Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка новых методов экспериментальной химиотерапии ларвальных эхинококкозов

ВАК РФ 03.02.11, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Разработка новых методов экспериментальной химиотерапии ларвальных эхинококкозов"

Школяр Наталья Александровна

Разработка новых методов экспериментальной химиотерапии ларвальных эхинококкозов

03.02.11 - паразитология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

2 Ь сн:д 2015

Москва-2015

005558130

005558130

Работа выполнена в ГБОУ ВПО медицинский университет имени И.М. Российской Федерации

Первый Московский государственный Сеченова Министерства здравоохранения

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Коваленко Феликс Павлович

Официальные оппоненты:

Довгалёв Анатолий Семенович, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный врач РФ, академик Российской Академии медико-технических наук (РАМТН), заведующий кафедрой тропических и паразитарных болезней ГБОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Минздрава России

Твердохлебова Татьяна Ивановна, доктор медицинских наук, старший научный сотрудник, директор ФБУН "Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии" Роспотребнадзора

Ведущая организация: ФГБВОУ ВПО Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова Министерства обороны РФ

Защита диссертации состоится « О » 2015 года в /^ ^часов

на заседании диссертационного совета Д 208.040.12 при Первом МГМУ имени И.М. Сеченова (119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦМБ Первого МГМУ имени И.М. Сеченова (117997, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49)

Автореферат разослан

2015 года.

Учёный секретарь

диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Фролова Александра Александровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Цистный и альвеолярный эхинококкозы - хронически протекающие тканевые гельминтозы, вызываемые личиночной (ларвапьной) стадией цестод Echinococcus multilocularis и Echinococcus granulosus, относятся к наиболее тяжёлым паразитарным заболеваниям. Цистным эхинококкозом болеют человек и сельскохозяйственные животные. Альвеолярный эхинококкоз (альвеококкоз) является заболеванием человека. Ввиду широкого распространения и огромного экономического ущерба здравоохранению и животноводству, исчисляемого сотнями миллионов долларов в год, эти заболевания представляют серьёзную социальную и экономическую проблему для многих стран мира, в том числе России [Stojkovic М. et al.; 2009; Коваленко Ф.П. и др., 2005; Eckert J., Deplazes P., 2004; Torgerson P.R., 2003]. По данным официальной статистики, в Российской Федерации ежегодно регистрируются 200250 первично выявленных больных, причём заболеваемость эхинококкозами населения страны в последние годы возрастает [Коваленко Ф.П. и др., 2005].

Единственным радикальным методом лечения эхинококкозов до настоящего времени остаётся хирургический, малоэффективный в запущенных случаях заболевания и при множественной локализации паразита. Радикальную операцию удаётся выполнить лишь у 11-15 % больных альвеококкозом и 25-58 % больных цистным эхинококкозом. Даже при успешной выполненной операции нередки случаи рецидива инвазии (до 54 %) из-за неполного удаления зародышевых элементов эхинококка. Рецидивы приводят к необходимости повторных операций [Horton J. et al., 2003]. Применяемые для химиотерапии эхинококкозов препараты группы карбамат-бензимидазолов (мебендазол и албендазол) не гарантируют излечение больного на протяжении всей его жизни [Kern P. et al., 2003].

С целью расширения круга новых специфических противопаразитарных препаратов нами предприняты исследования по дальнейшему изучению выявленной ранее терапевтической активности противоопухолевого препарата группы карбаматбензи-мидазолов - нокодазола [Джабарова В.И. и др., 1983] на патогенетически разных экспериментальных моделях ларвальных цистного и альвеолярного эхинококкозов.

Целью диссертационной работы является разработка методов эффективной химиотерапии ларвапьных цистного и альвеолярного эхинококкозов на лабораторных моделях инвазии при парентеральном применении нокодазола в низких дозах.

Задачи исследований

1. Изучить сравнительную эффективность парентеральных инъекций нокодазола (внутрибрюшинных, внутримышечных и подкожных) в повышенных (скринин-говых) средних суточных дозах (125-500 мг/кг) на патогенетически разных моделях инвазии ларвальным Echinococcus multilocularis (у золотистых хомяков, джунгар-ских хомячков, хлопковых и белых крыс) на поздней стадии инвазии и определить наличие резорбции нокодазола из мест его введения.

2. Изучить эффективность повторных подкожных и внутрибрюшинных инъекций нокодазола в низких средних суточных дозах (5-20 мг/кг) на поздней стадии экспериментальной инвазии белых мышей ларвальным Echinococcus granulosus; определить оптимальный режим применения препарата, обеспечивающий гибель всей популяции паразита у леченых животных; определить наличие и выраженность резорбции нокодазола из мест его введения.

Научная новизна результатов исследований

В результате исследований получены следующие данные, характеризующиеся научной новизной:

1. Установлена ларвицидная активность противоопухолевого препарата - нокодазола при экспериментальной инвазии ларвальным E.granulosus;

2. Доказана возможность радикальной химиотерапии экспериментальных ларвапьных эхинококкозов на поздней и терминальной стадиях гиперинвазии E.granulosus и на поздней стадии инвазии Emultilocularis повторными парентеральными инъекциями нокодазола;

3. Установлено, что при интенсивных экспериментальных инвазиях E.granulosus и Emultilocularis ранней прижизненно регистрируемой манифестацией антипаразитарной активности эффективного противоэхинококкового препарата является коллапс ларвоцист эхинококка у леченных животных;

4. Показана возможность профилактики анафилактического шока и его фа-

тальных последствий при лечении экспериментальной гиперинвазии ЕягапиЬзш методом контролируемого коллапса ларвоцист эхинококка у леченых животных без применения антигистаминных препаратов;

5. Установлено, что наиболее надёжным и объективным критерием успешной экспериментальной химиотерапии ларвальных эхинококкозов является отсутствие рецидива инвазии при отдалённых сроках вскрытия животных после окончания лечения;

6. Выявлен феномен полной резорбции субстанции нокодазола из мест парентеральных инъекций препарата лабораторным животным в количествах, не вызывающих образования перифокальной соединительнотканной капсулы;

7. При экспериментальном ларвальном эхинококкозе ларвицидная активность вводимого парентерально нокодазола превышает таковую мебендазола в равных условиях эксперимента.

Практическое значение результатов исследования

Проведённые исследования открыли перспективу успешного применения нокодазола для лечения ларвальных цистного и альвеолярного эхинококкозов человека на ранней и поздней стадиях инвазии разных интенсивности и локализации паразита методом мезотерапии благодаря впервые выявленному в эксперименте уникальному свойству препарата подвергаться полной резорбции («рассасыванию») из мест парентеральных микроинъекций. Это свойство препарата, обусловленное химической природой субстанции нокодазола, в новом режиме применения обеспечивает высокую его эффективность при экспериментальной химиотерапии различных паразито-зов (гельминтозов, протозоозов и др.) и злокачественных новообразований.

Внедрение материалов исследований в практику

Основные положения исследований защищены патентом Российской Федерации № 2517044 «Способ лечения ларвального эхинококкоза лабораторных животных».

Материалы исследований используются в виде лекций, семинарских и практических занятий, а также в научных исследованиях:

1. Кафедрой тропической медицины и паразитарных болезней МПФ ГБОУ

ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава РФ по специальности 03.02.11 -паразитология;

2. НИИ МПиТМ им. Е.И, Марциновского (лаборатория экспериментальной химиотерапии отдела синтеза и доклинического изучения противопаразитарных препаратов) в исследованиях по оптимизации химиотерапии на экспериментальных моделях тканевых гельминтозов;

3. НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН при изучении эффективности новых лекарственных форм карбаматбензимидазолов при экспериментальной химиотерапии злокачественных опухолей у лабораторных животных (договор № 2113-х от 10.12.12 г. о научно-техническом сотрудничестве НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН и Первым МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава РФ).

Положения, выносимые на защиту

1. Субстанция противоопухолевого препарата нокодазола обладает свойствами эффективной лекарственной формы пролонгированного действия, обеспечивающей при повторном парентеральном применении ларвицидный эффект на поздних стадиях экспериментальных инвазий ларвапьными E.granulosus и E.multilocularis.

2. При экспериментальных инвазиях E.granulosus и E.multilocularis ларвицидный эффект нокодазола на всю популяцию паразита у хозяина достигается в режиме серийных повторных инъекций препарата в низких суточных дозах с интервалом между инъекциями 3-4 дня.

Апробация результатов исследования

Материалы диссертации доложены на Научном совете НИИ МПиТМ им. Е.И. Марциновского Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, 18 июня 2014 г.

Личный вклад автора

Лично автором проведено экспериментальное заражение лабораторных животных разных видов (белых мышей, золотистых хомяков, джунгарских хомячков, белых и хлопковых крыс) ларвальными цистным и альвеолярным эхинококкозами, лечение заражённых животных парентеральными инъекциями нокодазола и ме-

бендазола, определение индивидуальных интенсивности инвазии и жизнеспособности ларвоцист эхинококка у животных экспериментальных и контрольных групп. Выполнены анализ полученных результатов лечения, сбор и обобщение литературных данных, статистическая обработка количественных показателей результатов лечения.

Публикации

По материалам исследований опубликовано 4 статьи в рецензируемых научных журналах, включённых в перечень рекомендованных ВАК России, и 1 патент Российской Федерации № 2517044 на изобретение «Способ лечения ларвального эхинококкоза лабораторных животных».

Соответствие темы диссертации паспорту научной специальности

Задачи и научные положения, выносимые на защиту, диссертации соответствуют формуле специальности 03.02.11 - паразитология. Результаты проведённого исследования соответствуют области исследования паспорту специальности 03.02.11 - паразитология, конкретно пунктам 8, 9.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 286 источников, из которых 29 на русском языке и приложения. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 46 рисунками.

Благодарности

Приношу глубокую благодарность научному руководителю доктору медицинских наук, профессору Ф.П. Коваленко за постоянную помощь в экспериментальных исследованиях, при анализе полученных результатов. Искренне благодарю сотрудников лаборатории экспериментальной химиотерапии отдела синтеза и доклинического изучения противопаразитарных препаратов НИИ МПиТМ им. Е.И. Марци-новского М.Н. Лебедеву, В.И. Джабарову, И.В. Кухалеву, Г.А. Гицу, Т.Е.Буланову за консультации, доброжелательное отношение и помощь в работе.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Объем исследований

Объекты исследований - лабораторные модели ларвальных эхинококкозов, субстанции нокодазола (производитель - Aldrich Chemical Company, Inc., CIIIA) и препарата сравнения мебендазола (производитель - ОАО «Гедеон Рихтер», Венгрия).

нокодазол мебендазол

метил-(5-[2-таснилкарбонил]-1Н-бензимндазол-2-ил) карбамат метиловый эфир 5-бензоил-2-бснзимидазол-карбаминовой кислоты

Рабочую модель цистного эхинококкоза воспроизводили у белых мышей путём внутрибрюшинного заражения животных (280 голов) зрелыми протосколексами, выделенными из ларвоцист Е.^апШойт от спонтанно инвазированной убойной овцы-донора. Рабочую модель ларвального альвеококкоза воспроизводили у 171 лабораторного животного четырёх видов путём внутрибрюшинного заражения животных микроскопическими ацефалоцистами, выделенными из ларвоцист Е.тиШ-1оси1апз от 53 экспериментально заражённых хлопковых или белых крыс-доноров (базовые модели альвеококкоза, на которых изолят альвеококка от красной лисицы попеременно пассируется на ларвальной стадии в лаборатории экспериментальной химиотерапии НИИ МПиТМ им. Е.И. Марциновского в течение последних 40 лет). Группы заражённых ларвальными эхинококкозами лабораторных животных лечили нокодазолом и мебендазолом путём парентеральных инъекций (внутрибрюшинных, подкожных, внутримышечных). Препараты использовали в виде водной суспензии. Эффективность нокодазола исследовали на лабораторных моделях альвеококкоза патогенетически разных типов (у золотистых хомяков, джунгарских хомячков, хлопковых и белых крыс) при 1-8-кратных парентеральных инъекциях в повышенных (скрининговых) суточных дозах. При цистном эхинококкозе белых мышей на поздней стадии инвазии длительностью 7,5 мес. изучали эффективность подкожных серийных (10-15 в день) инъекций нокодазола в постепенно повышаемых средних суточных дозах от 5 до 20 мг/кг 2 раза в неделю в течение 4 мес. с интервалом между

сериями инъекций Ъ-\ дня. Эффективность внутрибрюшинных инъекций нокодазо-ла в средней суточной дозе 13,2 мг/кг на той же модели и в том же режиме лечения изучали на терминальной стадии гиперинвазии длительностью 11,5 мес. Показателями эффективности нокодазола на лабораторных моделях ларвальных эхинококко-зов служили: 1) снижение массы паразитарных ларвоцист, вызванное коллапсом паразита; 2) деструктивные изменения зародышевых элементов эхинококка (протоско-лексов и микроскопических ацефалоцист) под влиянием нокодазола, выявленные с помощью макро- и микроскопического исследования нативных препаратов паразита, у каждого леченого животного. Исследования включали определение индивидуальных параметров инвазии у животных экспериментальных (леченых) и контрольных групп. В экспериментальных группах определяли: 1) исходную (в начале лечения) массу паразитарных ларвоцист; 2) изменение массы паразита в течение курса лечения и после его окончания; 3) наличие и степень выраженности коллапса паразита; 4) жизнеспособность всех ларвоцист эхинококка, выявленных при вскрытии животных по наличию и выраженности деструктивных изменений; 5) наличие препарата и степень его резорбции из мест инъекций. У контрольных животных определяли индивидуальную массу паразита и оценивали его жизнеспособность и степень зрелости в разные сроки после заражения.

Методы исследований 1. Метод приготовления инокулята при моделировании инвазии Е.^апи-1озиз. Пузыри эхинококка были выделены от спонтанно инвазированной овцы-донора. Пузырную жидкость и соскоб с внутренней стенки эхинококковых пузырей помещали в мерный стакан объёмом 1 л, очищали от погибших зародышевых элементов и фрагментов оболочек паразита путём повторных взбалтывания, отстаивания и удаления надосадочной жидкости и концентрировали. Полученный инокулят равномерно перемешивали на магнитной мешалке со скоростью 1000 об/мин, забирали из него 1 мл в шприц иглой диаметром 0,25 мм, из шприца сразу же наносили на предметные стекла несколько капель и подсчитали в каждой капле число живых зрелых протосколексов при малом увеличении микроскопа. По количеству капель в единице объёма инокулята и числу протосколексов в 1

капле определяли дозу инвазионного материала.

2. Метод приготовления инокулята при моделировании инвазии Е.тиШ-1оси1апв. В качестве инвазионного материала использовали микроскопические ацефалоцисты альвеококка. Ларвоцисты альвеококка, выделенные от экспериментально заражённых хлопковых или белых крыс-доноров, измельчали ножницами; гомогенат протирали через мельничный газ (диаметр ячеек - 0,3 мм) при одновременной перфузии физиологическим раствором. Концентрацию фильтрата, его очистку от погибших зародышевых элементов и фрагментов оболочек паразита, подсчёт в готовом инокуляте живых микроскопических ацефалоцист, проводили так же, как это описано в методе приготовления инокулята при моделировании инвазии Е.&апи1озш.

3. Методика заражения лабораторных животных зародышевыми элементами Е^гапиккт и Е.тиИИосиШпБ. Протосколексами Е.^гатЛозт заражали внут-рибрюшинно белых мышей (самок) в возрасте 1-1,5 мес. Каждое животное получило по 1 ООО протосколексов. При воспроизведении рабочей лабораторной модели ларвального агтьвеококкоза инвазионным материалом служили микроскопические ацефалоцисты альвеококка диаметром 50-300 мкм, доза которых для хлопковых крыс, джунгарских хомячков, золотистых хомяков и белых крыс составляла соответственно 200, 300, 500 и 5000 экз. на животное. Для профилактики перитонита у заражённых животных в инокулят добавляли антибиотики (пенициллин - 4000 ЕД/мл и гентамицин - 1 мг/мл).

4. Методы экспериментальной химиотерапии лабораторных моделей лар-вальных эхинококкозов.

4.1. Метод химиотерапии альвеококкоза. Экспериментально заражённых апьвеококкозом лабораторных животных начинали лечить на 38-92 дни после заражения при средней исходной массе паразитарных ларвоцист 1,6^,9 г, составлявшей 1,2-21,7% от массы тела хозяина. Нокодазол в виде водной суспензии вводили парентерально однократно или повторно в средних суточных дозах 125— 500 мг/кг в течение 1-3 мес. Леченых и контрольных животных вскрывали в течение 5 мес. после заражения (табл. 1).

Таблица 1

Эффективность нокодазола при экспериментальном ларвальном альвеококкозе лабораторных грызунов

Вид животных Группа животных Число животных Доза ИМ, ад/жив* ИЛИ**, дни после заражения Способ введения препарата Кратность инъекций Разовая доза ДВ, г/кг Суммарная доза ДВ, г/кг Срок вскрытия после заражения, дни Средняя масса (г) ларвоцист альвеококка при вскрытии животных ИТРП, %

исходная к началу лечения (СИМЛ) после лечения

Золотистые хомяки леченые 5 500 64 в/бр 1 0,50 0,50 7-30 2,08 (3,9 % от СВТХ) 1,67 (3,0% от СВТХ) 100

6 0,25 0,25

контрольные 5 - - - - 8$ 2,24 (4,6 % от СВТХ) -

Джунгарские хомячки леченые 4 300 91 в/бр 1 0,25 0,25 118 4,91 (21,7% от СВТХ) 2,70 (20,7% от СВТХ) 100

контрольные 6 - - - - 7,36 (35,6% от СВТХ) -

Белые крысы леченые 10 5000 59 в/бр 1 0,125 0,125 102 1,63 (1,2% от СВТХ) 1,53 (0,8 % от СВТХ) 100

146 3,87 (1,3% от СВТХ) 94,4

контрольные 19 - - - - 102 9,44 (4,4% от СВТХ) -

146 41,38 (17,2% от СВТХ) -

Хлопковые крысы леченые 4 200 37 в/м 8 0,125 1,00 81 3,25 (2,2 % от СВТХ) 2,84 (2,1 % от СВТХ) 100

3 п/к 8 0,20 1,60

контрольные 8 - - - - 87,84 (77,2% от СВТХ) -

Обозначения: * - доза инвазионного материала (ИМ) при заражении, число микроскопических ацефалоцист альвеококка на 1 животное;

** - исходная (до начала лечения) продолжительность инвазии - ИПИ; в/бр, в/м, п/к - внутрибрюшиино, внутримышечно и подкожно соответственно; СВТХ - средний вес тела хозяина; ИТРПЛ - индекс торможения роста паразитарных ларвоцист.

4.2. Методы химиотерапии цистного эхинококкоза. В первом опыте лечение подкожными инъекциями нокодазола начинали при исходной продолжительности инвазии 7,5 мес. (средняя исходная масса ларвоцист составляла 23,9 % от среднего веса тела животных). Препарат вводили 2 раза в неделю с интервалом Ъ-Ь дня в разные участки на дорзальной и вентральной поверхностях тела животного в течение 4 мес. в постепенно повышаемых суточных дозах от 5 до 20 мг/кг (всего 32 инъекции, суммарная доза - 400 мг/кг, средняя суточная доза за курс - 12,5 мг/кг). Животных вскрывали через 3 мес. после окончания лечения. Во втором опыте лечение мышей внутрибрюшинными инъекциями нокодазола начинали на терминальной стадии гиперинвазии длительностью 11,5 мес. Средняя исходная масса ларвоцист составляла 102 % от среднего веса тела животных. Препарат вводили 2 раза в неделю с интервалом 3-4 дня, в течение 4-32 дней. Животные получили по 2-8 инъекций в суммарной дозе на курс 14-126 мг/кг. Мышей вскрывали через 33-81 день после начала лечения.

5. Методы оценки эффективности экспериментальной химиотерапии ла-рвальных цистного и альвеолярного эхинококкозов. Лечение заражённых аль-веококкозом лабораторных животных начинали через 1-3 мес. после заражения. К этому сроку вскрывали 4-5 животных и определяли в граммах среднюю исходную массу ларвоцист альвеококка на 1 животное (Ми). Перед лечением и после начала лечения определяли вес тела каждого животного, меченного индивидуальной меткой, экспериментальных (леченых) и контрольных групп с точностью до Irl раз в день в течение 1-5 мес. Леченых и контрольных животных вскрывали в течение 5 мес. после заражения. При вскрытии животных сравниваемых групп определяли массу, жизнеспособность и степень зрелости всех выявленных ларвоцист альвеококка у каждого животного. Среднюю массу ларвоцист на 1 животное в экспериментальных (Мл) и контрольных (Мк) группах в граммах, её отношение к среднему весу тела хозяина (СВТХ) в процентах и индекс торможения роста паразитарных ларвоцист (ИТРПЛ) в процентах у леченых животных по сравнению с контролем определяли по формуле:

ИТРПЛ = (Мк - Мл) / (Мк - Ми) х 100,

где Ми, Мк и Мл - средние значения массы ларвоцист эхинококка на 1 животное: исходное, у контрольных и леченых животных соответственно [Ф.П. Коваленко, 1998]. При лечении экспериментального цистного эхинококкоза интенсивность инвазии (среднюю массу ларвоцист на 1 животное) в сравниваемых группах определяли прижизненно в динамике (в начале лечения, в течение курса лечения и после его окончания) с помощью оригинальной методики. Для этого использовали дополнительную контрольную группу здоровых белых мышей тех же возраста и пола. Среднюю массу ларвоцист у мышей экспериментальной и контрольной групп выражали разностью между средними значениями веса тела заражённых мышей сравниваемых групп и средним весом здоровых животных по формулам:

СМЛлж = СВТлж - СВТзж, СМЛкж = СВТюк - СВТзж,

где СМЛлж и СМЛкж - средняя масса ларвоцист эхинококка у леченых и контрольных животных соответственно; СВТлж, СВТкж и СВТзж - средний вес тела леченых, контрольных и здоровых животных соответственно. Для дополнительной качественной и количественной оценки противопаразитарной активности нокодазола при экспериментальных ларвальных эхинококкозах применён новый критерий - показатель коллапса ларвоцист (ПКЛ), который вычисляли для каждого леченого животного в процентах по формуле:

ПКЛ = МЛ х 100 / ВТи - ВТпл, где МЛ - масса ларвоцист эхинококка, выявленных при вскрытии животного; ВТи, ВТпл - вес тела того же животного (с ларвоцистами эхинококка): исходный и после лечения соответственно.

6. Морфологическое исследование ларвоцист Е^гаям/олглу и Е.тиШ1оси1ап$. У животных экспериментальных и контрольных групп определяли жизнеспособность и степень зрелости паразита в свежих нативных препаратах. О зрелости ларвоцист свидетельствовало наличие в них живых ввёрнутых протосколексов. Жизнеспособность ларвоцист оценивали с помощью микроскопического исследования нативных препаратов свежевыделенных из брюшной полости заражённых животных паразитарных ларвоцист на наличие и выраженность деструктивных изменений зародышевых элементов. Показателями гибели протосколексов слу-

жили потемнение, зернистость и сглаженность структуры паренхимы, исчезновение известковых телец, деформация или отпадение короны крючьев, нарушение целостности тегумента. Признаками гибели ацефалоцист являлись потемнение и зернистость герминативной оболочки, её отслоение от кутикулярной (хитиновой) оболочки, нарушение целостности последней, коллапс ацефалоцист.

Статистическая обработка результатов Для определения статистической достоверности различий между полученными количественными показателями в исследовании эффективности лечения использовали таблицы сопряжённости с вычислением значения критерия %2. Расчёты проводили с помощью статистического критерия Стьюдента.

Результаты собственных исследований 1. Эффективность парентеральных инъекций нокодазола на лабораторных моделях ларвального альвеококкоза. Парентеральные инъекции нокодазола, испытанные на патогенетически разных моделях ларвального альвеококкоза на поздней стадии инвазии Е.тиШ1оси1ап$, проявили высокую ларвицидную активность на моделях ларвального альвеококкоза у золотистых хомяков, джунгарских хомячков и хлопковых крыс (табл. 1).

1.1 Отличительной особенностью экспериментального альвеококкоза золотистых хомяков являлись медленный, доброкачественный рост ларвоцист (по типу однокамерного эхинококка), без экзогенного почкования паразита и формирование выраженной соединительнотканной капсулы хозяина. После однократного внутрибрюшиннош введение нокодазола хомякам в суточных дозах 0,5 и 0,25 г/кг гибель всех ларвоцист альвеококка у животных отмечали с 8-11 дней после инъекции препарата, тогда как мебендазол в дозе 0,25 г/кг был неэффективным. У контрольных хомяков, вскрытых на 90-92 дня после заражения, все выявленные ларвоцисты альвеококка были живыми, зрелыми. Преимущество нокодазола перед мебендазолом в одинаковых условиях эксперимента обусловлено его ларви-цидной активностью в отношении зародышевых элементов альвеококка - протосколексов и ацефалоцист, гибель которых сопровождалась выраженным коллапсом паразитарных ларвоцист (ПКЛ = 23,7-31,5 %) (рис. 1).

1.2 Экспериментальный альвеококкоз джунгарских хомячков характеризовался медленным, но злокачественным течением инвазии с экзогенной пролиферацией клеток герминативной оболочки и формированием слабовыраженной соединительнотканной капсулой хозяина. У всех животных с гиперинвазией однократная внутрибрюшинная инъекция нокодазола в дозе 0,25 г/кг была губительной практически для всех выявленных при вскрытии паразитарных ларвоцист (табл. 1). Ларвицидная активность нокодазола на этой модели сопровождалась выраженным коллапсом паразита, о чём свидетельствовали резкое снижение средней массы и деструкция ларвоцист альвеококка у леченых животных по сравнению со средним исходным показателем интенсивности инвазии и жизнеспособностью паразита у контрольных животных (рис. 2).

1.3 У белых крыс ларвальный альвеококкоз характеризовался доброкачественным течением инвазии, медленным экзогенным почкованием паразита и формированием утолщённой соединительнотканной капсулы хозяина. Нокодазол, введённый животным внутрибрюшинно однократно в дозе 0,125 г/кг, не вызвал гибель паразитарных ларвоцист, но угнетал их рост на 94,4 % (табл. 1).

1.4 Экспериментальный альвеококкоз хлопковых крыс характеризовался бурным злокачественным ростом ларвоцист с выраженной экзогенной и эндогенной пролиферацией клеток герминативной оболочки, формированием слабовыраженной соединительнотканной капсулы хозяина. В группах хлопковых крыс, получавших нокодазол внутримышечно или подкожно на поздней стадии инвазии, все выявленные при вскрытии животных ларвоцисты альвеококка были погибшими (табл. 1; рис. 3).

Очаговые скопления нокодазола, в виде плоских бляшек, покрытых соединительнотканной капсулой, выявлены на серозной поверхности брюшной полости, в участках подкожных и внутримышечных инъекций препарата у всех животных, леченных нокодазолом в испытанных повышенных суточных дозах.

2. Терапевтическая активность парентеральных инъекций нокодазола при ларвапьном цистном эхинококкозе белых мышей. Повторные серийные подкожные и внутрибрюшинные инъекции нокодазола в низких суточных дозах, на поздней и

2,08 г

2,24 г

1,79 г

0,72 г Л

ш ■

ИСХОДНАЯ

масса ларвоцист (в начале лечения)

масса ларвоцист у хомяков, леченных

НОКОДАЗОЛОМ

масса ларвоцист у хомямяков, леченных МЕБЕНДАЗОЛОМ

масса ларвоцист у КОНТРОЛЬНЫХ

хомяков

Рис. 1. Сравнительная эффективность однократных внутрибрюшинных инъекций нокодазола и мебендазола при экспериментальном ларвальном альвеококкозе золотистых хомяков*.

* - препараты вводили в дозе 0,25 г/кг на 65 день после заражения; животных вскрывали через 3-4 недели после введение инъекции (2,5-3 мес. после заражения); живые ларвоцисты; ЩЛ - погибшие ларвоцисты.

4,91 г 7,36 г

2,70 г

ИСХОДНАЯ

масса ларвоцист (в начале лечения)

масса ларвоцист у хомячков, леченных НОКОДАЗОЛОМ

масса ларвоцист у КОНТРОЛЬНЫХ

хомячков

Рис. 2. Эффективность однократной внутрибрюшинной инъекции нокодазола при экспериментальном альвеококкозе джунгарских хомячков*.

* - препарат вводили в дозе 0,25 г/кг на 92 день после заражения; животных вскрывали на 28 день после

инъекции (119 день после заражения); Ц - живые ларвоцисты; Ц - погибшие ларвоцисты.

87,841

ИСХОДНАЯ

масса ларвоцист (в начале лечения)

масса ларвоцист у крыс, леченых ВНУТРИМЫШЕЧНЫМИ

инъекциями*

масса ларвоцист у крыс, леченных ПОДКОЖНЫМИ инъекциями, **

масса ларвоцист у КОНТРОЛЬНЫХ крыс***

. Эффективность 8-кратных внутримышечных и подкожных инъекций нокодазола при экспериментальном ларвапьном альвеококкозе хлопковых крыс. Продолжительность инвазии к началу лечения - 37 дней. Интенсивность инвазии оценивали по массе ларвоцист при вскрытии животных на 45 день после окончания лечения (82 день после заражения).

- средняя суточная доза - 125 мг/кг (суммарная лечебная доза - 1,0 г/кг);

- средняя суточная доза - 200 мг/кг (суммарная лечебная доза - 1,6 г/кг);

- контрольных животных вскрывали на 82 день после заражения;

- живые ларвоцисты;

- погибшие ларвоцисты.

Рис.4. Ларвицидная активность подкожных инъекций нокодазола при экспериментальном ларвапьном цистном эхинококкозе белых мышей. Передняя брюшная стенка удалена.

А - леченая мышь с интенсивной исходной инвазий Е.granulosus длительностью 7,5 мес.; нокодазол вводили подкожно 2 раза в неделю с интервалом между инъекциями 3-4 дня в постепенно повышаемых средних суточных дозах от 5 до 20 мг/кг в течение 4 мес.; мышь вскрыта через 3 мес. после окончания лечения (14,5 мес. после заражения);

Б - мышь из контрольной группы, павшая через 13 мес. после заражения протосколексами Е.granulosus.

терминальной стадиях инвазии Eg?•яяи/o.sг«,, полностью угнетали рост и вызывали гибель всей популяции паразита у 37,5-57,1 % леченых животных.

2.1 При вскрытии мышей, леченных на поздней стадии инвазии (длительностью 7,5 мес.) сериями повторных подкожных инъекций нокодазола в течение 4 мес. в средней суточной дозе 12,5 мг/кг и вскрытых через 3 мес. после окончания лечения, установлено, что препарат вызвал гибель всех выявленных ларвоцист эхинококка у 37,5 % животных. Все или подавляющие большинство ларвоцист были погибшими у 70,8 % леченых мышей. Среди полностью излеченных белых мышей были животные с массой погибших ларвоцист эхинококка, достигавшей 10,9 г (36,9 % от веса тела хозяина) (табл. 2; рис. 4, 5). У 83,3 % мышей, леченных подкожными инъекциями нокодазола, установлена полная резорбция препарата из подкожной клетчатки.

2.2 Внутрибрюшинные инъекции нокодазола в том же режиме на терминальной стадии инвазии Е.кгатЛоьш длительностью 11,5 мес. и исходной средней массой ларвоцист эхинококка 34,2 г (102,2 % от среднего веса тела животных) при продолжительности курса лечения 4-32 дня вызвали полное излечение 57,1 % животных. Результаты вскрытия леченых животных показали, что у мышей, получивших по 8 инъекций нокодазола в средней суточной дозе 13,2 мг/кг (средняя суммарная доза на курс - 105 мг/кг), все выявленные ларвоцисты эхинококка были погибшими. В группе излеченных мышей число ларвоцист на животное колебалось в пределах 27-214 экз., а общая масса погибших паразитов на животное достигала 31,0 % от веса тела хозяина. Губительное действие нокодазола сопровождалось выраженным коллапсом ларвоцист у всех леченых животных (ПКЛ составлял 57,575,9 %). Параметры индивидуального режима лечения нокодазолом гиперинвазии Е^гаш/1аш<;, обеспечившие радикальный терапевтический эффект, представлены на рисунке 6. Феномен выживания леченных нокодазолом мышей на терминальной стадии гиперинвазии свидетельствует о возможности контролирования интенсивности коллапса и преодоления тем самым его фатальных анафилагенных последствий путём парентеральных инъекций нокодазола в низких суточных дозах с интервалом между инъекциями 3—4 дня. В результате проведённых опытов установ-

Таблица 2

Количественные показатели эффективности нокодазола при экспериментальном цистном эхинококкозе белых мышей *

Группа леченых животных Число животных Результаты вскрытия животных через 3 мес. после окончания курса лечения

Число животных, у которых Количественные показатели инвазии у излеченных животных

все ларвоцисты погибшие (излеченные животные) преобладают погибшие ларвоцисты преобладают живые ларвоцисты масса ларвоцист эхинококка на 1 животное, г отношение массы паразита к весу тела хозяина, % максимальный диаметр ларвоцист, мм

максимальная средняя максимальное среднее

абс. % абс. % абс. %

Интенсивная исходная инвазия 13 4 30,8 5 38,4 4 30,8 10,89 5,03 ± 2,82 36,9 15,5 ±9,1 22

Слабая исходная инвазия 11 5 45,4 3 27,3 3 27,3 2,12 0,81 ±0,38 5,9 2,5 ± 1,0 18

Сводная 24 9 37,5 8 33,3 7 29,2 10,89 2,68 ± 1,33 36,9 8,3 ± 4,2 22

Обозначения: * - лечение начинали через 7,5 месяцев после внутрибрюшинного заражения протосколексами; нокодазол вводили подкожно 2 раза в неделю в течение 4 мес. в постепенно повышаемых суточных дозах от 5 до 20 мг/кг; животных вскрывали через 3 мес. после окончания курса лечения.

35 30 25 20 15 10 5 О

32,51 г

7,60 г 6,44 г

масса ларвоцист (в начале лечения)

леченных НОКОДАЗОЛОМ

КОНТРОЛЬНЫХ

мышей

Рис. 5. Эффективность повторных подкожных инъекции нокодазола при экспериментальном цистном эхинокок-козе белых мышей на поздней стадии гиперинвазии*.

* - лечение начинали через 7,5 мес. после внутрибрюшинного заражения мышей протосколексами Е.granulosus; препарат вводили в средней суточной дозе 12,5 мг/кг 2 раза в неделю с интервалом между инъекциями 3-4 дня в течение 4 мес.; животных вскрывали через 3 мес. после окончания лечения (14,5 мес. после заражения);

0

5 10 15 20 25 30 35 40 70 75 80

Дни после начала лечения

Рис. 6. Влияние внутрибрюшных инъекций нокодазола на изменение массы тела экспериментально заражённой цистным эхинококкозом белой мыши № 2 и на жизнеспособность ларвоцист Е.granulosus после курса лечения на поздней стадии инвазии*.

* - мышь заражена внутрибрюшинно протосколексами Е.granulosus-, лечение начинали - через 11,5 мес. после заражения; - масса ларвоцист эхинококка, г; if-вес тела мыши (без ларвоцист), определённый при вскрытие животного на 82 день после начала лечения;

X 5,4 - день введение препарата, суточная доза ДВ, мг/кг;

СЛД - суммарная лечебная доза препарата, мг/кг;

(П) — при вскрытии все выявленные у животного ларвоцисты эхинококка были погибшими;

ПКЛ - показатель коллапса паразитарных ларвоцист на день вскрытия животного, %.

лено, что подкожные и внутрибрюшинные инъекции нокодазола в низких средних суточных дозах (10,9-15,7 мг/кг) могут обеспечить тотальный ларвицидный эффект в отношении всей популяции паразита у животных на поздней и терминальной стадиях экспериментального ларвального цистного эхинококкоза. Высокая ларвицидная активность нокодазола достигалась благодаря режиму повторных парентеральных инъекций препарата в низких суточных дозах, что обеспечивало постоянное, непрерывное и продолжительное поступление его из возобновляемых депо в плазму крови заражённых животных в концентрации и экспозиции, достаточных для губительного действия на всю популяцию паразита у животного.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Эффективность парентеральных инъекций противоопухолевого препарата нокодазола изучали на лабораторных моделях ларвапьных альвеолярного и цистного эхинококкозов на поздней стадии инвазии. На 4 патогенетически разных моделях альвеококкоза (у золотистых хомяков, джунгарских хомячков, хлопковых и белых крыс) препарат, испытанный при 1-8-кратных внутрибрюшинных, подкожных и внутримышечных способах введения в повышенных суточных дозах (125500 мг/кг), проявил радикальный паразитоцидный эффект у золотистых хомяков, джунгарских хомячков, хлопковых крыс и выраженный паразитостатический эффект у белых крыс. Повторными (8-кратными) внутримышечными и подкожными инъекциями нокодазола удалось вызвать гибель всех ларвоцист альвеококка у наиболее устойчивой к химиотерапии модели инвазии Е.гтШИосиЬпэ - хлопковых крыс. Заметной резорбции препарата, испытанного в повышенных суточных дозах, не установлено. На модели ларвального цистного эхинококкоза белых мышей (поздняя и терминальная стадии гиперинвазии Е.^апи1о.чиз) повторные подкожные и внутрибрюшинные инъекции нокодазола в низких средних суточных дозах (520 мг/кг) вызвали гибель всей популяции ларвоцист эхинококка у 37,5-57,1 % леченых животных. Полная резорбция нокодазола из мест инъекций препарата установлена у 83,3 % животных. Ларвицидный эффект парентеральных инъекций нокодазола при экспериментальных ларвальных эхинококкозах сопровождался коллапсом паразитарных ларвоцист, более выраженном при цистном эхинококкозе

(ПКЛ у леченых животных составлял 57,5-75,9 % при цистном эхинококкозе и 24,0-31,5 % при альвеококкозе). Выявленная высокая эффективность парентеральных инъекций противоопухолевого препарата нокодазола обосновывает целесообразность его испытания на лабораторных моделях других паразитозов и злокачественных опухолей, а также перспективность клинического применения этого препарата методом мезотерапии в паразитологии и онкологии.

ВЫВОДЫ

1. На поздней стадии экспериментальной гиперинвазии ларвальным E.gra-nulosus белых мышей повторные парентеральные инъекции противоопухолевого препарата нокодазола с интервалом 3-4 дня в средних суточных дозах 12,513,2 мг/кг обеспечивают полную резорбцию препарата из возобновляемых микродепо, постоянное его поступление в циркуляторные системы хозяина и гибель всей популяции паразита у леченых животных;

2. На поздней стадии экспериментальной инвазии ларвальным Е. multilocularis губительное действие нокодазола на всю популяцию ларвоцист установлено у золотистых хомяков и джунгарских хомячков после однократных внутри-брюшинных инъекций в средних суточных дозах 250-500 мг/кг и у хлопковых крыс после 8-кратных внутримышечных или подкожных инъекций в средних суточных дозах 125-200 мг/кг.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При экспериментальной химиотерапии ларвальных эхинококкозов наиболее надёжные показатели ларвицидной активности в отношении цистного и альвеолярного эхинококкозов могут быть получены на самой устойчивой к химиотерапии модели инвазии - ларвальном альвеококкозе хлопковых крыс.

При оценке эффективности перспективных противоэхинококковых препаратов на лабораторных моделях инвазии надёжными критериями являются: 1) морфологическое исследование всех ларвоцист эхинококка, выявленных при вскрытии каждого леченого животного на наличие жизнеспособных зародышевых элементов (протосколексов и микроскопических ацефалоцист); 2) максимальная синхронность гибели зародышевых элементов во всей популяции ларвоцист эхи-

нококка у каждого леченого животного; 3) вскрытие леченых животных в отдалённые сроки (через 1-3 мес.) после окончания лечения.

При экспериментальной химиотерапии ларвальных эхинококкозов на поздней стадии инвазии биологически активными специфическими препаратами неизбежны развитие коллапса ларвоцист и угроза анафилактического шока, приводящего часто к гибели животных. Профилактика падежа леченых животных от анафилактического шока без применения антигистаминных препаратов возможна путём искусственного сдерживания интенсивности коллапса. Это достигается применением низких суточных доз препарата и индивидуальным режимом его введения в зависимости от изменения веса тела животного в течение курса лечения.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Работы, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Коваленко Ф.П., Школяр H.A., Кухалева И.В., Легонькое Ю.А., Буланова Т.Е. Способ лечения ларвального эхинококкоза лабораторных животных. Патент РФ № 2517044. // Опубликован: 27.05.2014. - Бюл. - № 15.

2. Коваленко Ф.П., Кухалева И.В., Школяр H.A., Легонькое Ю.А. Сравнительная эффективность масляных суспензий албендазола и мебендазола при экспериментальном ларвальном альвеококкозе белых мышей // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 2013. - № 2. - С. 17-20.

3. Школяр H.A., Кухалева И.В., Легонькое Ю.А., Коваленко Ф.П. Терапевтическая активность нокодазола на экспериментальных моделях ларвального аль-веококкоза// Медицинская паразитология и паразитарные болезни. — 2013. - № 2. - С. 20-27.

4. Школяр H.A., Кухалева И.В., Легонькое Ю.А., Коваленко Ф.П. Эффективность парентеральных инъекций нокодазола при экспериментальном ларвальном эхинококкозе белых мышей // ПЕСТ-Менеджмент. - 2014. -№ 1. - С. 16 - 23.

5. Школяр H.A., Кухалева И.В., Легонькое Ю.А., Коваленко Ф.П. Эффективность нокодазола при экспериментальной инвазии Echinococcus granulosus белых мышей // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 2014. -№ 2. - С.42 - 46.

Подписано в печать 28.12.2014 г. Формат 60x90/16. Гарнитура: Times New Roman Тираж 150 экз. Заказ №1374

Отпечатано в ООО «ЭстетикЦентрЮг» г. Москва, Варшавское шоссе д. 18, к.З E-mail: info@etcu.ru