Разработка методических подходов для специфической индикации и идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза с помощью полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией

Зинченко, Ольга Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка методических подходов для специфической индикации и идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза с помощью полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка методических подходов для специфической индикации и идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза с помощью полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией"

На правах рукописи

ЗИНЧЕНКО Ольга Викторовна

РАЗРАБОТКА МЕТОДИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ИНДИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА И МЕЛИОИДОЗА С ПОМОЩЬЮ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ РЕЗУЛЬТАТОВ

03.02.03 - микробиология

Автореферат

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Волгоград-2010

003494493

Работа выполнена в ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук, доцент Антонов Валерий Алексеевич

Офншшльпые оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Шуб Геннадий Маркович кандидат биологических наук Осина Наталия Александровна

Ведущая организации:

Федеральное государственное учреждение «48 Центральный научно-исследовательский институт Минобороны РФ»

Защита состоится «20» апреля 2010 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ Рос-НИПЧИ «Микроб».

Автореферат разослан «19» марта 2010 г.

Ученый секретарь лпссертанпоипого совета

доктор биологических наук,

старшин научный сотрудник A.A. Слудский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Патогенные буркхольдерии - В. mallei и B.pseudomallei относят к возбудителям особо опасных инфекционных заболеваний, а также к потенциальным агентам биотерроризма группы В [А.А.Воробьев, 2001; В.В. Алексеев, 2003; J.M. Rusnak, 2004]. Угроза возникновения террористических актов, чрезвычайных ситуаций в результате техногенных катастроф, а также возможность завоза в Россию инфекций из эндемичных территорий путем миграции населения, ввоза больных животных, почвы, пищевых продуктов, контаминированных патогенными буркхольдериями [В.И. Илюхин, 1999] диктует необходимость разработки высокочувствительных методов специфической индикации и ускоренной идентификации этих возбудителей.

В последнее время для специфической индикации и ускоренной идентификации возбудителей инфекционных заболеваний все более активно используют молекулярно-генетические-подходы, позволяющие выявлять определенные участки генома микроорганизмов. Зарубежными и отечественными исследователями опубликованы данные о конструировании различных праймеров для идентификации патогенных буркхольдерии. В качестве ДНК мишеней были рекомендованы гены J6S рРНК [Т. Dharakul et al., 1996], 23S рРПК[А. Е. Lew et al., 1994], спейсерные области 16-23S рРНК[М. Kunakom et al., 1995], кластер генов LPS, кодирующий капсульный липополисахарид [А. Rattanathongkom et al., 1997], гены системы Ш-типа секреции (TTSI) [C.Winstanley et al., 2000; L. Rainbow et al., 2002], флагеллярный ген [P. Sonthayanon et al., 2002]. В большинстве работ использовался ПЦР-анализ с электрофоретической детекцией. \

Г:>

Применение классической полимеразной цепной реакции на этапе детекции предусматривает использование электрофоретического оборудования, что создает определенные трудности при идентификации микроорганизмов: возможность перекрестной контаминации реакционных смесей специфическими ампликонами и получение ложноположительных результатов, трудоемкость, продолжительность этапа электрофореза, необходимость дополнительного помещения и выполнение ПЦР силами нескольких сотрудников.

Использование реакции амплификации с флуоресцентной детекцией специфических ампликонов позволяет избавиться от вышеперечисленных недостатков [S. Tyagi et al., 1996]. Флуоресцентные технологии отличает безопасность и высокая чувствительность, благодаря чему они приобрели широкое распространение [R. Higuchi, 1993; J.L. Versage, 2003; Е. М. Fykse et al., 2007].

Детекция в режиме реального времени позволяет наглядно отображать этапы ПЦР и количественно оценивать продукты реакции [С.А. Heid, 1996]. Кроме того, регистрация прибором флуоресценции разной длины волны позволяет применять ДНК внутреннего контроля для подтверждения достоверности отрицательных результатов.

Данный метод обнаружения возбудителей ООН отличает высокая чувствительность, специфичность, быстрота получения результатов, возможность автоматизации при минимальном объеме исследуемого материала.

Снижение требований к организации ПЦР-лабораторий, а также способность выполнения ПЦР-анализа силами одного сотрудника позволяет использовать такие амплификационные тест-системы в условиях автономной мобильной ПЦР-лаборатории.

Цель работы: конструирование специфичных флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов и разработка методических подходов для специфи-

ческой индикации и ускоренной идентификации патогенных буркхольдерий с помощью ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов.

Задачи исследования:

1. Подобрать специфичные праймеры и олигонуклеотидные зонды на основе нуклеотидных последовательностей генов 23S рРНК, III типа секреции (TTS I) и флагеллярного гена fliC для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза.

2. Определить основные параметры ПЦР, обеспечивающие высокую чувствительность и специфичность выбранных праймеров и олигонуклеотид-ных зондов, на широком наборе гомологичных и гетерологичных видов микроорганизмов. Оптимизировать условия проведения ПЦР на приборах с детекцией «по конечной точке» и в режиме реального времени для выявления патогенных буркхольдерий.

3. Провести анализ различных способов очистки и выделения ДНК патогенных буркхольдерий из биологического материала и объектов окружающей среды для исследования методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов.

4. Оценить возможность использования магноиммуносорбентов на этапе подготовки проб из объектов окружающей среды и пищевых продуктов для исследования методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов на наличие ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза.

5. Оценить эффективность применения сконструированных праймеров и зондов для ускоренной идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза при экспериментальной инфекции.

Научная новизна. Для идентификации патогенных буркхольдерий впервые сконструированы олигонуклеотидные флуоресцентно-меченые зонды, являющиеся фрагментами генов 23S рРНК, 111 типа секреции (7T.S7) и флагел-

лярного гена /НС, на основе которых возможна разработка амплификационных тест-систем для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза с регистрацией результатов амплификации «по конечной точке» и в режиме реального времени.

Определена высокая эффективность использования ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов как при идентификации чистых культур патогенных буркхольдерий, так и при выявлении ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза в пробах из объектов внешней среды, в пищевых продуктах, искусственно контаминированных В. таНсп и В. рхсш1ота11сп, а также в биологическом материале от экспериментально зараженных животных.

Впервые проведен сравнительный анализ эффективности олигонуклео-тидных праймеров й флуоресцентных зондов с учетом результатов амплификации как «по конечной точке», так и в режиме реального времени для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза. Показано, что ПЦР в режиме реального времени, в отличие от флуоресцентной детекции «по конечной точке», позволяет не только наглядно отображать этапы ПЦР, но и количественно оценивать продукты реакции при выявлении ДНК патогенных буркхольдерий.

Предложены эффективные способы подготовки проб различного характера, инфицированных патогенными буркхольдериями, для анализа методом ПЦР. Впервые представлены доказательства использования магноиммуносор-бентбв (МИС) с целью селективного концентрирования клеток возбудителей сапа и мелиоидоза на этапе пробоподготовки и очистки ДНК от примесей веществ, ингибирующих ПЦР.

Показана возможность использования олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов для конструирования амплификационных тест-систем с целью выявления патогенных буркхольдерий в условиях работы передвижной автономной ПЦР-лаборатории.

Практическая ценность. В результате проведенных исследований созданы экспериментальные серии тест-систем для ускоренной идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза в биологическом материале и объектах окружающей среды методом ПЦР с флуоресцентной детекцией.

По результатам работы составлены методические рекомендации, утвержденные директором ВолгоградНИПЧИ (протокол № 10 от 26.12.07 г.), по использованию ПЦР с флуоресцентной детекцией для идентификации B.mallei и В. pseudomallei, выявления возбудителей сапа и мелиоидоза в пробах из объектов внешней среды и пищевых продуктов, контаминированных патогенными буркхольдериями, а также при различных экспериментальных формах сапа и мелиоидоза.

Показано, что разработанные олигонуклеотиды в составе диагностических тест-систем, могут быть использованы для исследования проб из объектов внешней среды, пищевых продуктов и биологического материала, подозрительных на контаминацию В. mallei и В. pseudomallei, как в стационарной специализированной лаборатории, так и в условиях передвижной автономной ПЦР-лаборатории.

По результатам работы проведены межведомственные комиссионные испытания в соответствии с Программой, согласованной с генеральным директором ЗАО НПФ «ДНК-технология» Д.Ю. Трофимовым и утвержденной директором Волгоградского научно-исследовательского противочумного института В.В. Алексеевым и генеральным директором ООО «РБ-спектр» A.A. Семеню-ком 16.01.2008 года.

Материалы диссертационной работы используются сотрудниками института в рамках учебных программ по первичной специализации и переподготовке специалистов: Программы курсов повышения квалификации бактериологов и эпидемиологов по противодействию биотерроризму, утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 01.02.2001 г., Программы курсов повышения квалификации врачей - бактерио-

логов общей медицинской сети, центров Госсанэпиднадзора и противочумных учреждений по специфической индикации и лабораторной диагностике особо опасных инфекций, санитарной охране территории и противоэпидемической защите населения, утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 28.09.1999 г., а также Программы курсов повышения квалификации медицинских работников (с высшим и средним специальным образованием) санитарно-карантинных пунктов и отделов (СКП и СКО), утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко. Кроме того, материалы настоящей работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий для студентов медико-биологического факультета Волгоградского государственного медицинского университета.

Положения, выносимые на защиту:

1. Системы олигонуклеотидов, сконструированные на основе участков генов 23S рибосомальной РНК, orfl3 из кластера генов (К типа секреции (7757) и флагеллярного гена /7/С, включающие прямые, обратные праймеры и гибридизационные зонды, меченые флуорофорами, обеспечивают как специфическую амплификацию фрагментов ДНК, так и регистрацию результатов реакции по повышению уровня флуоресценции.

2. Гибридизационно-флуоресцентные олигонуклеотидные зонды трех ДНК-мишеней - участков генов 23S рРНК, JHC и orfli увеличивают специфичность реакции амплификации и повышают достоверность результатов при индикации н идентификации В. mallei и В. pseudomallei.

3. Системы олигонуклеотидов, разработанные для обнаружения генов 23S рРIIК, orf!3 и флагеллярного гена Дг'С, позволяют идентифицировать чистые культуры патогенных буркхольдерий при их концентрации 1 х 101 м.к./мл в условиях гибридизационно-флуоресцентной детекции «по конечной точке» и 1 х 102 м.к./мл с детекцией в режиме реального времени.

4. Олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные зонды пригодны для специфической индикации возбудителей сапа и мелиоидоза при исследовании проб из объектов окружающей среды, пищевых продуктов, искусственно контаминированных В. mallei и В. pseudomallei, а также биологического материала, полученного от экспериментально зараженных животных.

5. Использование магноиммуносорбентов на этапе подготовки проб из объектов окружающей среды и пищевых продуктов для исследования методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов обеспечивает выявление ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза при их концентрации не менее 1 х 10г м.к./мл (г).

Апробация работы

участников Содружества Независимых Государств» (Оболенск, 2006); XI Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2006), IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии Борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007), V международном конгрессе по мелиоидозу (Thailand, 2007), IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества Независимых Государств» (Волгоград, 2008), 66-й юбилейной научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2008), а также на ежегодных итоговых научных конференциях Волгоградского НИПЧИ.

Публикации

I lo теме диссертации опубликовано 15 научных работ, из них 3 - в рецензируемых периодических изданиях, рекомендованных ВАК для защиты докторских и кандидатских диссертаций, 3 - в зарубежной печати.

Структура н объем диссертации

Диссертация изложена на 136 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 6-ти глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 283 работы, в том числе 38 отечественных и 245 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 16 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

В качестве исследуемого материала использовали бактериальные взвеси чистых культур микроорганизмов, пробы почвы и пищевых продуктов, искусственно контаминированные штаммами В. pseudomallei и В. mallei, и биологический материал от лабораторных животных, экспериментально зараженных возбудителями сапа и мелиоидоза.

Работа выполнена на 98 штаммах, из них - 43 штамма В. pseudomallei, 14 штаммов В. mallei, 10 штаммов Burkholderia cepacia, 5 штаммов Burkholderia thailandensis, 2 штамма Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, по 1 штамму Brucella abortus, Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella ovis, Francisella tularemis, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica, Vibrio cholcrac, Bacillus anthracis, Shigella flexneri, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Stenotrophomonas maltophilia, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Sahnonella enteritidis, Shigella zonne, Shigella flexneri, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris.

Моделирование экспериментальной инфекции осуществляли на золотистых хомячках внутрибрюшинным заражением штаммами В. pseudomallei 100 и В. mallei 10230. Кусочки внутренних органов (легких, печени, селезенки) и кровь исследовали в ПЦР. Одновременно эти же образцы методом отпечатков высевали на питательные среды.

Экстракцию и очистку ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза в экспериментальном клиническом материале проводили с помощью коммерческого набора «ДНК-экспресс» (НПФ «Литех», Москва) и методом нуклеосорбции в присутствии гуанидинтиоцианата по методике, предложенной R. Boom [R. Boom et al., 1990], с дополнительной отмывкой ацетоном.

Для выделения и очистки ДНК из объектов окружающей среды, искусственно контаминированных патогенными буркхольдериями, использовали метод

нуклеосорбции на силикагеле в присутствии гуанидинтиоционата [R. Boom et al., 1990], метод гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформной депротеинизации с последующей очисткой ДНК нуклеосорбцией [Г.А. Ткаченко с соавт., 2007] и коммерческий набор «ДНК-экспресс» (НПФ «Литех», Москва). Для концентрирования микроорганизмов и очистки проб почвы и пищевых продуктов от примесей, ингибирующих ПЦР, использовали магноиммуносорбенты (МИС).

Подбор праймеров и олигонуклеотидных зондов проведены совместно с сотрудниками НПФ «ДНК-технология», г. Москва. Олигонуклеотидные праймеры синтезировали фосфоамидитным методом на автоматическом синтезаторе ДНК «АСМ-102 У» (АОЗТ «Биосан», г. Новосибирск).

В работе использовали ПЦР-буфер и Taç-полимеразу производства ФГУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, г. Москва.

Все манипуляции при постановке реакции амплификации проводили в соответствии с МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами 1-11 групп патогенности» (2003 г).

Реакцию амплификации и анализ продуктов ПЦР осуществляли на программируемом термоциклере «Терцик» (ЗАО «НПФ ДНК-технология», г. Москва) и детекторе флуоресценции «Gene» (ЗАО «НПФ ДНК-технология», г. Москва) «по конечной точке» и в режиме реального времени - «Rotor-Gene 6000» («Corbctt Rcscarch», Австралия) и «SmartCycler» («Cephcid», США) в объеме 25 мкл с использованием «горячего старта». Наличие специфического ампликона определяли методом гель-электрофореза в 1,5% агарозном геле с окраской фрагментов ДНК этидиум бромидом и визуализацией в УФ-свете.

Для проведения статистической обработки результатов использовали пакет прикладных программ STAT1STICA 6.0 (StatSoft Inc.,США)

Результаты исследований

Для идентификации В. mallei и В. pseudomallei в качестве ДНК-мишеней были выбраны участки гена 23S рРНК, гена orfI3 из кластера генов III типа секреции (TTSI) и флагеллярного гена fliC, исследуемых микроорганизмов. С помощью компьютерного анализа (программы Gene Runner 3.0 и Oligo 4.0) были проанализированы несколько пар праймеров и олигонуклеотидные зонды. Праймеры к гену 23S рРНК и флагеллярному гену fliC были сконструированы ранее сотрудниками Волгоградского НИПЧИ [В.А. Антонов, 2004; В.В. Алтухова, 2005]. Ген orf¡3 послужил основой для создания оригинальных праймеров. Флуоресцентно-меченые зонды, представляющие собой вариант «молекулярных маячков», получены нами на основе консервативных последовательностей амплифицируемых участков данных генов. Сконструированные праймеры и зонды являлись группоспецифичными и детектировали возбудителей сапа и мелиоидоза.

Нуклеотидные последовательности выбранных праймеров и зондов представлены в таблице 1. Размер фланкируемого фрагмента ДНК для праймеров b23s7/b23a7 составлял 243 п.н., для Ь23з7/Ь23а8 - 266 п.н., для b23s7/b23a9 - 313 п.н., для ВTTS-s 1/ВTTS-as3 - 162 п.н., а для bfl-ls/bß-2a - 376 п.н. В рамках совместной НИР с ЗАО НПФ «ДНК-технология» сконструирован внутренний контроль, который использовали для всех амплификационных реакций. Размер ампликона внутреннего контроля составлял 560 п.н. При использовании программ Gene Runner и BLAST была проанализирована структура выбранных зондов и пар праймеров и показана теоретическая пригодность олигонуклео-тидных затравок для успешной инициации реакции амплификации.

В серии экспериментов с ДНК патогенных буркхольдерий и гетерологич-ных микроорганизмов подобраны оптимальные параметры постановки реакции амплификации (температура отжига, количество циклов, реакционный буфер, концентрация флуоресцентного зонда).

Таблица 1. Последовательности олигонуклеотидных праймеров и зондов и размер специфических ампликонов

Праммеры п ДНК-юпды Нуклеотилные последовательное! и иршшерои н ДНК-чоидоп Размер амшшкеша

Ген 23Яр1>11К

Ь23х7 Ь23а7 Ьигк23_/1р ост о< о (, \1 ссс аос тле тог ССА ОСА ЛТЛ ТТО АСС ТСС ТТС ССА (ГАМ)-ОСС' ТСС СТО АСТ ССС ССС СТА АСС ССА ООС-(В1К)1) 243 п.н.

Ь23х7 1)23«$ Ьшк23 _///; ОСТ ССС СЛТ ССС лее тле тот ССС ССА ТСС. СЛТ СТА ЛСО АС (ГЛМ)-ССС ТСС С ГС ЛОТ ССС ССС СТА лее сел еесчвно!) 266 п.и.

1)23.^7 Ь23п9 Ыик23 _///> ест ссс елт ссс лее тле тст ОСА ССС АСС ССС АСТ ТСС ААС (глм)-ссс тсс стс лот ссс ссс ста лес со а ССС-(ВН01) 313 п.и.

Ь23х7 Ь23п8 1>Г-23Я-1 ее г ссс елт ссс лес тле тст ССС ССА ТОО СА Г СТА АСС АС (1;лм)-ссс тсс ете лот сео ссс ста лее сел сес-опу!) 266 п.и.

Ген ¡»-рз

ПТТЬ-х! Н'ПЪ'-ихЗ И П 5-/1 еле тол ссс; ссс тс:а ало ссс; ТСС ССС СТО ЛСД ААС ОТТ ТСО (ГЛМ)-ССС ОСА ССС ССА СТО АТС АСС О АС ССС сс;-(вндо 162 11.11.

ЯШл/ В Ш-ахЗ />/ / /.V / (¡АС ТОЛ ССС ССС тел АЛО ССС ТСС" ССС СТО ЛСД ЛЛС 01 1 1 со (ГАМ)-ССС ОСА ССС ССА ОТО АТС ЛОС СЛС ССС СО-(КТ01) 162 п.и.

Геи [НС

Ь/!-2п лее стс тсс стс олс стс лс сот гол тст ССС САД сел тс (КЛМ)-СОС ТОТ СОЛ ПТ ССС САД С'СА ОСО -(1Ш}1) 376 11.11.

/>11-/х 1>]1-2а Р[-В]1-2 АС С! (¡ТС ТСС С ГС ОЛС СТС ЛС СО Г ГОЛ ТСТ ОСО САЛ ССА ТС (Г'лм)-ссс сел ссс л тс дел лсл лес лос со-(КТ01) 376 11.11.

В состав реакционных смесей входили комплементарные специфическому фрагменту и внутреннему контролю олигонуклеотидные зонды в концентрации 6 пМ, меченые флуорофором ИАМ и гасителем флуоресценции (ГИ<31, ВИС?1), а также по 12 пМ праймеров, 0,2 мМ каждого дНТФ, буферный раствор, фермент 7>/<7-полимераза и 3 мМ МцС12. Для предупреждения испарения в процессе амплификации на мультициклере «Терцик» на поверхность

:меси наслаивали 20 мкл минерального масла. В ПЦР с детекцией «по конечной точке» использовали 5 мкл образца, с детекцией в режиме реального зремени - 10 мкл. Программы термоциклирования реакционных смесей оптимизированы для приборов «Терцик», «Rotor-Gene 6000», «SmartCycIcr» табл. 2).

Таблица 2. Программы термоциклирования для обнаружения генов 23S iPHK, orflí.jliC.

Номер этапа «Терцик» «Rotor-Gene 6000» «SmartCycIcr»

Температура, С Время Количество циклов Температура, С Время Количество циклов Температура, 'с Время Количество циклов

23SpPHK

1 95,0 ! 5 мин 1 95,0 15 мни | 1 ! 95,0 15 мин j 1

2 95,0 67,0 5 сек 15 сек 5 95,0 67,0 20 сек ! _ ¡ 95.0 60 сек | ¡ 67,0* ^сек i 10 30 сек |

3 95,0 67.0 1 сек 15 сек 40 95.0 64,0* 20 сек I ^ 60 сск ¡ 95,0 64,0* 20 сек | г 30 сек ¡

oif/3

1 95,0 15 мин 1 95,0 15 мил 1 95.0 15 мин 1 '

2 95,0 64,0 67,0 5 сск 5 сек 5 сек 5 95,0 64,0 20 сск 40 сек 10 95,0 64,0* 20 сек 30 сек 45

3 95,0 64,0 67,0 1 сек 5 сек 5 сек 40 95,0 64,0* 20 сек 40 сек 35 - - -

fliC

1 95,0 15 мин 1 j 95,0 15 мин 1 95,0 15 мин 1

2 95,0 65,0 72.0 10 сек 10 сек i 10 сск 5 Í 95,0 ! 65.0 20 сек 60 сек 10 95,0 65,0* 20 сек I 45 сек 10

3 95,0 60.0 72,0 | 10 сек i 10 сск j 10 сек 40 i 95'° ': 60,0* 1 20 сек 60 сек i 95,0 i 20 сек j „ i 60,0* i 45сек ! 1 i !

Примечание: * - регистрация результатов приданной температуре.

Для сравнения эффективности тушения флуорофора зонды с идентичной последовательностью метили гасителем ВНС>1 и ЯТС>1. Выбор гасителей был обусловлен рекомендациями компании ЗАО «Синтол» (г. Москва). Результаты исследования показали, что чувствительность ПЦР с использованием зонда Ьигк23_? 1р, меченного гасителем ВНр1. на амплификаторе «Терцик» оказалась

на порядок ниже чувствительности ПЦР с зондом P/-23S-I, меченным гасителем RTQ1. Полученные данные позволили сделать выбор в пользу использования зонда, меченного гасителем RTQ1.

При проверке специфичности праймеров Ь23я7/Ь23а7, Ь23.ч7/Ь23а9, фланкирующих фрагмент гена 23S рРПК, выявлено, что они детектировали три штамма близкородственных буркхольдерий (В. cepacia 8235, 3181, 3189) в концентрации 1 х 107 м.к./мл. Полученные результаты свидетельствовали о наличии гомологичных нуклеотидных последовательностей данных микроорганизмов с ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза. Учитывая, что эти праймеры оказались неспецифичными для патогенных буркхольдерий, последующая работа с ними не проводилась. Праймеры b23s7/b23a8, BTTS-sl/BTTS-as3, bjl-ls/bjl-2a и зонды, направленные на обнаружение гена 23S pPIIK, orfl3, JliC, показали высокую специфичность в реакции амплификации (рис. 1), поэтому они были выбраны нами для разработки ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов, предназначенной для специфической индикации и ускоренной идентификации В. mallei и В. pseudomallei.

Рисунок 1. Результат ПЦР с детекцией на флуориметре «Gene» при анализе ДНК гетерологичных штаммов в концентрации 1 х 107 м.к./мл (праймеры

Ь23.ч7/Ь23а8).

При анализе результатов ПЦР в режиме реального времени выявлено, что чувствительность реакции составила I х 10! м.к./мл. Следует отметить, что при

j детекции результатов «по конечной точке» на детекторе «Gene» чувствитель-| ность реакции амплификации оказалась ниже на один-два порядка в сравнении с чувствительностью ПЦР в режиме реального времени (рис. 2).

■

I I

J OS-

! Р

í I"

I S.13'

Рисунок 2. Результат амплификации с праймерами b23s7/b23a8 и зондом Pf-23S-1 на приборе «Rotor-Gene 6000».

\ - B.pseudomaltei С141, 1 х 102м.к./мл

2 - B.pseudomallei С141, 1 х 10"' м.к./мл ,.г.|д

3 - B.pseudomnUei С141, 1 х 104 м.к./мл

А - «-» контроль

5 - «+» контроль (B.pseudomallei 136, J х !08 м.к./мл)

С целью оценки эффективности различных олигонуклеотидных систем и методов выделения ДНК, исследовали пробы из объектов внешней среды, продуктов питания и биологического материала, контаминированные В. mallei и В. pseudomaUei. В работе были использованы несколько технических подходов - метод R. Boom [R. Boom et al, 1990], гуанидинтиоцианат-фенольная экстракция с последующей очисткой нуклеосорбцией на Si02 [Г.А. Ткаченко с соавт., 2007] и набор «ДНК-экспресс» (НПФ «Литех», Москва). ;

Показано, что при выделении ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза из проб воды и жидких продуктов питания (сок, молоко) с использованием метода нуклеосорбции в присутствии гуанидинтиоцианата чувствительность ПЦР составила 1 х 103 м.к./мл, что совпадало с чувствительностью ПЦР при анализе

чистых культур микроорганизмов. При экстракции ДНК из контаминированных патогенными буркхольдериями проб воды и сока набором «ДНК-экспресс» (НПФ «Литех», Москва) чувствительность реакции амплификации составила 1 х Ю' м.к./мл, а для молока - 1 х 104м.к./мл.

Для эффективной очистки ДНК патогенных буркхольдерий из проб почвы более предпочтительным оказался метод гуанидин-фенол-хлороформной депротеинизации с последующей очисткой нуклеосорбцией на Si02, который, несмотря на многоэтапность и трудоемкость, обеспечивал получение очищенной ДНК. При его использовании чувствительность реакции амплификации составила 1 х 104м.к./мл.

Для селективного концентрирования клеток возбудителей сапа и мелиои-доза из проб почвы, а также с целью очистки ДНК от примесей веществ, ингибирующих ПЦР, и, следовательно, более эффективной пробоподготовки использовали магноиммуносорбенты (МНС). После взаимодействия МИС с анализируемыми пробами, проводили их отмывку от ингибирующих примесей и выделение ДНК методом нуклеосорбции, после чего проводили реакцию амплификации с флуоресцентной детекцией. Чувствительность реакции амплификации при этом удалось повысить с 1 х 104м.к./мл до 1 х 102м.к./мл.

Для оценки информативности реакции амплификации и эффективности различных способов выделения ДНК патогенных буркхольдерий исследовали биоптаты печени, легкого, селезенки и кровь больных животных, экспериментально зараженных И. mallei 10230 и В. pseudomallei 100. ДНК возбудителей сапа и мелиоиоза выделяли методом нуклеосорбции в присутствии гуанитин-тиоцианата с дополнительной отмывкой ацетоном, а также набором «ДНК-экспресс» (НПФ «Литех»),

В результате исследований показана эффективность использования метода нуклеосорбции при выделении ДНК патогенных буркхольдерий из крови и биоптатов зараженных животных. Так, возбудители сапа и мелиоидоза обнаруживались в печени и селезенке золотистых хомячков в 100 % случаев

при исследовании праймерами Ь23я7/Ь23а8 и Ь/1-!а/Ь(1-2а с детекцией результатов как «по конечной точке», так и в режиме реального времени. Эффективность ПЦР с праймерами ВТТЯ-х ¡/ВТТй-аяЗ оказалась ниже на 20%. В пробах крови ДНК микроорганизмов обнаруживали в 33 % случаев, что, вероятно, с одной стороны связано с ингибированием ДНК-полимеразы веществами, циркулирующими в крови (гемоглобин, иммуноглобулины, гормоны), а с другой - низким уровнем бактериемии, выходящей за пределы чувствительности реакции амплификации. Обнаружение патогенных буркхольдерий в реакции амплификации с флуоресцентной детекцией оказалось более информативным в сравнении с бактериологическим методом (р<0,05) (рис. 3). %

Ь23а8 ВТТ5-аз

ЬА-2э бактериология

□ Ь23$7/Ь23а8 Е ВТТ5-51/вт~а5 В Ы1-Ь/ЬЯ-2а И бактериология

Рисунок 3. Выявление патогенных буркхольдерий в органах и крови экспериментально зараженных животных с использованием бактериологического метода и ПЦР «по конечной точке» (выделение ДНК методом нуклео-сорбции).

При сравнении двух методов выделения ДНК из биологического материала выявлено, что метод нуклеосорбции оказался более эффективным в сравнении с термокоагуляционным методом (набор «ДНК-экспресс») (уровень достоверности различий - р<0,05).

Таким образом, в процессе данной работы для идентификации патогенных буркхольдерий сконструированы праймеры и флуоресцентные зонды для обнаружения гена 256' рРПК, гена ог/13 из кластера генов !11 типа секреции

(TTSl) и флагеллярного гена В. mallei и В. pseudomallei. Использование разработанных олигонуклеотидных затравок и зондов позволяло выявлять возбудителей сапа и мелиоидоза в концентрации 1 х 103 м.к./мл при детекции «по конечной точке» и 1 х I О2 м.к./мл - в режиме реального времени. Изучены различные способы подготовки проб, дана сравнительная оценка их эффективности при исследовании объектов внешней среды и пищевых продуктов, а также показана возможность использования магноиммуносорбентов с целью концентрирования клеток исследуемых микроорганизмов на этапе подготовки проб почвы и пищевых продуктов. Показана принципиальная возможность обнаружения возбудителей патогенных буркхольдерий в пробах биологического материала с помощью ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов.

На основании представленных данных нами предложен алгоритм генной диагностики патогенных буркхольдерий, состоящий из двух этапов, разделенных на индикацию и идентификацию патогена. Причем на каждом этапе используется свой набор олигонуклеотидов.

Разработанный алгоритм интерпретации результатов позволяет на первом этапе проводить индикацию патогенных буркольдерий в объектах внешней среды и биологическом материале с помощью праймеров b23-s7/b23-a8 и олигонуклеотидного зонда Pf-23-l. Второй этап предусматривает идентификацию штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза в реакции амплификации с праймерами и зондами для обнаружения фрагментов генов jliC и ог/13, а также подтверждение первичного положительного ответа, полученного на первом этапе.

Применение флуоресцентных систем детекции снижает риск контаминации, сокращает продолжительность и трудоемкость проведения исследований, что особенно важно в полевых условиях. По этой причине разработанные олигонуклеотидные затравки и зонды могут быть использованы для ускоренной идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза в условиях автономной мобильной ПЦР-лаборатории. Программное обеспечение позволяет быстро

оценивать и документировать результаты анализов. Мобильные ПЦР-лаборатории с таким набором диагностических тест-систем могут быть использованы как в составе специализированных противоэпидемических формирований, так и в лабораториях, осуществляющих плановый территориальный эпидемиологический мониторинг.

Выводы

1. На основе анализа геномов патогенных буркхольдерий сконструированы олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные зонды, являющиеся фрагментами гена 23S рРНК, флагеллярного гена fliC, и гена orfl3 из кластера генов III типа секреции В. mallei и В. pseudomallei и разработаны оптимальные параметры ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов синтезируемых фрагментов ДНК патогенных буркхольдерий.

2. Для индикации и идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза разработаны праймеры и флуоресцентные зонды с детекцией результатов ПЦР «по конечной точке» и в режиме реального времени, которые позволяют обнаруживать патогенные буркхольдерии с чувствительностью I х 103 и 1 х I02 м.к./мл, соответственно.

3. Проведена апробация и подтверждена диагностическая ценность, разработанных олигонуклеотидных праймеров и зондов для конструирования амплификационных тест-систем с целью обнаружения В. mallei и В. pseudomallei в объектах окружающей среды, а также диагностики экспериментального сапа и мелиоидоза.

4. Установлено, что наиболее эффективным способом очистки и экстракции ДНК из проб жидких пищевых продуктов, искусственно контаминиро-ванных патогенными буркхольдериями, является сорбция ДНК на силикагеле в присутствии гуанидинтиоцианата, а из проб почвы - метод, основанный на гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформной депротеинизации с последующей очисткой ДНК методом нуклеосорбции.

5. Показана целесообразность применения МИС с целью концентрирования патогенных буркхольдерий и очистки пробы от примесей, ингиби-рующих реакцию амплификации. Чувствительность ПЦР при этом составила 1 х 10! м.к./мл со всеми испытуемыми парами праймеров и флуоресцентными зондами.

6. Предложен алгоритм двухэтапной генной диагностики сапа и ме-лиоидоза, при котором для индикации возбудителей в нативном материале и для идентификации штаммов В. mallei и В. pseudomallei используются разные ДНК-мишени, что позволяет осуществлять подтверждение первичного положительного ответа о наличии в пробе ДНК патогенных буркхольдерий.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ткаченко Г.А., Антонов В.А. Замараев B.C., Илюхин В.И., Алексеева В.В., Зинченко О.В., Использование метода ПЦР для идентификации возбудителя мелиоидоза // Природно-очаговые особо опасные инфекции на Юге России, их профилактика и лабораторная диагностика. Сб. науч. тр. - Астрахань, 2001,- С. 328-330.

2. Tkatchenko G.A., Antonov V.A., Zamaraev V.S., Ilyukhin V.I, Alekseeva V.V., Zinchenko O.V. Detection and identification of Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei by PCR // Natural infectious diseases. Abstract of scientific conference. 6 December, 2001, Ulaanbaatar, Mongolia, 2001. - P. 68-70.

3. Ткаченко Г.А., Антонов В.А., Замараев B.C., Илюхин В.И., Алексеева В.В., Зинченко О.В. Идентификация патогенных буркхольдерий методом ПЦР // Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 26-28 марта 2002, Москва, 2002. - С. 347-348.

4. Зинченко О.В., Алтухова В.В., Замараев B.C., Голосеев Ю.А., Васильев В.П., Пивень H.H. Обнаружение возбудителя мелиоидоза методом ПЦР с использованием магноиммуносорбентов / Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях // Материалы VI Межгосударственной науч.- практ. конф. государств-участников СНГ, 13-14 сентября, 2005, Волгоград. - 2005. - С. 239-240.

5. Антонов В.А., Зинченко О.В., Лобанов А.Н., Замараев B.C., Алексеев В.В., Трофимов Д.Ю., Гончарова Е.В., Саматов Г.А. Детекция возбудителей особо опасных инфекций в условиях автономной мобильной ПЦР-лаборатории I Генодиагностика инфекционных болезней II Материалы Российской науч.-практ. конф., 25-27 октября, 2005, «Сосновка», Новосибирская обл., - Новосибирск. - 2005. - С. 88-89.

6. Антонов В.А., Зинченко О.В., Ткаченко Г.А., Замараев B.C., Алексеев В.В., Трофимов Д.Ю., Гончарова Е.В. Гибридизационно-флуоресцентная ПЦР-тест-система для идентификации возбудителей сапа (Burkholderia mallei) и мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) / Генодиагностика инфекционных болезней II Материалы Российской науч.-практ. конф., 25-27 октября, 2005, «Сосновка», Новосибирская обл., - Новосибирск. - 2005. - С. 90-91.

7. Зинченко О.В., Антонов В.А., Алтухова В.В., Замараев B.C., Трофимов Д.Ю. Конструирование гибридизационно-флуоресцентной амплификационной тест-системы для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза / Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины // Сборник тезисов к науч-практ. конф. молодых ученых - Санкт-Петербург, 2006. - С. 274-275.

8. Савченко С.С., Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Алтухова В.В., Зинченко О.В., Замараев B.C. Идентификация и генетическое типирование возбудителей сапа и мелиоидоза с использованием методов секвенирования / Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная

охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» // Материалы VII Межгосударственной науч.- практ. конф. государств-участников СНГ, 3-5 октября, 2006, Оболенск. - 2006. - С. 122-123.

9. Антонов В.А., Зинченко О.В., Ткаченко Г.А., Замараев B.C., Трофимов Д.Ю., Абрамов Д.Д. Идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией / Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» // Материалы VII Межгосударственной науч.- практ. конф. государств-участников СНГ, 3-5 октября, 2006, Оболенск. - 2006. - С. 176-177.

10. Зинченко О.В., Антонов В.А., Замараев B.C., Голосеев Ю.А., Васильев В.П., Ломова Л.В., Пивень H.H. Использование магноиммуносорбентов для обнаружения возбудителя мелиоидоза в пробах почвы и молока методом ПЦР / Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» // Материалы VII Межгосударственной науч.- практ. конф. государств-участников СНГ, 3-5 октября, 2006, Оболенск. - 2006. - С. 203-204.

11 . Алтухова В.В., Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Зинченко О.В., Замараев B.C., Плеханова Н.Г., Илюхин В.И., Трофимов Д.Ю. Использование полиме-разной цепной реакции для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза при экспериментальной инфекции // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2007. - №3. - С. 22 -27.

12. Antonov V.A., Aleksccv V.V., Tkachcnko G.A., Altukhova V.V., Zama-racv V.S., Zinchcnko O.V., Viktorov D.V., llyukhin V.l., Trofimov D.Yu. Mobile PCR Laboratory for Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei detection // The 5th World melioidosis congress, November 21-23 2007, Khon Kaen, Thailand, 2007.-P. 88.

, 13. Зинченко О.В., Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Алтухова В.В., Замараев B.C., Пивень H.H., Голосеев Ю.А., Васильев В.П., Ломова Л.В., Алексеев В.В. Сравнительная оценка способов выделения ДНК для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза с помощью ПЦР // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2008. - № 1. - С. 55-60.

14. Антонов В.А., Илюхин В.И., Сенина Т.В., Лобойко А.Д., Ткаченко Г.А., Зинченко О.В., Мазурова И.Ю. Фенотипическая и генотипическая идентификация бактерий комплекса Burkholderia cepacia // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол,- 2008. - № 4. - С. 78-82.

15. Antonov V.A., Tkachcnko G.A., Altukhova V.V., Savchenko S.S., Zin-chenko O.V., Viktorov D.V., Zamaraev V.S., llyukhin V.l., Alekseev V.V. Molecular identification and typing of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei: when is enough enough? // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. - 2008. - № 102/S1. - P. 563-568.

Зинченко Ольга Викторовна «РАЗРАКОТКА М ЕТОД ИЧ ЕС К И X ПОДХОДОВ ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ИНДИКАЦИИ II ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА II МЕЛПОПДОЗА С ПОМОЩЬЮ ПОЛИМЕРАЗИОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ РЕЗУЛЬТАТОВ» направлении профессиональной подготовки 03.02.03 - микробиология

Волгоград, 2010

Подписано к печати 09.02.2010 г. Формат 60x90 1/16.

Печать трафаретная. Бумага офсетная № 65. Гарнитура «Тайме». Усл. нем. л. 1,5. Усл. ичд. л. 1,4. Тираж 100 ж-!. Заказ № 2401. Отпечатано в ООО «Бланк». Лиц. №3550. 400131, г. Волгоград, ул. Скосырева, 2а.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Зинченко, Ольга Викторовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гибридизационно-флуоресцентные амплификационные тест- 14 системы в ДНК-диагностике инфекционных заболеваний

1.2. Молекулярно-генетические методы идентификации патогенных 24 буркхольдерий

1.3. Способы подготовки проб исследуемого материала и очистки ДНК 32 микроорганизмов для проведения генодиагностики

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы микроорганизмов, питательные среды, условия культиви- 40 рования

2.2. Подготовка проб биологического материала, из объектов внешней 45 среды и пищевых продуктов для анализа методом ПЦР

2.3. Концентрирование клеток патогенных буркхольдерий на этапе под- 46 готовки проб из объектов внешней среды

2.4. Выделение ДНК

2.5. Постановка реакции амплификации с флуоресцентными олигонук- 51 леотидными зондами

2.6. Проведение электрофореза и флуоресцентная детекция продуктов 53 амплификации. Учет результатов ПЦР

2.7. Моделирование экспериментальной инфекции

2.8. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. ПОДБОР ПРАЙМЕРОВ И ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ

ЗОНДОВ ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ ГИБРИДИЗАЦИОННО -ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ АМПЛИФИКАЦИОННЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ

3.1. Выбор и характеристика праймеров и гибридизационных олигонук- 55 леотидных зондов для обнаружения Burkholderia pseudomallei и Burk-holderia mallei

3.2. Оптимизация условий проведения реакции амплификации на пре- 61 паратах ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза

ГЛАВА 4. ОЦЕНКА СПЕЦИФИЧНОСТИ

СКОНСТРУИРОВАННЫХ ПРАЙМЕРОВ И ЗОНДОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА И МЕЛИОИДОЗА

ГЛАВА 5. ВЫБОР ОПТИМАЛЬНОГО СПОСОБА ПОДГОТОВКИ 82 ПРОБ ПОЧВЫ И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ ДЛЯ ПОСЛЕДУЮЩЕЙ ПОСТАНОВКИ ПЦР

5.1. Определение эффективности различных способов очистки и выде- 82 ления ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза для их обнаружения методом ПЦР в пробах почвы и пищевых продуктов

5.2 Использование магноиммуносорбентов при исследовании проб, контаминированных патогенными буркхольдериями

ГЛАВА 6. ГЕНОДИАГНОСТИКА САПА И МЕЛИОИДОЗА ПРИ 91 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка методических подходов для специфической индикации и идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза с помощью полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией"

Патогенные буркхольдерии - Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei - являются возбудителями особо опасных инфекций. В силу изменившихся социально-экономических условий (расширение транспортных связей, туристические поездки в эндемичные области, миграция населения, завоз экзотичных животных) возникает угроза чрезвычайных ситуаций, увеличивающих риск поражения людей опасными биологическими агентами, в том числе патогенными буркхольдериями. Кроме того, потециальная возможность применения возбудителей сапа и мелиоидоза в качестве биологического оружия, внезапность его использования с поражением людей и животных, контаминацией питьевой воды, пищевых продуктов и объектов окружающей среды требуют повышенной готовности к реагированию органов здравоохранения.

Необходимость верификации диагноза в первые дни заболевания предопределяет высокие требования к чувствительности, специфичности и экс-прессности методов лабораторной диагностики инфекций, вызываемых данными микроорганизмами.

Одним из таких методов является полимеразная цепная реакция, к достоинству которой, наряду с высокой специфичностью и быстротой получения результатов, относится возможность выявления низких концентраций возбудителей инфекций в различных биологических объектах и пробах окружающей среды.

Зарубежными и отечественными исследователями опубликованы данные о конструировании различных праймеров для идентификации патогенных буркхольдерий. В качестве ДНК мишеней были рекомендованы гены 16SрРНК [77], 23SрРНК [155], спейсерные области 16-23SрРНК [149], кластер генов LPS, кодирующий капсульный липополисахарид [211], гены системы Ill-типа секреции (TTS1) [196, 281], флагеллярный ген [50]. В большинстве работ использовался ПЦР-анализ с электрофоретической детекцией [71, 77, 109, 149, 155, 183, 196, 281].

Однако при анализе большого количества проб и использовании для детекции продуктов амплификации электрофоретического оборудования существует вероятность получения ложноположительных результатов, связанных с контаминацией реакционных смесей специфическими ампликонами. В связи с этим возникает необходимость использования альтернативных способов детекции ПЦР-продуктов, позволяющих учитывать результаты реакции, не открывая пробирки. Одним из таких подходов является разработка ПЦР-тест-систем с флуоресцентной детекцией [79, 195]. В основе методов лежит специфическая флуоресцентная гибридизация в процессе амплификации, регистрируемая детектором флуоресценции по окончании реакции [95, 107, 226] или в режиме реального времени [115, 195].

Применение гибридизационно-флуоресцентных систем детекции без открывания пробирки исключает рассеивание продуктов амплификации — основного источника ложноположительных результатов ПЦР, а таюке обеспечивает объективный аппаратный учет результатов [130, 234]. Детекция в режиме реального времени позволяет наглядно отображать этапы ПЦР и количественно оценивать продукты реакции [128]. Кроме того, регистрация прибором флуоресценции разной длины волны позволяет применять ДНК внутреннего контроля для подтверждения достоверности отрицательных результатов.

Данный метод обнаружения возбудителей особо опасных инфекций (ООИ) отличает высокая чувствительность, специфичность, быстрота получения результатов, возможность автоматизации при минимальном объеме исследуемого материала.

Мобильные ПЦР-лаборатории с набором диагностических гибридиза-ционно-флуоресцентных тест-систем могут быть использованы как в составе специализированных противоэпидемических формирований, так и в лабораториях, осуществляющих плановый территориальный эпидемиологический мониторинг. Однако для выявления возбудителей сапа и мелиоидоза такие тест-системы до сих пор не разработаны.

На основании вышеизложенного, создание гибридизационно-флуоресцентных ПЦР-тест-систем для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза остается актуальным по сегодняшний день.

Цель работы - конструирование специфичных флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов и разработка методических подходов для специфической индикации и ускоренной идентификации патогенных буркхольдерий с помощью ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов.

Задачи исследования:

1. Подобрать специфичные праймеры и олигонуклеотидные зонды на основе нуклеотидных последовательностей генов 23SрРНК, III типа секреции (TTST) и флагеллярного гена fliC для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза.

2. Определить основные параметры ПЦР, обеспечивающие высокую чувствительность и специфичность выбранных праймеров и олигонуклеотидных зондов, на широком наборе гомологичных и гетерологичных видов микроорганизмов. Оптимизировать условия проведения ПЦР на приборах с детекцией «по конечной точке» и в режиме реального времени для выявления патогенных буркхольдерий.

4. Оценить возможность использования магноиммуносорбентов на этапе подготовки проб из объектов окружающей' среды и пищевых продуктов для исследования методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов на наличие ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза.

Научная новизна:

Для идентификации патогенных буркхольдерий впервые сконструированы олигонуклеотидные флуоресцентно-меченые зонды, являющиеся фрагментами генов 23S рРНК, III типа секреции (TTST) и флагеллярного гена///С, на основе которых возможна разработка амплификационных тест-систем для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза с регистрацией результатов амплификации «по конечной точке» и в режиме реального времени.

Определена высокая эффективность использования ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов как при идентификации чистых культур патогенных буркхольдерий, так и при выявлении ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза в пробах из объектов внешней среды, в пищевых продуктах, искусственно контаминированных В. mallei и В. psendomallei, а также в биологическом материале от экспериментально зараженных животных.

Впервые проведен сравнительный анализ эффективности олигонуклео-тидных праймеров и флуоресцентных зондов с учетом результатов амплификации как «по конечной точке», так и в режиме реального времени для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза. Показано, что ПЦР в режиме реального времени, в отличие от флуоресцентной детекции «по конечной точке», позволяет не только наглядно отображать этапы ПЦР, но и количественно оценивать продукты реакции при выявлении ДНК патогенных бурк-хольдерий.

Предложены эффективные способы подготовки проб различного характера, инфицированных патогенными буркхольдериями, для анализа методом ПЦР. Впервые представлены доказательства использования магноимму-носорбентов (МИС) с целью селективного концентрирования клеток возбудителей сапа и мелиоидоза на этапе пробоподготовки и очистки ДНК от примесей веществ, ингибирующих ПЦР.

Практическая ценность:

В результате проведенных исследований созданы экспериментальные серии тест-систем для ускоренной идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза в биологическом материале и объектах окружающей среды методом ПЦР с флуоресцентной детекцией.

По результатам работы составлены методические рекомендации, утвержденные директором ВолгоградНИПЧИ (протокол № 10 от 26.12.07 г.), по использованию ПЦР с флуоресцентной детекцией для идентификации В.mallei и В. pseudomallei, выявления возбудителей сапа и мелиоидоза в пробах из объектов внешней среды и пищевых продуктов, контаминированных патогенными буркхольдериями, а также при различных экспериментальных формах сапа и мелиоидоза.

Материалы диссертационной работы используются сотрудниками института в рамках учебных программ по первичной специализации и перепо-готовке специалистов: Программы курсов повышения квалификации бактериологов и эпидемиологов по противодействию биотерроризму, утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 01.02.2001 г., Программы курсов повышения квалификации врачей — бактериологов общей медицинской сети, центров Госсанэпиднадзора и противочумных учреждений по специфической индикации и лабораторной диагностике особо опасных инфекций, санитарной охране территории и противоэпидемической защите населения, утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 28.09.1999 г., а также Программы курсов повышения квалификации медицинских работников (с высшим и средним специальным образованием) сани-тарно-карантинных пунктов и отделов (СКП и СКО), утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко. Кроме того, материалы настоящей работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий для студентов медико-биологического факультета Волгоградского государственного медицинского университета.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Системы олигонуклеотидов, сконструированные на основе участков генов 23S рибосомальной РНК, orflS из кластера генов III типа секреции

TTS1) и флагеллярного гена fliC, включающие прямые, обратные праймеры и гибридизационные зонды, меченые флуорофорами, обеспечивают как специфическую амплификацию фрагментов ДНК, так и регистрацию результатов реакции по повышению уровня флуоресценции.

2. Гибридизационно-флуоресцентные олигонуклеотидные зонды трех ДНК-мишеней - участков генов 23S рРНК, fliC и orfl3 увеличивают специфичность реакции амплификации и повышают достоверность результатов при индикации и идентификации В. mallei и В. pseudomallei.

3. Системы олигонуклеотидов, разработанные для обнаружения генов 23S рРНК, orfl3 и флагеллярного гена fliC, позволяют идентифицировать чистые культуры патогенных буркхольдерий при их концентрации 1 х 103 м.к./мл в условиях гибридизационно-флуоресцентной детекции «по конечной гу точке» и 1 х 10 м.к./мл с детекцией в режиме реального времени.

Апробация работы

Основные материалы диссертации были представлены на конференции к 100-летию Астраханской противочумной станции «Природно-очаговые особо опасные инфекции на Юге России, их профилактика и лабораторная диагностика» (Астрахань, 2001); на зарубежной научной конференции «Natural infectious diseases» (Монголия, 2001); VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002); VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005); Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Новосибирск, 2005); научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2006); VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» (Оболенск, 2006); XI Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2006), IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии Борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007), V международном конгрессе по мелиоидозу (Thailand, 2007), IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества Независимых Государств» (Волгоград, 2008), 66-й юбилейной научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2008), а также на ежегодных итоговых научных конференциях Волгоградского НИПЧИ.

По теме диссертации опубликовано 18 научных работ, из них 3 - в рецензируемых периодических изданиях, рекомендованных ВАК для защиты докторских и кандидатских диссертаций, 3 — в зарубежной печати.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 136 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 6-ти глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 283 источника, в том числе 38 отечественных и 245 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 16 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Зинченко, Ольга Викторовна

108 ВЫВОДЫ

1. На основе анализа геномов патогенных буркхольдерий сконструированы олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные зонды, являющиеся фрагментами гена 23S рРНК, флагеллярного гена fliC и гена ог/13 из кластера генов III типа секреции В. mallei и В. pseudomallei и разработаны оптимальные параметры ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов синтезируемых фрагментов ДНК патогенных буркхольдерий.

2. Для индикации и идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза разработаны праймеры и флуоресцентные зонды с детекцией результатов ПЦР «по конечной точке» и в режиме реального времени, которые позволяют обнаруживать патогенные буркхольдерии с чувствительностью 1 х 103 и 1 х 102 м.к./мл, соответственно.

3. Проведена апробация и подтверждена диагностическая ценность, разработанных олигонуклеотидных праймеров и зондов для конструировании амплификационных тест-систем с целью обнаружения В. mallei и В. pseudomallei в объектах окружающей среды, а также диагностики экспериментального сапа и мелиоидоза.

4. Установлено, что наиболее эффективным способом очистки и экстракции ДНК из проб жидких пищевых продуктов, искусственно контаминированных патогенными буркхольдериями, является сорбция ДНК на си-ликагеле в присутствии гуанидинтиоцианата, а из проб почвы - метод, основанный на гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформной депротеинизации с последующей очисткой ДНК методом нуклеосорбции.

5. Показана целесообразность применения МИС с целью концентрирования патогенных буркхольдерий и очистки пробы от примесей, инги-бирующих реакцию амплификации. Чувствительность ПЦР при этом составила 1 х 103 м.к./мл со всеми испытуемыми парами праймеров и флуоресцентными зондами.

6. Предложен алгоритм двухэтапной генной диагностики сапа и мелиоидоза, при котором для индикации возбудителей в нативном материале и для идентификации штаммов В. mallei и В. pseudomallei используются разные ДНК-мишени, что позволяет осуществлять подтверждение первичного положительного ответа о наличии в пробе ДНК патогенных буркхольдерий.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаем признательность сотрудникам НПФ «ДНК-технология» (г. Москва) в лице директора Д.Ю. Трофимова за помощь в подборе и синтезе праймеров и зондов, использованных в работе, С.И. Жуковой, заведующей лабораторией иммунопрофилактики Волгоградского научно-исследовательского противочумного института за предоставленные штаммы гетерологичных видов микроорганизмов, а также сотрудников лаборатории иммунодиагностики и биотехнологии института за помощь в конструировании магноиммуносорбентов. Благодарим коллектив отдела сапа и мелиоидоза за неоценимую помощь и поддержку в ходе выполнения диссертационной работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Патогенные буркхольдерии — В. mallei и В. pseudomallei относят к возбудителям особо опасных инфекционных заболеваний, а также к потенциальным агентам биотерроризма группы В [3, 7, 111, 191, 274]. Угроза возникновения террористических актов, чрезвычайных ситуаций в результате техногенных катастроф, а также возможность завоза в Россию инфекций из эндемичных территорий путем миграции населения, ввоза больных животных, почвы, пищевых продуктов, контаминированных патогенными бурк-хольдериями [9] диктует необходимость разработки высокочувствительных методов специфической индикации и ускоренной идентификации этих возбудителей.

Для выявления различных микроорганизмов применяются специальные диагностические тест-системы и оборудование, которые позволяют обнаруживать и идентифицировать ПБА в ПЦР, ИФА и МФА. Молекулярно-генетическое исследование обладает наибольшей чувствительностью из всех известных методов экспресс-анализа и дает возможность детектировать в пробах от единичных до сотен клеток инфекционного агента.

В последнее время для специфической индикации и ускоренной идентификации возбудителей инфекционных заболеваний все более активно используют молекулярно-генетические подходы, позволяющие выявлять определенные участки генома микроорганизмов. Применение классической по-лимеразной цепной реакции на этапе детекции предусматривает использование электрофоретического оборудования, что создает определенные трудности при идентификации микроорганизмов в полевых условиях: возможность перекрестной контаминации реакционных смесей специфическими амплико-нами и получение ложноположительных результатов, трудоемкость, продолжительность этапа электрофореза, необходимость дополнительного помещения и выполнение ПЦР силами нескольких сотрудников [259]. Использование метода с флуоресцентной детекцией позволяет избавиться от вышеперечисленных недостатков. Флуоресцентные технологии отличает безопасность и высокая чувствительность, благодаря чему они приобретают широкое распространение [130]. Сущность этих методов заключается в исследовании накопления продуктов амплификации с помощью специального прибора без последующего электрофореза. Так как кинетика накопления продуктов амплификации связана с исходным содержанием матрицы, это дает возможность точно оценить ее количество [128]. Отличительными чертами данного метода, в сравнении с классической ПЦР, является возможность количественного определения ДНК/РНК инфекционных агентов в исследуемом материале, менее строгие требования к организации ПЦР-лаборатории. Использование специальных флуоресцентных меток позволяет отказаться от стадии электрофореза, что снижает риск перекрестной контаминации продуктами ПЦР и, соответственно, уменьшает число ложноположительных результатов. Поскольку регистрация результатов проводится непосредственно в процессе реакции амплификации, весь анализ можно проводить в одной-двух комнатах лаборатории силами одного сотрудника. Этот подход позволяет проводить автоматическую интерпретацию полученных результатов и снимает проблему субъективной оценки электрофореграмм.

Флуоресцентная детекция, основанная на использовании олигонуклео-тидных последовательностей (зондов), меченых флуорофорами — молекулами, обладающими способностью к флуоресценции в результате поглощения энергии светового потока определенной длины волны и эмиссии ее на другой длине волны, делится на два типа: «по конечной точке» (измерение уровня флуоресцентного сигнала по окончании ПЦР) [160, 259] и в режиме реального времени (регистрация флуоресценции в процессе реакции амплификации) [128, 130]. Существует множество флуоресцентных технологий, различающихся по способам генерации репортерной флуоресценции [282].

Первые сообщения о разработке флуоресцентной амплификационной тест-системы для идентификации патогенных буркхольдерий были сделаны F.M. Thibault [254] и Н. Tomaso с соавторами в 2004 году [86]. В последующем в качестве специфических ДНК-мишеней для конструирования праймеров и зондов зарубежные авторы изучали гены III типа секреции (TTS1) [64, 87, 93, 254], флагеллярный ген [86, 87, 211], а также ген IpxO [180], гены внутриклеточного движения [88, 267], гены, кодирующие гипотетические белки [91].

В Волгоградском научно-исследовательском противочумном институте на протяжении 10 лет проводилась работа по обнаружению оптимальной последовательности в геномах возбудителей сапа и мелиоидоза, обеспечивающей максимальную специфичность и чувствительность анализа. Так, на основе последовательности гена 23S рРНК была разработана диагностическая амплификационная тест-система для идентификации патогенных буркхольдерий [37], которая обеспечивала специфическую амплификацию фрагменл тов ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза с чувствительностью 1 х 10^- 1 х л

10 м.к./мл. Была показана принципиальная возможность использования их для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза в контаминированных пробах почвы и воды открытых водоемов и в органах зараженных животных.

В дальнейшем для снижения вероятности получения ложноположи-тельных результатов и повышения эффективности анализа при исследовании проб из внешней среды и биологического материала, зараженного В. mallei и В. pseudomallei, была выбрана еще одна пара праймеров на основе фрагмента флагеллярного гена fliC исследуемых микроорганизмов [1]. Обе пары олиго-нуклеотидных затравок обладали одинаковой чувствительностью. Таким образом, была разработана группоспецифическая ПЦР-тест-система с двумя парами праймеров (b23-s7/b23-a8 и bfl-ls/ bfl-2a), которая позволяла обнаруживать патогенные буркхольдерии в крови и органах экспериментально зараженных животных на разных стадиях развития инфекций, а также в пробах воды и продуктов питания.

Следует отметить, что данные исследования проводились для разработки амплификационных тест-систем с электрофоретической детекцией результатов. Флуоресцентные ПЦР-тест-системы для выявления В. mallei и

В. pseudomallei в нашей стране на сегодняшний день не разработаны, что и предопределило направление исследований, связанных с их созданием.

В нашей работе использовали зонды с комплементарными концевыми последовательностями по типу «молекулярных маячков» (molecular beacons) [259]. В качестве ДНК-мишеней были выбраны участки гена 23S рибосомальной РНК и флагеллярного гена fliC, специфичность которых была изучена в работах исследователей Волгоградского НИПЧИ [1, 37], а также orfl3 из кластера генов III типа секреции (TTS1) [198] данных микроорганизмов. При конструировании олигонуклеотидных зондов для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза ориентировались на результаты секвенирования, представленные в GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, США). Нами были проанализированы исследуемые фрагменты генов и на их основе сконструированы олигонуклеотидные последовательности, которые в свободном состоянии принимают форму «шпильки» с комплементарными последовательностями на противоположных концах зонда.

В результате проведенных исследований были выбраны праймеры и флуоресцентные зонды для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза в чистой культуре, в объектах внешней среды, в клиническом материале и отработаны основные параметры ПЦР.

Основные параметры реакции амплификации - температура отжига, количество циклов, реакционный буфер для Тод-полимеразы, концентрация флуоресцентного зонда отработаны на чистых культурах В. pseudomallei С141 и В. mallei 10230. Режим амплификации адаптирован для проведения ПЦР на мультициклере с последующей детекцией «по конечной точке» и в режиме реального времени.

Первоначально для идентификации В. mallei и В. pseudomallei было выбрано несколько пар олигонуклеотидных праймеров {b23s7/b23a7, b23s7/b23a8, b23s77b23a9) и зонды burk23J'lp и P/-23S-1 на основе последовательности участка генов 23S рибосомальной РНК возбудителей сапа и мелиоидоза. Длина фрагментов ДНК составляла 243, 266 и 313 п.н. При использовании всех трех пар праймеров специфические фрагменты амплификации синтезировались при анализе ДНК, выделенной из проб, содержащих клетки В. mallei и В. pseudomallei. Однако с парами праймеров b23s7/b23a7 и b23s7/b23a9 обнаруживались и три штамма В. cepacia (8235, 3181, 3189). В связи с чем, дальнейшая работа с этими праймерами была прекращена.

Для повышения специфичности реакции амплификации были предложены праймеры на основе генов III типа секреции (BTTS-sl/BTTS-as3) и флагеллярного гена fliC (bfl-ls/bfl-2a), а также соответствующие им флуоресцентные зонды. При использовании этих праймеров и зондов были получены специфические фрагменты (162 и 376 п.н., соответственно для ог/13 и fliC) при анализе ДНК В. mallei и В. pseudomallei.

Для проверки специфичности праймеров использовали ДНК 26 видов микроорганизмов в концентрации 1 х 10 м.к./мл. Перечисленные праймеры обладали специфичностью лишь в отношении патогенных буркхольдерий. ДНК гетерологичных видов микроорганизмов, использованных в работе, с помощью данных олигонуклеотидных затравок и зондов не обнаруживалась.

Чувствительность реакции амплификации с флуоресцентной детекцией «по конечной точке» и чувствительность стандартной ПЦР не отличалась и о составила 1x10 м.к./мл. Однако при использовании ПЦР в режиме реального времени чувствительность реакции удалось повысить до 1 х 10 м.к./мл.

Немаловажное значение для успешного результата ПЦР имеет выбор способа пробоподготовки, что зависит от природы проб и образцов и наличия примесей в них [243, 250]. Поэтому, с целью оценки эффективности различных олигонуклеотидных систем и методов выделения ДНК, исследовали пробы из объектов внешней среды, продуктов питания и биологического материала, контаминированные В. mallei и В. pseudomallei. При анализе чистых культур чувствительность реакции амплификации с детекцией «по конечной точке» составила 1x10 м.к./мл.

Наибольшую трудность составляет выделение ДНК микроорганизмов из проб внешней среды, которые содержат примеси, ингибирующие ПЦР.

Сотрудниками Волгоградского НИПЧИ при подготовке проб почвы, контаминированных патогенными буркхольдериями, методом нуклеосорбции на силикагеле была показана возможность обнаружения ДНК возбудителей сапа л и мелиоидоза с чувствительностью 1x10 м.к./мл [37]. Однако в отдельных пробах с высоким содержанием гумусных кислот он не обеспечивал выделение ДНК микроорганизмов. Для эффективной очистки ДНК патогенных буркхольдерий более предпочтительным оказался метод гуанидин-фенол-хлороформной депротеинизации с последующей очисткой нуклеосорбцией на Si02, который, несмотря на многоэтапность и трудоемкость, обеспечивал получение более чистых препаратов ДНК. При его использовании чувствительность реакции амплификации составила 1 х 104 м.к./мл.

С целью селективного концентрирования клеток возбудителей сапа и мелиоидоза, а также с целью очистки ДНК от примесей веществ, ингиби-рующих ПЦР, и, следовательно, более эффективной подготовки проб использовали способ, основанный на применении магноиммуносорбентов, который заключается в иммуносепарации микробной взвеси с последующим отделением магносорбентов при помощи магнита.

Применяя МИС для предварительной пробоподготовки с целью концентрирования и устранения ингибиторов ПЦР и последующего выделения ДНК методом нуклеосорбции из проб окружающей среды, удалось повысить чувствительность реакции амплификации с 1 х 104 м.к./мл до 1 х 102 м.к./мл.

Имунномагнитная сепарация может быть использована для клеток или нуклеиновых кислот в клеточном лизате и, возможно, более сложных образцах. Этот метод выделения представляется одним из наиболее перспективных. В частности, внедрение простых экспресс-методов, основанных на применении сорбентов - твердофазных носителей с иммобилизованными лиган-дами позволяет достаточно быстро и эффективно обнаруживать биоагенты в объектах внешней среды и пищевых продуктах.

Для выделения патогенов из объектов окружающей среды в качестве сорбентов используют как органические инертные материалы, такие как гранулы агарозы, полистирола, ультрагеля, так и неорганические - пористое стекло, оксиды металлов, кремнезем и др. [8, 38]. Особый интерес представляют микрогранулированные сорбенты на основе полиакриламидного геля (ПААГа), используемые для концентрирования исследуемого материала, в методах экспресс-анализа и мониторинга окружающей среды [6, 25].

Придание магнитных свойств микрогранулированным сорбентам позволяет существенно упростить и ускорить манипуляции с ними на всех этапах работы, концентрировать и выделять ПБА из реакционных сред и биологических жидкостей. Магнитные свойства гранул обусловлены включением в них частиц магнитного материала, например окислов железа (магнетита) или ферритов, инертных в химическом отношении. Манипуляции с магносорбен-тами поддаются автоматизации, что уже практикуется в радиоиммунном и иммуноферментном анализах [13, 28].

Магноиммуносорбенты (МИС) на основе полиакриламидного геля нашли применение для концентрирования клеток различных видов патогенных микроорганизмов из загрязненных сопутствующей микрофлорой объектов внешней среды [4, 35, 202].

Однако достаточно сложная технология получения микрогранулиро-ванных сорбентов ограничивает возможности их применения, что в свою очередь требует в дальнейшем разработки новых типов сорбентов и методов, обеспечивающих специфическую индикацию и идентификацию ПБА в объектах внешней среды.

При выделении ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза из проб воды и жидких пищевых продуктов (сок, молоко), из биологического материала методом, предложенным R. Boom [49], чувствительность ПЦР составила 1 х 103 м.к./мл. При экстракции ДНК из контаминированных патогенными бурк-хольдериями проб воды и сока набором «ДНК-экспресс» чувствительность реакции амплификации составила 1 х 103 м.к./мл, для молока - 1 х 104 м.к./мл, что, по-видимому, связано с наличием ингибирующих ПЦР-примесей.

Метод, предложенный R. Boom [49], может быть рекомендован для выделения ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза из проб воды и жидких пищевых продуктов (сок, молоко), так как является простым, быстрым, доступным и экономически более выгодным.

В отношении подготовки проб от экспериментальных животных наши исследования подтвердили результаты, полученые в работах, выполненных ранее [1, 37]. Была показана эффективность использования метода нуклео-сорбции при выделении ДНК патогенных буркхольдерий из крови и биопта-тов зараженных животных. Так, возбудители сапа и мелиоидоза обнаруживались в печени и селезенке золотистых хомячков в 100 % случаев при исследовании праймерами b23s7/b23a8 и bfl-ls/bfl-2a с детекцией результатов как «по конечной точке», так и в режиме реального времени. Эффективность ПЦР с праймерами BTTS-sl/BTTS-as3 оказалась ниже на 20%.

Сравнивая результаты выявления ДНК патогенных буркхольдерий, было выявлено, что приборы для ПЦР в режиме реального времени являлись более чувствительными и детектировали возбудителей в 100 % случаях во всех исследуемых пробах, полученных от инфицированных животных.

В пробах крови ДНК микроорганизмов обнаруживали лишь в 33 % проб, что, вероятно, с одной стороны связано с ингибированием ДНК-полимеразы веществами, циркулирующими в крови (гемоглобин, иммуноглобулины, гормоны), а с другой - низким уровнем бактериемии, выходящей за пределы чувствительности реакции амплификации.

Статистический анализ полученных результатов позволил установить достоверное различие в эффективности бактериологического метода и ПЦР (р<0,05) при обнаружении возбудителей сапа и мелиоидоза.

Разработанный алгоритм интерпретации результатов позволяет на первом этапе проводить индикацию патогенных буркольдерий в объектах внешней среды и биологическом материале с помощью праймеров b23-s7/b23-a8 и олигонуклеотидного зонда Pf-23-l. Второй этап предусматривает идентификацию штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза в реакции амплификации с праймерами и зондами для обнаружения фрагментов генов fliC и orfl3, а также подтверждение первичного положительного ответа, полученного на первом этапе.

Использование олигонуклеотидных зондов с различными флуоресцентными метками для обнаружения нескольких ДНК-мишеней патогенных буркхольдерий является перспективой для создания мультиплексных тест-систем, что позволит повысить эффективность реакции амплификации, в частности при индикации искомых патогенов в нативном материале.

Предлагаемый методический подход может быть использован для ускоренной идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза в условиях автономной мобильной ПЦР-лаборатории. Применение гибридизационно-флуоресцентных систем детекции снижает риск контаминации, сокращает продолжительность и трудоемкость проведения исследований, что особенно важно в полевых условиях. Программное обеспечение позволяет быстро оценивать и документировать результаты анализов. Данный метод обнаружения возбудителей ООИ отличает высокая чувствительность, специфичность, быстрота получения результатов и возможность автоматизации. Мобильные ПЦР-лаборатории с таким набором диагностических тест-систем могут быть использованы как в составе специализированных противоэпидемических формирований, так и в лабораториях, осуществляющих плановый территориальный эпидемиологический мониторинг.

Таким образом, в процессе данной работы для идентификации патогенных буркхольдерий сконструированы праймеры и флуоресцентные зонды для обнаружения гена 23SрРНК, гена orfl3 из кластера генов III типа секреции (7757) и флагеллярного гена В. mallei и В. pseudomallei. Использование разработанных амплификационных олигонуклеотидных затравок и зондов позволяло выявлять возбудителей сапа и мелиоидоза в концентрации 1 х 103 м.к./мл при детекции «по конечной точке» и 1 х 10 м.к./мл - в режиме реального времени. Изучены различные способы подготовки проб, дана сравнительная оценка их эффективности при исследовании объектов внешней среды и пищевых продуктов, а также показана возможность использования маг-ноиммуносорбентов с целью концентрирования клеток исследуемых микроорганизмов на этапе подготовки проб почвы и пищевых продуктов. Показана принципиальная возможность обнаружения возбудителей патогенных буркхольдерий в пробах биологического материала с помощью ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Зинченко, Ольга Викторовна, Саратов

1. Алтухова В.В. Использование полимеразной цепной реакции для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза при экспериментальной инфекции: Ав-тореф. дис. канд. мед. наук. Волгоград, 2005. — 24 с.

2. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Ленинград: Гос. изд-во мед. лит., 1962. — 181 с.

3. Аэрогенные инфекции в аспекте проблемы биотерроризма / Алексеев В.В., Тихонов Н.Г, Липницкий А.В. и др. // Проблемы особо опасных инфекций. -Саратов, 2003. -Вып. 85. С. 20-27.

4. Владимцева И.В. Научно-методические аспекты приготовления и использования магнитоуправляемых иммобилизованных микробиологических систем: дисс. докт. биол. наук. Ставрополь, 2002 г. - 304 с.

5. Воробьев А.А. Оценка вероятности использования биоагентов в качестве биологического оружия // Эпидемиол. и ифекц. бол. 2001. - № 6. - С. 54-56.

6. Жарникова И.В. Структурированный керамический носитель с магнитным материалом для иммобилизации антител // Биотехнология. 2004. - № 1. - С. 71-76.

7. Илюхин В.И. Мелиоидоз // Эпидемиология и инфекционные болезни. 1999. - № 4. — С. 49-51.

8. Иммунологическая диагностика мелиоидоза / Храпова Н.П., Тихонов Н.Г., Рыбкин B.C. и др. // Мелиоидоз: Сб. науч.тр. Волгоград, 1995. - С. 57-68.

9. Использование ПЦР для идентификации Burkholderia mallei / Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Алтухова В.В. и др. // Мол. генет. микробиол. вирусол. 2004.- № l.-C. 12-17.

10. Кальной С.М., Гончаров В.И., Василенко Н.Ф. Получение и использование магнитных биосорбентов в методах иммуноанализа антигенов микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология. 2004. - Т. 40. - № 2. - С. 227-234.

11. Клонирование ДНК. Методы / Под ред. Д. Гловера. М., Мир, 1988. - С. 238-340.

12. Куличенко А.Н. Конструирование молекулярно-генетических систем для детекции возбудителей особо опасных инфекций: чумы, бруцеллеза и сибирской язвы: Автореф. дис. . докт. мед. наук. — Саратов, 1995. 39 с.

13. Мазин А.В., Кузнеделов К.Д., Краев А.С. и др. Методы молекулярной генетики и генной инженерии // Новосибирск. Наука.: Сиб. отд-ние, 1990. — 248 с.

14. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер с англ.- М.: Мир, 1984.- 479 с.

15. Мелиоидоз / Илюхин В.И., Замараев B.C., Батманов В.П. и др. // Диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней. Саратов, 1998. - Т. 2 - С. 115-143.

16. Мелиоидоз. Сб. науч. тр. Под ред. Н.Г. Тихонова. Волгоград: Ниж.-Волж. кн. Изд-во, 1995.-224 с.

17. Метлина A.JI. Жгутики прокариот как система биологической подвижности // Успехи биологической химии. 2001. - Т. 41. - С. 229-282.

18. Методы почвенной микробиологии и биохимии: Учеб. пособие / Под ред. профессора Д.Г.Звягинцева. -М.: Изд-во МГУ, 1991.- 304 с.

19. МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами 1-11 групп патогенности».- М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2003. 39 с.

20. МУ 3.5.5.1034 01 «Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп, при работе методом ПЦР». - М., 2001. - 6 с.

21. Приготовление и применение магнитных сорбентов для изучения антигенов микроорганизмов: Методические рекомендации / Пушкарь В.Г., Климова И.М., Ефременко В.И. и др. Волгоград, 1984. - 14 с.

22. Приказ Министерства высшего и среднего специального образования СССР № 48 от 23.01.1985 г. «О контроле за проведением работ с использованием экспериментальных животных».

23. Приказ Министерства высшего и среднего специального образования СССР № 742 от 13.11.1984 г. «Об утверждении правил проведения работ с использованием экспериментальных животных».

24. Пушкарь В.Г. Получение и использование магнитных сорбентов в методах иммунофлуоресцентного и иммуноферментного анализа для обнаружения чумного микроба: автореф. дисс. . канд. биол. наук. Саратов, 1989. - 22 с.

25. ПЦР — детекция маркеров эпидемической значимости штаммов Vibrio colerae 0139, изолированных в Сибири / Балахонов С.В., Миронова JI.B., Марамович А.С. и др. // Мол. генет., микробиол. вирусол. 2001. - № 2. - С. 24-26.

26. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. М.: Медиа Сфера, 2003.-305 с.

27. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1285 03. Безопасность работы с микроорганизмами 1-11 групп патогенности (опасности) // Госсанэпиднадзор России. - М., 2003. - 103 с.

28. Сап / Илюхин В.И., Храпова Н.П., Замараев В.С.и др.// Диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней. Саратов, 1998 - Т. 2. - С. 101-114.

29. Сап.: Сб. науч. тр. под ред. акад. Н.Г. Тихонова. Волгоград.: Ниж.-Волж. кн. изд-во, 1995. 128 с.

30. Современные методы диагностики особо опасных инфекций и способы их применения: Методическое пособие / Гавенский С.Д., Ефременко В.И., Климова И.М. и др. Саратов, 1991. - С. 213-219.

31. Специфическая индикация патогенных биологических агентов. Практическое руководство / Под ред. ак. РАМН, проф. Г.Г. Онищенко. М.: ЗАО «МП Гигиена», 2006. — 288 с.

32. Ткаченко Г.А. Конструирование амплификационной тест- системы для выявления патогенных буркхольдерий: Автореф. дис. . канд. мед. наук. -Волгоград, 2003. 24 с.

33. Шаханина K.JL, Чахава О.В., Чумак Л.Г. Применение иммуносорбентов для определения специфичности и активности люминесцирущих сывороток // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1969. - № 10. -С. 21-26.

34. A Burkholderia pseudomallei type III and exhibits guanine nucleotide exchange factor activity / Stevens M. P., Friebel A., Taylor L. A. et al. // J. Bacteriol. 2003. -Vol. 185. - P. 4992^4996.

35. Aizawa S. Bacterial flagella and type III secretion systems // FEMS Microbiol. Lett.-2001.-Vol. 202.-P. 157-164.

36. Alonso R., Nicholson P. S., Pitt T. L. Rapid extraction of high purity chromosomal DNA from Serratia marcescens II Lett. Appl. Microbiol. 1993. - Vol. 6. — P. 77-79.

37. Al-Soud W.A., Jonsson L.J., Radstrom P. Identification and characterization of immunoglobulin G in blood as a major inhibitor of diagnostic PCR // J. Clin.Microbiol. 2000. - Vol. 38. - P. 345-350.

38. Al-Soud W.A., Radstrom P. Capacity of nine thermostable DNA polymerases to mediate DNA amplification in the presence of PCR-inhibiting samples // Appl. Environ Microbiol. 1998. - Vol. 64. -P. 3748-3753.

39. Al-Soud W.A., Radstrom P. Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells // J. Clin.Microbiol. 2001. - Vol. 39, № 2. - P. 485493.

40. A new real-time quantitative TaqMan PCR to detect Chlamydia trachomatis DNA in urine and in urogenital swabs / Jaton K., Bille J., Andre C. et al. // 16th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases Nice, France, April 1-4 2006.

41. An Inv/Mxi-Spa-like type III protein secretion system in Burkholderia pseudomallei modulates intracellular behaviour of the pathogen / Stevens M. P., Wood M. W., Taylor L. A. et al. // Mol. Microbiol. 2002. - Vol. 46. - P. 649-659.

42. Arabinose assimilation defines a nonvirulent biotype of Burkholderia pseudomallei / Smith M. D., Angus B. J., Wuthiekanun V. et al. // Infect. Immun. 1997. - Vol. 65.-P. 4319-4321.

43. A rapid and simple method for purification of nucleic acids / Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M. et al. // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28, № 3. - P. 495-503.

44. Attenuated virulence and protective efficacy of a Burkholderia pseudomallei bsa type III secretion mutant in murine models of melioidosis / Stevens M. P., Haque A., Atkins T. et al. // Microbiology. 2004. - Vol. 150. - P. 2669-2676.

45. Bahrani F. K., Sansonetti P. J., Parsot C. Secretion of Ipa proteins by Shigella flexneri: inducer molecules and kinetics of activation // Infect. Immun. 1997. — Vol. 65.-P. 4005-4010.

46. Balashov S. V., Park S., Perlin D. S. Assessing resistance to the echinocandin antifungal drug caspofungin in Candida albicans by profiling mutations in FKS1II Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2006. - Vol. 50, №. 6. - P. 2058-2063.

47. Bergan T. Human and animal pathogenic members of the genus Pseudomonas // Procariots. Berlin, 1981. -№ 1. - P. 666 -700.

48. Best viral elution method available for quantification of enteroviruses in sludge by both cell culture and reverse transcription-PCR / Monpoeho S., Maul A., Mignotte

49. Cadiergues В. et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - Vol. 67. - P. 2484 -2488.

50. Blocker A., Komoriya K., Aizawa S.-I. Type III secretion systems and bacterial flagellar insights into their function from structural similarities // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - Vol. 100. - P. 3027-3030.

51. Blood culture techniques for the diagnosis of melioidosis / Wuthiekanun V., Dance D.A.B., Chaowagul W. et al. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1990. - Vol. 9.-P. 654-658.

52. Brett P. J., DeShazer D., Woods. D. E. Burkholderia thailandensis sp. nov., a Burkholderia pseudomallei-\ik.Q species // Int. J. Syst. Bacteriol. 1998. - Vol. 48. -P. 317-320.

53. Brown L.J., May J.P., Brown T. Synthesis of a modified thymidine monomer for site-specific incorporation of reporter groups into oligonucleotides // Tetrahedron Lett. 2001.-Vol. 42.-P. 2587-2591.

54. Cheng A. C., Currie B. J. Melioidosis: epidemiology, pathophysiology, and management // Clin. Microbiol. Rev. 2005. Vol. 18. - P. 383-416.

55. Chevaliez S., Bouvier-Alias M., Laperche S., et al. Performance of the Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan real-time PCR assay for hepatitis В vims DNA quantification // J Clin Microbiol. 2008. - Vol. 46, № 5. - P. 1716-23.

56. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidi-nium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. 1987. - Vol. 162, №1. - P.156-159.

57. Clegg R.M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids // Methods Enzymol. 1992.-Vol. 211. - P. 353-388.

58. Clinical evaluation of a type III secretion system real-time PCR assay for diagnosing melioidosis / Meumann E. M., Gal D., Novak R. T. et al. // J. Clin. Microbiol. -2006. Vol. 44. - P. 3028-3030.

59. Collazo С. M., Galan J. E. The invasion-associated type-Ill protein secretion system in Salmonella—a review // Gene. 1997. - Vol. 192. - P. 51-59.

60. Comparison of the polymerase chain reaction and serologic tests for diagnosis of septicemic melioidosis / Sermswan R., Wongratanacheewin S., Anuntagool N. et al. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2000. - Vol. 63. - P. 146-149.

61. Comparison of three different PCR methods for detection of Brucella spp. in human blood samples / Navarro E., Escribano J., Fernandez J. et al. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2002. - Vol. 34. - P. 147-151.

62. Comparison of three PCR primer sets for diagnosis of septicemic melioidosis / Kunakom M., Raksakait K., Sethaudom C. et al. // Acta Trop. 2000. - Vol. 74. -P. 247-251.

63. Complex polysaccharides as PCR inhibitors in feces: Helicobacter pylori model / Monteiro L., Bonnemaison D., Vekris A. et al. // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35.-P. 995-998.

64. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification / Wittwer C.T., Herrmann M.G., Moss A.A. et al. // BioTechniques. 1997. - Vol. 22. - P. 130-138.

65. De Lomas J.G., Sunzeri F.G., Busch M.P. False-negative results by polymerase chain reaction due to contamination by glove powder // Transfusion. 1992. - Vol. 32.-P. 83-85.

66. Detection of Bacillus anthracis DNA by LightCycler PCR / Bell C.A. Uhl J.R., Hadfield T.L. et al. // J.Clin.Microbiol. 2002. - Vol. 40, № 8. - P. 2897-2902.

67. Detection of Brucella melitensis and Brucella abortus by DNA amplification / Baily G. G., Krahn J. В., Drasar B. S. et al. // J. Trop. Med. Hygiene 1992. - Vol. 95.-P. 271-275.

68. Detection of Burkholderia pseudomallei DNA in patients with septicemic melioidosis / Dharakul Т., Songsivilai S., Viriyachitra S.et. al. // J. Clin. Microbiol. -1996. Vol. 34. - P. 609-614.

69. Detection of Chlamydia trachomatis by Isothermal Ramification Amplification Method: a Feasibility Study / Zhang W., Cohenford M.5 Lentrichia B. et al. // J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol. 40. - P. 128 - 132.

70. Detection of minimal residual disease in hematologic malignancies by real-time quantitative PCR: principles, approaches, and laboratory aspects / van der Velden V.H., Hochhaus A., Cazzaniga G. et al. // Leukemia. 2003. - Vol. 17, № 6. - P. 1013-1034.

71. Detection of PCR products using selfprobing amplicons and fluorescence / Whit-combe D., Theaker J., Guy S. P. et al. // Nature Biotechnol. 1999. - Vol. 17. - P. 804 - 807.

72. Detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis in a single tube with molecular beacons / El-Haji H. H., Marras S. A., Tyagi S. et al. // J. Clin. Microbiol. 2001. -Vol. 39. - P. 4131-4137.

73. Detection of Salmonella species in foodstuffs / Bhagwat A. A., Patel J., Chua T. et al. // Methods in Molecular Biology. 2008. - Vol. 429. - P. 33-43.

74. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 50-30 exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase / Holland P.M., Ab-ramson R.D., Watson R. et al. // Proc. Natl. Acad Sci USA. 1991. - Vol. 88. - P. 7276-7280.

75. Detection of Vibrio cholerae by real-time nucleic acid sequence-based amplification / Fykse E. M., Skogan G., Davies W. et al. // Applied and environmental microbiology. 2007. - Vol. 73, № 5. - P. 1457-1466.

76. Development of a multitarget real-time TaqMan PCR assay for enhanced detection of Francisella tularensis in complex specimens / Versage J.L., Severin D.D.M., Chu M.C. et al. // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol. 41, № 12. - P. 5492-5499.

77. Development of 5'- nuclease real-time PCR assays for the rapid identification of the Burkholderia mallei/Burkholderia pseudomallei complex / Tomaso H., Scholz H. C., Al Dahouk S. et al. // Diagn. Mol. Pathol. 2004. - Vol. 13. - P. 247-253.

78. Development of a 5'- nuclease real-time PCR assay targeting fliP for the rapid identification of Burkholderia mallei in clinical samples / Tomaso H., Scholz H.C., Dahouk S. A. et al. // Clin. Chem. 2006. - Vol. 52. - P. 307-310.

79. Development of procedures for direct extraction of Cryptosporidium DNA from water concentrates and for relief of PCR inhibitors / Jianlin J., Kerri A. A., Singh A. et al. // Appl. Environ.l Microbiol. 2005. - Vol. 71, № 3. - P. 1135-1141.

80. Development and evaluation of a PCR-enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of human brucellosis / Morata P., Queipo-Ortuno M. I., Reguera J. M. et al. //J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol. 41. - P. 144-148.

81. Development and evaluation of a real-time PCR assay targeting the type III secretion system of Burkholderia pseudomallei / Novak R. Т., Glass M. В., Gee J. E. et al. // J. Clin. Microbiol. 2006. - Vol. 44. - P. 85-90.

82. Development and evaluation of serotype- and group-specific fluorogenic Reverse Transcriptase PCR (TaqMan) assays for Dengue Virus / Callahan J. D., Wu S.-J. L., Dion-Schultz A. et al. // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39. - P. 4119 - 4124.

83. Development of two real-time quantitative TaqMan PCR assays to detect circulating Aspergillus fumigatus DNA in serum / Costa C., Vidaud D., Olivi M. et al. // J. Microbiol. Methods. 2001. - Vol. 44, № 3. - P. 263-269.

84. Diggle M. A., Edwards G. F. S., Clarke S. C. Automation of fluorescence-based PCR for confirmation of meningococcal disease // J. Clin. Microbiol. 2001. — Vol. 39, № 12.-P. 4518-4519.

85. Direct detection of Brucella spp. in raw milk by PCR and reverse hybridization with 16S-23S rRNA spaser probes / Rijpens N.P., Van Asbroeck J. M., Rossau R.et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - Vol. 62. - P. 1683-1688.

86. Direct polymerase chain reaction from whole blood without DNA isolation / Nishimura N., Nakayama Т., Tonoike H. et al. // Ann. Clin. Biochem. 2000. -Vol. 5.-P. 674-680.

87. DNA extraction from soils: old bias for new microbial diversity analysis methods / Martin-Laurent F., Philippot L., Hallet S. et al. // Appl. Environ. Microbiol. -2001. Vol. 67, № 5. - P. 2354-2359.

88. DNA extraction strategies for amplified fragment length polymorphism analysis / Comey C.T., Koons B.W., Presley K.W. et al. // J. Forensic Sci. 1994. - Vol. 39. -P. 1254-69.

89. Dohner D.E., Dehner M.S., Gelb L.D. Ingibition of PCR by mineral oil exposed to UV irradiation for prolonged periods // BioTechniques. 1995. - Vol. 18. — P. 964-967.

90. Duplex Scorpion primers in SNP analysis and FRET / Solinas A., Brown L.J., McKeen C. et al. // Nucleic Acids Res. 2001. Vol. 29, № 20. - P. 96.

91. Effect of heparin on polymerase chain reaction / Satsangi J., Jewell D. P., Welsh K. et al. //Lancet. 1994. - Vol. 343. - P. 1509-1510.

92. Effects of anticoagulants and storage of blood samples on efficacy of the polymerase chain reaction assay for hepatitis С virus / Wang J. Т., Wang Т. H., Sheu J. C. et al. // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30. - P. 750-753.

93. Evaluation and optimization of DNA extraction and purification procedures for soil and sediment samples / Miller D.N., Bryant J.E., Madsen E.L. et al. // Appl. and Environ. Microbiol. 1999. - Vol. 65, № 11. - P. 4715-4724.

94. Evaluation of a fluorescence-based PCR Method for identification of serogroup A meningococci / Diggle M. A., Smith K., Girvan E. K. et al. // J. Clin. Microbiol. -2003. Vol. 41, № 4. - P. 1766-1768.

95. Evaluation of PCR for diagnosis of melioidosis / Haase A., Brennan M., Barrett S. et al. // J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol. 36. - P. 1039-1041.

96. Evidence of labile inhibitors in the detection of Chlamydia trachomatis in cervical specimens by polymerase chain reaction / Clad A., Naudascher I., Flecken U. et al. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1996. - Vol. 15, № 9. - P. 744-747.

97. Flagellum mediated adhesion by Burkholderia pseudomallei precedes invasion of Acanthamoeba astronyxis / Inglis T.J.J., Robertson T.A., Woods D.E. et al. // In-fect.Immun. - 2003. - Vol.71, № 4. - P.2280 - 2282.

98. Fluorescence energy transfer detection as a homogeneous DNA diagnostic method / Chen X., Zehnbauer В., Gnirke A. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1997. -Vol. 94, №20.-P. 10756-10761.

99. Forster V.Th. Zwischenmolekulare energiewanderung und fluoreszenz // Ann. Phys. (Leipzig). 1948. - Vol. 2. - P. 55-75.

100. Freeman W.M., Walker S.J., Vrana K.E. Quantitative RT-PCR: pitfalls and potential // Biotechniques. 1999. - Vol. 26, № 1. - 112-122, 124-125.

101. Further evaluation of a rapid diagnostic test for melioidosis in an area of endemici-ty / O'Brien M., Freeman K., Lum G. et al. // J. Clin. Microbiol. 2004. - Vol. 42. - P. 2239-2240.

102. Gene localization for an autosomal dominant familial periodic fever to 12pl3 / Mulley J., Saar K., Hewitt G. et al. // Am. J. Hum. Genet. 1998. - Vol. 62. - P. 884-889.

103. Genomic plasticity of the causative agent of melioidosis, Burkholderia pseudomallei / Holden M. T. G., Titball R. W., Peacock S. J. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - Vol. 101. - P. 14240-14245.

104. Genome-wide comparison reveals great inter- and intraspecies variability in B. pseudomallei and B. mallei pathogens / Monastyrskaya G., Fushan A., Abaev I. et al. // Res. Microbiol. 2004. - Vol. 155. - P. 781-793.

105. Gibb A. P., Wong S. Inhibition of PCR by agar from bacteriological transport media // J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol. 36, № 1. - P. 275-276.

106. Gibson U.E., Heid C.A., Williams P.M. A novel method for real time quantitative RT-PCR // Genome Res. 1996. - Vol. 6. - P. 995-1001.

107. Gilardi G.L. Characterization of Pseudomonas species isolated from clinical specimens // Appl. Microbiol. 1971. - Vol. 21, № 3. - P. 414 - 419.

108. Glass M. В., Popovic T. Preliminary evaluation of the API 20NE and RapID NF plus systems for rapid identification of Burkholderia pseudomallei and B. mallei II J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol. 43. - P. 479-483.

109. Gubala A. J. Multiplex real-time PCR detection of Vibrio cholera // Journal of Microbiological Methods. 2006. - Vol. 65, № 2. - P. 278-293.

110. Guiver M., Levi K., Oppenhei B. A. Rapid identification of Candida species by TaqMan PCR // J. Clin. Pathol. 2001. - Vol. 54. - P. 362-366.

111. Gullsby K., Storm M., Bondeson K. Simultaneous detection of Chlamydophila pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae by use of Molecular Beacons in a duplex Real-Time PCR // J. Clin. Microbiol. 2008. - Vol. 46, № 2. - P. 727-731.

112. Heid C.A. Real-time quantitative PCR // Genome Res. 1996. - № 6. - P. 986994.

113. High-throughput SNP genotyping by allele-specific PCR with universal energy-transfer-labeled primers / Myakishev M.V., Khripin Y., Hu S. et al. // Genome Res.-2001.-Vol. 11.-P. 163-169.

114. Higuchi R. Kinetic PCR Analysis: Real-time monitoring of DNA amplification reactions // Biotechnology. 1993. - № 11. - P. 1026-1030.

115. Hiyoshi M., Hosoi S. Assay of DNA denaturation by polymerase chain reaction-driven fluorescent label incorporation and fluorescence resonance energy transfer // Anal. Biochem. 1994. - Vol. 221, № 2. - P. 306-311.

116. Homogenous assays for the rapid PCR detection of Burkholderia pseudomallei 16S rRNA gene on a real-time fluorometric capillary thermocycler / Yap E.P.H., Ang S.M., Seah S.G.K. et al. // 2002. - P. 59-70.

117. Hueck CJ. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - Vol. 62. - P. 379^133.

118. Human neurobrucellosis with intracerebral granuloma caused by a marine mammal Brucella spp. / Sohn A. H., Probert W. S., Glaser C. A. et al. // Emerging Infectious Diseases. 2003. - Vol. 9, No. 4. - P. 485-488.

119. Immunofluorescence microscopy for the rapid diagnosis of melioidosis / Walsh A. L., Smith M. D., Wuthiekanun V. et al. // J. Clin. Pathol. 1994. - Vol. 47. - P. 377-379.

120. Imported melioidosis in England and Wales / Dance D.A.B., Smith M.D., Aucken H.M. et al. // Lancet. 1999. - Vol. 353. - P. 208.

121. Indirect hemagglutination assay in patients with melioidosis in northern Australia / Cheng A. C., O'Brien M., Freeman K. et al. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2006. -Vol. 74.-P. 330-334.

122. Individual donor nucleic acid amplification testing for detection of West Nile Virus / Lee D.-H., Mathew J., Pfahler W. et al. // J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol. 43, № 10. - P. 5111-5116.

123. Ingibition of PCR by components of food samples, microbial diagnostic assays and DNA-extraction solutions / Rossen L., Norskov P., Holmstrom K. et al. // Int. J. Food Microbiol. 1992. - Vol. 17. - P. 37-45.

124. Inhibition of PCR in genital and urine specimens submitted for Chlamydia trachomatis testing / Toye В., Woods W., Bobrowska M. et al. // J. Clin. Microbiol. -1998. Vol. 36, № 8. - P. 2356-2358.

125. Inhibitory effects of urine on the polymerase chain reaction for cytomegalovirus DNA / Khan G., Kangro H. O., Coates P. J. et al. // J. Clin. Pathol. 1991. - Vol. 44.-P. 360-365.

126. In situ amplification using universal energy transfer-labeled primers / Nuovo G.J., Hohman R.J., Nardone G.A. et al. // J. Histochem. Cytochem. 1999. - Vol. 47. -P. 273-280.

127. Interaction between Burkholderia pseudomallei and Acanthamoeba species results in coiling phagocytosis, endamoebic bacterial survival, and escape / Inglis T.J.J., Rigby P., Robertson T.A., et al. // Infect. Immun. 2000. - Vol. 68. - P. 1681 -1686.

128. Internally controlled Real-Time PCR monitoring of Adenovirus DNA load in serum or plasma of transplant recipients / Claas E. C. J., Schilham M. W., de Brouwer C. S. et al. // J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol. 43, № 4. - P. 1738-1744.

129. Katcher H.L., Schwartz I. A distinctive property of Tth DNA polymerase: Enzymatic amplification in the presence of phenol // BioTechniques. 1994. - Vol. 16. — P. 84-92.

130. Kovarova M., Draber P. New specificity and yield enhancer of polymerase chain reactions // Nucleic Acids Res. 2000. - Vol. 28, № 13. - P. e70.

131. Kunakorn M., Markham R.B. Clinically practical seminested PCR for Burkholderia pseudomallei quantitated by enzyme immunoassay with and without solution hybridization //J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol. 33. - P. 2131-2135.

132. Mhlanga M.M., Malmberg L. Using molecular beacons to detect single-nucleotide polymorphisms with real-time PCR // Methods. 2001. - Vol. 25, № 4. - P. 463741.

133. Molecular procedure for rapid detection of Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei / Bauernfeind A., Roller C., Meyer D. et al. // J. Clin. Microbiol. -1998. Vol. 36, № 9. - P. 2737-2741.

134. Lakowicz J.R. Energy transfer // Principles of fluorescent spectroscopy. 1983. -Plenum Press, New York, NY. - P. 303-339.

135. Lanciotti R. S., Kerst A.J. Nucleic acid sequence-based amplification assays for rapid detection of West Nile and St. Louis encephalitis viruses // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39. - P. 4506-4513.

136. Lee L.G., Connell C.R., Bloch W. Allelic discrimination by nick-translation PCR with fluorogenic probes // Nucleic ACIds Res. 1993. - Vol. 21. - P. 3761-3766.

137. Lew A. E., Desmarchelier P. M. Detection of Pseudomonas pseudomallei by PCR and hybridization // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32. - P. 1326-1332.

138. Liming S. H., Bhagwat A. A. Application of a molecular beacon-real-time PCR technology to detect Salmonella species contaminating fruits and vegetables I I International Journal of Food Microbiology. 2004. - Vol. 95, № 2. - P. 177-187.

139. Loffert D., Stump S., Schaffrarh N. PCR: Effects of template quality // Qiagen News. 1997. - Vol. 1. - P. 8-10.

140. Lowe P., Engler C., Norton R. Comparison of automated and nonautomated systems for identification of Burkholderia pseudomallei. J. Clin. Microbiol. -2002. - Vol. 40. - P. 4625-4627.

141. Mode of action and application of Scorpion primers to mutation detection / Thel-well N., Millington S., Solinas A. et al. // Nucl. Acids Res. 2000. - Vol. 28. - P. 3752-3761.

142. Molecular beacons as diagnostic tools: technology and applications /Abravaya K., Huff J., Marshall R. et al. // Clin. Chem. Lab. Med. 2003. - Vol. 41, № 4. - P. 468-474.

143. Molecular beacon sequence analysis for detecting drug resistance in Mycobacterium tuberculosis / Piatek A.S., Tyagi S., Pol A.C. et al. // Nature Biotechnol. -1998.-Vol. 16.-P. 359-363.

144. Molecular epidemiologic evaluation of transmissibility and virulence of Mycobacterium tuberculosis /Rhee J. Т., Piatek A. S., Small P. M. et al. // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37. - P. 1764 - 1770.

145. Monitoring HCV RNA viral load by locked nucleic acid molecular beacons real time PCR / Morandi L., Ferrari D., Lombardo C. et al. // J. Viro. Meth. 2007. -Vol. 140.-P. 148-154.

146. Mullis K.B., Fallona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction // Meth. Enzymol. 1987. - Vol. 155. - P. 335-350.

147. Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons / Vet J.A.M., Majithia A.R., Marras S.A.E. et al. // PNAS. 1999. - Vol. 96, № 11. P. 6394-6399.

148. Nazarenko I., Bhatnagar S., Hohman R. A closed tube format for amplification and detection of DNA based on energy transfer // Nucleic Acids Research. 1997. — Vol. 25.-P. 2516-2521.

149. Neubauer H., Meyer H., Finke E. J. Human glanders // Int. Rev. Armed Forces Med. Serv. 1997. - Vol. 70. - P. 258-265.

150. Nimri L.F. Diagnosis of recent and relapsed cases of human brucellosis by PCR assay // BMC Infect. Dis. 2003. - Vol. 3. - P. 5.

151. Nucleic acid similarities among Pseudomonas pseudomallei, Pseudomonas multi-vorans and Actinobacillus mallei / Rogul M., Brendle J .J., Haapala D.K. et al. // J. Bacteriol. 1970. - Vol. 101, № 3. - P. 827-835.

152. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization /Livak K.J., Flood S.J., Marmaro J. et al. // PCR Methods Appl. 1995. - Vol. 4, № 6. -P. 357-362.

153. Olive D.M. Detection of enterotoxigenic Escherichia coli after polymerase chain reaction amplification with a termostable DNA polymerase // J. Clin. Microbiol. — 1989.-V. 27.-P. 261-265.

154. Optimization of the PCR for detection of Staphylococcus aureus nuc gene in bovine milk / Kim C.-H., Khan M., Morin D.E. et al. // J. Dairy Sci. 2001. - Vol. 84, № l.-P. 74-83.

155. Palleroni N. Family of Pseudomonadaceae // Bergey's manual of. systematic bacteriology / Ed. by KriegN., Holt G. Baltimore, 1984. - Vol.l. - P.141-199.

156. Park S., Perlin D. S. Establishing surrogate markers for fluconazole resistance in Candida albicans II Microbial Drug Resistance. 2005. — Vol. 11, № 3. - P. 232238.

157. PCR-based identification of Burkholderia pseudomallei / Merritt A., Inglis T. J. J., Chidlow G. et al. // Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo. 2006. - Vol.48, № 5. - P. 239-244.

158. Penn C.W., Luke C.J. Bacterial flagellar diversity and significance in pathogenesis // FEMS Microbiology Letter. 1992. - Vol. 100. - P. 331-336.

159. Persson K., Hamby K., Ugozzoli L.A. Four-color multiplex reverse transcription polymerase chain reaction—Overcoming its limitations // Analytical Biochemistry. -2005.-Vol. 344, № l.-P. 33-42.

160. Poddar S.K. Symmetric vs asymmetric PCR and molecular beacon probe in the detection of a target gene of adenovirus // Mol. Cell. Probes. — 2000. Vol. 14. - P. 25-32.

161. Potential misidentiflcation of Burkholderia pseudomallei by API 20NE / Inglis T. J., Chiang D., Lee G. S. et al. // Pathology. 1998. - Vol. 30. - P. 62-64.

162. Polymerase chain reaction-gene probe detection of microorganisms by using filter-concentrated samples / Bej A.K., Mahbubani M.N., Dicesare J.L. et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1991. - Vol. 57. - P. 3529-3534.

163. Polymerase chain reaction (PCR) detection of Listeria monocytogenes in diluted milk and reversal of PCR inhibition caused by calcium ions / Bickley J., Short

164. J.K., McDowell D.G. et al. // Lett.Appl. Microbiol. 1996. - Vol. 22. - P. 153158.

165. Preliminary validation of real-time PCR assays for the identification of Yersinia pestis / Tomaso H., Jacob D., Eickhoff M. et al. // Clin. Chem. Lab. Med. 2008. — Vol. 46, № 9. - P. 1239-1244.

166. Proteinase inhibition of the detection of Listeria monocytogenes in milk using the polymerase chain reaction / Powell H.A., Gooding C.M., Garrett S.D. et al. // Lett. Appl. Microbiol. 1994. - Vol. 18. -P. 59-61.

167. Public health assessment of potential biological terrorism agents / Rotz L.D., Khan A.S., Lillibridge S.R. et al. // Emerg. Infect. Dis. 2002. - Vol. 8, № 2. - P. 225230.

168. Quantification of Human Immunodeficiency Virus type 1 pro viral DNA by using TaqMan technology / Zhao Y., Yu M., Miller J. W. et al. // J. Clin. Microbiol. -2002. Vol. 40. - P. 675 - 678.

169. Quantitative detection of Hepatitis В Virus DNA by Real-Time nucleic acid sequence-based amplification with molecular beacon detection / Yates S., Penning M., Goudsmit J. etal. //J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39. - P. 3656-3665.

170. Quantitative multiprobe PCR assay for simultaneous detection and identification to species level of bacterial pathogens / Yang S., Lin S., Kelen G. D. et al. // J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol. 40. - P. 3449 - 3454.

171. Raeymaekers L. Basic principles of quantitative PCR // Mol. Biotechnol. 2000. — Vol. 15, №2. -P. 115-122.

172. Rainbow L., Hart C. A., Winstanley G. Distribution of type III secretion gene clusters in Burkholderia pseudomallei, B. thailandensis and B. mallei II J. Med. Microbiol. 2002. - Vol. 51. - P. 374-384.

173. Ram S., Vajpayee P., Shanker R. Rapid culture-independent quantitative detection of enterotoxigenic Escherichia coli in surface waters by Real-Time PCR with Molecular Beacon I I Environ. Sci. Technol. 2008. - Vol. 42. - P. 4577-4582.

174. Rapid and sensitive identification of pathogenic and apathogenic Bacillus anthracis by real-time PCR / Ellerbrok H., Nattermann H., Ozel M. et. al. // FEMS Microbiol. Lett. 2002. - Vol. 214. - P. 51-59.

175. Rapid detection of Salmonella from hydrodynamic pressure-treated poultry using molecular beacon real-time PCR / Patel J. R., Bhagwat A. A., Sanglay G. C. et al. // Food Microbiol. 2006. - Vol. 23. - P. 39-46.

176. Rapid detection of Salmonellae in poultry with the magnetic immuno-polymerase chain reaction assay / Fluit A.C., Widjojatmodjo M.N., Box A.T.A. et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - Vol. 59. - P. 1342-1346.

177. Rapid detection of the Vibrio cholerae ctx gene in food enrichments using realtime polymerase chain reaction / Fedio W., Blackstone G.M., Kikuta-Oshima L. et al. // J AOAC Int. 2007. - Vol. 90, № 5. - P. 1278-83.

178. Rapid detection of Yersinia pestis with multiplex real-time PCR assays using fluorescent hybridisation probes / Tomaso H., Reisinger E. C., Dahouk S. A. et al. // FEMS Immunology and Medical Microbiology. 2003. - Vol. 38. - P. 117-126.

179. Rapid diagnosis of Brucella epididymo-orchitis by real-time PCR assay in urine samples / Queipo-Ortuno M. I., Colmenero J. D., Munoz N. et al. // J. Urol. 2006. -Vol. 176.-P. 2290-2293.

180. Rapid DNA extraction protocol from soil for polymerase chain reaction-mediated amplification / Smalla K., Cresswell N., Mendonca-Hagler L.C. et al. // J. Appl. Bacteriol. 1993. - Vol. 74. - P. 78-85.

181. Rapid genotypic detection of Bacillus anthracis and the Bacillus cereus group by multiplex real-time PCR melting curve analysis / Kim K., Seo J., Wheeler K. et al. // Immunol. Med. Microbiol. 2005. - Vol. 43, № 2. - P. 301-310.

182. Rapid identification of Candida dubliniensis using a species-specific Molecular Beacon / Park S., Wong M., Marras S. A. et al. // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38.-P. 2829-2836.

183. Rapid immunofluorescence microscopy for diagnosis of melioidosis / Wuthieka-nun V., Desakorn V., Wongsuvan G. et al. // Clin. Diagn. Lab Immunol. 2005. — Vol. 12.-P. 555-556.

184. Rapid presumptive identification of Burkholderia pseudomallei with real-time PCR assays using fluorescent hybridization probes / Tomaso H., Pitt T. L., Landt O. et al. // Mol. Cell Probes. 2005. - Vol. 19. - P. 9-20.

185. Rattanathongkom A., Sermswan R.W., Wongratanacheewin S. Detection of Burkholderia pseudomallei in blood samples using polymerase chain reaction // Mol. Cell Probes. 1997. - Vol. 11. - P. 25-31.

186. Real-time detection of genetically modified soya using Lightcycler and ABI 7700 platforms with TaqMan, Scorpion, and SYBR Green I chemistries / Terry C.F., Shanahan D.J., Ballam L.D. et al. // J AO AC Int. 2002. - Vol. 85, № 4. - P. 938944.

187. Real-Time LightCycler PCR for detection and discrimination of Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis / Kosters K., Reischl U., Schmetz J. et al. // J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol. 40. - P. 1719 - 1722.

188. Real-time multiplex PCR assay for detection of Brucella spp., B. abortus, and B. melitensis / Probert W.S., Schrader K.N., Khuong N.Y. et al. // J. Clin. Microbiol. -2004.-Vol. 42.-P. 1290-1293.

189. Real-Time PCR assay using molecular beacon for quantitation of Hepatitis В Virus DNA / Sum S. S.-M., Wong D. K.-H., Yuen M.-F. et al. // J. Clin. Microbiol. -2004. Vol. 42, № 8. - P. 3438-3440.

190. Real-time PCR system targeting a chromosomal marker specific for Bacillus anthracis / Antwerpen M.H., Zimmermann P., Bewley K. et al. // Mol. Cell. Probes.-2008.

191. Real-time PCR using hybridization probes for the rapid and specific identification of Francisella tularensis subspecies tularensis / Tomaso H., Scholz H. C., Neu-bauer H. et al. // Mol. Cell Probes. 2006. - Vol. 21, № 1. - P. 12-16.

192. Real time polymerase chain reaction: a new powerful tool for the diagnosis of neurobrucellosis / Colmenero J. D., Queipo-Ortuno M. I., Reguera J. M. et al. // J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 2005. - Vol. 76. - P. 1025-1027.

193. Real-time RT-PCR for quantitation of hepatitis С virus RNA / Yang J.H., Lai J.P., Douglas S.D. et al. // J. Virol. Meth. 2002. - Vol. 102. - P. 119-128.

194. Removal of PCR inhibitors from human fecal samples through the use of an aqueous two-phase system for sample preparation prior to PCR / Lantz P.-G., Matsson M., Wadstrom T. et al. // J. Microbiol. Methods. 1997. - Vol. 28 - P. 159-167.

195. Recent developments in laboratory diagnosis of melioidosis / Sirisinha S., Anunta-gool N., Dharakul T. et al. // Acta Trop. 2000. - Vol. 74. - P. 235-245.

196. Retinal VEGF mRNA measured by SYBR green I fluorescence: A versatile approach to quantitative PCR / Simpson D.A., Feeney S., Boyle C. et al. // Mol. Vis. 2000. - Vol. 6. -P. 178-183.

197. Reust C.E. SOAP: solutions to often asked problems. Chlamydia trachomatis testing // Arch. Fam. Med. 2000. - Vol. 9, № 9. - P. 885-886.

198. Rickert A. M., Lehrach H., Sperling S. Multiplexed Real-Time PCR using universal reporters // Clinical Chemistry. 2004. - Vol. 50, №. 9. - P. 1680-1683.

199. Rudney J.D., Chen R., Pan Y. Endpoint quantitative PCR assays for Bacteroides Jbrsythus, Porphyromonas gingi valis, andActinobacillus actmomycetemcomitans II Journal of Periodontal Research. 2003. - Vol. 38, № 5. - P. 465-470.

200. Ryu C., Lee K., Yoo C. Sensitive and rapid quantitative detection of Anthrax Spores isolated from soil samples by real-time PCR // Microbiol. Immunol. — 2003. Vol. 47, № 10. - P. 693-699.

201. Saha B.K., Tian В., Bucy R.P. Quantitation of HIV-1 by real-time PCR with a unique fluorogenic probe // J. Virol. Methods. 2001. - Vol. 93. - P. 33-42.

202. Sandhya S., Chen W., Mulchandani A. Molecular beacons: A real-time polymerase chain reaction assay for detecting Escherichia coli from fresh produce and water // Analytica Chimica Acta. 2008. - Vol. 614. - P. 208-212.

203. Serum is the preferred clinical specimen for diagnosis of human brucellosis by PCR / Zerva L., Bourantas K., Mitka S. et al. // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39.-P. 1661-1664.

204. Short report: a rapid method for the differentiation of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis / Wuthiekanun V., Anuntagool N., White N. J. et al. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2002. - Vol. 66. - P. 759-761.

205. Simplified detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum using smear microscopy and PCR with molecular beacons / Haldar S., Chakravorty S., Bhalla M. et al. // Journal of Medical Microbiology. 2007. - Vol. 56. - P. 1356-1362.

206. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences / Higuchi R., Dollinger G., Walsh P.S. et al. // Biotechnology. 1992. - Vol. 10. - P. 413-417.

207. Simultaneous detection of influenza viruses A and В using real-time quantitative PCR / van Elden L. J. R., Nijhuis M., Schipper P. et al. // J. Clin. Microbiol. -2001.-Vol. 39.-P. 196-200.

208. Simultaneous detection of microorganisms in soil suspension based on PCR amplification of bacterial 16S rRNA fragments / McGregor D.P., S.Forster, J.Steven et al.//BioTechniques. 1996. -Vol. 21.- P. 463-471.

209. Skottman Т., Piiparinen H., Hyytiainen H. et al. Simultaneous real-time PCR detection of Bacillus anthracis, Francisella tularensis and Yersinia pestis // J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2007. - Vol. 26, № 3. - P. 207-211.

210. Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil / Kuske C. R., Banton K. L., Adorada D. L. et al. // Appl. and Environ. Microbiol. 1998. - Vol. 64, № 7. p. 2463-2472.

211. Specific detection of Brucella DNA by PCR / Romero C., Gamazo C., Pardo M., et al. // J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol. - 33. - P. 615-617.

212. Stanton A.T., Fletcher W. Melioidosis and its relation to glanders // J. Hyg. 1925. -Vol. 23.-P. 347-363.

213. Starnbach M. N., Falkow S., Tomkins L. S. Species-specific detection of Legionella pneumophila in water by DNA amplification and hybridization // J. Clin. Microbiol. 1989.-Vol. 27.-P. 1257-1261.

214. Steffan R.J., Atlas R.M. DNA amplification to enchance detection of genetically engineered bacteria in environmental samples // Appl. Environ. Microbiol. 1988. -Vol. 54.-P.2185-2191.

215. Strand specific quantitative real-time PCR to study replication of hepatitis С virus genome / Komurian-Pradel F., Perret M., Deiman B. et al. // Journal of Virological Methods. 2004.-Vol. 116.-P. 103-106.

216. Strategies for PCR based detection of Burkholderia pseudomallei DNA in paraffin wax embedded tissues / Hagen R. M., Gauthier Y. P., Sprague L. D. et al. // Mol. Pathol. 2002. - Vol. 55. P. 398-400.

217. Structural flexibility in the Burkholderia mallei genome / Nierman W. C., DeSha-zer D., Kim H. S. et al. // Proc.Natl. Acad. Sci USA. 2004. - Vol. 101. - P. 14246-14251.

218. Suitability of partial 16S ribosomal RNA gene sequence analysis for the identification of dangerous bacterial pathogens / Ruppitsch W., Stoger A., Indra A. et al. // J. Appl. Microbiol. 2007. - Vol. 102, № 3. - P. 852-859.

219. Tan W.H., Wang K.M., Drake T.J. Molecular beacons // Curr. Opin. Chem. Biol. -2004. -№ 8. -P. 547-553.

220. TaqMan amplification system with an internal positive control for HCV RNA quantitation / Castelain S., Descamps V., Thibault V. et al. // J. Clin. Virol. 2004. -Vol. 31.-P. 227-234.

221. Tebbe C.C., Vahjen W. Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - Vol. 59. - P. 2657-2665.

222. Thermodynamic basis of the enhanced specificity of structured DNA probes / Bonnet G., Tyagi S., Libchaber A. et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1999. - Vol. 96, №11. - P. 6171-6176.

223. The LightCycler: a micro volume multisample fluorimeter with rapid temperature control / Wittwer C.T., Ririe K.M., Andrew R.V. et al. // Biotechniques. 1997. -Vol. 22.-P. 176-181.

224. The prothrombin gene is expressed in the rat kidney / Grover P. K., Dogra S. C., Davidson B. P. et al. // Eur. J. Biochem. 2000. - Vol. 267. - P. 61-67.

225. Thibault F. M., Valade E., Vidal D. R. Identification and discrimination of Burkholderia pseudomallei, B. mallei, and B. thailandensis by real-time PCR targeting type III secretion system genes // J. Clin. Microbiol. 2004. - Vol. 42. - P. 5871-5874.

226. Trichomonas vaginalis detection using real-time TaqMan PCR / Schirm J., Bos P.A.J., Roozeboom-Roelfsema I.K. et al. // Journal of microbiological methods. 2007. - Vol. 68, № 2. - P. 243-247.

227. Tsai Y., Olson B.H. Detection of low numbers of bacterial cells in soil and sediments by polymerase chain reaction // Appl. Environ. Microbiol. 1992. — Vol. 58.-P. 754-757.

228. Tsai Y., Olson B.H. Rapid method for separation of bacterial DNA from humic substances in sediments for polymerase chain reaction // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - Vol. 58. - P. 2292-2295.

229. Tyagi S., Bratu D. P., Kramer F.R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination // Nature Biotechnol.-1998. Vol. 16. - P. 49-53.

230. Tyagi S., Kramer F.R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization // Nature Biotechnol. 1996. - № 14. - P. 303-308.

231. Use of a multiplex Molecular Beacon platform for rapid detection of methicillin and vancomycin resistance in Staphylococcus aureus / Sinsimer D., Leekha S., Park S. et al. // J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol. 43, № 9. - P. 4585-4591.

232. Use of a real time PCR assay for detection of the ctxA gene of Vibrio cholerae in an environmental survey of Mobile Bay / Blackstone G. M., Nordstrom J. L., Bo-wen M. D. et al. // Journal of Microbiological Methods. 2007. - Vol. 68, № 2. -P. 254-259.

233. Use of a real-time PCR TaqMan assay for rapid identification and differentiation of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei / U'Ren J. M., Van Ert M. N., Schupp J. M. et al. // J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol. 43. - P. 5771-5774.

234. Use of gDNA as internal standard for gene expression in staphylococci in vitro and in vivo / Vandecasteele S. J., Peetermans W. E., Merckx R. et al. // J. Bacteriol. -2001. Vol. 183. - P. 7094 - 7101.

235. Use of onsite technology for rapidly assessing environmental Bacillus anthracis contamination on surfaces in buildings // MMWR, CDC. 2002. - Vol. 50, № 48. -P. 1087.

236. Use of real-time quantitative PCR to detect Chlamydophila felis infection / Helps C., Reeves N., Tasker S. et al. // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39. - P. 2675 -2676.

237. Using real-time PCR to specifically detect Burkholderia mallei / Ulrich M.P., Norwood D.A., Christensen D.R. et al. // J. Med. Microbiol. 2006. - Vol. 55. - P. 551-559.

238. Use of 16S rRNA gene sequencing for rapid identification and differentiation of Burkholderia pseudomallei and B. mallei / Gee J.E., Sacchi C.T., Glass M.B. et al. // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol.41. - P.4647-4654.

239. Vandesompele J., De Paepe A., Speleman F. Elimination of primer-dimer artifacts and genomic coamplification using a two-step SYBR green I real-time RT-PCR // Anal. Biochem. 2002. - Vol. 303. - P. 95-98.

240. Vaneechoutte M., Van Eldere. The possibilities and limitations of nucleic acid amplification technology in diagnostic microbiology // J. Med. Microbiol. 1997. -Vol. 46.-P. 188-194.

241. Visualizing the dynamics of viral replication in living cells via TAT peptide delivery of nuclease-resistant molecular beacons / Yeh H.-Y., Yates M.V., Mul-chandani A. et al. // Proc Natl Acad Sci USA. 2008. - Vol. 105. - P. 1752217525.

242. Warawa J., Woods D. E. Type III secretion system cluster 3 is required for maximal virulence of Burkholderia pseudomallei in a hamster infection model // FEMS Microbiology Letters. 2005. - Vol. 242, № i. p. Ю1-108.

243. Weyant R.S., Edmonds P., Swaminathan B. Effect of ionic- and nonionic detergents on Taq-polymerase // Bio. Techniques. 1990. — Vol. 9. - P. 308-309.

244. Wheelis M. First shots fired in biological warfare // Nature. 1998. - № 395. -P.213.

245. White N. J. Melioidosis // Lancet. 2003. - Vol. 361. - P.l 715-1722.

246. Wiedbrauk D.L., Werner J. C., Drevon A. M. Inhibition of PCR by aqueous and vitreous fluids //J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol. 33. - P. 2643-2646.

247. Wilde J., Eiden J., Yolken R. Removal of inhibitory substances from human fecal specimens for detection of group A rotaviruses by reverse transcriptase and polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28. - P. 1300-1307.

248. Wilson I.G. Ingibition and fasilitation of nucleic acid amplification // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - Vol. 63. -P.3741-3751.

249. Winstanley C., Hales B. A., Hart C. A. Evidence for the presence in Burkholderia pseudomallei of a type III secretion system-associated gene cluster // J. Med. Microbiol. 1999. - Vol. 48. - P. 649-656.

250. Winstanley C., Hart C. A. Presence of type III secretion genes in Burkholderia pseudomallei correlates with Ara" phenotypes // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38.-P. 883-885.

251. Wong M. L., Medrano J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation // BioTechni-ques. 2005. — Vol. 39, № 1.-P. 1-11.

252. Zysk G., Splettstosser W. D., Neubauer H. A review on melioidosis with special respect on molecular and immunological diagnostic techniques // Clin. Lab. 2000. -Vol. 46.-P. 119-130.

Информация о работе

Зинченко, Ольга Викторовна
кандидата медицинских наук
Саратов, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Разработка методических подходов для специфической индикации и идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза с помощью полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы