Разработка новых биотехнологических методов получения инсулина и лечения инсулинозависимого сахарного диабета мелких домашних животных

Абдрахманов, Игорь Камильевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка новых биотехнологических методов получения инсулина и лечения инсулинозависимого сахарного диабета мелких домашних животных
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка новых биотехнологических методов получения инсулина и лечения инсулинозависимого сахарного диабета мелких домашних животных"

005002247

АБДРАХМАНОВ ИГОРЬ КАМИЛЬЕВИЧ

РАЗРАБОТКА НОВЫХ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА И ЛЕЧЕНИЯ ИНСУЛИНОЗАВИСИМОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА МЕЛКИХ ДОМАШНИХ ЖИВОТНЫХ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени 1еских наук

Ульяновск - 2011

005002247

Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко» РАСХН

Научные консультанты: Заслуженный деятель науки РСФСР

доктор биологических наук, профессор [ДЬЯКОНОВ ЛЕВ ПЕТРОВИЧ!

доктор биологических наук, профессор САВЧЕНКОВА ИРИНА ПЕТРОВНА

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

ГЕНИНГ ТАТЬЯНА ПЕТРОВНА

доктор биологических наук, профессор ГИЛЬМУТДИНОВ РУСТАМ ЯКУБОВИЧ

доктор биологических наук, профессор БУКАРОВ НУРМАГОМЕД ГАДЖИКУЛИЕВИЧ

Ведущая организация ФГБУ Федеральный центр токсикологиче-

ской и радиационной безопасности «ФЦТРБ-ВНИВИ»

Защита состоится «23» декабря 2011 г. в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.065.01 при ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» по адресу: 432063, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1, тел. 8 (8422) 44-30-58; факс 44-30-72, e-mail: kormlen@yandex.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия», а с авторефератом на сайте www.vak.ed.gov.ru

Автореферат разослан « с£<Р » 2011

года

Ученый секретарь С~/ " г

диссертационного совета ^¿^¡.о-^-с. a_j> Пыхтина Лидия Андреевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Инсулинозависимый сахарный диабет (ИЗСД) является тяжелейшим заболеванием вследствие повреждения островковой ткани поджелудочной железы (ПЖ) и сопровождается абсолютной инсулиновой недостаточностью. Сахарный диабет (СД) по распространённости занимает первое место среди эндокринологических заболеваний и третье место после сердечнососудистых и онкологических заболеваний.

Принимая во внимание угрожающие данные по статистике СД, остро встает вопрос о разработке принципиально новых подходов к его лечению, которое на сегодняшний день, как правило, является симптоматическим и не устраняет причины заболевания. Инсулинотерапия, по сути, не является лечением, это только способ отодвинуть на некоторое время наступление выраженных нарушений углеводного обмена, и, как следствие, осложнений СД. Введение больших доз инсулина не позволяет достичь желаемых результатов, т.е. полной компенсации углеводного обмена, и, тем самым, замедлить или остановить прогрессирование поздних сосудистых осложнений (Кузин М.И. с со-авт., ¡985; Литпшан И., 1985). При этом лечение сопутствующих диабету ап-гиопатий эффективно только на фоне достигнутой стабилизации уровня глюкозы в крови (Дедов И.И. с соавт., 2004). Лечение СД в ветеринарии ограничивается только инсулинотерапией.

Применение экзогенного инсулина имеет ряд недостатков, связанных с постепенным развитием иммунного ответа на молекулу инсулина и потерю активности гормона. Препараты коммерческого инсулина, производимые фармком-паниями созданы максимально приближенными к природному, однако методы генной инженерии не могут в полной мере смоделировать процессы биологического синтеза «зрелой» молекулы гормона, происходящие в р-клетках ПЖ.

Другой метод лечения СД в гуманной медицине - трансплантация ПЖ или её части - связана с обязательной иммуносупрессией и обременена большим количеством этических проблем. Поэтому задача по поиску способа воздействия на причину заболевания и восстановления организмом утраченных функций остается актуальной и в медицине, и в клинической ветеринарии.

Успешное внедрение в практику экспериментальной биологии методов длительного культивирования стволовых клеток (СК) и клеток - предшественников различных тканей человека, работа с Р-клетками ПЖ, поиск адекватного клеточного материала, не вызывающего иммунного отторжения трансплантатов, создали предпосылки для разработки технологий заместительной клеточной и тканевой терапии. Один из таких методов - трансплантация в организм больного ИЗСД островковых клеток (ОК) ПЖ - представляется перспективным способом достижения гликемического контроля, поступления в организм эндогенного инсулина, предотвращения тяжёлых гипогликемий и сопутствующих осложнений (Скапецкий Н.Н. с соавт., 1994, ГеЛегИп К. et а1, 1999).

Трансплантация р-клеток ПЖ как потенциальный метод лечения диабета была внелркня в медицинскую практику более 10 лет назад, в ветеринарии этот метод не был отработан ни экспериментально, ни клинически. Однако применение этого метода будет всегда ограничиваться трудностями получения

достаточного количества островков от доноров. Решением проблем тканевой трансплантации, а, следственно, лечения ИЗСД людей и животных, является разработка методов получения возобновляемых ресурсов клеток путём использования клеточных технологий.

Цель работы - разработать новые биотехнологические методы, направленные на получение инсулина in vitro, а также на лечение инсулинозависимо-го сахарного диабета мелких домашних животных. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделить из ПЖ плодов кролика, собаки, кошки р-клетки, очистить; изучить их свойства и признаки in vitro.

2. Провести гибридизацию р-клеток ПЖ плодов кролика с мутантной линией почки овцы, дефектной по тимидинкиназе (ПО ТК").

3. Провести сравнительный анализ клонов межвидовых гибридных культур ПО ТК" х р-клетки и отобрать клоны с высокой продукцией инсулина.

4. Адаптировать клоны с наиболее высокой продукцией инсулина к рол-лерно-суспензионному культивированию и получить суспензионные клоны гибридной культуры.

5. Изучить гистологическую совместимость межвидовых гибридных культур in vitro с сыворотками крови человека.

6. Разработать методы получения и культивирования примордиальных половых зародышевых клеток (111 13К) свиньи.

7. Получить in vitro инсулин-секретирующие клетки, подобные р-клеткам Г1Ж, путем направленной дифференцировки эмбриональных половых клеток (ЭПК) свиньи.

8. Осуществить трансплантацию р-клеток ПЖ плодов кролика лабораторным животным с экспериментальным СД и изучить влияние данной процедуры на течение заболевания.

9. Разработать метод трансплантации р-клеток ПЖ плодов кролика мелким домашним животным с диагнозом СД и изучить влияние трансплантации клеток на течение заболевания.

Научная новизна. Впервые из ПЖ собак и кошек получены культуры Р-клеток, изучены их свойства и признаки in vitro. Оптимизированы методики выделения р-клеток ПЖ плодов кроликов, разработаны методики выделения фетальных р-клеток кошек и собак.

Впервые посредством слияния получена гибридная культура почка овцы х Р-клетки кролика (ПО ТК- х ркр), способная продуцировать инсулин in vitro.

Впервые получены и прокультивированы ППЗК свиней. Проведена направленная индукция ЭПК свиньи в инсулин-секретирующие клетки.

В опытах на лабораторных животных установлено, что ксенотранспланта-ция р-клеток ПЖ плодов кроликов нормализует течение экспериментального СД.

Впервые проведена клиническая трансплантация {3-клеток ПЖ плодов кроликов мелким домашним животным, больным СД. При этом доказано, что в результате трансплантации происходит снижение уровня глюкозы в крови и

моче, снижение дозы либо отказ от экзогенного инсулина, уменьшение возникновения сопутствующих диабету сосудистых осложнений.

Научно-практическая значимость работы. Разработан и запатентован способ выделения ß-клеток кроликов, собак и кошек из плодной ПЖ на определенных сроках гестации и очистки их культивированием, а также способ лечения СД у собак и кошек, заключающийся в трансплантации ß-клеток непосредственно через брюшную стенку в паренхиму левой доли печени, без применения иммуносупрессивной терапии (патент на изобретение РФ №2325921). Указанный способ успешно используется в ряде ветеринарных клиник.

Разработаны и утверждены «Методические рекомендации о порядке аттестации и поддержания перевиваемых линий клеток, используемых для культивирования вирусов и производства иммунобиологических препаратов ветеринарного назначения».

Разработаны и утверждены «Методические рекомендации по лечению ин-сулинозависимого сахарного диабета (СД 1) собак и кошек методом внутрипе-ченочной трансплантации ß-клеток плодов кроликов».

Полученные результаты расширяют представление о методах клеточной инженерии, направленных на получение клеточных культур, стабильно продуцирующих инсулин.

Полученные результаты открывают перспективы, позволяющие разрабатывать способы получения клеточного материала, используемого в терапии СД.

Результаты исследования могут найти применение в теоретической и экспериментальной клеточной биологии, биотехнологии, физиологии, фармакологии и клинической ветеринарии.

Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно, участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях. В выполнении отдельных этапов работы принимали участие: к.б.н. Т.А. Придан-цева, к.б.н. Т.В. Гальнбек, д.б.н. H.A. Зиновьева, д.б.н. H.H. Скалецкий, к.б.н. М.А.Селюгин, к.с-х.н. Ю.А.Кузнецов, к.б.н. А.С.Симонова, кб.н. Н.Б. Савенко, Л.А. Сережина, к.б.н. Т.А. Сидорова, н.с. H.A. Шевцова за что автор приносит им свою благодарность.

Основные положения, вынесенные на защиту:

1. Инсулино-продуцирующие и культурально - морфологические свойства культур ß-клеток из ПЖ плодов кроликов, собак, кошек не однозначны. Наиболее перспективным материалом для клеточной инженерии являются кроличьи ß-клетки.

2. Гибридизация ß-клеток с постоянной линией клеток почки овцы(ПО ТК") и последующее клонирование позволяют получить культуру клеток - продуцентов инсулина in vitro.

3. Продукция инсулина в гибридных клонах зависит от длительности и метода культивирования.

4. Культивирование ЭПК свиньи в индукционной среде приводит к формированию колоний инсулин-продуцирующих клеток, подобных ß-клеткам ПЖ.

5. Предложенный метод терапии СД мелких домашних животных путем трансплантации очищенных ß-клеток ПЖ плодов кролика позволяет улучшить течение заболевания и сопутствующих ему осложнений.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и об-суждсны на: VIIth International Congress of Andrology «Andrology in the 21st Century» (Montreal, Canada, 2001)-, международном симпозиуме «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» (Казань, 2005); международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы исследовании по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел» (Москва, 2008); Всероссийской научной конференции «Современные проблемы науки и образования» Российской академии естествознания (Москва, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 23 печатных работы, в том числе 10 в журналах, рекомендованных ВАК РФ и 1 патент.

Структура и объем работы. Работа изложена на 300 страницах стандартного компьютерного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования с обсуждением полученных результатов, выводы, практические предложения, библиографический список использованной литературы и приложение. Материалы диссертации иллюстрированы 36 таблицами, 118 рисунками. Библиографический список литературы включает 341 источник, из которых 240 - иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена с 2005 по 2011 гг. в отделе клеточной биотехнологии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко, согласно заданию 02.01.20. РНТП «Осуществить поддержание и развитие уникальных коллекций клеточных культур животных, вакцинных и эпизоотических штаммов вирусов, бактерий, грибов, простейших. Создать новые культуры клеток - суперпродуценты для биотехнологии методами клеточной инженерии».

Общая схема исследований представлена на Рис. 1.

В качестве материала OK использовали ПЖ плодов на сроках гестации -26±2 сут., 38-56 сут., 42-50 сут. для кроликов, собак и кошек соответственно. Выделение OK проводили с использованием коллагеназы (Sigma) и трипсина (ПанЭко). Культивирование проводили в С02 инкубаторе при температуре 37°С, 5% С02. Средой для культивирования была среда 199 с добавлением 10% сыворотки плода коровы (СПК) (Hyclone).

Для гибридизации клеток в качестве партнера по слиянию использовали мутантную перевиваемую линию клеток почки овцы ПО ТКГ. Эксперименты по гибридизации проводили согласно «Методическим рекомендациям по гибридизации соматических клеток сельскохозяйственных животных» ^ьяконсз

Tí Tí г ^лл™ 10ЯЯ) .......

Выделение

р-клвток из ПЖ плодов кроликов, собак, кошек

)

Гибридизация Получение

р-клеток плодов кролика ППЗК и их

с линиеи клеток почки дифференцировка

овцы (дефектной по ТК~) в р-клетки

изучение культурально-морфологических свойств

слияние клеток-партнеров

изучение культурально-морфологических свойств

определение продукции инсулина в культуральную среду

цитохимическое выявление инсулина

иммуноцитохимическое выявление инсулина

тест по стимуляции глюкозой

клонирование и реклонирование гибридов

кариологический анализ клонов на наличие хромосом клеток-па ртенров

определение гистосовместимости с сыворотками крови человека

суспензионное культивирование клонов

выделение ППЗК из плодов свиней

очистка ППЗК

культивирование ППЗК

клонирование ППЗК с получением колоний ЭПК

направленная дифференцировка ЭПК

в инсулин-продуцирующие клетки

изучение культурально-морфологичесхих свойств

определение продукции инсулина в культуральную среду

иммуноцитохимическое выявление инсулина

тест по стимуляции глюкозой

выявление инсулина с помощью молекулярно-биологических методов (ОТ-ПЦР и Вестерн блот)

определение продукции инсулина в культуральную среду

цитохимическое выявление инсулина

иммуноцитохимическое выявление инсулина

тест по стимуляции глюкозой

Трансплантация Р-кпеток плодов кролика лабораторным мышам с индуцированным сахарным диабетом

анализ содержания глюкозы в крови

изменение клинических проявлений диабета

1ищ111и ииипщиииш .......

Трансплантация Р-кпеток плодов кролика собакам и кошкам для лечения сахарного диабета

анализ содержания глюкозы в крови биохимический и клинический анализ крови и мочи

изменение клинических проявлений диабета

Рис. 1. Общая схема исследований.

Суспензионное культивирование гибридных клеток осуществляли на роллерной установке (Wheaton) во флаконах, обработанных силиконом.

Гистосовместимость гибридных клеток оценивали по методу микровариант комплемент - зависимой цитотоксической реакции (Абрамов В.Ю., 2005).

Наличие инсулина в экспериментальных клетках определяли с помощью цитохимического окрашивания альдегидфуксином.

Для иммуноцитохимического окрашивания экспериментальных клеток на инсулин использовали мышиные моноклональные антитела против инсулина (Sigma), специфичные для выявления инсулина кролика, собаки, кошки, свиньи. В качестве вторичных антител использовали антимышинные антитела, меченные FITC (Sigma), а также антимышинные антитела, меченные перокси-дазой хрена (Медгамал).

Уровень продукции инсулина в культуральной жидкости определяли методом радиоиммунного анализа (Ronald R., 1992) в лаборатории радиоизотопного анализа НИИТиИО с помощью наборов «Insulin RIA DSL 1 600, USA».

Эксперименты по цитотоксическому действию сыворотки человека на гибридные клетки проводили в присутствии комплемента человека или кролика. Использовалась взвесь гибридных клеток ПО ТК" х Ркр. в концентрации 600 тыс. кл/мл. Инкубация клеток с сывороткой человека составила 30 мин, а с комплементом человека или кролика (5 мкл) - 60 мин. Каждый эксперимент выполняли дважды.

Для проведения Вестерн-блотинга белки разделяли с помощью вертикального электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS) с последующим переносом их на нитроцеллюлозную мембрану и детекцией методом иммуноблотинга. Использовали первичные мышиные моноклональные антитела против инсулина (Sigma) и вторичные антимышинные антитела, меченные пероксидазой хрена (Amersham). В дальнейшем мембраны обрабатывали ELC-реагентом с регистрацией люминесценции на фотопленку Kodak Biomax Light Film (Sigma).

Уровень экспрессии мРНК инсулина в экспериментальных клетках определяли методом ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ ПЦР) в соответствии со стандартным протоколом. ПЦР проводилась в амплификаторе «Терцик». Продукты амплификации анализировали используя гель-электрофорез в 1,5 %-ом агарозном геле. Окраску гелей производили при помощи бромистого этидия в стандартной концентрации.

ППЗК из плодов свиней выделяли на 23, 26, 31 и 33-и сут. супоросности от естественно осемененных помесных свиноматок (крупная белая х ландрас). Культивирование ППЗК осуществляли на фидерных слоях, представленных перевиваемыми фибробластами мыши линии STO.

Фидерные STO-клетки, используемые при выделении и культивировании ППЗК, выращивали в среде DMEM, дополненной 10 %-ми СПК, 2тМ альфа-глутамила (ПанЭко) и 50 мкг/мп геитамицина (ПянЭко), Дпя подавления митоза клеток фидерных слоев при достижении ими монослоя использовали среду DMEM, дополненную 10 % СПК и 10 мкг/мл митомицина С (Sigma). Фидерные слои готовили по методике, описанной Савченковой И.П. (1999).

ППЗК свиней культивировали в С02 инкубаторе при температуре 37°С в контакте с газовой средой, содержащей 5 % С02. Средой служила ДМЕМ, содержащая 15 % СПК, 2тМ альфа-глутамина, 10'6 шМ 2-меркаптоэтанола (Serva), 50 мкг/мл гентамицина на предварительно приготовленном фидерном слое STO-клеток.

СД у лабораторных мышей BALB/c индуцировали внутривенным введением стрсптозотоцина (STZ) (Sigma) в дозе 150 мг/кг массы.

Внутрипеченочную трансплантацию клеток лабораторным мышам осуществляли интрапаренхиматозно под общей анестезией в дозе 100 тыс. кл./0,5 мл раствора на мышь.

Лабораторным собакам ß-клетки вводили подкожно в область холки двукратно с интервалом 19 сут. в дозе 100 тыс. клеток на 1 кг массы тела.

Собакам и котам с диагнозом СД клетки трансплантировали в паренхиму печени под эхографическим контролем в количестве 100 тыс. клеток на 1 кг массы тела непосредственно через брюшную стенку в паренхиму левой доли печени, без применения иммуносупрессивной терапии.

Уровень глюкозы в крови определяли глюкометром Accu-Chek Active (Roshe).

Оценку клинических и биохимических показателей крови и мочи после трансплантации проводили в ветеринарных лабораториях г.Москвы хозяева больных животных.

Все полученные данные подвергали биометрической обработке с определением достоверности различий между соответствующими показателями контрольных, опытных и интактных групп, с использованием общепринятых методов вариационной статистики (Лакан Г.Ф., 1990) и прикладных программ «Statistica 5.5», «Excel».

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1 Выделение из поджелудочных желез плодов кролика, собаки, кошки ß-клеток. Изучение их свойств и признаков

Работы по выделению ß-клеток из ПЖ животных и человека ведутся с шестидесятых годов прошлого столетия. Несмотря на то, что методы выделения OK в большинстве случаев являются рутинными, основное направление исследований сфокусировано на получении максимально очищенного материала с высоким процентом жизнеспособных клеток.

Наиболее удобной моделью (синхронность, доступность, стоимость и пр.) для отработки методов выделения плодных ß-клеток, безусловно, являются ПЖ плодов кроликов. При этом в качестве диспергирующего раствора при выделении наиболее часто используется коллагеназа (Feldman J. et al., 1975) и

с то/:\

J. Iti Ii V-11:1 .Ш.ИЧ D. tí UL., 17UUJ.

В кашей стране Шумакиб В.И. с соавш. (1995) для выделения ß-клеток из ПЖ плодов кроликов разработали модифицированный метод, использовав смесь равных долей коллагеназы и трипсина.

Получение р-клеток собак и кошек представляет собой более трудоемкий процесс. Краткосрочное (24 ч) культивирование фрагментов ПЖ собак впервые описано Matas A. et al. в 1976 году. Позже Scharp D. et al. (1980) предложили два метода выделения ОК из ПЖ собак для очистки материала от про-токовой, ацинарной и фиброзной тканей. В одном случае использовали колла-геназу в различных композициях, в другом - трипсин с последующим выделением клеток в градиенте Фиколла. Данный протокол был предложен как основа в отработке методов выделения р-клеток из взрослой ПЖ человека для ауто-и аллотрансплантаций. В последующем работы исследователей по получению ОК из ПЖ собак были направлены на совершенствование методов выделения максимального количества островков, а также на более качественную очистку материала от сопутствующих клеток.

Более сложными в получении культуры, пригодной для трансплантации, оказались р-клетки из ПЖ кошек. Маепо Т. et al. (2006) описали метод выделения островково-подобных клеток из ПЖ кошек с использованием коллагеназы и последующим культивированием в течение 9 сут в бессывороточной среде. Трансплантация под капсулу почки 4-м кошкам с удаленной ПЖ очищенных таким образом клеток, позволила добиться нормогликемии на протяжении 12 сут. Zini Е. et al. (2009) описали опыт получения кошачьих ОК 6-тью методами выделения с применением коллагеназы (варианты однократной и двойной обработки коллагеназой, последующее центрифугирование в градиенте Фиколла в присутствии коллагеназы или аккутазы). И хотя при использовании всех вариантов выход чистых ОК оказался одинаковым, он был чрезвычайно низок - не более 2 %.

Учитывая изложенное, представляло интерес выделить, охарактеризовать и сравнить в качестве материала для трансплантации р-клетки из ПЖ плодов кролика, собаки и кошки.

Для ферментативной обработки ткани ПЖ плодов кролика мы использовали трипсин или коллагеназу. В обоих случаях на 4-е сут. культивирования отмечали клеточные колонии с характерной для ОК ПЖ морфологией. К 7 сут. культивирования колонии р-клеток укрупнялись, формируя плотные многослойные конгломераты. По их краям наблюдали уплотненную зону роста фиб-робластов (Рис.2). Начиная с 10-12 дневного срока культивирования в культурах наблюдали инволютивные изменения, что коррелирует с данными Шумакова В. И. с соавт. (1995). Кондиционированная среда клеток плодов кроликов содержала инсулин в концентрации 38-80 мкИЕ/мл.

При окрашивании альдегид-фуксином отмечали специфическую пурпурную зернистость цитоплазмы в значительной части клеточных колоний клеток эпителиоподобной морфологии. Фибробласты при этом не прокрашивались (Рис.3). Интенсивность окрашивания существенно не менялась на протяжении всего срока культивирования клеток. Доля клеток со специфической зернистостью в колониях эпителиоподобных клеток превышала 90%.

При иммуноцитохимическом окрашивании культуры клеток, выделенной из ПЖ кролика, на инсулин с использованием флуоресцирующего красителя (Р1ТС), выявляли специфическое желто-зеленое «свечение» прикрепившихся к стеклу колоний ОК (Рис.4); а при использовании АТ, меченных пероксидазой хрена - специфическое окрашивание секреторных клеток (Рис.5).

Таким образом, по цитологическим признакам, наличию специфической альдегид-фуксин позитивной зернистости, окрашиванию мечеными АТ против инсулина, а также феномену дегрануляции, наступающему в ответ на повышение содержания глюкозы в культуральной среде можно было заключить, что выделенные нами клетки являются р-клетками островков Лангерганса ПЖ плодов кроликов.

Для выделения Р-клеток из ПЖ плодов собаки и кошки мы использовали методику с использованием раствора трипсин/версена. Характерной особенностью Р-клеток из ПЖ плодов собаки была способность при культивировании образовывать крупные колонии, от которых спонтанно отрывались клетки и плавали в суспензии, а затем снова прикреплялись, давая начало новым колониям (Рис.6). Уровень продукции инсулина во флаконах с секреторными клетками в среднем составлял 84 мкИЕ/мл. При окрашивании секреторных клеток на инсулин наблюдали специфическую пурпурную зернистость цитоплазмы (окраска ПАФ) или специфическое жёлто-зелёное свечение (ИЦХ с БЕГС).

Было установлено, что клетки плодов собаки по сравнению с кроличьими и кошачьими характеризовались самой низкой адгезией. В таких культурах было наибольшее количество плавающих клеток: одиночных и группами. Клетки, идентифицированные нами как Р-клетки, представляли собой округлые секреторные клетки с зернистой вакуолизированной цитоплазмой. Основной особенностью их было формирование крупных многослойных плавающих колоний. Пик митотической активности наблюдали на 4-5 сут. после выделения клеток, однако к 7-10 сут. культивирования клетки замедляли рост и появлялись признаки клеточной дегенерации. К 14 сут. в культуре не оставалось ни одной живой секреторной клетки.

В отличие от собак, Р-клетки из ПЖ плодов кошек на 3-4 сут. культивирования проявляли активный рост с преобладанием делящихся фибробластов (Рис.7). В монослое отмечали единичные эпителиоподобные клетки. После пересева с использованием трипсина клеточные культуры включали в себя только фибробласты. Без пересева клеток дегенерация монослоя происходила полностью к 10 сут. Такой характер роста клеток позволил нам заключить, что Р-клетки плодов кошки подвергаются вытеснению их фибробластами во время культивирования. Одной из причин этого являются, возможно, высокие адгезивные способности клеток данного вида, которые не позволяют их очистить.

Рис.2. Колония прикреплённых к пластику р-клеток ПЖ плодов кролика на фоне монослоя фкбробластов. Натнвный прапарат. 7 сут. культивирования. Микрофото. ув. 100.

Рис.4. Специфическое свечение конгломератов р-клеток плода кролика и одиночных клеток. 7 сут. культивирования. ИЦХ-ПТС. Микрофото. ув. 200.

Рис.б. Кластеры секреторных р-клеток плода собаки. 7 сут. культивирования. Натнвный препарат. Мнкрофото. ув. 100.

Рис.3. Секреторные клетки ПЖ плодов кролика, окрашенные ПАФ. 7 сут. культивирования. Микрофото. ув. 200.

Рис.5. Специфическое окрашивание инсулина, содержащегося в островках и одиночных р-клетках плода кролика. 7 сут. культивирования. IЬшуношгго химия (перокснлаза хрена). Микрофото, ув. 100.

Рис.". Формирование плотного монослоя фибробластов с небольшими плотными островками и вкраплениями единичных Р-клеток плода кошки. 7 сут. культивирования. Натнвный препарат. Мнкрофото. ув. 100.

С другой стороны, можно предположить, что они подвергаются ранней дегенерации, что делает эти клетки непригодными для дальнейшего культивирования и трансплантации.

Уровень секреции инсулина на 3 сут. культивирования составлял 77 мкИЕ/мл.

Таким образом, опираясь на данные, полученные в экспериментах по выделению Р-клеток ПЖ плодов кроликов, собак и кошек можно заключить, что культуры клеток, полученные из ПЖ кошек заметно отличались от культур собак и кроликов высокой адгезивной способностью.

Во всех опытах мы воспроизводили низкий уровень выхода секреторных клеток. Сроки жизни кошачьих культур были заметно короче: 16-18 сут. - срок жизни р-клеток плода кролика, 14 сут. - собаки, 10 сут. - кошки. Кластеров секреторных клеток в культурах Р-клеток ПЖ плодов кошек образовывалось гораздо меньше, адгезивная способность их была выше.

По проценту выхода секреторных клеток, сроку их жизни и степени чистоты клеточного материала для своих дальнейших исследований мы посчитали наиболее приемлемым материалом ПЖ плодов кролика. У клеток собак и кошек значительно меньше выход секреторных клеток и ниже их жизнеспособность. Кроме того, имеются определенные трудности в получении необходимого количества материала на определенных сроках гестации.

Доказательством того, что полученные и использованные нами в последующих исследованиях клетки являются именно р-клетками, служат культу-рально-морфологические свойства, цитохимическое и иммуноцитохимическое окрашивание клеток на инсулин, а также радиоиммунный анализ продукции клетками инсулина в культуре.

1.2 Межвидовая гибридная культура почки овцы ПО ТЬГ с fi - клетками поджелудочной железы плодов кроликов. Получение, клонирование и изучение её свойств и признаков

В задачу наших исследований входило получить культуру, способную длительно перевиваться, не обладать туморогенностью и в то же время продуцировать инсулин. Для этого необходимо было получить гибрид р-клеток, не пролиферирующих in vitro, с клетками из немалигнизированных тканей.

Учитывая недостаток литературных данных по гибридизации р-клеток, использовали методики, разработанные ранее в отделе клеточной биотехнологии ГНУ ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко, по получению гибридных линий на основе мутантной культуры ПО ТК". Проведено несколько серий экспериментов по гибридизации с целью подбора оптимальных условий гибридизации, при которых расход клеток будет минимальным, а индекс слияния наибольшим:

1. ПЭГ 4000 и экспозицию 1 ч в соотношении сливаемых клеток 1:10;

2. ПЭГ 4000 и экспозицию 12 ч в соотношении клеток 1:10;

3. ПЭГ 1000 с экспозицией 1 ч и клетки в соотношении 1:1.

Получено по 6 гибридных популяций клеток из каждой серии экспериментов (Таблица 1). Клетки гибридов первого поколения стимулировали глюкозой, что бы по выбросу инсулина из клеток оценить их потенциал.

Таблица 1 - Продукция инсулина (мкИЕ/мл) на ранних пассажах гибридами, полученными при разных условиях гибридизации.

Группа экспериментов Название полученного гибрида Пассаж Стимуляция глюкозой

0* 6 1 час 12 часов 24 часа

1. А 13,3 15,8 15,9 14,3 12,1

Б 14,3 15,5 - - -

В 12,7 14,7 - - -

Г 20,1 30,2 37,2 35,5 32,0

д 18,0 28,8 29,6 24,9 18,8

Е 12,9 13,1 - - -

2. 3.1.1.А 8,0 12,2 - - -

3.1.1.Б 10,5 9,6 - - -

3.1.1.В 6,3 13,1 13,9 12,4 10,2

3.1.1.Г 14,1 12,7 - - -

3.1.1.Д 7,5 13,3 13,8 12,9 11,8

3.1.1.Е 7,8 12,5 - - -

3. 3.1.2.А 13,2 18,1 20,7 19,4 19,0

3.1.2.Б 12,1 22,8 24,2 21,5 18,1

3.1.2.В 11,9 10,3 - - -

3.1.2.Г 14,6 14,0 - - -

3.1.2.Д 14,5 13,2 - - -

3.1.2.Е 17,2 13,6 - - -

Культуральная среда + сыворотка 1,7-12,3

Норма в сыворотке крови 4-16

Отрицательный контроль 15,99

Примечание:

Пробы культуральной жидкости для анализа отбирали на 6 сут. культивирования * - уровень продукции инсулина определяли в среде ГАТ на 8 сут. культивирования

Использование ПЭГ 4000 с экспозицией 1 час и 10-кратного количества секреторных клеток (1 млн. ß-клеток : 100 тыс. клеток ПО ТК~) (1 группа экспериментов) позволило получить гибриды с более высоким уровнем продукции инсулина (Таблица 1), по отношению к другим экспериментальным группам, в частности на 30% выше, чем в 3 группе. Использование ПЭГ 1000 и соотношением клеток 1:1 является оптимальным (100 тыс. ß-клеток : 100 тыс. клеток ПО ПС) (3 группа экспериментов), т.к. позволяет расходовать ß-клетки в экономичном режиме и полученные гибриды обладают достаточно высоким уровнем продукции инсулина и имеют в популяции большое число клеток с

морфологией, подобной р-клеткам ПЖ. Причем, наблюдали зависимость между морфологией клеток, характером роста культуры и секреторной способностью клеток. В гибридах наблюдали различное соотношение округлых секреторных клеток (с морфологией р-клеток, выделенных из ПЖ плодов кроликов) и эпителиоподобных клеток, обладающих высокими адгезивными свойствами. В клонах с высокой секреторной способностью наблюдали больший процент округлых клеток.

Было установлено, что уровень продукции инсулина на 6 сут культивирования на 6 пассаже в таких гибридах (с высокими продуктивными свойствами) составляет от 15,8 мкИЕ/мл до 30,2 мкИЕ/мл, что находится на верхней границе или почти в 2 раза превышает содержание инсулина в ростовой среде. Для дальнейшего клонирования мы отобрали именно эти клоны.

Гибриды клонировали на 7 пассаже методом предельных разведений. Всего при последующем отборе и реклонировании был получен 201 клон клеточной гибридной культуры.

В результате проводимого отбора методами цитохимии, иммуноцитохи-мии, радиоиммунного анализа на инсулин, стимуляции глюкозой оказались наиболее продуктивными клоны ГА-2, 3.2.17, 3.2.42 межвидовой гибридной культуры клеток ПО ТКГх Ркр. На уровне 24 пассажа имели соответствующие культурально-морфологические характеристики и высокий уровень продукции инсулина в культуральной среде. Кариологический анализ показал, что гибриды несут в своем составе хромосомы обоих партнеров по слиянию (овцы и кролика).

Однако после 32-го пассажа мы отмечали стабильное снижение уровня продукции гормона от пассажа к пассажу. Так, клетки клона ГА-2 снизили свою продукцию на 13 % от первоначальной, а клетки клонов 3.2.17 и 3.2.42 -на 28 % и 50 %, соответственно (Таблица 2).

Таблица 2 - Продукция инсулина (мкИЕ/мл) гибридными клонами при моно-слойном культивировании.

Гибридный клон № пассажа

10 24 32 40

ГА-2 29,7 28,7 25,9 22,7

3.2.17. 30,1 25,2 22,2 14,6

3.2.42. 26,2 20,0 13,2 6,3

Для повышения уровня секреции инсулина была проведена серия экспериментов по получению суспензионных штаммов гибридной культуры ПО ТК* х Ркр. Для этого использовали клоны:

- 3.2.17 на 32 пассажс (на момент качала эксперимента продукция инсу-

рллфпптжтт„ Т) Т . ..-ТЛТ? /.

.1111111 иогши И11\1 11Л 1ЧЛ/)

- 3.2.42 на 24 пассаже (продукция инсулина 20,0 мкИЕ/мл);

- ГА-2 на 54 пассаже (24,3 мкИЕ/мл).

В результате проведенных экспериментов было установлено, что на первых 2-3 пассажах культивирования в суспензии наблюдается увеличение продукции инсулина. Но с увеличением числа пассажей продуктивность клеток всех трех клонов заметно снизилась и к 11 пассажу наступила дегенерация клеток всех клонов (Таблица 3).

Таблица 3 - Продукция инсулина (мкИЕ/мл) гибридными клонами при суспензионном культивировании.

Гибридный клон № пассажа

до опыта 2 4 7 11

3.2.17. 22,2 28,7 16,4 дегенерация дегенерация

3.2.42. 20 26,1 17 дегенерация дегенерация

ГА-2 24,3 29,9 26 11,2 дегенерация

Примечание: нумерация пассажей ведется от начала опыта по суспензионному культивированию

Таким образом, установлена нестабильность признака секреции инсулина, присущего ß-клеткам ПЖ плодов кролика. Более того, при переводе гибридных клонов с максимальной продукцией инсулина в режим роллерно-суспезионного культивирования происходят изменения, которые вероятно ведут к утрате способности ими секретировать инсулин. Клеточные гибриды, полученные в результате слияния ß-клеток ПЖ плодов кролика и клеток почки овцы ПО ТК", способны продуцировать инсулин в культуральную среду, однако продукция эта нестабильна и зависит от длительности культивирования.

1.2.1 Определение гистологической совместимости гибридной культуры in vitro

Считается, что при пересадке островковых ß-клеток необходимо исключить контакт эндотелия донора с кровью реципиента, чтобы снизить вероятность гиперострого отторжения по типу гиперкоагуляции за счет продуцируемых тромбоцитами цитокинов (Badet L. et al, 2002).

Olphen A. et al. (2002) показали возможность нахождения на поверхности клеток-клонов гибридной линии человек х КРС (МДВК х 293-Puro) поверхностных антигенов любого из родителей, что доказывает неравномерное распределение хромосом родительских линий в дочерних клетках при последующих делениях. Этот факт позволил предположить отсутствие на поверхности гибрида ПО ТК" х |3кр. видовых антигенов вообще, что делает целесообразным проведение исследований на его гистосовместимость с другими видами животных. Представляло интерес определить степень вероятности отторжения гибридной культуры при трансплантации человеку.

Мы провели ряд тестов на гистосовместимость гибридной культуры ПО ТК" х ßKp. с сыворотками человека для определения возможности трансплантации инсулин-продуцирующих клонов больным СД (Таблица 4). Оценку реакции выражали в условных единицах цитотоксического теста (от 0 до 4).

Таблица 4 - Цитотоксическое действие сыворотки человека на гибридные клетки ПО ТК" х Ркр.

Цитотоксический агент № С комплементом

лунки человека кролика

^ лошади против лейкоцитов 1 0 4

человека

Пул сывороток человека, без 2 0 4

НЬА-антител, инактивиро- 3 0 4

ванных нагреванием 56°С 30 4 0 4

мин.

5 1 4

6 1 4

7 4 4

8 1 4

9 0 4

Сыворотка человека, АВ (IV) 10 0 4

(потенциальные реципиенты 11 0 4

почки, п=13) 12 4 4

13 2 4

14 0 4

15 3 4

16 3 4

17 4 4

18 4 4

19 2 4

20 0 4

Сыворотка человека (больные 21 0 4

22 0 4

кардиологического отделения, мужчины, п~10) 23 4 4

24 4 4

25 1 4

26 0 4

27 0 4

Комплемент кролика лизировал клетки ПО ТК" х ркр. во всех комбинациях, в том числе и в отсутствие сыворотки человека, что доказывает наличие видовых (кроличьих) АГ на поверхности гибридных клеток. Такой результат является положительным контролем наличия кроличьих хромосом в составе гибридной культуры.

Комплемент человека не лизировал клетки ПО ТК- х ркр. в 13 случаях из 23 (лунки 5. 6. 8-10, 11, 14, 20-22, 25-27). что составляет более 50 %, Этот эффект наблюдали в присутствии иммуноглобулинов лошади, инактивированной сыворотки человека и самостоятельно (Таблица 4,Таблица 5).

Таблица 5 - Цитотоксическое действие комплемента на гибридные клетки ПО ТК" х |3кр.

Дитотоксический агент № лунки С комплементом

человека кролика

1. Инкубация клеток в среде 199-30 минут. 2. Инкубация с комплементом человека или кролика 60 минут. 1 1 4

2 1 4

3 1 4

4 0 4

5 0 4

6 0 4

Из результатов видно, что межвидовая гибридная культура ПО ТК" х ркр. обладает определенной гистосовместимостью с AT человека.

Известно, что комплекс гистосовместимости человека представляет собой несколько пар аллельных генов, которые у животных могут отличаться по числу генов, входящих в этот комплекс или вообще их наличию.

Из-за того, что невозможно было определить в наших экспериментах, какие AT связываются с гибридными клетками, можно предположить, что отсутствие AT в сыворотках крови человека к клеткам гибридной культуры ПО ТК" х Ркр. еще не свидетельствует о гистосовместимости этих двух видов. Возможно появление антител (AT) при втором или третьем введении антигенных структур этих клеток. Нельзя исключить возможность сенсибилизации организма реципиента при однократном введении трансплантата, однако повторное введение материала может привести к анафилактической реакции, а также к отторжению трансплантата. В связи с этим, мы пришли к выводу, что вопрос о гистосовместимости гибридной культуры ПО ТК' х ркр. с человеком остается спорным и требует дальнейшего детального изучения.

1.3 Разработка модели получения инсулин-продуцирующих клеток in vitro с использованием стволовых клеток

1.3.1 Выделение примордиальных половых зародышевых клеток

(ППЗК) из плодов свиней и их очистка

Выделение ППЗК из зачатков гонад млекопитающих с целью получения из них культур ЭГПС позволяет создать экспериментальные модели для изучения in vitro процессов цитодифференцировки. Однако, получение и культивирование ППЗК весьма сложный и трудоемкий процесс. Для нас представляло интерес получить и охарактеризовать культуру ППЗК из плодов свиней.

ППЗК выделяли из плодов, взятых от свиноматок, которых забивали в различные сроки супоросности: на 23-и, 26-е, 31-е, 33-и сут.

Методом выделения и очистки от других клеточных типов, базирующимся на дифференциальной адгезии клеток к поверхности (Савченкова

И.П., 2001), нами были получены популяции клеток, принятые за ППЗК (Таблица 6).

Таблица 6 - Результаты очистки свиных ППЗК с помощью дифференциальной адгезии к поверхности

Возраст плода (сут.) Количество плодов Общее количество выделенных клеток на 1 плод Количество ППЗК на 1 плод Чистота клеточной популяции ППЗК (%)

23 14 2475000 737428 30

26 16 3359362 1269524 38

31 15 5792876 3674279 63

33 6 5918444 4537000 77

Было установлено, что ППЗК свиней обладают низкой адгезивной способностью. Поэтому метод разделения гоноцитов от примеси соматических клеток позволяет сформировать популяцию клеток, в среднем на 52% представленную ППЗК свиньи.

Основными критериями, на которых базировался отбор предполагаемых ППЗК, были их морфологические особенности и наличие фермента щелочной фосфатазы. Свежеизолированные ППЗК свиней показывали положительную реакцию на эндогенную щелочную фосфатазу, для них были характерны шарообразная форма и наличие крупного ядра, окруженного узким ободком цитоплазмы, размер клеток достигал в среднем приблизительно 13 мкм в диаметре. Кроме того, мы также наблюдали наличие выростов цитоплазмы - псевдоподий у ППЗК, мигрирующих в зачатки гонад.

Таким образом, выявленные в данной работе морфологические и биохимические свойства ППЗК согласуются с описанными в литературе.

1.3.2 Культивирование ППЗК свиньи

Культивирование ППЗК млекопитающих имеет большие трудности, связанные, прежде всего, с длительным поддержанием их в культуре, поэтому для нас представляло интерес изучить факторы, влияющие на длительное поддержание ППЗК in vitro.

После очистки ППЗК от примеси соматических клеток с использованием метода дифференциальной адгезии к поверхности и подсчета клеточной популяции, ростовую среду, содержащую ППЗК, в равных количествах переносили в чашки Петри с d=6 см на питательный слой, представленный монослоем из STO-клеток.

В результате эксперимента было установлено, что использование фидерного слоя в качестве подложки, является необходимым условием при культивировании ППЗК свиней. Мы обнаружили, что когда ППЗК культивировали в

отсутствие питательного слоя, то они сохраняли жизнеспособность только на протяжение 24-х ч.

С целью получения клеточной линии ЭПК мы попытались провести клонирование колоний, которое осуществляли на 8-е сут. культивирования ППЗК.

В результате были получены клоны ЭПК на питательных слоях, представленных STO-клетками. Так, в одной из лунок на 6-е сут. культивирования мы наблюдали образование 3-х новых колоний, которые сохраняли фенотип, характерный для эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), после перенесенных манипуляций.

В результате субклонирования было получено 28 компактных колоний клеток с типичным ЭСК-подобным фенотипом. Данные клетки не содержали жировых вакуолей и каких-либо других включений в цитоплазме, но каждая из них характеризовалась наличием ядрышка в ядре. Размер клеток в колониях достигал от 10 до 13 мкм в диаметре. При окраске таких колоний на ЩФ была отмечена позитивная реакция.

Представленная нами характеристика колоний ЭПК совпадает с имеющимися по этому вопросу литературными сведениями.

1.3.3 Направленная in vitro дифференцировка ЭПК свиньи в инсулин-

секретирующие клетки

Для индукции дифференцировки СК в клетки-продуценты инсулина мы использовали метод, описанный в работе O.Clark et al. (2007), для чего высевали очищенные ЭПК в коллагенизированные лунки планшета с добавлением 5 ммоль глюкозы, гидрокортизона, аскорбиновой кислоты, а также факторов роста - b-FGF (фибробластный), IGF (инсулиноподобный), VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), EGF (эпидермальный).

На 14 день культивирования в индукционной среде отмечалось формирование клеточных кластеров сферической формы. Колонии с подобной морфологией мы отмечали при культивировании свежевыделенной островковой ткани ПЖ плодов кролика и собаки.

Для выявления секреции инсулина мы провели стимуляцию полученных колоний клеток глюкозой. В результате было установлено, что экспозиция с повышенными концентрациями глюкозы приводила к увеличению количества инсулина в культуральной среде в 7 раз, достигая максимальных значений 200220 мкИЕ/мл при концентрации глюкозы 25 ммоль/л.

Иммуноцитохимическое окрашивание позволило выявить инсулин-позитивные клетки в полученной популяции.

С помощью ОТ-ПЦР был обнаружен продукт экспрессии гена инсулина, клетками, формирующими островково-подобные кластеры (Рис.8).

Актин Инсулин

М.м к+ эпк к- к+ эпк к-

460 Ьр

300 Ьр

Рис.8. Уровень экспрессии мРНК ACT и INS в клетках. ОТ-ПЦР.

Рис. 9. Содержание белка инсулина в клетках. Вестерн-блот.

Примечание:

ЭПК- Дифференцированные инсулин-продуцирующие клетки К- СПЭВ (Контроль -)

К+ Свиная ПЖ (Контроль+) _

Вестерн-блот анализ на выявление в клетках внутриклеточного инсулина показал достаточно высокое его количество в дифференцированных клетках (Рис.9).

На основании полученных данных мы сделали вывод, что ЭПК, полученные из ППЗК свиньи при индукции могут формировать in vitro инсулин-секретирующие клетки с морфологией р-клегок ПЖ.

1.4 Ксеногенная трансплантация Р-клеток поджелудочной железы плодов кролика лабораторным животным с индуцированным СД

В данной экспериментальной работе мы исследовали влияние ксеноген-ной культуры ОК, полученной из ПЖ плодов кролика, на организм мышей с экспериментальным (стрептозотоциновым) СД. Нам было важно подтвердить природу полученных нами р-клеток ПЖ плодов кролика, изучить качество и степень очистки материала, а также показать эффект от трансплантации этих клеток на течение СД и развитие его осложнений у лабораторных мышей.

После внутривенного введения стрептозотоцина в дозе 150 мг/кг у всех подопытных мышей развился тяжелый СД с высокой гликемией (более 20 ммоль/л) без тенденции к спонтанной реверсии. Наблюдалась полифагия, полидипсия, полиурия, выпадение шерсти, похудание, гиподинамия.

Через 10 сут. после введения STZ произвели контроль гликемии, а затем интрапаренхиматозную внутрипеченочную ксенотрансплантацию культуры р-клеток ПЖ кролика в дозе 105 кл/0,5 мл раствора на животное.

Таблица 7 - Характеристики экспериментальных групп мышей с индуцированным СД

Группы С роки после т эансплантации (сут.)

-1 1 3 7 14 21 28 35 42 49 56

Контроль ■ Глюк., ммоль/л 7,1 ±0,3 7,0 ±0,2 7,5 ±0,3 7,3 ±0,4 7,1 ±0,4 7,4 ±0,3 7,4 ±0,2 7,0 ±0,3 7,8 ±0,4 7,2 ±0,3 7,3 ±0,3

Масса, г. 27 ±0,4 27,2 ±0,5 26,8 ±0,4 28,1 ±0,3 27,8 ±0,5 28,2 ±0,4 28,0 ±0,3 28,0 ±0,4 29,4 ±0,5 29,5 ±0,3 29,3 ±0,4

Диабет и Глюк., ммоль/л 20,3 ±0,5 23,5 ±0,7 25,8 ±0,3 38,2 ±0,5 - - - - - - -

Масса, г. 23,4 ±0,4 23,7 ±0,5 21,9 ±0,4 20,4 ±0,2 - - - - - - -

Диабет + транспл. Р ся Глюк., ммоль/л 20,8 ±0,5 21,3 ±0,8 17,5 ±0,7 12,8 ±0,6 10,4 ±0,3 8,2 ±0,7 8,3 ±0,4 7,9 ±0,3 7,8 ±0,5 7,1 ±0,4 6,9 ±0,4

Масса, г 22,8 ±0,4 23,4 ±0,5 23,0 ±0,5 23,5 ±0,4 23,7 ±0,3 24,1 ±0,4 25,1 ±0,5 27,2 ±0,6 28,0 ±0,4 27,2 ±0,5 28,4 ±0,4

После трансплантации у 7 из 8 мышей (88 %) группы «Диабет + трансплантация» на 21 сут. установилась нормогликемия (8,2±0,7 ммоль/л), что свидетельствовало о влиянии трансплантированных ß-клеток на течение диабета (Таблица 7). При этом наблюдали стабилизацию массы тела и нормализацию потребления воды. Эти характеристики сохранялись в течение 8 недель без иммуносупрессии.

В группе «Диабет» (животные с экспериментальным диабетом без трансплантации) отмечалось ухудшение общего состояния животных, нарастание всех признаков диабета, стойкая гипергликемия (20-38 ммоль/л). Одна мышь погибла на 13-е сут. после введения STZ, 3 мыши на 14-е сут., 5 мышей погибли к 17-му дню эксперимента. Масса больных животных (20-23 г.) снизилась с начала эксперимента на 20-25 %. Таким образом, все мыши данной группы погибли в результате стойкой гипергликемии.

В контрольной группе животных изменений общего состояния и массы тела не отмечали при наличии стойкой нормогликемии (7,1-7,8 ммоль/л).

Статистическая обработка данных эксперимента показала достоверность результатов при Р<0,05.

Таким образом, результаты наших экспериментов показали, что трансплантация культуры фетальных кроличьих ß-клеток лабораторным мышам с экспериментальным СД позволяет добиться снижения уровня глюкозы крови и его нормализации на протяжении всего срока наблюдения (60 дней) без введения экзогенного инсулина. Полученные нами данные согласуются с таковыми отечественных и зарубежных исследователей (Rajotte R., 1983, Скалецкий H.H., 1987, Пужалин А. Н„ 2006, Писарев В.Б. с соавт., 2009). Кроме того, нормализация уровня глюкозы после трансплантации происходила без применения иммуносупрессантов, что позволило нам сделать вывод о возможности исследования выделенных нами прокультивированных и очищенных OK плодов кролика в клинической ксенотрансплантации домашним животным при лечении инсулинозависимого СД.

1.5 Определение иммуногенности 0-клеток плодов кроликов и вероятности иммуноотторжения посредством экспериментальной трансплантации

Ксенотрансплантация культур ОК лабораторным собакам позволила оценить степень иммуногенности культуры клеток и необходимость применения иммуносупрессивной терапии животным-реципиентам, больным СД.

Существует мнение, что при использовании предварительно культивированных ОК длительная ремиссия диабетического статуса может быть достигнута без иммуносупрессии, а также повторная трансплантация таких клеток не вызывает сенсибилизации организма (Блюмкин В. Н. с соавт., 1983; Скалец-кийН.Н., 1987).

Мы проверили степень реакции организма реципиента на введение культивированных ОК на лабораторных беспородных собаках вивария ветеринарной клиники «Биоконтроль» (РОНЦ РАМН).

Р-клетки плодов кроликов на 6 сут. культивирования вводили лабораторным собакам подкожно в количестве 100 тыс. клеток на 1 кг веса в область холки двукратно с интервалом в 19 сут.

Иммуносупрессию при введении клеток не проводили. Наблюдение за собаками проводили неотрывно в течение 24 ч после каждого введения клеток, далее в течение 14 сут. после первого введения и 4 сут. после повторного введения. Оценивали общее состояние животного, а также биохимические и общеклинические показатели крови на 7-14 и 23 сут. после начала эксперимента.

У собаки №1 наблюдали до опыта нейтрофильный лейкоцитоз, однако, при этом отмечали динамику снижения палочкоядерных нейтрофилов на 14 и 23 сут. после опыта. На 14 сут. наблюдали увеличение числа эозинофилов, количество которых на 4 сут. после второго введения клеток вернулось к норме. Снижение количества тромбоцитов вместе с усилением активности ами-нотрансфераз и нейтрофилезом свидетельствует о наличии вирусной инфекции (в частности, аденовирозе) у собаки.

У собаки №2 до начала эксперимента наблюдали ярко выраженную форму анемии, нейтрофилез, в основном за счет сегментоядерных клеток, увеличение числа моноцитов и эозинофилез; снижение активности панкреатической амилазы. После первого введения клеток наблюдали увеличение количества эозинофилов, после повторного введения их число было ниже предыдущего. После обоих введений клеток наблюдали динамику роста активности аминотрансфе-раз и снижения активности панкреатической амилазы.

У собаки №3 наблюдали явления анемии после 2-х введений клеток. Количество тромбоцитов было понижено и оставалось примерно на одном уровне на всем продолжении эксперимента. Перед началом опытов у собаки наблюдали нейтрофилез (за счет палочкоядерных нейтрофилов) и эозинофилез. После введения клеток количество эозинофилов вернулось в пределы нормы, наблюдали динамику снижения числа нейтрофилов. Активность панкреатической шчйЛоЗЫ СКИЖСНа На ПрОТЯЖСНИй БССГО ЭКСПЕрНМСНТа. ЧсрСЗ 14 Сут. ПОСЛс первого введения клеток наблюдали увеличение количества креатинина в сы-

воротке крови, что связано с эндогенными причинами и отношения к опыту не имеет.

Считаем, что эозинофилез у собак №1 и №2 не был связан с введением клеток, потому что второе введение спровоцировало бы еще более сильную аллергическую реакцию со стороны организма. Лейкоцитоза и тромбоцитоза после введения клеток не наблюдали. За время наблюдения состояние животных было удовлетворительным, признаков иммунных реакций, беспокойства, угнетения не наблюдали.

Данная работа позволила нам заключить, что иммунная реакция со стороны экспериментальных собак на введение р-клеток плодов кроликов отсутствовала. Это является обоснованием возможности проведения клинической трансплантации р-клеток животным, больным СД.

1.6 Изучение влияния Р-клеток, выделенных из поджелудочной железы плодов кролика, на течение инсулинозависимого сахарного диабета после их введения собакам и кошкам

Было изучено влияние трансплантированных р-клеток на течение СД у домашних животных: пяти собак и трёх котов.

В исследования включали животных с клиническими проявлениями СД: полидипсией, полиурией, полифагией, ожирением или нарастающей кахексией, с лабораторно установленной глюкозурией и гипергликемией, с согласия владельца животного.

По мнению Шумакова В. И. с соавт. (1995) и Shapiro J. et al (2002), ал-лотрансплантация OK считается более приоритетным методом, в связи с идентичностью клеточного материала донора и реципиента. При этом происходит синтез инсулина, что обеспечивает максимальную компенсацию СД и минимизирует риск развития осложнений ИЗСД. Однако Chu G. et al. (1997) продемонстрировали, что именно ксеногенные ОК не подвергаются аутоиммунному повреждению, что характерно для аллотранспладтации.

Ксеногенную трансплантацию р-клеток использовали Блюмкин В. Н. с соавт. (1983) и Скалецкий Н.Н. (1987), которые показали, что предварительное культивирование Р-клеток ксеногенных культур позволяет достигнуть длительной ремиссии течения диабета без иммуносупресии. В связи с этим, представляло интерес изучить влияние р-клеток, выделенных из ПЖ плодов кролика, на течение ИЗСД после их введения собакам и кошкам.

Собакам и котам очищенные предварительно путем культивирования р-клетки ПЖ плодов кролика мы трансплантировали чрезкожно в паренхиму печени под эхографическим контролем в количестве 100 тыс. клеток на 1 кг массы тела.

При выборе иммунопривилигированной зоны для переноса клеточной суспензии мы руководствовались результатами многих ученых, показавших, что внутрипечёночная пересадка признана наиболее эффективным способом введения р-клеток. Так, Bretzel R. et al. (1978) показали, что островки, транс-

плантированные в печень, способны к выживанию в течение нескольких лет, способствуя нормализации углеводного обмена и уровня гликозилированного гемоглобина, при отсутствии гипогликемии. При этом отсутствовали признаки отторжения и рецидива аутоиммунности, что было подтверждено гистологическими исследованиями. Ранее Najarían J. et al. (1977) вводя культуру Р-клеток в воротную вену, добились снижения потребности в инсулине у 3 из 4 больных сроком до 18 месяцев. Alejandro R. et al. (2002) использовали внутри-портальную трансплантацию и добились полного отсутствия инсулиновой зависимости в течение года.

Сразу после трансплантации мы отменяли либо значительно снижали дозу вводимого инсулина и наблюдения за животными выполняли под ежедневным контролем уровня глюкозы в крови. Назначение инсулина проводили только в случаях значительного превышения нормального уровня глюкозы и неудовлетворительного состояния животного.

В случае необходимости проводили симптоматическое лечение сопутствующих патологий. Уровень глюкозы в крови после трансплантации определяли хозяева животных глюкометром в домашних условиях 1-4 раза в сут. Биохимическое, клиническое исследование крови и общий анализ мочи проводили за 2-3 сут. до трансплантации и на 5, 21 и 60 сут. после трансплантации, затем по необходимости.

Об эффективности проведённой трансплантации судили по снижению потребности в экзогенном инсулине, уменьшении уровня глюкозы крови и мочи, нормализации показателей липидного обмена (кетоацидоза), течению диабетической полинейропатии и нефропатии, исчезновению полидипсии и поли-урии, улучшению общего состояния и повышению активности.

В результате мы провели трансплантацию р-клеток ПЖ плодов кроликов восьми инсулинозависимым животным с диагнозом СД. Следует заметить, что состояние животных, взятых в опыт, было изначально разным: у одних отсутствовали признаки осложнений, у других животных были ярко выражены, одним животным диагноз был поставлен давно, другие только недавно поступили на лечение. Как видно из данных, представленных в Таблице 8, положительного результата мы добились у 6 животных. Наблюдали улучшение лабораторных показателей, таких как снижение уровня глюкозы в крови и моче, исчезновение кетоацидоза. На Рис. 10-19 представлены графики, отражающие динамику изменения уровня глюкозы в крови и доз вводимого инсулина.

По результатам проведённого эксперимента можно сделать выводы, что внутрипечёночная трансплантация очищенных плодных р-клеток кролика позволяет достичь нормоголикемии у больных СД животных с полным отказом от эндогенного инсулина в 4 случаях из 8 (50 % от общего числа экспериментальных животных). В 2-х случаях из 8 было продемонстрировано снижение дозы экзогенного инсулина на 60 % и на 80 % в течение 8 мес. (25 % от общеГО "йСЛй OICCÍTCpfíivíб11ТоЛЬНЬХХ ЖИВОТНЫХ). Траксплактация СКаЗалаСЬ нсзффск-

TTIDUAU Г» О ^mrniav Ш Q И^о/,^ Uoimini г» 1 лтттоа тжг» О Afvr ллгкгат-пл ТТЛ 1тпта< г .................•• « «ы u <\tf, i.ivj/4ачи и х vjíJ1 nuv tu ^ uuDAvn/iwiM ntuirinri^-ivi

стероидного диабета-гиперкортицизма, при котором применяется принципиально другой тип лечения. Достоверно установлено, что у 6 животных из 8

Экспериментальное жисотное Снижение дсгы экэосеняоге инсулина Ся/f жтяя^уо сня ¿.7WKPJW *J»ÜBW К Jífírr HoieifíQ-sexTie хетеацнФояi Срок иияь.геним антндиа&апнч tCKOtV эффекта Нормализация аршнако» нефроиатии и ¿епвтопатив Признаки ухудшения состояния, порочные эффекты трсяааантатт Улучшение о&щего сеапбянпя (с? entre xi>2*ee)

1 2 3 4 i б 7 S

Бвллк -1 трансолавт. Деза ансулина ка момент трйЕСЕдазгегош 44 Елсут. В енк выраженности э-ффеЕта снажение дозы иисулана аз S0%. Сълтьоооргзвое снижена« уровня: тлюкогы Еровв. Снижение уровня иш^изы. яоча с 35 МИОЛЬ/Л ДО 17 УМОЛЬ-'З. Н; дипгностп-роззв С 12 ЕС «01 сух. снижение уровня гаюкозы в дозы мисулияа. Пек снижения на 36 CVF. Восстановление Бормальвого еттохя хёдчи. Лейьопзгтоз в первые 36 сут, Н»;з2члтгл »вое улучшегше.

Билля - 2 грдвспаавт. В шх ацралсеннссш эффекта сншьсвжг дож янсуляна на 30%. С^э^оосрашое сасжсзЕс урсьн* ГЛЮКОЗЫ ЕрОВН. С'ки^снес уровня ГЗЮьОЗЫ лота с 17 МЫОЛЬ.;."Г яо нормы. Эффект П0Л8НЛСЯ через 9 сут, продолжался 14 сут. Прпзнажв н-ефро- в гешют»хяй отсутствуют. 0тс>тсхвовал2.

Дяессв Доза явсудина sa моыеггг траясЕ-таатапшг 20 Ед/еут. С IZ сут. эксперимента и&зп&стио ОТЕЛЗЗЛПСЬ от ЕЕсуляна. Наолкдалв вор»гсглш:смгк> с 1 сут. после трансплантации, stсмотря са рмко* са&гсенне дозу нксулнна С б сут. а долге кетоновые тела в моче ве е&заружимлп. Эффект наступил срагу же после тр;з2С1тптлх?1гп и продлился oto.no i лет. К <50 суткам аггавнеехь ге-дгнотралефер аз »срвузссь & норме. 'Ж ел гзеде фнциткая аасмЕяг тромоогштоз-сясдстол« гветгроевзрноэьтом нп. 3ab$tnB0íi улу»ласвяс состояния.

Люся Доза инсулина аа момент трааеплаятацшг 14 Ед/сух. К. 60 сутхзьг дозу инсулгнз уаеднчнлп на 2S?¿. a 178 нз 64% по отзошению к хзреттрзнеплаятапЕгояяоп. Снижекне доэк пйсз-аинл провоцировала гзггергдпгЕштчеоде сазчкн.. К. сутааы погштлзсь кетоновые тела в моче. набзюгаяи. З-б ыеслз.еа поязилксь Ep25S2>nj поражения почек, уплачивалось ко.тичестао ояялр^ябанз s ыо?«. К 98 суткам пока елся 0«лок в моче. Гное ль ва 270 CJT. О* оята i «льнь: п длзгноз: гвлеркортядтм. Не ПОЬ;ЕПЯЛЛ В« OÓIEft? состояна« 2ле0тнсг0.

Л от Доза шгузявз ез моуеэт тразсвляятаиии 40 £д*ут. Снягив цнсулнна на ЗО^'ь ьаршнд скачвдоорзггшх шыенйзан урезая глюкозы осталась и норыогшгммшг ЛООПЯЯ.ТИГК уодзиТОЪЯЯ ДПХКГ НИГуЛ«НЙ "Колкчггтзо шоко ш в моче ие изменилось, а е. j 0 сушм -шучрпг.тд Не знатносга- р<5Я2Н. Некоторый эф фег.т наблюдала в ПРрЯОД wяду 39 И 50 CYIK2ÍÍ2. Аилввость АЛТ ло овыта - s pal выше вормк, к 351 дню - з 2 рата эыш^ (7 f гкяттягк F 1 рячл) К 39 стттг ^т^лгчялось колячсстзо лознкофкдп* Не поа::аяля на OOBEÍ ЖИВОТНОГО.

Продолжение таблицы 8

со

1 2 3 4 5 б 7 8

Линда Полная отмена инсулина к 25 сутхям с 30 Ед сут на момент трансплантации. Нормогшисемшг наступила на 6 сут., характеризовалась постоянные уровнем, без скачков. К 23 суткам гдюкозз в маче исчезла. Не диагностирован. Норысг.тикемая установиласьк 6 суткам, дальнейшее снижение дозы инсулина не вызывало скачков пшерглякежш. Признаков вторичных диабетических осложнений нет, но количество креаттшжа на 25°о выше верхнего порога нормы, а. 23 сутхан — норма. Незначительное увеличение активности амияотр ансфера з. Заметное улучшение состояния.

Мптроф ая Доза инсулина на момент трансплантации -0 Зд.'сут С 50 сут. инсулин вводили а дозе 13 Ед/сут, это на 354 ниже от начальной дэзы. К 172 суткам полностью <57КЭЗЯЛНСЬ от ¡шсушша. Полное отсутствие глюкозы а моче DPC.it тр ансплантадип. Нормогднкемпл при дозе инсулина 13 Ед;'сут установилась с 43 сут. С 172 сут. норг&глякемдя при отсутствие экзогенного инсулина. СВР сут. можно проследить динамику «гажевня глюкозы крови; снижение дозы инсулина предотвратило ГЕПОглякемачес кие екзчьн. Кот поступил на летаняе с признаками выроненного поражения печени. К 46 суткан сронющзо снижение активности печенотаьк ферментов в 1,25-2,8 рад. К 70 суткам активность эш ферментов узе дичилась, к 138 суткам еостояяне животного приблизилось к Ередтрансплантацаоннез4У. В первые 25 сут. наблюдали усиление активности амзнотр ансфераз. пашфеатжческой амзтш. Заметное улучшение состояния.

Каэямлр До» инсулина за шмент трансплантации 15 Ед:сут. В период с 4? по 11Р сут. средняя доза кнеулзна, обеспечивая норм огликклео. снизилась на $0°-* я составила 6 Ед Нерысгаикеан* при до 5« инсулина 9 Едсут, установилась с 6 сут.. прн дозе ивсулнна 6 Ед сут с 47 стт. К 25 суткам уровень глююош достиг норин. Изначально признаки тепато- н нефроаапш отсутствовали. К 5 и 46 суткам уровни креагнтшга н иочезаны были с-коло верхних порогов норык. На 5 и 46 сут. эксперимента отмечали признаки застойных яелснпй жглчевызодхщнх путей н рост панкреатической амялазы. Улучшение состояния.

Марс На момент трансплантатов дсаа жгогенногогвсузнна 10 Едсут. Через 2Р сут. после трансплантации полностью отказались от инсулина Стзопльаоз достигли к 34 сутаы эксперимента. С 7 от. уровень ГЛтОХг! нзчал снижаться; стзоплшашк глюкозы крозп к 34 суткам. С" 2? - полный отказ от ЕЕС7ЛПЕ1. Нам не удалось сяазнтъ Тфнзвакэв хронгчешзй соченной недостаточности. К <52 дню эксперимента вырос уровень креатннина и печеночных ферментов. Возможно, вследствие воспаллтельяыз либо процессов отторжения. Заыетасе улучшение состояния.

Рис.10 Динамика изменения уровня глюмиы в крови и до 5 вводимого инсулина Собака Билли

Сроки до и после трансплантации (сущиI

Рис. 12 Динамика изменения уровня глюкозы в крови и лоз вводимого инсулина. Собака Люся

20 I 18

| 10

4 0 1 3 в 17 55 ез газ ИГ С роки до и после трансплантации (сутки)

Рис. 11 Динамика изменения уровня глюкозы в крови и доз вводимого инсулина. Собака Джесси

Сроки до и после траисолантацм* (сутки)

Рпс.П Динамика и вменения уровня г люко зы в крови и доз вводимого инсулина. Собака Лоца

о •> » 4« ч* # Q # # f $ $ „■» # & & Ф 0 Сроки до и поел«- трансплантации (сутки)

Рис.14. Динамика изменения уровня глюкозы в крови и доз вводимого инсулина. Собака Линда

• : ; ! и г « !! в 5 9 ! а 4 : » (

Сроки до и послр траноллантации (¡'у тки)

Рис 15 Динамика изменения уровня глюкозы в крови и доз вводимого инсулина. Кот Митрофан

i "

Р®5

' » : t 8 8 S ! ! ! S S С С ! S S и : ■

Сроки до и поол* трансплантации (оутки)

Рис.16 Динамика изменения уровня глюкозы в крови и доз _вводимого инсулина Кот Казимир_

О 3 4 5 19 21 23 27 2Э 31 Сроки до и посла трансплантации (оутки)

Рнс.17. Динамика изменения уровня глюкозы в крови и доз вводимого _инсулина. Кот Марс_

Сутки до и после трансплантации

Рис.18. Сравнение динамики изменения дозы вводимого животным инсулина

испытуемых происходит улучшение лабораторных показателей: снижение уровня глюкозы в крови и моче, исчезновение кетоацитоза; значительное снижение доз экзогенного инсулина, либо отказ от него; улучшение течения сопутствующих СД осложнений (нефропатий, ангиопатий, гепатопатий).

Таким образом, можно предположить, что благодаря отсутствию «узнаваемости» очищенные путем культивирования Р-клетки ПЖ плодов кролика позволяют проводить ксеногенную трансплантацию материала собакам и кошкам без применения иммуносупрессантов. Кроме того, необходимо отме-

тить, что способ трансплантации р-клеток домашним животным в паренхиму печени, чрезкожно, под контролем ультразвука является неинвазивным способом и позволяет провести её без общей анестезии, без обездвиживания животного и без лапаротомии.

ВЫВОДЫ

1.Получены культуры ß-клеток ПЖ, выделенные из плодов кроликов, собак и кошек, изучены их свойства и признаки:

а) по цитологическим признакам, наличию специфической альдегид-фуксин позитивной зернистости, специфическому окрашиванию мечеными AT против инсулина, а также феномену дегрануляции, наступающему в ответ на повышение содержания глюкозы в культуральной среде, установлено, что выделенные клеточные популяции являются ß-клетками островков Лангер-ганса;

б) уровень продукции инсулина (в кондиционированных средах) ß -клетками кроликов составляет в среднем 80 мкИЕ/мл, собак - 84 мкИЕ/мл, кошек - 77 мкИЕ/мл, соответственно, на 3-4 сут культивирования;

в) выявлена низкая адгезивная способность ß-клеток ПЖ плодов кролика, которая позволяет их очистить от остальных типов клеток в процессе культивирования, посредством последовательного отбора и переноса в новые культуральные флаконы.

2. Сравнительный анализ свойств и признаков ß-клеток, выделенных из ПЖ плодов кроликов, собак и кошек показал, что наиболее перспективным материалом для клеточной инженерии являются кроличьи ß-клетки.

3. Получены межвидовые гибридные клоны - продуценты инсулина посредством слияния ß-клеток, выделенных из ПЖ плодов кролика, и клеток почки эмбрионов овец, дефектных по ТК (ПО TIC), в соотношении 1:1, соответственно, в присутствии ПЭГ 1000:

а) сравнительный анализ межвидовых гибридных клонов ПО ТК' х ßKp. по способности продуцировать инсулин in vitro показал, что полученная популяция гетерогенна и представлена 4 клонами с повышенной продукцией инсулина (18-30 мкИЕ/мл).

б) отбор клонов с высокой продукцией инсулина и их последующее ре-клонирование позволяют сохранить продукцию инсулина in vitro в течение 24 пассажей и нормальный кариотип.

в) установлено, что длительное культивирование (до 54 пассажа) и перевод клеток в суспензионное культивирование приводит к снижению уровня продукции инсулина межвидовыми клеточными гибридами.

4. Микролимфоцитотоксический тест показал, что межвидовая гибридная культура ПО ТК' х ßKp. обладает определенной гистологической совместимостью с антителами человека.

5. Из 23-33-х суточных плодов свиньи выделены первичные половые клетки (ППЗК) и разработаны условия поддержания их в культуре. Установ-

лено, что наличие фидерного слоя, представленного эмбриональными фиб-робластами мыши линии STO и среды ДМЕМ, дополненной 15% сыворотки плодов коров, 2тМ альфа-глутамина, 10"6 шМ 2-меркаптоэтанола позволяет получить колонии эмбриональных половых клеток (ЭПК) с фенотипом подобным ЭСК свиньи.

6. Культивирование ЭПК свиньи в индукционной среде, содержащей глюкозу, гидрокортизон, аскорбиновую кислоту, а также факторы роста - Ь-FGF, IGF, VEGF, EGF ведет к их направленной дифференцировке in vitro в клетки с морфологией, подобной р-клеткам ПЖ.

7. Установлено, что трансплантация культуры фетальных кроличьих р-клеток лабораторным мышам с экспериментальным СД позволяет добиться снижения уровня сахара в крови и его нормализации на протяжении 60 сут. без введения экзогенного инсулина. Нормализация уровня глюкозы после трансплантации происходит без применения иммуносупрессантов.

8. Показано, что длительное культивирование р-клеток ПЖ плодов кролика способствует снижению иммунной реакции у экспериментальных собак на их введение.

9. Установлено, что ксеногенная трансплантация р-клеток ПЖ плодов кролика позволяет добиться положительного результата у 6 животных из 8 испытуемых. В результате наблюдали: улучшение лабораторных показателей - снижение уровня глюкозы в крови и моче, исчезновение кетоацидоза; значительное снижение доз экзогенного инсулина, либо отказ от него; улучшение течения сопутствующих СД осложнений (нсфропатий, ангиопатий, гепа-топатий).

10. Предложен новый неинвазивный способ введения р-клеток домашним животным через брюшную стенку в паренхиму левой доли печени, под контролем ультразвука, который позволяет провести трансплантацию без общей анестезии, без обездвиживания животного и без лапаротомии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Очищенные путем культивирования р-клетки ПЖ кролика могут быть использованы для клинической трансплантации животным, больным СД.

2. Гибридную культуру ПО ТК- х ркр. возможно использовать для дальнейших исследований, направленных на получение постоянной линии клеток, продуцирующей инсулин in vitro.

3. р-клетки, получаемые дифференцировкой из ППЗК, возможно применять в дальнейших исследованиях, направленных на разработку методов клеточной терапии для лечения СД.

4. Трансплантация р-клеток ПЖ плода кролика непосредственно через брюшную стенку в паренхиму левой доли печени, без применения иммуно-супрессивной терапии, позволяет добиться снижения уровня глюкозы крови и улучшения течения ангиопатий у больных С Д.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Приданцева Т.А. Выделение и культивирование примордиальных половых зародышевых клеток свиньи / Т.А. Приданцева, И.П. Савченкова, Абдрахманов И.К. // Ветеринарная патология. - 2003.- №1(5). - С. 37-39.

2. Абдрахманов И. К. Стволовые клетки животных (История и перспективы) / И. К. Абдрахманов // Ветеринарная патология - 2005.- №1(12) -С. 55-58.

3. Сережина Л.А. Клинические наблюдения за результатами внутрипе-чсночной трансплантации ксеногенных островковых клеток поджелудочной железы плодов кролика трем животным при лечении сахарного диабета / Л.А. Сережина, Н.М. Туржанская, Л.П. Дьяконов, И.К. Абдрахманов, М.А. Селюгин, Ю.А. Кузнецов // Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные. -2005,- № 3,- С. 13-15.

4. Кузнецов Ю.А. Сахарный диабет мелких домашних животных / Ю.А. Кузнецов, М.А. Селюгин, И.К. Абдрахманов // Ветеринарная патология. -2006.-№2(17).-С. 81-85.

5. Абдрахманов И.К. Гибридные клеточные системы - новый подход в биотехнологии продуцентов биологически активных веществ / И.К. Абдрахманов, Т.В. Гальнбек, H.H. Скалецкий, М.Л. Фридман, Л.П. Дьяконов, П.М. Кленовицкий // Фундаментальные исследования - 2008,- № 5,- С. 13.

6. Фридман М.Л. Стволовые клетки кожи - перспективный источник генетического материала редких и исчезающих видов животных / М.Л. Фридман, И.К. Абдрахманов // Ветеринарная патология. - 2008. -№4. - С. 6265.

7. Абдрахманов И.К. Внутрипеченочная трансплантация островковых клеток поджелудочной железы для лечения сахарного диабета у домашних животных (Собаки и кошки) / И.К. Абдрахманов, М.А. Селюгин, Ю.А. Кузнецов, Л.П. Дьяконов, Л.А. Сережина, И.Ф. Вилковыский // Ветеринарный врач. -2008. -№6. - С. 37-38.

8. Абдрахманов И.К. Клинические результаты внутрипеченочной трансплантации ксеногенных островковых клеток поджелудочной железы плодов кролика домашним животным при сахарном диабете / И.К. Абдрахманов, Л.А. Сережина, М.А. Селюгин, Н.М. Туржанская, Ю.А. Кузнецов, И.Ф. Вилковыский, Н.Б. Савенко, В.Н. Митин, Л.П. Дьяконов // Российский ветеринарный журнал. - 2011. - №2. - С. 14-18.

9. Абдрахманов И.К. Пути преодоления иммунного отторжения при ксенотрансплантации островковых клеток поджелудочной железы в лечении сахарного диабета / И.К. Абдрахманов, Л.А. Сережина, М.А. Селюгин, Н.М. Туржанская, Ю.А. Кузнецов, И.Ф. Вилковыский, Н.Б. Савенко В.Н, Митин Л.П, Дьяконов // Ветеринарный впач. — 201!. - №4. — С. 31-34.

10. Абдрахманов И.К. Культуры ß-клеток поджелудочной железы животных - источник материала для трансплантации в терапии сахарного диа-

бета домашних животных / И.К. Абдрахманов, Н.Б. Савенко // Достижения науки и техники АПК. - 2011. - №8. - С.63-65.

Патент на изобретение

11. Способ получения трансплантата для лечения сахарного диабета у собак и кошек и способ лечения сахарного диабета у собак и кошек. Абдрахманов И.К. [и др.]: патент, на изобретение РФ №2325921. - 2006.

Статьи, материалы, тезисы

12. Приданцева Т.А. Влияние возраста плодов свиньи на выделение из них примордиальных половых зародышевых клеток / Т.А. Приданцева, И.П. Савченкова, И.К. Абдрахманов, Г.Ф. Жирков, JI.K. Эрнст // Материалы научно-практической конференции по проблеме «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения». - РАМЖ - п. Быково, Московская область, 2000. - С. 84.

13. Приданцева Т.А. Влияние возраста плодов свиньи на выделение из них примордиальных половых зародышевых клеток и получение колоний с морфологией эмбриональных стволовых клеток / Т.А. Приданцева, И.П. Савченкова, И.К. Абдрахманов, Г.Ф. Жирков, JI.K. Эрнст // Тезисы докладов научной конференции, посвященной 60-летию ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных, «Селекционно-генетические методы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных». - ВНИИРГЖ -Санкт- Петербург, 2000. - С. 64-65.

14. Приданцева Т.А. Выделение примордиальных половых зародышевых клеток из плодов свиньи / Т.А. Приданцева, И.П. Савченкова, И.К. Абдрахманов, Г.Ф. Жирков, JI.K Эрнст // Тезисы докладов И-ой Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». - ВНИИСХБ - Москва, 2000. - С. 44-46.

15. Pridantseva Т. Isolation of primordial germ cells from pig fetuses / T. Pri-dantseva, I. Savchenkova, I. Abdrakhmanov // Proceedings of the VIIth International Congress of Andrology «Andrology in the 21st Century». - Montreal, Quebec, Canada, 2001. - pp. 143-148.

16. Абдрахманов И.К. Сравнительный анализ эффективности ретрови-русных векторов в переносе экзогенной ДНК в клетки млекопитающих, культивируемые in vitro / И.К. Абдрахманов, И.П. Савченкова, Т.А. Приданцева, Н.А. Зиновьева, Л.К. Эрнст // Доклады РАСХН. - 2001. - № 5. - С. 30-31.

17. Teplyashin A. Characterization of human MSC-like cells isolated from bone marrow, adipose tissue, skin and placenta / A. Teplyashin, N. Tchupikova, S. Sharifullina, M. Rostovskaya, S. Koijikova, I. Abdrakhmanov, A. Dunaev, S. Petrin, I. Savtchenkova // Annual Fall Meeting of German Society for Biochemistry and Molecular Biology, MOnster, 2004.

18. Абдрахманов И.К. Получение островковых клеток поджелудочной железы плодов кролика и предпосылки для их клинического применения в ветеринарной медицине / И.К. Абдрахманов, Л.П. Дьяконов, М.А. Селюгин, Ю.А. Кузнецов // Тезисы докладов международного симпозиума «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний». - Казань, 2005. - С. 416420.

19. Дьяконов Л.П. Кариологическая характеристика некоторых межвидовых гибридных культур клеток животных. Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных / Дьяконов Л.П., Гальнбек Т.В., Сафина А.Н., Симонова A.C., Савенко Н.Б., Абдрахманов И.К., Клсно-вицкий П.М. // Сб. научн. тр. ВИЭВ, 2006. - С. 635-640.

20. Каталог Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК(П), (СХЖ РАСХН). Л.П. Дьяконов, Т.В. Гальнбек, Г.Т. Акиншина, И.К. Абдрахманов [и др.]. Всерос. науч.-исслед. ин-т эксперим. ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ), Отдел клеточной биотехнологии и питательных сред. - 2-е изд. (доп., уточнен.). - Москва, 2006. - 115 с.

21.Zhukova O.S. Cytotoxic effect of catalytic system containing phtalocya-nine and naphtalocyanine complexes and ascorbic acid on normal and tumor cells / O.S. Zhukova, I.K. Abdrakhmanov, G.K. Gerassimova, L.P. Dyakonov // Abstracts 46th ETCS International Meeting "In vitro cytotoxicity mechanisms". Verona, March 26-29, 2006. - P.46.

22. Абдрахманов И.К. Гибридные клеточные системы - новый подход в биотехнологии продуцентов биологически активных веществ / И.К. Абдрахманов, Т.В. Гальнбек, М.Л. Фридман, Л.П. Дьяконов // Материалы международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы исследовании по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел». - ВИЭВ, Москва, 2008. - С.307-311.

23. Радиоэкотоксикологическая микробиология / Иванов A.B., Низамов Р.Н., Плотникова Э.М., Абдрахманов И.К.//- М.: Колос, 2009. - 680 с.

Отпечатано в типографии ООО "Франтера" ОГР№ 1067746281514 от 15.02.2006г. Москва, Талалихина, 33

Подписано к печати 17.10.2011г. Формат 60x84/16. Бумага "Офсетная №1" 80г/м2. Печать трафаретная. Усл.печ.л. 2,00. Тираж 100. Заказ 455.

WWW.FRANTERA.RU

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Абдрахманов, Игорь Камильевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1 ВВЕДЕНИЕ.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Классификация СД.

2.2 Этиология и патогенез СД.

2.3 СД у домашних животных: современные методы лечения.

2.4 Инсулин - свойства и функции в организме.

2.4.1 Биосинтез инсулина.

2.4.2 Способы промышленного получения инсулина.

2.5 Развитие современных биотехнологических подходов к лечению ИЗСД

2.5.1 Стволовые клетки в реконструкции панкреатической функции.

2.5.2 Манипуляции с клетками млекопитающих, направленные на получение клеток с заданными свойствами.

2.5.2.1 Генетическая трансформация клеток.

2.5.2.2 Методы клеточной инженерии.

2.5.2.3 Гибридизация соматических клеток животных. Особенности получения гибридных клеточных культур на основе клеток - продуцентов биологически активных веществ и способы оценки гибридов.

2.5.2.4 Суспензионное культивирование клеток - продуцентов биологически активных веществ.

2.5.3 Особенности получения и культивирования Р-клеток - донорского материала для трансплантации.

2.5.3.1 Механизм пролиферации и факторы роста Р-клеток.

2.6 Трансплантация Р-клеток при лечении СД 1.

2.6.1 Биологическая совместимость тканей при трансплантации, НЬА-типирование.

2.6.2 Период «гестационного окна».

2.6.3 Иммунопривилегированные зоны для трансплантации островковых клеток

2.6.4 Трансплантация Р-клеток и островков Лангерганса.

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.ч.

3.1 Оборудование и реактивы.

3.2 Культуры клеток и методы работы с ними.

3.3 Гибридизация клеток.

3.4 Исследования на гистологическую совместимость.

3.5 Методы определения продукции инсулина.

3.6 Трансплантация клеток.

4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1 Выделение клеточных популяций, представленных р-клетками поджелудочной железы плодов животных и их очистка.

4.1.1 Выделение клеточных популяций, представленных Р-клетками ПЖ плодов кроликов и их очистка.

4.1.2 Выделение клеточной популяции, представленной Р-клетками ПЖ плодов собак и их очистка.

4.1.3 Выделение клеточной популяции, представленной р-клетками ПЖ плодов кошек и их очистка.

4.1.4 Стимуляция Р-клеток из ПЖ плодов кролика, собаки и кошек глюкозой.

4.2 Межвидовая гибридная культура почки овцы по ТК" с Р-клетками поджелудочной железы плодов кроликов, получение, клонирование и изучение её свойств и признаков.

4.2.1 Проверка на реверсию мутантной по тимидинкиназе культуры почки овцы

4.2.2 Определение показателя отрицательного контроля для оценки секреции инсулина гибридными и первичнотрипсинизированными р-клетками.

4.2.3 Гибридизация мутантной культуры ПО ТК -150 с Р-клетками, выделенными из ПЖ плодов кролика.

4.2.4 Клонирование гибридов ПО ТК- х (Зкр.

4.2.4.1 Потомки гибридов 3.1.2.А, 3.1.2.Б.

4.2.4.2 Клонирование клеточного гибрида Д.

4.2.4.3 Клонирование клеточного гибрида Г.

4.2.4.4 Реклонирование клона Г-2.

4.2.4.5 Реклонирование клона Г-1.

4.2.4.6 Реклонирование клона ГГ-4.

4.2.5 Стимуляция клеточных гибридов глюкозой.

4.2.6 Цитохимическое и иммуноцитохимическое выявление инсулина гибридными клетками.

4.2.7 Селекция клонов гибридной культуры ПО ТК" х |3кр с наиболее высокой продукцией инсулина.

4.2.8 Культурально-морфологические, кариологические и секреторные свойства гибридного клона ГА-2 культуры клеток ПО ТК- х (Зкр.

4.2.9 Кариологические свойства клонов гибридной культуры ПО ТК- х 0кр

4.2.10 Получение суспензионных клонов гибридной культуры ПО ТК- х |3кр

4.2.11 Определение гистологической совместимости гибридной культуры т vitro

4.3 Разработка модели получения инсулин-продуцирующих клеток in vitro с использованием стволовых клеток.

4.3.1 Выделение примордиальных половых зародышевых клеток из плодов свиней и их очистка.

4.3.2 Культивирование ППЗК свиньи.

4.3.3 Направленная in vitro дифференцировка ЭПК свиньи в инсулин -секретирующие клетки.

4.4 Ксеногенная трансплантация Р-клеток поджелудочной железы плодов кролика лабораторным животным с индуцированным СД.

4.5 Определение иммуногенности Р-клеток плодов кроликов и вероятности иммуноотторжения посредством экспериментальной трансплантации.

4.6 Изучение влияния фетальных р-клеток поджелудочной железы кролика после трансплантации собакам и кошкам на течение ИЗСД.

4.6.1 Особенности клинической оценки лабораторных показателей как отражение состояния больных животных и эффективности трансплантации

4.6.2 Влияние трансплантации островковых клеток поджелудочной железы кроликов на течение СД у собак и кошек.

5 ВЫВОДЫ.

6 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка новых биотехнологических методов получения инсулина и лечения инсулинозависимого сахарного диабета мелких домашних животных"

1.1 АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Инсулинозависимый сахарный диабет (ИЗСД) является тяжелейшим заболеванием, вследствие повреждения островковой ткани поджелудочной железы (ПЖ) и сопровождается абсолютной инсулиновой недостаточностью. Синдром ИЗСД опасен не только нарушенным метаболизмом глюкозы, но, прежде всего, своими осложнениями: диабетической ретинопатией, приводящей к полной потере зрения, нефропатией, приводящей к отказу почек, поражением сосудов ног, сосудов сердца и мозга [105]. В последние десятилетия стало всё более и более очевидно, что капиллярные осложнения СД являются следствием гипергликемии. Основной задачей в сдерживании развития патологического процесса при СД является постоянный контроль уровня глюкозы крови [322].

В настоящее время во всем мире зарегистрировано резкое увеличение заболевания СД, и, как прогнозируют специалисты, в дальнейшем статистика заболевания будет только расти. В связи с этим Международная диабетическая федерация инициировала массовое движение общественности по распространению среди широких слоев населения планеты информации об угрозе диабета. Результатом этой широкомасштабной акции стало принятие Организацией Объединённых Наций Резолюции по СД за №

61/225 от 20 декабря 2006 года, в которой стремительный рост заболеваемости диабетом объявлен чрезвычайной угрозой для всего мирового сообщества [83-е пленарное заседание организации Объединенных

Наций, 20 декабря 2006 года]. В Резолюции звучит призыв государствам членам ООН принять экстренные меры для борьбы с диабетом и разработать национальные программы профилактики и лечения диабета. СД во всеуслышание признан медико-социальной проблемой XXI века, которая может привести к эпидемии неинфекционного характера и, как следствие, к тяжёлым социально-экономическим и демографическим последствиям. 9

СД по распространённости занимает первое место среди эндокринологических заболеваний и третье место после сердечнососудистых и онкологических заболеваний. В 1965 г. в мире насчитывалось 30 млн. диабетиков, а в 1972 г. - уже 70 млн. По состоянию на 2002 г. в мире СД болело около 120 млн. человек, а к 2025 году их число по прогнозам увеличится до 380 млн. человек. Ежегодно число диабетиков увеличивается примерно на 7 млн. человек, а от болезней, обусловленных СД, каждый год умирают около 3,8 млн. человек. Однако это лишь приблизительные расчёты, т. к. при существующем стремительном росте заболевания трудно приводить какие-либо точные данные.

Статистика заболевания по странам в процентном отношении к населению выглядит приблизительно так: Россия - 3-4%, США - 4-5%, страны Западной Европы - 4-5%, страны Латинской Америки - 14-15%.

По данным официальной статистики СД в России страдают более 2 млн. человек. Ведущие специалисты считают, что эта цифра существенно занижена и на самом деле число больных диабетом в России в 2-3 раза превышает официальную статистику и может достигать 7 млн. человек. Около 15 тыс. детей до 15 лет имеют диабет 1 типа, и ежегодно диагностируется еще приблизительно 2500 случаев диабета в этой возрастной группе.

Урбанизация планеты накладывает своё влияние на неуклонный рост заболеваемости СД не только на население городов, но и на т.н. «животных - спутников» - собак и кошек. Считается, что в городах, в среднем на 200 кошек или собак приходится одно животное с диагнозом ИЗСД. Как у собак, так и кошек, причиной возникновения СД служит гибель или дисфункция панкреатических Р-клеток, а факторами, способствующими его развитию, являются гиподинамия, дисбаланс компонентов рациона, переедание и связанное с этим ожирение.

Принимая во внимание угрожающие данные по статистике СД, остро встает вопрос о разработке принципиально новых подходов к его лечению.

Существующие методы лечения СД в гуманной медицине -инсулинотерапия и трансплантация ткани или всей ПЖ. Инсулинотерапия, по сути, не является лечением, это только способ отодвинуть на некоторое время наступление выраженных нарушений углеводного обмена, и, как следствие, осложнений СД. Препараты коммерческого инсулина, производимые фармкомпаниями, высокоэффективны и созданы для максимально приближения к природному, однако методы генной инженерии не могут в полной мере смоделировать процессы биологического синтеза «зрелой» молекулы гормона, происходящие в (3-клетках ПЖ. Поэтому постепенное развитие инсулинорезистентности, гипо- и гипергликемические скачки (из-за сложностей расчёта необходимого в данный момент количества экзогенного инсулина организму) для людей, применяющих инсулин, и развитие осложнений неизбежны.

Другой широко распространённый метод - это трансплантация части органа или всей ПЖ. Однако спрос на донорские органы превышает предложение. Кроме того, на сегодняшний день стало очевидно, что, несмотря на совершенствование медицинских технологий, в этой области существует множество проблем и, прежде всего, этического характера, а также необходимость применять иммуносупрессоры, которые сами обладают диабетогенным действием [296, 325].

Лечение сопутствующих диабету ангиопатий эффективно только на фоне достигнутого стабильного содержания глюкозы в крови. Все еще не решена проблема профилактики и коррекции инсулиновой недостаточности в абдоминальной хирургии, т.к. при тяжёлых сочетанных повреждениях двенадцатиперстной кишки и ПЖ, а также при тяжёлом хроническом диффузном панкреатите предполагается тотальное удаление данных органов в комплексе с селезёнкой. При этом развивается выраженный постспленэктомический иммунодефицит [9, 84]. Введение больших доз инсулина [36, 41] не позволяет достичь желаемых результатов, т.е. полной компенсации углеводного обмена, и тем самым замедлить или остановить прогрессирование поздних сосудистых осложнений СД.

В ветеринарии же лечение СД мелких домашних животных сводится только к инсулинотерапии, соблюдению диеты и симптоматическому лечению осложнений.

Профилактика СД 2 сводится к правильному сбалансированному питанию, активному образу жизни, соблюдению гигиенических правил, устранению очагов хронической инфекции в организме, поддержанию естественной микрофлоры организма.

Достижение строгой компенсации углеводного обмена у больных СД, близкой к нормогликемии, может быть достигнуто только применением технологий, предусматривающих наличие такой же нормальной обратной связи регуляции углеводного обмена, как и в здоровом организме [19].

Успешное внедрение в практику экспериментальной биологии методов длительного культивирования стволовых клеток (СК) и клеток-предшественников различных тканей человека, работа с (3-клетками ПЖ, поиск адекватного клеточного материала, не вызывающего иммунного отторжения трансплантатов, создали предпосылки для разработки технологий заместительной клеточной и тканевой терапии. Один из таких методов - трансплантация в организм больного ИЗСД ОК ПЖ -представляется перспективным способом достижения гликемического контроля, поступления в организм эндогенного инсулина, предотвращения тяжёлых гипогликемий и сопутствующих осложнений [164].

Трансплантация (3-клеток ПЖ как потенциальный метод лечения диабета была внедрена в медицинскую практику более 10 лет назад, в ветеринарии этот метод не был отработан ни экспериментально, ни клинически. Однако применение этого метода будет всегда ограничиваться трудностями получения достаточного количества островков от доноров. Решением проблем тканевой трансплантации, а, следственно, лечения ИЗСД людей и животных, является разработка методов получения возобновляемых ресурсов клеток путём использования клеточных технологий.

1.2 ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ

Цель настоящей работы: разработать новые биотехнологические методы, направленные на получение инсулина, а также на лечение инсулинозависимого сахарного диабета мелких домашних животных.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Выделить из ПЖ плодов кролика, собаки, кошки (З-клетки, очистить; изучить их свойства и признаки in vitro.

2. Провести гибридизацию (3-клеток ПЖ плодов кролика с мутантной линией почки овцы, дефектной по тимидинкиназе (ПО ТК~).

3. Провести сравнительный анализ клонов межвидовых гибридных культур ПО ТК" х (З-клетки и отобрать клоны с высокой продукцией инсулина.

4. Адаптировать клоны с наиболее высокой продукцией инсулина к роллерно-суспензионному культивированию и получить суспензионные клоны гибридной культуры.

5. Изучить гистологическую совместимость межвидовых гибридных культур in vitro с сыворотками крови человека.

6. Разработать методы получения и культивирования примордиальных половых зародышевых клеток (ППЗК) свиньи.

7. Получить in vitro инсулин-секретирующие клетки, подобные (3-клеткам ПЖ, путем направленной дифференцировки эмбриональных половых клеток (ЭПК) свиньи.

8. Осуществить трансплантацию (3-клеток ПЖ плодов кролика лабораторным животным с экспериментальным СД и изучить влияние данной процедуры на течение заболевания.

9. Разработать метод трансплантации Р-клеток ПЖ плодов кролика мелким домашним животным с диагнозом СД и изучить влияние трансплантации клеток на течение заболевания.

1.3 НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Впервые из ПЖ собак и кошек получены культуры Р-клеток, изучены их свойства и признаки in vitro. Оптимизированы методики выделения Р-клеток ПЖ плодов кроликов, разработаны методики выделения фетальных Р-клеток кошек и собак.

Впервые посредством слияния получена гибридная культура почка овцы х Р-клетки кролика (ПО ТК- х Ркр), способная продуцировать инсулин in vitro.

В опытах на лабораторных животных установлено, что ксенотрансплантация Р-клеток ПЖ плодов кроликов нормализует течение экспериментального СД.

Впервые проведена клиническая трансплантация Р-клеток ПЖ плодов кроликов мелким домашним животным, больным СД. При этом доказано, что в результате трансплантации происходит снижение уровня глюкозы в крови и моче, снижение дозы либо отказ от экзогенного инсулина, уменьшение возникновения сопутствующих диабету сосудистых осложнений.

1.4 ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработан и запатентован способ выделения Р-клеток кроликов, собак и кошек из плодной ПЖ на определенных сроках гестации и очистки их культивированием, а также способ лечения СД у собак и кошек, заключающийся в трансплантации Р-клеток непосредственно через брюшную стенку в паренхиму левой доли печени, без применения иммуносупрессивной терапии (патент на изобретение РФ №2325921).

Указанный способ успешно используется в ряде ветеринарных клиник.

Разработаны и утверждены «Методические рекомендации по лечению инсулинозависимого сахарного диабета (СД 1) собак и кошек методом внутрипеченочной трансплантации ß-клеток плодов кроликов».

1.5 АПРОБАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на: Vllth International Congress of Andrology «Andrology in the 21 st Century», Montreal, Quebec, Canada, 2001; международном симпозиуме «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний», Казань, 2005; международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы исследовании по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел», ВИЭВ, Москва, 2008; Всероссийской научной конференции «Современные проблемы науки и образования» Российской академии естествознания, Москва, 2008.

1.6 ПУБЛИКАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

По материалам диссертации опубликовано 23 печатные работы, в том числе 10 в журналах, рекомендованных ВАК РФ и 1 патент.

1.7 ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Инсулино-продуцирующие и культурально - морфологические свойства культур Р-клеток из ПЖ плодов кроликов, собак, кошек не однозначны. Наиболее перспективным материалом для клеточной инженерии являются кроличьи р-клетки.

2. Гибридизация Р-клеток с постоянной линией клеток почки овцы (ПО ТК-) и последующее клонирование позволяют получить культуру клеток - продуцентов инсулина in vitro.

3. Продукция инсулина в гибридных клонах зависит от длительности и метода культивирования.

4. Культивирование ЭПК свиньи в индукционной среде приводит к формированию КОЛОНИЙ инсулин-продуцирующих клеток, подобных Р" клеткам ПЖ.

5. Предложенный метод терапии СД мелких домашних животных путем трансплантации очищенных Р-клеток ПЖ плодов кролика позволяет улучшить течение заболевания и сопутствующих ему осложнений.

1.8 СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Работа изложена на 300 страницах стандартного компьютерного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования с обсуждением полученных результатов, выводы, практические предложения, библиографический список использованной литературы и приложение. Материалы диссертации иллюстрированы 36 таблицами, 119 рисунками. Библиографический список литературы включает 341 источник, из которых 240 - иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Абдрахманов, Игорь Камильевич

выводы

1.Получены культуры Р-клеток ПЖ, выделенные из плодов кроликов, собак и кошек, изучены их свойства и признаки: а) по цитологическим признакам, наличию специфической альдегид-фуксин позитивной зернистости, специфическому окрашиванию мечеными AT против инсулина, а также феномену дегрануляции, наступающему в ответ на повышение содержания глюкозы в культуральной среде, установлено, что выделенные клеточные популяции являются Р-клетками островков Лангерганса; б) уровень продукции инсулина (в кондиционированных средах) Р -клетками кроликов составляет в среднем 80 мкИЕ/мл, собак - 84 мкИЕ/мл, кошек - 77 мкИЕ/мл, соответственно, на 3-4 сут культивирования; в) выявлена низкая адгезивная способность Р-клеток ПЖ плодов кролика, которая позволяет их очистить от остальных типов клеток в процессе культивирования, посредством последовательного отбора и переноса в новые культуральные флаконы.

2. Сравнительный анализ свойств и признаков Р-клеток, выделенных из ПЖ плодов кроликов, собак и кошек показал, что наиболее перспективным материалом для клеточной инженерии являются кроличьи Р-клетки.

3. Получены межвидовые гибридные клоны - продуценты инсулина посредством слияния Р-клеток, выделенных из ПЖ плодов кролика, и клеток почки эмбрионов овец, дефектных по ТК (ПО ТК"), в соотношении 1:1, соответственно, в присутствии ПЭГ 1000: а) сравнительный анализ межвидовых гибридных клонов ПО ТК" х Ркр. по способности продуцировать инсулин in vitro показал, что полученная популяция гетерогенна и представлена 4 клонами с повышенной продукцией инсулина (18-30 мкИЕ/мл). б) отбор клонов с высокой продукцией инсулина и их последующее реклонирование позволяют сохранить продукцию инсулина in vitro в течение 24 пассажей и нормальный кариотип. в) установлено, что длительное культивирование (до 54 пассажа) и перевод клеток в суспензионное культивирование приводит к снижению уровня продукции инсулина межвидовыми клеточными гибридами.

4. Микролимфоцитотоксический тест показал, что межвидовая гибридная культура ПО ТК" х Ркр. обладает определенной гистологической совместимостью с антителами человека.

5. Из 23-33-х суточных плодов свиньи выделены первичные половые клетки (ППЗК) и разработаны условия поддержания их в культуре. Установлено, что наличие фидерного слоя, представленного эмбриональными фибробластами мыши линии STO и среды ДМЕМ, дополненной 15% сыворотки плодов коров, 2шМ альфа-глутамина, 10"6 тМ 2-меркаптоэтанола позволяет получить колонии эмбриональных половых клеток (ЭПК) с фенотипом подобным ЭСК свиньи.

7. Установлено, что трансплантация культуры фетальных кроличьих Р-клеток лабораторным мышам с экспериментальным СД позволяет добиться снижения уровня сахара в крови и его нормализации на протяжении 60 сут. без введения экзогенного инсулина. Нормализация уровня глюкозы после трансплантации происходит без применения иммуносупрессантов.

8. Показано, что длительное культивирование Р-клеток ПЖ плодов кролика способствует снижению иммунной реакции у экспериментальных собак на их введение.

9. Установлено, что ксеногенная трансплантация Р-клеток ПЖ плодов кролика позволяет добиться положительного результата у 6 животных из 8

262 испытуемых. В результате наблюдали: улучшение лабораторных показателей - снижение уровня глюкозы в крови и моче, исчезновение кетоацидоза; значительное снижение доз экзогенного инсулина, либо отказ от него; улучшение течения сопутствующих СД осложнений (нефропатий, ангиопатий, гепатопатий).

10. Предложен новый неинвазивный способ введения Р-клеток домашним животным через брюшную стенку в паренхиму левой доли печени, под контролем ультразвука, который позволяет провести трансплантацию без общей анестезии, без обездвиживания животного и без лапаротомии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Очищенные путем культивирования (3-клетки ПЖ кролика могут быть использованы для клинической трансплантации животным, больным СД.

2. Гибридную культуру ПО ТК- х (Зкр. возможно использовать для дальнейших исследований, направленных на получение постоянной линии клеток, продуцирующей инсулин in vitro.

3. (3-клетки, получаемые дифференцировкой из ППЗК, возможно применять в дальнейших исследованиях, направленных на разработку методов клеточной терапии для лечения СД.

4. Трансплантация Р-клеток ПЖ плода кролика непосредственно через брюшную стенку в паренхиму левой доли печени, без применения иммуносупрессивной терапии, позволяет добиться снижения уровня глюкозы крови и улучшения течения ангиопатий у больных СД.

Заключение.

В процессе культивирования мы наблюдали тенденцию по снижению продуктивной способности клеток, увеличению митотического индекса и пролиферации, скорости формирования монослоя.

Морфологически клеточные культуры тоже изменились: уменьшилось число напластований кластеров округлых клеток на поверхности монослоя и в суспензии, увеличилась адгезивная способность клеток.

Результаты, полученные нами посредством иммуноцитохимического, радиоиммунного и цитохимического методов, позволяют нам заключить, что округлые клетки на поверхности монослоя и кластеры округлых клеток в суспензии, вероятнее всего, являются клетками с генотипом р-клеток пппчгрчл/ттппипи мсрттр'Зм тл ррьпртппиаа

11V^ Д V шч/и шилулл XX положительно коррелирует с количеством таких клеток. В наших исследованиях, кроме выявления уровня инсулина в культуральной жидкости радиоиммунным методом, это подтверждалось иммуноцитохимическим исследованием и окрашиванием ПАФ.

Некоторые авторы считают, что в связи с потерей хромосом одного из видов клеток в гибриде в процессе культивирования от пассажа к пассажу вместе с изменением морфологии снижается секреторная способность клеток [44, 57].

Следует заметить, что в некоторых клонах наблюдалось варьирование показателя уровня инсулина в процессе культивирования. Однако, эти значения не превышают значений отрицательного контроля. Можно предположить, что такой эффект связан с использованием сывороток различных серий, уровень инсулина в которых зависит от физиологического статуса животного, от которого она была получена (Таблица 5).

Таким образом, мы попытались создать новую клеточную систему посредством межвидовой гибридизации (3-клеток - продуцентов инсулина перевиваемой линией ПО ТК\ Селекция клонов, проведенная нами на выявление наилучшего клона-продуцента инсулина, позволила нам отобрать три клона, отвечающих нашим требованиям. Однако, при переводе их на роллерно-суспензионной культивирование, к 10 пассажу произошла их дегенерация. Вполне вероятно, что в результате слияния нам не удалось отобрать клетки, которые отличались бы одновременно высокой продукцией инсулина, хорошими культурально-морфологическими свойствами, способностью отвечать на введение глюкозы продукцией инсулина и возможностью перехода в линию суспензионного культивирования.

Однако, несмотря на существование ряда проблем, связанных с культивированием, селекцией, гистологической совместимостью этих клеток, есть надежда, что наши исследования явились еще одним шагом

ПТТЛЛЛТТ ттп ГТТ ГРХХ ТТ ПТТ11ГТ тж ТЮДГТТОТТПГТ » ЖЛМ/Т>Т1 ттлпт IV ГЧТ^ПТ! ТТТТТ IV туттатту ои^/рч/д па п^ ш у^иодаппл п пэ^ ч^пил м^л\опдиЬв1л 1 пирпДпоАл ал^хихч сельскохозяйственных животных, как продуцентов биологически активных веществ.

2.3 РАЗРАБОТКА МОДЕЛИ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИН

ПРОДУЦИРУЮЩИХ КЛЕТОК IN VITRO С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК.

2.3.1 Выделение примордиальных половых зародышевых клеток из плодов свиней и их очистка.

Работа по получению примордиальных половых зародышевых клеток (ППЗК) была выполнена в 1998-2001 гг. в отделе клеточной инженерии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства совместно с д.б.н., проф. И.П.Савченковой и к.б.н. Т.А.Приданцевой.

Выделение ППЗК из зачатков гонад млекопитающих с целью получения из них культур ЭПК представляет собой одно из перспективных направлений в клеточной биологии, поскольку позволяет создать экспериментальные модели для изучения in vitro процессов цитодифференцировки в развитии млекопитающих [42].

Известно три типа эмбриональных стволовых клеток. Первый тип включает клетки, полученные из эмбриобласта предымплантационных зародышей млекопитающих. Именно их принято называть эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК). Вторым типом эмбриональных стволовых клеток являются клетки эмбриональных карцином (ЭКК). К третьему типу эмбриональных стволовых клеток относятся ППКЗ, выделенные из полового бугорка эмбрионов [66].

Подобно ЭСК, ППЗК при культивировании образуют эмбриоидные тела, содержащие в себе как дифференцированные клетки, так и пролиферирующие прогениторные клетки. Дезагрегация эмбриоидных тел и последующее культивирование их потомков даёт начало клеточным линиям с нормальным диплоидным кариотипом, экспрессирующим как прогениторные, так и дифференцированные маркеры [314].

Продукция инсулина in vitro клетками, полученными в результате манипуляций со стволовыми клетками, описана многими исследовательскими группами. Однако подавляющее большинство работ связано с использованием ЭСК [221, 217, 293] и СК костного мозга [136, 183, 319].

Вероятно, это связано с определенными трудностями в получении и культивировании ППЗК.

Тем не менее, анализ литературных данных показал, что уже неоднократно предпринимались попытки выделения ППЗК крупного рогатого скота, свиней, кролика [186, 210, 215].

Что касается сельскохозяйственных животных, то, на наш взгляд, наиболее подходящим объектом для выделения ППЗК служит свинья. Это объясняется тем, что свинья является многоплодным животным, которое характеризуется высокой физиологической и половой скороспелостью (воспроизводительный цикл составляет 110-140 суток). Приблизительно к 38 суткам развития плода происходит закладка основных органов, в том числе формирование гонад [50, 80]. Достоверно установлено [181], что у 19-суточных зародышей свиньи ППЗК обнаруживаются только в дорсальной тм/aiirra т* г» лтдйтта гт^глиттлг'л натттг^п r-i nnnTinv г» плплплта ОЛ ТО v тттлтг upDimvniic jri d viwjiv munuTnui и iviv^iiiivci, d илидал d DUjpavi^ vу hjiv

ППЗК выявляются в дорсальной брыжейке, стебле желточного мешка и в половых гребнях. В возрасте 31-33-х суток развития в половой железе плода -будущего самца начинается соматическая дифференцировка структуры семенника, в то время как яичник имеет вид недифференцированной железы.

Следует заметить, что ППЗК называют только половые клетки, располагающиеся вне зачатка гонады, либо те клетки, которые уже колонизировали зачаток гонады, но находятся в нем до того времени, когда можно различить пол зачатка гонады, т.е до дифференцировки соматических элементов гонады [20].

За основу выделения ППЗК из плодов свиней мы взяли метод выделения ППЗК из плодов мышей и их очистки от других клеточных типов, базирующийся на дифференциальной адгезии клеток к поверхности [67].

ППЗК выделяли поэтапно из плодов, взятых от свиноматок, которых забивали в различные сроки супоросности: на 23-и сутки беременности (14 плодов), на 26-е сутки беременности (16 плодов), на 31-е сутки беременности (15 плодов), на 33-и сутки беременности (6 плодов) (Таблица 22).

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Абдрахманов, Игорь Камильевич, Москва

1. Абрамов В.Ю. Оценка биологической совместимости донора и реципиента при трансплантации почки / В.Ю. Абрамов. Москва, 2005. - С. 42.

2. Балаболкин М.И. Сахарный диабет / М.И. Балаболкин. М.: Медицина. - 1994. - С. 384.

3. Баранов В.Г. Экспериментальный сахарный диабет. Роль в клинической диабетологии / В.Г. Баранов, И.М. Соколоверова, Э.Г. Гаспарян -Л: Наука. 1983. - С. 240.

4. Бекикова Е.А. Опыт лечения детей, страдающих сахарным диабетом, при помощи алло- и ксенотрансплнтации культуры островковых клеток поджелудочной железы / Е.А. Беникова, И.С. Турчин, Л.С. Белякова и др. // Проблемы эндокринологии. 1987. - №2. - С. 19-22.

5. Бенюмович М.С. Суспензии клеток человека и животных / М.С. Бенюмович // Итоги науки и техники, 4.1, ВИНИТИ, серия «Цитология». -1990. -т.6. С. 300.

6. Бикхарт К. Клиническая ветеринарная патофизиология / К. Бикхарт -М.: «Аквариум», 2001. С. 400.

7. Бордуновский В.Н. Пластическая хирургия селезенки и печени (экспериментально-клиническое исследование): автореферат дис. д-ра мед. наук / Бордуновский В.Н., Пермь. 1992. - С.52.

8. Бурыкин И.М. Динамика бета- и альфа-клеточных популяций поджелудочной железы и содержания глюкозы в крови крыс при аллоксановом диабете / И.М. Бурыкин Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 2002. - Т. 133. - №2. - С. 151-153.У

9. Васильев A.C. Гемореологическое действие асковертина при аллоксановом диабете у крыс/ A.C. Васильев Вопр. биол. мед. и фармац. химии. - 2001.- №4. - С. 26-28.

10. Волчегорский И. А. Инсулинпотенцирующее действие антиоксидантов при экспериментальном сахарном диабете / И.А. Волчегорский, J1.M. Рассохина, И.Ю. Мирошниченко // Проблемы эндокринологии. 2010. - 56. - № 2. - С. 27-35.

11. Газарян К.Г. Экспериментальный перенос генов в соматических клетках млекопитающих / К.Г. Газарян, В.З. Тарантул // Успехи современной биологии. 1981. - Т.92. - №2. - С. 163-179.

12. Гладких А.И. Влияние фенсукцинала на функциональное состояние панкреатических бета-клеток у крыс с неонатально индуцированным стрептозотоциновым диабетом / А.И. Гладких Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 2001. - Т. 132. - №7. - С. 55-58.

13. Глебов O.K. Генетическая трансформация соматических клеток / O.K. Глебов Л.: Наука. - 1989. - С. 351.

14. Григорьева М.В. Функциональная морфология рыхлой волокнистой соединительной ткани кожи в условиях аллоксанового диабета и коррекции его альфа- токоферолом : дис. . канд. мед. наук / Григорьева М.В.; Великий Новгород. 2009. - 165 с.

15. Дедов И.И. Современные аспекты трансплантации островков поджелудочной железы при сахарном диабете / И.И. Дедов, М.И. Балаболкин, Е.М. Клебанова // Сахарный диабет.- 2004.- №2(23).- С. 43-41.

16. Дыбан А.П. Раннее развитие млекопитающих / А.П. Дыбан Л.: Наука., Лен. отд., 1988. - С. 228.

17. Дьяконов Л.П. Животная клетка в культуре / Л.П. Дьяконов, В.И.

18. Гитч/пп // Л/Г • ОППП Г 4Г>0lAALilWiJ // ITA. W11J X lllliV I • W. V-/. T^V/V.

19. Дьяконов Л.П. Методические рекомендации по гибридизации соматических клеток сельскохозяйственных животных / Л.П. Дьяконов, A.A. Кущ, Ш.М. Тугизов и др. // Москва. 1988. - С. 11.

20. Дьяконов Л.П. Методические рекомендации по получению мутантных штаммов перевиваемых линий клеток сельскохозяйственных животных, пригодных для гибридизации / Л.П. Дьяконов, A.A. Кущ, Ш.М. Тугизов // Москва. 1984. - С. 16.

21. Дьяконов Л.П. Основные достижения и перспективы развития клеточной биотехнологии / Л.П. Дьяконов // Труды ВИЭВ. 1998. - т.71. - С. 149-162.

22. Елизарова Ю.Н. Влияние некоторых производных 3-оксипиридинана морфо-функциональное состояние сердца при экспериментальном сахарном диабете : дис. . канд. мед. наук / Елизарова Ю.Н.; Саранск. 2008. - 158 с.

23. Жданкина A.C. Морфофункциональные изменения сетчатки глаза при фотоповреждении на фоне аллоксанового диабета и их коррекция асковертином : (экспериментальное исследование) : автореф. дис. . канд. мед. наук / Жданкина A.C.; Томск. 2006. - 23 с.

24. Игнатенко С.Н. Трансплантологические методы лечения сахарного диабета: автореф. дис. . докт. мед. наук / С.Н. Игнатенко; Москва. 1989.-С.46.

25. Карпенко Л.Ю. Особенности проявления и лечения сахарного диабета у кошек / Л.Ю. Карпенко, Е.А. Ермолаева // Материалы 13 международного Московского конгресса по болезням мелких домашних животных. 2005. - С. 42-43.

26. Кистнер Ю.И. Паравазальная субкапсулярная аллотрансплантация ткани неонатальной поджелудочной железы в семенник крыс / Ю.И. Кистнер, И.Д. Кирпатовский, Н.Ю. Александров и др. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2003. - №1. - С. 31-33.

27. Клюшниченко В.Е. Генно-инженерный инсулин человека. ВЭЖХ в анализе продуктов основных стадий производства / В.Е. Клюшниченко,

28. С.А. Акимов, К.В. Мальцев и др.// Биорганическая химия. 1992. - 18. - № 12.-С. 1478-1486.

29. Комиссаренко В.П. Трансплантация культуры островковых клеток поджелудочных желез плодов человека и животных как метод лечения сахарного диабета / В.П. Комиссаренко, И.С. Турчин, И.В. Комиссаренко и др. // Врач. Дело. 1983. - №4. - С. 52-56.

30. Кузин М.И. Хронический панкреатит / М.И. Кузин, М.В. Данилов, Д.Ф. Благовидов // М.: Медицина. 1985. - С. 275—298.

31. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин- М.: Высшая школа. 1990. -С. 352.

32. Лейбсон Л.Г. Биологическая активность инсулинов разного происхождения и связывание их специфическими рецепторами. Механизм действия гормонов / Л.Г. Лейбсон // Ташкент. 1976. - С. 86.

33. Лейниекс A.A. Оценка эффективности трансплантации культуры островковых клеток поджелудочной железы у больных сахарным диабетом: автореф. дис. . канд. мед. наук / Лейниекс A.A.; Москва. 1989. - С.33.

34. Леонович С.И. Трансплантация культуры островковых клеток поджелудочной железы в красный костный мозг/ С.И. Леонович, Б.А. Слука, И.Н. Игнатович и др. // Белорусский медицинский журнал. 2004. - №1. - С. 44.

35. Литтман И. Оперативная хирургия / И. Литтман Будапешт: Изд-во Академии наук Венгрии. Academia Kiado. - 1985. - С. 662—670.

36. Лукина H.A. Клеточное размножение и процессы дифференциации / H.A. Лукина. Л.: Наука, Лен отд. -1983. - С.248

37. Лучкина O.A. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на развитие стрептозотоцининдуцированного сахарного диабета : дис. . канд. мед. наук / O.A. Лучкина; Смоленск. 2008. - 148 с.

38. Марри Р. Биохимия человека./ Р. Марри, Д. Греннер, П. Мейес, В. Родуэлл М.: Мир. - 1993. - С.384.

39. Мартов Ю.Б. Ксенотрансплантация культуры В-клеток поджелудочной железы больным сахарным диабетом / Ю.Б. Мартов, С.Г. Подолинский, A.A. Чиркин и др. // Здравоохранение. 1996. - №9. - С. 41-43.

40. Миргородская O.A. Протеолиз проинсулина человека, катализируемый нативным, модифицированным и иммобилизованным трипсином. / O.A. Миргородская, Г.А. Казанина, Е.П. Миргородская и др. // Биоорганическая Химия. 1997. - 23. - № 2. - С. 91 - 97.

41. Моренкова С. А. Способ получения препарата инсулина для перорального применения : Пат 2058788 Россия, МКИ6 А61К 38/28, 9/14 Моренкова С. А. № 5000106/14 Заявл. 26.7.91; Опубл. 27.4.96, Бюл. № 12.

42. Назаренко Г.И. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований / Г.И. Назаренко, A.A. Кишкун М.: Медицина. - 2000. - С. 544.

43. Невзгодина М.В. Формирование половых желез в эмбриогенезе свиней / М.В. Невзгодина Сельскохозяйственная биология. - 1971. - Т. 6. -№ 6. - С. 887-894.

44. Новиков И.И. Морфологические изменения губчатого вещества кости после его трансплантации под фиброзную капсулу почки / Новиков И.И. // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. 1972. - №1. - С. 31-37.

45. Панин Л.Е. Синтез фрагментов инсулина и изучение их физико-химических и иммунологических свойств / Л.Е. Панин, Ф.В. Тузиков, О.Н. Потеряева и др. // Биоорганическая Химия. 1997. - 23. - № 12. - С. 953 - 960.269

46. Пиняев В.И. Влияние низкотемпературного консервирования на первичные половые клетки ранних зародышей человека: дис. канд. мед. наук / Пиняев В.И.; Харьков. 1989. - 117 с.

47. Писарев В.Б. Механизмы токсического действия стрептозотоцина на бета-клетки островков Лангерганса / В.Б. Писарев, Г.Л. Снигур, A.A. Спасов и др. // Бюл.эксперим.биологии и медицины. 2009. - Т. 148. - № 12. -С. 700-702.

48. Плате H.A. Макромолекулярные системы с инсулином в связи с проблемой диабета / H.A. Плате, Л.И. Валуев, Л.К. Старосельцева и др. // Высокомолек. соед. 1994. - 36. - № 11. - С. 1876 - 1879.

49. Подшивалин A.B. Оценка эффективности трансплантации культур островковых клеток поджелудочной железы у больных сахарным диабетом радионуклидными методами: автореф. дис. . канд. мед. наук / Подшивалин A.B.; Москва. 1993. -С.35.

50. Полянская Г.Г. Особенности кариотипической изменчивости в постоянных клеточных линиях / Полянская Г.Г. Ветеринарная патология. -2003.-№1(5).-С. 21-22.

51. Пужалин А. Н. Моделирование сахарного диабета стрептозотоцином / А. Н. Пужалин. Фармация. - 2006. - № 4. - С. 35-37.

52. Райцина С.С. Происхождение и развитие половых клеток // Современные проблемы сперматогенеза / С.С. Райцина М.: Наука. - 1982. -С. 5-25.

53. Розенталь Р.Л. Трансплантация культур островковых клеток поджелудочной железы при лечении гнойных хирургических заболеваний убольных сахарным диабетом / P.JI. Розенталь, В.А. Закревский, И.М. Ильинский и др. // Вестник хирургии. 1988. - №5. - С. 83-85.

54. Ройт А. Иммунология / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл М.: Мир. - 2000. - С. 582.

55. Романовский А.И. Определение оптимальной методики пересадки островковых клеток поджелудочной железы: автореф. канд. мед. наук / Романовский А.И.; Минск. 2001. - С. 20.

56. Савенко Н.Б. Получение поликлональных антител к синтетическому пептиду прионного белка и определение их специфичности: дисс. . канд. биол. наук 03.00.23 / Савенко наталья Борисовна; ГНУ ВИЭВ, Москва. -2005,-С.119.

57. Савченкова И.П. Эмбриональные стволовые клетки в биологии: настоящее и будущее / И.П. Савченкова Дубровицы. - 1999. - С. 95.

58. Савченкова И.П. Выделение и очистка примордиальных половых клеток зародышей мышей / И.П. Савченкова, Т.А. Приданцева, Н.И. Сергеев и др. // С.-х. биология. 2000. - №2. - С. 119-125.

59. Сафина А.Н. Стационарное и роллерно-суспензионное культивирование межвидовой гибридной культуры клеток свинья х лошадь (A4xL) / А.Н. Сафина, Л.П. Дьяконов, Т.В. Гальнбек // Успехи современного естествознания. 2004. - №3. - С. 33.

60. Семенова-Тянь-Шанская А.Г. Изменение ядер гоноцитов на ранних этапах их дифференцировки у ранних зародышей человека / А.Г. Семенова-Тянь-Шанская Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. -1978.-Т. 74.-№ 1,-С. 91-97.

61. Семенова-Тянь-Шанская А.Г. Цитологические особенности гоноцитов в ходе их миграции у ранних эмбрионов крыс / А.Г. Семенова-Тянь-Шанская Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. - 1976. - Т. 71. -№2. - С. 52-58.

62. Скайлер Д. Эндокринология. Инсулинозависимый сахарный диабет: этиология, патогенез и принципы терапии / Д. Скайлер. Под редакцией Н. Лавина М.: Практика. - 1999. - С. 758-872.

63. Скалецкий H.H. Ксенотрансплантация культур островковых клеток поджелудочной железы плодов человека крысам с экспериментальным сахарным диабетом: автореф. дис. . канд. мед. наук /Скалецкий H.H. Москва. - 1987. - С.43.

64. Скалецкий H.H. Получение культур островковых клеток для трансплантации: новые подходы и новое качество / H.H. Скалецкий, J1.A. Кирсанова, Н.В. Баранова и др. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2002. - №3. - С. 86.

65. Скалецкий H.H. Проблемы трансплантологии и искусственных органов / учебное пособие // H.H. Скалецкий, JI.A. Кирсанова, В.Н. Блюмкин -М. 1994. -С. 73—80.

66. Скалецкий H.H. Трансплантация культур островковых клеток поджелудочной железы в лечении инсулинозависимого сахарного диабета / H.H. Скалецкий, H.J1. Фатеева, Г.Т. Сухих, Е.М. Молнар // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1994. - №4. - С. 356-363.

67. Соколов П.А. Развитие половых органов у плодов свиней / Доклады ТСХА. 1972. - Вып. 178. - С. 171-178.

68. Справочник практического врача / Ю.Е.Вельтищев и др. ; под ред. А.И. Воробьева. М.: Медицина. - 1991. - В 2 томах.

69. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков./ В.М. Степанов М.: Высшая школа. - 1996. -С.335.

70. Ol ЛНTT "Г*/ v' ТI л л л Я Л Г\ О I- П л 1 лoj. v^ipancp л. виихимия / ^лраиер л. — ivi.: ivinp. - ^.jiz.

71. Тимербулатов М.В. Органосохраняющая и миниинвазивная хирургия селезенки / М.В.Тимербулатов, А.Г. Хасанов, Р.Р. Фаязов и др.// М.: МЕД-пресс-информ. 2004. - С. 218.

72. Третьяк С.И. Длительное сохранение жизнеспособности аллогенных тканей в сосудах и сердце реципиента (экспериментальное исследование): автореф. дис. д-ра мед. наук / С.И. Третьяк Минск. - 1996. -С. 33.

73. Третьяк С.И. Отдаленные результаты ксенотрансплантации макроинкапсулированной культуры островковых клеток поджелудочной железы / С.И. Третьяк, A.B. Прохоров, A.A. Глинник // Трансплантология. -2004. Т.7. - №3. - С. 364-366.

74. Утяганова E.B. Изучение гипогликемической активности и факторов неспецифической резистентности у животных с аллоксановым диабетом при введении кверцетина и его производных : автореф. дис. . канд. фармац. наук Пятигорск. - 2009. - 23 с.

75. Фриденштейн А.Я. Клеточные основы кроветворного микроокружения / А.Я. Фриденштейн, Е.А. Лурия М: Медицина. - 1980. - С. 216.

76. Шотт A.B. Иммунологические парадоксы в трансплантологии / A.B. Шотт, С.И. Третьяк, А.П. Красильников и др. // Здравоохранение. -1999. №2. - С. 36-37.

77. Шотт A.B. Необычная реакция на чужеродные ткани / A.B. Шотт, A.C. Леонтюк, С.И. Третьяк и др. // ч.2, Минск. 1992. - С. 286.

78. Штамм межвидовых гибридных клеток почки овцы (ovis aries) с бета-клетками кролика продуцент инсулина. Дьяконов Л.П. и др.: патент, на изобретение РФ №2293116. - 2005.

79. Шумаков В.И. Результаты трансплантации культур островковых клеток поджелудочной железы больным сахарным диабетом / В.И. Шумаков,тз Т-j сг* ти ™ // тос лг„с1. илгигалип, ^.11. iiinaicnivu и др. // i ipvjuji. ^/пдилрипил. — i 70J. J1^ J. 67.70.

80. Шумаков В.И. Трансплантация островковых клеток поджелудочной железы / В.И. Шумаков, В.Н. Блюмкин, H.H. Скалецкий и др. -М.: Канон. 1995. - С. 384.

81. Шумаков В.И. Костный мозг как источник получения мезенхимальных клеток для восстановительной терапии поврежденныхорганов / В.И. Шумаков, Н.А. Онищенко, М.Е. Крашенинников и др. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2002. - 4. - С. 4-7.

82. Шумаков В.И. Трансплантация культур островковых клеток поджелудочной железы (очерки) / В.И. Шумаков, В.Н. Блюмкин, Н.Н. Скалецкий и др. // Москва. 1994. - С. 384.

83. Шумаков В.И. Трансплантация островковых и других эндокринных клеток / В.И. Шумаков, Н.Н. Скалецкий // В кн.: Трансплантология — руководство, Тула: Репроникс Лтд. 1995. - С. 317— 331.

84. Щелкунов С.Н. Конструирование гибридных молекул ДНК / С.Н. Щелкунов Новосибирск: Наука, Сибирское отделение. - 1987. - С. 220.

85. Юрина М. А. Влияние антиокса и коэнзима Q10 на повышение устойчивости панкреатических бета-клеток к цитотоксическому действию аллоксана: Автореф. дис. . канд. биол. наук Тюмень. - 2002. - 22 с.

86. Юрченко Н.В. Структурно-функциональная реорганизация сенсомоторной коры большого мозга белых крыс при аллоксановом диабете : дис. . канд. мед. наук Омск. - 2004. - 153 с.

87. Яглов В.В. Биология ацино-островковых клеток поджелудочной железы. / В.В. Яглов // В кн.: «Эволюционная эндокринология поджелудочной железы» Л.: Наука. - 1977. - С. 82-89.

88. Ярошинский Ю.Н. Судьба биологических протезов клапанов сердца (клинико-морфологическое исследование) / Ю.Н. Ярошинский, Г.И. Цукерман, Т.В. Артюхина и др. // Вестн. АМН СССР. 1974. - №6. - С. 6872.

89. Abbott С. Somatic cell hybrids: the basics / С. Abbott, S. Povey // IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England. 1995.

90. Alejandro R. Insulin independence in 7 patients following transplantation of cultured human islets / R. Alejandro, J.V. Ferreira, A. Caulfield et al. // Am J Transplant. 2002. - vol. 2. - Suppl. 3. - p. 227.

91. American Diabetes Association. Diabetic Nephropathy. Diabetes Care // 1998. 21 (Suppl 1). - pp. S50-S53.

92. Ann MacGregor E. a-Amylase structure and activity / Ann MacGregor E. // Journal of protein chemistry. 1988. - vol. 7. - №4. - pp. 399415.

93. Appel J.Z. Xenotransplantation: the challenge to current psychological attitudes / J.Z. Appel, J.P.N. Alwayn, D.K.C. Cooper // Progress in Transplantation. 2000. - Vol. 10. - №4. - pp. 217-225.

94. Arinzeh T.L. A comparative study of biphasic calcium phosphate ceramics for human mesenchymal stem-cell-induced bone formation / T.L. Arinzeh, T. Tran, J. McAlary et al. // Biomaterials. 2005. - 26 (17). - pp. 36313638.

95. Assady S. Insulin production by human embryonic stem cells / S. Assady, G. Maor, M. Amit et al. // Diabetes. 2001. - 50. - pp. 1691-1697.

96. Badet L. The interaction between primate blood and mouse islets induces accelerated clotting with islet destruction / L. Badet, T. Titus et al. // Xenotransplantation. 2002.- №9. - Issue 2. - p. 91.

97. Bailey C.J. Immunoreactive insulin in bile and pancreatic juce of the rat / C.J. Bailey, P.R. Flatt, T.W. Atkins, A.J. Matty // J. Endocrinology. 1976. -68.-3.-pp. 19-20.

98. Barker C.F. Immunologically privileged sites / C.F. Barker, R.E. Billingham // Adv Immunol. 1977. - №25. - pp. 1-54.

99. Baron F. Nonmyeloablative Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation / F. Baron, Y. Beguin // Journal of Hematotherapy & Stem Cell Research. 2002. - 11. - pp. 243-263.

100. Baue A.B. The immunologic response to heterotopic allovital aortic valve transplants in presensitised and nonsensitesed recipients / A.B. Baue, W.J. Bonawick // J. Thorac, Cardiovasc. Surg. 1968. - Vol 56. - №6. - pp. 775-788.

101. Beattie G.M. Regulation of proliferation and differentiation of human feta islet cells by extracellular matrix, hepatocyte growth factor, and cellcell276contact / G.M. Beattie, J.S. Rubin, M.I. Mally et al. // Diabetes. 1996. - 45. - pp. 1223-1228.

102. Bender T.P. Site specific monoclonal antibodies to insulin / T.P. Bender, J.A. Schroer // Methods Enzymologist. 1985. - vol. 55. - p. 704.

103. Bendtzen K. Cytotoxicity of human pi 7 interleukin-1 for pancreatic islets of Langerhans / K. Bendtzen, T. Mandrup-Poulsen, J. Nerup et al. // Science. 1986. - №232. - pp. 1545-1547.

104. Berney T. Transplantation of islets of Langerhans: new developments / T. Berney, L. Buhler, A.Caulfield et al. // Swiss. Med. Wkly. 2002. - 132. - pp. 671-680.

105. Biarnijs M. P-Cell Death and Mass in Syngeneically Transplanted Islets Exposed to Short-and Long-Term Hyperglycemia / M. Biarnijs, M. Montolio, VfNacher et al. // Diabetes. 51. - 2002. - pp. 66-72.

106. Biden T. Signal transduction events in the regulation of insulin. / T. J. Biden // Proc. Austral. Physiol, and Pharmacol. Soc. 1997 - 28. - № 1. - p. 84.

107. Bobrow M. Differential staining of human and mouse chromosomes in interspecific cell hybrids / M. Bobrow, J. Cross // Nature. 1974 (London). -251. - pp. 77-79.

108. Bobzien B. Intratesticular transplantation os islet xenografts (rat to mouse) / B. Bobzien, Y. Yasunami, M. Majercik et al. // Diabetes. 1983. - Vol. 32. - Issue 3. - pp. 213-216.

109. Bonner-Weir S. A second pathway for regeneration of adultexocrine and endocrine pancreas / S. Bonner-Weir, L.A. Baxter, G.T. Schupping et al. // Diabetes. 1993. - 93. - pp. 1715-1720.

110. Bonner-Weir S. In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue / S. Bonner-Weir, M. Taneja, G.C. Weir et al. // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. - 97. - pp. 7999-8004.

111. Bonner-Weir S. New sources of pancreatic (3-cells / S. Bonner-Weir, G.C. Weir // Nat Biotechnol. 2005. - 23. - pp. 857-861.

112. Bonner-Weir S. Regulation of pancreatic beta-cell mass in vivo / S. Bonner-Weir // Rec Progr Hormone Res. 1994. - 49. - pp. 91-104.

113. Bosco D. Actively synthesizing beta-cells secrete preferentially after glucose stimulation / D. Bosco, P. Meda // Endocrinology. 1991. - 129(6). - pp. 3157-3166.

114. Bosi E. Autoantibody response to islet transplantation in type 1 diabetes / E. Bosi, S. Braghi et al. // Diabetes. 2001. - №50. - pp. 2464-2471.

115. Bretzel R.G. The liver as a site for implantation of islets of Langerhans in experimental diabetes. Morphologic and metabolic observation / R.G. Bretzel, E. Manus, C. Schomber // Acta Endocrinol. 1978. - 87. - Suppl.-.AO i u. |j. .

116. Brunetti P. Immunoprotection of pancreatic islet grafts within artificial microcapsules / P. Brunetti, G. Basta et al. // Int. J. Artif. Organs. 1991. -№14. - pp. 789-791.

117. Casanova D. Is the high level of nitric oxide metabolites a marker in early rejection after experimental islet pancreas transplantation / D. Casanova, E. Martino et al. // Transpl. Proc. 1998. - №30. - pp. 639-640.

118. Cheng L. Role of leukemia inhibitory factor and its receptor in mouse primordial germ cell growth / L. Cheng, D.P. Gearing, L.S. White et al. // Development. 1994. - V. 120. - pp. 3145-3153.

119. Chinchar V. G. Characterization of hybrids between bovine (MDBK) and mouse (L-cell) cell lines / V.G. Chinchar, A.D. Floyd, G.D. Chinchar et al. // Biochem. Genet. 1979. - 17. - pp. 133-148.

120. Choi J.B. Little evidence of transdifferentiation of bone marrow-derived cells into pancreatic beta cells / J.B. Choi et al. // Diabetologia. 2003. -46.-10.-pp. 1366-1374.

121. Clark G.O. Glucose responsive insulin production from human embrionic germ (EG) cell derivates / G.O. Clark, R.L. Yochem, J. Axelman et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. - May 11. - 356 (3). - pp. 587-593.

122. Comitti R. A monoclonal-based, two-site enzyme immunoassay of human insulin / R. Comitti, G. Racchetti, P. Gnocchi et al. // J. of Immunogical methods. 1987. - vol. 99. - pp. 25-37.

123. Cotterell A.H. The humoral immune response in humans following cross-perfusion of porcine organs / A.H. Cotterell, B.H. Collins et al. // Transplantation. 1995. - №60. - pp. 861-868.

124. Davidson R. L. Improved techniques for the induction of mammalian cell hybridization by polyethylene glycol / R.L. Davidson, P.S. Gerald // Sornat. Cell Genet. 1976. - 2. - pp. 165-176.

125. Davison L. Anti-insulin antibodies in dogs with naturally occurring diabetes mellitus / L. Davison, J. Ristic, M. Herrtage // Vet Immunol Immunopath. -2003.-91.-pp. 53-60.

126. De Felici M. Leukemia inhibitory factor sustains the survival of mouse primordial germ cells cultured on TM4 feeder layers / M. De Felici, S. Dolci // Dev. Biol. 1991. - 147. - pp. 281-284.

127. De Vos P. Association between capsule diameter, adequacy of encapsulation and survival of microencapsulated rat islet allografts / P. De Vos, B.J. De Haan et al. // Transplantation. 1996. - №62. - pp. 893-899.

128. Dekel B. Human and porcine early kidney precursors as a new source for transplantation / B. Dekel // Nat Med. 2003. - 9. - 1. - pp. 53-60.279

129. Delovitch T.L. T-lymphocyte recognition of insulin / T.L. Delovitch // Conference of insulin. Structure, chemistry and biology. University of York, England. 1989. - pp. 42-50.

130. Deng A. Y. Chromosomal assignment of 11 loci in the rat by mouse-rat somatic hybrids and linkage / A.Y. Deng, L. Gu, J.P. Rapp et al. // Mamm. Genome. 1994. - 5. - pp. 712-716.

131. Dodson G. 2 International Symposium: Insulin Chemistry, structure and function / G. Dodson // Editors: D. Branderburg and Wollmer, Berlin New-York. - 1980. - p. 593.

132. Dolci S. Requirement for mast cell growth factor for primordial germ cell survival in culture / S. Dolci, D. Williams, M.K. Ernst et al. // Nature. 1991. - Vol. 352. - pp. 809-811.

133. Drury R.A.B. Carleton's histological technique / R.A.B. Drury, E.A. Wallington // Ed. 5. Oxford University Press, Oxford, UK. 1980.

134. Dunger A. The effect of human amniotic fluid on DNA synthesis of rat pancreatic islets in tissue culture / A. Dunger, H. Reiher, H.J. Hahn // Exp Clin Endocrinol. 1989. - 93. - pp. 157-160.

135. Efrat S. Conditional transformation of a pancreatic beta cell line derived from transgenic mice expressing a tetracycline-regulated oncogene / S. Efrat, D. Fusco DeMane, H. Lemberg et al. // Proc Natl Acad Sei USA 1995. -92. - pp. 3576-3580.

136. Efrat S. Genetic engineering of beta-cells for cell therapy of diabetes: cell growth, function, and immunogenicity / S. Efrat // Diabetes Rev. 1996. - 4. -pp. 224-234.

137. Efrat S. Prospects for gene therapy of insulin-dependent diabetes mellitus / S. Efrat//Diabetologia. 1998.-41. - pp. 1401-1409.

138. Fagoonee S. Generation of functional hepatocytes from mouse germ line cell-derived pluripotent stem cells in vitro / S. Fagoonee, R.M. Hobbs, L. De Chiara et al. // Stem Cells Dev. 2010. - Aug, 19(8). - pp. 1183-94.

139. Farney A.C. Inhibition of pancreatic islet beta cell function by tumor necrosis factor is bloked by a soluble tumor necrosis factor receptor / A.C. Farney, E. Xenos, D.E. Sutherland et al. // Transpl. Proc. 1993. - №25. - pp. 865-866.

140. Faustman D.L. Prevention of rejection of murine islet allografts by pretreatment with antidendritic cell antibody / D.L. Faustman, R.M. Steinman et al. // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1984. - № 81. - pp. 3864-3868.

141. Faustman D.L. Prolongation of murine islet allograft survival by pretreatment of islets with antibody directed to la determinants / D.L. Faustman, V. Hauptfeld et al. // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1981. - № 78. - pp. 5156-5159.

142. Federlin K. Indications for clinical islet transplantation today and in the foreseeable future the diabetologisf s point of view / K. Federlin, G. Pozza // J Mol Med. - 1999. - 77. - pp. 148-152.

143. Feldman J.M. Preparation of islets of Langerhans from rabbits and hamsters by the collagenase digestion technique/ J.M. Feldman, B. Chapman // Acta Diabetol Lat. 1975. - 12(3-4). -pp. 208-218.

144. Feldman S.D. Intrasplenic islet isografts / S.D. Feldman, G.E. Hirshberg et al. // Surgery. 1977. - № 82. - pp. 386-394.

145. Ferber S. Surrogate beta cells / S. Ferber, H. Heimberg, M. Brownlee et al. // Diabetologia. 1997. - 40. - pp. B39-B43.

146. Freidman T. A critical role for human Cd4+ T-cells in rejection of porcine islet cell xenografts / T. Freidman, R.N. Smith, R.B. Colvin et al. // Diabetes. 1999. - Vol. 48. - Issue 12. - pp. 2340-2348.

147. Gazdar A.F. Continuous, clonal, insulin- and somatostain-secreting cell lines established from a transplantable rat islet cell tumor / A.F. Gazdar, W.I. Chick, H.K. Oie et al. // Proc Natl Acad Sci USA. 1980. - 77. - pp. 3519-3523.

148. Goossens M. Response to insulin treatment and survival in 104 cats with diabetes mellitus (1985-1995) / M. Goossens, R. Nelson, E. Feldman // J Vet Intern Med. 1998. - 12. - pp. 1-6.

149. Gorman C. Transformation of mammalian cells / C. Gorman, B. Howard, R. Reeves // Nucleic Acid Res. 1983.- V. 11. - pp. 7631-7648.

150. Gotoh M. Immunological Characteristics of purified pancreatic islet grafts / M. Gotoh, T. Maki, S. Satomi et al. // Transplantation. 1986. - № 42. -pp. 387-390.

151. Green I.C. Effects of pregnancy in the rat on the size and insulin secretory response of the islets of Langerhans / I.C. Green, K.W. Taylor // J Endocrinol. 1972. - 54. - pp. 317-325.

152. Groth C.G. Transplantation of porcine fetal pancreas to diabetic patients / C.G. Groth, O. Korsgren et al. // Lancet. 1994. - Vol. 344. - № 8934. -pp. 1402-1404.

153. Guo L.H. Studies of genetic engineering of human insulin-purification and characterization of human proinsulin and insulin / L.H. Guo // Shih Yen Sheng Wu Hsueh Pao. 1992. - vol. 25. - 2. - pp. 157-163.

154. Hammerman MR. Pancreas and kidney transplantation using embryonic donor organs / M.R. Hammerman // Organogenesis. 2004. - №1. - 1. - pp.3-13.

155. Hayek A. Growth factor/matrix-induced proliferation of human adult betacells / A. Hayek, G.M. Beattie, V. Cirulli et al. // Diabetes. 1995. - 44. - pp. 1458-1466.

156. Heneine W. No evidence of infection with endogenous retrovirus in recipients of porcine islet-cell xenografts / W. Heneine, A.Tibell et al. // Lancet.1 nno \ f„T ici I„„nnnzrr»c ¿AA1770. " V UI. JJi. " issue 71Z.7. pp. vyj-vyy.

157. Hess D. Bone marrow-derived stem cells initiate pancreatic regeneration / D. Hess et al. // Nat Biotechnol. 2003. - 21. - 7. - pp. 763-770.

158. Holtz W. Migration of primordial germ cells during embryonic development in pigs / W. Holtz, E. Mahabir // Reprod. Domest. Anim. 1999. - V. 34.-p. 35.

159. Horejsi V. Murine hybridomas Monoclonal antibodies against insulin: cross reactivity with insulin's of three species and blocking of insulin binding to its receptor / V. Horejsi, I. Hildert, H. Kristofova et al. // Immunol. Lett. 1984. - 8. -p. 279.

160. Ianus A. In vivo derivation of glucose-competent pancreatic endocrine cells from bone marrow without evidence of cell fusion / A. Ianus et al. // J Clin Invest. 2003. - 111. - pp. 843-850.

161. Ianus A. In vivo derivation of glucose-competent pancreatic endocrine cells from bone marrow without evidence of cell fusion / Ianus A., et al. // J. Clin. Invest. 2003. - 111. - pp. 843-850.

162. Jahoda C.A.B. Hair follicle dermal sheath cells: unsung participants in wound healing / C.A.B. Jahoda, A.J. Reynolds // Lancet. 2001. - 358. - pp. 14451448.

163. Jianchi Ding. Isolation of germ cells from rabbit fetal gonads / Jianchi Ding, A.C. Hahnel, J.B. Keith // Theriogenology. 1995. - Vol. 25. - p. 196.

164. Jonas J.S. Chronic hyperglycemia triggers lossof pancreatic beta-cells differentiation in an animals model of diabetes / J.S. Jonas, A. Sharma, W. Hasenkapet al. //J Biol Chem. 1999. - 274. - pp. 14112-14121.

165. Juang J.H. Outcome of subcutaneous islet transplantation improved by a polymer device / J.H. Juang, S. Bonner-Weir, J.P.Vacantu et al. // Transpl. Proc. 1995. -№27. - pp. 3215-3216.

166. Katsoyannis P.G. Hepatospeciflc insulin analoques. : Пат 5208217 США, МКИ5 A61K 37/26, C07K 7/40 / P.G. Katsoyannis // Mount Sinai School of Medicine of the city University of New York, № 785146; Заявл. 29.10.91;

167. Ппчйп ПА оа. итутл сіл /і v-ШуОЛ. ut.uj.yj, xxxvjri ji*t/j.

168. Kaufman D.B. Differential roles of Mac-1+ cells and CD4+ and CD8+ T lymfocytes in primary nonfunction and classic rejection of islet allografts / D.B. Kaufman, J.L. Piatt, F.L. Rabe et al. // J Exp. Med. 1990. - №172. - pp. 291-302.

169. Kelsell D.P. Development of a panel of monochromosomal somatic cell hybrids for rapid gene mapping / D.P. Kelsell, L. Rooke, D.Warne et al. // Ann. Hum. Genet. 1995. - 59. - pp. 233-241.

170. Kelsell D.P. Gene mapping using somatic cell hybrids / D.P. Kelsell, N.K. Spurr // Methods Mol. Biol. 1997. - 68. - pp. 45-52.

171. Kimura T. Induction of pluripotency in primordial germ cells / T. Kimura, T. Nakano // Histol Histopathol. 2011. - 26(5). - pp. 643-50.

172. Klug M.G. Genetically selection cardiomyocytes from differentiating embryonic stem cells form stableintracardiac grafts / M.G. Klug, M.H. Soonpaa, G.Y. Koh et al. // J Clin Invest. 1996. - 98. - pp. 216-224.

173. Kohler G. Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion / G. Kohler, C. Milstein // Eur. J. Immunol. 1976. -6. -pp. 511-519.

174. Kolb E. Clinical islet transplantation / E. Kolb, F. Largiader // Transpl. Proc. 1980. - 12. - №4. - pp. 205-207.

175. Kostia S. SINE targeting of bovine microsatellites from bovine/rodent hybrid cell lines / S. Kostia, J. Vilkki, M. Pirinen et al. // Mamm. Genome. 1997. - 8. - pp. 365-367.

176. Kotin R.M. Site-specific integration by adeno-associated virus / R.M. Kotin, M. Siniscalco, R.J. Samulski et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1990.1. CT 1 OT1C

177. U / . j-'p. ¿'S- a I-¿.i* 1 U .

178. Koulmanda M. Pig islets xenografts are resistant to autoimmune destruction by non-obese diabetic recipients after anti CD4 treatment / M. Koulmanda, A. Qipo, R.N. Smith // Xenotransplantation. 2003. - Vol 10. - pp. 178-184.

179. Kovaric J. Islet transplantation / J. Kovaric, T.E. Mandel // Transpl. Proc. 1999. - № 31. - pp. 45-48.

180. Kozak T. Hematopoietic stem cell transplantation for multiple sclerosis / T. Kozak, E. Havrdova et al. // J. Neurol. 2002. - 249. - pp. 10881097.

181. Kroon E. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo / E. Kroon, L.A. Martinson, K. Kadoya et al. // Nat Biotechnol. 2008. - 26. - pp. 443-452.

182. Kulseng B. Alginate polylysine microcapsules as immune barrier: permeability of cytokines and imunoglobulins over the capsule membrane / B. Kulseng, B. Thu, T. Espevik et al. // Cell Transp. 1997. - № 6. - pp. 387-394.

183. Lacy P. Method for the isolation of intact islats of Langerhans from the rat pancreas / P. Lacy, M. Kostianovsky // Diabetes. 1967. - № 16. - pp. 3539.

184. Lacy P.E. Maintenance of normoglycemia in diabetic mice by subcutaneous xenografts of encapsulated islets / P.E. Lacy, O.D. Hegre et al. // Science. 1991. - № 254. - pp. 1782-1784.

185. Lakshmi K.G. Indications of islet allotolerance in nonhuman primates / K.G. Lakshmi, Y. Nitta et al. // Ann. NY Acc. Sci. 2002. - № 958. - pp. 199203.

186. Lanza R.P. Perspectives in diabetes. Islet transplantation with immunosupression / R.P. Lanza, S.J. Sullivan, W.L. Chic // Diabetes. 1992. - № 41. - pp. 1503-1510.

187. Lau H. Prolongation of rat islet allograft survival by direct ultraviolet irradiation of the graft / H. Lau, K. Reemtsma, M.A. Hardy // Science. 1984.1. ATnOTJ cm ^OQ1. J^^^J. pp. \J\J I -UU7.

188. Lavoir M.-C. Isolation and identification of bovine fetal germ cells / M.-C. Lavoir, P.K. Basrur, K.J. Betteridge // Mol. Reprod. Dev. 1994. - Vol. 37. -pp. 413-424.

189. Le Blanc K. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells / K. Le Blanc, C. Tammik, K. Rosendahl et al. // Exp. Hematol. 2003. - 31. - pp. 890-896.

190. Le Blanc K. Immunomodulatory effects of fetal and adult mesenchymal stem cells / K. Le Blanc // Cytotherapy. 2003. - 6. - pp. 485-489.

191. Lechner A. Stem/progenitor cells derived from adult tissues: potential for the treatment of diabetes mellitus / A. Lechner, J. Habener // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2003. - 284. - 2. - E259-E266.

192. Lee J-H. Characterizing and mapping porcine endogenous retroviruses in Westran pigs / J-H. Lee, G.C. Webb, R.D.M. Allen et al. // J Virology. 2002. -Vol. 76. - № 11. - pp. 5548-5556.

193. Leichthammer F. In vitro culture and cryopreservation of farm animals primordial germ cells / F. Leichthammer, G. Brem // Theriogenology. -1990.-Vol. 33 (1).-p. 272.

194. Leichthammer F. Behavoir of living primordial germ cells of livestock in vitro / F. Leichthammer, E. Baunack, G. Brem // Theriogenology. 1990. -Vol. 33.-pp. 1221-1230.

195. Lester L.B. Directed differentiation of rhesus monkey ES cells into pancreatic cell phenotypes / L.B. Lester, H.C. Kuo, L. Andrews et al. // Reprod Biol Endocrinol. 2004 - 2. - p. 42.

196. Li B.C. Directional differentiation of chicken primordial germ cells into adipocytes, neuron-like cells, and osteoblasts / B.C. Li, Z.Q. Tian, M. Sun et al. // Mol Reprod Dev. 2010. - 77(9). - pp. 795-801.

197. Li M. Generation of purified neural precursors from embryonic stem cells by lineage selection / M. Li, L. Pevny, R. Lovell-Badge et al. // Curr Biol.1 nno ne.mi c\na1 y 713. — I \J. pp. y / L-y / t.

198. Liu E.H. Transplantation of the islets of Langerhans: new hope for treatment of type 1 diabtes mellitus / E.H. Liu, K.C. Herold // TEM-2000. Vol. 11. - №9. - pp. 379-382.

199. Lumelsky N. Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structures similar to pancreatic islets / N. Lumelsky, O. Blondel, P. Laeng et al. // Science. 2001. - 292. - pp. 1389-1394.

200. Ma D.R. The Location, Molecular Characterisation and Multipotency of Hair Follicle Epidermal Stem Cells / D.R. Ma, E.N. Yang, S.T. Lee // Ann. Acad. Med. Singapore. 2004. - 33. - pp. 784-788.

201. MacKenzie D.A. Analysis of pessenger cell composition of human fetal pancreas: implications for transplantation / D.A. MacKenzie, H.W. Sollinger, D.A. Hullet // Transpl. Proc. 1999. - № 254. - pp. 1782-1784.287

202. Mandrup-Poulsen T. Human tumor necrosis factor potentiates human interleukin 1-mediated rat pancreatic beta-cell cytotoxicity / T. Mandrup-Poulsen, K. Bendtzen et al. // J. Immunol. 1987. - № 139. - pp. 4077-4082.

203. Marmont A. M. Immunoablation followed or not by hematopoietic stem cells as an intense therapy for severe autoimmune diseases: new perspectives, new problems / A. M. Marmont // Haematologica. 2001. - 86. - pp. 337-345.

204. Martin J.M. Effect of growth hormone on the isolated pancreatic islets of rat in vitro / J.M. Martin, J.J. Gagliardino // Nature. 1967. - 213. - pp. 630631.

205. Martin J.M. Insulin secretion in rats with elevated circulating growth hormone due to MtT-W15 tumor / J.M. Martin, H.K. Akerblom, G. Garay // Diabetes. 1968. - 17. - pp. 661-667.

206. Mashima H. Beta-cellulin and activin A coordinately convert amylase-secreting pancreatic AR42j cells into insulin-secreting cells / H. Mashima, H. Ohnishi, K. Wakabayashi et al. // J Clin Invest. 1996. - 97. - pp. 1647-1654.

207. Mashima H. Formation of insulin-producing cells from pancreatic acinar AR42 J cells by hepatocyte growth factor / H. Mashima, H. Shibata, T. Mine et al. // Endocrinology. 1996. - 137. - pp. 3969-3976.

208. Matsubara N. The role of interleucin-4 in the regulation of mouse primordial germ cell numbers / N. Matsubara, Y. Takahashi, Y. Nishina et al. // Dev. Biol. 1996. - V. 180. - pp. 14-21.

209. Mauer S.M. Studies of the rate of regression of the glomerular lesions in diabetic rats treated with pancreatic islet transplantation / S.M. Mauer, M.W. Steffes, D.E. Sutherland et al. // Diabetes. 1975. - 24. - №3. - pp. 280-285.

210. McKusick V.A. The status of the gene map of the human chromosomes / V.A. McKusick, F.H. Ruddle // Science. 1977. - 196. - pp. 390405.

211. McLaren A. Development of primordial germ cells in the mouse / A. McLaren // Andrologia. 1992. - Vol. 24. - pp. 243-247.

212. McPaul J.J. Specificities of antibodies eluted from human cadaveric renal allografts / J.J. McPaul, P. Stastny, R.B. Freeman // J.Clin.Invest. 1981. -№67. -pp. 1405-1414.

213. McWhir J. Selective ablation of differentiated cells permits isolation of embryonic stem cell lines from murine embryos with non-permissive genetic background / J. McWhir, A.E. Schnieke, R. Ansell et al. // Nat Genet. 1996. -14. - pp. 223-226.

214. Misler S. A metabolite-regulated potassium channel in rat pancreatic B cells / S. Misler, L.C. Falke, K. Gillis et al. // Proc Natl Acad Sci USA. 1986. -83(18). - pp. 7119-7123.

215. Moldrup A. Effects of sex and pregnancy hormones on growth hormone and prolactin receptor gene expression in insulin-producing cells / A. Moldrup, E.D. Petersen, J.H. Nielsen // Endocrinology. 1993. - 133. - pp. 11651172.

216. Moldrup A. Rat insulinoma cells express both a 115 kDa growth hormone receptor and a 95 kDa prolactin receptor structurally related to the hepatic receptors / A. Moldrup, N. Billestrup, J.H. Nielsen // J Biol Chem. 1990. - 265. -pp. 8686-8690.

217. Motoyoshi S. Cellular characterization of pituitary adenoma cell line (AtT20 cell) transfected with insulin, glucose transporter Type 2 and glucokinase gene / S. Motoyoshi, T. Shirotani, E. Araki et al. // Diabetilogia. 1998. - 41. - pp. 1492-1501.

218. Nagy A. Embryonic stem cells alone are able to support fetal development in the mouse / A. Nagy, E. Gocza, E.M. Diaz et al. // Development. -1990.- 110.-pp. 815-821.

219. Najarían J.S. Human islet autotransplantation. A preliminary report / J.S. Najarían, D.E.R. Sutherland et al. // Transplant. Proc. 1977. - 9. - №1. - pp. 233-236.

220. Nathan S. Cell based therapy in the repair of osteochondral defects: a novel use for adipose tissue / S. Nathan, D. Das, A. Thambyah et al. // Tissue Eng. -2003.-9.-pp. 733-744.

221. Nichols E.A. A review of enzyme polymorphism, linkage and electrophoretic conditions for mouse and somatic cell hybrids in starch gels / E.A. Nichols, F.H. Ruddle // J. Hystochem. Cytochem. 1973. - 21. - pp. 1066-1081.

222. Nielsen J.H. Beta cell proliferation and growth factors / J.H. Nielsen, C. Svensson, E.D. Galsgaard et al. // J Mol Med. 1999. - 77. - pp. 62-66.

223. Nielsen J.H. Effects of growth hormone, prolactin and placental lactogen on insulin content and release, and deoxyribonucleic acid synthesis in cultured pancreatic islets / J.H. Nielsen // Endocrinology. 1982. - 110. - pp. 600606.

224. Nielsen J.H. Effects of pregnancy hormones on pancreatic islets in organ culture / J.H. Nielsen, V. Nielsen, L.M. Pedersen et al. // Acta Endocrinol (Cph). 1986. - 111. - pp. 336-341.

225. Nielsen J.H. Expression of growth hormone and prolactin receptors in the developing mouse pancreas / J.H. Nielsen, G. Gittes // J Cell Biochem Suppl.i yyZ. lOi . f\Dauav/i »vz.ii.

226. Nielsen J.H. Growth hormone is a growth factor for the differentiated pancreatic b-cell / J.H. Nielsen, S. Linde, B.S. Welinder et al. // Mol Endocrinol. -1989.-3. pp. 165-173.

227. Nielsen J.H. Growth hormone stimulates islet cell replication to form expanding monolayers / J.H. Nielsen, R. Jorgensen, K. Brunstedt et al. // Diabetologia. 1984. - 27. - p. 315A.

228. Nielsen J.H. Islet cell proliferation / In:. R.P. Lanza, W.L. Chick (eds) Pancreatic Islet Transplantation Series // Vol 1. Procurement of Pancreatic Islets. R.G. Landes Company Biomedical Publishers. - 1994. - pp. 157-168.

229. Nielsen J.H. The role of growth hormone and prolactin in beta cell growth and regeneration / J.H. Nielsen, A. Moldrup, N. Billestrup et al. // In: Vinik

230. AI (ed) Pancreatic islet cell regeneration and growth Adv Exp Med Biol. - 1992. -321. - pp. 9-17.

231. Nielsen J.H. The role of somatolactogenic hormones and receptors in the growth and function of the endocrine pancreas / J.H. Nielsen, A. Moldrup, N. Billestrup, E.D. Petersen // Pediatric Res. 1993. - 33. - p. S76.

232. Oberholzer J. (3 Cell Replacement for the Treatment of Diabetes / J. Oberholzer et al. // Annals of the New York Academy of Sciences 2001. - 944. -pp. 373-387.

233. Otoncoski T. Nicotinamide is a potent inducer of endocrine differentiation in cultured human fetal pancreatic cells / T. Otoncoski, G.M. Beattie, M.I. Mally et al. // J Clin Invest. 1993. - 92. - pp. 1459-1466.

234. Otoncoski T. Opposite effects of beta-cells différenciation and growth on reg expression of human fetal pancreas cells / T. Otoncoski, M.I. Mally, A.

235. TJawd- // F^oko+oo 1 ÛÛ/I AT. nri 1 1 £A1 1 f,f,iluJ Civ ii wiuuvivj. — i y j-t. — f>. Up. 1 1 Ut 1 1 \JVJ.

236. Otoncoski T. A role for hepatocyte growth factor/scatter factor in fetal mesenchyme-induced pancreatic beta-cell growth / T. Otonkoski, V. Cirulli, G.M. Beattie et al. // Endocrinology. 1996. - 137. - pp. 3131-3139.

237. Pedersen R.A. Studies of in vitro differentiation with embryonic stem cells / R.A. Pedersen // Reprod Fertil Dev. 1994. - 6. - pp. 543-552.

238. Penfonis A. Langerhans islet preparation in cell transplantation / A. Penfonis // Transfus. Sci. 1997. - Vol. 18. - №2. - pp. 235-241.

239. Pepper R.J. Experimental renal heterotransplantation.III. Passive transfer of transplantation immunity / R.J. Pepper, J.S. Najarían // Transplantation.- 1967. №5.-pp. 514-533.

240. Petropavlovskaia M. Identification and characterization of small cells in the adult pancreas: potential progenitor cells? / M. Petropavlovskaia, L. Rosenberg // Cell and Tissue Research. 2002. - 310 (1). - pp. 51-58.

241. Piedrahita J.-A. Generation of transgenic porcine chimeras using primordial germ cell-derived colonies / J.-A. Piedrahita, K. Moor, B. Oetama et al. // Biol, of reprod. 1998. - Vol. 58. - pp. 1321-1329. '

242. Pierluissi J. Effects of growth hormone on insulin release in the rat / J. Pierluissi, R. Pierluissi, S.J.H. Ashcroft // Diabetologia. 1980. - 19. - pp. 391— 396.

243. Pierluissi J. Effects of hypophysectomy and growth hormone on cultured islets of Langerhans of the rat / J. Pierluissi, R. Pierluissi, S.J.H. Ashcroft // Diabetologia. 1982. - 22. - pp. 134-137.

244. Piatt J.L. Islet xenotransplantation: how sweet it is / J.L. Piatt // J Clin Invest. 1996. - 15. - 98(6). - pp. 1273-1274.

245. Polak M. Demonstration of lactogenic receptors in rat endocrine pancreas by quantitative autoradiography / M. Polak, R. Scharfmann, E. Ban et al. // Diabetes. 1990. - 39. - pp. 1045-1049.

246. Pontecorvo G. Polyethylene glycol (PEG) in the production of mammalian somatic cell hybrids / G. Pontecorvo // Cytogenet. Cell Genet. 1976.- 16. pp. 399-400.

247. Qiu L. Promotes selective expansion of the nephrogenic mesenchyme during kidney organogenesis / L. Qiu et al. // Organogenesis. 2004. - 1. - №1. -pp. 14-21.

248. Quedraogo G. Determination of plasma alpha-amylase in the dog: a test of the specificity of new methods/ G. Quedraogo, J.P. Braun, B. Thorel et al. // J Clin Chem Clin Biochem. 1990. - 28(7). - pp. 493-495.

249. Rabinovitch A. Growth hormone stimulates b-cell replication in neonatal rat pancreatic monolayer cultures / A. Rabinovitch, C. Quigley, M.M. Rechler // Diabetes. 1983. - 32. - pp. 307-312.

250. Rafaelloff R. Cloning and sequencing of the pancreatic islet neogenesis associated protein gene and its expression in islet neogenesis in hamsters / R. Rafaelloff, G.L. Pittenger, S.W. Barlow et al. // J Clin Invest. 1997. -99.-pp. 2100-2109.

251. Ramiya V.K. Reversal of insulin-dependent diabetes using islets generated "in vitro" from pancreatic stem cells / V.K. Ramiya, M. Maraist, K.E. Arfors et al. // Nat Med. 2000. - 6. - pp. 278-282.

252. Rao M. Tumorigenesis and embryonic stem cell-derived therapy / M. Rao // Stem Cells Dev. 2007. - 16. - pp. 903-904.

253. Raplan H.J. A reconsideration of immunological privelege within the anterior chamber of the eye / H.J. Raplan, T.R. Stevens // Transplantation. 1975. -Vol. 19. - №4.- pp. 203-209.

254. Rasmusson I. Mesenchymal stem cells inhibit the formation of cytotoxic T lymphocytes, but not activated cytotoxic T-lymphocytes or natural killer cells/ I. Rasmusson, O. Ringden, B. Sundberg et al. /'/' Transplantation. -2003.-76. pp. 1208-1213.

255. Rathein D.A. Identification of antigenic determinants of insulin recognized by Monoclonal antibodies / D.A. Rathein, P.A. Underwood // Mol. Imunol. 1986. - Vol. 23. - pp. 441-450.

256. Rayat G.R. Potential application of neonatal porcine islets as treatment for type 1 diabetes: a review / G.R. Rayat, R.V. Rajotte, G.S. Korbutt // Ann NY Acad. SCI. 1999. - №875. - pp. 175-188.

257. Richardt M. Islet transplantation in experimental diabetes of the rat / M. Richardt, A. Menden, R. Bretzel // Hormone and metab. Res. 1984. - 16. -№10. - pp. 551-552.

258. Ringertz N.R. Cell hybrids / N.R. Ringertz, R.E. Savage // Academic Press, Inc., New York. 1976. - pp.147-161.293

259. Roche E. Long-term exposure of beta-INS cells to high glucose concentration increases anaplerosis, lipogenesis and lipogenetic gene expression / E. Roche, S. Farfary, L.A. Witters et al. // Diabetes. 1998. - 47. - pp. 1086-1094.

260. Rohwedel J. Induction of cellular differentiation by retinoic acid in vitro / J. Rohwedel, K. Guan, A.M. Wobus // Cells Tissues Organs. 1999. - 165. -pp. 190-202.

261. Ronald R. A rapid and sensitive radioimmunoassay for the measurement of proinsulin in human serum / R. Ronald // Diabetes. 1992. - Vol. 41. - pp. 411-420.

262. Rooman I. Effect of vascular endothelial growth factor on growth and differentiation of pancreatic ductal epithelium /1. Rooman, F. Schuit, L. Bouwens // Lab Invest. 1997. - 76. - pp. 225-232.

263. Rucinsky R. AAHA Diabetes Management Guidelines for Dogs and Cats / R. Rucinsky, A. Cook, S. Haley et al. // J of the American Animal Hospital Association. 2010. - Vol. 46. - pp. 215-224.

264. Ruddle F.H. A new era in mammalian gene mapping: somatic cell genetics and recombinant DNA methodologies / F.H. Ruddle // Nature (London). -1981.-294. pp. 115-120.

265. Ruddle F.H. Parasexual approaches to the genetics of man / F.H. Ruddle, R.P. Creagan // Annu. Rev. Genet. 1975. - 9. - pp. 407-487.

266. Ruddle F.H. Starch gel electrophoretic phenotypes of mouse x human somatic cell hybrids and mouse isozyme polymorphisms / F.H. Ruddle // In Vitro (Rockville). 1971.-7. - pp. 120-131.

267. Ryan J. Chromosomal assignment of a family of human oncogenes / J. Ryan, P.E. Barker, K. Shimizu et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. - 80. -pp. 4460-4463.

268. Schroer J.A. Hybridomas antibody recognition of the insulin molecule / J.A. Schroer // New York: Ravn Press. 1981. - pp. 167-173.

269. Schuldiner M. Selective ablation of human embryonic stem cells expressing a "suicide" gene / M. Schuldiner, J. Itskovitz-Eldor, N.V. Benvenisty // Stem Cells. 2003. - 21. - 3. - pp. 257-265.

270. Secchi A. Endocrinometabolic effects of whole versus segmental pancreas allotransplantation in diabetic patients a two-year follow-up / A. Secchi, J.M. Dubernard et al. // Transplantation. - 1991. - Vol. 51. - №3. - pp. 625-629.

271. Segev H. Differentiation of human embryonic stem cells into insulinproducing clusters / H. Segev, B. Fishman, A. Ziskind et al. // Stem Cells. -2004. 22. - pp. 265-274.

272. Shamblott M.J. Derivation of pluripotent stem cells cultured human primordial germ cells / M.J. Shamblott, J. Axelman, S. Wang et al. // Proc. Natl. Acad. Rec. USA. 1998. - 95. - pp. 13726-13731.

273. Shapiro J. A prospective randomized trial of FK 506/prednizolone vs 506/azathioprine/prednizolone in renal transplant patients /' J. Shapiro, M.L. Jordan et al. // Transp. Proc. 1995. - №27. - pp. 814-817.

274. Shapiro J. Eighty years after insulin: parallels with modern islets transplantation / J. Shapiro // Can. Med. Assoc. J. 2002. - Vol. 167, - №12. - pp. 1398-1400.

275. Sharon A. Prolongation of life in anephric rats following de novo enal organogenesis / A. Sharon, M. Rogers, R. Hammerman // Organogenesis. 2004. - 1,- 1. - pp. 22-25.

276. Shim H. Isolation of pluripotent stem cells from cultured porcine primordial germ cells / H. Shim, A. Gutierrez-Adan, L.-R. Chen et al. // Biol, of reprod. 1997. - Vol. 57. - pp. 1089-1095.

277. Siebers U. Histocompability of semipermeable membranes for implantable diffisin devices (bioartificial pancreas) / U. Siebers, T. Zekorn, R.G. Bretzel et al. // Transpl. Proc. 1990. - №22. - pp. 834-835.

278. Sjoholm A. Polyamine requirement in nicotinamide-stimulated beta-cells differentiation in fetal porcine islet-like clusters / A. Sjoholm, O. Korsgren, A. Andersson // Endocriniligy. 1994. - 135. - pp. 1559-1565.

279. Smith F.E. Enchanced insulin-like growth factor 1 gene expression in the regenerating rat pancreas / F.E. Smith, K.M. Rosen, L. Villa-Komaroff et al. // Proc Natl Acad Sci USA. 1991. - 88. - pp. 6152-6156.

280. Song K. In vitro transdifferentiation of adult pancreatic acinar cells into insulin-expressing cells / K. Song // Biochem Biophys Res Commun. 2004. -316. - pp. 1094-1100.

281. Soon S.P. Insulin independence in type I diabetic patient after encapsulated islet transplantation / S.P. Soon, R.E. Heintz et al. // Lancet. 1994. -№343. - pp. 950-951.

282. Soria B. Engineering pancreatic islets / B. Soria, E. Andreu, G. Berna et al. // Pflugers Arch. 2000. - 440. - pp. 1-18.

283. Soria B. From stem cells to beta cells: new strategies in cell therapy of diabetes mellitus / B. Soria, A. Skoudy, F. Martin // Diabetologia. 2001. - 44. -pp. 407-415.

284. Soria B. Insulin-secreting cells derived from embryonic ctem cells normalize glycemia in streptozotocin-induced diabetic mice / B. Soria, E. Roche, G. Berna et al. // Diabetes. 2000. - 49. - pp. 157-162.

285. Stevens L.C. The biology of teratomas / L.C. Stevens // Adv Morphog. 1967. - 6. - pp. 1-31.

286. Stevens R.B. Is islet transplantation a realistic therapy for the treatment of type 1 diabetes in the near future / R.B. Stevens, S. Matsumoto, C.L. Marsh // Clinical Diabetes. 2001. - №19. - pp. 51-60.

287. Stevens R.B. Role of nitric oxide in the pathogenesis of early pancreatic islet dysfunction during rat and human intraportal islet transplantation / R.B. Stevens, A. Lokeh et al. // Trans. Proc. 1994. - №26. - p. 692.

288. Sumner A.T. New technique for distinguishing between human chromosomes / A.T. Sumner, H.J. Evans, R.A. Buckland // Nature (London) New Biol. 1971.-232. - pp. 31-32.

289. Sun A.M. Studies on the effects of growth hormone and thyroxine on proinsulin synthesis and insulin formation in the isolated islets of Langerhans of the rat / A.M. Sun, B.J. Lin, R.E. Haist // Can J Physiol Pharmacol. 1972. - 50. -pp. 1147-1151.

290. Surani M.A. Germ Line and Pluripotent Stem Cells / M.A. Surani, W. Reik // Epigenetics Cold Spring Harbor (N.Y.). 2007. - Vol. 20. - pp.377-395.

291. Susini S. Glucose and glucoincretin peptides synergise to induce c-fos, c-jun, junB, zif268, nur-77gene expression in pancreatic beta-cells / S. Susini, E. Roche, M. Prentki et al. // FASEB J. 1998. - 12. - pp. 1173-1182.

292. Swenne I. Growth hormone regulation of somatomedin C/insulin-like growth factor I production and DNA replication in fetal rat islets in tissue culture/ I. Swenne, D.J. Hill, A.J. Strain et al. // Diabetes. 1987. - 36,- pp. 288-294.

293. Swenne I. Pancreatic beta-cell growth and diabetes mellitus / I. Swenne // Diabetologia. 1992. - 35. - pp. 193-210.

294. Szpirer C. Chromosomal assignment of five cancer-associated rat genes: two thyroid hormone receptor (ERBA) genes, two ERBB genes and the retinoblastoma gene / C. Szpirer, J. Szpirer, M. Riviere et al. // Oncogene. 1991. -6. - pp. 1319-1324.

295. Tayaramma T. Chromatin-Remodeling factors allow differentiation of bone marrow cells into insulin-producing cells / T. Tayaramma, B. Ma, M. Rohde et al. // Stem cells. 2006. - 24. - pp. 2858-2867.297

296. Tessone M. Prolactin binding in rat Langerhans islets / M. Tessone, Oliveira-Filho, E.H. Charreau // J Recept Res. 1980. - 1. - pp. 355-382.

297. Thomson J.A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocyst / J.A. Thomson, J. Itskovitz-Eldor, S.S. Shapiro // Science. 1998. -282. - pp. 1145-1147.

298. Till J.E. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells / J.E. Till, E.A. McCulloch // Radiat Res. 1961. - 14. -pp. 1419-1430.

299. Todo S. Liver, kidney and thoracic organ transplantation under FK506 / S. Todo, J.J. Fung et al. // Ann. Surg. 1990. - №212. - pp. 295-305.

300. Vaiman D. A set of 99 cattle microsatellites: characterization, synteny mapping, and polymorphism / D. Vaiman, D. Mercier, K. Moazami-Goudarzi et al. // Mamm. Genome. 1994. - 5. - pp. 288-297.

301. Valente U. Report of clinical cases of human fetal transplantation / U. Valente, M. Ferro, S. Barocci // Transplant. Proc. 1980. - 12. - №4. - pp. 213214.

302. Verme T.B. Regulation of pancreatic duct epithelial growth in vitro / T.B. Verme, S.R. Hootman // Am J Phisiol. 1990. - 258. - pp. G833-G840.

303. Vinik A. Determinants of pancreatic islet cell mass: a balance between neogenesis and senescence/apoptosis / A. Vinik, G. Pittenger, R. Rafaeloff et al. // Diabetes Rev. 1996. - 4. - pp. 235-263.

304. Wang Z.Q. Generation of completely embryonic stem cell-derivedmutant mice using tetraploid blastocyst injection / Z.Q. Wang, F. Kiefer, P. Urbanek et al. // Mech Dev. 1997. - 62. - pp. 137-145.

305. Weiss R.A. Xenotrsnsplantation / R.A. Weiss // BMJ. 1998. - №317. -pp. 931-934.

306. Welsh M. Genetic factors of importance for beta-cell proliferation / M. Welsh, J. Mares, C. Ôberg, T. Karlsson // Diabetes Metab Rev. 1993. - 9. -pp. 25-36.

307. White M. 1RS proteins and the common path to diabetes / M. White // Am J Physiol Endocrinol Metab. 2002. -283(3). - pp. E413-422.

308. Whittaker P.G. Direct effect of rat growth hormone on rat islets of Langerhans in tissue culture / P.G. Whittaker, K.W. Taylor // Diabetologia. 1980. - 18. - pp. 323-328.

309. Wobus A. Characterization of a pluripotent stem cell line derived from a mouse embryo / A. Wobus, H. Holzhausen, P. Jäkel et al. // Exp Cell Res. -1984.- 152.-pp. 212-219.

310. Wobus A.M. Retinoic acid accelerates embryonic stem cell-derived cardiac differentiation and enhances development of ventricular cardiomyocytes / A.M. Wobus, G. Kaomei, M.C. Shan et al. // J Mol Cell Cardiol. 1997. - 29. -pp. 1525-1529.

311. Womack J.E. Gene map of the cow: conservation oflinkage with mouse and man / J.E. Womack, Y.D. Moll // J. Hered. 1986. - 77. - pp. 2-7.

312. Yang L. In vitro trans-differentiation of adult hepatic stem cells into pancreatic endocrine hormone producing cells / L. Yang, S. Li, H. Hate et al.// Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2002. - 49. - pp. 157-162.

313. Youngner J.S. Monolayer tissue cultures. Preparation and standardization of suspensions of trypsin dispersed monkey kidney cells / J.S. Youngner // Proc. Soc. exper. Biol. Med. 1954. - 85. - p. 202.

Информация о работе

Абдрахманов, Игорь Камильевич
доктора биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Разработка новых биотехнологических методов получения инсулина и лечения инсулинозависимого сахарного диабета мелких домашних животных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы