 ±0,20
18 6,29 ±0,23 11,00 ±0,22 10,50 ± 0,25
Б Хоггингера
0 7,4±0,15 0,60±0,16 0,46±0,12
3 7,21±0,17 1,33±0,18 1,3±0,15 со т о о гя
6 6,9±0,21 3,25±0,33 4,16±0,20 со о о сч
9 б,5±0,22 6,15±0,25 6,28±0,27
12 6,4±0,21 8,90±0,23 8,43±0,24
16 6,30±0,20 9,92±0,25 9,65±0,21
18 6,30±0,21 12,00±0,23 10,60±0,26
Анализ полученных данных показал, что при культивировании некробактерий в среде на основе ФГМПЭМ и Б X показатели концентрации м к. в мл среды и количества экзотоксина в культуральной жидкости существенно не отличались Было отмечено, что численность клеток некробактерий, содержание белка в культуральной жидкости равномерно увеличивались и через 18 ч. культивирования эти показатели в 1,8 и 2 раза были выше, чем при стационарном методе выращивания Б песгорЬогиш в данных средах
Полученные данные позволяют констатировать, что питательная среда, изготовленная на основе ФГМПЭМ, по ростовым свойствам и выходу экзогенного белка в культуральной жидкости не уступает аналогичным показателям среды на основе мясного гидролизата по Хотгингеру Кроме того, установлено, что при глубинно-суспензионном реакторном культивировании Б. песгорЬогит выход бакмассы и экзогенного белка в мл среды значительно повышается.
3.3. Разработка оптимальных условий для глубинно-суспензионного способа культивирования возбудителя некробактериоза
При производстве биологических препаратов в процессе культивирования микроорганизмов для выхода конечного продукта существенное значение имеет количество и качество посевного материала, а также адаптированность микроорганизмов к данной питательной среде. Учитывая этот фактор, нами была применена методика предварительного адаптирования культуры некробактерий к условиям роста в среде на основе ФГМПЭМ в стационарных условиях В этих опытах в качестве посевного материала использовали культуру в экспоненциальной фазе роста В качестве стимулирующего фактора активного роста штаммов Р песгорИогит в среду добавляли сыворотку крови крупного рогатого скота в количестве 2,5% и глюкозы 0,2 и 0,7% (дробно) к общему объему питательной среды Результаты исследований через 20 ч культивирования бактерий представлены в таблице 3
Таблица 3 Адаптирование Р. песгорЬогит к предлагаемой
питательной среде
№ п/п Номер пассажа Концентрация млрд м к./мл Жизнеспособность микробных клеток, %
Начальная Конечная
1 1 0,7*10* 3,27±0,23 91
2 2 0,7*10у 4,95±0,18 96
3 3 0,7*10у 5,9±0,18 100
Из представленных данных видно, что для адаптирования культуры Р песгорЬогит к разработанной среде достаточно 3 пассажа. При этом отмечали 100%-ную жизнеспособность микробных клеток, в то время как в 1 и 2 пассажах выявляются лизированные бактерии и клетки с низкой жизнеспособностью
При изучении зависимости выхода биомассы при реакторном культивировании Р. песгорЬогит от концентрации м к. в посевном материале использовали адаптированную односуточную культуру Р песгорЬогит с таким расчетом, чтобы исходная концентрация м к. в мл среды в биореакторе составляла 0,2-0,4; 0,3-0,5; 0,5-0,7 и 0,7-0,9 млрд
Фрагмент результатов этого опыта с использованием посевного материала из расчета 0,5-0,7 млрд м к в мл среды представлены в таблице 4
Таблица 4 Результаты культивирования Р песгорЬогит глубинно-
суспензионным способом в питательной среде на основе ФГМПЭМ
Время взятия проб, ч рН среды Концентрация, млрд м к/мл Количество белка, мг/мл Температура среды, °С Скорость перемешивания, об/мин.
0 7,35±0,18 0,52±0,06 0,5±0,02 37 200-300
3 7,22±0,21 1,31±0,18 1,27±0,18 -«-
6 6,98±0,19 4,12±0,14 3,84±0,22 -«-
9 6,б4±0,17 6,4б±0,11 6,26±0,21 -«- -«-
12 б,41±0,21 10,07±0,21 8,42±0,19 -«- -«-
15 6,37±0,19 11,09±0,23 9,15±0,17 -«- -«-
18 6,33±0,23 12,95±0,18 10,27±0,23 -«- -«-
Анализ данных этих исследований показал, что на протяжении 3-12 ч культивирования посеянная культура некробактерий находилась в экспоненциальной фазе роста, а к концу эксперимента (15-18 ч.) переходила в стационарную фазу роста. Концентрация микробных клеток и содержание белка на протяжении опыта нарастали и к концу исследования составляли 12,95±0,18 млрд м к/мл и 10,27±0,23 мг/мл, соответственно В процессе культивирования бактерий рН среды снижалась от 7,35±0,18 до 6,33±0,23 пропорционально нарастанию бактериальной массы
Таким образом, использование для посева адаптированную культуру некробактерий при глубинно-суспензионном способе культивирования в питательной среде на основе ФГМПЭМ из расчета 0,5-0,7 млрд м к на 1 л. среды способствует повышению удельной скорости роста культуры в биореакторе и увеличению выхода бактериальной массы и экзотоксина Поэтому во всех последующих опытах использовали культуру адаптированную к питательной среде на основе ФГМПЭМ
3.4. Влияние глюкозы на рост и выход бактериальной массы Е. песгорЬогит при глубинно-суспензионном способе культивирования
С целью изучения динамики потребления глюкозы Р песгорЬогит при выращивании в глубинно-суспензионным способом в питательной среде на основе ФГМПЭМ и ее влияния на выход биомассы и экзотоксина, культивирование бактерий осуществляли в 36-литровом биореакгоре Результаты экспериментов обобщены и представлены в таблице 5.
Таблица 5 Динамика потребления глюкозы и выход бакмассы и экзотоксина в процессе выращивания Р песгорЬогиш
№ опыта Исследование проб (через ч) рН - среды Концентрация микробных клеток, млрд м к /мл Количество белка, мг/мл Концентрация глюкозы в объеме среды, %
Однократное добавление глюкозы (0,4%)
0 7,38±0,14 0,59±0,12 0,5±0,02 0,4
3 7,26±0,17 1,43±0,18 1,27±0,18 0,33
1 6 6,93±0,21 3,98±0,17 3,84±0,22 0,19
9 6,71±0,19 7,61±0,23 6,26±0,21 0
12 6,63±0,23 7,94±0,21 8,42±0,19 0
18 6,59±0,25 , 9,27±0,23 8,35± 0,28 0
Однократное добавление глюкозы (0,7%)
0 7,35±0,16 0,64±0,11 0,42±0,11 0,7
3 7,22±0,19 1,35±0,14 1,27±0,16 0,62
2 б 7,0б±0,18 3,60±0,1б 4,10±0,19 0,47
9 6,72±0,20 6,95±0,18 6,26±0,25 0,26
12 6,53±0,25 9,12±0,17 8,40±0,23 0,14
18 6,44±0,15 11,00±0,22 10,24±0,21 0,08
Однократное добавление глюкозы (1,2%)
0 7,42±0,18 0,56±0,15 0,46±0,12 1,2
3 7,28±0,23 1,06±1,18 1,3±0,15 1,14
3 6 7,17±0,21 3,35±0,22 4,16±0,20 0,88
9 6,81±0,19 б,54±0,21 6,28±0,27 0,54
12 6,63±0,28 8,62±0,24 8,43±0,24 0,36
18 6,44±0,25 10,00±0,23 9,16±0,20 0,28
Дробное добавление глюкозы (0,2 и 0,7%)
0 7,28±0,11 0,64±0,09 0,51±0,13 0,2
3 7,19±0,1б 1,61±0,11 1,2±0,14 0,11
4 6 6,98±0,23 4,15±0,16 5,1±0,23 0,17
9 6,73±0,18 7,83±0,13 8,7±0,26 0,48
12 6,41±0,17 13,9±0,14 11,00±0,27 0,12
18 6,32±0,21 15,6±0,18 13,00±0,27 0,03
Полученные данные, свидетельствуют о том, что однократное добавление глюкозы в количестве 0,4% к общему объему среды не достаточно, так как уже к 7-9 ч культивирования Б песгорЬогиш она полностью использовалась, а при первоначальном содержании глюкозы в среде 0,7 и 1,2% наблюдали снижение активности роста бактерий и не полное ее усвоение за весь цикл ферментации При этом к концу опыта остаточная концентрация глюкозы в питательной среде
находилась на уровне 0,08 и 0,28 %, а концентрация бактериальных клеток в мл среды не превышала 11,00 и 10,0 млрд, а экзотоксина 10,24 и 9,16 мг/мл
При двукратном добавлении глюкозы с интервалом 5-6 ч регистрировали в динамике ускоренный рост и размножение бактерий, и к 18 ч ферментации концентрация микробных клеток составляла 15,6 млрд м к/мл и экзотоксина 13 мг/мл, что в 1,7 и 1,4 раза превышают данные, полученные при однократном добавлении глюкозы
Таким образом, проведенные исследования показали целесообразность двукратной подпитки питательной среды глюкозой, первоначально из расчета 0,2 % и через 5-6 ч культивирования из расчета 0,7 % к общему объему среды
3.5. Изучение культурально-морфологических и биологических свойств взятых в опыт штаммов Р. песгорЬогиш при культивировании их разными способами и на различных питательных средах
С целью изучения возможного влияния среды на основе ФГМПЭМ на культурально-морфологические и биологические свойства Р песгорЬогиш, провели сравнительное изучение этих показателей у использованных в опытах штаммов после культивирования их в традиционно принятой среде-бульоне Хотгингера и в разработанной нами среде в стационарных условиях и глубинно-суспензионным способом в условиях биореактора
При выращивании Р песгорЬогит в бульоне Хотгингера, регистрировали одновременное помутнение всего столбика среды Максимальное накопление бактериальной массы регистрировали через 22-24 часа
Рост бактерий в среде на основе ФГМПЭМ происходила в начале в нижнем слое столбика, а затем перерастала в верхние слои питательной среды Максимальное накопление бактериальной массы регистрировали через 18 ч культивирования
В обоих случаях наблюдали газообразование, интенсивность которого варьировала в зависимости от штамма На плотных питательных средах рост культур проходил в течение 36-96 ч в виде мелких (менее 1 мм), россинчатых, гладких, плоских, хорошо очерченных колоний желто-серого цвета с углублением в центре Рост на кровяном агаре характеризовался зоной А- и В-гемолиза В обеих случаях в мазках штаммы представляли собой грамотрицательные полиморфные микроорганизмы, располагающиеся хаотично в виде палочек разной длины и переплетения нитей. К концу культивирования у некоторых нитей наблюдали чечевицеобразные утолщения и зернистость. Спор и капсул не образовывали
При изучении биохимических свойств установили, что все исследуемые штаммы возбудителя некробактериоза не зависимо от среды и условий культивирования продуцировали индол и сероводород, расщепляли' глюкозу, лактозу, галактозу, маннит и сахарозу Раффинозу и дульцит расщепляли штаммы 8, 12 и КОН, арабинозу ферментировал только штамм 8, мальтозу не расщепляли штаммы 8 и 12, и ни один из штаммов не ферментировал глицерин Разницы в сахаролитических свойствах во всех случаях не регистрировали
Результаты изучения антигенных свойств выращенных в БХ и среде на основе ФГМПЭМ Р. песгорЬогиш обобщены и представлены в таблице 6
Таблица 6 Антигенная активность взятых в опыт штаммов, выращенных в различных средах и условиях
Сыворотки к штаммам Антиген из штаммов
8 12 КОН ВУП
8 а 1 5120/1 5120 1 160/1 160 1 640 / 1 640 1.1280/ 1 1280
б 1 512000 К>2,1 / 1 512000 К>2,1 1:32000 К>2,5 / 1-32000 К>2,5 1-128000К>2,5 1.128000К>2,5 1.128000 К>2,6 1.128000 К>2,6
12 а 1 320/1.320 1 5120/1 5120 1 40/1 40 1 320/1-320
б 1 32000 К>2,1 / 1 32000К>2,1 1 512000 К>2,1 1.512000 К>2,1 1 64000 К>2,6 / 1 64000 К>2,6 1.128000 К>2,5 1 128000 К>2,5
КОН а 1-320/1 320 1 40/1:40 1 5120/15120 1 640/ 1 640
б 1 64000 Ю>2,1 / 1.64000 К>2,1 1 64000 К>2,1 / 1.64000 К>2,1 1 512000 К>2,1/ 1 512000 К>2,1 1 256000 К>2,7 1 256000 К>2,7
ВУП а 1 1280/1 1280 1-320/1 320 1 40/ 1 40 1 5120/1 5120
б 1 256000 К>2,1 / 1 256000 К>2,1 1 128000К>2,1 / 1-128000 К>2,1 1 32000 К>2,1 / 1 32000 К>2,1 1-512000 К>2,6 1 512000 К>2,6
Примечание - а - РНИФ, б - ИФА
- в числителе после культивирования в БХ, в знаменателе после культивирования в среде на основе ФГМПЭМ
Из данных таблицы 6 видно, что не зависимо от среды и условий культивировании наиболее широкой активностью в РНИФ обладал антиген из штамма 8, а при исследовании в ИФА - антиген из штамма КОН со специфичностью К>2Д.
Сравнительный анализ результатов исследований антигенов в ИФА и РНИФ показывает, что результаты ИФА коррелировали с таковыми РНИФ, однако по чувствительности ИФА превосходил РНИФ в 5-10 раз.
Результаты определения вирулентных свойств исследуемых штаммов представлены в таблице 7.
Таблица 7 Показатели вирулентности штаммов возбудителя
некробактериоза (п=3)
Вид животных Способ заражения Объем введенной дозы мл Минимальная летальная доза /100 оттитрованное по белку в мг/мл
8 12 ВУП КОН
Белые мыши Подкожно 0,2/0,2 1,5/1,5 ±0,1 1,7/1,7 ±0,2 1,5/1,5 ±0,1 1,6/1,6 ±0,1
Белые мыши Внутри-брюшинно 0,2/0,2 0,9/0,9 ±0,1 0,6/0,6 ±0,1 0,8/0,8 ±0,2 0,9/0,9 ±0,1
Примечание - в числителе после культивирования в БХ, в знаменателе после культивирования в среде на основе ФГМПЭМ
Полученные результаты свидетельствуют о том, что не зависимо от сред и условий культивирования вирулентность взятых в опыт штаммов не изменялась После подкожной инъекции бактериальной суспензии гибель животных отмечали на 7-10 день заражения с признаками анорексии, атаксии задних конечностей и изъязвления места инъекции. К внутрибрюшинному способу заражения белые мыши оказались наиболее чувствительными. При этом способе введения Б. песгорЬогиш гибель белых мышей наступала на 2-3 сут и выражалась общим угнетением, мышечной дрожью, параличами.
Сравнительный анализ результатов заражения подопытных животных показал, что при внутрибрюшинном введении вирулентность тест-штаммов была выше в 1,7-2,8 раза, чем при подкожном введении
Таким образом, обобщенный сравнительный анализ данных изучения культурально-морфологических и биологических свойств, а также вирулентности использованных штаммов Р песгорЬогиш, культивированных в бульоне Хоттингера и среде на основе ФГМПЭМ в стационарном и глубинно-суспензионном способах, позволяет констатировать, что использование разработанной нами питательной среды на основе ФГМПЭМ с содержанием 120130 мг/мл аминного азота для культивирования Р песгорЬогиш не вызывает каких либо изменений в свойствах у этих бактерий
3.6. Испытание иммунологической эффективности полиштаммовой формол-эмульсионной вакцины против некробактериоза, изготовленной из биомассы и экзотоксина, полученных в среде на основе ФГМПЭМ при глубинно-суспензионном способе культивирования
Бактериальную массу и экзотоксин для изготовления вакцины с высокой антигенной специфичностью получали, используя штаммы «8», «12» и «КОН», после культивирования их глубинно-суспензионным способом. Антиген и экзотоксин эмульгировали в масляном адъюванте.
Первая серия вакцины была изготовлена с использованием антигена и экзотоксина, полученных при культивировании штаммов в бульоне Хоттингера.
Вторая серия вакцины была изготовлена из антигена и экзотоксина, полученных при культивировании штаммов в среде на основе ФГМПЭМ
Первоначально изучение иммуногенной активности изготовленных серий вакцин осуществляли с использованием белых мышей.
Схема и результаты данного опыта приведены в таблице 8
Таблица 8 Оценка иммуногенности образцов вакцин
на лабораторных животных (п=3)
Группа животных №№ опыта Количество животных, гол. Выжило, гол Пало, гол Защитный эффект, %
1 2 3 4 5 6
Привитые первой 1 10 9 1
серией вакцины 2 10 9 1 86,6
3 10 8 2
1 2 3 4 5 6
Привитые второй 1 10 10 0
серией вакцины 2 10 8 2 90
3 10 9 1
Третья - контроль- 1 10 0 10
ная, не привитые 2 10 1 9
3 10 0 10
Результаты исследования свидетельствуют о том, что обе вакцинированные группы мышей оказались устойчивыми к контрольному заражению При этом выживаемость животных иммунизированных первой серией вакцины составила 86,6%, а второй - 90% Полученные данные свидетельствуют о том, что питательная среда на основе ФГМПЭМ вполне пригодна для культивирования некробактерий с целью изготовления вакцины против некробактериоза
Опыты по изучению иммунологической активности опытных серий вакцины против некробактериоза на крупном рогатом скоте провели в условиях хозяйств, стационарно неблагополучных по некробактериозу крупного рогатого скота Анализ эпизоотической ситуации по некробактериозу в СХПК «Арский» РТ показал, что заболеваемость коров некробакгериозом варьировало в пределах 12-23% из общего поголовья, а в СХПК «Серп-Молот» этот показатель достигал 28-34%
В каждом хозяйстве вакцинировали по 2 группы животных по 50 голов в каждой В опыте в СХПК «Арский» в качестве контроля была оставлена специальная группа коров в количестве 50 голов, которых не вакцинировали Схема и результаты опытов представлены в таблице 9
Таблица 9 Схема и результаты оценки иммуногенности образцов
вакцин на крупном рогатом скоте
Группа животных №№ опыта Количество животных, гол Средний титр антител на 30 сутки после вакцинации Заболело после вакцинации
Привитые 1-й 1 50 1:1280 -
серией вакцины 2 50 1-640 -
Привитые 2-й 1 50 1-1280 -
серией вакцины 2 50 1 1250 -
Не вакциниро- 1 50 1-140 4
ванная группа
Результаты исследования свидетельствуют о том, что обе вакцинированные группы крупного рогатого скота оказались устойчивыми к естественному заражению возбудителем некробактериоза, в то же время в контрольной (не вакцинированной) группе коров заболели 4 головы При этом отмечали отечность, изъязвление кожи и некроз подлежащих тканей в области венчика и межкопытной
щели Бактериологическими исследованиями витальных соскобов с
пораженных участков выделили возбудителя некробактериоза У этих животных процесс прогрессировал, и они были подвергнуты медикаментозному лечению
При изучении антигенной активности вакцины и динамики иммунологического процесса в организме подопытных животных исследованиями крови установлено, что максимальные показатели титра специфических антител в ИФА - 1:512000 и в РНИФ - I 640 регистрировали на ЗОсут после вакцинации В дальнейшем (к 4 месяцам) титр антител постепенно снижался и не превышал 1 6400 и 1-160, соответственно
Обобщенный анализ клинических, эпизоотологических, серологических и бактериологических исследований показал, что вакцина, изготовленная с использованием биомассы и экзотоксина, полученных при глубинно-суспензионном культивировании Р. песгорЬогит в среде на основе ФГМПЭМ, не уступает по иммуногенности вакцине, изготовленной из биомассы и экзотоксина, полученных при культивировании этих бактерий в среде на основе перевара Хоттингера
Исходя из результатов исследований глубинно-суспензионный способ культивирования Р. песгорЬогит в среде на основе ФГМПЭМ с целью получения бактериальной массы и экзотоксина внедрен в процесс широкомасштабного производства полиштаммовой формол-эмульсионной вакцины против некробактериоза Из биомассы и экзотоксина, полученных разработанным нами способом, за 2004-2006г изготовлено 8 серий вакцины общим объемом более 65 тыс доз, которые с положительными результатами испытаны в хозяйствах Татарстана, Мордовии, Марий-Эл, Самарской, Курской и Новосибирской областей с различной эпизоотической ситуацией по некробактериозу крупного рогатого скота разного возраста Заболеваемость скота некробактериозом в этих хозяйствах снизилась от 18-40,4% до 1,3-4% от общего числа восприимчивого поголовья
ВЫВОДЫ
1 Разработана технология изготовления дешевой питательной среды на основе ферментативного гидролизата непищевого сырья - маточно-плацентарно-эмбриональной массы крупного рогатого скота для культивирования Р. песгорЬогит в стационарным и глубинно-суспензионным способами с целью первичного выделения и наработки бактериальной массы и экзотоксина для производства вакцины против некробактериоза сельскохозяйственных животных
2 Питательная среда, изготовленная на основе ФГМПЭМ, по эффективности выхода бактериальной массы и экзотоксина Р песгорЬогит в культуральной жидкости не уступает бульону Хоттингера, получаемой с использованием гидролизата из мышечной ткани и не оказывает отрицательного влияния на культурально-морфологические, биохимические, антигенные, вирулентные и иммуногенные свойства этих микроорганизмов при стационарном и глубинно-суспензионном способах культивирования в условиях биореактора
3 Разработанные оптимальные условия глубинно-суспензионного культивирования Р. песгорЬогит в больших объемах обеспечивают выход
бактериальной массы до 15,б±0,18 млрд м к/мл и накопление внеклеточных белков в культуральной жидкости до 13,00±0,27 мг/мл
4 Рост культуры и выход биомассы F necrophorum значительно стимулируются углеводами и оптимальной является дробное (двукратное) добавление глюкозы при глубинно-суспензионном культивировании из расчета 0,2 и 0,7% с интервалом 5-6 ч к общему объему питательной среды
5 Полиштаммовая формол-эмульсионная вакцина, изготовленная из биомассы и экзотоксина, полученных в среде на основе ФГМПЭМ глубинно-суспензионным способом культивирования F. necrophorum, обладает высоким антигенным и иммуногенным свойствами
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1 Для первичного выделения, пересевов и наработки бактериальной массы F necrophorum рекомендуется дешевая питательная среда на основе ферментативного гидролизата маточно-плацентарно-эмбриональной массы крупного рогатого скота, приготовленная согласно «Методической рекомендации по ее изготовлению . », одобренной научно-методическим советом ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»
2 Для получения большого объема бактериальной массы и экзотоксина с целью изготовления вакцины против некробактериоза рекомендуется режим глубинно-суспензионного способа культивирования F necrophorum в реакторах различного объема с использованием жидкой питательной среды на основе ФГМПЭМ
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1 Сабирова, В В Иммуноферментный метод для определения антител к возбудителю некробактериоза /Д А Хузин, Е К Акимов, В В Сабирова, Н А Хисматуллина//Матер науч конф , посвящ 125-летию КГВAM. -Казань,-1998 -
4 1 -С 111-112
2 Сабирова, В В Биотехнология получения некробактериозного антигена /В В Сабирова//Матер науч конф , посвящ 125-летию КГВ AM -Казань -1998 -Ч 1 -С 112-113
3 Сабирова, В В Методические рекомендации по оценке поствакционного иммунитета и диагностики некробактериоза /Е К Акимов, Д А Хузин, В.В Сабирова, НА Хисматуллина, ХН Макаев //- Казань, фонд ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», инв №3743.-1998 -4с
4. Сабирова, В В Применение ИФА для оценки напряженности иммунитета у животных, вакцинированных против некробактериоза /Д А Хузин, Е К Акимов, Н А Хисматуллина, X Н Макаев, В В. Сабирова//Диагностика лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний Биотехнология, эпидемиология, ветеринария //Матер юбил науч конф , посвящ. 75 летию НИИ микробиологии МО РФ,-Киров -1998 -С 255-256
5 Сабирова, В.В Использование ИФА для индикации фузобактерий некроза в патологическом материале /Д А Хузин, Е К Акимов, В В. Сабирова //Диагностика лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний
Биотехнология, эпидемиология, ветеринария //Матер, юбил науч
конф , посвящ 75 летию НИИ микробиологии МО РФ, - Киров.-1998. - С. 255257
6. Сабирова, В В. Оценка поствакцинального иммунитета животных при некробактериозе /В В Сабирова //Молодые ученые - агропромышленному комплексу. //Матер второй респуб конф молодых ученых - Казань -2000 - С. 121-122.
7. Сабирова, В В Оценка уровня специфических антител против некробактериоза в сыворотках крови иммунизированных животных /Е К Акимов, ХН Макаев, В В Сабирова, НИ Галиакберова //Ученые записки КГАВМ, том 174 -Казань 2003г-С 22-23
8 Сабирова, В В Влияние питательных сред на рост некробактерий в суспензионных условиях культивирования /Е.К Акимов, X Н. Макаев, В В Сабирова// Ветеринарная биотехнология Настоящее и будущее. //Матер Междунар. научно-практич конф. - Щелково -2004 - С 206-207 9. Сабирова, В В. Динамика потребления глюкозы при выращивании РпесгоЬошт в питательной среде на основе ФГМПЭМ /ЕК Акимов, ХН Макаев, ВВ. Сабирова, ДА. Хузин, ДВ Маковецкий //Матер Междунар симпозиума, посвящ 45-летию образования ВНИВИ -Казань -2005-С 14-16 10 Сабирова, В В Сравнительная оценка методов выявления антител при некробактериозе /ЕК Акимов, ХН Макаев, ДА Хузин, НА Хисматуллина, В Г Гумеров, А.К Галиуллин, В В. Сабирова //Ветеринария -2005 -№1 -С 2829.
11. Сабирова, В В Методические рекомендации по изготовлению питательной среды для культивирования возбудителя некробактериоза /ХН Макаев, ДА Хузин, Е К Акимов, Н И Галиакберова, В В Сабирова // - Казань, фонд ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», инв №2741 -2005 - 6с
Сдано в набор 16 04 2007 Подписано в печать 17 04 2007 Заказ № 38 Тираж 100 экз Формат 60x90 1/16 Уел печ л 1,25
Типография ФГУ "ФЦТРБ" (г Казань) Адрес 420075, г Казань, Научный городок-2
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сабирова, Валентина Васильевна
ВВЕДЕНИЕ.
1. Обзор литературы.
1.1. Культурально-морфологические, биологические и иммунологические свойства возбудителя некробактериоза.
1.2. Значение питательных сред при выращивании возбудителя некробактериоза.
1.3. Современные подходы к культивированию микроорганизмов.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2. Материалы и методы исследований.
3. Результаты исследований.
3.1. Разработка технологии получения питательной среды на основе ферментативного гидролизата маточно-плацентарно -эмбриональной массы (ФГМПЭМ) крупного рогатого скота для культивирования
Р. песгорЬогит
3.2. Сравнительная оценка эффективности питательной среды на основе ФГМПЭМ для получения биомассы Б. песгорЬогит при различных условиях культивирования.
3.3. Разработка оптимальных условий для глубинно-суспензионного способа культивирования возбудителя некробактериоза.
3.4. Влияние глюкозы нарост и выход бактериальной массы
Р .песгорЬогит при глубинно-суспензионном способе культивирования.
3.5. Изучение культурально-морфологических и биологических свойств взятых в опыт штаммов Р. песгорЬогит, при культивировании их разными способами и на различных питательных средах.
3.5.1. Изучение свойств Р. песгорЬогит, выращенных в бульоне Хоггингера.
3.5.2. Изучение биологических свойств Р. песгорЬогит, культивированных в питательной среде на основе ФГМПЭМ глубинно-суспензионным способом.
3.6. Испытание иммунологической эффективности полиштаммовой формол-эмульсионной вакцины против некробактериоза, изготовленной из биомассы и экзотоксина, полученных в среде на основе ФГМПЭМ при глубинно- суспензионном способе культивирования.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.
ВЫВОДЫ.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка оптимальных условий глубинно-суспензионного способа культивирования Fusobacterium necrophorum"
Актуальность темы. Некробактериоз крупного рогатого скота широко распространенное инфекционное заболевание, наносящее значительный экономический ущерб скотоводству. В связи с этим, предотвращение возникновения и распространения некробактериоза среди сельскохозяйственных животных является актуальной проблемой ветеринарной науки и практики (Д.Н. Бондаренко, 1980; И.А. Калашник и др., 1983; Ю.Г., Анакина 1988; С.И., Братюха, 1988; Т.Е Какоулин, 1997; Х.Н. Макаев, Д.А. Хузин и др., 2001).
Заболеваемость крупного рогатого скота некробактериозом отмечается в последние годы по РФ в среднем от 12 до 25 % от общего восприимчивого поголовья скота. В отдельных хозяйствах этот показатель достигает до 40 %. Заболевание носит хронический характер, спорадически обостряясь при ослаблении общей резистентности организма животных (А.А Самойлов, 1991; И.Г. Тириков, 1996; Д.А. Хузин, 2001).
К F.necrophorum наиболее восприимчивы высокопродуктивные животные, первотелки и бычки во второй половине откорма. В неблагополучных по некробактериозу хозяйствах сохранность приплода не превышает 62-75 %, так как телята рождаются с первичным иммунодефицитом, вследствие внутриутробной интоксикации продуктами жизнедеятельности возбудителя некробактериоза (В.А. Балабанов, 1971; A.A. Самоловов и др., 1997, 1998; Х.Н. Макаев и др., 2001).
В последние годы широкое применение в борьбе с некробактериозом в животноводстве нашли варианты вакцин, для изготовления которых необходимо получение значительного количества бактериальной массы (Г.Х. Камалов, 1991; A.A. Самоловов, A.A. Сидорчук, С.Д. Панасюк, 1994; Д.А. Хузин, 1996,1997; Х.Н. Макаев и др. 2004). С целью получения биоматериала при производстве вакцинных препаратов широко используют питательные среды, приготовленные на основе отвара мышечной ткани, однако, мясо-сырье является ценным и дефицитным пищевым продуктом. В связи с этим, снижение себестоимости вакцинных препаратов возможно при использовании в качестве источников для приготовления питательных сред более доступных и дешевых компонентов.
Из значительног о количества различных наименований бактериальных биопрепаратов, производимых отечественной биологической промышленностью, лишь небольшая часть их изготавливается получением биомассы глубинно-суспензионным способом (И.В. Звягин, 1978; Виестур, 1980; В.И. Заерко, 1996; В.В. Меньшенин, 1997).
Вопросы, связанные с глубинным культивированием различных микроорганизмов, рассматривались многими исследователями. Несмотря на это к настоящему времени технология крупномасштабного глубинно-суспензионного выращивания F. necrophorum с использованием дешевой питательной среды из непищевого сырья недостаточно изучена. Не определен компонентный состав питательной среды, недостаточно данных о влиянии качества посевного инокулята и углеводного субстрата на рост и размножение F. necrophorum в условиях глубинно-суспензионного культивирования.
Решение этих вопросов остается актуальной проблемой биологической науки и практики.
Цель и задачи исследований. Целью наших исследований явился поиск дешевой питательной среды и разработка оптимальных условий крупномасштабного культивирования F. necrophorum для получения биомассы и экзотоксина при производстве вакцины против некробактериоза.
В связи с этим перед нами были поставлены следующие задачи:
1. Изготовить питательную среду на основе ферментативного гидролизата непищевого сырья - маточно-плацентарно-эмбриональной массы крупного рогатого скота (ФГМПЭМ) - для культивирования Р. песгорЬогит и сравнительно изучить ее эффективность.
2. Разработать технологию глубинно-суспензионного способа культивирования Р. песгорЬогит изучив при этом влияние качества, количества посевного материала и углеводного субстрата на выход бакмассы и экзотоксина.
3. Изучить возможное влияние среды на основе ФГМПЭМ на культурально-морфологические и биологические свойства Р. песгорЬогит при выращивании глубинно-суспензионным способом.
4. Изготовить и испытать вакцину против некробактериоза с использованием биомассы и экзотоксина Р. песгорЬогит, полученных глубинно-суспензионным способом культивирования данного микроба в среде на основе ФГМПЭМ.
Научная новизна. Впервые разработана методика изготовления питательной среды на основе ферментативного гидролизата непищевого сырья - маточно-плацен гарно-эмбриональной массы крупного рогатого скота для выращивания Р. песгорЬогит.
Отработан глубинно-суспензионный способ культивирования Р. песгорЬогит в реакторных условиях и изучена при этом роль качества, количества посевного материала и углеводов (глюкозы) на рост и развитие данных бактерий.
Установлено, что глубинно-суспензионный способ культивирования Р. песгорЬогит в реакторных условиях в среде на основе ФГМПЭМ не изменяет свойства данных бактерий, а вакцина, изготовленная из биомассы и экзотоксина, полученных в этих условиях, не уступает по иммуногенности вакцине, изготовленной из биомассы и экзотоксина, полученных в бульоне Хоттингера.
Практическая значимость работы заключается в том, что разработанная нами питательная среда на основе ФГМПЭМ и отработанный режим крупномасштабного культивирования возбудителя некробактериоза в условиях биореактора значительно удешевляют получение биомассы экзотоксина Р. песгорЬогит при производстве высокоиммуногенной вакцины против некробактериоза животных.
Разработанные «Методические рекомендации по изготовлению питательной среды для культивирования возбудителя некробактериоза» (2005) одобрены Научно-методическим советом ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» и внедрены в технологию производства полиштаммовой формол-эмульсионной вакцины против некробактериоза животных.
Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены: на ежегодных заседаниях ученого совета ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (1999-2005); Республиканских научно-производственных конференциях (Казань): Международной научной конференции, посвященной 125-летию Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана (Казань, 1998); Юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ «Биотехнология. Ветеринария» (Киров, 1998); Всероссийской конференции молодых ученых «Молодые ученые - агропромышленному комплексу» (Казань); Международной научно-практической конференции «Ветеринарная биотехнология - настоящее и будущее (Щелково, 2004); Международного симпозиума посвященного 45 летию ФГУ «ФЦТРБ» (Казань, 2005). Основные положения, выносимые на защиту: -эффективность питательной среды, приготовленной на основе ферментативного гидролизата маточно-плацентарно-эмбриональной массы (ФГМПЭМ) для культивирования Б. песгорЬогит;
-оптимизация условий глубинного культивирования возбудителя некробактериоза с использованием питательной среды на основе ФГМПЭМ;
-культурально-морфологические и биологические свойства возбудителя некробактериоза при выращивании глубинно-суспензионным способом в среде на основе ФГМПЭМ;
-иммунологическая эффективность вакцины против некробактериоза рогатого скота, изготовленной из биомассы и экзотоксина, полученных при культивировании Б. песгорЬогиш в питательной среде на основе ФГМПЭМ глубинно-суспензионным способом.
Публикация. По материалам диссертации опубликованы 11 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 110 стр. Состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений. Иллюстрирована 15 таблицами. Список использованной литературы включает 183 источников, в том числе 39 иностранных.
Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Сабирова, Валентина Васильевна
ВЫВОДЫ
1. Разработана технология изготовления дешевой питательной среды на основе ферментативного гидролизата непищевого сырья - маточно-плацентарно-эмбриональной массы крупного рогатого скота для культивирования Б. песгорЬогит в стационарным и глубинно-суспензионным способами с целью первичного выделения и наработки бактериальной массы и экзотоксина для производства вакцины против некробактериоза сельскохозяйственных животных.
2. Питательная среда, изготовленная на основе ФГМПЭМ, по эффективности выхода бактериальной массы и экзотоксина Б. песгорЬогит в культуральной жидкости не уступает бульону Хоттингера, получаемой с использованием гидролизата из мышечной ткани и не оказывает отрицательного влияния на культурально-морфологические, биохимические, антигенные, вирулентные и иммуногенные свойства этих микроорганизмов при стационарном и глубинно-суспензионном способах культивирования в условиях биореактора.
3. Разработанные оптимальные условия глубинно-суспензионного культивирования Р. песгорЬогит в больших объемах обеспечивают выход бактериальной массы до 15,6±0,18 млрд.м.к./мл и накопление внеклеточных белков в культуральной жидкости до 13,00±0,27 мг/мл.
4. Рост культуры и выход биомассы Б. песгорЬогит значительно стимулируются углеводами и оптимальной является дробное (двукратное) добавление глюкозы при глубинно-суспензионном культивировании из расчета 0,2 и 0,7% с интервалом 5-6 часов к общему объему питательной среды.
5. Полиштаммовая формол-эмульсионная вакцина, изготовленная из биомассы и экзотоксина, полученных в среде на основе ФГМПЭМ глубинно-суспензионным способом культивирования Б. пссгорЬогит, обладала высоким антигенным и иммуногенным свойствами.
Эти свойства вакцины подтверждены в опытах на лабораторных животных и при испытании на крупном рогатом скоте в производственных условиях. Случаев заболевания некробактериозом вакцинированного скота не наблюдалось, в тоже время среди не вакцинированных заболели 8% коров.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Для первичного выделения, пересевов и наработки бактериальной массы некробактерий рекомендуется дешевая питательная среда на основе ферментативного гидролизата маточно-плацентарно-эмбриональной массы крупного рогатого скота приготовленная согласно «Методической рекомендации по её изготовлению.», гидролизата одобренной научно-методическим советом ФГУ ФЦТРБ и утвержденной директором института.
2. Для получения большого объема бактериальной массы с целью изготовления вакцины против некробактериоза рекомендуется режим глубинно-суспензионного способа культивирования Б. песгорИогит в реакторах различного объема с использованием жидкой питательной среды на основе ФГМПЭМ.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сабирова, Валентина Васильевна, Казань
1. Абрамов, Д.В. Технология гидролизатов сывороточных белков молока для ветеринарных целей, их физико-химические и биологические свойства./Д.В. Абрамов// Автореферат. дис. канд. биол. наук. М., 1990, -24с.
2. Акимов, Е.К. Методическая рекомендация по оценке поствакцинального иммунитета и диагностики некробактериоза животных /Е.К. Акимов, Х.Н. Макаев, ДА. Хузин //-Казань, 1998. -7с.
3. Акимов, Е.К. Оценка уровня специфических антител против некробактериоза в сыворотках крови иммунизированных животных /Е.К. Акимов, Х.Н. Макаев, Д.А. Хузин //Ученые записки КВИ. Казань, 2003.-Т.174,- С.22-26.
4. Акимов, Е.К. Сравнительная оценка методов выявления антител при некробактериозе животных /Е.К. Акимов, Х.Н. Макаев, Д.А. Хузин //Ветеринария, -2005.- № 1.- С.28-29.
5. Алимов, A.M. Изучение аминокислотного состава питательной среды при глубинном культивировании вакцинного штамма листерий АУФ /A.M. Алимов //Ученые записки КВИ. -Казань, 1972. -Т.113. С. 93-97.
6. Алимов, A.M. Сравнительная оценка питательных сред при культивировании вакцинного штамма листерий АУФ /A.M. Алимов, O.A. Котылев //Ученые записки КГВИ, 1975. Т. 119. -С. 158-162.
7. Анакина, Ю.Г. Болезни конечностей рогатого скота в условиях интенсивной технологии (обзор). /Ю.Г. Анакина//-М., 1988. -С50-54.
8. Антонов, Б.И. Лабораторные исследования в ветеринарии. Бактериальные инфекции. /Б.И. Антонов //Справочник. -М., Агропромиздат, 1986, -352с.
9. Аристовская, Т.В. Новая питательная среда из горохового автолизата для выращивания дизентерийных бактерий. /Т.В. Аристовская, Н.И. Шапиро //Материалы по обмену опытом. М., -1954, -№1. -С.44-47.
10. Артеменко, В.Л. Использование экспериментально-анаметического метода для балансировки жидких питательных сред для роста и токсинообразования /В.Л. Артеменко, Л.Г. Иванова, В.П. Кенашев //ЖМЭИ, 1985.-№11. -С. 37-40.
11. Аткинсон, Б. Биохимические реакторы /Б. Аткинсон// Л.: Пищ. пром., 1979. -280с.
12. Балабанов, В.А. Некробактериоз животных./В.А. Балабанов// Л., 1971. -136с.
13. Баснакьян, И. А. Патология и физиология микробов. Усовершенствование технологии культивирования /И.А. Баснакьян //Микробиология, 1982. -№12. -С. 28-33.
14. Баснакьян, И.А. Оптимизация культивирования микроорганизмов в иммунобиотехнологии /И.А. Баснакьян //Микробиология, 1989. -№5. -С. 9096.
15. Баснакьян, И.А. Классификация процессов культивирования микроорганизмов /И.А. Баснакьян, В.М. Боровкова, Л.Н. Запорожцев //Тр. Моск. науч.-исслед. ин-та вакцин и сывороток им. Мечникова. М.,1981. -С. 5-17.
16. Баснакьян, И.А. Морфологические особенности в сопоставлении с физиолого-биохимическими закономерностями жизнедеятельности микроорганизмов при периодическом и непрерывном культивировании /И.А. Баснакьян, Г.П. Дубинина//Микробиология, 1974. -№7. -С. 3-8.
17. Баснакьян, И.А. Морфологические особенности в сопоставлении с физиологически-биохимическими закономерностями жизнедеятельности микроорганизмов при периодическом и непрерывном культивировании /И. А. Баснакьян, Г.П. Дубинина//ЖМЭИ, 1974. -№7. -С. 3-7.
18. Бекер, М.Е. Введение в биотехнологиию. /М.Е. Бекер//- М., 1978. -С.7-23.
19. Бирюков, В.В. Оптимизация периодических процессов культивирования микроорганизмов. /В.В. Бирюков, В.М. Каптере //- Л.: -Наука, 1985.-С. 215-292.
20. Благовещенский, В.А. Метод концентрации и очистки анатоксинов регйг^еш, приготовленных на казеиновых средах. /В.А. Благовещенский, Л.Я. Мармалевская, А.Н. Кузьмина //Материалы по обмену опытом. М., 1960.-2/58.-С.68-75.
21. Богачева, Р.И. М-Концентрация бактерий Флекснера в процессе глубинного выращивания /Р.И. Богачева, В.Б Алферова //Микробиология и эпидемиология бактериальных и вирусных болезней в Узбекистане. -Ташкент, 1959. -С. 73-76.
22. Бондаренко, Д.Н. Болезни конечностей у крупного рогатого скота в животноводческих комплексах /Д.Н. Бондаренко //Диагностика ипрофилактика болезней животных в молочных комплексах Омской области. /Учеб.пособ. -Омск, 1980. -С. 51-59.
23. Борисова, Л.М. Влияние различных источников углевода на рост и размножение бактерий некроза /Л.М. Борисова //Сибирский вест. с.-х. науки, 1976. -№5. -С. 82-84.
24. Братюха, С.И. Об этиологии и патогенезе заболеваний конечностей крупного рогатого скота при откорме в специализированных хозяйствах / С.И. Братюха, //Болезни конечностей с.-х. животных. М., 1988. -С. 26-30.
25. Вейсман, И.Ш. Предпосылки комплексной оценки физиологического состояния бактерий и их популяция /И.Ш. Вейсман //Микробиология, 1984. -№4. -С. 3-8.
26. Вершаков, Д.С. Приборы для культивирования микроорганизмов /Д.С. Вершаков, Е.А. Сидоров, Б.В. Нестеров //В. сб. «Биофиз. микробов и биоинженерия». -М., 1976.-С. 101-108.
27. Виестур, У.Е. Технологические реализации процессов ферментации./У.Е. Виестур, М.Ж. Кристансонс//- М., 1977.-С. 109-110.
28. Виестур, У.Е. Культивирование микроорганизмов./ У.Е. Виестур, М.Ж. Кристапсонс, Е.С. Былинкина // Л.: Пищевая промышленность, -1980. -231с.
29. Винник, А.Л. Питательная среда для выделения и культивирования пневмококков /А.Л. Винник, А.К. Баргина, З.И. Ершова //ЖМЭИ, -1985. -№8.-С. 19-21.
30. Виноградова, И.Н. Использование протеолитических ферментов плесневых грибов в производстве питательных сред для глубинного выращивания /И.Н. Виноградова //Научные основы производства вакцин и сывороток. М., 1955. -С. 83-87.
31. Виноградова, И.Н. Новые питательные среды и их применение в производстве бактериальных препаратов /И.Н. Виноградова //Проблемы эпидемиологии и микробиологии. М., -1959. -№2. -С. 141-152.
32. Власова, В.Е. Получение анатоксина Cl. ocdematiens на питательной среде из гидролизата казеина и изучение его антигенных и иммуногенных свойств /В.Е. Власова, И.Н. Виноградова, H.A. Палкина //Микробиология, -1960. -Ж. -С. 108-114.
33. Волик, Е.К. Глубинный способ выращивания бактериальных культур для получения биопрепаратов /Е.К. Волик, В.А. Плотникова //Труды н.-контр., ин-та ветеринарных препаратов. -М., -1954. -№3, -С. 241-250.
34. Волкова, A.A. Некробактериоз /A.A. Волкова //Вет. энциклопедия, -1973 -Т.4.-С.394-402.
35. Волкова, A.A. Материалы к эпизоотологии некробациллеза овец в Киргизии /A.A. Волкова, P.C. Галиева //Известия АН Киргизской ССР, серия Биологические науки. Фрунзе, -1962. -Т. 4,.- Вып. 5.
36. Волкова, A.A. Обследование здоровых овец на носительство бактерий некроза /A.A. Волкова, P.C. Галиева //Инфекционные болезни животных и вопросы природной ачаговости. Фрунзе, -1965. -С. 47-60.
37. Волкова, A.A. Чувствительность бактерии некроза к различным антибиотикам /A.A. Волкова, P.C. Галиева, В.Г.Стародубцев //Инфекционные болезни животных и вопросы природной ачаговости. Фрунзе, -1965. -С. 89-96.
38. Воронкина, И.М. Казеиновая среда для дизентерийного бактериофага /И.М. Воронкина //Сб. тр. Горьковского ин-та эпидемиол. и гигиены. -Горький, -1959. -№4. -С. 125-128.
39. Воскресенский, Г.В. Антигенные и иммуногенные свойства стафилококковых анатоксинов, приготовленных на мясных и казеиновых средах /Г.В. Воскресенский, З.И. Лебедева//Микробиология, -1958. -№9. -С. 16-20.
40. Выгодчиков, Г.В. Комбинированные препараты для активной профилактики раневых инфекций /Г.В. Выгодчиков //Проблемы эпидемиол. и микробиол. -М., -1959. -№2. -С. 3-13.
41. Галиев, P.C. Вирулентность штаммов бактерий некроза, выделенных из разных объектов /P.C. Галиев //Природная очаговость и инфекционные болезни овец Фрунзе, -1972. -С. 77-84.
42. Галиуллина, Э.Р. Ростовые свойства ГПЭМ для различных штаммов бруцелл /Э.Р. Галиуллина, Р.Я. Гильмутдинов, A.M. Фомин // Матер.Всерос. научно-практич.конф. по акт.проблемам Агропром. Комплекса. -Казань. -2004. -4.1. -С.26-27.
43. Геккер, В.Д. Применение синтетических сред для приготовления кишечных вакцин /В.Д. Геккер, A.B. Яковлева //Вопросы активной иммунизации против кишечной инфекции. М., -1955. -С. 9-20.
44. Герна, Р. Хранение микроорганизмов /Р. Герна //Методы общей бактериологии-М.: Мир, -1983. -Т. 1. -С. 512-534.
45. Глебов, Н.Х. К вопросу о выявлении «фактора распространения» (гиалуронидазы) у В. necrophorum /Н.Х. Глебов //Ученые записки КГВИ, -1957. -Т. 65.-С. 219-223.
46. Глизман, М.П. Среды для получения сильного столбнячного токсина /М.П. Глизман, М.П. Червяков, Г.М. Старобинец //Тр. Мечниковского института, -1935. -Т. 1. -№2. -С. 379-380.
47. Голубева, И.В. Энтеробактерии: (Руководство для врачей). /И.В. Голубева, В.А. Килессо, Б.С. Киселева //- Д.: Медицина, -1985. -321с.
48. Грачева, И.М. В кн.: Технология ферментных препаратов /И.М. Грачева // -М., -1987. -С. 13-19.
49. Грубер, И.М. Кинетика процессов периодического культивирования Streptococcus pneumonede в зависимости от физиологического состояния посевной культуры /И.М. Грубер, Л.Г. Жданова, В.Ф. Нисалевич, И.Д. Горбачев //ЖМЭИ, -1986. -№2. -С. 3-8.
50. Грубер, И.М. Кинетика процессов периодического культивирования в зависимости от физиологического состояния посевной культуры /И.М. Грубер, Л.Г. Жданова, В.Ф. Нисилева //Микробиология, -1986. -№2. -С.3-7.
51. Дерябина, Л.А. Плацента человека как перспективный источник для получения белковых гидролизатов. /Л.А. Дерябина // Автореф. дис. канд. мед. наук. Рига, 1971, -22с.
52. Джавец, Э. Руководство по медицинской микробиологии. /Э. Джавец, Д.Л. Мельник, Э.А. Эйдельберг //- М.: Медицина, 1982. -С. 366-368.
53. Дубинина, Г.П. Особенности морфологии и инфраструктуры тифозных бактерий в условиях лимита и избытка глюкозы /Т.П. Дубинина, И.А. Баснакьян, Н.В. Волкова//Микробиология, 1979. -№8. -С. 20-26.
54. Елинов, Н.П. Химическая микробиология. /Н.П. Блинов // Л.: Высшая школа, 1989, -447с.
55. Жданова, Л.Г. Непрерывное культивирование патогенных микроорганизмов /Л.Г. Жданов, И.М. Грубер //ЖМЭИ, 1973. -№4. -С. 92-97.
56. Заерко, В.И. Производство живых вакцин против сальмонеллеза животных на питательных средах из непищевого сырья. /В.И. Заерко// Автореферат дис. канд. вет. наук. М., 1996, -18с.
57. Замуховская, А.Н. Биологические свойства микробов кишечной группы при выращивании в жидкой среде с аэрацией /А.Н. Замуховская, A.C.
58. Нечаева, JI.A. Шварцман //Научные основы производства вакцин и сывороток. М., 1955. -С. 5-23.
59. Звягин, И.В. Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов /И.В. Звягин //Экспресс-информ. Всесоюз. науч. иссл. и техн. ин-та биол. пром., 1978. -Вып. 7. -С.3-6.
60. Иерусалимский, Н.Д. Основы физиологии микробов /Н.Д. Иерусалимский //- М.: Из-во АН СССР, 1963. -С. 242-244.
61. Имшенецкий, A.A. Возможность обнаружения «нуклеотидов» в клетках бактерий в зависимости от возраста их культур /A.A. Имшенецкий, Г.К. Жильцов //Микробиология, 1965. -Т. 34. -С. 305-312.
62. Кадымов, P.A. Некробактериоз овец (этиология, клиника, лечение) /P.A. Кадымов, Э.М. Агаева//Ветеринария, 1984. -Вып.1. -№12. -С. 32-34.
63. Какоуллин, Т.Е. Некробактериоз крупного рогатого скота /Т.Е. Какоуллин, Ц. Лудыпов //Эпизоотология, диагностика, профилактика и меры борьбы с болезнями животных. Новосибирск, 1997. -С. 115-116.
64. Калашник, И.А. Заболевания копытец у коров, содержащихся на комплексах по производству молока /И.А. Калашник, Б.Л. Передера, Л.И. Юрченко //Совершенствование мер борьбы с болезнями мелкого и крупного рогатого скота. Харьков, 1983. -Т. 296. -С. 10-13.
65. Камалов, Г.Х. Получение чистых культур некробактериоза крупного рогатого скота /Г.Х. Камалов, И.И. Алексеева, Д.А. Хузин //Тезисы докл. Респ. науч.-произв. конференции. Казань, 1991. -С. 29-31.
66. Кашинцева, Н.С. Изучение столбнячных токсинов и анатоксинов, полученных на казеиновых средах /Н.С. Кашинцева, Е.А. Гилыут, И.В. Буланова//Микробиология, 1957. -№4.-С. 10-14.
67. Кириллова, В.В. Токсичность и иммуногенность производственных штаммов salmonella typhimurium, выращенных в реакторе /В.В. Кириллова //Тр. Всесоюз. гос. научн.-контр. нн-та ветпрепаратов, 1978. -Т. 27. -С. 57-60.
68. Ковалева, Н.И. Экспериментальное обоснование технологии производства кишечных вакцин, приготовленных из бактерий, выращенных на синтетических средах в глубинных культурах с аэрацией. /Н.И. Ковалева // -Дис. док. мед. наук. М., 1958. -209с.
69. Ковалева, Н.И. Динамика потребления питательных веществ бактериями кишечной группы в процессе роста на синтетической среде в условиях аэрации /Н.И. Ковалева, А.Г. Кузьмина //Вопросы активной иммунизации против кишечных инфекций. М., 1955. -С. 41-57.
70. Ковалева, Н.И. Закономерности размножения бактерий кишечно-тифозной группы на синтетических средах в глубинных культурах с аэрацией /Н.И. Ковалева, A.B. Яковлева//Микробиология, 1960. -№6, -С. 31-34.
71. Коваленко, Я.Р. Некробациллез с.-х. животных. /Я.Р. Коваленко //- Л.: -1948.-271с.
72. Коваленко, Я.Р. Некробациллез /Я.Р. Коваленко //Анаэробные инфекции с.-х. животных. -М., 1954.-С. 167-222.
73. Кондратьева, О.В. К изучению питательных потребностей бруцелл /О.В. Кондратьева, В.М. Степанов //Сооб. 1. в сб. «Микробиология и иммунология особо опасных инфекций», Саратов, 1968, -3. -С. 335-337.
74. Коротеева, Л.А. Питательные среды на основе ферментативного казеиново-дрожжевого гидролизата (ФКДГ) для культивирования вакцинных штаммов колибактерий и пастерелл /Л.А. Коротеева //Автореферат, дисс. канд. биол. наук. -Л.: 1984, -22с.
75. Котов, Б.Г. Изучение свободных внутриклеточных аминокислот и аминокислотного состава белка у штамма Aspergillus usamii /Б.Г. Котов, С.А. Коновалов, А.К. Овчаров //Микробиология, 1965. -Т. 34. -В 6. -С. 952-955.
76. Кузнецова, Т.Н. Оптимизация периодического процесса культивирования Pseudomonas aeraginosa с целью получения экзотоксина /Т.Н. Кузнецова, H.A. Михайлова, И.А. Баснакьян //ЖМЭИ, 1991. -№6. -С. 22-25.
77. Лабораторные методы диагностики некробактериоза с.-х. животных (Метод, рекомендации) //НИИСХ Крайнего Севера. Новосибирск, 1987. -42с.
78. Лайшев, А.Х. К вопросу о токсинах некрозной палочки /А.Х. Лайшев, А.Г. Маслухина //Тр. НИИСХ Крайнего Севера. Якутск, 1966. -Т. 13. -С. 33-35.
79. Лебедев, Н.Е. Новые методы выращивания микроорганизмов и изготовление бактериальных препаратов. /Н.Е. Лебедев //Автореф. дис. докт. наук, 1950. -18с.
80. Лозицкая, Н.Д. Методы консервации бактерий Pseudomonas denitrificans /Н.Д. Лозицкая // Тез. докл. конф. мол. ученых. Рига, 1987. -С. 138-141.
81. Макаев, Х.Н. Разработка средств диагностики, лечения и профилактики некробактериоза крупного рогатого скота /Х.Н. Макаев, Д.А. Хузин, Е.К. Акимов, Д.И. Александров, В.В. Сабирова //Тр. II съезда ветер, врачей РТ -Казань, 2001. -С. 152-154.
82. Мамлеева, Н.К. Эффективная питательная среда для индикации 2 эрогенной микрофлоры. /Н.К. Мамлеева, С.Х. Хаертынов //Сб. научн. трудов и методы борьбы с туберкулезом животных. (Вет. институт) -Казань. -1985. -С.43-46.
83. Маслухина, А.Г. Бактерионосительство при некробактериозе северных оленей /А.Г. Маслухина // Ветеринария, 1972. -№10. -С. 70-71.
84. Матвеев, К.И. Ботулизм. /К.И. Матвеев //-Л.: Медгиз, 1959. -150с.
85. Машилова, Г.М. Оптимизация процесса культивирования бактерий рода «Провиденция» и изучение антигенной активности культур /Г.М. Машилова, Л.А. Левина, В.П. Рагинская //Тр. Моск. науч.-исслед. ин-та вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, 1981. -С. 25-39.
86. Мельникова, В.А. Патология и физиология микробов /В.А. Мельникова, И.А. Баснакьян, Т.К. Рыжникова //Сообщение 3. Критерии оценки функциональных состояний //Микробиология, 1984. -№1. -С. 42-46.
87. Меньшенин, В.В. Питательная среда для промышленного культивирования F. necrophorum /В.В. Меньшенин, Е.Г. Ловченко, О.И. Соломаха//Ветеринария, 1997. -№3. -С. 27-28.
88. Нечаева, A.C. Усвоение микробами кишечной группы питательных веществ в процессе выращивания с аэрацией и накопление ими антигена /A.C. Нечаева, А.К. Варгина //Поливакцины. М., 1956. -С. 294-310.
89. Никитин, Е.Е. Замораживание и высушивание биологических препаратов. /Е.Е. Никитин, И.В. Звягин //- Л.: Колос, -1971. -343с.
90. Панкова, Г.Е. Испытание ростовых свойств питательных сред и биологически активных компонентов отечественного производства для культур клеток /Г.Е. Панкова, Л.П. Дьяконов //Труды ВИЭВ, 1981. -Т. 53. -С. 78-81.
91. Перт, С.Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. /С.Д. Перт//-Л.: Мир, 1978. -332с.
92. Петрович, C.B. Влияние возраста культур и концентрации спор дерматофитов на устойчивость к высушиванию. /C.B. Петрович, О.Г.
93. Утмелидзе //Бюл. Всесоюз. ин-та эксп. Ветеринарии, 1981. -Вып. 42. -С. 2526.
94. Пилипенко, А.А. Морфологические и физиологические особенности возбудителя некробактериоза северных оленей /А.А. Пилипенко, J1.M. Борисова, Б.В. Маслухина //Вестник с.-х. науки, 1972. -№2. -С. 66-69.
95. Писаренко, Н.И. Подбор и изучение изменений питательных сред в процессе роста бактерий некроза /Н.И. Писаренко, А.А. Козенкова, В.П. Шишова //Доклады ВАСХНИЛ, 1973.-№10.-С. 35-37.
96. Поляченко, В.М. Конструирование питательной среды для бактерий рода Haemophilus продуцентов рестрактирующих эндонуклеотид /В.М. Поляченко, В.А. Мельникова, И.М. Грубер, Г.А. Смирнова, Б.М. Раскин //ЖМЭИ, 1988. -№3. -С. 3-8.
97. Прокофьева, Г.И. Опыт основания глубинного производства вакцин /Г.И. Прокофьева //Сб. трудов Горьковского ин-та эпидемиол. и гигиены. -Горький, 1959. -№3, -С.3-16.
98. Работнова, И.Л. Об изучении физиологического состояния исследуемых микроорганизмов /И.Л. Работнова //Микробиология, 1980. -Т.49., -Вып. 4. -С. 634-638.
99. Работнова, И.Л. Проблемы культивирования микроорганизмов в СССР за 60 лет /И.Л. Работнова//Микробиология, 1977. -С. 46-48.
100. Работнова, И.Л. Теория и практика непрерывного культивирования. /И.Л. Работнова, //Сборник, М., 1980. -С. 220-222.
101. Равилов, А.З. Микробиологические среды. /А.З. Равилов, Р.Я. Гильмутдинов, М.Ш. Хусаинов //Л.: Казань: ФЭН, 1999. -398с.
102. Ревнивых, А.Г. Копытная болезнь северного оленя и ее возбудитель //Сб. по оленеводству, тундровой ветеринарии и зоотехнии. /А.Г. Ревнивых //-М., 1932.-С. 209-233.
103. Ревнивых, А.Г. Этиология так называемой «копытной болезни» северных оленей /А.Г. Ревнивых //Совет, ветеринария, 1935. -№8. -С. 18-24.
104. Рынков, P.C. Биотехнология перспективы /P.C. Рынков, В.Г. Попов //Биотехнология. - М., 1984. -С. 13-20.
105. Самоловов, A.A. Диагностическая ценность культурально-биологических свойств F. necrophorum /A.A. Самоловов //Диагностика болезней животных и профилактика их на фермах и комплексах. -Новосибирск, 1984. -С. 53-58.
106. Самоловов, A.A. Среда для культивирования возбудителя некробактериоза /A.A. Самоловов //Ветеринария, 1985. -№3. -С. 68-69.
107. Самоловов, A.A. F. necrophorum: морфологические, биологические свойства, классификация /A.A. Самоловов //Научное обеспечение ветеринарных проблем в животноводстве. Новосибирск, 1999. -С. 399-406.
108. Самоловов, A.A. Некробактериоз животных. /A.A. Самоловов //Л.: Новосибирск, 1993. -128с.
109. Самоловов, A.A. Некробактериоз крупного рогатого скота (эпизоотология, диагностика и меры борьбы) /A.A. Самоловов //Авт. дис. докт. вет. наук. -Новосибирск, 1991. -24с.
110. Самоловов, A.A. Современный взгляд на проблему некробактериоза крупного рогатого скота /A.A. Самоловов //Актуальные вопросы ветеринарной медицины в России. Новосибирск, 1998. -С. 320-325.
111. Самоловов, A.A. Лечение крупного рогатого скота при разных стадиях некробактериозного процесса. /A.A. Самоловов, С.В. Лопатин, В.А. Цурбанов //Эпизоотология, диагностика, профилактика и меры борьбы с болезнями животных. Новосибирск, 1997.-С. 122-124.
112. Сидоров, М.А. Определитель зоопатогенных микроорганизмов. /М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, В.Б. Фезотов //-Л.: Колос, 1995. -320с.
113. Сидорчук, A.A. Комплекс мероприятий при некробактериозе крупного рогатого скота /A.A. Сидорчук, С.Д. Панасюк //Ветеринария, 1994. -№1. -С.12-15.
114. Соломаха, О.И. Некоторые морфологические особенности F. necrophorum /О.И. Соломаха//Аграр. Россия, 2000. -№3. -С. 59-61.
115. Соломаха, О.И. Серологическая идентификация В. necrophorum и обнаружение антител к ним в сыворотках крови северных оленей иммунофлуоресцентным методом /О.И. Соломаха //Автореф. дис. канд. вет. наук.-1973.-17с.
116. Соломаха, О.И. Получение люминесцирующих сывороток против Bacterium necrophorum /О.И. Соломаха //Тр. НИИ сел. х-ва Крайнего Севера, 1974. -Т. 20. -С. 88-90.
117. Сосов, В.Д. Эпизоотология. /В.Д. Сосов, Р. Ведерников //- JL: Колос,1969.-369с.
118. Студенцов, А.П. Ветеринарное акушерство и гинекология. /А.П. Студенцов, B.C. Шипилов, А.Г. Субботина, О.Н. Преображенский //- Л.: Агропромиздат, 1986, -480с.
119. Тарасов, В.Н. Итоги науки и техники. Аппаратура для культуральнотехнических процессов в микробиологии /В.Н. Тарасов //Серия микробиология.-Л.: 1984.-Т. 14.-305с.
120. Татаренко, И.Ф. Влияние условий культивирования на размножение брюшно-тифозной палочки /И.Ф. Татаренко //Вопросы эпидемиологии и микробиологии кишечных инфекций. Киев, 1960. -С. 80-82.
121. Темишевская, Л.Я. Белковые гидролизаты. /Л.Я. Темишевская //- Л.: -2000. -295с.
122. Тетерина, З.В. Ультраструктура клеток вакцинных штаммов бруцелла абортус 19 в динамике роста /З.В. Тетерина //Вестник с/х наук.- Алма-Ата,1970. -№3.-С.55-56.
123. Тириков, И.Г. Оптимизация лечебно-профилактических мероприятий при некробактериозе крупного рогатого скота /И.Г. Тириков //Авт.дис. .канд. вет. наук. -Новосибирск, 1996. -18с.
124. Торанюк, З.Е. Производство холерной вакцины глубинным методом /З.Е. Торанюк // Автореф. дис. канд. мед. наук Горький, 1959, -18с.
125. Федосеев, К.Г. Физические основы и аппараты микробного синтеза биологически активных соединений. /К.Г. Федосеев //- М.: Медицина, 1977. -С. 303-307.
126. Хаертынов, С.Х. Использование непищевых белков для приготовления бактериологических питательных сред /С.Х. Хаертынов, Н.К. Мамлеева, В.А. Никитина //Ученые записки КГВИ. -1976. -Т.122. -С.166-169.
127. Хаертынов, С.Х. Новые бактериологические и питательные среды для культивирования микроорганизмов. / С.Х. Хаертынов, В.А. Никитина, М.П. Торбина //- Казань, 1991, -С.22-24.
128. Хватов, Б.П. Строение и физиологические изменения половой системы самок домашних животных. /Б.П. Хватов //Л.:- Симферополь, 1955, -53с.
129. Хузин, Д.А. Клиническая диагностика некробактериоза крупного рогатого скота /Д.А. Хузин //Тезисы докл. научн.-произв. конференции по проблемам ветер, и зоотехнии. Казань, 2001. -С. 101-102.
130. Хузин, Д.А. Определение иммунного статуса животных, вакцинированных против некробактериоза /Д.А. Хузин //Матер, науч.произв. конференции по проблемам ветер, и животноводства. Казань, 1997. -С. 272-274.
131. Хузин, Д.А. Кулыурально-морфологические и биологические свойства музейных штаммов и изолятов возбудителя некробактериоза /Д.А. Хузин, Г.Х. Камалов, Е.К. Акимов //Тезисы докл. Респ. научн.-производ. конференции. -Казань, 1997. -С. 274-276.
132. Шафоростова, Л.Д. Особенности роста периодической культуры Вас. Megaterium /Л.Д. Шафоростова//Микробиология, 1971. -40, -3. -С. 397-401.
133. Шафоростова, Л.Д. Неравномерный рост Е. coli при периодическом культивировании /Л.Д. Шафоростова, Э. Стейскалова, Э. Павлосова, Б. Бегал, С. Нечанова //Микробиология, 1975, -44. -С. 780-785.
134. Шептун, Н.Г. Биологические обоснования к получению и использованию гидролизатов фибрина и отходов производства препаратов иммуноглобулинов /Н.Г. Шептун // Автореф. дисс. канд. биол. наук. -Воронеж, 1989, -22с.
135. Шлегель, Г. Общая микробиология. /Г. Шлегель //- Л.: Мир, 1987. -567с.
136. Шмелева, Е.И. Перспективы изучения штаммов патогенных микроорганизмов, применяемых при производстве бактерийных препаратов /Е.И. Шмелева //Сб. тр. центр, науч.-исслед. ин-та вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, -М., -1987. -№14317. -С. 2-18.
137. Behrens, O.K. Pertussis vaccine preparation / O.K. Behrens, P.N. Ensminger //Patent №2. -USA. -1958. -V.l. "-P.167-178.
138. Berg, J.N. Studies of Fusobacterium necrophopum from bovine hepatic abscesses, biotypes, guantitation, virulence and antibiotic susceptibility / J.N. Berg, C.M. Scanlon //Am.J. Veter. Res., -1982. -V.43. № 9. -P. 1580-1586.
139. Berkhoff, C.A. Recovery and identification of anaerobes in veterinary medicine: a 2-year experience / C.A. Berkhoff //Veter. Microbial, -1977. -V.2. -№3. -P. 237-252.
140. Buchonon, R.E. Bergeys manual of determinative bacteriology Sth. Eg. / R.E. Buchonon, N.E. Cibbons // The Williams and wilkins Co., Baltimore 8-th ed., -1974.
141. Calkins, H.E. Isolation of Sphacrophorus necrophorum from bovine Liver abscesses / H.E. Calkins, L.H. Schrivner //Appl. Microbial., -1967. -№15. -P. 1492-1493.
142. Capcia, M.M. Characterization of endotoxin from Fusobacterium necrophopum / M.M. Capcia, K.M. Chariton, K.A. Me Kay //Infect. Immun, -1975. -V. 11. -№. 2. -P. 371-379.
143. Careia, M.M. A Satisfactory medium and technigue for the mass cultivation of sphaerophorus necrophorum / M.M. Careia, K.A. Me Kay //Canad.J. Microbiol, -1973.-V. 19.-P.396-398.
144. Dicker, D.T. Cell cycle changes in the biogant density of exponential -phase cells of Streptococcus faecium / D.T. Dicker, L. Higgins // J. Bacteriol, -1987. -Vol. 169. №3. -P. 1200-1204.
145. Dolezal, I. Physiological characteristics of chemostatically grown Cytobacter freundii as a function of the specific growth rate and type of nutrientlimitation /1. Dolezal, F. Kapralek //Folia Microbiol, -1976. -Vol.2. -№3. -P. 165-168.
146. Emery, D.L. Cultural characteristics and virulence of strains of Fusobacterium necrophopum isolated from the feet of cattle and sheep / D.L. Emery//Aust. Vet. J., -1985. -V.62. -№ 2. -P. 43-46.
147. Emery, D.L. Studies on the purification of the leucocidin of Fusobacterium necrophopum and its neutralization by specific anticera / D.L. Emery // Vet. Microbial, -1986. -V.ll. -№4. -P.357-372.
148. Fluas, J.M. Estimation de 1. etat physiologique des microorganisms dans un bioprocede / J.M. Fluas, A. Cherry, M.N. Pons //APII, -1990. -Vol. 23. -№3. -P.221-220.
149. Hottinger, R. Nachpruefung und kritik der ueblichen Bouillonbereitung / R. Hottinger. //Zbe. Bakt., -1913. -1. -V. 67. -№3-9. 178-206.
150. Johansen, E. Survival of 1. bifidus after treezedrying / E. Johansen //Appl. Bact., -1972. -Vol.35. -№3. -P. 415-421.
151. Kanoe, M. Bacteriology of bowine hepatic adscesses. / M. Kanoe, H. Imagawa, M. Toda, A. Sato //Nippon Juigaku Zasshi, -1976. -V. 38. -№3. -P. 263268.
152. Kuesera, C.J. Developmen of a chemically altered pasteurella multocida vaccina. atrain./C.J. Kuesera, J.C. Wong, R.L. Eis//Am. J. Vet. Res., -1981. Vol. 42. -№8. -P.1389-1394.
153. Kussovsky, V.K. Investigation into phagocytosis sensitivity of certain salmonellae, depending on the phase development of the culture in vitro. / V.K. Kussovsky, D.K. Veljanov //Докл. A.H. Болг., -1985. -Vol. 38. -№10. -P. 13631365.
154. Langworth, B.L. Fusobacterium necrophopum its characteristics and role as an animal pathogen / B.L. Langworth //Bacteriological Reviewes, -1977. Vol.41. -№2. -P. 373-390.
155. Lnoul, T. Chemical and biological properties of lippopolysaceharides from Fusobacterium necrophopum biovar A and biovar B strans / T. Lnoul //NIPPON Juigaku Zasshi, -1985, -V. 47. -№4. -P. 639-645.
156. Nakagaki, M. Partial characterization of Fusobacterium necrophopum protease./ M. Nakagaki //Nicrobios, -1991. -V 66. -№627. -P. 117-123.
157. Narayanau, S. Ribotyping to compare Fusobacterium necrophopum isolates from bovine liver abscesses, ruminal walls and ruminal contains./ S. Narayanau // Appl. Environ. Microbiol, -1997. -V. 63. -№ 12. -P. 4671-4678.
158. Roberts, D.S. The pathogenic synergy of Fusobacterium necrophopum and Coiynebacterium pyogenes. I. Influence of the leucocidal exotoxin of Fusobacterium necrophopum. / D.S. Roberts //Br. J. Exp. Pathol, -1967. -№48. -P. 665-673.
159. Robertson, D.S. Clucose catabolism of Erysipelothrix rhusiopatiae / D.S. Robertson, W.C. Mecullough //J. of Bacteriology, -1968. -Vol. 95. -№6. -P. 2112-2116.
160. Scanlan, C.M. Comparatiwe in vitro leukotoxin production of three bowine strains of Fusobacterium necrophopum / C.M. Scanlan, J.N. Derg, W.H. Fales. // Am. J. Vet -1982. Res.43: -P.1329-1333.
161. Scanlon, C.M. Experimental hepatic necrobacillosis infection in cattle / C.M. Scanlon // Cornel Vet., -1983. -V. 73. -№ 2. -P.l 17-124.
162. Scanlan, C.M. Bovine rumenitis Liver abscess complex: a bacteriological review. / C.M. Scanlan //Cornell Vet., -1983. V. 73. -№3. -P. 288-297.
163. Scanlon, C.M. Comparative biological features of a rat liver abscess model induced wifh three Fusobacterium necrophopum strains / C.M. Scanlon //Am, J. Vet. Res., -1983. -V.44. -№9. -P. 1789-1792.
164. Schechata, T.E. Effect of nutrient concentration on the growth of Escherichia coli / T.E. Schechata, A.C. Marr //J. Bacterial, -1971. -Vol. 107. -№1.-P. 210-216.
165. Shinjo, Т. Physiological and biochemical chauacteristics of Fusobacterium necrophopum biovar A and biovar В strains and their deoxyribonucleic acid homology./ T. Shinjo, S. Miyzato, C. Kaneuchi //Japan. J. Veter. Sc., -1981. -V. 43. -№ 2. -P.233-341.
166. Shinjo, T. S. Stability of hemagglutinating and hemolytic activities in Fusobacterium necrophopum biovar A. strains. / T.S. Shinjo // Nippon Juigaku Zasshi, -1986 -V. 48. -№3. -P. 603-604.
167. Shinjo, T. Abherence of Fusobacterium necrophopum biovar A and В strains to erythrocytes and tissue culture cells / T. Shinjo // Ann. Inst Pasteur. Nicrobiol., -1988. -V. 139. -№4. -P. 453-460.
168. Shinjo, T. Recognition of biovar cof Fusobacterium necrophopum (Flugge) Moore and Holdeman as Fusobacterium pseudnecrophorum sp. nov., rev. (ex. Prevot 1940). / T. Shinjo //Lnt J. Syst. Bacterial, -1990. -V. 40. -№1. -P. 71-73.
169. Simon, P.C. Cultivation and maintenance anaerobie medium for aerobic incubation. / P.C. Simon //Canad. J. Сотр. Med., -1974. -V.38. -Jan. -P. 94-96.
170. Simon, P.C. A simple method for rapid identification of Sphacrophorum necrophorus isolates / P.C. Simon //Canad. J. Сотр. Med., -1975. -V. 39. -№3. -P. 349-353.
171. Smith, G.R. The prevalence of Fusobacterium necrophopum biovar A in animal faeces. / G.R. Smith //Epidemiol. Infect., -1993. -V. 110. -№2. -P. 327331.
172. Turowsky, G. Аэрированная глубинная культура hemophilus pertussis в применении к продукции вакцины / G. Turowsky, В. Kusiak //Med. Doswiadczalna I Mikrobiol., -1959. -V. 10. -P. 4. -P. 493-499.
173. Vrana, D. Age related changes in the physiological state of budding yeast cells / Vrana D., J. Votruba, J. Placek //Exp. Cell. Res., -1982. -Vol. 138. -№ 1. -P. 57-62.
-
Сабирова, Валентина Васильевна
-
кандидата биологических наук
-
Казань, 2007
-
ВАК 03.00.07
- Геномный полиморфизм Fusobacterium Necrophorum и оптимизация гнездовой ПЦР с целью усовершенствования диагностики некробактериоза животных
- Разработка промышленной технологии производства эритроцитарного антигена и экспресс-метода диагностики некробактериоза крупного рогатого скота
- Усовершенствование промышленной технологии производства инактивированной эмульгированной вакцины против некробактериоза животных
- Изыскание и разработка средств лечения крупного рогатого скота при некробактериозе
- Специфическая профилактика инфекционного баланопостита откормочных бычков смешанной этиологии
