Разработка иммунохимических методов диагностики LT подобных токсинов

Алексанкин, Андрей Павлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка иммунохимических методов диагностики LT подобных токсинов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка иммунохимических методов диагностики LT подобных токсинов"

На правах рукописи

Алексанкин Андрей Павлович

РАЗРАБОТКА ИММУНОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ 1Л ПОДОБНЫХ ТОКСИНОВ

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

Работа выполнена в ГНУ Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства им. В.А. Афанасьева и ГУ Научно-исследовательский институт морфологии человека РАМН

Научные руководители: кандидат биологических наук

Козловский Юрий Евгеньевич кандидат биологических наук, доцент Серебряков Сергей Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Соловьев Борис Васильевич кандидат биологических наук Семикрасова Алла Николаевна

Ведущая организация: ФГОУ ВПО Московская

государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина

j с

Защита состоится «. в 2006 г. в/52 _часов на заседании

диссертационного совета Д 006.033.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко по адресу: 109428, Москва, Рязанский проспект, д. 24, корп. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ. Автореферат разослан « »_2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

профессор Н.П. Овдиенко

Общая характеристика работы

Актуальность темы. В настоящее время во многих районах земного шара острые диарейные заболевания остаются нерешенной проблемой ветеринарии и медицины. Причинами роста распространенности кишечных инфекций является увеличение спектра микроорганизмов, которые вызывают развитие инфекционных процессов и целый ряд факторов, способствующих повышению вирулентных свойств условнопатогенной микрофлоры.

Установлено, что изменения патогенности у бактерий реализуются на генетическом уровне через мутации и генетические рекомбинации (В.М. Бондаренко, 1999).

Если раньше наиболее известными возбудителями острых кишечных инфекций были Vibrio cholerae, а также патогены из родов Shigella и Salmonella, то в настоящее время все большее этиологическое значение приобретают условнопатогенные энтеробактерии в том числе и Escherichia coli (А.Р. Мавсютов, С.В. Фиалкина, 2002).

Многочисленными исследованиями было установлено, что ведущую роль в патогенезе диарейных заболеваний играют так называемые цитотонические токсины: термолабильный (LT) и термостабильный (STI, STII) энтеротоксины, синтез которых кодируется плазмидами (Ю.В. Вертиев 1996; В. Spangler 1992; Dallas et al., 1980).

В большинстве случаев от токсикоинфекций страдает молодняк сельскохозяйственных животных, а также пушных зверей. Поскольку токсикоинфекции, обусловленные различными представителями семейства энтеробактерий, наносят серьезный ущерб сельскому хозяйству (Д. Д. Новак, Т.А. Гришина, И.И. Сидорчук и др., 1995), актуальной задачей является борьба с ними.

Серьезная роль в борьбе с токсикоинфекциями отводится их ранней диагностике. Поскольку нет четкой корреляции между принадлежностью энтеробактерий к той или иной серогруппе и типом продуцируемых ими

токсинов (О.А. Полякова, 1986), возникает необходимость определения энтеротоксина.

Большинство соответствующих биологических тестов трудоемки, характеризуются низкой чувствительностью, неудовлетворительной воспроизводимостью результатов. В случае энтеротоксинов эшерихий это биопроба на мышах-сосунках (Dean et al., 1972), тест отека лап у мышей (R.A. Finkelsein, 1976; Вартанян и др., 1978), тест на изолированной петле кишечника кролика (Evans et al., 1973; Holmgren et al., 1982), результат которых зависит от многих факторов и не всегда объективен. Применяемые для определения LT тесты на культурах клеток (C.N. К wan 1974; S.T. Donta, 1976; Nozawa et al., 1978) так же мало специфичны.

Вышеперечисленных недостатков лишены иммунохимические методы определения энтеротоксинов. Оптимальной, на наш взгляд, является разработка иммуноферментных тест-систем (ИФА) и радиоиммунологических тест-систем (РИА) для определения энтеротоксинов. ИФА, так же как и РИА, намного более специфичен и чувствителен, чем биологические методы или методы, основанные на преципитации, но не требует применения радиоактивных реагентов. Идеальным инструментом для создания подобных методов индикации энтеротоксинов эшерихий являются моноклональные антитела (мкАт).

В настоящее время за рубежом получены мкАт к LT и ST энтеротоксинам эшерихий (M. Thomson et.al, 1984). Разработаны также твердофазный метод ИФА для определения ST энтеротоксина на основе мкАт и РИА системы для определения LT и ST энтеротоксинов (Yolken et al., 1977).

Учитывая все вышеизложенное, целью нашего исследования является разработка иммунохимических методов для качественного определения термолабильного энтеротоксина в исследуемых образцах.

Оптимальным в данном случае является создание иммуноферментного диагностикума с использованием специфических моноклональных антител.

Цель исследования. Целью настоящего исследования является разработка на основе оригинальных мкАт иммуноферментной тест-системы для качественного определения термолабильного энтеротоксина в исследуемых образцах.

Задачи исследования.

1. Выделить и очистить препаративное количество термолабильного энтеротоксина эшерихий.

2. Получить и очистить мкАт к термолабильному энтеротоксину в препаративных количествах.

3. Изучить возможность создания иммунохроматографической тест-системы (ИХА) на основе мкАт.

4. Разработать на основе мкАт специфическую и высокочувствительную иммуноферментную тест-систему для качественного определения термолабильного энтеротоксина.

5. Провести лабораторные испытания разработанной иммуноферментной тест-системы.

Научная новизна исследования.

Новизна настоящего исследования состоит в следующем:

1. С целью увеличения выхода высокоочщценного термолабильного энтеротоксина эшерихий модифицирована схема его выделения и очистки.

2. Показана принципиальная возможность разработки на основе мкАт иммунохромато графического диагностикума для определения термолабильного энтеротоксина.

3. Впервые разработана с использованием оригинальных мкАт иммуноферментная тест-система дня качественного определения термолабильного энтеротоксина.

ТЕСТ). Разработанная тест-система может быть использована при исследованиях биологического материала в ветеринарной и медицинской практике на наличие ЬТ-подобных токсинов.

Результаты исследований использованы при написании нормативно-технической документации по изготовлению и применению диагностикума для определения термолабильного энтеротоксина (утвержден Секцией пушного звероводства РАСХН протокол №6 от 20 сентября 2005).

Личный вклад соискателя заключается в модификации метода получения и очистки термолабильного энтеротоксина, подборе пары мкАт для разработки иммуноферментного и иммунохромато графического диагностикума с целью определения термолабильного энтеротоксина, проведение лабораторных испытаний разработанного диагностикума по обнаружению термолабильного энтеротоксина в образцах корма и пробах фекалий, анализе и обобщении результатов исследований.

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации доложены на международной научно-практической конференции "Ветеринарная медицина - 2004", (Феодосия, 2004), научной конференции ГУ НИИ морфологии человека РАМН «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии», (Москва, 2006), , на заседании Ученого совета ГНУ НИИПЗК им В.А. Афанасьева (2004, 2005, 2006 гг.). Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены на межлабораторном заседании сотрудников ГНУ НИИПЗК им В.А. Афанасьева (2006 г.)

Основные положения, выносимые на защиту. Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения:

-результаты модифицированной схемы по выделению и очистке термолабильного энтеротоксина эшерихий;

-результаты качественного определения LT-подобных токсинов иммуноферментной тест-системой, разработанной на основе оригинальных мкАт;

-результаты качественного определения термолабильного энтеротоксина с помощью иммунохроматографической тест-системы;

-результаты лабораторных исследований по обнаружению термолабильного энтеротоксина в образцах кормов и пробах фекалий с помощью иммуноферментной тест-системы.

Публикации. Основные материалы диссертации изложены в 6 научных статьях, отражающих основное содержание работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах компьютерного текста и включает в себя введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, библиографический список используемой литературы, приложения. Работа содержит 19 таблиц и 18 рисунков. В списке использованной литературы 248 источников, в том числе 176 иностранных.

Содержание работы Материалы и методы исследования В работе использовались лабораторные штаммы E.coli С 600 и его производные, холерный токсин (Sigma, США), В-субьединица холерного токсина (Sigma, США), А-субьединица холерного токсина (CALBIOCHEM, США), а так же коллекция штаммов энтеробактерий, изолированных от пушных зверей, сельскохозяйственных животных, человека и выделенных из объектов окружающей среды.

Для культивирования микроорганизмов и получения биомассы, штаммы выращивали в среде Luria-Bertani (LB) в условиях активной аэрации в термостатируемом шейкере при 37°С в течение 18 часов. Лизат микробных клеток получали посредством ультразвуковой обработки биомассы по методике М.В. Степановой (1985), воздействием лизоцимом и тритоном X-

100 по методике Г.В. Холминой (1980), мочевиной по методике Л.И. Давыдовой (1998).

Выделение термолабильного энтеротоксина из лизатов осуществляли посредством фракционирования сульфатом аммония, гель-фильтрацией на Sepharose 6В (Amersham Biosciences, США), с последующей аффинной хроматографией на голубой агарозе. Голубую агарозу получали в лабораторных условиях посредством иммобилизации красителя цибакрона голубого 3FGA на агарозной матрице.

Для оценки чистоты выделенных препаратов термолабильного энтеротоксина использовали метод электрофореза в ПААГе с SDS-Na по U.K. Laemmli (1970). Концентрацию белка определяли методом Лоури или путем измерения оптической плотности раствора при 280 нм. ■ " Биологическую активность препарата термолабильного энтеротоксина определяли по методу Ю.П. Вартанян (1978) в тесте отека лап на самках белых мышей линии BALB/c (массой 18-20 г.). Поликлональные антитела к термолабильному энтеротоксину получали посредством иммунизации кроликов породы советская шиншилла (массой 2-2,5 кг) препаратом энтеротоксина.

Обнаружение энтеротоксина и специфических поликлональных антител в сыворотке проводили по методу Ухтерлони (1950). Антигенную активность полученных препаратов оценивали посредством метода I.I. Mekalanos (1978) и выражали в единицах удельной активности (е.а./мг).

Клеточные работы проводили по методике Е. Fazekas (1980). Очистку мкАт, содержащихся в асцитической жидкости, проводили высаливанием с помощью сульфата аммония с последующей ионообменной хроматографией на DEAE Toyopearl 650М (Toyo Soda, Япония).

Получение в препаративных количеств мкАт к термолабильному энтеротоксину проводили путем внутрибрюшинного введения : клеток гибридом мышам линии BALB/c (массой 18-20 г.) с последующим получением асцитической жидкости.

Коньюгат мкАт с периксидазой хрена получали перийодатным методом по Вилсону и Накане (1974). Иммунологическую активность асцитов и очищенных мкАт определяли в непрямом ИФА. Для подбора пары мкАт при разработке тест-системы использовали двухцентровой ИФА.

Определение термолабильного энтеротоксина в исследуемых образцах проводили при помощи иммунохроматотрафических полосок с адсорбированными мкАт к термолабильному э нтерото ксину и коньюгатом мкАт с коллоидным золотом (Sigma, США).

Эпитопную специфичность мкАт устанавливали с помощью иммуноблоттинга. Перенос антигена на нитроцеллюлозные фильтры и гибридизацию с мкАт осуществляли по общепринятой методике (Blake M.S., 1984). Проявление иммунореплики осуществляли при помощи орто-фенилдиамина.

Для статистической обработки полученных результатов пользовались методами вариационной статистики. Достоверность различий между показателями определяли по t-критерию Стьюдента (Г.Ф. Лакин, 1989).

Результаты собственных исследований Получение и очистка термолабильного энтеротоксина Для выделения и очистки термолабильного энтеротоксина использовали модифицированный нами метод Л.И. Давыдовой (1998).

Таблица 1 — Последовательности очистки LT

Стадии очистки токсина Концентра ция белка мг/мл Общая активность е. а. х 10"3 Удельная активность Степень очистки Выход %

Грубый экстракт 540,6 1080 9,9 - 100

Сульфат аммония 135,7 270 10,05 39 66,5

Гель-фильтрация 85,7 171 997,6 157 54,3

Аффинная хроматография 0,72 1,44 1165,0 200 37,5

Очистка термолабильного энтеротоксина проводилась в три стадии, ~ включающие в себя фракционирование сульфатом. аммония и последовательную хроматографическую очистку посредством гель-фильтрации на БерЬагозе 6В (рис. 1) и аффинную хроматографию на голубой агарозе ЗРвА (табл. 1). ,

В результате проведенной работы была достигнута 200-кратная степень очистки термолабильного энтеротоксина с выходом продукта 37,5% Антигенная активность определялась в реакции двойной радиальной иммунодифузии по Ухтерлони с поликлональной антитоксической сывороткой к термолабильному энтеротоксину. Линии преципитации обнаруживаются в разведение токсина в 2, 4, 8 раз, что говорит о его достаточно высокой антигенной активности (рис. 2).

Рис. 1 Гель фильтрация ЬТ на основе верЬапке 6В

1- пик, содержащий максимальное количество ЬТ, 2 - примесь балластных белков

Рис. 2 Результаты реакции иммунодиффузии по "Ухтерлони с антитоксической сывороткой

АС - антитоксическая сыворотка, 1, 2, 3, 4, 5, 6 - разведения токсина в 1/2, 1/4, 1/8, 16, 1/32, 1/64 раза.

Чистота препарата была подтверждена денатурирующим электрофорезом в ПААГе с БОЗ-Ыа (рис. 3), где наблюдались две полосы, соответствующие по молекулярной массе субъединицам А и В. Титр в реакции Ухтерлони составил 1/8. Биологическая активность очищенного энтеротоксина в тесте отека лап мышей дала положительный результат.

Рис. 3 Электрофореграмма термолабильного энтеротоксина на различных стадиях очистки 1 - Токсин (сульфатная фракция), 1 - после гель-фильтрации, 3 - после аффинной хроматографии, 4,5 - сконцентрированный в 200 раз токсин.

Очищенный препарат термолабильного энтеротоксина использовался при иммунизации кроликов с целью получения антитоксической сыворотки. Нативную сыворотку очищали посредством ионообменной хроматографии на БЕЛЕ Тоуорег1 650М (рис. 4) и высаливанием сульфатом аммония. Таким образом, был получен препарат поликлональных антител. Титр очищенной сыворотки в реакции Ухтерлони составил 1/16 (рис. 5). Гомогенность подтверждена электрофорезом в ПААГе с БОБ-Ка (рис. 6).

0,003

Рис. 4 График элюции поликлональных антител ЕОП - единицы оптической плотности элюции при 280 нм. I, П, Ш — номера фракций. М- молярность. Фракция № Ш — очищенные политональные антитела.

Рис. 5 Реакция Ухтерлони с очищенными поликлональными антителами

1/2, 1/4, 1/8, 1/16 - Титр очищенных поликлональных антител в реакции Ухтерлони

Рис. 6 Электрофореграмма полученных поликлональных антител к термолабильному энтеротоксину К - контроль (нативная сыворотка).

1,2,3 - поликлональные антитела после ионообменной хроматографии, полученные от трех кроликов.

Полученные после очистки поликлональные антитела практически не содержали примесей балластных белков, на электрофореграмме четко видны легкие и тяжелые цепи иммуноглобулинов (рис. 6). Очищенные таким образом поликлональные антитела использовались в дальнейшей работе.

Культуральные работы Использование перитониальных макрофагов За сутки до размораживания исследуемого клона, в 24-луночный планшет со стерильной средой ИРМ! - 1640 вносили клетки перитониальных макрофагов (рис. 7). Они служили источником биологически активных веществ и при культивировании поглощали нежизнеспособные клетки.

ШШШЁШШ

..-ь -■»■ - =

• 'ЗЙ,

.....V- ■ -ол-.««

у*. ,

Рис. 7 Перитониальные макрофаги в культуральной среде М - перитониальные макрофаги

Получение препаративных количеств мкАт

Клоны, показавшие положительный результат в непрямом ИФА (табл. 2), были перенесены из 24-х луночных планшетов в культуральные флаконы с целью получения количества клеток, необходимого для внутрибрюшинного введения мышам линии ВА1ЛЗ/с. На всех этапах культур аль ной работы часть клеток обязательно замораживалась в специальной среде с целью предотвращения потери клонов гибридом.

Таблица 2 — Клоны гибридом, используемые в работе

Антиген Клоны

ЪТ ту-8 ту. 1 ТУ- Ы Т7- 13 IV- 4 тл 12 К. 4, К3 , К4 , К4 , Г^з , К4

Для всех 6-ти клонов была получена асцитическая жидкость в объеме от 8 до 10 мл (табл. 3). Для первичной очистки мкАт из асцитной жидкости использовали метод осаждения сульфатом аммония с последующей ионнообменой хроматографией на сорбенте ОЕАЕ-Тоуореаг1650 М (рис. 8).

Таблица 3 - Концентрация иммуноглобулинов в асцитической жидкости

мкАт Изотип Содержание мкАт в асцитной жидкости мг/мл

Кз1 10

К/ 5,2

К413 1й01 2,9

Кз4 1й01 13,6

К4- 1*61 1,2

Концентрация иммуноглобулинов в асцитах колебалась от 1,2 до 13,6 мг/мл, наиболее высокими показателями отличались препараты мкАт К'з, К*з

ИК94.

2,0

1,0

0,3

Рис. 8 Элюция антител с колонки для ионнообменной хроматографии

ЕОП — единицы оптической плотности элюции при 280 нм. t - время. I, И, Ш - номера фракций. М — молярность солевого буфера. Целевой белок содержался во фракции П.

Чистота полученных препаратов моноклональных антител контролировалась методом электрофоретического разделения в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (рис. 9), а активность в непрямом ИФА.

Рис. 9 Электрофорез мкАт в ПААГе в присутствии додецилсульфата

натрия

5 - контроль (мкАт до очистки). 1 - К94, 2 — к'з, 3 - К154, 4 — К3д: различные мкАт после ионнообменой хроматографии. Были очищены мкАт из 4-х различных клонов гибридом, провереных на активность.

Иммуноблоттинг

Специфичность мкАт проверяли с помощью иммуноблоттинга. В качестве матриксов для связывания термолабильного энтеротоксина при иммуноблоттинге использовали нитроцеллюлозную мембрану (BIO-RAD, США). Перенос субъединиц энтеротоксинов, в том числе термолабильного после денатурирующего электрофореза, проводили в буфере для переноса в течение 1 часа при мощности 70 В и силе тока 250 мА. После завершения переноса осуществляли блокирование неспецифической сорбции в блокирующем буферном растворе на шейкере в течение 30 минут при 37°С. После блокирования проводили гибридизацию с первичными мкАт на шейкере в течение 30 минут при 37 °С. На следующем этапе, проводили отмывку мембраны в промывочном буфере на шейкере 30 минут при 37 °С и добавляли вторичные мкАт, коньюгированые с пероксидазой хрена, полученные против иммуноглобулинов мышей, инкубировали на шейкере 30 минут при После инкубации проводили отмывку геля промывочным

буфером на" шейкере 30 минут при 37°С. Проявление иммунореплики (рис. 10) осуществляли при помощи О-фенилендиамина на шейкере в течение 10 минут при 37°С.

I II

Рис. 10 Иммуноблоттинг с мкАт К'4

1 - В-субъединица холерного токсина (Sigma США); 2 - холерный токсин (Sigma США); 3 - термолабильный энтеротоксин. А - А-субьединица, В - В-субьединица. I — электрофореграмма, П - иммуноблоттинг с мкАт к®4.

Моноклональные антитела, исследованные таким образом, показали свою специфичность по отношению к рецепторной части молекулы 1/Г и иммунологически родственному ему холерному токсину.

Для разработки тест-системы по определению термолабильного энтеротоксина иммуноферментным методом нами были получены конътогаты мкАт с ферментом, в данном случае с пероксидазой хрена. Для этого нами была проведена конъюгация 4 мкАт по методу Вилсона и Наканы. Все конъюгаты были активны и применялись в дальнейшей работе как "верхние" антитела.

Подбор специфической пары моноклональных антител для разработки двухцентровой иммуноферментной тест-системы Следующим этапом наших исследований было проведение экспериментов по одновременному связыванию двух мкАт с термолабильным энтеротоксином методом двухцентрового ИФА (табл. 4)

Таблица 4 - Результаты определения одновременного взаимного связывания двух мкАт с молекулой ЬТ методом двухцентрового ИФА

мкАт коньюгированые сПХ Твердофазные мкАт т/»1 ж." 9 »-4 Л 3 К 4 К 4 IV 3

К]з — + + + + +

КЧ4 + + — + + +

+ I + — + +

К«з + + | + + . + —

+ положительная реакция, — отрицательная реакция,

++ результат, показавший максимальную оптическую плотность в ИФА.

Таким образом, мкАт К'3 образует специфическую пару с мкАт К94 мкАт К^з; мкАт К94 образуют специфическую пару с к'3 К154; мкАт К,34 только с мкАт К^з; мкАт К^з с мкАт К*3 с К94. Данная пара К^ К94 в дальнейшем использовалась при создании диагностикума так как показывала, по сравнению с другими парами мкАт, наибольшую оптическую плотность при минимальной концентрации антигена.

Создание тест-системы для определения ЬТ При разработке иммуноферментной тест-системы мкАт К4, использовались нами для иммобилизации иммунологических планшетов, а мкАт К94 — в качестве коньюгата (табл. 5, рис. 11). Использование данной пары мкАт в обратном порядке приводит в потере чувствительности разрабатываемой тест-системы. Эта система позволяет определить как В-субьединицу в составе цельной молекулы энтеротоксина, так и ее свободную В-субьединицу.

Таблица 5 - Результаты определения термолабильного энтеротоксина ИФА с использованием пары мкАт К34 и К94

Концентрация ЬТ нг 2000 1000 500 250 125 60 30 0

ЕОП (450 нм) >2 >2 1,916 ±0,01 1,436 ±0,01 0,913 ±0,01 0,592 ±0,01 0,278 ±0,01 0,063 ±0,01

(представлены средние оптические плотности при 450 нм трех определений с указанным стандартным отклонением)

Концентрация ЬТ нгУмл

Рис. 11 Калибровочная кривая для определения ЬТ двухцентровым двухступенчатым ИФА

ЕОП- единицы оптической плотности

Калибровочная кривая в диапазоне от 30 до 1000 нг ЬТ имеет линейный характер.

Оптимизация условий постановки иммуноферментного анализа

При проведении иммуноферментного анализа лимитирующим является ряд условий, таких как концентрация мкАт при адсорбции на пластике, значение рН при сорбции мкАт на иммунологические планшеты, рабочее разведение кокыогата мкАт, проявляющий раствор, температура и временные параметры различных стадий иммунохимической реакции.

Мы установили, что оптимальной концентрацией мкАт при сорбции на планшеты является 10 нг/мл, рН посадочного буфера - 3,2, а температурный режим 37 °С. В качестве проявляющего раствора мы использовали тетраметилбензидин. Время инкубации исследуемых проб и конъюгата составило 30 минут, инкубация с проявляющим раствором 10 минут.

В качестве отрицательного контроля использовали фосфатный буферный раствор, в качестве калибровочных точек использовали полученный и очищенный нами термолабильный энтеротоксин.

Аналитические параметры иммуноферментной тест-системы на ЬТ

Чувствительность тест-системы — это наименьшее количество анализируемого вещества, определяемого с помощью данного набора, которое статистически достоверно, отличается от величины оптической плотности отрицательной пробы, не содержащей анализируемого соединения (Тигранян Р. А, 1994).

8= ¡Х(Щ>-ОЦо)2 V п-1

где: О/70 - среднее арифметическое значение оптической плотности

отрицательного контроля;

ОПд - значение оптической плотности каждого измерения для

отрицательного контроля;

П - число измерений

Для штаммов определение концентрации ЬТ составляет менее 6 нг/мл.

Под специфичностью понимали способность данной иммуноферментной тест-системы определять только то соединение, для определения которого

эта система предназначена. Специфичность проверяли путем постановки ИФА с другими типами энтеротоксинов микроорганизмов. Получить положительный результат с этими токсинами не удалось (табл. 6)

Таблица б - Специфичность тест-системы LT-ИФА

№ Энтеротоксины Результат реакции Оптическая плотность М±ш

1 STI - 0,051±0,002

2 STII - 0,054±0,001

3 Шига подобный токсин I типа - 0,068±0,001

4 Шита подобный токсин П типа - 0,055±0,001

5 Положит, контроль LT (С — 125 нг) + 0,732±0,002

6 Отрицат. контроль (Clt - 0) - 0,057±0,001

ST 1 и ST 2 — термостабильные энтеротоксины эшерихий.

Из таблицы видно, что все исследуемые энтеротоксины, кроме положительного контроля, показали отрицательный результат в иммуноферментном анализе. Оптическая плотность энтеротоксинов достоверно отличалась от положительного контроля (Р>0,999).

Определение термолабильного энтеротоксина при помощи иммунохроматографического анализа

После разработки ИФА тест-системы для определения термолабильного энтеротоксина следующим этапом нашей работы была разработка иммунохроматографического теста для качественного определения термолабильного энтеротоксина в исследуемых образцах. В работе использовались четыре мкАт К'з, К'д, К154, которые были адсорбированы на нитроцеллюлозную мембрану (МгШроге, США), два мкАт К94, К*з были коньюгированы с коллоидным золотом и использовались в качестве красителя для проявления иммунологической реакции (рис.12). Антимышиный конъюгат наносился на нитроцеллюлозную мембрану в

качестве контроля. В результате проведенных экспериментов ЬТ в ИХА определялся в более высоких концентрациях, нежели в ИФА.

Рис. 12 Определение ЬТ иммунохроматографическим анализом

А - положительный результат, В - отрицательный результат. 1 -исследуемый образец, 2 — мкАт конъюгированные с коллоидным золотом, 3 -мкАт против ЬТ, 4 — антимышиные антитела, 5 - нитроцеллюлозная мембрана.

Образование двух визуально видимых полосок свидетельствуют о положительном результате, образование одной полосы об отрицательном результате или низкой чувствительности диагностикума. Так же были проведены сравнительные исследования по определению термолабильного энтеротоксина в ИФА и ИХА (табл. 7).

Таблица 7 - Результаты сравнение определения ЬТ в ИФА и ИХА

Концентрация ЬТ/нг ЕОП в ИФА Определение ЬТ в ИХА

2000 >2000 +

1000 >2000 +

500 1,916 ±0,01 +

250 1,436±0,01 +

125 0,913±0,01 +

60 0,592±0,01 -

30 0,278±0,01 -

0 0,063±0,01 -

ЕОП- единицы оптической плотности

На основании полученных результатов (табл. 7) можно сделать вывод, что иммунохроматографическим анализом можно определить термолабильный энтеротоксин в концентрации только свыше 60 нг.

Лабораторные испытания иммуноферментной тест системы Анализ бактериальных штаммов на токсинообразование

В работе использовались лабораторные штаммы различных бактерий семейства Enterobacteriaceae, которые были проанализированы в иммуноферментном анализе на токсинообразование.

Приступая к скринингу бактерий с помощью иммуноферментного анализа, необходимо было подготовить используемые образцы к анализу. Для этого штаммы бактерий выращивали в 10 мл LB в течение 18 часов на шейкере при 37 °С, 200 об/мин. Биомассу с целью получения осадка центрифугировали при 15000 об/мин в течение 15 мин, супернатант отбрасывали, а осадок обрабатывали буфером для экстракции термолабильного энтеротоксина с 12 М мочевиной и лизоцимом.

Полученный таким образом препарат исследовался в иммуноферментном анализе. В 96 луночный планшет Costar (США) с адсорбированными мкАт вносили по 50 мкл положительного контроля (LT — 125 нг\мл) и 50 мкл (LT - 0 нг\мл) отрицательного контроля, во все остальные лунки по 50 мкл исследуемых проб. Планшет накрывали крышкой и термостатировали в течении 30 минут при 37 °С. Затем планшеты 4 раза промывали промывочным буфером в количестве 200 мкл/лунка, тщательно удаляя остатки буфера. Затем вносили конъюгированные антитела в фосфатном буферном растворе, инкубировали 30 минут при 37 °С. После 4-разовой отмывки промывочным буфером вносили проявляющий раствор ТМБ, и после остановки реакции через 10 мин 2М H2S04 спектрофотометрически определяли интенсивность поглощения при 450 нм.

Из 83 проверенных штаммов 18 (22%) дали положительную реакцию, остальные 62 (78%) показали отрицательный результат. Оптическая плотность исследуемых образцов колебалась в пределах от 0,052 до 0,405 ЕОП, что позволяет судить о различном уровне токсигенности изучаемых штаммов. Настоящие результаты соответствуют данным, полученным И.В. Плугиной (2003) в полимеразной цепной реакции.

Обнаружение термолабильного энтеротоксина в биологических образцах Мы провели исследования по выяснению возможности использования ИФА для обнаружения термолабильного энтеротоксина в биологических образцах и кормах.

По результатам проведенных исследований кормов животного происхождения и проб фекалий установлено, что токсигенные штаммы вне зависимости от уровня продукции ими термолабильного энтеротоксина, хорошо обнаруживались разработанной нами тест-системой (табл. 8).

Таблица 8 - Определение ЬТ в пробах фекалий и кормах иммуноферментным методом

№ опыта Результат в ИФА Оптическая плотность в ИФА в пробах фекалий (М±т) Оптическая плотность в ИФА в кормах (М±т)

1 + 0,162±0,001 0,155±0,001

2 + 0,173±0,002 0,190±0,001

3 + 0,138±0,001 0,161±0,001

Положительный контроль + 0,130±0,001 0,181±0,001

Отрицательный контроль - 0,059±0,001 0,059±0,001

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о высокой чувствительности иммуноферментной тест-системы при обнаружении термолабильного энтеротоксина в биологических образцах.

Разработка методов быстрой и специфичной диагностики термолабильного энтеротоксина имеет большое значение, особенно для массового скрининга бактериальных штаммов. Тест-система позволяет работать с малым количеством материала. Минимальная определяемая концентрация термолабильного энтеротоксина составляет 6 нг/мл.

Данные, полученные в результате проведенных исследований свидетельствуют о необходимости применения иммуноферментного анализа для обнаружения токсигенной микрофлоры в биологических объектах.

Таким образом, нами впервые была разработана и создана иммуноферментная тест-система на основе оригинальных мкАт для качественного определения термолабильного энтеротоксина в исследуемых образцах. С ее помощью были проведены эксперименты по обнаружению термолабильного энтеротоксина в образцах корма и пробах фекалий. Термолабильный энтеротоксин обнаруживался во всех исследуемых лизатах.

Впервые показана возможность использования мкАт для разработки иммунохроматографической тест-системы с целью быстрого и точного обнаружения ЬТ.

Выводы

1. Модифицированный метод выделения и очистки термолабильного энтеротоксина эшерихий делает возможным получение биологически и иммунологически активного энтеротоксина из клеток штаммов суперпродуцента с высокой степенью очистки.

2. Показана возможность использования полученного высокоочшценного термолабильного энтеротоксина для определения иммунологической активности мкАт, иммунизации лабораторных животных, а так же при разработке и производстве иммуноферментной тест-системы.

3. Подобрана специфическая пара мкАт К^з, К94 и впервые разработан на их основе иммунохроматографический диагностикум для качественного определения термолабильного энтеротоксина.

4. Разработана на основе оригинальных мкАт высокочувствительная иммуноферментная тест-система для качественного определения термолабильного энтеротоксина в исследуемых образцах. Чувствительность тест-системы составила 6 нг/мл, специфичность подтверждена в опыте с использованием шигаподобных токсинов I и II типа, а так же термостабильных энтеротоксинов БТ I и вТ И.

5. Проведенные лабораторные испытания разработанного диагностикума показали его эффективность при определении термолабильного энтеротоксина в лизатах, полученных из коллекции штаммов энтеробактерий. Из 83 исследуемых штаммов энтеротоксин достоверно определен в изолятах 22% штаммов. В образцах кормов и пробах фекалий термолабильный энтеротоксин обнаруживался в 100% случаев.

Практические предложения

1. Предлагаем использовать модифицированную схему для получения и очистки ЬТ-подобных токсинов.

2. Разработанная иммуноферментная тест-система для качественного определения термолабильного энтеротоксина может быть использована в ветеринарной и медицинской практике.

3. Учитывая простоту, воспроизводимость и информативность иммуноферментной тест-системы, рекомендуем ее как доступный и специфичный метод для обнаружения термолабильного энтеротоксина в биологических образцах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Алексанкин А.П. Использование моноклональных антител в разработке иммунохимических методов детекции термолабильного энтеротоксина эшерихий/Алексанкин А.П., Матевосян К.Ш., Пьянкова А.Н., Серебряков С.Н.// Международная научно-практическая конференция "Ветеринарная медицина — 2004", Феодосия. Меж. тематический науч. сборник, 2004, №84, с.814-815.

2. Алексанкин А.П. Иммуноферментная тест-система для определения термолабильного энтеротоксина эшерихий/Алексанкин А.П., Матевосян К.Ш., Белоновская О.С., Серебряков С.Н. // Вопросы физико-химической биологии в ветеринарии: Сб. научн. тр. - М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ им К.И. Скрябина, 2004-2005, с. 53-56.

3. Алексанкин А.П. Разработка антитоксического препарата на основе резидентной микрофлоры/Тихонова Н.Б., Плугина И.В., Матевосян К.Ш., Пьянкова А.Н., Серебряков С.Н., Козловская Г.В, Алексанкин А.П., Козловский Ю.Е. // Бюллетень Волгоградского научного центра РАМН, 2005, №1, с 71-72.

4. Алексанкин А.П. Изменение микрофлоры желудочно-кишечного тракта у мышей линий C57BLX6 и BALB\c при холодовом стрессе. Сб. научных трудов/Козловский Ю.Е., Королева O.E., Матевосян К.Ш., Серебряков С.Н., Трунова Г.В., Алексанкин А.П., Овчарова А.Н., Козловская Г.В., Харламов Р.В. // "Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии" - 2006 г. с. 121-124.

5. Алексанкин А.П. Определение термолабильного энтеротоксина в кормах и фекалиях с помощью иммуноферментной тест-системы/Алексанкин А.П. // Ж. Крол. и звер. 2006. №5. с. 26.

6. А.Р. Alexankin. Investigation of pathogenic and immunological properties of Aeromonas hydrophila and characteristic analysis of some subcellular components/T.I. Khomyakova, H. Gong, J. Yang, Ch. Dong, T. Song, T. Lin, O.V. Makarova, Yu.E. Kozlovskyi, A.P. Alexankin, S.E. Severin, Yu.N. Khomyakov. // Ж. Молекулярная медицина, 2006. №3 с. 33-38.

Подписано в печать 22.09.2006

Формат 60x90/16

Объём 1.5 п.л.

Тираж 100 экз.

Заказ № 22090616

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт» ИНН/КПП 7728572912X772801001

Адрес: 117292, г. Москва, ул. Дмитрия Ульянова, д. 8, кор. 2. Тел. 125-22-73. ИИр:/Ллл№УУ.ип1уе го rint.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Алексанкин, Андрей Павлович

Список используемых сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Токсины энтеробактерий.

1.1.1. Энтеротоксины.

1.1.1.1. 8Т-энтеротоксины.

1.1.1.2. Термолабильный энтеротоксин.

1.2. Распространение способности токсинообразования среди различных групп микроорганизмов.

1.3. Методы культивирования токсигенных эшерихий.

1.4. Методы выделение и очистки термолабильного энтеротоксина

1.5. Методы обнаружения термолабильного энтеротоксина.

1.5.1. Методы биологического обнаружения термолабильного энтеротоксина.

1.5.2. Иммунохимические методы диагностики термолабильного энтеротоксина.

1.5.3. Другие методы детекции термолабильного энтеротоксина.

1.6. Моноклональные антитела.

Глава 2. Собственные исследования.

2.1. Материалы и методы.

2.1.1. Штаммы бактерий.

2.1.2. Лабораторные животные.

2.1.3. Среды для культивирования микроорганизмов и клеточных культур.

2.1.4. Буферные растворы.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Получение биомассы штамма продуцента термолабильного энтеротоксина.

2.2.2.1. Получение препаратов термолабильного энтеротоксина ультразвуком.

2.2.1.2. Экстракция термолабильного энтеротоксина из клеток продуцентов 8М мочевиной.

2.2.1.3. Выделение термолабильного энтеротоксина с использованием лизоцима.

2.2.2. Осаждение термолабильного энтеротоксина сульфатом аммония.

2.2.3. Гель-фильтрация.

2.2.4. Аффинная хроматография.

2.2.5. Определение концентрации белка.

2.2.6. Электрофорез в ПААГе.

2.2.7. Иммуноблотинг.

2.2.8. Определение антигенной активности.

2.2.9. Реакция радиальной иммунодифузии по

Ухтерлони.

2.2.10. Тест на биологическую активность термолабильного энтеротоксина.

2.2.11. Получение поликлональных антител.

2.3. Методы работы с культурами клеток.

2.3.1. Клонирование гибридом.

2.3.2. Хранение клеток.

2.3.3. Размораживание клеток.

2.3.4. Получение препаративного количества мкАт.

2.3.5. Очистка мкАт с помощью ионообменной хроматографии.

2.4. Иммуноферментный анализ.

2.4.1. Приготовление конъюгата мкАт и поликлональных антител с пероксидазой хрена.

2.4.2. Приготовление проявляющего раствора.

2.4.3. Непрямой метод иммуноферментного анализа.

2.4.4. Двухцентровой метод иммуноферментного анализа.

2.4.5. Определение токсигенности бактериальных штаммов.

2.5. Иммунохроматографический анализ.

Глава 3. Результаты исследований.

3.1. Выделение и очистка термолабильного энтеротоксина эшерихий.

3.1.1. Получение биомассы штамма продуцента.

3.1.2. Получение грубых-экстрактов штамма продуцентов.

3.1.3. Фракционирование грубого экстракта сульфатом аммония

3.1.4. Очистка препарата энтеротоксина посредство гель -фильтрации.

3.1.5. Аффинная хроматография на голубой агарозе.

3.1.6 Определение чистоты полученных препаратов термолабильного энтеротоксина.

3.1.7. Определение антигенной активности термолабильного энтеротоксина.

3.1.8. Определение биологической активности термолабильного энтеротоксина.

3.1.9. Определение специфичности мкАт с использованием иммуноблотинга.

3.2. Получение поликлональной антисыворотки против термолабильного энтеротоксина.

3.2.1. Выделение и очистка поликлональных антител из антитоксической сыворотки.

3.2.2. Хроматография поликлональной сыворотки на ЭБАЕ Тоуореаг! 650М.

3.2.3. Определение специфичности препаратов поликлональных антител.

3.2.4. Получение конъюгатов поликлональных антител с пероксидазой хрена.

3.2.5. Подбор оптимальных условий для сорбции поликлональных антител на пластик.

3.3. Получение и очистка препаративных количеств мкАт.

3.3.1. Использование перитониальных макрофагов.

3.3.2. Получение препаративных количеств мкАт.

3.3.3. Хроматографическая очистка мкАт на сорбенте ОЕАЕ-ТоуореаН 650М.

3.3.4. Определение чистоты полученных препаратов мкАт.

3.3.5. Исследования используемых мкАт методом ИФА.

3.3.5.1. Получение конъюгатов мкАт с пероксидазой хрена

3.3.5.2. Подбор специфической пары мкАт для обнаружения термолабильного энтеротоксина.

3.3.5.3. Определение оптимальных условий сорбции мкАт на иммунологические планшеты.

3.4. Создание иммуноферментной тест-системы для определения термолабильного энтеротоксина.

3.4.1. Аналитические параметры иммуноферментной тест-системы для обнаружения термолабильного энтеротоксина.

3.5. Определение термолабильного энтеротоксина при помощи иммунохроматографического анализа.

3.6. Испытание иммуноферментной тест системы.

3.6.1. Анализ бактериальных штаммов на токсинообразование.

3.6.2. Определение термолабильного энтеротоксина в кормах.

3.6.3. Определение термолабильного энтеротоксина в биологических образцах.

Глава 4. Обсуяедение результатов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка иммунохимических методов диагностики LT подобных токсинов"

Многочисленными исследованиями было установлено, что ведущую роль в патогенезе диарейных заболеваний играют так называемые цитотонические токсины: термолабильный (LT) и термостабильиый (STI, STII) энтеротоксины, синтез которых кодируется плазмидами (Ю.В. Вертиев 1996; В. Spangler 1992; Dallas et al., 1980).

В большинстве случаев от токсикоинфекций страдает молодняк сельскохозяйственных животных, а также пушных зверей. Поскольку токсикоинфекции, обусловленные различными представителями семейства энтеробактерий, наносят серьезный ущерб сельскому хозяйству (Д.Д. Новак, Т.А. Гришина, И.И. Сидорчук и др., 1995), актуальной задачей является борьба с ними.

Большинство соответствующих биологических тестов трудоемки, характеризуются низкой чувствительностью, неудовлетворительной воспроизводимостью результатов. В случае энтеротоксинов эшерихий это биопроба на мышах-сосунках (Dean et al., 1972), тест отека лап у мышей (R.A. Finkelsein, 1976; Вартанян и др., 1978), тест на изолированной петле кишечника кролика (Evans et al., 1973; Holmgren et al., 1982), результат которых зависит от многих факторов и не всегда объективен. Применяемые для определения LT тесты на культурах клеток (C.N. Kwan 1974; S.T. Donta, 1976; Nozawa et al., 1978) так же мало специфичны.

В настоящее время за рубежом получены мкАт к LT и ST энтеротоксинам эшерихий (М. Thomson et.al, 1984). Разработаны также твердофазный метод ИФА для определения ST энтеротоксина на основе мкАт и РИА системы для определения LT и ST энтеротоксинов (Yolken et al., 1977).

Задачи исследования.

1. Выделить и очистить препаративное количество термолабильного энтеротоксина эшерихий.

2. Получить и очистить мкАт к термолабильному энтеротоксину в препаративных количествах.

3. Изучить возможность создания иммунохроматографической тест-системы (ИХА) на основе мкАт.

4. Разработать на основе мкАт специфическую и высокочувстви гельную иммуноферментную тест-систему для качественного определения термолабильного энтеротоксина.

5. Провести лабораторные испытания разработанной иммуноферментной тест-системы.

Научная новизна исследования.

Новизна настоящего исследования состоит в следующем:

1. С целью увеличения выхода высокоочищенного термолабильного энтеротоксина эшерихий модифицирована схема его выделения и очистки.

2. Показана принципиальная возможность разработки на основе мкАт иммунохроматографического диагностикума для определения термолабильного энтеротоксина.

3. Впервые разработана с использованием оригинальных мкАт иммуноферментная тест-система для качественного определения термолабильного энтеротоксина.

Практическая значимость. На основе проведенных исследований разработан технологический регламент на иммуноферментную тест-систему для качественного определения термолабильного энтеротоксина (ЬТ-ИФА-ТЕСТ). Разработанная тест-система может быть использована при исследованиях биологического материала в ветеринарной и медицинской практике на наличие ЬТ-подобных токсинов.

Результаты исследований использованы при написании нормативно-технической документации по изготовлению и применению диагносгикума для определения термолабильного энтеротоксина (утвержден Секцией пушного звероводства РАСХН протокол №6 от 20 сентября 2005).

-результаты модифицированной схемы по выделению и очистке термолабильного энтеротоксина эшерихий;

-результаты качественного определения ЬТ-подобных токсинов иммуноферментной тест-системой, разработанной на основе оригинальных мкАт;

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Алексанкин, Андрей Павлович

Выводы

1. Модифицированный метод выделения и очистки термолабильною энтероюксина эшерихий делает возможным получение биологически и иммунологически активного энтеротоксина из клеток штаммов суперпродуцента с высокой степенью очистки.

2. Показана возможность использования полученною высокоочищенного термолабильного энтеротоксина для определения иммунологической активности мкАт, иммунизации лабораторных животных, а так же при разработке и производстве иммуноферментной тест-системы.

3. Подобрана специфическая пара мкАт К4з, К94 и впервые разработан на их основе иммунохроматографический диагностикум для качественного определения термолабильного энтероюксина.

4. Разработана на основе оригинальных мкАт высокочувствительная иммуноферментная тест-система для качественного определения термолабильного энтеротоксина в исследуемых образцах. Чувствительность тест-системы составила 6 нг/мл, специфичность подтверждена в опыте с использованием шигаподобных токсинов I и 11 типа, а так же термостабильных энтеротоксинов БТI и БТII.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Алексанкин, Андрей Павлович, Москва

1. Алмагамбетов К., Горская Е.М., Бондаренко В.М. Транслокация кишечной микрофлоры и ее механизмы // Журн. микроб., эпидем., иммун.- 1991.-№ 10.-С. 74-78.

2. Бондаренко В.М. Токсические биомолекулы патогенных энтеробактерий // Аграрная Россия. 2002. - № 2 - С. 29-32.

3. Бондаренко В.М. "Острова" и "островки" патогенности бактерий // Аграрная Россия. 2002. - № 2. - С. 33 - 35.

4. Бондаренко В.М. Мавзютов А.Р., Габидуллин З.Г. Термостабильные энтеротоксины условно патогенных представителей Enterobacter!асеае // Журн. микроб., эпидем., иммун. 1998. - № 3. - С. 104-107.

5. Бондаренко В.М., Мавзютов А.Р. Ингибиторы полимеразной цепной реакции // Генодиагностика инфекционных заболеваний, 4 Всеросс. Науч.-практич. конфер. 2002. - С.399-402.

6. Бондаренко В.М., Мавзютов А.Р. Секретируемые факторы патогенности энтеробактерий // Микробиология. 2002. - № 1. - С. 84-90.

7. Бондаренко В.М., Тимофеева И.Т., Степанова М.В., Вертиев Ю.В. О значимости высеваемости клебсиелл, энтеробактер. цитробактер и кишечных иерсиний при бактериологических исследованиях // Журн. микроб., эпидем., иммун. 1987. - № 6. - С. 74-78.

8. Бондаренко В.М. Факторы патсиенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса // Микробиология. 1999. - № 5. -С. 34-39.

9. Бухарин О.В, Туйгунов М.М., Зурочка A.B., и др. Феномен апоптоза в выживании энтеробактерий в системе паразит хозяин // Журн. микроб., эпидем., иммун. - 2002. - № 1. - С. 79-81.

10. Вартанян Ю.П. Методы биологического тестирования энтеротоксинов // Журн. микроб., эпидем., иммун. 1981. - № 3. - С. 19-24

11. Вартанян Ю.П., Северцова М.К., Введенская О.И., Станиславский Е.С. Отек лап белых мышей тес г для оценки активности энтеротоксинов E.coli // Бюл. экспер. биол. - 1978. - № 2. - С. 150-152.

12. Вертиев Ю.В. Бактериальные токсины: биологическая сущность и происхождение // Журн. микроб., эпидем., иммун. 1996. - №3. - С. 43-46.

13. Вертиев Ю.В., Шагинян И.А., Степанова М.В. Определение токсигенности штаммов кишечной палочки и холерного вибриона радиоиммунологическим методом // Молек. ien. микробиол. и вирусол. 1985. - № 3. - С.38-40.

14. Вертиев Ю.В. Молекулярная структура бактериальных токсинов и генетический контроль их биосинтеза // М. 1985.

15. Вертиев Ю.В. Токсин-опосредованная обусловленность инфекционных заболеваний // Журн.микроб., эпидем., иммун. 1987. - № 3. - С. 86-92.

16. Войтенко A.B., Ливанова Л.Ф., Ерошенко Г.А., Щербаков A.A., Смирнова Н.И. Конструирование штаммов E.coli // Ветеринария. -2000,-№9.-С. 27-31.

17. Волынский М.Я., Вартанян Ю.П., Станивлавский Е.С., Табачник А.Л., Гиршович Е.С. Выделение термолабильного энтеротоксина и изучение его биологических свойс1в // Бюл. экспер. биол. 1976. - № 10.-С. 1237-1239.

18. Давыдова Л.И. Разработка технологии получения очищенных препаратов термолабильного энтеротоксина эшерихий // Диссертационная работа на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М. 1998. 146 с.

19. Домарадский И.В. Вирулентность бактерий как функция адаптации // Журн. микроб., эпидем., иммун. 1997. - № 4. - С. 16-20.

20. Домарадский И.В. Некоторые проблемы адаптации патогенных бактерий к окружающей среде // Журн. микроб., эпидем., иммун. -1997.-№4.-С. 31-35.

21. Дурихин К.В., Попова А.Е. Количественная оценка биологической активности фильтратов культуры холерного вибриона на белых мышах // Журн. микроб., эпидем., иммун. 1974. - № 9. - С. 52-56.

22. Езепчук Ю.В. Биомолекулярные основы патогенности бактерий // М.1985.- 240 с.

23. Екимов А.Н., Шипулин Г.А., Бочкарев Е.Г, Рюмин Д.В. Новейшие технологии в генодиагностике: полимеразная цепная реакция в реальном времени (real-time PCR) // Вестник последипломн.медицинск. образования. 2002. - 3. - С.7-10

24. Емельяненко П.А. Биологические методы ващиш животных oi бактериальных энгероюксинов // Докл. Рос. сель.-хоз. наук. 2004. -№ 1. - С. 52-53.

25. Емельяненко П.А., Козловский Ю.Е., Тинаева Е.А. Экспериментальное обоснование защиты пушных зверей о г токсикозов бактериальной этиологи // "Проблемы пушного звероводства и кролиководства". Матер, конфер. 1997. - С. 81-82.

26. Жукова Э.В., Ша1инян H.A., Гайлонская H.H. Определение энтеротоксина холерных вибрионов методом пассивного иммунного гемолиза//Журн. микроб., эпидем., иммун. 1981. - № 4. - С. 55-59.

27. Зенин-Бермес H.H., Мальцева Т.В., и др. Этиология энтеробактериальных кишечных заболеваний у детей раннего возраста //Журн. микроб., эпидем., иммун. 1985. - № 9. - С. 17-20.

28. Зыкин Л.Ф., Дунаев Г.С. Получение и свойства энтеротоксина неагглютинирующихся вибрионов // Журн. микроб., эпидем., иммун. 1974.-№3.-С. 62-66.

29. Калачиков С.М., Адаричев В.А., Дымшиц Г.М. Иммобилизация ДНК на микропористых мембранах с помощью УФ-облучения // Биоорганич. химия. 1992. - т. 18. - № 1. - С. 52-62.

30. Камзолкина Н.Б. Энтеротоксины сальмонелл // Журн. микроб., эпидем., иммун. 1983. - № 3. - С. 9-15.

31. Канарейкина С.К., Левина E.H. и др. Условно-патогенная микрофлора семейства Enterobacteriaceae здоровых и больных детей раннего возраста с острыми кишечными инфекциями невыясненой этиологии //Журн. микроб., эпидем., иммун. 1981. - № 4. - С. 82-85.

32. Кафтырева Л.А., Макарова М.А., Егорова С.А. Геноиндикация факторов патогенности эшерихий как метод достоверной лабораторной диагностики острых кишечных инфекций //Сб.тр.науч.-практ.конф."Генодиагностика инфекционных заболеваний". 2004. -T.2.-C. 45-46.

33. Киселева Б.С., Голубева И.В. Дифференциация и идентификация бактерий семейства Enterobacteriaceae // Сборник трудов. Диагностические препараты и методы лабораторной диагностики заболеваний, вызываемых энтеробактериями / ВНИИВС. 1977. - С. 39-40.

34. Кудлай Д.Г. Внехромосомные факторы наследственное ж бактерий и их значение в инфекционной патологии // М., Медицина. 1977. - 224с.

35. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований // М. 1978.

36. Лакин Г.Ф. Биометрия // М.:Высшая школа. 1990. - 352 с.

37. Лиходед В.Г., Табачник А.Л., Шулыа М.Г. Плазмиды кишечных бактерий // Журн. микроб., эпидем., иммун. 1978. - № 12. - С. 3-9.

38. Маиианис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование // М., Мир. 1984.

39. Микульские А.В., Доморадская Т.И. и др. Клонирование и экспрессия гена термостабильного энтеротоксина Escherichia coli // Биоорганическая химия. 1992. - т. 18. - № 1. - С. 63-70.

40. Миллер Д. Эксперименты в молекулярной генетике // М., 1976.

41. Мнацаканов С.Т. Сочетание факторов патогенности у Escherichia coli, выделенных от детей и домашних животных // Журн. микроб., эпидем., иммун. 1987. - № 6. - С. 36-38.

42. Мнацаканов С.Т. Факторы колонизации у эшерихий, выделенных от детей с острыми кишечными заболеваниями // Журн. микроб., эпидем., иммун. 1983. - № 7. - С. 41-42.

43. Никитин В.М. Справочник методов биохимической экспресс-индикации микробов // Кишинев: Картя Молдовеняскэ. 1986. - 296 с.

44. Петровская В.Г., Бондаренко В.М. Общие принципы генетического контроля патогенности бактерий // Журн. микроб., эпидем., иммун. -1994. № 3. - С. 106-110.

45. Петровская В.Г., Бондаренко В.М. Энтеротоксины энтеротоксигенных Escherichia coli: характеристика, механизм действия и генетический контроль // Журн. микроб., эпидем., иммун. 1990.-№7.-С. 92-98.

46. Поликарпов Н.А., Шилов В.М. и др. Биологические свойства условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от здоровых людей и соматических больных с дисбактериозом кишечника // Журн. микроб., эпидем., иммун. 1986. - № 2. - С. 34-38.

47. Полоцкий Ю.Е., Бондаренко В.М., Ефремов В.Е. Патогенез кишечных инфекций и морфологическая оценка вакцин // Журн. микроб., эпидем., иммун. 1992. - № 5. - С. 51-57.

48. Полякова О.А., Евглевская Н.И. и др. Адгезивный антиген К99 итермостабильный энтеротоксин у патогенных эшерихий, возбудителей колибактериоза телят// Ветеринария. 1986. - № 8. - С.37.40.

49. Плугина И.В. Молекулярно-генетический анализ распространения токсигенной микрофлоры // Диссертационная работа на соискание ученой степени кандидата биологических наук, п Родники, Мое. обл., 1998. 143 с.

50. Северцова М.К., Вартанян Ю.П., Горбачев И.Д., Станиславский Е.С. Динамика выделения биологически активного энтеротоксина E.coli // Журн. микроб., эпидем., иммун. 1978. - № 7. - С. 15-17.

51. Серебряков С. Н., Вербицкий М. Ш., Емельяненко П. А., Козловский Ю. Е. Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к различным вариантам термолабильного энтеротоксина эшерихий // Сб. науч. тр. ВИЭВ. 1998.

52. Серебряков С.Н. Получение моноклональных антител к термолабильному энтеротоксину эшерихий // Диссертационная работа на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М 1998. 132 с.

53. Скоупс Р. Методы очистки белков.- М.: "Мир",1985.-358 с.

54. Смирнова JI.A. Сравнительная характеристика токсинов Escherichia coli // Журн. микроб., эпидем., иммун. 1984 - № 1. - С. 56-59.

55. Смирнова Н. И. Основные факторы патогенности холерного вибриона и их генетический контроль // Журн. микроб., эпидем., иммун. 1987-№7.-С. 103-109.

56. Станиславский Е.С., Волынский М.Я. Энтеротоксины энтеробактерий // Журн. микроб., эпидем., иммун. 1976. - № 10. - С. 3-9.

57. Степанова М.В., Вертиев Ю.В. Использование иммуноферментного метода для определения токсигенности штаммов кишечной палочки // Бактериальные токсины: Сб. науч. тр. НИИЭМ им. И. Ф. Гамалеи., -1987.-С. 151-157.

58. Степанова М.В., Вертиев Ю.В. Определение токсигенности штаммов кишечной палочки и холерного вибриона радиоиммунологическим методом // Молек. генетика, микробиол., вирусол. 1985. - № 3. - С.38.40.

59. Табачник А.Л., Гиршович Е.С. Получение и анализ биологических свойств энтеротоксина эшерихий // Сб. науч. тр. НИИ эпидемиологии и микробиологии. 1976. - С. 145-148.

60. Табачник A.JI., Гиршович Е.С., Темпер P.M. Энтеротоксигенные E.coli //Журн. микроб., эпидем., иммун. 1977. -№ 3. - С. 31-38.

61. Тимошенко A.B., Герасимова J1.K., Колупаева Л.И., Черенкевич С.Н. Межклеточная агрегация тимоцитов и бактериальных клеюк Escherichia coli // Биополимеры и клетка. 1991. - № 3. - С. 98-102.

62. Улиско И.Н., Степанова М.В., Вертиев Ю.В., Батуро А.П. Энтеротоксигенные эшерихии у больных острыми кишечными инфекциями // Журн.микроб., эпидем., иммун. 1988. - № 8. - С. 4852.

63. Урбанович Л.Я., Саппо С.Г., Колесник B.C. О факторах патогенности Vibrio cholerae // Журн. микроб., эпидем., иммун. 1988. - № 9. - С. 105-109.

64. Ушкалов В. А., Головко А. Н. Факторы патогенности E.coli, выделенные от телят// Ветеринария. 1992. - № 4. - С. 23-24.

65. Федоров Ю.Н., Брылин А.П., Досталева М.И. Факторы патогенности энетеротоксигенных E.coli и перспективы применения моноклональных антител при эшерихиозах животных // Сельскохоз. биология, 1988,-№5.-С. 117-124.

66. Хайтович А.Б., Ильичев Ю.А., Андроновская И.Б., Кирьякова Л.С. Мониторинг токсигенных штаммов холеры в Украине // Генодиагностика инфекционных заболеваний, 4 Всеросс. Науч.-практич. конфер. 2002. - С.304-305.

67. Хубка Е.И., Яровой П.И., Калинская Т.П. и др. Этиологическая структура острых кишечных инфекций // Лаб. дело. 1990. - № 2. - С. 40-44.

68. Шагинян И.А., Маракуша Б.Н. Модификация метода пассивною иммунного гемолиза на плотной среде для выявлении продукции термолабильных энтеротоксинов штаммами холерных вибрионов и кишечной палочки // Журн. микроб., эпидем., иммун. — 1983. № 7.- С. 92-97.

69. Эберт Л.Я., Лунькина М.В., Русанова H.H. Энтеротоксины эшерихии, выделенные при диарее у недоношенных новорожденных детей // Журн. микроб., эпидем., иммун. 1988. - № 10. - С. 105.

70. Эмдина И.А., Алексеева Л.П., Грищенко H.A., Сомова А.Г. Возможности использования серологических меюдов выявления холерного токсина // Журн. микроб., эпидем., иммун. 1987. - № 11.- С. 60-63.

71. Энтеробакгерии: Руководство для врачей под ред. В.И. Покровского // М, «Медицина». 1985. - 320 с.

72. Acres S. Enterotoxigenic Escherihia coli infection in newbord calves: a review//J. Dairy Sei. 1985. - 68 (1). - P. 229-256.

73. Ajaib S., Monan K.S., Sethi S.K., Vadenra D.V. Cross-neutralisation reactions of E.coli and V.cholerae enterotoxins as studied by rabbit skin inoculation test // Acta Microb. Acad. Sci.Hyng. 1977. - 21 (1). - P. 3339.

74. Blake M.S., et al. A Rapid, Sensitive Method for Detection of Alkaline Phosphatase Conjugated Antibody on Western Blots. Anal. Biochem., 136:175-178,1984.

75. Blome'n I., Lo"fdahl S., Stenstro'm T.A., Norberg R. Identification of enterotoxigenic Escherichia coli isolates: a comparison of PCR, DNA hybridization, ELISAs and bioassays // J. Microbiol. Methods. 1993. -17. - P. 181-191

76. Bopp C.A., Threatt V.L., Moseley S.L., Wells J.G., Wachsmuth I.K. A comparison of alkaline phosphatase and radiolabeled gene probes with bioassays for enterotoxigenic Escherichia coli //Mol. Cell Probes. 1990, -4(3).-P. 193-203.

77. Boros 1., Posfai G., Venetianer P. High-copy-number derivatives of the plasmid cloning vector pBR322 // Gene. 1984. - 30. - P. 257-260.

78. Brunton J., Hinde D., Langston C., Gross R., Rowe В., Gurwith M. Enterotoxigenic Escherichia с oli in central Canada // J. Clin. Microbiol. -1980.- 11.-P. 343-348.

79. Clarke D.R., Harpor I.A., Thompson R.Q. The detection of E. coli heat-labile enterotoxins by ELISA // J.Infection. 1980. - V.9.-N.1. - P. 224251.

80. Clements J.D., Finkelstein R.A. Isolation and characterization of homogeneous heat-labile enterotoxins with high specific activity from Escherichia coli cultures // Infect. Immun. 1979. - 24. - P. 760-769.

81. Clements J.D., Flint D.C., Klhpstein F.A. Immunological and physiochemical characterization of heat-labile enterotoxins isolated from two strains of Escherichia coli // Infect. Immun. 1982. - 38. - P. 806-809.

82. Dahlen P., Syvanen A.C., Hunskainer P. et al. Sensitive detection of genes by sandwich hibridization and time resolved fluorometry // Mol. Cell. Probes. - 1987.- 1.-P. 159-168.

83. Dallas W.S. Conformity between heat-labile toxin genes from human and porcine enterotoxigenic Escherichia coli // Infect. Immun. 1983. - 40. - P. 647-652.

84. Dallas W.S., Falkow S. Amino acid sequence homology between cholera toxin and Escherichia coli heatlabile toxin // Nature (London). 1980. -288.-P. 499-501.

85. De S.N., Chatterje D.N. An experimental study of the mechanism of action of Vibrio cholerae on the intestinal mucous membrane // J. Pathol. Bacterid. 1953. - 66. - P. 559-562.

86. Dean A.G., Ching Y.C., Williams R.B., Harden L.B. Test for Escherichia coli enterotoxin using infant mice: application in a study of diarrhea in children in Honolulu//J. Infect. Dis. 1972. - 125. - P. 407-411.

87. DeBoy J. M., Wachsmuth I.K., Davis B.R. Serotypes of enterotoxigenic Escherichia coli isolated in the United States // Infect. Immun. 1980.- 29. -P. 361-368.

88. Donta S.T. Interaction of choleragenoid and Gm,ganglioside with enterotoxins of V.cholerae and E.coli in cultured adrenal cells // J.Infect.Dis.Suppl. 1976. - 133. - P. 115-119.

89. Donta S.T., Moon H.W., Whipp S.C. Detection of heat-labile Escherichia coli enterotoxin with the use of adrenal cells in tissue culture // Science. -1974,- 183.- P. 334-336.

90. Dragas A.Z., Zaicsatter J., Jane M., Hren V. H., Drinovec B., Strnad S. Some biological characteristics of E.coli strains isolated from acute diarrhoeal diseases of infants // Bacteriol. Parasit.Infect. 1979. - 244 (4). -P. 439-451.

91. Echeverria P., Orskov F., Orskov I., Plianbangchang D. Serotypes of enterotoxigenic Esclherichia coli in Thailand and the Philippines // Infect. Immun. 1982.-36.-P. 851-856.

92. Echeverría P., Taylor D.N., Seriwatana J., Moe C. Comparative study of synthetic oligonucleotide and cloned polynucleotide enterotoxin gene probes to identify enterotoxigenic Escherichia coli // J. Clin. Microbiol. -1987.- 25.-P. 106-109.

93. Edelman R., Levine M.M. Actual diarrheal infections in infants. II. Bacterial and viral causes // Hosp. Pract. 1980. - 15. - P. 97-104.

94. Eisenstein B.I., Engleberg N.C. Applied molecular genetics: new tools for microbiologists and clinicians// J. Infect. Dis. 1986. - 153. - P. 416-430.

95. Evans D.J., Jr., Evans D.G., Gorbach S.L. Polymixin B-induced release of low-molecular-weight heatlabile enterotoxin from Escherichia coli // Infect. Immun. 1974. - 10. - P. 1010-1017.

96. Evans D.G., Evans D.J., Gorbach S.L. Identification of enterotoksigenic Escherichia coli and serum antitoxin activity by the vascular permeability factor assay // Infect. Immun. 1973. - 8. - P. 731-735.

97. Evans D.J., Jr., Evans D.G. Direct serological assay for the heat-labile enterotoxin of Escherichia coli, using passive immune hemolysis // Infect. Immun. 1977.- 16.-P. 604-609.

98. Evans D.G., Evans D.J., Jr. Pierce N. F. Differences in the response of rabbit small intestine to heat-labile and heat stable enterotoxins of Escherichia coli // Infect. Immun. 1973. - 7. - P. 873-880.

99. Feinberg A.P., Vogelstein B.A. A technique for radiolabelling DNA restriction endonuclease fragment to high specific activity // Analyt. Biochem.- 1983.- 132 (1).-P. 6-13.

100. Finkelstein R.A. Progress in the study of cholera and related enterotoxins // In A. W. Bernheimer (ed.), Mechanisms in bacterial toxinology. John Wiley & Sons, Inc. 1976. - P. 53-84.

101. Finkelstein R.A., Jehl I.I., Goth A. Patogénesis of experimental cholerae: choleragen-induced rat foot odema a method of screening anticholeradrugs // Pros.Soc.Exper.Biol.Med., New.York. 132. - P. 835-841.

102. Finkelstein R.A., Yang Z. Rapid test for identification of heat-labile enterotoxin-producing Escherichia coli colonies // J. Clin. Microbiol. -1983.- 18.-P. 23-28.

103. Georges M.C., Wachsmuth I.K., Birkness K.A., Moseley S.L., Georges A.J. Genetic probes for enterotoxigenic Escherichia coli isolated from childhood diarrhea in the Central African Republic // J. Clin. Microbiol. -1983.-18.-P. 199-202.

104. Greenberg, H. B., D. A. Sack, W. Rodriguez, R. B. Sack, R. G. Wyatt, A. R. Kalica, R. L. Horswood, R. M. Chanock, and A. Z. Kapikian. 1977. A microtiter solid-phase radioimmunoassay for detection of

105. Escherichia coli heat-labile enterotoxin. Infect. Immun. 17:541-545.

106. Gill D.M., Clements J.D., Robertson D.C., Finkelstein R.A. Subunit number and arrangement in Escherichia coli heat-labile enterotoxin // Infect. Immun. 1981. - 33. - P. 677-682.

107. Gill D.M., Evans D.J., Evans D.G. Mechanism of activation of adenylate cyclase in vitro by polymixin-released, heat-labile enterotoxin of Escherichia coli//J. Infect. Dis. 1976. - 133. - P. 103-107.

108. Giugliano L.G., Mann G.F., Drasar B.D. Response of mammalian cell lines to the toxin of Escherichia coli // J.Med.Microbiol. 1982. - 15. - P. 531-539.

109. Guanella A.A. Sucking mous model for detection of ST E.coli enterotoxin: characteristics of the Model // Infection and Immunology. 1976. - 14. - P. 95-99.

110. Guerrant R.L., Moore R.A., Kirschenfeld P.M., Sande M.A. Role of toxigenic and invasive bacteria in acute diarrhea of childhood // N. Engl. J. Med. 1975.-293.-P. 567-573.

111. Guth B.E. C., Trabulsi L.R. Evaluation of antisera used for detecting enterotoxigenic Escherichia coli in Sao Paulo // J. Clin. Microbiol. 1985.- 22 (4). P. 626-628.

112. Guth B.E.C., Twiddy E.M., Trabulsi L.R., Holmes R.K. Variation in chemical properties and antigenic determinants among type II heat-labile enterotoxins of Escherichia coli // Infect. Immun. 1986. - 54. - P. 529536.

113. Gyles C.L., So M., Falkow S. The enterotoxin plasmids of Escherichia coli //J. Infect. Dis. 1974. - 130. - P. 40-49.

114. Gylles C.L. Limitation of the infant mouse test for Escherichia coli heat-stable enterotoxin // Canad. J. comp. med. 1979. - 15. - P. 289-301.

115. Hawhey P.M., Lewis D.A. Medical bacteriologi: a practical approach // IRL Press, Oxford.

116. Hirst T.R., Randall L.L., Hardy S.J.S. Cellular location of heat-labile enterotoxin in Escherichia coli // J. Bacteriol. 1984. - 157 (2). - P. 637642.

117. Holmgren J., Fredman P., Lindblad M., Svennerholm A.M., Svennerholm L. Rabbit intestinal glycoprotein receptor for Escherichia coli heat-labile enterotoxin lacking affinity for cholera toxin // Infect. Immun. 1982. - 38.- P.424-433.

118. Holmgren J. Comparison of the tissue receptors for Vibrio cholerae and Escherichia coli enterotoxins by means of gangliosides and natural cholera toxoid // Infect. Immun. 1973. - 8. - P. 851- 859.

119. Honda T., Taga S„ Takeda Y., Miwatani T. Modified Elek test for detection of heat-labile enterotoxin of enterotoxigenic Escherichia coli // J. Clin. Microbiol. 1981,-13.-P. 1-5.

120. Honda T., Tsuiji T., Takeda T., Miwatani T. Immunological non-Identity of heat-labile enterotoxins from humans and porcine enteropathogenic Escherichia coli // infect. Immun. -1981.-34.- P.337-340.

121. Hsu S.M., Raine L., Fanger H. Use of avidin -biotin peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques : a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures // J. Histochem. - 1981. - 29 (4). - P. 577-589.

122. Hunkapiller M.W., Lujan E., Ostrander F., Hood L.E. Methods in enzymology // Academic Press, New York. 1983. - 91. - P. 227.

123. Iida T., Tsuji T., Honda T., Miwatani T., Wakabayashi S., Wada K., Matsubara H. A single amino acid substitution in B subunit of Escherichia coli enterotoxin affects its oligomer formation // J.Biol.Chem. 1989. -264 (24).-P. 14065-14070.

124. Jablonski E., Moomaw E.W., Tullis R.H., Ruth J.L. Preparation of oligodeoxynucleotide-alkaline phosphatase conjugates and their use as hybridization probes // Nucleic Acids Res. 1986.- 14. - P. 6115-6128.

125. Kafos F.C., Jones C.W., Efstratiadis A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure // Nucleic Acids Res. -1979. 7. - P. 1541 -1552.

126. Kantor H.S. Action of E.coli enterotoxin adenilate cyclase behavior of intestinal cells in culture // Infection and Immunology. 1974. - v.9 - P. 1003-1006.

127. Kantor H.S. Enterotoxin of E.coli and V.cholerae model for molecular biologist//J. Infect. Dis. 1975. - 131. - P. 22-32.

128. Kessler C. The digoxigenin:anti-digoxigenin (DIG) technology a survey on the concept and realization of a novel bioanalytical indicator system // Mol. Cell. Probes. - 1991. - 5. - P. 161-205.

129. Keusch G., Donta S. // J.Infect.Dis. 1975. - 131. - № 1.-P.58-62.

130. Khatib L.A., Tsai Y.L., Olson B.H. A biomarker for the identification of cattle fecal pollution in water using the LTIIa toxin gene from enterotoxigenic Escherichia coli // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. -59.-P. 97-104.

131. Kirii Y., Danbara H., Komase K., Arita H., Yoshikawa M. Detection of enterotoxigenic Escherichia coli by colony hybridization with biotinylated enterotoxin probes // J. Clin. Microbiol. 1987. - 25. - P. 1962-1965.

132. Klipstein F.A., Engert R.F. Immunological relationship of different preparations of coliform enterotoxins // Infection and Immunity. 1978.21(3).-P. 771-778.

133. Kunkel S., Robertson D. C. Purification and chemical characterization of heat-labile enterotoxin produced by enterotoxigenic Escherichia coli. // Infect. Immun. 1979. - 25. - P. 586-596.

134. Kwan C.N., Wishnow R.M. E.coli enterotoxin-induced steroidogenesis in cultured adrenal tumor cells // Infection and Immunology. 1974. - 10. - P. 146-151.

135. Landegren U., Kaiser R., Caskey C.T., Hood L. DNA diagnostics-molecular techniques and automation // Science 1988. - 242. - P. 229237.

136. Langer P.R., Waldrop A.A., Ward D.C. Enzimatic synthesis of biotin -lebeled polynucleotides: Novel nucleic acid affinity probes // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -1981. 78 (1 1). - P. 6633-6637.

137. Leary J.J., Brigati D.J., Ward D.C. Rapid and sensitiv colorimetrik method for visualising biotin labeled DNA or RNA immobilised on nitrocellulose: Bio-blot // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. - 1983. - 80 (13). -P. 4045-4049.

138. Levine M.M. Escherichia coli that cause diarrhea: enterotoxigenic, enteropathogenic, enteroinvasive, enterohemorrhagic and enteroadherent // J. Infect. Dis. 1987. - 155. - P. 377-389.

139. Li P., Medon P.P., Skingle D.C., Lanser J.A., Symons R.H. Enzyme-linked synthetic oligonucleotide probes: non-radioactive detection of enterotoxigenic Escherichia coli in faecal specimens // Nucleic Acids Res. 1987.- 15.-P. 5275-5287

140. Maas R., Silva R.M., Gomes T.A.T., Trabulsi L.R., Maas W. Detection of genes for heat-stable enterotoxin I in Escherichia coli strains isolated in Brazil // Infect. Immun. 1985. 49. - P. 46-51.

141. Manning J.E., Hershey N.D., Broker T. R. et al. A new method of in situ hybridization // Chromosoma (Berlin). 1975. - 53 (2). - P. 107-117.

142. Medon P.P., Lanser J.A., Monckton P.R., Li P., Symons R.II. Identification of enterotoxigenic Escherichia coli isolates with enzyme-labeled synthetic oligonucleotide probes// J. Clin. Microbiol 1988. - 26. -P. 2173-2176.

143. Meínkoth J., Wahl G. Hybridization of nucleic acids immobilized on solid supports // Anal. Biochem. 1984. - 138. - P. 267-284.

144. Mekalanos J.J., Swartz D. J., Pearson G.D.N., Harford N., Groyne F., M. de Wilde. Cholera toxin genes: nucleotide sequence, deletion analysis and vaccine development // Nature (London). 1983. - 306. - P. 551 -557.

145. Merson M.H., Orskov F., Orskov I., Sack R.B., Huq I., Koster F.T. Relationship between enterotoxin production and serotypes in enterotoxigenic Escherichia coli // Infect. Immun. 1979. - 23. - P. 325329.

146. Merson M.H., Black R.E., Gross R.J., Rowe B., Huq I., Eusof A. Use of antisera for identification of enterotoxigenic Escherichia coli // Lancet ii -1980.-P. 222-224.

147. Meyers J.A., Sanchez D., Elwell L.P., Falkow S. Simple agarose gel electrophoretic method for the identification and characterization of plasmid deoxyribonucleic acid//J. Bacteriol. 1976. 127. - P. 1529-1537

148. Mills K., Tietze K. Monoclonal antibody enzyme-linked immunosorbent assay for identification of K99 positive Echerichia coli isolates from calves//J.Clin. Microbiol., 1984. - 19, 4. - P. 498-501

149. Minami J., Okabe A., Nagata A., Hayashi H. Quantitative analysis of the production of heat-labile enterotoxin by enterotoxigenic Escherichia coli // Acta Med Okayama. 1984. - 38 (5). - P. 461-469.

150. Moon H.W. Mechanisms of association of enteropatogenic E.coli with intestinal epithelium //Amer.J.Clin.Nut. 1979. - 32(1). - P. 119-127.

151. Moseley S.L., Huq I., Alim A.R.M.A., So M., Samadpour- Motalebi M., Falkow S. Detection of enterotoxigenic E. coli by DNA colony hybridization //J. Infect. Dis. 1980. - 142. - P. 892-898.

152. Moseley S.L., Hardy J.W., Huq M.I., Echeverría P., Falkow S. Isolation and nucleotide sequence determination of a gene encoding a heat-stable enterotoxin of Escherichia coli // Infect. Immun. 1983. - 39. - P. 11671174.

153. Moss J., Richardson S.H. Activation of adenylate cyclase by heat-labile enterotoxin. Evidence for ADP-ribosyl transferase activity similar to that of choleragen // J. Clin. Invest. 1978. - 62. - P. 281-285

154. Mullis K.B., Faloona F. Specific synthesis of DNA "in vitro" via a polymerase-catalysed chain reaction // Methods Enzymol. 1987. - 155. -P.335.

155. Murray B. E., Mathewson J. J., DuPont H. L., Hill W. E. Utility of oligodeoxyribo-nucleotide probes for detecting enterotoxigenic Escherichia coli // J. Infect. Dis. 1987. - 155. - P. 809-811.

156. Nogareda M., Arias M., Sanches-Vizcaino J. Factor de adhesion K88 de cepas eterotoxigenicas porcinas de Echerichia coli y su adaption a la tecnica elisa sandwiche in directo // An. INIA Ser. Ganadera. 1984. - 20. -P. 105-119.

157. Norval M., Bingham R. W. Advances in the use of nucleic acid probes in diagnosis of viral disease of man // Arch. Virol. 1987. - 97. - P. 151-165.

158. Nozawa B.T., Yokota T., Kuwahara S. Assay method for Vibrio cholerae and Escherichia coli enterotoxins by automated counting of floating Chinese hamster ovary cells in culture medium // J. Clin. Microbiol. -1978.-7.-P. 479-485

159. Olive D.M. Detection of enterotoxigenic Escherichia coli after polymerase chain reaction amplification with a thermostable DNA polymerase // J. Clin. Microbiol. 1989. - 27. - P. 261-265.

160. Olive D.M., Atta A.I., Setti S.K. Detection of toxigenic Escherichia coli using biotin-Iabelled DNA probes following enzymatic amplification of the heat labile toxin gene // Mol. Cell. Probes. 1988. - 2. - P. 47-57.

161. Olive D.M., Khalik D.A., Sethi S.K. Identification of enterotoxigenic Escherichia coli using alkaline phosphataselabeled synthetic oligodeoxynucleotide probes // Eur. J. Clin.Microbiol. Infect. Dis. 1988. -7.-P. 167-171.

162. Olsvik 0., Wasteson Y., Lund A., Homes E. Pathogenic Escherichia coli found in food//Int. J. Food Microbiol. 1991.

163. Olsvik O., Strockbine N.A. PCR detection of heat-stable, heat-labile, and Shiga-Iike toxin genes in Escherichia coli. In D. H. Persing, T. F. Smith, F.

164. C. Tenover, and T. J. White (ed.) // Diagnostic molecular microbiology. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1993. - P. 271276.

165. O'Meara D., O'Shaughnessy E., Cryan B., Fanning S. Colorimetric detection of heat-labile toxin-encoding gene of enterotoxigenic Escherichia coli by PCR // J. Clin. Microbiol. 1995. - 33. - P. 1957-1960

166. Orskov F., Orskov I. , Evans D.J., Sack R.B. , Sack D.A., Wadstrom T. Special Escherichia coli serotypes among enterotoxigenic strains from diarrhea in adults and children // Med. Microbiol. Immunol. 1976. - 162.- P. 73-80.

167. Osek J. Multiplex polymerase chain reaction assay for identification of enterotoxigenic Escherichia coli strains // J. Vet. Diagn. Invest. 2001. -13.-P. 308-311.

168. Palva E.T., Hirst T.R., Hardy S.J.S., Holmgren J., Randall L. Synthesis of a precursor to the B subunit of heatlabile enterotoxin in Escherichia coli // 1981.- 146.-P. 325-330.

169. Pickering L.K., Evans D.J., Munoz Jr.0., DuPont H.L., Coelho-Ramirez P., Vollet J.J., Conklin R.H., Olarte J., Kohl S. Prospective study of enteropathogens in children with diarrhea in Houston and Mexico // J. Pediatr.- 1978.-93.-P. 383-388.

170. Pickett C.L., Twiddy E.M., Belisle B.W., Holmes R.K. Cloning of genes that encode a new heat-labile enterotoxin of Escherichia coli // J. Bacteriol.- 1986.- 165.-P. 348-352.

171. Qeary S.J., Marchlewicz B.A., Finkelstein R.A. Comparison of heat-labile enterotoxins from porcine and human strains of Escherichia coli // Infect. Immun. 1982.-36.-P. 215-220.

172. Raab-Traub N., Pagano J.S. Hibridization of viral nucleik acids : newer metods of solid media and in solution // Meth. Virol. 1984. - 8. - P. 1-39.

173. Reis M.H.L., Matos D.P., Castro A.F.P., Toledo M.R.F., Trabulsi L.R. Relationship among enterotoxigenic phenotypes, serotypes, and sources of strains in enterotoxigenic Escherichia coli // Infect. Immun. 1980. - 28. -P. 24-27.

174. Renz M., Kurz С. A colorimetric method for DNA hybridization // Nucleic Acids Res. 1984. - 12. P. 3425-3444.

175. Rigby P.W.J., Dieckmann M., Rhodes C., Berg P. Labeling DNA to high specific activity in vitro by nick translation with DNA polymerase I // J. Mol. Biol. 1977.- 1 13.-P. 237-251

176. Riley L.K., Caffrey C.J. Identification of enterotoxigenic Escherichia coli by colony hybridization with nonradioactive digoxigenin-Iabeled DNA probes//J. Clin. Microbiol. 1990. - 28. - P. 1465-1468.

177. Riley L.W., Remis R.S., Helgerson S.D., McGee H.B. et al. Hemorrhagic colitis associated with a rare E. coli serotype // N. Engl. J. Med. 1983. -308.-P. 681-685.

178. Ronnberg В., Soderlind O., Wadstrom T. Evaluation of a competitive enzyme-linked immunosorbent assay for porcine Escherichia coli heat-stable enterotoxin//J. Clin. Microbiol. 1985.

179. Ryskov A.P., Jincharadse A.O., Prosnyak M.I. et al. M13 phag as universal marker for DNA fingerprint of animals, plant and microorganisms // FEBS Letters. 1988. - 233. - P. 388-392

180. Sack B. R. Human diarrheal disease caused by enterotoxigenic Escherichia coli // Annu. Rev. Microbiol. 1975. - 29. - P. 333-353.

181. Sack D.A., Sack R.B. Test for enterotoxigenic Escherichia coli using Y1 adrenal cells in miniculture // Infect, mmun. 1975. - 11. - P. 334-336.

182. Sack R.B. Human diarrheal disease caused by enterotoxigenic Escherichia coli //Annu. Rev. Microbiol. 1975. - 29. - P. 333-353.

183. Sack R.B. Enterotoxigenic Escherichia coli: identification and characterization//J. Infect. Dis. 1980. - 142. - P. 279-286.

184. Saez-Llorens X., Guzman-Verduzco L.M., Shelton S., Nelson J.D., Kupersztoch Y.M. Simultaneous detection of Escherichia coli heat-stable and heat-labile enterotoxin genes with a single RNA probe // J. Clin. Microbiol. 1989. - 27 (7). - P. 1684-1688.

185. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Scharf S.J., Higuchi R., Horn G.T., Mullis K.B., Erlich H.A. Primerdirected enzymatic amplification of DNAwith a thermostable DNA polymerase // Science. 1988. - 239. - P. 487491.

186. Saiki R.K., Bugawan T.L., Horn G.T., Mullís K.B., Erlich H.A. Analysis of enzymatically amplified P-globin and HLA-DQa DNA with allele-specific oligonucleotide probes // Nature (London). 1986. - 324. - P. 163166.

187. Saulnier P., Andremont A. Detection of genes in feces by booster polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. 1992. - 30. - P. 20802083.

188. Seed B. In: Genetic engineering : principles and methods (ed J.K. Setlow, A. Hollaender) // Plenum Publishing, New York. 1982. - 4. - P. 91.

189. Serafím M.B., Pestaña de Castro A.F., Leonardo M.B., Monteiro A.R. Single radial immune hemolysis test for detection of Escherichia coli thermolabile enterotoxin // J. Clin. Microbiol. 1981. - 14. - P. 473-478.

190. Seriwatana J., Echeverría P., Taylor D.N., Rasrinaul L., Brown J.E., M. Peiris J.S., Clayton C.L. Type II Heat-Labile Enterotoxin-Producing Escherichia coli Isolated from Animals and Humans // Infection.and Immunity.- 1988.-56 (5).-P. 1158-1161.

191. Seriwatana J., Echeverria P., Escamilla J., Glass R., Huq I., Rockhill R., Stoll B. J. Identification of enterotoxigenic Escherichia coli in patients with diarrhea in Asia with three enterotoxin gene probes // Infect. Immun. 1983.-42.-P. 152-155.

192. Sethabutr O., Hanchalay S., Echeverria P., Taylor D.N., Leksomboo U. A nonradioactive DN probe to identify Shigella and enterotoxigenic Escherichia coli in stools of children with diarrhea // Lancet ii 1985. - P. 1095-1097.

193. Smith H.W., Gyles C.L. The relationship between two apparently different enterotoxins produced by enterotoxigenic strains of E.coli of porcine origin// J.Med.Microbiol. 1970. - 3. - P. 387-401.

194. Smith H.W., Halls S. Observation by the ligated intestinal segments and oral inoculation methods on E.coli ifections in pigs, calves, lambs and rabbits // J. Pathol, and Bacter. 1967. - 93. - P. 499-529.

195. Smith H.W., Halls S. The transmissible nature of the genetic factor in E.coli that controls enterotoxin production // J. Gen. Microbiol. 1968. - v. 52.-P. 319-334.

196. So M., McCarthy B.J. Nucleotide sequence of the bacterial transposon Tnl681 encoding a heat stable (ST) toxin and its identification in enterotoxigenic Escherichia coli strains // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1980.-77.-P. 4011-4015.

197. So M., Dallas W.S., Falkow S. Characterization of an Escherichia coli plasmid encoding for synthesis of heat-labile toxin: molecular cloning of the toxin determinant. // Infect Immun. 1978. - 21. - P. 405-411.

198. Sommerfeit H.S., Grewal H.M.S., Bhan M.K. Simplified and accurate nonradioactive polynucleotide geneprobe assay for identification of enterotoxigenic Escherichiacoli // J. Clin. Microbiol. 1990. - 28. - P. 4954.

199. Southern E.M. Detection of specific sequence among DNA fragments separated by gel electrophoresis//J. Mol. Biol. 1975. - 98. - P. 503-517.

200. Spicer E.K., Noble J.A. Escherichia coli heat-labile enterotoxin. Nucleotide sequence of the A subunit gene // J. Biol. Chem. 1982. - 257. -P. 5716-5721.

201. Stacy-Phipps S., Mecca J.J., Weiss J.B. Multiplex PCR assay and simple preparation method for stool specimens detect enterotoxigenic Escherichia coli DNA during course of infection // J. Clin. Microbiol. 1995. - 33. - P. 1054-1059.

202. Stavric S. A modified bioassay for E.coli enterotoxin // Can. J. Microbiol. 1977.-23 (3).-P. 331-336.

203. Stoll B.J., Rowe B., Glass R.I., Gross R.J., Huq I. Changes in serotypes of enterotoxigenic Escherichia coli in Dhaka over time: usefulness of polyvalent antisera // J. Clin. Microbiol. 1983. - 18 - P. 935-937.

204. Suggs S.V., Hirose T., Miyake T., Kawashima E.H., Johnson M.J., Itakura K., Wallace R.B. Use of synthetic oligodeoxyribonucleotides for the isolation of specific cloned DNA sequences // UCLA Symp. Mol. Cell, Biol. 1981.-23.-P. 683-693.

205. Svennerholm A.M., Holmgren J. Identification of Escherichia coli heat-labile enterotoxin by means of a ganglioside immunosorbent assay (GMI-ELISA) procedure. //Curr. Microbiol. 1978. - 1. - P. 19-23.

206. Takeda Y., Shimonishi Y., Takeda T., Miwatani T. Molecular structure and function of heat stable enterotoxins of enterotoxigenic Escherichia coli // Microecol. Ther. 1984. - 14. - P. 43-52.

207. Tamanai-Shacoori Z., Jolivet-Gougeon A., Pommepuy M., Cormier M., Colwell R.R. Detection of enterotoxigenic Escherichia coli in water by polymerase chain reaction amplification and hybridization // Can. J. Microbiol. -1994. 40. - P. 243-249.

208. Taub F., Thompson E.B. An improved method for preparing large arrays of bacterial colonies containing plasmids for hybridization: in situ purification and stable binding of DNA on paper filters // Anal. Biochem. -1982.- 126.-P. 222-230.

209. Thomas P.S. Hibridization of denatured RNA and small DNA fragments transferred to nitrocellulose paper // Proc. Natl. Acad. Sei. -1980. 77. - P. 5201-5205.

210. Thompson M.R., Brandwein H., LaBine-Racke M., Giannella R.A. Simple and reliable enzyme-linked immunosorbent assay with monoclonal antibodies for detection of Escherichia coli heat-stable enterotoxins // J. Clin. Microbiol.- 1984. 20. - P. 59-64.

211. Tsen H.Y., Jian L.Z. Development and use of a multiplex PCR system for the rapid screening of heat labile toxin I, heat stable toxin II and shiga-like toxin I and II genes of Escherichia coli in water // J. Appl. Microbiol.1998.-84.- P. 585-592.

212. Uhle'n. Magnetic separation techniques in diagnostic microbiology // Clin. Microbiol. Rev. 1994. - 7.- P. 43-54.

213. Vaughan M., Moss J. Mechanism of action of choleragen // J. Supramol. Struct. 1978.- 8.-P. 73-488.

214. Wachsmuth I.K. Escherichia coli: typing and pathogenicity // Clin. Microbiol. Newsl. 1980. - 2. - P. 4-7.

215. Weller M. G. Immunochromatographic techniques a critical review // Anal Chem 366 :635-645, 2000

216. Zuk R.F., Ginsberg VK, Houts T, Rabbie J, Merrick H, Ullman EF, Fischer MM, Sizto CC, Stiso SN and Litman DJ // Enzyme immunochromatography a quantitative immunoassay requiring no instrumentation. Clinical Chemistry 31: 1144-1150, 1985

217. Yam W.C., Lilung M., Ng M.H. Evaluation and optimization of the DNA filter assay for direct detection of enterotoxigenic Escherichia coli in the presence of stool coliforms//J. Clin. Microbiol., 1986. - 24 (1). - P. 149151.

218. Yamamoto T., Gojobori T., Yokota T. Evolutionary origin of pathogenic determinants in enterotoxigenic Escherichia coli and Vibrio cholerae Ol. // J. Bacteriol. 1987. 169. - P. 1352-1357.

219. Yamamoto T., Nakazawa T., Miyata T., Kaji A., Yokota T. Evolution and structure of two ADP-ribosylation enterotoxins, Escherichia coli heat-labile toxin and cholera toxin // FEBS Lett. 1984. - 169. P. 241 -246.

220. Yamamoto, T., Tamura T., Yokota T. Primary structure of heat-labile enterotoxin produced by Escherichia coli pathogenic for humans // J. Biol. Chem. 1984. - 259. - P. 5037-5044.

221. Yamamoto T., Tamura T.A., Ryoji M., Kaji A., Yokota T., Takano T. Sequence analysis of the heat-labile enterotoxin subunit B gene originating in human enterotoxigenic Escherichia coli //J. Bacteriol. 1982. - 152. - P. 506-509.

222. Yavzori M., Porath N., Ochana O., Dagan R., Orni-Wasserlauf R., Cohen D. Detection of enterotoxigenic Escherichia coli in stool specimens by polymerase chain reaction // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1998. - 31.1. P.503-509.

223. Yoh M., Yamamoto K., Honda T., Takeda Y., Miwatani T. Effects of lincomycin and tetracycline on production and properties of enterotoxins of enterotoxigenic Escherichia coli // Infect. Immun. 1983. - 42. - P. 778-782.

224. Yolken R.H., Greenberg H.B., Merson M.H., Sack R.B., Kapikian A.Z. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Escherichia coli heat-labile enterotoxin // J. Clin. Microbiol. 1977. - 6. - P. 439-444.

225. Zhu Q.Y., Li L.Q., Lin W.M., Zhou Z.J., Liu C.J. Detection of genes for heat-stable enterotoxin in Escherichia coli by biotinylated ST-DNA probes // Chin. Med. J. (Engl). 1994. -107(5). - P. 338-41.

Информация о работе

Алексанкин, Андрей Павлович
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка иммунохимических методов диагностики LT подобных токсинов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы