Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Разработка ИФА-тест системы для диагностики и мониторинга чумы мелких жвачных животных

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Разработка ИФА-тест системы для диагностики и мониторинга чумы мелких жвачных животных"



На правах рукописи

ДЖУМАЕВ Шухрат Нурмуродович

Разработка ИФА-тест системы для диагностики и мониторинга чумы мелких жвачных животных

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11 9 МАЙ 2011

Москва-2011

4846854

Работа выполнена в НПП «Биологические препарата» Таджикской Академии сельскохозяйственных наук и ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина»

Научные руководители: доктор ветеринарных наук,

член-корреспондент ТАСХН, Аноятбеков Музафар

доктор биологических наук, член-корреспондент РАСХН, профессор Девришов Давудай Абдулсемедович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Фомина Наталья Васильевна

доктор ветеринарных наук, профессор Диев Вячеслав Иванович

Ведущая организация ГНУ «Всероссийский научно-исследовательских институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко»

Защита состоится «_2_» 2011 г. в ¿У часов на заседании

диссертационного совета Д.220.042.01 при ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, дом 23; тел. (495) 377-93-83

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина».

Автореферат разослан « 6 » 2011 г. и размещен на сайге

http://mgavm.ru.

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

Грязнева Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Чума мелких жвачных животных (ЧМЖЖ) - la peste des petits ruminants - вирусное заболевание, характеризующееся некротическим стоматитом, диареей и бронхопневмонией. Возбудитель - РНК-содержащий вирус, относится к семейству Парамиксовирусов, роду Морбишшвирус. Впервые она была зарегистрирована в Кот Дивуаре в Западной Африке в 1942 году.

Вирусная этиология болезни была подтверждена в 1972 году во время всестороннего исследования вспышки болезни среди овец и коз клинически похожей на чуму крупного рогатого скота.

Экономический ущерб, причиняемых ЧМЖЖ козоводству и овцеводству велик, особенно в странах, где преимущественно разводят мелких жвачных животных, так как заболеваемость в первичных очагах болезни может достигать 100%, при высоком уровне летальности.

Для борьбы с этой болезнью необходим точный диагноз, но не всегда это удаётся из-за схожести с другими болезнями. Своевременная диагностика ЧМЖЖ является важным условием купирования инфекции в первичном очаге.

В настоящее время для диагностики ЧМЖЖ применяют различные серологические методы такие как: реакции диффузионной преципитации (РДП), реакции связывания комплемента (РСК), реакции нейтрализации (РН) и иммуноферменгаый анализ (ИФА).

Наиболее простым в исполнении и легко воспроизводимым являются реакции диффузионной преципитации и связывания комплемента, но малочувствительные, реакция нейтрализации является длительным, трудоемким и требует для постановки культур клеток.

Известно, что разработанный для диагностики болезни ЧМЖЖ метод ИФА применяют во многих странах. Однако в разных странах методы ИФА отличаются между собой по многим параметрам и имеют специфические особенности.

Принимая вышеуказанное во внимание можно сделать заключение о необходимости разработки ИФА для выявления антигена и ангател при ЧМЖЖ. Для широкого применения ИФА для диагностики и серомонигоринга требуется разработка и создание универсальных отечественных высокоспецифических диагностикумов.

Цель и задачи исследований.

Разработать тест-систему для лабораторной диагностики и иденгафикации антигена вируса ЧМЖЖ и антител к нему.

Для достижения указанной цели необходимо было:

- провести эпизоотологические и вирусологические исследования в очагах инфекции и выделил» эпизоотический изолят вирулентной культуры вируса ЧМЖЖ, пригодный для приготовления диагностических препаратов;

- отработать методы приготовления комплексных культуральных специфических и нормальных (контрольных) антигенов для серологических тестов;

- получить активную вирусоспецифическую и антивидовую сыворотку пригодную для постановки ИФА;

- подобрать оптимальные методы выделения иммуноглобулинов и аффинно-очищенных антител, и на их основе получения иммунопероксидазных конъюгатов;

- отработать оптимальные условия постановки твердофазного варианта ИФА для обнаружения специфического антигена вируса ЧМЖЖ;

- разработать оптимальные условия постановки непрямого твердофазного варианта ИФА для обнаружения антител к вирусу ЧМЖЖ.

Научная новизна. Научная новизна проведенных исследований состоит в том, что:

- впервые выделен эпизоотический вирус ЧМЖЖ из очага болезни мелкого рогатого скота в Республике Таджикистан. Выделенный вирус ЧМЖЖ паспортизован и депонирован в коллекции микроорганизмов ДТП Научно-исследовательском институте проблем биологической безопасности Республики Казахстан штамм вируса ЧМЖЖ «Темурмалик» для биотехнологических целей.

- впервые в Республике Таджикистан разработана методика приготовления комплексных культуральных специфических (на основе пгшмма «Темурмалик» ЧМЖЖ) и нормального антигенов;

- разработана схема гипериммунизации получения высокоактивных виру-соспецифических (на основе штаммов «С-45» и «Темурмалик») и ангивидовых сывороток для серологических реакций;

- отработаны оптимальные условия постановки прямого «Сэндвич» - варианта ИФА для обнаружения антигена вируса ЧМЖЖ;

- отработаны отимальные условия постановки непрямого варианта ИФА для выявления вирусспецифических антител к вирусу ЧМЖЖ;

Практическая значимость работы. Предложен способ изготовления куль-турального ангагена на основе эпизоотического штамма «Темурмалик» вируса ЧМЖЖ для постановки серологических реакций и гипериммунизации животных.

Рекомендованная схема получения специфической сыворотки на культураль-ный антиген и антивидовой кроличьей сыворотки, а также методы выделения и очистки из них иммуноглобулинов и аффинноочшценных антител переданы для использования в НПП «Биологические препараты» Таджикской Академии сельскохозяйственных наук для налаживания их производства.

По результатам исследований разработана и составлена нормативно-техническая документация: Дастур оид ба ташхиси озмоишгохии тоуни чорвои хурди шохдор бо усули тахлили иммунофермеши (Наставление по лабораторной диагностже ЧМЖЖ методом ИФА) и Тавсияхо оид ба гузаронидани тадбирхои зиддиэпизоота ва пешгирикунанда хангоми тоуни чорвои хурди шохдор (Рекомендации по проведению противоэпизоотических мероприятий при чуме мелких жвачных животных), утвержденные начальником и зам. начальником Службы государственного ветеринарного надзора Министерства сельского хозяйства Республики Таджикистан (15 марш 2011г.).

Личный вклад соискателя. Экспериментальные данные получены автором самостоятельно. Теоретическое обоснование, проведение экспериментов, анализ и обработка полученных данных проведены при личном участии автора. Результаты работы опубликованы и апробированы в производственных условиях.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы изложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета НПП «Биологические препараты» (Среднеазиатского ящурного института) - 2003-2010гт., на научно - теоретических конференциях в Бишкеке и Москве.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 12 научных работ, го них три статьи в изданиях, по перечню ВАК РФ, в которых изложены основные положения и выводы по изучаемым вопросам.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 119 страницах компьютерного текста (Word) и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений и списка литературы. Список используемой литературы включает 151 источников, из которых 79 иностранных. Диссертация иллюстрирована 9 рисунками, 25 таблицами. Приложение на 10 страницах.

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты выделения вирулентного изолята вируса ЧМЖЖ из очага эпизоотии от больных и павших животных;

- результаты изучения выделенного вируса, его паспортизации и депонирования в коллекции микроорганизмов для создания иммунобиологических препаратов (диагностикумов, вакцин);

- результаты получения компонентов диагностических препаратов пригодных для постановки ИФА на обнаружения антигена и антител вируса ЧМЖЖ на основе полученного штамма;

- разработки ИФА тест-системы для выявления антигена вируса ЧМЖЖ и наставления по использованию в лабораторной практике;

- разработки ИФА тест-системы для выявления антител из сывороток крови больных и иммунизированных животных вирусом ЧМЖЖ.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа была проведена в НПП «Биологические препараты» ТАСХН, ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина», экспериментальное изучение вируса ЧМЖЖ проведено на базе ДТП Научно- исследовательского института проблем биологической безопасности Республики Казахстан, производственные опыты проведены на базе республиканской и областных ветеринарных лабораторий и в овцеводческих и козоводческих хозяйствах Республики Таджикистан.

В экспериментах по изучению вируса ЧМЖЖ принимали участие сотрудники лаборатории «Диагностика и индикация вирусных инфекций» ДТП НИИПББ МОН Республики Казахстан, которому автор выражает искреннюю признательность за оказанную помощь и сотрудничество.

Материалы для исследований Вирусы. В опытах использованы выделенный и депонированный нами штамм ЧМЖЖ «Темурмалик» с биологической активностью 5,25 ^ТЦЦлУсм3; вакцинный штамм ЧМЖЖ «0-45» с биологической активностью 4,5 ^ТЦДя/см3.

Животные. Для получения вируссодержащего материала, вирусспецифиче-ских и вцдоспецифических сывороток использовали овец и коз в возрасте от 18-36 месячного возраста, массой от 45 до 50 кг; кроликов местной породы, массой от 2 до Зкг.

Культуры клеток. Для выделения, адаптации, культивирования, титрования вирусов ЧМЖЖ использовали культуру клеток ТЯ, ПЯ и МДВК, выращенные в лаборатории «Культивирование клеток и тканей» ДТП НИИПББ МОН Республики Казахстан.

Методы исследований Приготовление вируссодержащего органо-тканевого материала. Навеску органа измельчали с помощью ножниц и растирали в ступке с кварцевым песком. Готовили 10-20% суспензию органов в стерильном физиологическом растворе. Полученный гомогенаг однократно замораживали при минус 40°С в течение 3 час оттаивали при комнатной температуре и центрифугировали при 4000-5000 об/мин. в течение 30 минут. Надосадок использовали в качестве испытуемого антигена.

Инфицирование культур клеток и получение вируссодержащего культу-рального материала. Заражение линий культур клеток вирусом ЧМЖЖ осуществляли следующим способом. Культуру клеток в пробирках со сформировавшимся монослоем заражали 10-20% органо-тканевой В1фуссодержащей суспензией с 1000 ед/мл пенициллина и стрептомицина в объеме 0,2 см3 на каждую пробирку. Контакт вируссодержащего материала с монослоем осуществляли в течение 11,5 час при 37-38°С, после чего клеточный монослой отмывали трехкратно поддерживающей средой ПСП и заливали по 1мл питательной среды. В ходе культи-

вирования смену среды проводили питательной средой с 5% инактивированной нормальной сыворотаи крови эмбриона коровы через каждые 2-3 суг. В ИФА такие вируссодержащие пробы исследовали после появления ЦОД.

Серологические методы. В опытах по определению уровня накопления антител в сыворотках крови животных, специфического антигена в инфицированной культуре клеток применяли РСК и РДП которые ставили согласно методическим указаниям, утвержденным директором ДТП НИИПББ МОН Республики Казахстан.

Статистическая обработка результатов. Инфекционный тигр вирусных препаратов рассчитывали по методу Рида и Менча. Цифровые данные подвергали статистическому анализу с определением средних величин и их ошибок непосредственным и разностным методом по Стьюдешу.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Выделение вируса ЧМЖЖ в эпизоотических неблагополучных очагах и получение штамма «Темурмалик» вируса ЧМЖЖ для приготовления диагностических препаратов. Эпизоотический пггамм «Темурмалик» вируса ЧМЖЖ выделен из патологического материала от больного ягненка путем перемежающихся пассажей на первично-трипсинизированной культуре клеток ТЯ, ПЯ и перевиваемую линию культуры клеток МДВК.

Штамм ЧМЖЖ «Темурмалик» депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов ДТП НИИПББ МОН Республики Казахстан. В данной работе штамм «Темурмалик» использован для приготовления диагностических препаратов для отработки условий постановки ИФА.

Приготовление культурального антигена для ИФА при ЧМЖЖ и гипериммунизации животных. Антиген для серологических реакций и гипериммунизации животных должен обладать достаточной активностью, быть безвредным, удобным в применении и длительно сохраняться.

В связи с необходимостью приготовления единого набора для диагностики ЧМЖЖ методом ИФА были отработаны способы приготовления комплексного

8

культурального антигена. Эти исследования нами проводились с использованием вакцинного штамма «С-45» и эпизоотический пггамм вируса ЧМЖЖ «Темурма-лик».

Из штаммов вируса ЧМЖЖ «0-45» и «Темурмалик» наиболее активным в культурах с последующим определением их биологической активности клеток оказался эпизоотический штамм «Темурмалик» активность, которого составила в ТЯ 5,25±0,171дТЦЦ5(/см3, а в ПЯ 5,0+0,14 ^ТЩЫсм3. Указанный штамм «Темурмалик» и культура клеток ТЯ в последующем нами были использованы для приготовления комплексных антигенов для серологических тест-систем, а также при получении вирусспецифических сывороток при ЧМЖЖ.

По результатам опыта наиболее активные антигены были получены из клеточной фракции, сконцешрированной в 100 раз с последующим термолизисом клеток, активность которых составляет в РДП 1:32. Антигены, приготовленные другими способами, проявляли слабую активность в РДП или давали отрицательный результат.

В дальнейшем приготовленный культуральный антиген будет использоваться при отработке условий постановки ИФА для выявления антигена и антител к вирусу ЧМЖЖ.

Получение вирусспецифических сывороток. В качестве аншгена для гипериммунизации овец и коз использовали культуральный концентрированный антиген вируса чумы мелких жвачных животных из штамма «Темурмалик», 20%-ную оргада-тканевую вируссодержащую суспензию из органов больных чумой мелкого рогатого скота, культуральную вируссодержащую суспензию вируса ЧМЖЖ.

До начало цикла гипериммунизации животных иммунизировали вакцинным штаммом <<3-45» вируса ЧМЖЖ.

В результате активность полученных сывороток в РДП составила 1:32, причем отрицательный результат получен с антигеном нормальным. Это показывает их ни высокую специфичность.

Анализируя вышеизложенное можно заключить, что оптимальной схемой для иммунизации овец и коз является 5-кратное введение культурального антигена в

возрастающей дозе I; 3; 5; 10; 10 см3 в комплексе с равным объемом полного адь-юванта Фрейнда с недельным интервалом.

Получение видоспецифичсских сывороток. Для титрования в ИФА сывороток от переболевших и вакцинированных против ЧМЖЖ необходим ангавидо-вой - против глобулинов мелкого рогатого скота - иммунопероксидазный конъ-югат. Целью настоящих исследований была отработка оптимальных схем гипериммунизации доноров видоспецифических антител (кроликов) препаратами сывороточного гаммаглобулина мелкого рогатого скота.

В качестве антигена для иммунизации кроликов использовали выделенный антиген нами по методу Конам

За неделю до начала цикла гипериммунизации подколенные лимфатические узлы кроликов сенсибилизировали неполным адьювангом Фрейнда в дозе 1 см3 на каждого кролика.

Динамику накопления тигра антител в полученных сыворотках контролировали в РДП. Результаты проведенных опытов по получению антивидовых сывороток на кроликах показывают, что антивидовые сыворотки, полученные по 3 схеме, обладали высокой преципигирующей активностью от 3,63±0,12...до 4,62±0,13 1о§2. Первая и вторая схемы гипериммунизации оказались малоэффективными, титры антител в сыворотках не превышали их разведения 1:3. В связи с этим третья схема была рекомендована для получения антивидовых сывороток.

Приготовление и контроль иммунопероксидазных конъюгатов для ИФА при ЧМЖЖ. Как известно, наиболее важным фактором, влияющим на чувствительность, специфичность и воспроизводимость ИФА, является качество используемых конъюгатов. В свою очередь качество конъюгатов находится в прямой зависимости от качества (чистота, активности и специфичности) используемых для конъюгации иммуноглобулинов и антител. В связи с этим, первым этапом исследований в этом направлении была отработка условий выделения и очистки активных и специфичных иммуноглобулинов и антител из специфических и антивидовых сывороток.

Гамма-глобулиновые фракции из вирусспецифических сывороток мелкого рогатого скота выделяли различными методами:

10

1. Ступенчатым осаждением альбумина и иммунных глобулинов, различными концентрациями этинового спирта по методу Кона;

2. Трехкратным осаждением общей глобулиновой фракции насыщенным раствором сульфата аммония при 40%, 35 % и 33% степени насыщения раствора по общепринятой методике;

3. Осаждением гамма-глобулина из сыворотки крови сгшртово-хлороформным методом.

Для оценки качества полученных иммуноглобулинов последние параллельно с исходными сыворотками исследовали на активность и специфичность в РДП и ИФА.

В процессе работы из выделенных специфических иммуноглобулинов наиболее активным и специфичным оказались иммуноглобулины, полученные с помощью спиртового осаждения по Кону (активность в РДП-1:10,68±2,34-22,54±6,31, в ИФА-1:29804,78±398,61-1:36782,74+1879,14). Осаждение иммуноглобулинов спиртово-хлороформным методом и трехкратное переосаждение общей фракции глобулинов с помощью насыщенного раствора (N114)2504 позволяли получить иммуноглобулины с достаточно высокой активностью в РДП и ИФА, но приготовленные в дальнейшем на их основе коньюгаты давали значительное неспецифическое фоновое окрашивание, в то время как коньюгаты, приготовленные на основе иммуноглобулинов, выделенных по методу Кона были достаточно специфичными в ИФА.

Следующим этапом исследований для выделения и очистки антивидовых антител были испытаны методы:

- спиртовое осаждение гаммаглобулина по Кону;

- аффинная очистка антител по методу Б. Аугатеаз и Т.Тешупск.

Методом Кона было выделено 5 серии ангивидового гаммаглобулина, преци-

питируюшдя активность приготовленных иммуноглобулинов была 1:8-1:16. Им-мунопероксидазные коньюгаты, приготовленные на их основе, имели предельные тшры в ИФА 1:800-1:1600 и соответственно рабочие 1:200 - 1:400, однако были неспецифичны до разведения 1:100 -1:200, да и в своем рабочем разведении вызывали неспецифическое фоновое окрашивание при исследовании нормальных сы-

11

вороток. По этому с целью повышения специфичности ИФА в дальнейших наших исследованиях был испытан метод аффинного выделения антивидовых антител на белково-ппотаральдегидном иммуносорбенге. Результаты исследования доказывают, что аффинно-очшценные антитела, выделенные указанной методике, имеют высокую иммунологическую активность в РДП 1:10,67±2,58-1:26,6715,33, а активность исходной сыворотки 1:13,14± 14,ЗОЮ,47. В дальнейшем на основе препаратов аффинно-очшценных антивидовых антител были приготовлены иммуно-пероксидазные конъюгаты для ИФА. Коньюгаты обладали достаточной специфичностью и позволили выявлять антитела к вирусу ЧМЖЖ, начиная в цельном виде и с разведения сыворотки 1:10.

Таким образом, в результате проведенных исследований были подобраны оптимальные условия выделения и очистки активных и специфичных препаратов вирусспецифических и антивидовых антител. Это позволило перейти к отработке методов конъюгации приготовленных глобулинов и антител с пероксидазой хрена.

По данным литературы наиболее эффективными методами конъюгации антител с пероксидазой хрена признаны перийодагаые (P.K. Nakane и А. Kawaoi; M.B. Wilson и P.K. Nakane). Исходя из этого, они были испытаны для приготовления вирусспецифических и антивидовых коньюгатов, пригодных для ИФА при ЧМЖЖ. С применением метода P.K. Nakane и А Kawaoi было приготовлено 4 микросерии вирусспецифического и 3 микросерии антивидового коньюгата, методом M.B.Wilson и P.K. Nakane - 6 микросерий вирусспецифического и 4 микросерий антивидового коньюгата. Для конъюгации использовали в основном перокси-дазу хрена с Rz = 2,6- 3,4 и активностью по белку 650-1400 ЕД/мг. Приготовленные конъюгаты очищали от несвязавшихся реагентов методом гельфильтрации через сефадекс G-200.

Активность и специфичность приготовленных серий вирусспецифического и антивидового коньюгатов проверяли методом их шахматного титрования в прямом и непрямом вариантах ИФА соответственно.

Таким образом, в результате проведенных исследований по приготовлению активных и специфичных иммунопероксвдазных коньюгатов было установлено, что из испытанных двух перийодатных методов конъюгации антител с пероксида-

12

зой хрена лулпим оказался метод М.В.МЬоп и Р.К. Nakane. Данный метод конъюгации позволил полунить активные и специфичные иммунопероксидазные конъюгаты с титром в ИФА 1:400-1:1600, которые были активнее в 4 раза.

Отработка параметров применения твердофазного ИФА для выявления специфического антигена вируса ЧМЖЖ. С целью оптимизации условий постановки прямого «Сэндвич»-варианга ИФА были проведены исследования по определению оптимальной (для сенсибилизации твердой фазы) концентрации ви-русспецифического гаммаглобулина и рабочей дозы иммунопероксидазного конъюгата, а также изучено влияние различных условий постановки ИФА на его чувствительность.

Определение оптимальной концентрации вирусспецифических гамма-глобулинов. Определение оптимальной дозы специфических гамма-лобулинов осуществляли методом их шахматного титрования со специфическим и нормальным культуральными антигенами в «Сэндвич»-варианге ИФА. В качестве твердой фазы использовали полистироловые плоскодонные планшеты с 96 лунками. Гамма-глобулины испытывали в разведениях 1:250-1:25600, которые растворяли в ОДМ карбонатно-бикарбонатном буфере (КББ) рН 9,5. Для сенсибилизации планшетов были испытаны все варианш полученных гамма-глобулинов. Испытанные концентрации гамма-глобулинов, имеющих активность в РДП с 1:8 до 1:16, дают положительную реакцию в ИФА со специфическими антигенами, при отрицательной реакции с нормальным антигеном.

Оптимальная концентрация гамма-глобулина, которая позволяет выявить специфический культуральный антиген в его предельном тшре, составляет для разных серий гамма-глобулина от 1:16000. В дальнейшей работе для сенсибилизации лунок планшетов использовали стократный оптимальный тигр гамма-глобулина 1:160. Сенсибилизированные специфическим иммуноглобулином планшеты обрабатывали 1,0% раствором БСА в буферном растворе для ИФА в течение 1 часа при (37-38)°С, внося его в лунки по 200 мкл.

Определение рабочего разведения вирусспецифического иммунопероксидазного конъюгата. Вирусспецифические иммунопероксидазные конъюгаты предварительно тшровали в «Сэндвич»-варианте ИФА со стандартным (нормаль-

13

ным и специфическим) культуральными антигенами. Предельным титром каждой серии коньюгата считали максимальное его разведение, которое способно выявить специфический антиген при отрицательном результате с нормальным антигеном. За оптимальное рабочее разведение коньюгата принимали его восьмикратный предельный тигр.

В нашем опыте предельный тигр коньюгата равен 1:400, при этом разведении конъюгат выявляет антиген в тигре 1:100. Отсюда восьмикратное рабочее разведение коньюгата составляет 1:50.

Отработка оптимальных условий постановки ИФА («Сэндвич»-вариант). Для того чтобы получить стабильные результаты в ИФА, необходимо предварительно отработать оптимальные условия постановки этого метода, то есть выбрать оптимальные буферные растворы для разбавления компонентов реакции, время и температурный режим их взаимодействия с твердой фазой. Отработку оптимальных условий постановки «Сэндвич»-варианта ИФА проводили поэтапно. На первом этапе отрабатывали оптимальные условия сенсибилизации твердой фазы вирусспецифическими иммуноглобулинами, взятыми в рабочей концентрации на 0,1М КББ рН 9,6. При этом контакт специфического антигена, взятого в разведении 1:100, а затем коньюгата (1:50) с твердой фазой длился в течение 240 и 90 минут соответственно при температуре 37°С. После сенсибилизации планшетов иммуноглобулинами проводилась забивка активных центров твердой фазы 1% раствором БСА. В процессе постановки ИФА было установлено, что 1% концентрация БСА является наиболее оптимальной, инкубация планшетов с раствором БСА в течение 60 минут при 37°С полностью снимает неспецифическое фоновое окрашивание в контрольных рядах при сохранении чувствительности метода.

На втором этапе отрабатывали оптимальные условия взаимодействия антигенов с иммуносорбентом (специфические гаммаглобулины, закрепленные на твердой фазе). При этом было выяснено, что применение для разбавления антигенов ФБС (0.1М, 0,01М) или физиологического раствора с добавлением в них 0,1% твин-80 дает практически одинаковую чувствительность и специфичность метода ИФА.

Опытным путем доказано, что наивысшей чувствительностью «Сэндвич »-ИФА обладает при контакте антигена с твердой фазой в течение 4 часа при 37°С, дальнейшее увеличение времени контакта не приводит к существенному повышению титра антигена. Такие же результаты получены при инкубации антигена с твердой фазой в течение 18 часов при 4°С.

В связи с этим, в дальнейшей своей работе аншгены инкубировали с планшетом в течение 4 часов при 37°С или в течение 18 часов при 4°С.

При этом контакт с коньюгатом длился 60 минут при 37°С.

Также доказано, что наивысшее значение оптической плотности специфического антигена достигается, при инкубации коньюгата с антигеном в течение 60 минут при 37°С. Дальнейшее увеличение времени контакта коньюгата с антигеном не приводит к существенному повышению чувствительности ИФА.

Опытным путем также установлено, что оптимальным режимом инкубации субстратов пероксвдазы (АБТС) с коньюгатом для слабоположигельных проб является 60 минут, а для проб с большим содержанием антигена (обычно концентрированный культуральный антиген) достаточно 30 минут контакта субстрата с коньюгатом при комнатной температуре.

Учет результатов реакции проводили на фотометре марки «Multiskan Plus» при длине волны 405 нм (для АБТС).

Результат считали положительным, если оптическая плотность испытуемого антигена в 2 и более раз превышала оптическую плотность контрольного нормального антигена. Оптическая плотность положительных проб должна быть не ниже 0,15.

Эффективность применения метода твердофазного ИФА для выявления и идентификации специфического антигена вируса ЧМЖЖ. Постановку «Сэндвич »-варианта ИФА осуществляли в полистироловых плоскодонных планшетах с 96 лунками по отработанной нами ранее методике. Испытуемые образцы слабых в антигенном отношении 10-20% суспензий из тканевых материалов и суспензий зараженных культур клеток жследовали в ИФА в цельном виде и в последовательных двукратных разведениях до 1:2048. Конгролями реакции служили: пробы патматериала взятые от клинически здоровых животных, суспензии неин-

филированных культур клеток, а также стандартные специфические и нормальные культуральные антигены при ЧМЖЖ.

Результаты оценки чувствительности ИФА при исследовании антигенов представлены в табл. 1.

Таблица 1.

Результаты оценки чувствительности ИФА при исследовании антигенов

1 ¡1 Антигены Количество исследованных проб Результаты исследований в ИФА

1 Нормальный, сер. 1 197 -

2 Специфический, сер. 1 197 13,72+0,38

3 Специфический, сер. 2 65 12,36±0,23

4 Нормальная суспензия культуры клеток 393 -

5 Вируссодержащая суспензия культуры клеток 393 3,40±0,08

6 20%-ая суспензия органо-тканевого материала MPC, инфицированного вирусом ЧМЖЖ 49 6,80+0,16

7 20%-ая суспензия органо-тканевого материала от здорового MPC 73 -

Примечание: тигры антигенов выражены в обратных величинах;

«-»- отрицательная реакция.

Из данных таблицы 1 видно, что «Сэндвич»-варианг ИФА позволяет выявлять антиген вируса ЧМЖЖ практически во всех исследованных пробах. В максимальных титрах антиген выявляется в пробах органах больных вирусом ЧМЖЖ 20%-ая суспензия органо-тканевого материала мелкого рогатого скота. Титрование в ИФА специфических культуральных антигенов при ЧМЖЖ показало, что их активность составила 1:5381,65+142,82-1:11245,69+672,38. Испытанные пробы органов от здоровых животных, нормальные культуральные ангигены показали отрицательные результаты в ИФА, что говорит о высокой чувствительности данного метода.

В дальнейшем были проведены исследования по проверке специфичности ИФА с набором гомологичных и гетерологичных препаратов.

Все испытанные пробы неинфицированные культуральные суспензии в цельном виде, концентрированные нормальные культуральные антигены, а также гете-рологичные антигены при оспы овец, КЭО и КЛО показали отрицательный результат в ИФА, начиная с разведения 1:10. При этом культуральные вирусспеци-фические и концентрированные антигены ЧМЖЖ давали положительные результаты в ИФА. Активность концентрированных антигенов вируса ЧМЖЖ составляла в ИФА-13,99± 0,291о&.

Отработка оптимальных условий постановки твердофазного метода ИФА для выявления антител при ЧМЖЖ. Для диагностики ЧМЖЖ большое значение имеет серологический анализ. Применение РДП, РСК и РН для оценки сывороток от вакцинированных, переболевших и гипериммунизированных животных требует больших затрат времени и культур клеток. ИФА в этом плане является экспрессной реакцией (4-6 часов) и более чувствительной, титры антител в ИФА в 100-1000 раз выше тигров в РСК и РДП и сравнимы или превосходят титры в РН. В связи с этим нами были проведены исследования по разработке и применению непрямого варианта ИФА для титрования вирусспецифических антител в сравнении с другими серологическими реакциями.

В задачу наших исследований входило: отработать оптимальные условия постановки непрямого варианта ИФА. С этой целью необходимо было подобрать оптимальные концентрации компонентов реакции, время и температуру их инкубации с твердой фазой, а также определить возможность применения этого варианта ИФА для ттпрования антисывороток с целью диагностики ЧМЖЖ и оценки поствакцинального иммунитета.

На первом этапе разработки непрямого варианта ИФА был проведен подбор оптимальной рабочей концентрации специфического культурального антигена для сенсибилизации планшетов.

Как известно, очень высокая концентрация антигена, используемого для сенсибилизации шашек, приводит к неспецифическим результатам, а слишком низкая к понижению чувствительности ИФА. Поэтому для каждой серии специфического культурального антигена необходимо определить оптимальную рабочую дозу. Для этого перед использованием каждую серию антигена предварительно

17

титровали методом шахматного титрования со специфической и нормальной сыворотками в ИФА, конъюгат при этом использовали в рабочем разведении. Рабочей дозой каждого из испытанных антигенов считали его удвоенное разведение, в котором он максимально связывается с антителами специфической сыворотки в ее наивысшем разведении. Для сенсибилизации планшетов было испытано 10 серий специфического культурального антигена. Для обоих вариантов ИФА оптимальной рабочей дозой испытанных специфических антигенов явились их разведения, начиная с 1:50 до 1:200.

Для ресуспендирования антигенов в непрямом варианте ИФА испытывали растворы: 0,01М ФБС с рН 7,2-7,4; 0,15М №С1 с рН 6,8-7,2, а также раствор, состоящий го 0,1М КББ с рН 9,6. Существенного различия в чувствительности ИФА при применении этих буферных растворов для разбавления антигенов не замечено, поэтому в дальнейшей работе мы использовали КББ, так как он применяется для разбавления вирусспецифического гамма-глобулина в «Сэндвич»-варианге ИФА.

Определение наиболее оптимального режима постановки непрямого варианта ИФА для титрования антител проводили поэтапно с применением диагностических антигенов и сывороток.

На первом этапе были испытаны разные временные и температурные условия инкубации антигена с лунками планшета: 1, 2, 3 часа при 37°С и 18-24 часа при 4°С.

Опытным путем установлено, что существенное увеличение оптической плотности сыворотки достигается при инкубации антигена с планшетом в течение 2 часов при 37°С, дальнейшее увеличение времени инкубации антигена не приводит к увеличению оптической плотности сыворотки. Таким образом, было установлено, что специфические культуральные антигены имеют оптимальную рабочую дозу (для сенсибилизации лунок планшета) 1:50 - 1:200, их достаточно инкубировать в течение 2 часов при 37°С или 18 часов при 4°С.

Оптимальный режим взаимодействия специфических и нормальных сывороток со специфическим культуральным антигеном определяли путем инкубирования их с лунками планшета от 15 минут до 2 часов при 37°С, время инкубирования с коньюгатом составило 60 минут при 37°С.

В процессе опыта установлена, что чувствительность реакции возрастает в течение 1,0 часа при инкубации сывороток с антигеном. Далыюйшее увеличение времени контакта сывороток с антигеном не приводит к ощутимому повышению чувствительности непрямого ИФА.

В следующей серии опытов были отработаны оптимальные условия инкубации ангаввдового коньюгата с сыворотками. При этом время контакта сывороток с антигеном было постоянным и составило 1,5 часа при 37°С, а время контакта коньюгата изменялось от 20 минут до 1,5 часа при 37°С.

Более высокая чувствительность ИФА отмечена при контакте коньюгата с сыворотками в течение 50-60 минут при 37°С. Поэтому в дальнейших опытах при титровании вирусспецифических антител в непрямом варианте ИФА контакт антивидового коньюгата с испытуемыми и контрольными сыворотками проводили в течение 50-60 минут при 37°С.

Опытным путем было установлено, что оптимальным временем взаимодействия рабочего раствора субстрата пероксидазы хрена (АБТС) с конъюгатом составило 15-30 минут при комнатой температуре.

Учет результатов непрямого варианта ИФА проводили на фотометре марки «Multiskan Plus» при длине волны 405 нм (для АБТС) по отношению оптической плотности испытуемой сыворотки к оптической плошости нормальной сыворотки.

Результат считали положительным, если оптическая плотность испытуемой сыворотки в 2 и более раза превышала оптическую плотность нормальной сыворотки. Оптическая плотность положительных проб должна быть не ниже 0,15.

Изучение специфичности, чувствительности и эффективности непрямого варианта ИФА. Специфичность тестов оценивали параллельным исследованием в ИФА сывороток от гипериммунных, вакцинированных, здоровых и невакциниро-ванных животных, а также гегерологичных сывороток мелкого рогатого скота к вирусам оспы овец, контагиозной эктимы овец и катаральной лихорадки овец.

Результаты определения чувствительности и специфичности непрямого варианта ИФА представлены в табл. 2.

Таблица 2.

Чувствительность и специфичность непрямого варианта ИФА при исследовании сывороток

№№ п/п Характеристика сывороток Непрямой вариант ИФА

количество исследованных проб разведения (1о&)

1 Гипериммунные сыворотки ЧМЖЖ 9 13,5410,34

2 Сыворотки от вакцинированных мелкого рогатого скота (21 суток ПВ) против ЧМЖЖ 717 6,6110,19

3 Сыворотки от переболевших животных 3560 8,99±0,21

4 Сыворотки от здоровых и невакцинированных животных 197 н/о

5 Гетерологичные сыворотки: Оспы овец 110 н/о

6 Контагиозной эктимы овец 167 н/о

7 Катаральной лихорадки овец 73 н/о

Примечание: титры выражены в обратных величинах; ПВ - после вакцинации; «н/о» - отрицательный результат.

Из данных таблицы видно, что непрямой вариант ИФА позволяет обнаруживать вирусспецифические антитела в гипериммунных сыворотках в разведениях 13,5410,34 1о£2, в сыворотках переболевших животных 8,99±0,21 1о{52, а в сыворотках крови от вакцинированных животных с разведения 6,6110,19 log2. Исследованные пробы сывороток от здоровых мелкого рогатого скота и гетерологичные сыворотки в ИФА дали отрицательные результаты.

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о высокой чувствительности и специфичности непрямого варианта ИФА при исследовании проб сывороток от вакцинированных животных и о возможности их применения для экспресс - диагностики ЧМЖЖ и оценки напряженности поствакцинального иммунитета.

выводы

1. Впервые в Республики Таджикистан получен штамм вируса ЧМЖЖ («Те-мурмалик») из эпизоотического очага от больной овцы. Проведена его адаптация на культуре клеток ТЯ. Биологическая активность штамма «Темурмалик» в культуре клеток ТЯ составляет 5,25 ^ИЩ^см3, штамм характеризуется высокой им-муногенной активностью и может быть использовании при создании иммунобиологических препаратов.

2. Разработана технология приготовления специфического антигена вируса ЧМЖЖ на основе штамма «Темурмалик».

3. Разработаны схемы получения диагностических вирусспецифических и антивидовых сывороток, для ИФА метода диагностики ЧМЖЖ

4. Отработаны оптимальные режимы выделения вирусспецифических иммуноглобулинов из сывороток иммунизированных вирусом ЧМЖЖ животных (спиртовое осаждение по Кону), а из ангавидовых - методом аффинной очистки антител на белково-глютаральдегидном иммуносорбенге. Получены специфически активные и ангивидовые иммуноглобулины и вирусспецифические иммуноперок-свдазные коньюгаты. Предельные разведения приготовленных конъюгатов в ИФА составили от 1:400 до 1:1600, а рабочие разведения от 1:50 до 1:200.

4. Определены оптимальные параметры постановки ИФА при ЧМЖЖ, позволяющие обнаруживать специфический антиген в органо-тааневых и культураль-ных материалах и вирусспецифические антитела в сыворотках крови от больных, переболевших и гипериммунизированных овец и коз в течение 4-6 часов после поступления проб на анализ. Отработаны методические параметры контроля ИФА-теста на специфичность, чувствительность и интерпретации результатов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Рекомендованная схема получения специфической сыворотки на культураль-ный ангиген и антивидовой кроличьей сыворотки, а также методы выделения и очистки из них иммуноглобулинов и аффинноочшценных антител переданы для использования в НПП «Биологические препараты» Таджикской Академии сельскохозяйственных наук и ООО «Агровет» для налаживания их производства.

21

По результатам исследований разработана и составлена нормативно-техническая документация: Наставление по лабораторной диагностике ЧМЖЖ методом ИФА (Дастур оид ба ташхиси озмоишгохии тоуни чорвои хурди шохдор бо усули тахлили иммуноферменш) и Рекомендации по проведению прогивоэпизоо-тических мероприятий при чуме мелких жвачных животных (Тавсияхо овд ба гуза-ронидани тадбирхои звдциэпизооти ва пешгирикунанда хангоми тоуни чорвои хурди шохдор), угверзвденные начальником и зам. начальником Службы государственного ветеринарного надзора Министерства сельского хозяйства Республики Таджикистан (15 марта 2011г.).

Разработанные мероприятия по эпизо отологическому анализу и диагностике ЧМЖЖ внедрены в практику ветеринарной службы Таджикистана.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Серомонигоринг чумы мелких жвачных животных Таджикистана / Аноят-беков М., Джумаев Ш.Н., Бобоев Г.Ю. и др. // ж. Ветеринария: изд-во. «Эчод».-Душанбе,- 2005.- № 3,- С. 30.

2. Эпизоотическая ситуация по трансграничным болезням животных в Таджикистане / Джумаев Ш.Н., Бобоев Г.Ю., Косумбеков М.И. и др. // ж. Ветеринария: изд-во. «Эчод»,- Душанбе.- 2005. № 4,- С. 15-18.

3. Серологический мониторинг чумы мелких жвачных животных / Бобоев Г.Ю., Джумаев Ш.Н. и др. // Актуальные проблемы, перспективы развития сельского хозяйства: Сб.нлр.. Том Ш. - Душанбе: изд-во. «Дониш» - 2006.- С. 195-197.

4. О чуме овец и коз в Таджикистан /Амирбеков М., Мурватуллоев С.А, Аноятбеков М., Бобоев Г., Джумаев IIL и др. // Вестник Кыргызского научно-исследовательского института животноводства, ветеринарии и пастбищ имени А. Дуйшева,- Бишкек.-2007,- С. 171-174.

5. Приготовление и контроль иммунопероксидазных коньюгатов дня имму-нофермеотного анализа при чуме мелких жвачных животных / Аноятбеков МА., Джумаев Ш.Н., Бобоев Г.Ю. и др. //Доклады Таджикской академии сельскохозяйственных наук.- Душанбе.-2007. № 3.- С. 48-53.

22

6. Изучение культуральных свойств вируса чумы мешок жвачных животных, выделенного в Республике Таджикистан /Аноятбеков МЛ., Джумаев Ш.Н., Бобоев Г.Ю. и др. // Материалы международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел», посвященной 110-летнему юбилею Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко.-М.: ВИЭВ.-2008,- С. 41-45.

7. Распространение и особенности проявления чумы мелких жвачных животных в Таджикистане / Бобоев Г.Ю., Джумаев Ш.Н., Вискова Т.К. и др. //Материалы международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспекгавы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел», посвященной 110-летнему юбилею Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. им. Я.Р. Коваленко.-М.: ВИЭВ.-2008.-С. 55-60.

8. Изучение антигенных свойств вируса чумы мелких жвачных животных в лабораторных тест-системах / Кошемегов Ж.К., Джумаев Ш.Н., Бобоев Г.Ю. и др. // ж. Ветеринария: изд-во. «Эчод».- Душанбе.- 2008.- № 4.- С. 26-31.

9. Изучение культуралыгого свойства штамма «Кентау-7» вируса чумы мелких жвачных животных / Кошемегов Ж.К, Джумаев ШЛ., Бобоев Г.Ю. и др. // ж. Ветеринария: изд-во. «Эчод».- Душанбе.- 2009.-М» 2.- С. 31-35.

10. Эпизоотическая ситуация по чуме мелкого рогатого скота в Республике Таджикистан / Бобоев Г.Ю., Джумаев Ш.Н., Аноятбеков М.А. и др. Ветеринарная медицина домашних животных: сборник науч. статей.- Выпуск 7.-Казань:- КВА.-2010.-С. 83-85.

11. Оптимальные условия проведения иммуноферментного анализа для выявления ангагел против чумы мелких жвачных животных / Джумаев Ш.Н., Бобоев Г.Ю., Аноятбеков М.А. и др. //Ветеринарная медицина - 2011.- № 1- С. 72-74.

12. Джумаев Ш.Н., Аноятбеков М.А., Девришов ДА. Чувствительность и специфичность ИФА-теста диагностики чумы мелких жвачных животных //Ветеринарная медицина - 2011.- № 2- С.17-19.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 26.09.2000 г. Подписано в печать 06.05.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5 Печать авторефератов (495)73047-74,778-45-60

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Джумаев, Шухрат Нурмуродович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Краткая характеристика ЧМЖЖ.

1.2. Лабораторные методы диагностики ЧМЖЖ.

1.3. Конкурентные методы ИФА.

1.3.1. Неконкурентные методы ИФА.

1.3.2. Твердофазный носитель для ИФА.

1.3.3. Иммуноферментные коньюгаты.

1.3.4. Принципы получения диагностических сывороток.

1.3.5. Принципы приготовления антигенов.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Разработка ИФА-тест системы для диагностики и мониторинга чумы мелких жвачных животных"

Актуальность проблемы. Чума мелких жвачных животных (ЧМЖЖ) — Га peste des petits ruminants — вирусное заболевание, характеризующееся некротическим стоматитом, диареей и бронхопневмонией. Возбудитель — РНК-содержащий вирус, относится к семейству Парамиксовирусов, роду Морбилливирус. Впервые она была зарегистрирована в Кот Дивуаре в Западной Африке в 1942 году.

Вирусная этиология болезни была подтверждена в 1972 году во время всестороннего исследования вспышки болезни среди овец и коз клинически похожей на чуму крупного рогатого скота.

Согласно данным МЭБ чума овец и коз в настоящее время распространена по всей территории Центральной Африки, Турции (1994), Ирана, Аравийского полуострова, Индии, Пакистана (1991), Бангладеш, Непала (1993) и Афганистана (1995).

Экономический ущерб, причиняемый ЧМЖЖ козоводству и овцеводству, велик, особенно в странах, где преимущественно разводят мелких жвачных животных, так как заболеваемость в первичных очагах болезни может достигать 100%, при высоком уровне лётальности. Кроме того, ЧМЖЖ обуславливает возникновение сопутствующих болезней у животных, что определяет высокий уровень экономических потерь.

Для борьбы с этой болезнью необходим точный диагноз, но не всегда это удаётся из-за схожести с другими болезнями. Своевременная диагностика ЧМЖЖ является важным условием купирования инфекции в первичном очаге.

В настоящее время для диагностики ЧМЖЖ применяют различные серологические методы такие как: реакция диффузионной преципитации (РДП), реакция связывания комплемента (РСК), реакция нейтрализации (РН) и иммуноферментный анализ (ИФА).

Наиболее простыми в исполнении и легко воспроизводимыми являются реакции диффузионной преципитации и связывания комплемента, но они малочувствительны, реакция нейтрализации является длительной, трудоемкой и требует для постановки культуру клеток.

Известно, что разработанный для диагностики болезни ЧМЖЖ метод ИФА применяют во многих странах. Однако в разных странах методы ИФА отличаются между собой по многим параметрам и имеют специфические особенности.

Принимая вышеуказанное во внимание можно сделать заключение о необходимости разработки ИФА для выявления антигена и антител при ЧМЖЖ. Для широкого применения ИФА для диагностики и серомониторинга требуется разработка и создание универсальных отечественных высокоспецифических диагностикумов.

Цель и задачи исследований.

Разработать тест-систему для лабораторной диагностики и идентификации антигена вируса ЧМЖЖ и антител к нему.

Для достижения указанной цели необходимо было:

- провести эпизоотологические и вирусологические исследования в очагах инфекции и выделить эпизоотический изолят вирулентной культуры вируса ЧМЖЖ, пригодный для приготовления диагностических препаратов; отработать методы приготовления комплексных культуральных специфических и нормальных (контрольных) антигенов для серологических тестов;

- получить активную вирусоспецифическую и антивидовую сыворотку пригодную для постановки ИФА;

- подобрать оптимальные методы выделения иммуноглобулинов и аффинноочищенных антител, и на их основе получения иммунопероксидазных конъюгатов;

- отработать оптимальные условия постановки твердофазного варианта ИФА для обнаружения специфического антигена вируса ЧМЖЖ;

-7- разработать оптимальные условия постановки непрямого твердофазного варианта ИФА для обнаружения антител к вирусу ЧМЖЖ.

Научная новизна. Научная новизна проведенных исследований состоит в том, что:

- впервые выделен эпизоотический вирус ЧМЖЖ из очага болезни мелкого рогатого скота в Республике Таджикистан. Выделенный вирус ЧМЖЖ паспортизован и депонирован в коллекции микроорганизмов ДТП Научно-исследовательском институте проблем биологической безопасности Республики Казахстан штамм вируса ЧМЖЖ «Темурмалик» для биотехнологических целей.

- впервые в Республике Таджикистан разработана методика приготовления комплексных культуральных специфических (на основе штамма «Темурмалик» ЧМЖЖ) и нормального антигенов;

- разработана схема гипериммунизации получения высокоактивных вирусоспецифических (на основе штаммов «0-45» и «Темурмалик») и антивидовых сывороток для серологических реакций;

- отработаны оптимальные условия постановки прямого «Сэндвич» -варианта ИФА для обнаружения антигена вируса ЧМЖЖ;

- отработаны оптимальные условия постановки непрямого варианта ИФА для выявления вирусспецифических антител к вирусу ЧМЖЖ;

Практическая значимость. Предложен способ изготовления культурального антигена на основе эпизоотического штамма «Темурмалик» вируса ЧМЖЖ для постановки серологических реакций и гипериммунизации животных.

Рекомендованная схема получения специфической сыворотки на культуральный антиген и антивидовой кроличьей сыворотки, а также методы выделения и очистки из них иммуноглобулинов и аффинноочищенных антител переданы для использования в НЛП «Биологические препараты» Таджикской Академии сельскохозяйственных наук для налаживания их производства.

По результатам исследований разработана и составлена нормативно-техническая документация: Дастур оид ба ташхиси озмоишгохии тоуни чорвои хурди шохдор бо усули тахлили иммуноферменти (Наставление по лабораторной диагностике ЧМЖЖ методом ИФА) и Тавсияхо оид ба гузаронидани тадбирхои зиддиэпизооти ва пешгирикунанда хангоми тоуни чорвои хурди шохдор (Рекомендации по проведению противоэпизоотических мероприятий при чуме мелких жвачных животных), утвержденные начальником и зам. начальника Службы государственного ветеринарного надзора Министерства сельского хозяйства Республики Таджикистан (15 марта 2011г.) - приложение.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы изложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета НЛП «Биологические препараты» (Среднеазиатского ящурного института) - 2003-2010гг., на научно - теоретических конференциях в Бишкеке и Москве.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 12 научных работ, из них три статьи в изданиях, по перечню ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 119 страницах компьютерного текста (Word) и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений и списка литературы. Список используемой литературы включает 151 источников, из которых 79 иностранных. Диссертация иллюстрирована 9 рисунками, 25 таблицами. Приложение на 10 страницах.

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Джумаев, Шухрат Нурмуродович

-925. ВЫВОДЫ

1. Впервые в Республике Таджикистан получен штамм вируса ЧМЖЖ («Темурмалик») из эпизоотического очага от больной овцы. Проведена его адаптация на культуре клеток ТЯ. Биологическая активность штамма «Темурмалик» в культуре клеток ТЯ составляет 5,25 ^ТЦД50/см3, штамм характеризуется высокой иммуногенной активностью и может быть использовании при создании иммунобиологических препаратов.

2. Разработана технология приготовления специфического антигена вируса ЧМЖЖ на основе штамма «Темурмалик».

3. Разработаны схемы получения диагностических вирусспецифических и антивидовых сывороток, для ИФА метода диагностики ЧМЖЖ.

4. Отработаны оптимальные режимы выделения вирусспецифических иммуноглобулинов из сывороток иммунизированных вирусом ЧМЖЖ животных (спиртовое осаждение по Кону), а из антивидовых - методом аффинной очистки антител на белково-глютаральдегидном иммуносорбенте.

Получены специфически активные и антивидовые иммуноглобулины и вирусспецифические иммунопероксидазные конъюгаты. Предельные разведения приготовленных конъюгатов в ИФА составили от 1:400 до 1:1600, а рабочие разведения от 1:50 до 1:200.

5. Определены оптимальные параметры постановки ИФА при ЧМЖЖ, позволяющие обнаруживать специфический антиген в органо-тканевых и культуральных материалах и вирусспецифические антитела в сыворотках крови от больных, переболевших и гипериммунизированных овец и коз в течение 4-6 часов после поступления проб на анализ. Отработаны методические параметры контроля ИФА-теста на специфичность, чувствительность и интерпретации результатов.

-936. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Рекомендованная схема получения специфической сыворотки на культуральный антиген и антивидовой кроличьей сыворотки, а также методы выделения и очистки из них иммуноглобулинов и аффинноочищенных антител переданы для использования в НПП «Биологические препараты» Таджикской Академии сельскохозяйственных наук и ООО «Агровет» для налаживания их производства.

По результатам исследований разработана и составлена нормативно-техническая документация: Наставление по лабораторной диагностике ЧМЖЖ методом ИФА (Дастур оид ба ташхиси озмоишгохии тоуни чорвои хурди шохдор бо усули тахлили иммуноферменти) и Рекомендации по проведению противоэпизоотических мероприятий при чуме мелких жвачных животных (Тавсияхо оид ба гузаронидани тадбирхои зиддиэпизооти ва пешгирикунанда хангоми тоуни чорвои хурди шохдор), утвержденные начальником и зам. начальника Службы государственного ветеринарного надзора Министерства сельского хозяйства Республики Таджикистан (15 марта 2011г.)

Разработанные мероприятия по эпизоотологическому анализу и диагностике ЧМЖЖ внедрены в практику ветеринарной службы Таджикистана.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Джумаев, Шухрат Нурмуродович, Москва

1. Алексеева В.Н. Характеристика некоторых иммуносорбен-тов//Препараты для экспресс диагн. —Ленинград, 1981. -С. 43

2. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. //Статистические методы в микробиол. исследованиях.-Ленинград, 1962.-С. 180.

3. Бабиков Н.В., Шустова Н.Д., Васерин Ю.И. Иммуноферментный анализ, условия количественного определения антител к вирусу гриппа //Мед. химия. -1984.- С. 4.

4. Бакулова И.А.Чума мелких жвачных. // Карантинные и малоизвестные болезни животных. «Колос» -1983. С. 106.

5. Башкиров О.Г. Лиофилизация конъюгатов для ИФА //Бюл. ВИЭВ.-Москва, 1986. -Выпуск 57.- С. 35-36.

6. Белозеров А.П., Навольнев С.О. Сравнительная характеристика некоторых методов ИФА для определения суммарных иммуноглобулинов//МЭИ,- 1985. -№1. -С. 59.

7. Беляев H.H. Применение иммунных комплексов фермента-антитело в серологическом анализе //МЭИ. -Москва, 1988. -№4. -С. 50-53.

8. Березин И.В., Егоров A.M. Новые направления развития ИФА //Вест. АМН СССР.- 1987. -12. -С. 72-78.

9. Брыкалов, A.B. Новые композиционные носители для иммобилизации ферментов / A.B. Брыкалов, О.В. Воробьева // Современные достижения биотехнологии: Материалы Всерос. конф. -Ставрополь. 1996.- С.279.

10. Ю.Брыкалов, A.B. Получение биопрепаратов на основе методов -аффинной сорбции и иммобилизации // Дис. . д-ра хим. наук / A.B. Брыкалов. -1993,СПб. 330с.

11. П.Ванеева Л.И., Янкина Н.Ф. Разработка методов получения моноспецифических ингредиентов для ИФА //ЖМЭИ. -1989. -№5. -С. 50-55.

12. Ванеева Л.И. Изучение сорбционной способности полистирольных планшетов, используемых в иммуноферментном анализе /, И.Ю.' Гридина, О.Н. Пантелеева и др., // ЖМЭИ- №9.- 1989.-С. 86-89.

13. Васильев А. В. // Пробл. молекул, биол. и патол. с/х животных. -Сб. науч. трудов.- Москва, 1998.- Том 113. -С. 71.

14. Васильев A.B., Непоклонова И.В. Иммуноферментный метод в диагностике вирусных инфекций //Вет. -1982.- №8. -С. 63-65.

15. Василенко Н.Ф., Заревина Л.И. О применении твердофазного ИФМ для определения туляремийного антигена //Акт. вопр. иммунодиагн. особо опасных инфекц. Тез. докл. Всесоюз. науч.-практ. конф. 26-27 мая 1986 г. -С. 53.

16. Веселов М.Е., Синяков И.Г. Разработка иммуноферментной тест-системы для количественной индикации гемагглютинина вируса гриппа в биологических образцах //Вопр. вирусол. -1985. -№ 6.- С. 672.

17. Виха И.В., Воробьев A.A., Желудева С.И. Получение, свойства и применение ß-галактозидазы В. Subtitles в ИФА //ВНИИ биологическая приборостроения. -Москва, 1985.- С. 12-15.

18. Вудворд, Д. Иммобилизованные клетки и ферменты / Д. Вудворд М.: Мир, 1988.- 161с.

19. Гаврилова Е.М., Дзантиев Б.В., Егоров A.M. Иммуноферментный анализ: Тез.докл.З-го Всес.науч.симпоз. "Получение иммобилизованных ферментов в научных исследованиях, промышленности и медицине"-Л., 1980. С.37-38.

20. Георгиу X. Сравнительная оценка ИФА и РСК при анаплазмозе рогатого скота//Бюл. ВИЭВ -Москва, 1985. -Выпуск 58. -С. 52-54.

21. Граевская Н. А. Закономерности синтеза противовирусных антител. Теоретические исследования в связи с проблемой получения гипериммунных сывороток// Док. дисс. Москва, 1968.

22. Дзантиев Б.Б., Осипов А.П. Классификация и характеристика методов ИФА //Итоги науки и техн. -Биотех. -Москва, 1987. -Т. 3. -С. 56-116.

23. Дзантиев Б.Б. Современное состояние и перспективы развития иммуноферментного анализа //Ж. Всесоюз. химического общества имени Д.И.Менделеева.- 1982.- Т. XXIV.- №4.- с. 82-89.

24. Дзантиев Б.Б. Гетерогенные методы ИФА //Бюл. ВИЭВ. 1985. -Выпуск 58.- С. 10.

25. Диев В.И., Соколов JI.H., Мамкова Р.В., Евсеев A.M., Куляшбекова Ш.К. Изучение чувствительных различных клеточных культур к вирусу чумы мелких жвачных животных.// Вирусные болезни сельскохозяйственных животных. Владимир, 1995.-С.94.

26. Думанова Д., Текерлеков П. Дифференциация вируса ящура с помощью ELISA //Вет.-медицинские науки. -1983.- 2.- С. 13-19.

27. Егоров A.M. //Современное состояние и перспективы развития ИФА: школа-семинар. Совр. проб, биотех. -Астрахань, 1985. -С. 2-24.

28. Иванов А.П., Башкирцев В.Н. Разработка и применение ИФМ для диагностики аденовирусных инфекций //Вопр. вирусол. -1981. -№6. -С. 23-26.

29. Капускин Е.В. Изучение чувствительности клеточных культурах к вакцинному вирусу чумы мелких жвачных штамма «ВНИИЗЖ», Вестник Кыргызкого научно-исследовательского института животноводства, ветеринарии и пастбищ имени А. Дуйшева. Бишкек-2007. С.212-215).

30. Коромыслов Г.Ф., Авилов B.C. Иммуноферментный анализ и применение его в ветеринарии //Бюл. ВИЭВ Москва, 1985. -Выпуск 58.

31. Коромыслов И.Г., Шарабрин О.И., Гуленков В.В. Иммуноферментный метод в диагностике коронавирусной инфекции у КРС //Бюл. ВИЭВ — • Москва, 1985. -№58. -С. 48-51.

32. Кольцов, С.И. Изучение влияния носителя на свойства катализатора / С.И. Кольцов, В.М. Смирнов, В.Б. Алесковский // Кинетика и катализ. -1973.- Т. 14, №5.-С.1300-1303.

33. Корогодин Д.В. Перспективные области применения ИФА на нитроцеллюлозном носителе в биотехнологии и медицине //Механизмы иммунорегуляции и иммун. -Биотех.- Москва, 1989. -С. 87-89.

34. Курманова J1.B., Ермолин Г.А., Эткин А.Ф. Получение специфических иммуноферментных конъюгатов против класса иммуноглобулинов человека// Лаб. дело. -1984. -№2. -С. 80.

35. Кэтти Д. Получение меченых антител посредством связывания антигена с носителем, связывания антител с антигеном и метки ферментом или флуоресцентной краской с последующим освобождением антител. //В кн.: Антитела 2. Москва «Мир», 1991.-С.210-212.

36. Лайко C.B., Блинова Т.В. Приготовление конъюгатов для ИФМ диагностики вирусного гепатита//Вопр. вирусол. №4. -1986. -С. 473.

37. Мамадалиев С.М., Кошеметов Ж.К., Троицкий Е. Н., Нурабаев С. Ш. Отработка условий приготовления специфического антигена чумы крупного рогатого скота// Вторая международная научная конференция

38. Мониторинг распространения и предотвращения особо опасных болезней животных». Сборник материалов конференции Самарканд- -2004г. С. 125-127.

39. Матвеева В.М., Кошеметов Ж.К. Мамадалиев С.М.Способы выделения и очистки иммуноглобулиновых препаратов для ИФА при оспе овец. //Биотехнология. Теория и практика. 2006г. №1 С.87-90.

40. Михалкин И.П. Чума мелких жвачных животных.// Сибирская язва и другие опасные инфекционные болезни животных. — Покров, 2005.-С.159-163.

41. Мникова Л. А. Разработка средств и методов иммуноферментного анализа для диагностики оспы овец //Дисс. канд. биол. наук. -Гвардейский, 1977.- 13/1С-Д/46.

42. Нго Г.Т, Ленхофор Г.М. Иммуноферментный анализ —М:. 1988.-С.25— 167

43. Пономарева H.A., Нечаева A.C. //Гамма-глобулин. -Москва, 1965. -С. 3-20.

44. Покровский, В.И. Иммуноферментный анализ: современное состояние и тенденции развития / В.И. Покровский // Медицинская генетика и иммунология.- М:. 1986.- С. 4-5.

45. Пшеничная JI. А., Хабижанов А. Б. Полимеразная цепная реакция // Эскулап. Алматы, 2000.- №9. - С. 8.

46. Рукосуев B.C., Капинус JI.H. Иммуноморфологический метод исследования с меткой антител пероксидазой //Архив патол. -1979. -№5. -С. 64-67.

47. Сухоруков, A.M. Изучение сорбционных свойств полистироловых планшетов, используемых в иммуноферментном анализе / A.M. Сухоруков, А.М.Пономарева//ЖМЭИ.- 1987.-№9.- С. 18-22.

48. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. // Диагностика вирусных болезней животных. -Москва ВО "Агропромиздат", 1991. С. 157.

49. Тривен, М. Иммобилизованные ферменты / М. Тривен. М:. Мир, 1983.-c.23.

50. Федоров Ю.Н. Принципы получения моноспецифических антисывороток к Иг Г овец //Труды Всесоюз. института экспериментальной вет. -1980. -51. -С. 106-112.

51. Фримель Г. //Иммунологические методы. -Медицина.- Москва, 1987.-С.472.

52. Харитоненков И.Г., Христова М.М. Использование ИФА в вирусологии// МГМиВ. -1985.- №6.-С.17-21.

53. Хлюстов C.B., Коломнец Н.Д., Коломнец А.Г. Применение ИФА в целях диагностирования ретровирусной инфекции при лейкозе КРС //Теор. и практ. вопр. вет,- Тарту.- 1981. Т.2.- С. 25-31.

54. Чард Г. //Радиоиммунологические методы.- Москва, 1981.- С. 246.

55. Шажко Ж.А., Мищенко H.H. Оптимизация ИФМ на фильтровальных мембранах для выявления ящура и противоящурных антител //Бюл. ВИЭВ.—Москва, 1985.-Выпуск 58. -С. 62-64.

56. Шамардин В.А., Кузьмин Ю.А., Каральник Б.В. Использование каталазы в иммуноферментных реакциях //Лаб. дело. -1988. -№4. -С. 69-73.

57. Шаханина, К. Л. Выбор критериев пригодности твердофазных носителей на основе полистирола для проведения иммуноферментного анализа / К.Л. Шаханина, A.A. Соколенко, И.П. Павлова // ЖМЭИ.-№9.- 1987.-С. 8-11.

58. Янкина Н.Ф., Ванеева А.И. Разработка метода получения конъюгатов пероксидазы с антиглобулином для ИФА //МЭИ. -1985.- №1. -С. 35

59. Abu-Elzein E.M.E., Hassanien M.M., Al-Afaleq A.I., Abd-Elhadi M.A. & Housawi F.M.I. Isolation of peste des petits ruminants from goats in Saudi Arabia// Vet. Rec.-1990- 127 (12), 309-310

60. Anaokar,.S.Solid-phase enzyme immunoassay for serum ferreting / S. Anaokar, P.J. Sorry, J.C. Standefer // Clin. Chem.-1979.- V.25.-P.1426-1431.

61. Anderson J., Rowe L.W., Taylor W.P. An enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of Ig G, Ig M, Ig A antibodies to rinderpest virus in experimentally infected cattle //Res. vet. sci.- 1982.- V. 32.- №2.-P.98-100.

62. Anderson J. & McKay J.A. The detection of antibodies against peste des petits ruminants vims in cattle, sheep and goats and the possible implication to rinderpest control programmes// Epidemiol. Infect.-1994- 112, 225-234.

63. Avrameas S. Coupling of enzymes to proteins with glutaraldehyde. Use of the conjugates for the detection of antigens and antibody //Immunochemistry.- 1969.- №6.- P. 43-52.

64. Avrameas S., Wiel A. Methode de marquage d'antigens et d'anticorps avec des enzymes et su application immunodiffusion //C.R. acad. sci.- 1966.- V. 26.-№2.- P. 25-43.

65. Bazarghani IT, Charkhkar S, Doroudi J, Bani Hassan E. A Review on Peste des Petits Ruminants (PPR) with Special Reference to PPR in Iran// J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health.- 2006- Dec;53 Suppl 1:17-8.

66. Braide VP. Peste des petits ruminants, a review.//FAO World Animal Review.-1981-39:25-28.

67. Cantorero L.A., Butler J.E., Oslorne J.W. The adsorptive characteristics of protein for polystyrene and their significance in solid phase immunoassay //Anal, biochem.- 1980.- V. 105.- P. 375-382.

68. Catt R., Treagear G.W. Solid-phase radioimmunoassay in antibody coated tubes//Science.- 1967.-№158.-P. 1570.

69. Couacy-Hymann R.F., Hurard C., Guillou J.P., Libeau G. & Diallo A. Rapid and sensitive detection of peste des petits ruminants virus by a polymerase chain reaction assay//J. Virol. Methods.-2002.-100, 17-25.

70. Dhar, P., B. P. Sreenivasa, T. Barrett, M. Corteyn, R. P. Singh, and S. K. Bandyopadhyay. Recent epidemiology of peste des petits ruminants virus (PPRV)//Vet. Microbiol.-2002.- 88:153-159. 32.

71. Diop M, Sarr J, Libeau G. Evaluation of novel diagnostic tools for peste des petits ruminants virus in naturally infected goat herds// Epidemiol Infect.' 2005 Aug;133(4):711-7.

72. Diallo A, Minet C, Le Goff C, Berhe G, Albina E, Libeau G and Barrett T. The threat of peste de petits ruminants: progress in vaccine development for disease control // Vaccine.-2007.- 25(30):5591-5597.

73. Dugimont J.C. Essais d'automatisation de 1' ELISA //"Enzyme linked immunosorbent assay". Orig. lab. interpret.- 1976.- P. 627-629.

74. Durojaiye O.A., Obi T.U. & Ojo O. Virological and serological diagnosis of peste des petits ruminants//Trop. Vet.-1983.- 1, 13—17.

75. E1-Hakim OA .An Outbreak of Peste de Petit Ruminants (PPR) At Aswan Province, Eygpt Evaluation of Some Novel Tools for Diagnosis Of PPR //Assiut Veterinary Medical Journal.-2006.- 52(110): 132-145.

76. Engvall E., Perlmann P. Enzyme linked immunosorbent assay. III. Quantitation of specific antibodies by enzyme-labeled antiimmunoglobulin antigen-coated tubes//J.Immunol.- 1972.-V. 109.- №1.- P. 129-135.

77. Forsyth, M. and Barrett, T. Evaluation of polymerase chain reaction for the detection of rinderpest and peste des petits ruminants viruses for epidemiological studies// Virus Research.-1995.- 39, 151-163.

78. Ford D., Radin R., Pesce A. Characterization of glutaraldehyde coupled alcaline phosphatase-antibody and lactoperoxidase-antibody conjugates//Immunochemistry.-1978.- V. 15.-P. 237-243.

79. Gargadennec L. & Lalanne A. La peste des petits ruminants// Bull. Serv. Zoo. A.O.F.-1942.- 5, 15-21.

80. Gilbert L., Monnier A., Adaptation olu virus de la des petits ruminants aux cultures cellulaires. Note prelimimaire -Rev. Elev. Med. Vet. Pays trop., 1962, v.15 4, p. 321-325.

81. Guesdon J.L., Avrameas S. Magnetic solid phase enzyme immunoassay//Immunochemistry.- 1977.- V. 17.- P. 443-447.

82. Guesdon J.-L. La methde enzyme-immunologique. Aspects theoriques et practiques //Techn. et biol.- 1987.- V. 13.- P. 97-107.

83. Hamblin C.C., Barnett J.T.R. A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against food-and-mouth disease virus //J.Immunol. methods.- 1986.- V. 93.-№1.- P. 115-129.

84. Hamdy F.M. & Dardiri A.H. Response of white-tailed deer to infection with peste des petits ruminants virus// J. Wildl. Dis.-1976.-12, 516- 522.

85. Halliday M.J., Wisdom G.B. A comparison of three methods for the preparation of enzyme-antibody conjugates //Biochem. soc. trans.- 1986- № 14.- P. 473-474.

86. Hawanitz J.H. Immunoassay. Innovations in label technology //Arch, pathol. and Med. Lab.- 1988.- V. 112.- №8.- P. 775-779.

87. Hendry R.M., Hermann J.E. Immobilization of antibodies on nylon for use in enzyme-linked immunoassay //J.Immunol, methods.- 1980.- № 35.- P. 285-286.

88. Hendry R.M., Hermann J.E. Coupling of antibodies and enteroviruses to plastics enzyme linked immunoassay //Abstr. annu. meet. amer. microbiol. -Los Angeles, Calif. 1979. Washington D.C.- 1979.- P. 3330.

89. Ismail IM and House J. Evidence and identification of peste des petits ruminants from goats in Egypt// Archiv fur Experimentelle Veterinärmedizin.-1990.- 44(3):471-474.

90. Laurent A., Aspects biologigues de la multiplication au virus de la peste des petits ruminants on PPR sur les cultures cellulaires ,- Rev. Elev. Med. Vet. -Pays trop, 1968, v.21, 3,p.297-308

91. Laurent C. Detection d'antigens viruses de la maladie de Marek a l'immunoserums conyuquest a la peroxidase //C.R. acad. se. -Paris, 1973.- V. 277.-№19.- P. 2093-2096.

92. H.Lefevre P.C. & Diallo A. Peste des petits ruminants// Rev. sci. tech. Off. int. Epiz.-1990.- 9, 951-965.

93. Libeau, G. & Lefevre, P.C. Comparison of rinderpest and peste des petits ruminants viruses using anti-nucleoprotein monoclonal antibodies. Vet. Microbiol.-1990.- 25: 1-16.

94. Mohanty P.K., Verme P.C. Detection of swine pox and buffalo pox viruses in cell culture using protein A — horseradisch peroxidase conjugate //Acta, virol.- 1989.- V. 33.- №3.- P. 290-296.

95. Nakane, P.K. Peroxidase-labelled antibody a new method of conjugation /P.K. Nakane, A. Kawaoi // J.Histochem. Cytochem.-1974.- V.22. №4-P.506-506.

96. Nawathe D.R., Taylor W.P.// Trop. Anim. P^ep Prod. 1979. V. 11. P. 120123

97. Nygren H., Hansson H.A. Conjugation of horseradish peroxidase staphylococcus protein A with benzoquinone, gluteraldehyde or periodate as cross-linking reagents. A comparative study //Histochem. cytochem.- 1981.-V. 29. №2.- P. 266-270.

98. Obi T. U., M. O. Ojo, O. A. Durojaiye, O. B. Kasali, S. Akpavie, and D. B. Opasina. 1983. Peste des petits ruminants (PPR) in goats in Nigeria: clinical, microbiological and pathological features. Zentralbl. Veterinaermed. Reihe B 30:751-761.

99. Pfahler W.H.E., Reimann M. Abiotin-avidin amplified enzyme immunoassay for detection and quantitation of orthopox virus camel antibodies in dromedaries //J. Vet. med. b. 1986.- V. 33.- № 7.- P. 477-484.

100. Piroird R., Lambard M. Les methods immuno-enzymatiques et leurs applications serologiques //Rev. med. vet. pays trop.-1980,- V. 131.- P. 2542.

101. Potgieter L.N.D., Rouse B.T., Webb-Martin T.A. Enzyme-linked immunosorbent assay using staphylococcal protein A for detecting virus antibodies //Amer. J. Vet. res.- 1980- V. 41.- №6- P. 978-980.

102. Rossister P.B., Iessett D.M., Holmes P. MicroELISA test for detecting antibodies to rinderpest virus antigens //Trop. anim. hlth. prod.- 1981.-' №13.-P. 113-116.

103. Rossiter PB. Peste des petits ruminants. In: Infectious Diseases of Livestock, vol 2, 2nd edition, Coetzer JAW and Tustin RC (eds), Oxford University Press, UK.-2005.

104. Saliki J.T., Libeau G., House J.A., Mebus C.A. & Dubovi E.J. Monoclonal antibody based blocking ELISA for specific detection and titration of peste des petits ruminants antibody in caprine and ovine sera.//J. clin. Microbiol.-1993-31 (5), 1075-1082.

105. Sanders G.S., Clinard E.N., Bartelett M.L. Application of the indirect enzyme-labelled antibody microtest to the detection and surveillance of animal diseases //J.Infect. dis.- 1977-№136- P.258-266.

106. Schilow W.E., Meyer V. Durchführung und Awendungsmöglichkeiten des ELISA in der veterinärmedizinischen Virusdiagnostik //Mh. vet.-med.-1985.-№ 40.-P. 186-189.

107. Shaila, M. S., D. Shamaki, M. A. Forsyth, D. Diallo, L. Goatley, R. P. Kitching, and T. Barrett. Geographie distribution and epidemiology of peste des petits ruminants viruses//Viras Res.-1996.- 43:149-153.

108. Singh R.P., Sreenivasa B.P., Dhar P., Shah L.C. & Bandyopadhyay S.K. Development of monoclonal antibody based competitive ELISA for detection and titration of antibodies to peste des petits ruminants (PPR) virus//Vet. Microbiol.-2004.- 98 (1), 3-15

109. Steck F., Huggler Chr. Inheritance and interaction of immune traits in beef calves //"Off. int. epiz", 43 sess. general C. I. E.- Paris, 1975.- P.13-15.

110. Sumption K.J., Aradom G., Libeau G. & Wilsmore A.J. (1998). Detection of peste des petits ruminants antigen in conjunctival smears of goats by indirect immunofluorescence. Vet. Rec., 142, 421-424.

111. Sundquist V.-A., Wahren B. An interchangeable ELISA for cytomegalovirus antigen and antibody //J.Virol, methods.- 1981.- №2,- P. 301-302.

112. Taketa K., Ichikawa E. A tetrasolium method for staining peroxidase labels in blottings assays //J.Immunol, methods.- 1986.- V. 95.- №1.- P. 71-77.

113. Taylor W.P. Serological studies with the virus of peste des petits ruminants in Nigeria//Res. Vet. Sci., 26,- 1979.-236-242.

114. Taylor W.P., Albusaidy S. & Barrett T. The epidemiology of peste des petits ruminants in the Sultanate of Oman//Vet. Microbiol 22.- 1990. 341-352.

115. Taylor WP. The distribution and epidemiology of peste des petits ruminants//Preventive Veterinary Medicine -1984.-2:157-166.

116. Van Weemann B.K. ELISA. Highlights of the present state of the art //J.Virol, methods.- 1985.- V. 10, №4.- P. 371-378.

117. Vorde D.E., Sasse E.A., Hursa R. Competitive enzyme-linked immunoassay with use of soluble enzyme antibody immunocomplexes for labelling. I. measurement of human choriogonadotropin //Clin, chem.- 1976.- V. 22.-№8.-P. 1372-1377.

118. Voller A., Bidwell D.E., Bartlett A. The use of microplatelets test of ELISA in some infection diseases //Proc. int. symp. immuno-enz. techniques.- Paris, 2-4 Apr.- 1975.-№4. 1975.

119. Wilson M.B., Nakane P.K. Recent development in the periodate method of conjugating horseradish peroxidase (HRPO) to antibodies //Biomedical Press.- 1978.-P. 215-244.

120. ВАЗОРАТИ КИШОВАРЗИИ ЧУМ^УРИИ Ю1ЩКИСТОП АКАДЕМИКИ ИЛМДОИ КИШОВАРЗИИ то^икистон КОРХОНАИ ИЛМИЮ ИСТЕДСОЛИИ «МАВОДХОИ БИОЛОГИ»

121. Дида ва маъкул дониста шуд» Дар Шурой илмию техникии байтории Хадамоти назорати даэлатии байтории ВК Суратчдласаи №1 29 ноябри с. 2010

122. ДАСТУР ОИД БА ГАШХИСИ ОЗМОИШГОХДИ ТОУНИ ЧОРВОИ ХУРДИ ШОХДОР БО У СУЛИ ТАХдаЛИ ИММУНОФЕРМЕНГЙ1. ДУШАНБЕ -201*ясунам» назоратикч;трбеков с.201ф

123. ВАЗОРАТИ КШПОВАРЗИИ ЧУМХУРИИ ТОЧИКИСТОН АКАДЕМИЯМ ШЕУЩОИ КИШОВАРЗИИ ТОЧИКИСТОН КОРХОНАИ ИЛМИЮ ИСТЕХСОЛИИ «МАВОДХОИ БИОЛОГЙ»

124. Дида ва маъкул дониста шуд» Дар Шурой илмию техиикии байтории Хадамоти назорати давлатии байтории ВК Ч,Т Сура-щаласаи № 1 ' 29 ноябри с. 2010

125. ТАВСИЯХО ОИД БА ГУ ЗАРОНИДАНИ Т^ДБИРХОИ ЗИДДИЭПИЗООТЙ ВА ПЕШГИРИКУНАНДА ХАНГОМИ ТОУНИ ЧОРВОИ ХУРДИ ШОХДОРI-ПО

126. ДТВЕРЖДАЮ» НачалыI»гГ^Служхп государственного де {ери йгрд >чй г.а надзора, ларных наук с А')|\мирбеков•'Ч'.*//., 2007г.