Разработка нового стимулятора роста микроорганизмов и изучение его влияния на их биологические свойства на примере некоторых вакцинных штаммов бактерий

Панова, Наталья Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка нового стимулятора роста микроорганизмов и изучение его влияния на их биологические свойства на примере некоторых вакцинных штаммов бактерий
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка нового стимулятора роста микроорганизмов и изучение его влияния на их биологические свойства на примере некоторых вакцинных штаммов бактерий"

На правах рукописи

Панова Наталья Викторовна

РАЗРАБОТКА НОВОГО СТИМУЛЯТОРА РОСТА МИКРООРГАНИЗМОВ И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО ВЛИЯНИЯ НА ИХ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НА ПРИМЕРЕ НЕКОТОРЫХ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ

03.00.23 - Биотехнология 03.00.07 - Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ставрополь - 2006

Работа выполнена в Ставропольском государственном университете и Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте.

Научные руководители: доктор ветеринарных наук, профессор

Тимченко Людмила Дмитриевна;

доктор медицинских наук, профессор Тюменцева Ирина Степановна.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Дударь Юрий Александрович;

доктор медицинских наук, профессор Базиков Игорь Александрович.

Ведущая организация: Северо-Кавказский государственный

технический университет

Защита г. в/^часов на заседании диссертацион-

ного совета ДМ 212.25б'о4/при Ставропольском государственном университете по адресу: Россия, 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина 1, корп. 2, ауд. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета.

Автореферат разосла

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук ^РЯЙЙЙ^-- Джандарова Т.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из главных принципов промышленной биотехнологии, использующей в качестве биологических объектов микроорганизмы, является их культивирование на любом из производственных этапов, от поддержания штаммов до получения биомассы микроорганизмов в количестве, достаточном для обеспечения эффективности производства.

Основным условием для успешного культивирования, обеспечивающего максимальное накопление биомассы и поддержания активности штаммов, является подбор питательных сред в соответствии с питательными и другими физиологическими потребностями микроорганизма (Малахов Ю.А., Панин А.Н., Соболева Г.Л., 2000; Прозоркина Н.В., Рубашкина JI.A., 2002; Ellinghausen H., Faine S., 1982).

Большинством специалистов для подавляющей массы производственных микроорганизмов лучшими признаны питательные среды из естественного сырья: препараты крови, казеин, мясные гидролизаты, экстракты растительного и животного происхождения (Коротеева JI.A., Шишов В.П., Маслак A.A., 2001; Меджидов М.М., 2003; Faine S., 1982). Однако практика показывает, что многие предприятия биологической промышленности, традиционно использующие среды из такого сырья, часто испытывают серьезные затруднения, связанные со снижением объема наращиваемой бактериальной массы, необходимой для производства препаратов.

Не исключено, что проблема снижения стандартности питательных сред, важность которой подчеркивается многими исследователями (Зелютков Ю.Г., Зайцев В.И., 1997; Геладзе В.Ш. и др., 1998; Овсова JI.M. и соавт., 2003), обусловлена, прежде всего, снижением качества продуктов природного происхождения в связи со сложной экологической обстановкой и антропогенным воздействием на окружающую среду. В частности, в мясных продуктах могут содержаться антибиотики, химикаты, нитраты, токсические продукты, что отрицательно отражается на культивировании промышленных штаммов (Рябов В., Генкель В., Волкова Н., 1996; Waguespack M., 1986; Corrigan Р J., Seneviratna P., 1989).

элементы, витамины, аминокислоты добавляют к питательным средам в минимальных количествах. Подобные биологически активные вещества в таких количествах не являются питательными компонентами, а выполняют роль активаторов роста или катализаторов (Никитина В.А., Бобрышев В.И., Кафизова Ф.И., 1979; Macfarlane D.E., Elian-Jones Т.Е., 1980), участвующих в сложнейших биохимических реакциях.

Однако все питательные добавки и стимуляторы роста обладают селективным действием по отношению к большинству микроорганизмов, а при избыточном добавлении некоторых из них отмечается даже эффект ингибирования ростовых свойств микробов (Глазунов А.В., Аргунов С.В., Капулыдевич Ю.Г., 1993; Gadgii M.D., 1967). Хороший стимулирующий эффект с возможностью использования для широкого перечня микробов при их культивировании может обеспечиваться при использовании питательных смесей, сочетающих различные ростостимулирующие компоненты (Мейнелл Дж., Мейнелл Э., 1967).

В связи с вышеизложенным, изыскание наиболее универсальных стимуляторов роста и размножения микроорганизмов, которые можно использовать для совершенствования традиционных питательных сред при выращивании большинства микробов, остается актуальной задачей.

Цель и основные задачи исследования. Целью работы явилась разработка на основе эмбриональных и внезародышевых тканей куриного яйца нового стимулятора роста микроорганизмов (ЭСРМ), изучение его влияния на их биологические свойства и ростостимупирующего эффекта на некоторые вакцинные штаммы.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи.

1. Изыскать оптимальные и рациональные биотехнологические приемы, способствующие накоплению и сохранению в препарате «ЭСРМ» оптимального набора и соотношения биологически активных веществ, обеспечивающих рос-тостимулирующую активность микроорганизмов.

2. Отработать методы стерилизации, обеспечивающие 100% стерильность и максимальную сохранность всех компонентов «ЭСРМ».

3. Исследовать стимулирующее действие препарата на жизнеспособность Listeria monocytogenes, Leptospira interrogans, Yersinia pestis.

4. Определить опытным путём минимальную и оптимальную дозы стимулятора роста в зависимости от тестового микроорганизма и среды, используемой для его выращивания.

5. Изучить влияние «ЭСРМ» на морфологические, тинкториальные и культуральные свойства тестовых микроорганизмов, выращенных на питательных средах с использованием «ЭСРМ».

6. Изучить химический состав препарата «ЭСРМ».

7. Исследовать возможность использования препарата в составе питательных сред для получения биомассы микроорганизмов в производственных целях, с последующим изучением изготовленных биопрепаратов по основным показателям согласно нормативной документации (НД).

Научная новизна. Разработан и экспериментально апробирован новый тканевой биологически активный препарат, обладающий стимулирующими свойствами на рост микроорганизмов, изготовленный по оригинальной технологии из инкубированного куриного яйца.

Впервые изучено и обнаружено стимулирующее действие препарата на рост чумного микроба, листерий, лептоспир и отработаны оптимальные дозы стимулятора роста для тестовых микроорганизмов при их культивировании на разных жидких и плотных питательных средах.

Установлено, что препарат «ЭСРМ» при добавлении в питательные среды не изменяет морфологические, тинкториальные, культуральные свойства культивируемых микроорганизмов.

Проведены исследования экспериментальных серий вакцин против лептос-пироза и чумы, изготовленных из бактериальной массы, выращенной на питательной среде с использованием стимулятора роста микроорганизмов «ЭСРМ» в соответствие нормативной документацией. Установлено, что изготовленные экспериментальные серии вакцин отвечают всем требованиям НД по изготовлению вакцин против лептоспироза и чумы.

Приоритетность выполненных исследований подтверждена уведомлением о положительном результате формальной экспертизы на изобретение, заявка от 24.05.2004, № 2004115830/13 (016861).

Теоретическая и практическая значимость. На основании проведенных исследований по приготовлению и испытанию препарата «ЭСРМ» разработана и утверждена техническая документация (Технические условия). Научные разработки используются в работе ФГУЗ Ставропольского научно-исследовательского противочумного института и ФГУП «Ставропольская биофабрика». Получены положительные результаты по эффективному применению препарата «ЭСРМ» в качестве стимулятора роста микроорганизмов. Результаты исследований используются в учебном процессе медико-биолого-химического факультета Ставропольского ГУ, Воронежского ГАУ им. К.Д. Глинки, Кабардино-Балкарской ГСХА, Пятигорской ГФА, Ставропольском филиале МГОПУ им. М.А. Шолохова в качестве дополнений к учебным материалам по дисциплинам «Микробиология» и «Биотехнология».

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на межрегиональной научно-практической конференции «Приори-

теты культуры и экологии в образовании» (апрель 2003 г., филиал МГОПУ им. М.А. Шолохова, г. Ставрополь); межрегиональной научной конференции «Студенческая наука - экономике России» (апрель 2003 г., Сев.-Кав. ГТУ, г. Ставрополь); межрегиональной научной конференции «Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе» (апрель 2004 г., Ставропольский ГУ); межрегиональной научно-практической конференции «Образование, здоровье и культура в начале XXI века» (апрель 2004 г., филиал МГОПУ им. М.А. Шолохова, г. Ставрополь); межрегиональной научной конференции «Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе» (апрель 2005 г., Ставропольский ГУ); Всероссийской студенческой конференции «Актуальные проблемы современной биологии» (апрель 2005 г., г. Астрахань); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и образования» (март 2005 г., Самарская ГСХА); научных чтениях, посвященных 200-летию Московского общества испытателей природы «Биотехнология, экология, охрана окружающей среды (Московский ГУ им. М.В. Ломоносова, 2005); I ежегодной научной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН (апрель 2005 г., г. Ростов-на-Дону.).

Препарат был представлен на Всероссийской выставке-ярмарке научно-исследовательских работ и инновационной деятельности студентов, аспирантов и молодых ученых высших учебных заведений РФ «ИННОВ-2003». «ИННОВ-2005» (2003, 2005 гг. ЮРГТУ, г. Новочеркасск), IV-V Московском международном салоне инноваций и инвестиций (г. Москва, 2004, 2005 гг.) и награжден 5 дипломами и 5 серебряными медалями.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 10 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 173 страницах машинописного текста, иллюстрирована 22 рисунками, 10 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений и приложений. Список использованной литературы содержит 259 источников, в том числе - 45 зарубежных авторов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Технология приготовления стимулятора роста микроорганизмов «ЭСРМ».

2. Результаты исследования стимулирующего влияния полученного препарата «ЭСРМ» на жизнеспособность тестовых микроорганизмов и его оптимальные дозы.

3. Результаты влияния «ЭСРМ» на морфологические, тинкториальные, куль-туральные и антигенные свойства исследуемых микроорганизмов.

4. Результаты производственной апробации препарата «ЭСРМ» в качестве стимулятора роста в биотехнологическом цикле вакцины поливалентной

«ВГНКИ» против лептоспироза животных и вакцины чумной живой сухой из штамма ЕВ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Научно-производственные опыты, апробация и производственные испытания проводились на базе лаборатории диагностических препаратов особо опасных и других инфекций ФГУЗ Ставропольского научно-исследовательского противочумного института и в цехах ФГУП «Ставропольская биофабрика», на кафедре биохимии Ставропольского государственного университета, в Ставропольском научно-исследовательском институте животноводства и кормопроизводства и Ставропольском филиале МГОПУ им. М.А. Шолохова.

Объектом разработки и материалом для исследования послужил новый биологически активный препарат из эмбрионально-яичной массы (ЭСРМ), разработанный нами с учетом потребностей микробиологической промышленности, испытывающей трудности, связанные с наращиванием бактериальной массы в процессе приготовления биопрепаратов.

При выполнении работы для тестирования биологических свойств препарата «ЭСРМ» были использованы 7 штаммов тестовых микроорганизмов: Yersinia pestis штамм EV, Listeria monocytogenes штамм АУФ, Leptospira interrogans се-ровар pomona, Leptospira interrogans серовар tarassovi, Leptospira interrogans ce-ровар grippotyphosa, Leptospira interrogans серовар sejroe, Leptospira interrogans серовар icterohaemorrhagiae.

Из культуры листерий, выращенной на бульоне Хоттингера готовили и окрашивали по Граму мазки, в которых изучали морфологию и тинкториальные свойства листерий. Для определения сохранения жизнеспособности культу-ральных свойств листерий во флаконах с наибольшим накоплением проводили пересев культуры на агар в чашки Петри. Визуальный контроль роста характерных колоний осуществляли через 24-48 часов. Культуральные свойства и жизнеспособность L. monocytogenes определяли в зависимости от дозы «ЭСРМ» путем внесения его в агар Хоттингера в количестве 0,5-0,2-0,1-0,050,25-0,0125 мл/л (по три чашки Петри на каждую дозу). После инкубирования в термостате (при 37±1°С в течение 24-48 часов) проводили визуальный контроль роста листерий и подсчет характерных колоний. Изучение подвижности листерий, выращенных с использованием стимулятора роста микроорганизмов, проводили путем укола в столбик среды полужидкого агара производства «HiMedia Laboratories Pvt. Ltd.» (Индия) по общепринятой методике.

Стимулирующее действие препарата «ЭСРМ» на рост и жизнеспособность Leptospira interrogans сероваров pomona, tarassovi, grippotyphosa, sejroe, icterohaemorrhagiae исследовали по накоплению лептоспир в водно-сывороточной

среде с добавлением «ЭСРМ» в дозе 0,2 мл/л в сравнении с контролем. Количество выросших клеток определяли путем микроскопирования «раздавленной капли» культуры в темном поле микроскопа при увеличении 40x7.

Из бактериальной массы лептоспир соответствующих штаммов, выращенной на питательной среде с добавлением «ЭСРМ», была выпущена экспериментальная вакцина поливалентная «ВГНКИ» против лептоспироза животных. Проверка вакцины на стерильность, безвредность, активность проводили в соответствии с технической инструкцией по изготовлению и контролю поливалентной вакцины «ВГНКИ» против лептоспироза животных.

При изучении влияния «ЭСРМ» на биологические свойства чумного микроба стимулятор вносили в агар Хоттингера в дозах 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 2,5; 3,0; 4,0; 5,0 мг/л. Через 48 часов инкубации при 28±1°С учитывали количество и характер выросших колоний и устанавливали оптимальную дозу стимулятора. В качестве контроля использовали агар без добавок.

Изучение морфологии и тинкториальных свойств микроорганизма проводили микроскопически в мазках, окрашенных по Граму. Параллельно определяли жизнеспособность чумного микроба в смывах с чашек с наибольшим количеством колоний с использованием стандарта мутности. Углубленное изучение морфологических особенностей Y. pestis EV проводили с помощью электронного микроскопа JEM-100SX фирмы «JEOL» (Япония) в ультратонких срезах клеток по общепринятым методикам (отмывка и центрифугирование фосфатным буфером, фиксация и отмывка от фиксатора, обезвоживание в спиртах, заключение в агар Дифко, резка на ультрамикротоме LKB-4028 (Швеция)).

Из полученной культуры Y. pestis EV изготовлена микросерия вакцины с последующей расфасовкой и сублимированием. Дальнейший контроль вакцины проводили по основным показателям в соответствии с ФС 42-3877-99 (жизнеспособность, термостабильность, иммуногенность).

Изучали резистентность микроорганизма к процессам сублимационной сушки путем учета морфологических свойств микробов в культуре, выращенной с добавлением «ЭСРМ» до сублимации и после нее методом электронной микроскопии (методом позитивного контрастирования). Сравнение проводили с вакциной, изготовленной без использования «ЭСРМ».

Результаты экспериментов подвергали вариационно-статистической обработке с помощью программы Primer of Biostatistics (Version 4.03). Расчет проводили при помощи IBM-совместимого компьютера Pentium-IV-1800. Фотографирование мазков, окрашенных по Граму, осуществляли при помощи компьютерного комплекса визуализации изображения на базе микроскопа «Микмед-2» и цифровой фотокамеры «01ympus-5060».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Технология приготовления препарата «ЭСРМ» и его характеристика

В качестве исходного субстрата для разработки нового стимулятора роста микроорганизмов нами выбраны куриное яйцо и эмбриональная ткань, издавна используемые в микробиологической промышленности, преимущественно в качестве питательной добавки к средам (Пяткин К.Д., 1971; Тогунова А.И., 1973; Ионина С.В., 2000).

Весь технологический цикл получения препарата разделили на три основных стадии: подготовительную, основную и заключительную.

Подготовительная стадия состоит из 4 этапов и заключается в обработке сырья. На первом этапе приготовления препарата проводили отбор куриных яиц среднего размера, правильной формы, без трещин, насечек, известковых наростов и загрязнения скорлупы.

На втором этапе проводили непосредственную закладку куриных яиц в инкубатор бытовой ИПХ-10 с температурным режимом 37,6-37,8°С. Основной целью этого этапа являлось получение высокоактивного яично-эмбрионального субстрата, используемого для дальнейшей обработки по методу В.П. Филатова в нашей модификации. В отличие от ранее используемых методик (Ржепаковский И.В., 2003), повышение биологической активности яично-эмбриональной массы достигали путем облучения яиц на 5, 6, 7, 8 сутки инкубации. В работе использовали полупроводниковый низкочастотный лазерный аппарат АЛ-01 «Семикон». Параметры облучения использовали согласно наставлению по применению аппарата (30 секунд при частоте 9 Гц и мощности излучения 9 мВт.). Целесообразность выбора данных сроков облучения лазером, по сравнению с облучением на 5, 6, 7 сутки и без облучения, подтверждена экспериментально. При этом биологическая активность массы после облучения на 5, 6, 7, 8 сутки превысила активность гомо-гената яйца на 23,5%, а активность массы, облученной на 5, 6, 7 сутки - на 34,7%. Увеличение активности сопровождалось повышением массы эмбриона, его печени, изменением соотношения массы желтка и белка в пользу желтка (признак интенсивности белкового питания).

На третьем этапе производился отбор полноценных куриных эмбрионов на 9-10 сутки инкубации с помощью овоскопа. Яйца без эмбриона или эмбрионы, погибшие в первые дни инкубации, выбраковывали.

Четвертый этап заключался в помещении куриных яиц с эмбрионом в холодильную камеру при температуре 2-4°С, где происходила медленная гибель эмбрионов. Для определения оптимального срока выдерживания куриных эмбрионов в холодильнике изучали биологическую активность яично-эмбрионального полуфабриката по методу К. Бакирджиева (Калашник И.А.,

1990) каждые сутки (со 2 по 8 сутки). Установлено, что максимальная активность яично-эмбрионального субстрата отмечается на 7 сутки выдерживания в холодильной камере и составляет 60,4% по отношению к контролю. После семидневного выдерживания эмбрионов в холодильнике яйца извлекали и обрабатывали спиртовым раствором йода. Для дополнительной стерилизации эмбрионы подвергали облучению в стерильном боксе источником УФ-излучения в течение 20 минут.

Основная стадия включала в себя четыре этапа. На первом этапе проводили подготовку помещений, посуды и инвентаря. Основным технологическим приемом следующего этапа являлась гомогенизация извлеченных куриных эмбрионов из скорлуповой оболочки в размельчителе тканей до однородной жидкости оранжевого цвета. На третьем этапе приготовления препарата проводили фильтрование полученного яично-эмбрионального субстрата через стерильный ватно-марлевый фильтр.

Для удаления из препарата балластных субстанций предварительно отфильтрованный яично-эмбриональный субстрат подвергали центрифугированию в течение 15 минут со скоростью 6000 об/мин.

Основной задачей заключительной стадия является обеспечение требований технических условий по изготовлению препарата. Включает в себя 4 этапа.

Расфасовка и укупорка «ЭСРМ» проводится в стерильные флаконы по 100200 мл. Целью второго этапа заключительной стадии являлось достижение стерильности полученного субстрата. Поэтому стерилизацию «ЭСРМ» проводили путем тиндализации на водяной бане с температурным режимом 56-58°С в течение часа 5 дней подряд и выдерживанием препарата в промежутках между прогреваниями в термостате при 37±1°С. Жидкий препарат использовали на месте в производственных условиях. При необходимости транспортировки для стабилизации состава и свойств стимулятора роста микроорганизмов с учетом сроков его хранения использовали лиофилизацию, которую проводили без производственной защитной среды.

В связи с вышеизложенным, выпуск экспериментальных серий препарата «ЭСРМ» осуществлен в двух вариантах. Жидкий препарат представляет собой оранжевую жидкость сливкоподобной консистенции. Срок годности жидкой формы «ЭСРМ» составляет один месяц со дня изготовления при условии хранения и транспортировки в сухом темном месте при температуре от 2 до 8°С. Второй вариант - сублимированный «ЭСРМ» представляет собой сухую пористую массу желтоватого цвета, хорошо растворимую в дистиллированной воде. Препарат пригоден для применения в течение 3 лет со дня его изготовления при условии хранения в сухом темном месте и транспортировки при температуре от 2 до 8°С.

Для обеспечения требований ТУ экспериментальные серии 2 вариантов «ЭСРМ» были подвергнуты испытаниям на стерильность, безвредность и активность.

Некоторые показатели химического состава препарата «ЭСРМ» В процессе эксперимента использовали свежеприготовленный препарат серии 6 и препарат серии 5 (срок хранения 1 месяц). Контролем служил гомогенат свежего яйца (рисунок 1).

Рисунок 1. Некоторые показатели химического состава препарата «ЭСРМ». А - аминокислоты. %. 1 - лизин; 2 - метионин; 3 - аргинин; 4 - гистидин; 5 - лейцин: 6 -нзолейцин; 7 - фенилаланин, 8 - тирозин, 9 - вапин; 10 - треонин; 11 - глицин. 12 - аспара-г и новая кислота, 13 - глутаминовая кислота; 14 - аланин; 15 - серии Б - макро- и микроэлементы, г/л" 1 - натрий: 2 - фосфор; 3 - калыпга. 4 - железо; 5 - марганец: 6 - медь В -липилные фракции, %: 1 - фосфолипиды; 2 - полярные липиды; 3 - гликолипиды: 4 - жирные кислоты; 5 - триглнцериды: 6 - эфиры стериновые; 7 - моно- и диглицериды Г - витамины. мг/л■ 1 - тиамин; 2 - рибофлавин, 3 - пантотеновая кислота; 4 - биотин, 5 - пиридок-снн; 6 - цианокобаламин; 7 - аскорбиновая кислота.

Установлено, что «ЭСРМ» имеет в своем составе широкий набор активных субстанций, необходимых для полноценного развития различных видов и штаммов микроорганизмов: белки - 41,7%, липиды — 7%, глюкозу - 5,6%, в том числе 15 аминокислот, 7 витаминов, богатый набор липидных веществ, различ-1 ные макро- и микроэлементы.

Вышеизложенное свидетельствует о поликомпонентности и полноценности препарата по химическому составу за счет сохранения и повышения концентрации биологических компонентов исходного субстрата и накопления свободных биологически активных метаболитов, большинство из которых относят к числу биогенных стимуляторов. Эти свойства обеспечивают ростостимулирующий эф-

фект и универсальность «ЭСРМ» в минимальных дозах по отношению к различным микроорганизмам, культивируемых на разнообразных питательных средах.

ИЗУЧЕНИЕ СТИМУЛИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ПРЕПАРАТА «ЭСРМ» НА РОСТ НЕКОТОРЫХ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ

Влияние препарата «ЭСРМ» на биологические свойства Listeria monocytogenes

Изучение влияния «ЭСРМ» на накопление бактериальной массы листерий с одновременным определением оптимальной дозы изучали в трех сериях взаимообусловленных опытов. Последовательное снижение дозы «ЭСРМ» для каждого этапа (от 5 до 0,5%; от 0,5 до 0,1 %; от 0,1 до 0,01%) вызвано тем, что максимальный рост микроорганизмов в каждом предыдущем опыте отмечался при минимальных дозировках препарата. С этой целью во флаконы с бульоном Хотгингера засевали культуру Listeria monocytogenes штамма АУФ, предварительно выращенной при 37±1°С в течение 18-20 часов. Посевная доза листерий составляла 10% от объёма питательной среды. В эксперименте использовали свежеприготовленный «ЭСРМ» в жидком виде.

После извлечения флаконов из термостата для определения веса выращенной бактериальной массы их содержимое центрифугировали для осаждения бактериальных клеток при 3000 об/мин. в течение 30 мин. Результаты определяли по конечному накоплению бактерий. Для этого осаждённую биомассу взвешивали на электронных весах, с последующим вычислением показателя прироста бактериальной массы. Показатель прироста бактериальной массы вычислялся по формуле (Олиферова Э.В., 1998):

Х= m - тп0 /100,

где X - показатель прироста, мг/мл; то - масса пустых пробирок, мг; m - масса пробирок с осадком, мг; 100 - общий объем среды в пробирках, мл.

Результаты исследований свидетельствуют о том, что на первом этапе максимальный, по сравнению с контролем, ростостимулирующий эффект (27,3 мг/мл) отмечен при минимальной дозировке «ЭСРМ» (5 мл/л). При концентрации препарата свыше 40-50 мл/л проявилось ингибирующее действие. На втором и третьем этапе сохранялся показатель прироста бактериальной массы с некоторой тенденцией к увеличению при минимальных дозировках «ЭСРМ» (0,1-0,2 мл/л), которые взяты нами в дальнейшей работе в качестве оптимальных.

Изменений тинкториальных, морфологических, культуральных свойств листерий, выращенных на бульоне Хотгингера с добавлением «ЭСРМ» при максимальном накоплении бакмассы (0,1-0,2 мл/л), не отмечено.

При изучении стимулирующего влияния «ЭСРМ» на плотных питательных средах использовали агар Хотгингера путем пятикратного пересева тестовой культуры. Определяли культуральные свойства и жизнеспособность бактериальных клеток. Нативный «ЭСРМ» добавляли к агару в следующих концентрациях: 0,5-0,2-0,1-0,05-0,25-0,0125 мл/л. Биологические показатели среды изучали при посеве 100 м.к. на чашки Петри. В качестве контроля использовали агар без добавок. Полученные данные отражены в таблице 1.

Таблица I

Результаты культивирования Listeria monocytogenes на плотной питательной среде с добавлением«ЭСРМ» в сравнении с контролем

Питательная среда Концентрация «ЭСРМ», мл/л Количество колоний, выросших при посеве 100 м.к (Mira)«

0,5 83,7±1,4

0.2 84,5±1,2

Агар Хотпшгера + «ЭСРМ» 0,1 91,2±2.3

0,05 96.9±4,2

0,025 88,3±6,9

0,0125 84,7±1.3

Средний показатель - 88,2±17,1

Агар Хоттннгера (контроль) - 70,7± 1.08

Примечание: * - статистически достоверные результаты (от Р< 0,001 до Р< 0,1)

Полученные результаты свидетельствуют о выраженном стимулирующем влиянии «ЭСРМ» на рост Listeria monocytogenes на плотных питательных средах в концентрации 0,05-0,025 мл/л. Кроме того, в течение 5 пересевов листерий не наблюдалось изменений их культуральных свойств.

Исследование сохранения подвижности листерий, выращенных на агаре Хот-тингера с добавлением «ЭСРМ», провели, используя в качестве полужидкого агара среду производства «HiMedia Laboratories Pvt. Ltd». Изучению была подвергнута 5 генерация Listeria monocytogenes штамма АУФ, выросшая в чашках Петри с наибольшим накоплением колоний. Посев культуры проводили путем укола бактериальной иглой в столбик полужидкого агара. Учет полученных результатов проведен через 24-48 часов. Характер роста сопоставляли с пробирками, содержащими среду без внесения бактериальной культуры.

Результаты, полученные в ходе проведенных опытов, позволяют прийти к заключению, что ингибируюшее действие препарата наблюдается при концентрации его в питательной среде 4-5% и выше. Диапазон стимулирующих доз располагается в широких пределах от 0,01 до 3%. Оптимальные концентрации «ЭСРМ» составляют для жидких питательных сред 0,1-0,2 мл/л, для плотных -0,05-0,025 мл/л и при этом не наблюдается изменений основных свойств микроорганизма.

Изучение влияния «ЭСРМ» на биологические свойства Leptospira interrogans

Вакцина поливалентная «ВГНКИ» против лептоспироза животных применяется для активной иммунизации сельскохозяйственных животных, собак и пушных зверей клеточного содержания против лептоспироза. Вакцину изготавливают в двух вариантах: первый вариант - из штаммов лептоспир серогрупп Помона, Тарассови и Иктерогемморагия; второй вариант - из штаммов лептоспир серогрупп Помона, Тарассови, Гриппотифоза и Сейро.

На изготовленной питательной среде с добавлением препарата «ЭСРМ» культивировали все производственные штаммы лептоспир. входящие в состав вакцины. Для контроля лептоспиры культивировали в водно-сывороточной питательной среде без добавления препарата «ЭСРМ».

Результаты исследований показали, что водно-сывороточная среда с добавлением препарата «ЭСРМ» обеспечивала рост всех производственных штаммов лептоспир. Результаты отражены в таблице 2.

Таблица 2

Изучение ростовых способностей питательной среды с добавлением препарата «ЭСРМ»

Накопление лептоспир в поле зрения микроскопа

Среда Pomona Tarassovi Grippoty-pliosa" Icterohae-morrhajjiae Sejroe (hardio) M±m

Водно-сывороточная 64.9±0,8* 68.7±2,6* 65.9±1.2* 72,1±2.4* 73,5±1.I* 69,02 ±3,89

Водно- 81.4 ±1.7

сывороточная + «ЭСРМ» 76.3±0,8* 82.9±1,7* 74.4±2.7* 77,5±2,4* 95.9±1,2*

Примечание. * - статистически достоверные результаты (Р<0,01).

Полученные статистически достоверные данные свидетельствуют о стимулирующем действии «ЭСРМ» на рост лептоспир в дозе 0,2 мл/л. В результате применения препарата в опытных группах прирост бактериальной массы лептоспир составил 10,6% по сравнению с контрольным культивированием (5,4%).

Установлено, что при пересевах производственных штаммов лептоспир на питательной среде с препаратом «ЭСРМ» через каждые 5-10 дней изменений морфологии, антигенной структуры и накопления лептоспир в течение 3 пассажей не происходило. Выращенные культуры лептоспир использовали для составления серий вакцины.

Исследование изготовленных серий вакцины на безвредность проводили согласно технической инструкции. Все лабораторные животные (30 мышей и 18 морских свинок) остались клинически здоровыми в течение 10 дней наблюдения.

Антигенную активность серий вакцины против лептоспироза проверяли в соответствии с технической инструкцией по изготовлению и контролю поливалентной

вакцины «ВГНКИ» против лептоспироза животных на 30 кроликах. Сыворотку крови исследовали в РМА. Полученные данные представлены в таблице 3.

Таблица 3

Результаты РМА в сыворотке крови кроликов, иммунизированных вакциной поливалентной «ВГНКИ» против лептоспироза животных, изготовленной на питательной среде с добавлением стимулятора роста «ЭСРМ»

Серия вакцины Штаммы Титр антител в РМА с лептоспирами

1 2 3 4 5

Серия 3, вариант ] Pomona 1 1440 ±466,5 11600 ±438,2 11360 ±499,6 11600 ±438,2 11600 ±438,2

Icterohaemorrha giae 1 1440 ±466,5 1 1440 ±466,5 1 2080 ±480 1.1440 ±466,5 1.1600 ±438.2

Tarassovi 1-800 ±219,1 1 1040 ±240 11000 ±268,3 1 760±240 11000 ±268,3

Серия 4, вариант 2 Gnppotyphosa 1.880±196 1.880±196 1 1200 ±253 1:720 ±233,2 1.960 ±271,3

Pomona 1 1440 ±466,5 1:1280 ±196 1:1440 ±466,5 1:960 ±160 11760 ±391,9

Tarassovi 1.1040 ±240 1 1120 ±196 1 1040 ±240 1 1280 ±196 1.880 ±196

Sejroe (hardjo) 1.520±120 1.560±147 1:340 ±124,9 1:400 ±109,5 1:440 ±97,98

Установлено, что выпущенная микросерия опытной вакцины поливалентной «ВГНКИ» против лептоспироза животных, изготовленная на основе биомассы бактерий, выращенной на питательной среде со стимулятором роста «ЭСРМ», по своим показателям не уступает контрольным сериям вакцин двух вариантов, то есть соответствует требованиям технических условий.

Влияние препарата «ЭСРМ» на биологические свойства Yersinia pestis EV Биологические свойства Yersinia pestis EV изучали путем посева культуры на чашки Петри с агаром Хоттингера, содержащим «ЭСРМ», в сопоставлении с агаром без него (контроль). Препарат «ЭСРМ» вносили в различных концентрациях для определения оптимальной дозы препарата (0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 2,5; 3,0; 4,0; 5,0 мг/л) по отношению к чумному микробу, по три чашки на каждую дозу, в пятикратном повторе. Ориентиром для испытуемых доз служили дозы, установленные при выращивании листерий на этой же питательной среде. Учет роста колоний проводили через 22, 24, 32, 48 и 96 часов после инкубации при 28±1°С. Первые проявления характерного роста бактерий отмечены уже через 24±2 часа на чашках с «ЭСРМ», в то время как на контрольных чашках колонии за этот период времени не приобретали достаточно характерной морфологии и были гораздо меньше по своим размерам.

Оценку стимулирующего влияния «ЭСРМ» на культуру чумного микроба проводили путем подсчета колоний, выросших на чашках через 48 часов. Полученные результаты отражены в таблице 4. Стимулирующий диапазон «ЭСРМ» для чумного микроба, культивируемого на плотных питательных средах, находится в пределах от 0,5 до 5 мг/л. Наибольший прирост бактериальных клеток наблюдался в чашках с концентрацией «ЭСРМ» 3 мг/л, что в 2,9 раза больше по сравнению с контролем. Проведенные исследования показывают, что дозировки препарата ниже 1 мг/л не оказывают существенного влияния на прирост бактериальной массы. Установлено, что жизнеспособность клеток в среднем по всем чашкам при использовании «ЭСРМ» составила на 9±! ,2% больше, чем при выращивании без него.

Изучение морфологии и тинкториальных свойств микроорганизма проводили микроскопически в мазках, окрашенных по Граму. Микроскопия мазков показала, что форма, размеры, наличие биполярности, грамнегативность свидетельствуют о специфике, подтверждающей принадлежность визуализируемых микроорганизмов к Yersinia pestis EV, а также полную и абсолютную идентичность морфологической картины в мазках из культуры, выращенной с добавлением «ЭСРМ» и без него.

Углубленное изучение морфологии чумного микроба, выращенного с использованием «ЭСРМ», проведено на ультраструктурном уровне (путем изучения ультратонких срезов). При этом ультраструктурных особенностей при сравнении 48 часовой культуры клеток, выращенных с добавлением «ЭСРМ» и без него, не установлено. Не отмечено также появления несвойственных форм и размеров бактерий и признаков, свидетельствующих о нарушении метаболизма в процесс культивирования.

Таблица 4

Влияние различных концентраций «ЭСРМ» на ростовые качества агара Хоттингера при выращивании вакцинного штамма Yersinia pestis EV

Питательная среда Концентрация «ЭСРМ», мг/л Количество колоний, выросших при посеве 100 м к (М±т)*

5 68,2±0,4

4 72±2,1

3 89,3±3,2

Агар Хоттингера + «ЭСРМ» 2.5 78,1±1,3

2 64,4±0,3

1 53±2,1

0,5 41,8±0,6

0,25 40,3±1.2

Агар Хоттингера (контроль) - 40±0,4

Примечание * - статистически достоверные результаты (Р<0,01)

Из полученной культуры У. ревйв ЕУ, выращенной с использованием «ЭСРМ» и без него, после определения в ней количества микробных клеток с помощью ОСО мутности 42-28-59-85-П ГИСК им. Л.А. Тарасевича, изготовили и провели контроль на жизнеспособность, термостабильность, иммуногенность микросерий вакцины согласно требованиям ФС-42-3877-99.

Изучение резистентности микроорганизма к процессам сублимационной сушки проводили путем учета морфологических свойств микробов в культуре, выращенной с добавлением «ЭСРМ», до сублимации и после нее электронной микроскопией методом позитивного контрастирования с последующим подсчетом поврежденных клеток в вакцинной суспензии до высушивания и после него. Результаты сравнивали с вакциной, приготовленной без добавления «ЭСРМ». Установлено, что процент поврежденных клеток до высушивания составляет в культуральной суспензии без «ЭСРМ» 3,1±1,4 (Р<0,1). в то время, как при добавлении препарата он равен в среднем 1,2±0, 6 (Р<0,1). После высушивания процент поврежденных клеток увеличился в обеих исследуемых группах вакцины. При этом в пробах с «ЭСРМ» он составил 4,7±1,3 (Р<0,5), а в пробах вакцины без него - 5,9±0,8 (Р<0,1). Эти результаты свидетельствуют о положительном влиянии препарата «ЭСРМ» на резистентность чумного микроба к температурным воздействиям на любом этапе технологического цикла.

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый биологически активный препарат для стимуляции роста микроорганизмов, технологическая схема которого заключается в направленном отборе исходного сырья (инкубационное куриное яйцо), управляемом с помощью лазерного излучения в процессе инкубации, устранении балластных и повышении концентрации биологически активных веществ, обеспечении стопроцентной стерильности, стабилизации состава препарата и увеличении сроков его хранения путем сублимации.

2. Экспериментально подтверждена: целесообразность применения методики облучения куриного эмбриона лазером на 5, 6, 7 и 8 день инкубации, что обеспечило увеличение массы эмбрионов на 42,5% (Р<0,01), массы печени на 47,4% (Р<0,001); необходимость выдерживания эмбрионов в холодильной камере при температуре 2-4°С не менее 7 суток, что подтверждено максимальными показателями биологической активности препарата (30,1%) по сравнению со 2, 3,4, 5, 6 и 8 сутками.

3. Наиболее доступным, эффективным и недорогим методом обеспложивания препарата, обеспечивающим 100% стерильность при сохранении внешнего вида, основного химического состава, присущего исходному субстрату и активности, является тиндализация.

4. Ростостимулирующая активность препарата «ЭСРМ» обеспечивается за счет широкого набора биологически активных веществ яйца и эмбриона, сохраняющихся в процессе обработки (белки - 41,7%, липиды - 7%, глюкоза -5,6%, 7 витаминов, 15 аминокислот, макро- и микроэлементы), а также полученных и активированных в процессе деградации ткани свободных биогенных стимуляторов. Биологическая активность препарата «ЭСРМ» превышает активность гомогената яйца на 60,4%.

5. Все вещества, входящие в состав препарата, не противоречат питательным потребностям изучаемых микроорганизмов. Однако в дозах, предлагаемых для использования, они не являются питательными компонентами среды, а представляют собой биологически активный субстрат, способный, положительно воздействовать на процессы метаболизма, размножения, жизнеспособность, морфологические, ультраструктурные, культуральные свойства бактерий на Listeria monocytogenes, Leptospira interrogans, Yersinia pestis, что позволяет отнести его к стимуляторам роста микробов.

6. Ростостимулирующий эффект препарата «ЭСРМ» проявляется при выращивании микроорганизмов на различных жидких и плотных питательных средах. На жидких оптимальная стимулирующая доза «ЭСРМ», независимо от вида микроба, составляет 0,1-0,2 мл/л, ингибирующая доза - 4-5% от общего объема питательной среды. На плотных средах выращивания - оптимальная стимулирующая доза «ЭСРМ» на порядок меньше и составляет в среднем от 3 до 10 мг/л.

7. На примере чумного микроба (штамма EV) подтверждено положительное влияние «ЭСРМ» на его резистентность к температурным факторам на разных этапах технологического цикла. Число поврежденных микробных клеток после сублимации в 1,25 раза меньше в вакцине, приготовленной на среде со стимулятором.

8. На примере вакцины против лептоспироза и чумы доказано, что при добавлении «ЭСРМ» в производственные питательные среды (агар Хоттингера и водно-сывороточную среду), он не оказывает отрицательного действия на безвредность и иммунологическую активность биопрепаратов, а также позволяет получить максимальный прирост бакмассы при минимальных его дозировках и без изменения основной рецептуры традиционных питательных сред.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Технологическая схема приготовления препарата «ЭСРМ» и технические условия (ТУ9291-002-75056550 -2005) могут быть использованы для изготовления препарата в условиях предприятий биотехнологической промышленности.

2. Полученные сведения о препарате использованы в научно-практических разработках и информационно—методическом материале, который может быть применен в практической деятельности микробиологами и биотехнологами:

- составлены рекомендации по применению, представленные вместе с образцами препарата на 5 Всероссийских выставках, итогом которых являются 5 дипломов и 5 серебряных медалей.

- итоги разработки положены в основу информации, по результатам экспертизы которой получена государственная финансовая поддержка научно-исследовательской деятельности в малом бизнесе (Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере, г. Москва).

3. Препарат может быть использован для наращивания бакмассы на биопредприятиях в промышленном производстве вакцин и сывороток.

4. Материалы диссертационной работы могут использоваться в научных целях, при составлении учебных и справочных пособий, чтении лекций, ведении практических занятий по биотехнологии и микробиологии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Тимченко, Л.Д.. Использование препарата «СТЭМБ-М1» для стимуляции роста Listeria monocytogenes / Л.Д. Тимченко, И.В. Ржепаковский, И.В. Булгакова, Н.В. Косик // Приоритеты культуры и экологии в образовании: Матер, межрегион, научно-практ. конф. / Ставроп. филиал МГОГТУ им. Шолохова. -Ставрополь, 2003. - Вып. 10-11. - С. 48-49.

2. Тимченко, Л.Д. Результаты испытания препарата «СТЭМБ-М1» в качестве стимулятора роста Listeria monocytogenes / И.В. Ржепаковский, Н.В. Косик // Матер. IV межрегиональной научн. конф. «Студенческая наука - экономике России». - Ставрополь: Изд-во СКГТУ, 2003. - С. 98.

3. Косик, Н.В. Пути и направления разработки нового стимулятора роста микроорганизмов / Н.В. Косик // Образование, здоровье и культура в начале XXI века: Матер, межрегион, научно-практ. конф. / Ставроп. филиал МГОПУ им. Шолохова. - Ставрополь, 2004. - Вып. 10-11. - С. 53-56.

4. Тимченко, Л.Д. Новый стимулятор роста микроорганизмов / Л.Д. Тимченко, И.В. Ржепаковский, Н.В. Косик / Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе: Матер. 50-й научн. конф. «Университетская наука - региону». - Ставрополь: Изд-во СГУ, 2004. - С. 34-35.

5. Тимченко, Л.Д. Совершенствование технологии приготовления иммуно-модулятора «СТЭМБ» / Л.Д. Тимченко, И.В Ржепаковский, Н.В. Косик // Биотехнология, экология, охрана окружающей среды: Научн. чтения, посвящ. 200-летию Московского общества испытателей природы (МГУ, 2005 г.). - М.: Изд-во ООО «Графикон-принт», 2005. - С. 113-114.

6. Тимченко, Л.Д. Испытание препарата «ЭСРМ» в качестве стимулятора роста микроорганизмов / Л.Д. Тимченко, И.С. Тюменцева, И.В. Ржепаковский, Н.В. Косик // Биотехнология, экология, охрана окружающей среды: Научн. чтения, посвящ. 200-летию Московского общества испытателей природы (МГУ, 2005 г.). - М.: Изд-во ООО «Графикон-принт», 2005. - С. 115-117.

7. Косик, Н.В. Отработка методов стерилизации эмбрионального стимулятора роста микроорганизмов (ЭСРМ) / Н.В. Косик // Проблемы развития биологии

и экологии на Северном Кавказе: Матер. 50-й научн. конф. «Университетская наука - региону». - Ставрополь: Изд-во СГУ, 2005. - С.160-161.

8. Косик, Н.В. Методы обеспечения стерильности эмбрионального стимулятора роста микроорганизмов (ЭСРМ) / Н.В. Косик, И.В. Ржепаковский // Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и образования: Сб. научн. тр. II Международной научно-практ. конф. - Самара, 2005. - С.39-41.

9. Косик, Н.В. Принципиальный подход к разработке нового стимулятора роста микроорганизмов (ЭСРМ) / Н.В. Косик // Первая ежегодная научн. конф. студентов и аспирантов базовых кафедр ЮНЦ РАН (Ростов-на-Дону, 15-21 апреля 2005 г.). - Ростов-на-Дону: Изд-во ЮНЦ РАН, 2005. - С. 316-318.

10. Косик, Н.В. Изучение морфологических свойств лептоспир под влиянием стимулятора роста микроорганизмов «ЭСРМ» / Н.В. Косик // Актуальные проблемы современной биологии: Тез. Российской студенческой конф. (20 апреля 2005 г.). - Астрахань: Издательский дом «Астраханский университет», 2005.-С. 176-177.

Печать офсетная. Бумага офсетная. Формат 60x84/16 Физ. печ. л. - 1,3 Усл. печ. л. - 1,2

Заказ 555 Тираж - 100 Отпечатано в цехе оперативной полиграфии краевого комитета государственной статистики г. Ставрополь, ул. Пушкина,4

2578

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Панова, Наталья Викторовна

Список сокращений.

Введение.

Глава!. Обзор литературы.

1.1. Основные задачи и принципы промышленного культиви- ^ ^ рования микроорганизмов.

1.1.1. Методы культивирования микроорганизмов.

1.1.2. Производственные питательные среды и требования, ^ ^ предъявляемые к ним.

1.2. Питательные потребности микроорганизмов.

1.3. Культивирование и микробиологический контроль от- ^ дельных вакцинных штаммов микроорганизмов.

1.3.1. Питательные потребности чумного микроба.

1.3.2. Питательные потребности лептоспир и листерий.

1.4. Оптимизация питательных сред.

Глава II. Материалы и методы исследований.

2.1. Лабораторное и производственное оборудование, пита- ^q тельные среды, растворы, реактивы.

2.2. Лабораторные животные, используемые в опытах.

2.3. Исследование препарата «ЭСРМ» на безвредность.

2.4. Исследование биологической активности препарата ^ «ЭСРМ».

2.5. Контроль стерильности препарата «ЭСРМ».

2.6. Исследование химического состава препарата «ЭСРМ».

2.7. Характеристика штаммов микроорганизмов, использованных в работе, и изучение биологических свойств препара- 54 та «ЭСРМ».

2.8. Метод электронной микроскопии.

2.9. Статистическая обработка результатов исследований.

Глава III. Технология приготовления препарата «ЭСРМ» и его ха- ^ рактеристика.

3.1. Технология приготовления препарата «ЭСРМ».

3.2. Результаты отработки оптимального метода стерилизации -«ЭСРМ».

3.3. Некоторые показатели химического состава «ЭСРМ».

Глава IV. Изучение стимулирующего действия препарата «ЭСРМ» ^ на рост некоторых вакцинных штаммов микроорганизмов.

4.1. Влияние препарата «ЭСРМ» на биологические свойства gg Listeria monocytogenes.

4.2. Влияние препарата «ЭСРМ» на биологические свойства ^ Leptospira interrogans.

4.3. Влияние препарата «ЭСРМ» на биологические свойства ^ ^ Yersinia pestis.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка нового стимулятора роста микроорганизмов и изучение его влияния на их биологические свойства на примере некоторых вакцинных штаммов бактерий"

Актуальность. Одним из главных принципов промышленной биотехнологии, использующей в качестве биологических объектов микроорганизмы, является их культивирование на любом из производственных этапов, от поддержания штаммов до получения биомассы микроорганизмов в количестве, достаточном для обеспечения эффективности производства.

Большинством специалистов для подавляющей массы производственных микроорганизмов лучшими признаны питательные среды из естественного сырья: препараты крови, казеин, мясные гидролизаты, экстракты растительного и животного происхождения (Коротеева Л.А., Шишов В.П., Маслак А.А., 2001; Меджидов М.М., 2003; Faine S., 1982). Однако практика показывает, что многие предприятия биологической промышленности, традиционно использующие среды из такого сырья, часто испытывают серьезные затруднения, связанные со снижением объема наращиваемой бактериальной массы, необходимой для производства препаратов.

Не исключено, что проблема снижения стандартности питательных сред, важность которой подчеркивается многими исследователями (Зелют-ков Ю.Г., Зайцев В.И., 1997; Геладзе В.Ш. и др., 1998; Овсова Л.М. и со-авт., 2003), обусловлена, прежде всего, снижением качества продуктов природного происхождения в связи со сложной экологической обстановкой и антропогенным воздействием на окружающую среду. В частности, в мясных продуктах могут содержаться антибиотики, химикаты, нитраты, токсические продукты, что отрицательно отражается на культивировании промышленных штаммов (Рябов В., Генкель В., Волкова Н., 1996; Wa-guespack М., 1986; Corrigan P.J., Seneviratna P., 1989).

Для повышения качества сред в их состав добавляют различные биологически активные вещества, нивелирующие отрицательные воздействия и стимулирующие биологические свойства микроорганизмов. В некоторые среды добавляют такие питательные добавки, как казеиново-дрожжевой экстракт, экстракт кормовых дрожжей, сыворотку крови животных, углеводы, пептон, желатин и другие компоненты, выступающие в роли дополнительных источников ростовых веществ (Бузолева JI.C., 2001; Гариб Ф.Ю., 2002; Саяпина JI.B., 2002; Brubaker R.R., Surgalla M.S., 1964). В отличие от питательных добавок микроэлементы, витамины, аминокислоты добавляют к питательным средам в минимальных количествах. Подобные биологически активные вещества в таких количествах не являются питательными компонентами, а выполняют роль активаторов роста или катализаторов (Никитина В.А., Бобрышев В.И., Кафизова Ф.И., 1979; Macfarlane k D.E., Elian-Jones Т.Е., 1980), участвующих в сложнейших биохимических реакциях.

Однако все питательные добавки и стимуляторы роста обладают селективным действием по отношению к большинству микроорганизмов, а при избыточном добавлении некоторых из них отмечается даже эффект ингибирования ростовых свойств микробов (Брильков А.В., Печуркин Н.С., 1990; Глазунов А.В., Аргунов С.В., Капульцевич Ю.Г., 1993; Gadgii M.D., 1967). Хороший стимулирующий эффект с возможностью использования для широкого перечня микробов при их культивировании может обеспечиваться при использовании питательных смесей, сочетающих различные ростостимулирующие компоненты (Мейнелл Дж., Мейнелл Э., 1967).

Цель и основные задачи исследования. Целью работы явилась разработка на основе эмбриональных и внезародышевых тканей куриного яйца нового стимулятора роста микроорганизмов (ЭСРМ), изучение его влияния на их биологические свойства и ростостимулирующего эффекта на некоторые вакцинные штаммы.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи.

1. Изыскать оптимальные и рациональные биотехнологические приемы, способствующие накоплению и сохранению в препарате «ЭСРМ» оптимального набора и соотношения биологически активных веществ, обеспечивающих ростостимулирующую активность микроорганизмов.

3. Исследовать стимулирующее действие препарата на жизнеспособность Listeria monocytogenes, Leptospira interrogans, Yersinia pestis.

5. Изучить влияние «ЭСРМ» на морфологические, тинкториаль-ные и культуральные свойства тестовых микроорганизмов, выращенных на питательных средах с использованием «ЭСРМ».

6. Изучить химический состав препарата «ЭСРМ».

Научная новизна. Разработан и экспериментально апробирован но-, вый тканевой биологически активный препарат, обладающий стимулирующими свойствами на рост микроорганизмов, изготовленный по оригинальной технологии из инкубированного куриного яйца.

Проведены исследования экспериментальных серий вакцин против лептоспироза и чумы, изготовленных из бактериальной массы, выращенной на питательной среде с использованием стимулятора роста микроорганизмов «ЭСРМ» в соответствие нормативной документацией. Установлено, что изготовленные экспериментальные серии вакцин отвечают всем требованиям НД по изготовлению вакцин против лептоспироза и чумы.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на межрегиональной научно-практической конференции «Приоритеты культуры и экологии в образовании» (апрель 2003 г., филиал МГОПУ им. М.А. Шолохова, г. Ставрополь); межрегиональной научной конференции «Студенческая наука - экономике России» (апрель 2003 г., Сев.-Кав. ГТУ, г. Ставрополь); межрегиональной научной конференции «Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе» (апрель 2004 г., Ставропольский ГУ); межрегиональной научно-практической конференции «Образование, здоровье и культура в начале XXI века» (апрель 2004 г., филиал МГОПУ им. М.А. Шолохова, г. Ставрополь); межрегиональной научной конференции «Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе» (апрель 2005 г., Ставропольский ГУ); Всероссийской студенческой конференции «Актуальные проблемы 1 современной биологии» (апрель 2005 г., г. Астрахань); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и образования» (март 2005 г., Самарская ГСХА); научных чтениях, посвященных 200-летию Московского общества испытателей природы «Биотехнология, экология, охрана окружающей среды (Московский ГУ им. М.В. Ломоносова, 2005); I ежегодной научной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН (апрель 2005 г., г. Ростов-на-Дону.).

Препарат был представлен на Всероссийской выставке-ярмарке научно-исследовательских работ и инновационной деятельности студентов, аспирантов и молодых ученых высших учебных заведений РФ «ИННОВ-2003», «ИННОВ-2005» (2003, 2005 гг. ЮРГТУ, г. Новочеркасск), IV-V Московском международном салоне инноваций и инвестиций (г. Москва,

2004, 2005 гг.) и награжден 5 дипломами и 5 серебряными медалями.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 10 печатных работ.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Панова, Наталья Викторовна

129 ВЫВОДЫ

1. Комплекс технологических приемов, позволивший разработать новый биологически активный препарат для стимуляции роста микроорганизмов, заключается в направленном отборе исходного сырья (инкубационное куриное яйцо), управляемом с помощью лазерного излучения в процессе инкубации, устранении балластных и повышении концентрации биологически активных веществ, обеспечении стопроцентной стерильности, стабилизации состава препарата и увеличении сроков его хранения путем сублимации.

2. Экспериментально подтверждена:

- целесообразность применения методики облучения куриного эмбриона лазером на 5, 6, 7 и 8 день инкубации, что обеспечило увеличение массы эмбрионов на 42,5% (Р<0,01), массы печени на 47,4% (Р<0,001);

- необходимость выдерживания эмбрионов в холодильной камере при температуре 2-4°С не менее 7 суток, что подтверждено максимальными показателями биологической активности (60,4%) по сравнению со 2, 3, 4, 5, 7 и 8 сутками.

4. Ростостимулирующая активность препарата ЭСРМ обеспечивается за счет широкого набора биологически активных веществ яйца и эмбриона, сохраняющихся в процессе обработки (белки - 41,7%, липиды -7%, глюкоза - 5,6%, 7 витаминов, 15 аминокислот, макро- и микроэлементы), а также полученных и активированных в процессе деградации ткани свободных биогенных стимуляторов. Биологическая активность препарата «ЭСРМ», превышает активность гомогената яйца на 60,4%.

5. Все вещества, входящие в состав препарата, не противоречат питательным потребностям изучаемых микроорганизмов. Однако, в дозах, предлагаемых для использования, они не являются питательными компонентами среды, а представляют собой биологически активный субстрат, способный положительно воздействовать на процессы метаболизма, размножения, жизнеспособность, морфологические, ультраструктурные, куль-туральные свойства бактерий Listeria monocytogenes, Leptospira interrogans, Yersinia pestis, что позволяет отнести его к стимуляторам роста микроорганизмов.

6. Ростостимулирующий эффект препарата «ЭСРМ» проявляется при выращивании микроорганизмов на различных жидких и плотных питательных средах. На жидких оптимальная стимулирующая доза «ЭСРМ», независимо от вида микроба, составляет 0,1-0,2 мл/л, ингибирующая доза -4-5% от общего объема питательной среды. На плотных средах выращивания - доза «ЭСРМ» - на порядок меньше и составляет в среднем от 3 до 10 j мг/л.

7. На примере чумого микроба (штамма EV) подтверждено положительное влияние «ЭСРМ» на его резистентность к температурным факторам на разных этапах технологического цикла. Число поврежденных микробных клеток после сублимации в 1,25 раза меньше в вакцине, приготовленной на среде с «ЭСРМ».

8. На примере вакцины против лептоспироза и чумы доказано, что при добавлении «ЭСРМ» в производственные питательные среды (агар Хоттингера и водно-сывороточную среду), он не оказывает отрицательного действия на жизнеспособность, термостабильность, безвредность и иммунологическую активность биопрепаратов, а также позволяет получить максимальный прирост бакмассы при минимальных его дозировках и без изменения основной рецептуры традиционных питательных сред.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Технологическая схема приготовления препарата «ЭСРМ» (стимулятор роста микроорганизмов) и технические условия (ТУ9291-002-75056550-2005) могут быть использованы для изготовления препарата в условиях предприятий биотехнологической промышленности.

2. Полученные сведения о препарате использованы в научно-практических разработках и информационно-методическом материале, который может быть применен в практической деятельности микробиологами и биотехнологами:

- составлены рекомендации по применению, представленные вместе с образцами препарата на пяти Всероссийских выставках, итогом которых являются 5 дипломов и 5 серебряных медалей;

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На протяжении всего периода своего существования биотехнологическая промышленность, связанная с выращиванием разнообразных микроорганизмов, направленно реализует пути решения главной задачи — повышения объема выращиваемой бактериальной массы (Козлов Ю.А., 1950; Мейнелл Дж., Мейнелл Э., 1967; Методы общей бактериологии. М., 1984; Бирюков В.В., Кантере В.М., 1985; Тутов И.К., Ситьков В.И., 1997; Бошьян Е.Г., Романова И.В., Воробьев А.В. и др., 1998; Малахов Ю.А., Панин А.Н., Соболева Г.Л., 2000; Ахапкина А.Г., Блинкова Л.П., 2001; Прозоркина Н.В., Рубашкина Л.А., 2002; Ellinghausen Н., McCullought W., 1965; Faine S., 1982). Осуществление этого можно добиться лишь сохранением или контролированием изменений основных биологических свойств промышленных штаммов микроорганизмов (Тутов И.К., Ситьков В.И., 1997). Выращивание микроорганизмов - важнейший этап технологического процесса, начиная с расплодки штаммов до выращивания в больших производственных емкостях. Во всех случаях ведущую роль при этом играет качество питательных сред, перечень которых сегодня велик. Например, арсенал сред, разработанных только для лептоспир, включает более 15 наименований (сывороточные среды: среда Уленгута, ВГНКИ, Ферворта-Вольфа, Кортгофа, Флетчера и др.; полусинтетические и синтетические: среда Шенберга, Элингаузена, твин-альбуминовая среда, твин-альбумин-сывороточная среда Эллиса, альбуминовая среда ГНКИ). Причем качество питательных сред оставляет желать лучшего, поскольку в большинство из них входят растительные и животные компоненты. Экологическое и антропогенное воздействие привело к ухудшению их состава и качества. По единодушному мнению специалистов именно это является причиной снижения качества традиционных сред (Рябов В., Генкель В., Волкова Н., 1996; Lindsay D.G., 1983; Rice D.N., Wallen S., Nitzel D., 1984;

Venant A., Richou-Bac L., 1984; Waguespack M., 1986; Corrigan P.J., Seneviratna P., 1989).

Попытки исправить положение в сложившихся обстоятельствах приводят к разработке новых питательных сред (Ситьков В.И., Бобрышев В.И., 1994; Белоусов В.И., 1997; Федосеенко В.А., Сидорчук А.А., 1997; Ионина С.В., 2000; Волина Е.Г., Саруханова JI.E., 2001; Коротеева JI.A., Шишов В.П., 2001) или к модификации старых, с внесением дополнительных питательных компонентов в классичекие среды. Например, добавление к синтетическим средам сернокислого магния В.Ф. Разумнова, Л.И. Терентьева, В.В. Рощин (1981) добились увеличения урожайности чумных бактерий. Молибденовокислый аммоний, внесенный в питательные среды, улучшал рост микробов чумы и увеличивал выход биомассы вакцинного штамма ЕВ (Бондаренко Л.П. и др., 1990). При практическом изготовлении сред в качестве белкового субстрата использовали печень тарбагана (Шу-наев В.В., 1935), пептоны сердца, крови, почек (Терентьева Л.И., Разумнова В.Ф., Стручкова, 1994), кровяные сгустки (Кондратенко Н.Г., Юргина З.А., 1960; Трифонова А.А., 1960; Трифонова А.А., 1964) и другие субстраты. В.Г. Мацуга с соавт. (1989) использовали мясную воду от трупов грызунов в качестве основы питательных сред для выращивания возбудителя чумы. Целесообразность использования экстрактов и аутолизатов дрожжей доказана многими авторами (Филипов А.Ф., Кондрашкова Т.В., Муравьева Н.К., 1973; Филипов А.Ф., Кондрашкова Т.В., Муравьева Н.К., 1974; Дятлов И.А. с соавт., 1998). Белковым субстратом для культивирования мик-рорганизмов может выступать рыба (Мартене Л.А., 1964; Филиппов А.Ф. с соавт., 1973; Филиппов А.Ф. с соавт., 1974). Многие исследователи применяли в качестве добавок к питательным средам экстракты, гидролизаты и настои растительного проихождения (Канчух А.А. с соавт., 1961; Касаткина Н.Ф., 1972; Майский В.Г., Крылова А.А., 1990). Иногда эти субстраты приходится вносить в больших объемах, что, по нашему мнению, существенно меняет состав сред и удорожает процесс.

В микробиологической практике широко применяются различные стимуляторы роста микроорганизмов. В отличие от питательных добавок они вносятся в питательные среды в минимальных дозах не меняя их состава. Истинные стимуляторы роста выполняют чаще всего роль катализаторов биохимических процессов (Сохина A.M., Биргер М.О., 1961; Сохина

A.M., Биргер М.О., 1964; Галаев Ю.В., 1974; Никитина В.А., Бобрышев

B.И., Кафизова Ф.И., 1979; Doudoroff М., 1943; Scott Т.А., Bellion М., 1969; Wren M.W.D., 1969; Macfarlane D.E., Elian-Jones Т.Е., 1980) в сложнейших биохимических реакциях, происходящих при культивировании микроорганизмов и обеспечивающих высокое накопление общей биомассы в результате стимулирующего действия. Однако, для каждого отдельного микроорганизма или для нескольких одновременно, известен определенный спектр химических или органических компонентов, являющихся стимуляторами их роста. Например, сульфит натрия является стимулятором чумного микроба (Бахрах Е.Э., 1951). При добавлении к питательным средам липоевой кислоты в дозе 5 мг/л наблюдается наибольший прирост бактериальной массы Yersinia pestis (Катунина Л.С., 2002). При отсутствии в питательной среде одного из витаминов Bi и В)2 не возможно субкульти-вировать лептоспир (Малахов Ю.А., Панин А.Н., Соболева Г.Л., 2000). Стимулятор роста микроорганизмов «СРМ ТС-1» (Тутов И.К., 1996; Тутов И.К., Кравцов В.А., Каменский Н.И., Кубраков Ю.М., 1996; Веревкина В.Н., 1998; Олиферова Э.В., 1998; Олиферова Э.В., 1999; Веревкина В.Н., 2003), который представляет собой культуральную жидкость природной ассоциации микроорганизмов «чайного» гриба», оказывает ростостимули-рующее действие препарата на следующие микроорганизмы: листерии, сальмонеллы, пастереллы, возбудителя рожи свиней, причем необходимо для каждого отдельно взятого штамма или вида бактерий самостоятельно устанавливать оптимальную дозу. Анализируя литературные источники, мы пришли к выводу, что ни один из применяющихся в практике стимуляторов нельзя назвать универсальными по составу и рекомендовать для использования одновременно для ряда микроорганизмов на различных питательных средах.

Хороший стимулирующий эффект, с возможностью использования для широкого перечня микроорганизмов может обеспечиваться при использовании питательных смесей, сочетающих различные ростостимули-рующие компоненты (Мейнел Дж., Мейнел Э., 1967; Тутов И.К., Ситьков В.И., 1997).

Изыскание универсального стимулятора роста и размножения микроорганизмов для повышения накопления общей и живой микробной массы в процессе их выращивания в промышленных условиях независимо от типа питательной среды является актуальной проблемой. Поэтому мы поставили перед собой цель приготовить такой препарат и изучить его влияние на свойства микроорганизмов.

В связи с вышеизложенным, мы считаем, что препараты, применяемые в качестве стимуляторов роста, должны соответствовать определенным требованиям: изготавливаться из экологически чистых и безвредных ингредиентов с высоким содержанием биологически активных веществ на единицу объема, не противоречащих питательным потребностям микроорганизмов. Для изготовления препарата, сочетающего в себе вышеперечисленные признаки, необходимо было уделить особое внимание выбору субстрата, который, в свою очередь, тоже должен отвечать определенным требованиям. Сырье, используемое для приготовления стимулятора роста, должно быть субстратом живой системы с высоким уровнем метаболических процессов, оно должно быть поликомпонентным, максимально полноценным по химическому и биологическому составу, экологически чистым и безвредным, легко воспроизводимым, стерелизуемым.

При поиске таких субстратов наше внимание привлек богатый химический состав куриного яйца (Третьяков Н.П., Крок Г.С., 1968). Оно содержит в своем составе все вещества необходимые для полноценного развития куриного эмбриона. Однако в литературе встречаются также неоспоримые доказательства влияния эмбриональных тканей на макро- и микроорганизмы (Гольдберг Д.И., 1942; Симбирцев П.Ф., 1955; Багинкас В.П., 1960; Полковников P.M., Туренкова JI.T., 2000). Поэтому для повышения эффективности будущего препарата мы использовали сочетание биологических потенций обоих выбранных субстратов, которые имеют наличие широкого набора составных частей, обладающих положительным катализирующим действием на метаболизм бактерий.

Основой получения высокоэффективного стимулятора роста является разработка его технологической схемы, включающей разнообразные манипуляций и методики. В основу положен метод получения тканевых препаратов по В.П. Филатову (1946). В качестве прототипа, подтверждающее это, нами был взят «СТЭМБ» (Ржепаковский И.В., 2003), используемый для биологической стимуляции физиологических показателей организма животных. Однако, он имел ряд недостатков в технологии, которые не позволяли использовать его в качестве стимулятора роста микроорганизмов. Для обеспечения требований, предъявляемых к разрабатываемому стимулятору роста микроорганизмов, необходимо было его модифицировать. В связи с этим, были намечены и поэтапно устранены недостатки отдельных технологических приемов.

Весь технологический цикл разделен на 3 основные стадии (подготовительная, основная и заключительная).

Поскольку основной задачей подготовительной стадии являлось не только получение высокоэффективного стимулятора роста микроорганизмов, но и достижение его универсальности путем расширения перечня входящих в его состав биологически активных веществ, мы предприняли попытки повысить активность препарата в процессе технологии получения. Для этого применен метод, который основан на низкоинтенсивном лазерном излучении (Козлов В.И., Буйлин В.А., Самойлов Н.Г., Марков И.И., 1993). В работе использовали лазерный аппарат AJI-1 «Семикон», которым облучали яйца на 5, 6, 7, и 8 дни инкубации. Целесообразность применения лазера доказали полученные результаты. Масса эмбрионов увеличилась на 42,5%, масса печени на 47,4%, изменение соотношения массы желтка и белка наблюдалось в пользу желтка (признак интенсификации белкового питания). Для определения биологической активности полученного нами субстрата на промежуточных этапах использовали метод К. Бакирджиева (Калашник И.А., 1990), основанный на изменении бродильной активности дрожжей под действием испытуемого препарата. Экспериментальным путем мы установили, что яично-эмбриональный субстрат из яиц, облученных на 5, 6, 7 и 8 день инкубации, активнее гомогената яйца на 23,5%, а по отношению к контролю увеличение активности составляет 34,7%.

Дальнейшая технология изготовления препарата предусматривала использование технологии получения тканевых препаратов по В.П. Филатову (Калашник И.А., 1990) в нашей модификации. Активность субстрата, обработанного по вышеназванной методике, составила 60,4% по отношению к контролю и 30,1% по отношению к гомогенату свежего яйца.

Главной задачей основной стадии являлось достижение максимальной гомогенности полученного яично-эмбрионального субстрата путем тщательного измельчения тканей с последующей первичной фильтрацией и центрифугированием полуфабриката для освобождения его от различных балластных веществ.

Важнейшим технологическим этапом заключительной стадии является обеспечение стерильности препарата. Проанализировав литературные данные, касающиеся возможных методов стерилизации, мы пришли к выводу, что большинство методов основано на действии высоких температур. Например, для обеспложивания питательных сред (мясо-пептонный агар и бульон, триптический перевар и бульон Хоттингера) используют метод стерилизации насыщенным паром под давлением в автоклаве при 120°С в течение 15 минут. Стерилизация текучим паром производится дробно в течение 3 дней по 30-60 минут. Обычно используют аппарат Коха для стерилизации питательных сред, свойства которых изменяются при температуре выше 100°С (Пяткин К.Д., 1969; Герхард Ф., 1974; Лабинская А.С., 1978). Другой метод - пастеризация, направлен на уничтожение вегетативных форм микробов, при этом споры сохраняют жизнеспособность (Черкес Ф.К., 1974; Аникиев В.В., Лукомская К.А., 1977; Радчук Н.А., 1991), что недопустимо в микробиологической практике. Поэтому этот вид стерилизации не рассматривался нами как потенциально возможный метод, приемлемый к технологии «ЭСРМ». Тиндализация - дробная стерилизация, предложенная Тиндалем для веществ, легко разрушающихся и денатурирующихся при температуре 60°С (сыворотки, витамины) (Пяткин К.Д., 1969; Абуладзе К.И., Данилевский В.М., Веселова Т.П., 1988; Костенко Т.С., Скаршевская Е.И., Гительсон С.С., 1989). В ходе исследований мы испытали возможность использования всех вышеперечисленных методов стерилизации по отношению к «ЭСРМ». Разработанный нами препарат в своем составе содержит различные стимулирующие рост и развитие микроорганизмов вещества, витамины группы В, С, биотин, важнейшие микро- и макроэлементы, различные аминокислоты и белки. Белки являются термолабильными соединениями, и при нагревании свыше 50-60°С наступает их денатурация. Кроме того, некоторые витамины не стойки к нагреванию, например тиамин, пантотеновая кислота и рибофлавин (Ермолаев М.В., 1978; Кнорре Д.Г., Мызина С.Д., 2000). Поэтому мы рекомендуем наиболее приемлемый метод достижения стерильности препарата: тинда-лизацию.

Важнейшим моментом в технологии получения «ЭСРМ» было не только получение высокоэффективного стимулятора роста микроорганизмов, но и, прежде всего, сохранение его полезных свойств. В ходе проведенных биохимических исследований состава препарата мы установили, что жидкая форма «ЭСРМ» является нестабильной субстанцией и с течением времени (1 месяц) биологически активные вещества подвергаются распаду. Поэтому для сохранения полезных стимулирующих свойств препарата мы применили сублимирование нативного «ЭСРМ», что позволило увеличить срок годности стимулятора до 3 лет.

Приготовленный препарат «ЭСРМ» подвергали проверке на активность, стерильность и безвредность классическими методами.

Экспериментальная апробация разработанного нами стимулятора роста микроорганизмов проводилась на тестовых микроорганизмах: Yersinia pestis штамм EV, Listeria monocytogenes штамм АУФ, Leptospira interrogans серовар pomona, Leptospira interrogans серовар tarassovi, Leptospira interrogans серовар grippotyphosa, Leptospira interrogans серовар sejroe, Leptospira interrogans серовар icterohaemorrhagiae. Выбор именно этих микроорганизмов обусловлен, прежде всего, производственными трудностями, связанными со снижением накопления бактериальной массы, необходимой для получения биологических препаратов. Выбранные нами микроорганизмы имеют как сходства, так и различия в метаболических процессах, биологических свойствах, в методах культивирования и применяемых для этих целей питательных средах.

Проанализировав основные питательные потребности не только вышеперечисленных микроорганизмов, но и изучив общие потребности бактериальных клеток, мы поставили перед собой задачу исследовать химический состав «ЭСРМ», чтобы удостоверится и подтвердить наличие в препарате необходимых веществ для роста и развития микроорганизмов, а также присутствие биологически активных субстанций, оказывающих стимулирующее действие на бактериальные клетки.

Проведенные исследования химического состава «ЭСРМ» свидетельствуют о широком спектре веществ, органической и неорганической природы, входящих в состав препарата. Так, например, стимулятор роста содержит заменимые и незаменимые аминокислоты в свободном состоянии, что имеет большое значение для бактериальных клеток. Влияние аминокислот на рост микроорганизмов зависит от того, даются ли они в качестве единственного источника азота или же добавляются в среду дополнительно к другим азотистым веществам. В первом случае микроорганизм вынужден дезаминировать аминокислоту, чтобы извлечь из нее азот; во втором случае он может поглощать ее целиком, что освобождает клетку от необходимости осуществлять трудный для нее биосинтез этих аминокислот (Сохина A.M., Биргер О.М., 1961; Сохина A.M., Биргер О.М., 1964; Галаев Ю.В., 1974; Борисов Л.Б., 1994).

ЭСРМ» богат витаминами группы В, С, содержит биотин, которые в одних случаях ускоряют рост микроорганизмов, являясь коэнзимами ферментов, в других случаях они оказываются для них необходимыми (Иерусалимский Н.Д., 1963; Перт С.Дж., 1978).

Минеральные соли в клетках бактерий необходимы для поддержания осмотического давления, активации энзиматических систем, регулирования рН и окислительно-восстановительного потенциала, что может обеспечить «ЭСРМ» при добавлении к питательным средам, благодаря наличию в своем составе кальция, натрия, фосфора, железа, марганца, меди и других макро- и микроэлементов.

Наличие в разработанном нами препарате жирных кислот и водорастворимых липидов позволяет предположить, что «ЭСРМ» должен положительно влиять на рост и накопление бактериальной массы многих микроорганизмов, в том числе лептоспир.

На начальных этапах изучения разработанного нами стимулятора роста микроорганизмов мы проводили исследование его влияния на накопление общей бактериальной массы листерий. Полученные результаты положительного стимулирующего эффекта не давали полной картины о развитии культуры. По мнению многих авторов, величины, получаемые методом определения сырой биомассы, являются скорее относительными, чем абсолютными. При этом номинальный (полный) вес сырых бактериальных клеток (сырой вес) из жидкой суспензии определяют взвешиванием образца в таре с известным весом после отделения клеток фильтрованием или центрифугированием. Однако и в том, и в другом случае в интерстициальное (межклеточное) пространство захватывается раствор для разведения, вес которого входит в величину сырого веса биомассы, причем количество интерстициального раствора может быть существенным (Иерусалимский Н.Д., 1963; Мейнелл Э., Мейнелл Дж., 1967; Методы общей бактериологии. М., 1974; Ждан-Пушкина С.М., 1983). При измерении роста культуры бактерий массу и число микроорганизмов следует определять независимо друг от друга. Поэтому наряду с полученными результатами о приросте бактериальной массы, полученной под влиянием «ЭСРМ», мы поставили перед собой цель изучить количество жизнеспособных клеток, приходящихся на долю выращенной бакмассы. При подсчете жизнеспособных клеток смысл получаемой величины зависит от того, что следует понимать под термином «жизнеспособность». В литературных источниках встречается множество разнообразных определений этого понятия, базирующихся на каком-либо свойстве микроорганизмов, например, их способности образовывать колонии. В основе других определений лежат менее очевидные признаки, например, подвижность, ферментативная активность, устойчивость к красителям, внешний вид, выявляемый при помощи электронной микроскопии. Однако общепринятым критерием жизнеспособности является способность образовывать макроскопическую колонию на питательном агаре или вызывать видимое помутнение бульона при подсчете методом разведений. Поэтому в своих исследованиях мы параллельно изучали прирост бакмассы и основные биологические свойства микроорганизмов, выращенных с добавлением «ЭСРМ».

При изучении спектра стимулирующих и ингибирующих доз препарата «ЭСРМ» было выявлено, что концентрация стимулятора в питательной среде свыше 40-50 мл/л проявляет подавляющий эффект по отношению к росту и размножению микроорганизмов. Стимулирующий диапазон находится в широких пределах от 0,015 до 30 мл/л. Причем, действие стимулятора роста на плотных питательных средах обеспечивается более низкими дозами препарата, чем при культивировании бактерий в жидких субстратах, что объясняется, по всей видимости, разностью плотности сред. Так, например, при выращивании листерий и лептоспир в жидких средах оптимальная доза «ЭСРМ» составляет 0,1-0,2 мл/л, а при аналогичном культивировании листерий на агаре Хоттингера - 0,05-0,025 мл/л. Чумной микроб оказался более чувствительным к исследуемому стимулятору и проявил наибольший прирост бакмассы при концентрации «ЭСРМ» 3 мг/л, что составляет 0,015 мл/л нативного препарата. Полученные результаты исследований позволяют отнести разработанный препарат к числу истинных стимуляторов роста, которые действуют в минимальных количествах на микроорганизмы, а не рассматривать его, как питательную добавку к средам.

Одним из аспектов изучения влияния «ЭСРМ» является исследование основных биологических свойств микроорганизмов под его влиянием. При определении морфологических признаков исследуемых культур, в том числе углубленного изучения морфологии чумного микроба с помощью электронной микроскопии, не было выявлено изменений формы, размеров клеток. Кроме того, не изменились тинкториальные свойства бактерий, выращенных со стимулятором роста. Как известно, одним из культуральных свойств бактерий является их способность образовывать на плотных питательных средах характерные колонии. Экспериментальным путем было установлено, что ни в одном из проведенных посевов тестовых микроорганизмов на плотные питательные среды не наблюдалось изменения формы, края, размеров, оптических свойств поверхности, структуры, консистенции выросших колоний. При изучении подвижности листерии при посеве их в полужидкие среды, что тоже является культуральным признаком, также не наблюдалось каких-либо отклонений от нормы.

Экспериментальным путем было установлено, что «ЭСРМ» при добавлении в питательные среды, предназначенные для культивирования тестовых микроорганизмов, вызывает не только увеличение накопления бактериальных клеток с сохранением основных биологических свойств, но и обеспечивает выход функционально активной бакмассы микроорганизмов.

Иммуногенные свойства бактериальной массы, выращенной с добавлением стимулятора роста в питательные среды, изучали в соответствии с нормативными документами на лабораторных животных. Снижения им-муногенной активности лептоспир и чумного микроба не наблюдалось. Однако при изучении активности бакмассы лептоспир отмечалась положительная тенденция к увеличению титра антител в сыворотке иммунизированных кроликов.

Методом электронной микроскопии изучали влияние «ЭСРМ» на ультраструктуру микробных клеток до и после сублимационной сушки культуры Y. pestis EV. Было установлено положительное влияние «ЭСРМ» на резистентность микроба к температурным факторам, на разных этапах технологического цикла. Установлено, что процент поврежденных клеток до высушивания составляет в культуральной суспензии, выращенной без «ЭСРМ», 3,1 ±1,4 (Р<0,1), в то время как при добавлении препарата он равен в среднем 1,2±0,6 (Р<0,1). После высушивания процент поврежденных клеток увеличился в обеих исследуемых группах вакцины. При этом в пробах с «ЭСРМ» он составил 4,7±1,3 (Р<0,5), а в пробах вакцины без него - 5,9±0,8 (Р<0,1).

Таким образом, «ЭСРМ» проявляет стимулирующие свойства по отношению к тестовым микроорганизмам, что позволяет выдвинуть предположение об универсальности разработанного препарата. «ЭСРМ» не противоречит питательным потребностям и не изменяет основных биологических свойств культивируемых микрообъектов как на плотных, так и на жидких питательных средах. Может быть рекомендован для оптимизации производственных питательных сред при промышленном выращивании бактериальных культур.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Панова, Наталья Викторовна, Ставрополь

1. Абуладзе, К.И. Ветеринарная рецептура с основами терапии и профилактики: Справочник / К.И. Абуладзе, В.М. Данилевский, Т.П. Веселова и др. // Под ред. И.Е. Мозгова. М.: Агропромиздат, 1988. - С. 56-57.

2. Адамов, А.А. Влияние некоторых органических соединений на рост патогенных лептоспир / А.А. Адамов // Микробиол. 1959. - №8. - С. 104107.

3. Ананьин, В.В. Лептоспироз людей и грызунов, вызванный одновременно лептоспирами 2 серологических типов / В.В. Ананьин // Микробиолог. 1964. - №12. - С. 74-78.

4. Аникиев, В.В. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Учебное пособие для студентов биологических специальностей пед. иститутов. / В.В. Аникиев, К.А. Лукомская. М.: Просвещение, 1977.-128 с.

5. Апарин, Г.П. Микробиология чумы: Руководство / Г.П. Апарин, Е.П. Голубинский. Иркутск: Изд-во ун-та, 1989. - 91 с.

6. Арешидзе, Д.А. Методы статистической обработки данных в биологии / Д.А. Арешидзе. Ставрополь: РИО филиала МГОПУ в г. Ставрополе, 2003.-40 с.

7. Ассонов, Н.Р. Микробиология (Учебники и учебные пособия для студентов ВУЗов) / Н.Р. Ассонов. М.: Колос, 2001. - 352 с.

8. Ахапкина, А.Г. Питательные среды как исскуственная среда роста и развития микроорганизмов / А.Г. Ахапкина, Л.П. Блинкова // Микробиол. 2001. - №6. - С. 99-108.

9. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. JL: Медгиз, 1962. - 180 с.

10. Бакулов, И.А. Листериоз как пищевая инфекция. Вопросы диагностики и профилактики / И.А. Бакулов, Д.А. Васильев. Ульяновск. 1991.-156 с.

11. Бакулов, И.А. Листериоз сельскохозяйственных животных / И.А. Бакулов. -М.: Колос, 1965.-351с.

12. Бакулов, И.А. Эпидемиологические и эпизоотологические аспекты листериоза / И.А. Бакулов, В.М. Котляров, Т.И. Шестиперова // Микробиол. 1994. - №5.-С. 100-105.

13. Баронец, Н.Г. Витамин К как стимулятор роста микроорганизмов / Н.Г. Баронец //Микробиол. 2003. - №4. - С. 104-105.

14. Баронец, Н.Г. Влияние экстрактов лекарственных растений на рост микроорганизмов / Н.Г. Баронец и др. // Микробиол. 2001. - №5. - С. 71-72.

15. Баснакьян, И.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами / И.А. Баснакьян. М.: Медицина, 1992. - 192 с.

16. Баснакьян, И.А. Патология и физиология микроорганизмов. Усовершенствование технологии культивирования / И.А. Баснакьян // Микробиол. 1982. - №12. - С. 28-33.

17. Бахрах, Е.Э. Зависимость роста чумного микроба от наличия в питательной среде азотистых веществ / Е.Э. Бахрах, А.Н. Крайнова, А.П. Михайлова // Труды института «Микроб». Саратов, 1951. - Вып. 1 -С. 168-173.

18. Бахрах, Е.Э. Зависимость роста чумного микроба от окислительно-восстановительного потенциала питательной среды. Сообщ. 2 / Е.Э. Бахрах, Н.И. Шушерова // Тр. института «Микроб». Саратов, 1951. -Вып. 1.-С. 92-98.

19. Бахрах, Е.Э. Значение физико-химического состояния питательной среды в производстве чумной вакцины / Е.Э. Бахрах, Ф.К. Дроздов-ский, Н.К. Муравьева // Биохимия микробов и иммунохимия: Материалы конф. 18-20 апреля 1966 г. Горький, 1966. - С. 32-33.

20. Бахрах, Е.Э. Окислительно-восстановительный потенциал в культуре чумного микроба. Сообщ. 2 / Е.Э. Бахрах // Труды ин-та «Микроб». -Саратов, 1951.- Вып. 1. С. 84-91.

21. Беккер, М.Е. Биотехнология / М.Е. Беккер, Г.К. Липиньш, Е.П. Рай-пулис. М.: Агропромиздат, 1990. - С. 108-111.

22. Белоусов, В.И. Питательные среды для культивирования лептоспир / В.И. Белоусов // Междунар. научно-практ. конф. Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзот. и зооантропоноз. болезнями животных: Сб.ст.: Покров, 2000. - С. 232-236.

23. Белоусов, В.И. Разработка режима управляемого культивирования производственных штаммов лептоспир / В.И. Белоусов // Ветиринария. 1997.-№6.-С. 22-26.

24. Бендас, Л.Г. Стимулятор бактериального роста из кормовых дрожжей / Л.Г. Бендас, Б.М. Раскин // Лаб. дело. 1974. - № 1. - С. 43-46.

25. Бирюков, В.В. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза / В.В. Бирюков, В.М. Кантере. М.: Наука, 1985. -243 с.

26. Блохина, И.Н. Об особенностях аминокислотного обмена некоторых вариантов энтеробактерий / И.Н Блохина, Р.С. Перова, М.В Усцова // Тез. докл. конф., посвященной биохимии и физиологии микробов. -Горький, 1960.-С. 15-17.

27. Бондаренко, А.И. Разработка электронномикроскопического способа количественного определения поврежденных клеток чумной вакцины ЕВ: Дис. . канд. мед. наук / А.И. Бондаренко. Ставрополь, 1995. — 160 с.

28. Бондаренко, JI.H. Оптимизация плотной среды для аппаратного культивирования чумного микроба в бифазной системе: Автореф. дис. . канд. мед. наук / JI.H. Бондаренко. Саратов, 1988. - 23 с.

29. Бондаренко, Л.П. Управляемое многоциклическое культивирование чумного микроба в аппарате АКМ-Ш / Л.Н. Бондаренко, А.Ф. Филиппов, И.А. Дятлов // Микробиология, биохимия и специфическая профилактика карантинных инфекций. Саратов, 1990. - С. 110-116.

30. Боринских, И.И. Технология и аппаратура для полупромышленного выращивания почвенных микроорганизмов / И.И. Боринских, Г.А. Оборин, Д.И. Сычев // Ускоренная рекультивация земель с использованием высокоэффективной битехнологии. Пермь, 1988. - С. 17-23.

31. Брильков, А.В. Учет физиологии в моделях лимитирования и инги-бирования роста микроорганизмов / А.В. Брильков, Н.С. Печуркин // АН СССР. Сиб. отд-ние. Институт биофизики. Красноярск, 1990. - 37 с.

32. Бузолева, J1.С. Влияние органических веществ 1уминовых кислот на размножение энтеробактерий / Л.С. Бузолева и др. // Микробиол. 2002. -№2.-С. 89-91.

33. Буртов, Ю.З. Инкубация яиц / Ю.З. Буртов // Справочник. М.: Аг-ропромиздат, 1990. - 239 с.

34. Вейнблат, В.И. Синтетическая питательная среда для выращивания чумных микробов при 28-37°С / В.И. Вейнблат, И.А. Кузьмиченко, А.А. Синичкина, Н.Е. Борисова // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1972. - Вып. 4. - С. 123-127.

35. Веревкина, М.Н. Аминокислотный состав стимулятора роста микроорганизмов ТС-1 / М.Н. Веревкина // Диагностика, лечение и профилактика заболеваний сельскохозяйственных животных: Сб. науч. тр. / Став-роп. ГСХА. Ставрополь, 1998. - С. 58-61.

36. Веревкина, М.Н. Влияние СРМ ТС-1 на накопление биомассы Trichoh-pyton faviforme / М.Н. Веревкина // Актуальные проблемы инваз., ин-фекц. и незараз, патологии животных. — Ставрополь, 2003. С. 155-157.

37. Виноградова, И.Н. Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней / И.Н. Виноградова // Под редакцией К.И. Матвеева. М.: Медицина, 1973. - С. 96-110.

38. Волина, Е.Г. Культивирование лептоспир в жидкой питательной среде с лизированной кроличьей кровью / Е.Г. Волина, JI.E. Саруханова // Мик-робиол. 2001. -№1. - С. 3-5.

39. Воробьев, А.В. Микробиология: Учебник / А.В. Воробьев, А.С. Быков, Е.П. Пашков, A.M. Рыбакова. М.: Медицина, 1998. - С. 181-193.

40. Вяльцев, Е.М. Влияние сульфата магния и некоторых микроэлементов на рост Bact. alcaligenes, выделенных из преджелудков крупного рогатого скота / Е.М. Вяльцев // Вопросы физиологии микроорганизмов. -Краснодар, 1970. С. 70-73.

41. Галаев, Ю.В. Особенности обмена дикарбоновых аминокислот и их амидов у микроорганизмов кишечной группы / Ю.В. Галаев // ЖМЭИ. -1974. №6. - С. 23-26.

42. Галаев, Ю.В. Особенности обмена дикарбоновых аминокислот и их амидов у микроорганизмов кишечной группы // ЖМЭИ. 1974. - №6. -С. 23-26.

43. Гариб, Ф.Ю. Изучение влияния биостимулятора на рост и токсинообра-зовательную функцию CI. tetani «Копенгаген 471» / Ф.Ю. Гариб и др. // Микробиол. - 2002. - №3. - С. 115-118.

44. Глазунов, А.В. Способ расчета остаточной концентрации лимитирующего субстрата при хемостатном культивировании микроорганизмов /

45. A.В. Глазунов, С.В. Аргунов, Ю.Г. Капульцевич // Биотехнология. -1993. -Т.З. С. 25-27.

46. Голшмид, В.К. Гидролизаты крови для микробиологических питательных сред / В.К. Голшмид и соавт. // Лаб. дело. 1990. - №3. - С. 68-70.

47. Гольдберг, Д.И., 1942. Цит. по Филатову, В.П. Тканевая терапия / В.П. Филатов. М.: Знание, 1955. - 180 е..

48. Гончарова, М.Н. Некоторые аспекты сравнительного изучения чумных вакцин. Дис. канд. биол. наук / М.Н. Гончарова. - Ставрополь, 1981. -175 с.

49. Горкин, В.З. Роль металлов в каталитическом действии ферментов / В.З. Горкин. М.: Изд-во АН СССР, 1964. - С. 58-75.

50. Готшалк, Г. Метаболизм бактерий / Г. Готшалк. М.: Мир, 1982. - 310 с.

51. Гюлушанян, К.С. Возможность использования аминопептида при приготовлении комбинированного агара на основе кукурузного экстракта для производства чумной вакцины / К.С. Гюлушанян, С.А. Угримов,

52. B.Г. Майский, Л.П. Воропаева // Актуальные вопросы эпидемиологии, профилактики и диагностики особо опасных инфекций: Тез. докл. итоговой науч. конф. (21-22 декабря 1989 г.). 4.1. Ставрополь, 1989. - С. 77-80.

53. Дедюхина, Э.Г. Незаменимые химические элементы в регуляции метаболизма микроорганизмов / Э.Г. Дедюхина, В.К. Ерошин // Успехи микробиологии.-М.: Наука, 1992.-Вып. №25.-С. 126-141.

54. Джатдоев, Х.Х. Влияние климатических факторов на эпизоотологию лептоспироза в Карачаево-Черкесии / Х.Х. Джатдоев // Науч. труды Ставроп. сельскохозяйственного института. Выпуск 33. Том 4. Ставрополь, 1970.-С. 7-9.

55. Домарадский, И.В. Биохимия и генетика возбудителей чумы / И.В. До-марадский, Е.П. Голубинский, С.А. Лебедева, Ю.Г. Сучков. М.: Медицина, 1974.- 165 с.

56. Домарадский, И.В. Чума / И.В. Домарадский. М.: Медицина, 1998. -176 с.

57. Донская, Т.Н. Использование солей железа в качестве стимуляторов роста чумного микроба / Т.Н. Донская, Л.Н. Савицкая, Т.В. Кондрашко-ва // Лаб. дело. 1983. - № 3. - С. 13-58.

58. Држевецкая, И.А. Методические указания к практикуму по физиологии человека и животных / И.А. Држевецкая // Часть 3. Статистическая обработка результатов физиологических исследований. Ставрополь, 1990.-27 с.

59. Дрю, С. Методы общей бактериологии / С. Дрю // Под ред. Ф. Герхард и др. Т. 1. - М.: Мир, 1983. - С. 374, 407-408.

60. Дьяконов, Л.П. Достижения и перспективы развития клеточной биотехнологии / Л.П. Дьяконов // К 10-летию агробиологической промышленности России: Тезисы докладов. Курск, 1996. - С. 103-108.

61. Дьяконов, Л.П. Культивирование клеток тканей животных / Л.П. Дьяконов, В.Ф. Глухов, Г.Ф. Денисенко // Учебное пособие (книга первая). Ставрополь, 1986. - 96 с.

62. Дятлов, И.А. Утилизация глюкозы культурами штаммов ЕВ и К-1 чумного микроба / И.А. Дятлов, А.Ф. Филиппов // Микробиология, иммунология и биохимия особо опасных инфекций: Тр. противочумных учреждений СССР. Саратов, 1987. - С. 23-30.

63. Ермолаев, М.В. Биологическая химия / М.В. Ермолаев. М.: Медицина, 1978.-320 с.

64. Ефременко, В.И. Современное состояние эпидемиологического надзора в природных очагах чумы Северного Кавказа / В.И. Ефременко, Г.Д.

65. Брюханова, Г.М. Грижебовский и др. // Микробиол. 2003. - №6. - С. 71-75

66. Ждан-Пушкина, С.М. Основы роста культур микроорганизмов / С.М. Ждан-Пушкина. Л.: Изд-во ЛГУ, 1983. - С. 5-9.

67. Иерусалимский, Н.Д. Основы физиологии микроорганизмов и клеток / Н.Д. Иерусалимский. М.: Изд-во АМН СССР, 1963. - 263 с.

68. Ионина, С.В. Новая питательная среда с биодобавками и минеральным комплексом / С.В. Ионина // Сибир. аграр. наука III тысячелетия. Новосибирск, 2000.-С. 152-153.

69. Каграманов, B.C. Использование чумным микробом глюкозы и глюко-ната / B.C. Каграманов, Е.П. Голубинский // Микробиология, эпидемиология и профилактика инфекционных болезней: Сб. науч. работ. Ставрополь, 1976.-С. 18-21.

70. Калашник, И.А. Стимулирующая терапия в ветеринарии / И.А Калаш-ник. К.: Урожай, 1990. - 160 с.

71. Калашников, И.А. Особенности лептоспироза в Краснодарском крае / И.А. Калашников, В.М. Мезенцев, М.О. Мкртчан // Микробиол. 2003. -Коб.-С. 61-11.

72. Канчух, А.А. Использование кукурузного экстракта в качестве основы для питательной среды чумного микроба. Сообщ. 1 / А.А Канчух, В.Н. Сагатовский, А.Ф. Мелехина, Н.С. Сурнина // Сб. науч. работ. Махачкала, 1961.-С. 193-206.

73. Карклинь, Р.Я. Культивирование микроорганизмов (поверхностное) Учебное пособие. / Р.Я. Карклинь. Рига: МИПК СНХ ЛатвССР. -1983.-39 с.

74. Карпенко, В.В. Обезболивание животных в эксперименте / В.В. Карпенко, В.И. Сачков // Метод, рекомендации. М., 1985. - 53 с.

75. Карпузиди, К.С. Рост и размножение чумного микроба на среде с лиза-том микробов «кормилок» / К.С. Карпузиди, Л.Н. Макаровская // Тр. Ростов. н/Д. противочумного института. 1956. - Т.Х. - С. 44-53.

76. Касаткин, Н.Ф. Влияние кукурузного экстракта на качество агара Хоттингера, используемого для выращивания возбудителя чумы / Н.Ф. Касаткин, Н.Г Ованесова, В.И. Тынянова // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1972. - Вып.З (25). - С. 206-208.

77. Катунина, JI.C. Использование липоевой кислоты с целью усовершенствования питательных сред для культивирования чумного микроба: Дисс. .канд. биол. наук / JI.C. Катунина. Ставрополь, 2002. - 164 с.

78. Кестельман, В.Н. Оборудование для глубинного культивирования микроорганизмов в бродильной и микробиологической промышленности / В.Н. Кестельман, А.И. Веселов // Обзор. М., 1970. - 83 с.

79. Кивман, Г.Я. Препарат для выявления и стимуляции роста чумных микробов / Г.Я. Кивман, М.Д. Прядкина, Н.М. Гуторова // ЖМЭИ. 1955.-№ 12.-С. 61-66.

80. Классовский, Л.П. О факторах роста штаммов бактерий чумы, выделенных на Закавказском нагорье от полевок и блох / Л.П. Классовский, И.Л. Мартиневский, В.М. Степанов // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1972. - Вып.1. - С. 186-188.

81. Кнорре, Д.Г. Биологическая химия: Учеб. для хим., биол. и мед. спец. вузов. / Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина. М.: Высш. школа, 2000. - 479 с.

82. Князева, В.А. Стимуляция роста чумного микроба фильтратами его бульонной культуры / В.А. Князева // Тр. института «Микроб». Саратов, I960. - Вып.4. - С. 157-161.

83. Козлов, В.И. Основы лазерной физио- и рефлексотерапии / В.И. Козлов, В.А. Буйлин, Н.Г. Самойлов, И.И. Марков // Под ред. O.K. Скобелкина. Самара-Киев, 1993.-С. 13-22.

84. Козлов, Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии: (Руководство по приготовлению питательных сред для микробиологических институтов и санитарно-бактериологических лабораторий). / Ю.А. Козлов. М.: Медгиз, 1950. - 251 с.

85. Колотилова, Т.Г. Влияние автолизата хлебопекарных дрожжей и экстракта эритроцитов лошадей на ростовые свойства P. Multocida / Т.Г.

86. Колотилова и др. // Актуальные проблемы инфекционной патологии животных. Владимир, 2003. - С. 477-479.

87. Коляков, Я.Е. Ветеринарная иммунология / Я.Е. Коляков. М.: Аг-ропромиздат, 1986. - 272 с.

88. Кондратенко, Н.Г. Возможности использования агаровых сред, приготовленных из кровяных сгустков, в производстве живой противочумной вакцины / Н.Г. Кондратенко, З.А. Юргина // Тр. Ростов. н/Д. противочумного института, 1960. Т.ХУ11. - С. 146-151.

89. Костенко Т.С.и др. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии / Т.С. Костенко, Е.И. Скаршевская, С.С. Гительсон. М.: Агропромиздат, 1989. - 272 с.

90. Кузник, Б.И. Цитомедины: 25-летний опыт экспериментальных и клинических исследований / Б.И.Кузник, В.Г. Морозов, В.Х. Хавинсон. -СПБ.: Наука, 1998.-310 с.

91. Кулешова, И.А. Использование гидролизата фибрина в качестве основы питательной среды для выращивания рожистой палочки / И.А. Кулешова // Учен. зап. Витеб. гос. акад. вет. медицины, 1999. — Т.35. -4.1.-С. 71-72.

92. Куфулина, С.А. Эвтаназия экспериментальных животных / С.А Ку-фулина, Т.Н. Павлова // Метод, рекомендации по выведению животных из эксперимента. М., 1985. - 9 с.

93. Лабинская, А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований / А.С. Лабинская. М., «Медицина», 1978. - 394 с.

94. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. М: Высшая школа, 1990. - 352 с.

95. Ленинджер, А. Биохимия / А. Ленинджер. М.: Мир, 1976. - 412 с.

96. Любашенко, С.Л. Вакцинопрофилактика, серопрофилактика и серотерапия лептоспироза животных / С.Л. Любашенко // Ветеринария. -1949.-№7.- С. 6-9.

97. Любашенко, С.Я. Депонированная поливалентная вакцина против лептоспироза и ее антигенные свойства / С.Л. Любашенко Л.Г. Костри-кина, A.M. Косиков // Науч. труды Ставроп. сельскохозяйственного института. Выпуск 33. Том 4. Ставрополь, 1970. - С. 16-19.

98. Майский, В.Г. Особенности жизненных циклов микроорганизмов при различных способах культивирования / В.Г. Майский // Материалы второй Междунар. конф. Ставрополь: СевКавГТУ, 2000. С. 12-13.

99. Малахов, Ю.А. Лептоспироз животных / Ю.А. Малахов, А.Н. Панин, Г.Л. Соболева. Ярославль: ДИА-пресс, 2000. - 584 с.

100. Малек, И. Непрерывное культивирование микроорганизмов. Теоретические и методологические основы / Под ред. И. Малека, 3. Фенцля. -М.: Пищевая промышленность, 1968. - 345 с.

101. Мартене, Л.А. Плотные агаровые среды из кислотных гидролизатов рыбокостной муки / Л.А. Мартене // Микробиология и иммунология особо опасных инфекций: Сб. науч. работ противочумных учреждений СССР. Саратов, 1964. - С. 290-293.

102. Меджидов, М.М. Справочник по питательным средам / М.М. Мед-жидов. М.: «Медицина», - 2003. - 208 с.

103. Мезенцев, В.М. Лептоепироз в Южном Федеральном округе Российской Федерации / В.М. Мезенцев, Г.Д. Брюханова, В.И. Ефременко // Микробиол. 2003. - №6. - С. 63-67.

104. Мейнелл, Э. Экспериментальная микробиология (теория и практика) / Э. Мейнелл, Дж. Мейнелл. М.: Мир, 1967. - 347 с.

105. Меньшин, В.В. Культивирование листерий в жидкой питательной среде и влияние засевной дозы на накопление / В.В. Меньшин, А .Я. Са-муйленко, Е.Э. Школьников // Междунар. симпоз. Листериоз на рубеже тысячелетий: Материалы. Покров, 1999. - С. 109-111.

106. Меньшин, В.В. Усовершенствование питательной среды для культивирования листерий штамма АУФ / В.В. Меньшин, А.Я. Самуйленко, Е.Э. Школьников // Междунар. симпоз. Листериоз на рубеже тысячелетий: Материалы. Покров, 1999. - С. 106-107.

107. Месробяну, И.Л. Физиология бактерий / И.Л. Месробяну, Э. Пэуне-ску. Бухарест: Медицина, 1963. - 807 с.

108. Методические рекомендации по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов / ВНИИ эксперим. ветеринарии им. Я.Р. Коваленко. М., 1986. - 69 с.

109. Методические рекомендации по контролю пептидного состава гид-ролизатов для выращивания бактериальных культур / Всерос. гос. НИИ контроля, стандартизации и сертификации вет. препаратов. М., 1994. -7 с.

110. Методические рекомендации по физикохимическому и биологическому контролю белковых гидролизатов для бактериологических питательных сред / Сост. С.П. Рогожкин и др. / Всесоюз. науч.-исслед. и тех-нол. ин-т биолог, пром-сти и др. М., 1983. - 26 с.

111. Методы общей бактериологии / Под ред. Ф. Герхарда и др. М.: Мир, 1984.-264 с.

112. Никитина, В.А. Изыскание эффективной дрожжевой питательной среды для культивирования бактерий / В.А. Никитина, В.И. Бобрышев, Ф.И. Кафизова // Ученые записки Казанского гос. ветеринарного ин-та им. Н.Э.Баумана. Казань, 1979. -С. 132-134.

113. Овсова, JI.M. Влияние различных аминокислот и солей аммония с составе синтетических питательной среды на продукцию холерного эн-теротоксина / JI.M. Овсова и соавт. // Микробиол. 2003. - №4. - С. 108110.

114. Озеренко, О.А. Моделирование процессов периодического культивирования микроорганизмов: автореф. дис. на соиск. учен. степ. канд. биол. наук / О.А. Озеренко // Всерос. науч.-исслед. и технол. ин-т биол. пром-сти РАСХН. Щелково, 2004. - 28 с.

115. Олсуфьев, Н.Г. Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней / Н.Г. Олсуфьев // Под редакцией К.И. Матвеева. М.: Медицина, 1973. - С. 531-547.

116. Перт, С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / С. Дж. Перт. М.: Мир, 1978. - 331 с.

117. Питерман, М. Физические и химические свойства рибосом / М. Пи-терман. -М.: Мир, 1967.-221 с.

118. Подколозин, А.А. Действие биологически активных веществ в малых дозах / А.А. Подколозин, К.Г. Гуревич. М.: изд-во КМК, 2002. - 170 с.

119. Полюдек-Фабини, Р. Органический анализ / Р. Полюдек-Фабини, Т. Бейрих.-Д.: Химия, 1981.-624 с.

120. Пригода, А.С. Современное состояние и перспективы получения и использования питательных сред: Обзор, информ / А.С. Пригода, B.C. Муратов // ВНИИ систем упр., эконом, исслед. и НТИ. М., 1989. - 55 с.

121. Приказ №1179 от 10 октября 1983 г. Об утверждении нормативных затрат кормов для лабораторных животных в учереждениях здраво-охраненния. М., 1983.

122. Прозоркина, Н.В. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии: Учебное пособие для средних спец. мед. уч. заведений / Н.В. Прозоркина, JI.A. Рубашкина. Ростов н/Д: Феникс, 2002. - 416 с.

123. Прядкина, М.Д. Методика изготовления препарата манифестатора для стимуляции роста чумных и дифтерийных микробов / М.Д. Прядкина//Материалы по обмену опытом. М., 1958. - Т. 1958. - С. 353-357.

124. Пяткин, К.Д. Микробиология с вирусологией и иммунологией / К.Д. Пяткин. М.: Медицина, 1971.-351 с.

125. Пяткин, К.Д. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии. / К.Д. Пяткин, Н.С. Маркова, Н.Д. Трофимова. М.: Медицина, 1969. - 295 с.

126. Радчук, Н.А. Ветеринарная микробиология и иммунология / Н.А. Радчук, Г.В. Дунаев, Н.М. Колычев и др. // Под ред. Н.А. Радчука. М.: Агропромиздат, 1991.-383 с.

127. Разумов, В.А. Справочник лаборанта химика по анализу кормов / В.А. Разумов. -М.: Россельхозиздат, 1986. 304 с.

128. Раскин, Б.М. Отечественные сухие питательные среды и перспективы их разработки / Б.М. Раскин // ЖМЭИ. 1985. - №5. - С. 25-32.

129. Ржепаковский, И.В. Разработка биостимулятора эмбрионального и оценка его эффективности при иммунодефицитных состояниях у животных раннего возраста: Дисс. . канд. биол. наук / И.В. Ржепаковский. Ставрополь, 2003. - 157 с.

130. Рубан, Е.А. Оптимизация и масштабирование процессов глубинного культивирования микроорганизмов и клеток животных с использованием методов системного анализа: Дис. науч. докл. . д-ра биол. наук /

131. Е.А. Рубан // Всерос. н.-и. и технол. ин-т биол. пр-сти Деп. ветеринарии Минсельхозпрода России. М., 1995. - 56 с.

132. Рубан, Е.А. Оптимизация процессов глубинного культивирования микроорганизмов, культуры клеток и вирусов / Е.А. Рубан // Научные основы технологии пром. пр-ва вет. биол. препаратов. — Щелково, 1996. -С. 244-245.

133. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии / Под ред. Л.Б. Борисова, Б.Н. Козьмин-Соколова, И.С. Фрейдлин. М.: Медицина, 1984.-256 с.

134. Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней / Под ред. К.И. Матвеева. М.: Медицина, 1973. - 623 с.

135. Самсонова, А.П. Новый методический подход к изучению перси-стенции лептоспир при смешанных лептоспирозных инфекциях / А.П. Самсонова, Е.М. Петров, Н.В. Вышивкина, Ю.В. Ананьина // Микробиол. 2003. - №4. - С. 37-39.

136. Саяпина, Л.В. Новые питательные среды и иммунобиологические препараты для диагностики возбудителей особо опасных инфекций / Л.В. Саяпина и др. // Микробиол. 2002. - №6. - С. 73-75.

137. Светлакова, Е.В. Совершенствование способов повышения выживаемости микробных клеток в сухих живых вакцинах и пробиотиках: Дисс. канд. биол. наук / Е.В. Светлакова. Ставрополь, 2003. - 165 с.

138. Семенов, С.М. Пептоны, используемые в микробиологии (Использование в качестве компонентов питательных сред) / С.М. Семенов. М., 1988.-33 с.

139. Скичко, Н.Д. Гидролизаты животных белков основа питательных сред для промышленного производства биопрепаратов: Дис . д-ра биол. наук / Н.Д. Скичко. - М., 1992. - 49 с.

140. Славин, У. Атомно-адсорбционная спектроскопия / У. Славин. Л.: Химия, 1971.-296 с.

141. Сохин, A.M. О потреблении различных аминокислот энтеробакте-риями / A.M. Сохин, М.О. Биргер // Биохимия микробов. Горький, 1964.-С. 316-326.

142. Сохина, A.M. О потреблении различных аминокислот энтеробакте-риями / A.M. Сохина, М.О. Биргер // Биохимия микробов. Горький, 1964.-С. 316-326.

143. Сохина, A.M. Потребление аминокислот микробами семейства кишечных / A.M. Сохина, М.О. Биргер // ЖМЭИ. 1961. - С. 81-87.

144. Сохина, М.О. Потребление аминокислот микробами семейства кишечных/A.M. Сохина, М.О. Биргер //ЖМЭИ. 1961. - С. 81-87.

145. Таран, Т.В. Досвщ використання сереловища inia для культивування лептосшр / Т.В. Таран // BicH. аграр. науки. 1999. - №10. - С. 76-77.

146. Тартаковский, И.С. Листерии в инфекционной патологии человека -современная концепция / И.С. Тартаковский, В.В. Малеев, С.А. Ермолаева // ЗниСо, 1994. №3. - С. 1-4.

147. Тартаковский, И.С. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика / И.С. Тартаковский, В.В. Малеев, С.А. Ермолаева. — М.: Медицина для всех, 2002. 200 с.

148. Телишевская, Л.Я. Разработка методов изготовления гидролизатов для питательных сред / Л.Я. Телишевская, С.П. Сергеева // Аграр. наука, 2000.-№Ю.-С. 22-23.

149. Теппер, Е.З. Практикум по микробиологии: Учебное пособие для вузов / Е.З. Теппер, В.К. Шильникова, Г.И. Переверзева // Под ред. В.К. Шильниковой. М: Дрофа, 2004. - 256 с.

150. Тихонов, И.В. Основы биотехнологических процессов: Учеб.-метод. пособие по биотехнологии / И.В. Тихонов и др. // Часть 2. Промышленное культивирование микроорганизмов. / МГАВМиБ им. К.И. Скрябина.-М., 2000.-51 с.

151. Тогунова, А.И. Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней / А.И. Тогунова // Под редакцией К.И. Матвеева. М.: Медицина, 1973. - С. 239-270.

152. Третьяков, Н.П. Инкубация с основами эмбриологии / Н.П. Третьяков, Г.С. Крок.-М.: Колос, 1968.-301 с.

153. Триполитова, А.Б. Листериоз / А.Б. Триполитова, Г.В. Борисова. -Томск, 1965.-178 с.

154. Трифонова, А.А. Сравнительное изучение некоторых стимуляторов роста чумного микроба / А.А. Трифонова // Тр. института «Микроб» Саратов, 1960. Вып.4. - С. 162-167.

155. Трифонова, А.А., Питательная среда из кровяных сгустков для культивирования чумного микроба / А.А. Трифонова, А.В. Тереножкина // Микробиология и иммунология особо опасных инфекций. Саратов, 1964. - С. 287-290.

156. Трускова, Т.Ю. Живильш середовища на основ1 пдрол1зату з некондицшного м'яса сшьськогосподарських тварин / Т.Ю. Трускова, В.В. Клприч, // Вет. медицина. / 1н-т експерим. i юпшч. вет. медицини УААН, 2000. Вип. 78. - Т.1. - С. 287-291.

157. Тутов, И.К. Испытание новой питательной среды из органов лимфо-идной системы / И.К. Тутов, В.А. Кравцов // Диагностика, лечение и профилактика заболеваний с.-х. животных. Ставрополь, 2001. - С. 3132.

158. Тутов, И.К. Основы биотехнологии ветеринарных препаратов: Учеб. пособие для студ. высш. учебн. завед. по специальности 310800 «Ветеринария» / И.К. Тутов, В.И. Ситьков. Ставрополь, 1997. - 253 с.

159. Тутов, И.К. Перспективы использования стимулятора роста микроорганизмов ТС-1 в биологической промышленности / И.К. Тутов и др. // Вестник ветеринарии. 1996. - №2. - С. 78-83.

160. Физиология и биохимия микроорганизмов (бактерий): Медицинская микробиол., вирусол., иммунол.: Учебник / Под ред. Л.Б. Борисова, A.M. Смирновой. М., 1994. - С. 44-56.

161. Филатов, В.П. Тканевая терапия / В.П. Филатов. М.: Знание, 1955. -180 с.

162. Филиппов, А.Ф. Выращивание культур чумного микроба на средах из аутолизатов рыбы / А.Ф. Филиппов, Т.В. Кондрашкова, Н.К. Муравьева, Л.П. Павлова, Н.Н. Огарев // Проблемы особо опасных инфекций. -Саратов, 1973. Вып.6(34). - С. 74- 77.

163. Филиппов, А.Ф. Свойства культур чумного микроба, выращенных на средах из аутолизатов рыбы / А.Ф. Филиппов, Т.В. Кондрашкова, Н.К. Муравьева, Л.П. Павлова, Н.Н. Огарев // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1974. - Вып. 3 (37). - С. 62-66.

164. Фролов, И.Ю. Биологические проблемы нетрадиционных способов инкубации яиц и терапии цитомединами молодняка птиц и животных / И.Ю. Фролов. Волгоград: ПО «Полиграфист» Волгоградинформпе-чать, 1993. - С. 69.

165. Хозова, И.А. Влияние некоторых витаминов на рост чумного микроба / И.А. Хозова, Л.С. Кузнецова // Иммунология, биохимия, патогенез. Саратов, 1978. - Вып. 3 (61). - С. 70-71.

166. Черкес, Ф.К. Руководство к практическим занятиям по микробиологическим исследованиям / Ф.К. Черкес. М.: Медицина, 1974. - 221 с.

167. Шилов, П.И. Основы клинической витаминологии / П.И. Шилов, Т.Н. Яковлев. Ленинград: Медицина, 1974. - 342 с.

168. Шишов, С.В. Питательная среда для культивирования бактерий рожи свиней / С.В. Шишов, Б.А. Никаноров, Н.И. Передереев // Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности. / Экспресс-информация. М., 1981.-№3.-С. 10-14.

169. Шпилевая, Э.Г. Культивирование чумного микроба на средах из непищевого сырья в производственных условиях / Э.Г. Шпилевая, А.И. Тинкер, М.Н. Гончарова, И.Ф. Таран. Ставрополь, 1993. - 155 с.

170. Шунаев, В.В. К вопросу о росте В. pestis на крови животных, имеющих видовой иммунитет к чуме / В.В. Шунаев // Изв. Иркутского гос. н.-и. противочумного института Сибири и Дальнего Востока. 1935. -Т.2.-С. 12-14.

171. Ярцев, М.Я. Показатели роста микроорганизмов в управляемых процессах культивирования / М.Я. Ярцев // Ветеринария. 2000. - №4. - С. 25-28.

172. Ярцев, М.Я. Технология промышленного производства бактериальных вакцин / М.Я. Ярцев и соавт. // Ветеринария. 1998. - №3. - С. 2224.

173. Achorn, G.B. A method for the aeration of liquid culnures of microorganisms / G.B. Achorn, J.L. Schwab. Science, 1948. - V. 107. - P. 337.

174. Brison, J. Action de cations Ca et Mg sur la croissanse de quelques bac-teriens halophiles d' origine marine / J. Brison, H. Vargues // Ann. Inst. Past., 1963.-Vol. 105.-№3.-P. 580-596.

175. Brok, I. Effect of magnesium ion deficiency on Escherichia coli and possible relation to the mode of action of novobiocin / I. Brok // J. Bact. 1962. -Vol. 84.-№4.-P. 679-682.

176. Brownlow, W.J. Nutrition of Pasteurella pestis in chemically defined media at temperatures of 36 to 38° С / W.J. Brownlow, G.E. Wessman // J.Bacteriology. 1960. - V.79. - № 1. - P. 299-304.

177. Brubaker, R.R. The effect of Ca++ and Mg++ on lysis growth and production of virulence antigens by P. pestis / R.R. Brubaker, M.L. Surgalla // J. Infect. Dis. 1964. - V.l 14.-P. 13-25.

178. Charnetzky, W.T. RNA synthesis in Jersinia pestis during growth restriction in calcium deficient medium / W.T. Charnetzky, R.R. Brubaker // J. Bacterid. 1982. - Vol.149. - № 3. - P. 1089-1095.

179. Corrigan, P.J. Pesticide residues in Australian meat / P.J. Corrigan, P. Se-neviratna // Veter. Rec. 1989. - T.125. - №8. - P. 181-184.

180. Davis, B.D. The binding of fatty acids by serum albumin, a protective growth factor in bacteriological media / B.D. Davis, R.J. Dubos // J. exp. Med. 1947.-P. 86

181. Dimova, E. Enzyme peptone for microbiological purposes, obtained from extracted calf skin / E. Dimova, S. Nikolova, A. Gousterova, P. Nedkov // Biotechnol. biotechnol. Equipm., 2001. -T.15. -N.l. P. 99-102.

182. Doudoroff, M. Studies on the nutrition and metabolizm of Pasteurells pes-tis / M. Doudoroff// Pros. Soc. exp. Biol., 1943. Vol. 53. - P. 73-75.

183. Duszkiewicz-Reinhard, W. Badania microbiologiczne preparatow bi-alkowych z fasoli w ukladach modelowych oraz w polaczeniu z meisem / W. Duszkiewicz-Reinhard. Warszawa; Wydaw. SGGW, 1992. - 59 c.

184. Faine, S. Guidelines for the control of Leptospirosis / S. Faine // W.H.O. -Geneva, 1982.-P. 170.

185. Farber, J.M. Listeria monocytogenes, a food-borne patyhogen / J.M. Far-ber, P.I. Peterkin // Microbiol. Rev., 1991. №55. - P. 476-511.

186. Foster, I.W. Chemical activities of fungi / I.W. Foster. New York, 1949. -198 p.

187. Gellin, B.G. Listeriosis / B.G. Gellin, C.V. Broome. JAMA, 1989. -261.-P. 1313-1320.

188. Glass, V. The effect of various forms of particulate carbon on the growth of the gonococcus and meningococcus / V. Glass, S.J. Kennett // J. Path. Bact. 1939.-P. 49.

189. Haines, R.B. The proteolytic enzymes of microorganisms / R.B. Haines // Biol. Rev., 1933.-№9.-P. 235-261.

190. Hayaski, К. Bacteriolytic enzyme produced by streptomyces sp / K. Ha-yaski, A. Seino, T. Kasumi // J. Ferment Techno. 1981. - Vol.59.-N 4. - P. 319-323.

191. Hemert, P. Progress in indust / P. Hemert // Microbiol., 1974. 213 p.

192. Higuchi, K. Studies on the nutrition and physiology of Pasteurella pestis. 1. A casein hydrolyzate medium for the growth of Pasteurella pestis / K. Higuchi, C.E. Carlin//J. Bacteriol. 1957.-Vol. 73.-P. 122-129.

193. Higuchi, K. Studies on the nutrition and physiology Pasteurella pestis. 3. Effects of Calcium ions on the growth of virulent and avirulent strains of Pasteurella pestis / K. Higuchi, L. Kupferberg, J. Smith // J. Bacteriol. 1959. -Vol. 77.-317 p.

194. Higuchi, K., Kupferberg L., Smith J. Studies on the nutrition and physiology Pasteurella pestis. 3. Effects of Calcium ions on the growth of virulent and avirulent strains of Pasteurella pestis / J. Bacteriol. 1959. - Vol. 77. - P. 317.

195. Lichstein, H.C. Microbial nutrition / H.C. Lichstein // Annu. Rev. Microbiol., 1960.-V. 21.-P. 14.

196. Lindsay, D.G. Monitoring and testing for residues of therapeutics in meat. / D.G. Lindsay // Veter. Rec., 1983. Т. 112. - № 20. - P. 469-471.

197. Yebin, Liu The study on lactose promoting Escherichia coli multiplication / Liu Yebin et all. // Acta veter. zootechn. Sinica, 1999. Vol.30. - N.3. - P. 235-237.

198. Yebin, Liu The study on lactose promoting Escherichia coli multiplication / Liu Yebin, Zhang Guoxiang, Wang Jinyu, Dou Yougxi, Zhang Wenlong // Acta veter. zootechn. Sinica, 1999. Vol.30. - № 3. - P. 235-237.

199. Macfarlane, D.E. Improved media for the culture of Neisseria gonorrho-cea / D.E. Macfarlane, Т.Е. Elian-Jones // J. Microbiol., 1980. Vol. 13. -№4. - P. 595-607.

200. Neilands, J.B. Some aspects of iron metabolism / J.B. Neilands // Bacterial. Rev., 1957. №21. - P. 101-111.

201. Nieman, С. Influence of trace amounts of fatty acids on the growth of microorganisms / C. Nieman // Bact. Rev., 1954. P. 18-20.

202. Pirt, S. Y. Principles of Mikrobe and Cell Cultivation / S.Y. Pirt. 1975. -321 p.

203. Pollock, M.R. Unsaturated fatty acids in cotton wool plugs / M.R. Pollock //Nature. -Lond., 1948.-P. 161-165.

204. Porter, J.R. Bacteriol. chemistry and physiology / J.R. Porter // Ed. 11. -NV.London: Ed. J .Willey, A.Chorman, 1954. P. 1073.

205. Rao, M. Further studies on the nutrition of the plague bacillus: the role of haemation and other compounds / M. Rao // J. Med. Res. 1940. - Vol. 27. -P. 833.

206. Rice, D.N. Nebraska residue avoidance program report reducing residues in meat and milk / D.N. Rice, S. Wallen, D. Nitzel // Proceedings, 1984. P. 116-120.

207. Rowley, D. Interrelationships between amino-acids in the growth of coli-form organisms / D.J. Rowley // Gen. Microbiol. 1953. - N. 9. - P. 37.

208. Scott, T.A. The Conversion of Formyl-L-Aspartate into Nicotinic Acid by Extracts of Clostridium butylicum / T.A. Scott, M. Bellion // Europ. J. Bio-chem.- 1969.-Vol. 10. P. 318-323.

209. Seeliger, H.P.R. Listeriosen / H.P.R. Seeliger. Springer-Verlag KG, Berlin, 1958.-251 p.

210. Venant, A. Emploi actuel des pesticides organochlores en France. Toxic-ite-residus dans les denrees alimentaires d"origine animale / A. Venant, L. Richou-Bac.// Bull. Soc Veter. Prat. Fr., 1984. - T. 68. - № 1. - P. 31 -59.

211. Vrana, D. Exp Cell / D. Vrana et all // Res., 1982. 138 p.

212. Waguespack, M. Eliminating residue in «Bob» veal calves / M. Wa-guespack // Anim. Health Nutrit, 1986. T.41. - №6. - P. 28-30.

213. Waring, W.S. Iron deficience in bacterial metabolism / W.S. Waring, C.H. Werkman // Arch. Biochem., 1944. №4. - P. 75-87.

214. Waring, W.S. Iron requirements of heterotrophic bacteria / W.S. Waring, C.H. Werkman // Arch. Biochem., 1943. -№1.-P. 425-433.

215. Wren, M.W.D. An improved cooked meat medium for the growth of anaerobic bacteria / M.W.D. Wren // Med. Lab. Sci., 1979. Vol.36. - № 2. - P. 197-199.

216. Wright, H.D. A substance in cotton wool inhibitory to the growth of the pneumococcus / H.D. Wright // J. Path. Bact. 1934. - P. 38.

Информация о работе

Панова, Наталья Викторовна
кандидата биологических наук
Ставрополь, 2006
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка нового стимулятора роста микроорганизмов и изучение его влияния на их биологические свойства на примере некоторых вакцинных штаммов бактерий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы