Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и совершенствование инструментальных методов контроля для изготовления лиофилизированных биопрепаратов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и совершенствование инструментальных методов контроля для изготовления лиофилизированных биопрепаратов"

р

') м--» ч На правах рукописи

Л и ,

УДК 619:015.371 :578.09

ОПАРИН Юрий Галактионович

РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ИНСТРУМЕНТАЛЬНЫХ МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫХ БИОПРЕПАРАТОВ

03.00.23 — биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1998

Работа выполнена в отделе инструментальных методов контроля и лиофилизации Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ).

Научные руководители:

кандидат технических наук

кандидат биологических наук

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

А. И. ЖУРАВЛЕВ (MBА)

кандидат биологических наук

Т. К. КРАШЕНИННИКОВА (АО БИОХИММАШ)

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности

Защита состоится „ " ¡¿люил 1998 г. в ¿0^ ч.

на заседании Диссертационного совета К 020.28.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я- Р. Коваленко по адресу: 109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Автореферат разослан „ 23 " ОСп/Н^лЯ 1998 г.

Ю.П.ЧЕРНЕЦКИЙ 3. Ф. БОГАУТДИНОВ

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук

Ф.Г. ТЕРЕШКОВ

- I -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изготовление высококачественных лиофилизированных биопрепаратов, применяемых в ветеринарии, зависит от целого ряда факторо, среди которых важное значение придается режиму сублимационного высуиивания и величине остаточной влажности в получаемом продукте.

Для определения режима лиофилизации биопрепаратов при отрицательных температурах в РФ и ряде других стран применяется метод электропроводности (МЭ), с помощью которого находят эвтектические температуры (нижнюю - Т э.н. и верхнюю - Т э.в.), ограничивающие рекомендуемую зону сублимации. Однако, как показали наши предварительные исследования, ЫЭ непригоден для измерения эвтектических температур неэлектролитов, входящих в состав защитных сред для биопрепаратов. Значения эвтектических температур некоторых биопрепаратов с малой ионной активностью оказались выше истинной температуры плавления. Известны и противоположные примеры, когда незначительное содержание солей в препаратах с белковой основой (сывороточные препараты) приводило к получению очень низких эвтектических температур, ие соответствующих практическим температурам сублимации. В результате неточных измерений МЭ рекомендуемые режимы сублимации не были оптимальными. Необходимо было более полно изучить ЫЭ в сравнении с другими известными методами и подобрать или разработать более подходящий метод измерения эвтектических температур.

Одним из важных показателей, определяющих стабильность сухих биопрепаратов при их последующем хранении, является остаточная влажность, оптимальный диапазон которой для многих лиофяли-зируемых биопрепаратов и штаммов микроорганизмов экспериментально не установлен. В тех яе случаях, в которых проводились соот-

ветствукщие исследования, получаемые результаты были не всегда удовлетворительными из-за отсутствия единых и надежных методик определения и нормирования влажности.

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы заключалась в разработке надежных методов контроля процессов лиофи-лизации и сухих препаратов и их применении для совершенствования изготовления лиофилизированных биопрепаратов. В соответствии с этим в задачи исследований входило:

1. Разработка нового метода и прибора для измерения температуры плавления (Т пл) замороженных биопрепаратов и сопоставление его с известными методами.

2. Разработка устройства дифференциального термического анализа (ДТА) для определения Т пл замороженных биоматериалов.

3. Проведение сублимационных сушек модельных объектов на основании полученных температур плавления с оценкой

сухого препарата.

4. Разработка метода контроля влажности сухих биопрепаратов и сопоставление его с известными методами.

5. Разработка методики определения оптимальной нормы влажности сухих биопрепаратов и ее проварка на ряде штаммов микроорганизмов.

Научная новизна. Разработан принципиально новый метод определения Т пл замороженных биопрепаратов и пищевых продуктов, называемый методой нагруженного стержня (A.c. 1024835). Впервые проведены параллельные измерения Т пл замороженных биопрепаратов и компонентов защитных сред несколькими методами. Показано, что не позволяет точно определять эвтектические температуры био-njfönapaTOB и компонентов защитных сред, являющихся неэлектроли-rdtoi; результаты определения Т пл Ю зависят от применяемого

прибора и его рабочей частоты. Более точными и адекватными целям лиофилизации являются методы ДТА, нагруженного стержня и метод Мак Кензи (1975 г)

Методами ДТА и электропроводности установлено снижение активности ионов солей при плавлении замороженных высокогидрофильных растворов таких веществ как сахароза, глюкоза и сорбит, что может объяснять один из механизмов их криозащитного действия.

Впервые дан анализ МЭ, позволивший выдвинуть положение о том, что данным методом с применением прямого тока или тока высоких частот (от кгц до Мгц) можно определять температуру появления свободных ионов солей при плавлении замороженных биопрепаратов, которые могут катализировать окислительные процессы, негативно влияющие на качество продукта.

Установлены основные причины, влияющие на точность определения остаточной влажности сухих биопрепаратов гравиметрическими методами с применением бюкс.

Разработана методика получения относительно больших масс биопрепаратов с одинаковой влажностью, что позволило провести сравнительные испытания разных методов определения влажности с получением достоверных данных.

Практическая ценность работы. Разработанный метод нагруженного стержня используется в ВГНКИ для определения Т пл замороженных биопрепаратов, предназначенных для лиофилизации. Изготовлен опытно-промышленный образец прибора ПИТП-1, который может серийно выпускаться для нужд биопредприятий и НИИ.

Стандартный метод контроля влажности биопрепаратов применяется на биопредприятиях страны и в ветеринарных НИИ в соответствии с разработанными нами ГОСТ 24061-80 и ГОСТ 24061-69.

Методика определения оптимальной нормы влажности может быть

применена при разработке норм влажности сухих биопрепаратов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на:

5-й конференции молодых ученых Всесоюзного государственного научно-контрольного института ветеринарных препаратов (ВГНКЮ, Москва, 1983.

Всесоюзной научно-теоретической конференции "Использование достижений биотехнологии в животноводстве и ветеринарии", Новосибирск, 1991.

Апробация работы состоялась на межлабораторном совещании в ВГНКИ (Москва, 18 ноября 1997 г.)

Публикации. По результатам исследований получено а.с. I? 1024835, разработаны ГОСТ 24061-80 и СТ СЭВ 6279-89 (ГОСТ 24061-89), опубликовано 12 статей.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста и состоит из введения и трех глав, содержащих литературный обзор, описание собственных исследований, обсуждение полученных результатов и выводы. В конце приводятся основные выводы, список литературы и приложения. Работа содержит 9 рисунков, I фотографию и 16 таблиц. Список литературы содержит 177 источников, из них 99 отечественных и 78 зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Методика и техника собственных исследований

Работу выполняли в отделе инструментальных методов контроля ■ диофилиэацни ВГНКИ в период с 1980 по 1989 год. Исследования температуры плавления некоторых препаратов и защитных сред методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) выполняли специалисты Ченннградского ВНИИ особо чистых препаратов. Испытание прибора

ПИТП-1 проводили на Ставропольской биофабрике и в Московском технологическом институте пищевой промышленности. Исследования по нормированию влажности сухих биопрепаратов проводили с участием сотрудников профильных лабораторий ВГНКИ.

При разработке и совершенствовании методов и приборов для определения Т пл биопрепаратов и модельных растворов (Глава I) использовали следующие методы: метод нагруженного стер-

жня (МНС) и метод ДТА на приборах собственной конструкции, метод ЯМР на спектрометре высокого разрешения СХР-300 фирмы "Брукер" (ФРГ), метод электропроводности на двух эвтектикомониторах АВ-1 разной модификации фирмы "Лейбольд" и фирмы "Финн-Аква" (ФРГ), а также на приборе, вмонтированном в блок управления сублимационной установки ЛЗ-9.2 (ЧССР). Частоту переменного тока, подаваемого на платиновые электроды, измеряли частотомером 43-63 (СССР). Она составила 1,5 кгц в приборе АВ-1 фирмы "Лейбольд", 1,8 кгц в модифицированном приборе фирмы "Финн-Аква", называемом в дальнейшем АВ-1м, и 50 гц в приборе ЛЗ-9.2. Электронные схемы приборов АВ-1 были почти одинаковы, за исключением одного транзистора в усилительном каскаде, усиливающем напряжение основной частоты и гармоник с выхода мультивибратора. Транзистор типа 40347У1 с граничной частотой усиления 0,2-1,5 Мгц в приборе АВ-1 был заменен на транзистор типа ВР 349 с граничной частотой усиления 90 Мгц в приборе АВ-1м, что привело к появлению на платиновых электродах высокочастотных гармоник, которые снижали сопротивление кабеля с платиновыми электродами с II Мом ( прибор АВ-1) до I Мом (прибор АВ-1м). Это уменьшало разрешающую способность прибора и чувствительность. Эвтектические температуры замороженных модельных растворов и биопрепаратов определяли после графического построения кривых зависимости логарифда сопротивления и просто сопротивления от температуры по приняты?.« методикам, при

этом точка перехода относительно прямолинейного участка кривой в криволинейный на графике зависимости логарифма сопротивления образна от температуры соответствовала нижней температуре плавления (Т пл.н.), а на графике зависимости сопротивления от температуры - верхней (Т пл.в.).Лиофилизацию опытных образцов проводили во флаконах с вмороженным посредине термометром типа ТП-II на сублимационной установке ЖТ-2 (ФРГ).

При разработке стандартного метода контроля влажности сухих биопрепаратов (Глава 2) исследовали погрешности гравиметрических методов анализа и проводили сравнительные анализы остаточной влажности биопрепаратов и сухих модельных объектов разными методами. При исследовании погрешностей анализа влажности, вызываемых рядом факторов (вариация в показаниях весов, разница температур бокс при взвешивании с влажной и сухой пробами, неравноплечность и нарушение чувствительности весов, изменение плотности воздуха при анализе, увлажнение пробы при охлаждении), были применены расчеты с использованием известных физических констант. Для выяснения продолжительности охлаждения проб в эксикаторе использовали медьконстантановую термопару и микроамперметр М-95. Для исследования влияния увлажнения стекла бюксы на результат анализа была изготовлена батарея из 17 покровных стекол, применяемых в микроскопии, с общей поверхностью 1360 см*". Эту батарею взвешивали на аналитических весах АДВ-200 Ц с погрешностью отсчета 0,0001 г при относительной влажности помещения 59Затем ее высушивали в течение I часа при 130°С и охлаждали в эксикаторе со свеаепрокаленныы хлористым кальцием в течение I часа. После этого повторно взвепивапи. Для последующих опытов была изготовлена герметичная камера из оргстекла, на верхней крышке которой сделано

отверстие диаметром 3 мм для проволочки с подвешенной на ней батарееей стекол. Чашку весов снимали и на это место устанавливали камеру, в которой находилась батарея стекол. Эту батарею с помощью проволочки осторожно цепляли за коромысло весов таким образом, чтобы проволочка не касалась края отверстия в крышке камеры. Записывали показания весов. Затем через тонкий резиновый шланг, герметично проходящий снаружи внутрь камеры, осторожно наливали на дно камеры дистиллированную воду или насыщенный раствор KNO3, или NaCI. При этом происходила адсорбция влаги воздуха в камере на поверхности стекол до наступления равновесного состояния с влажностью воздуха внутри камеры, которая составляла для раствора NaCI 75,5%, для раствора KNOg - 92% и воды - около 100%. Конец адсорбции определяли по прекращению изменения показаний весов. Изменение веса относили к единице поверхности стекла, и после измерения площади поверхности бюксы вычисляли возможное изменение массы бюксы. Анализ остаточной влажности проб при исследовании влияния их массы в бюксе (0,1 и I г) и температуры высушивания (100 и 105°) проводили ускоренным методом с применением сушильного шкафа 2B-I5I и весов АДВ-200 М. Для проведения сравнительных испытаний разных методов анализа влажности в качестве модельных веществ использовали образцы промышленных вакцин и порошкообразные продукты. С целью повышения точности сравнительных анализов содержимое нескольких ампул (флаконов) одной серии ссыпали в один флакон вместимостью 20 мл, перемешивали, закрывали резиновой пробкой типа УЛ-I и обжимали металлическим колпачком. Флаконы помещали в картонные пеналы и вращали их в течение 1520 суток на роллерной установке, обеспечивая тем самым непрерывное перемешивание содержимого флаконов и более однородное распределение влажности по всему объему препарата. Для опытов использовали бюксы диаметром 30 мм и массу пробы 0,25-0,30 г. После сушки

разными методами пробы в боксах охлаждали в эксикаторе с хлористым кальцием не менее 30 минут. Влажность находили по формуле:

(м1 - м2моо%

X =

Mj -м0

где X - влажность,MQ - масса бюксы, г; Mj - масса бюксы с пробой, г; Mg - масса бюксы с сухой пробой, г.

Использовали следующие методы анализа: I. Ускоренный метод (прототип стандартного метода) состоял в том, что пробы высушивали I час при 105°, получали результат влажности, те же пробы еще сушили I час, выявляя суммарное значение влажности. 2. Вакуумный метод с применением сушильного шкафа типа SPT-200 (Польша) при давлении менее 5 мм рт.ст. Пробы сушили при 60° в течение трех часов, после определения.влажности эти же пробы сушили ускоренным методом еще I час при 105°, определяя суммарный результат влажност1 3. Метод Фишера, в котором измерения проводили на японском приборе МКА-3 с автоматической титрацией. В сосуд с 25 мл метанола вводили 0,6-0,8 г образца препарата, включали магнитную мешалку и титровали реактивом Фишера (титр 2,5 мг воды на I мл реактива). Спустя 30 минут после получения результата продолжали титрацию той же пробы и получали дополнительную влажность. За конечный результат принимали сумму основного и дополнительного значения влажности.

При разработке методики нормирования влажности (Глава 3) и ее проверке использовали сублимационный аппарат ЖГ-2, в котором сушили защитную среду состава : I0Í сахарозы и 1,5% желатина, втамм "Ла-Сота" вируса болезни Ньюкасла и штамм "TBBA-II8" гриба Трихофитон веррукозум вариант аутотрофикум. Сушили в ампулах типа ШПВ-6 с фасовкой I или 2 мл. Отбор партий материала прово-дшш на стадии досушивания через различные интервалы времени, чтобы получить в отобранных партиях остаточную влажность в широ-

ком интервале значений.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка метода нагруженного стержня для измерения

температуры плавления замороженных препаратов

Было изготовлено устройство (Рис. I), состоящее из измерительной ячейки I, в которую помещают испытуемую жидкость 2, металлический стержень 3 и датчик температуры 4. Для герметизации места ввода в ячейку стержня 3 предусмотрено резиновое уплотнение 5. Температуру жидкости в ячейке измеряет прибор ПИТ-5 6. Все узлы и детали устройства закреплены на штативе 7. Металлический стержень 3 после замораживания препарата соединяют накидным кольцом 8 с пружинным механизмом. Последний состоит из рейки 9, соединенной с зубчатым колесом 10 и пружиной II. На оси зубчатого колеса укреплена стрелка 12, показывающая величину силы натяжения пружины II на шкале циферблата 13.

Определение температуры плавления замороженных растворов проводят следующим образом. В ячейку с внутренним диаметром 17 мм и вставленным в нее стержнем и иглообразным датчиком температуры наливают 5 мл исследуемой жидкости и замораживают в холодильнике при -50...-60°С. Затем ячейку извлекают из холодильника, устанавливают в штатив, нагружают стержень (диаметр I мм и основной параметр шероховатости Я а = 0,6-0,8 мкм) с помощью пружинных весов типа ВЕЦ-Ю силой 9 кг и подсоединяют температурный датчик к прибору. Через 1-4 минуты отогрева при комнатной температуре начинается плавление замороженного раствора, связь со стержнем ослабевает и он начинает перемещаться, что можно заметить по движению стрелки весов. В этот момент отмечают температуру биоматериала в ячейке, которая соответствует Т пл. Основные параметры метода были подобраны таким образом, что получаемые значения Т пл

Ряс. j. Устройство для измерения температуры плавления заморо-геншх бноиатерзшлов п щвцеоых продуктов методом нагруженного стержня. A.c. Р 1024835

• - II -

замороженных 1055-ных растворов хлористого натрия, сахарозы, по-ливикилпирролидона (ПВП), желатина и глюкозы практически полностью совпали с признанными как референтные данными Мак Кензи по этим же растворам, которые являются температурами коллапса (Т к.) лиофилизируемого под микроскопом материала и представляют собой наиболее надежные значения верхней температуры материала при суб- ' лимации. Для подбора указанных параметров в работе применяли стержни разных диаметров (I, 2-й 3 мм), которые различались также по шероховатости, и использовали разный объем исследуемой жидкости в ячейке (5 и 8 мл). Испытывали также разные нагрузки на стержень (9, 4 и 2 кг). При оптимальных параметрах МНС измеряли среднее квадратичное отклонение от температуры плавления 10$-ных растворов сахарозы, NaCI, ПВП и желатина, которое составило из 10 измерений соответственно 0,2, 0,5, 0,6 и 1,3°. Описанное устройство было использовано при определении Т пл различных объектов в сравнении с другими методами.

Разработка устройства для дифференциального термического анализа замороженных биопрепаратов

Схема установки и изображение ее основного устройства приведены на рисунке 2. На разработанное устройство получено удостоверение на рационализаторское предложение.

Техническая характеристика установки Чувствительность, °С, не менее 0,002

Уровень помех, °С/мин 0,001

Объем исследуемого материала, мл 5,5 +0,1

Потребляемая мощность, вт 33

Средняя скорость нагрева, 0/мин 2

Методика проведения измерения заключается в следующем. Блок с ячейками, заполненными одинаковыми объемами исследуемой жидкости и дистиллированной воды, а также теплопроводящий конгух охлаждают

Рис. 2. Основное устройство для ДГА и блок-схема установки:

I - блок с ячейкаш! и акскалышы отверстие« для датчика температуры прибора ПИТ-5; 2 - батарея термопар; 3 - кокух тепяопроводящий; 4 - спираль медная для злектронагрева; 5 - кольцо стопорное; 6 - теплоизоляция; 7 - кольцо фторопластовое; 8 - опора; 9 - основное устройство для ДГА; 10 -терыометр ПИТ-5; II - микроамперметр Ы-95; 12 - трансформатор

раздельно в низкотемпературном холодильнике при -60° в течение двух часов, после чего их объединяют, теплоизолируют ватой торцевые участки и выдерживают в холодильнике еще 15-20 минут. Затем основное устройство переносят на лабораторный стол, подсоединяют через разъемы показывающие приборы (ПИТ-5 и М-95) и трансформатор, после чего записывают данные, отражающие зависимость силы тока от температуры. На построенной термограмме находят точку, в которой при изменении температуры на 1° увеличение тока составляет 0,35 мка, что соответствует изменению температуры между ячейками на 0,002°. Температуру, соответствующую этой точке, принимают за начало плавления. Разработанный прибор был испытан в сравнительных опытах по определению Т пл разными методами.

Результаты сравнительных испытаний методов определения

температуры плавления замороженных модельных растворов

В таблице I приведены результаты измерения температуры начала плавления модельных растворов, полученные в нашей лаборатории и другими авторами разными методами. Внимание привлекает значительная разница между температурами плавления одних и тех же объектов при использовании МЭ, что связано, главным образом, с типом применяемого прибора и его рабочей частотой. Самые низкие температуры плавления получены на приборе ЛЗ-9.2 с частотой тока 50 гц, а самые высокие - на приборе АВ-1м с частотой тока 1,8 кгц. В последнем случае температуры плавления растворов сорбита (-12°), глюкозы (-12°), сахарозы (-10°) были значительно выше, чем раствора лактозы (-16°), что противоречит результатам других методов, которые, по всей вероятности, более достоверно отражают истинные температуры плавления. Так, методами ДТА, ШС и Мак Кензи получен следующий порядок температур плавления этих растворов: сорбит < глюкоза < сахароза < лактоза. Такой же порядок следования температур пяавле-

Таблица I

Результаты измерения температуры плавления замороженных модельных растворов, полученные разными методами и авторами

Растворы веществ,

Методы и приборы

Электропроводности

: ДТА : МНС :Мак Кензи

: АВ-1ы : АВ-1 : ЛЗ-9.2: ЕК-1 : АВ-2 •.Юзифроид:

Сорбит, 10% -12 -30 - -21 -26 -26* -45 -41 -45

Глюкоза, 10% -12 -28 -32 -25 - -22Х -44 -39 -40

Сахароза, 10% -10 -20 -28 -25 -18 -29 -34 -31,5 -32

Лактоза, 10% -16 . - -24 -19 -24 -18 -30 -29 -31

Молоко -26 -28 -32 - - -31 -29 -20

Сыворотка лошади -49 -53 -61 - - -53 -34 -21 -

Примечание: Значения отмеченных звездочкой температур приблизительны. Авторами приведены температуры плавления только 3% растворов сорбита (-24°) и глюкозы (-20°).

АВ-1м, АВ-1, ЛЗ-9.2 , ДТА и ЫНС отражают наши результаты 9

I

ЕЙ-1 - результаты получены японским исследователем По К. (1970)

Юзифроид - результаты получены специалистами ВНИТИБП;

АВ-2 - результаты получены Чесаловым С.А. с соавторами//593)

ния получен на приборах АВ-1 и ЛЗ-9.2. Результаты других авторов по определению температур плавления этих же растворов МЭ очень противоречивы и трудно сопоставимы. Основываясь на последних достижениях по изучению электропроводимости льда (Маэно М., 1988), можно заключить, что эти значения не отражают истинных температур начала плавления замороженных модельных растворов, а являются температурами начала поляризационной проводимости, обусловленной ориентапией диполей под действием электромагнитного поля определенных частот.

По-видимому, для определения оптимальной температурной зоны сублимации льда в биопрепаратах достаточно знать температуру сублимации верхнюю (Т с.в.), при которой, с одной стороны, не происходит нарушения геометрической формы высушиваемого материала, то есть, Т с.в. < Т к., ас другой стороны, еще не появляются свободные ионы солей, которые могут катализировать окислительные процессы. Как следует из таблицы I, Т с.в., меньшую, чем Т к., можно определить исходя из данных, полученных методами ДТА, МНС и Мак Кензи, а определить температуру появления свободных ионов МЭ, по-видимому, нельзя на перечисленных в таблице I приборах. Причина этого заключается в невозможности отделить ток свободных ионов от других токов, присутствующих при анализе материала на низких частотах. Суммарный ток можно представить в виде трех составляющих: ток свободных ионов, ток ориентационной поляризации диполей и ток емкостной. Если ток свободных ионов, по-видимому, мало связан с частотой прибора, то ток ориентационной поляризации очень сильно зависит от частоты, и он затрудняет определение температуры, при которой возникает ток свободных ионов. В связи с этим практическое значение МЭ невелико и зависит от используемой частоты прибора. Возможно, что прш/.енение более высоких частот (от кгц до Мгц), например, применение измерителя полных проводюлостей Е 10-2 с частотой 2 Мгц (Новикова Л.С. и др., 1977).более удовлет-

воряет поставленной задаче, поскольку на этом приборе были получены очень высокие эвтектические температуры биопрепаратов. Известно также применение прямого тока при анализе пищевых продуктов при замораживании, который может быть более полезен, чем переменный (Хори Т. и др.-, 1982).

Измерение температур плавления замороженных биопрепаратов (Вакцина ЛТФ-130, вакцина против болезни Ньюкасла и комплемент для РСК) и защитных сред (сахарозо-желатиновая, молоко и сыворотка лошади) методами ЯМР, ДТА, МНС и МЭ не позволили сделать однозначный вывод о преимуществе ЯМР перед методами ДТА и МНС.

Разработка промышленного образца прибора ПИТП-1

В 8КБ ВНИИВС по техническому заданию нашей лаборатории был изготовлен опытно-промышленный образец прибора для измерения температуры плавления замороженных"биопрепаратов и пищевых продуктов методом нагруженного стержня, названный ШТП-1. Основные изменения конструкции по сравнению с прибором, изготовленным в ВГНКИ (Рис. I), заключались в следующем:

- изготовлена конусовидная ячейка вместо цилиндрической, которая размещена не в верхней, а в нижней части штатива;

- применен стержень увеличенного диаметра (3 мм);

- предусмотрен рычаг, поворотом которого создается нагрузка на вмороженный стержень около 9 кг;

- объем исследуемого материала составляет 8 мл.

Главное отступление от прототипа - увеличение диаметра стержня, вызывающее получение более высоких значений Т пл было вызвано следующими соображениями. В практических условиях лиофилизации биоматериалов температура видимого проявления деструкции как правило выше, чем температура деструкши, если последнюю наблюдать под микроскопом. Так, например, Т к. заморожен-

ного 10%-ного раствора сахарозы составляет -32° при лиофилизаиии под микроскопом (Мак Кензи, 1975), а при обычной лиофилизации Т к. находится в пределах от -22,5° (Беллоус, Кинг, 1972) до -25° (Ито, 1970). Поэтому получение более высоких значений Т пл на приборе ПИТП-1 больше соответствует практическому значению Т к. при лиофилизапии.

Сушка некоторых модельных растворов при температуре, полученной на приборе ПИТП-1,позволила сохранить форму таблетки этих объектов, однако молоко и сыворотка крови, высушенные соответственно при температурах -16° и -14° имели неоднородный цвет на поверхности таблетки. Учитывая это негативное обстоятельство, была предложена поправочная формула, для определения Т с.в. в зависимости от Т пл.в.:

Т с.в. = 3/4 Т пл.в. - 10° Молоко и сыворотка, высушенные соответственно при температурах -22 и -20°, которые были определены по поправочной формуле, имели нормальный внешний вид сухой таблетки.

Проведены комиссионные испытания прибора ПИТП-1 в Московском технологическом институте пищевой промышленности и на Ставропольской биофабрике, которые были успешными и оформлены соответствующими актами.

Исследование различных факторов, влияющих на результат определения остаточной влажности биопрепаратов гравиметрическими методами

При разработке стандартного метода анализа влажности сухих зетеринарных биопрепаратов за основу был взят ускоренный метод, чредложенный К.Е.Долиновым (1969 г). Неточное изложение его в юрмативно-технической документации, а также отступления при его выполнении, что заключалось в использовании разных температур выгуливания проб (100 и 105°), разных масс препарата (от 70 мг до ' г), разных по размеру бюкс, не связанных ö массой препарата,

разной продолжительности охлаждения проб после высушивания. Все это негативно отражалось на результатах анализа. Необходимо было метрологически обосновать метод и провести сравнительные измерения влажности биопрепаратов разными методами.

В результате проведенной работы выявили, что на результат определения влажности могут влиять как минимум 9 различных факторов, суть которых изложена ниже.

1. Вариация показаний весов (ДМ). Погрешность анализа Л X определяется по выведенной формуле:

Л Х_/ = --100%, где М - масса.

М пробы

Учитывая, что вариация показаний наиболее распространенных в РФ аналитических весов АДВ-200 находится в пределах 0,2 мг,

то максимальная погрешность анализа влажности при навеске 100 мг составит 0,2% или 10$ относительной ошибки определения влажности, если принять, что средняя влажность большинства препаратов составляет 2%.

2. Разница•температур бюкс с влажной и сухой пробами. .При наличии этой разницы в 1° возникает погрешность /\ Х^, которая зависит от объема бюксы (V), массы пробы (М) и изменения плотности воздуха (лР = 0,004 мг/см^):

А Х? = . юо%

* М

Например, при использовании пробы массой 100 мг и бюксы с размерами 25 х 35 мм, Л Х2 = 0,059%. Для этого примера ошибка определения влажности незначительна и соответствует продолжительности охлаждения трех бюкс в эксикаторе 35 минутам (Таблица 2) В таблице 2 приведены результаты продолжительности охлаждения бюкс в эксикаторе в зависимости от их общей массы и ЛТ, представ ляпцей разницу температур между наружной стенки бюксы, к которой

прикрепляли конец термопары, и температурой помещения. Из таблицы следует, что полностью загруженный эксикатор (24 бюксы) не охлаждается полностью за 3 часа, если температура сушильного шкафа, из которого выгружали бюксы для охлаждения, составляла 105°. Недостаточно охлажденные бюксы могут вызвать значительную погрешность анализа влажности, которую можно предотвратить тщательным охлаждением бюкс.

Таблица 2

Продолжительность охлаждения бюкс в эксикаторе в зависимости от их массы и А Т - разницы температур помещения и бюкс

Масса :Количес-: Продолжительность охлаждения бюкс до ДТ, мин.

бюкс,г :тво бюкс: 4° 3° 2° 1° 0.5°

42 3 18 21 24 35 47

84 6 23 29 38 50 70

168 12 38 48 64 90 120

336 24 58 69 ' 85 120 180

3. Увлажнение пробы в бюксе при охлаждении вне эксикатора.

При охлаждении бюксы в нее засасывается наружный воздух. Выведена формула, позволяющая оценить максимальную погрешность определения влажности биопрепаратов из-за засасывания воздуха любой относительной влажности:

&Ч ---Щ

о 3

где уI - плотность воздуха при комнатной тем-ре, г/см ;

плотность воздуха при тем-ре высушивания, г/см ;

плотность насыщенного пара воды при комнатной тем-ре;

^ - относительная влажность воздуха в помещении, %

V - объем бюксы, см^;

М - масса пробы, г.

- 20 -

Экспериментальная проверка этой формулы проведена на боксах с пятиокисыо фосфора, которые были вначале взвешены, потом нагреты до 105°, охлаждены без эксикатора при контролируемой влажности помещения и повторно взвешены. Результаты были сходны с теоретическими расчетами. Например, при влажности воздуха 50% погрешность определения влажности в бюксе 25 х 35 мм и навеске 100 мг составит 0,034%, что свидетельствует о малом влиянии этого фактора на результат определения влажности.

4. Увлажнение стекла бюксы. Опыты по взвешиванию батареи покровных стекол при разной влажности воздуха и последующие расчеты показали, что увлажнение I см^ стекла при влажности помещения 59% составляет ничтожно малую величину - 0,00029 мг, при влажности 75,5% - 0,0027 мг, при влажности 92% - 0,0073 мг. Пересчет полученных значений относительно наружной поверхности бюкс показывает незначительное изменение ее массы при влажности помещения меньше 75% и этой погрешностью можно пренебречь. Из этого и предыдущего опытов следует логичный вывод о том, что охлаждение бюкс можно проводить вне эксикатора в течение 15-20 минут. Еде одним основанием для такой рекомендации служат технические характеристики бюкс, выпускаемых по ГОСТ 7148-70. Так, при разнице относительной влажности воздуха снаружи и внутри бюксы 100% изменение массы бюксы не долнсно превышать 5 мг за 16 часов или 0,008 мг за 15 минут. В практических условиях проведения анализа разность влажности воздуха снаружи и внутри бюксы редко превышает 70%, и величина увлажнения содержимого бюксы будет значительно меньше.

Нарушение чувствительности весов. Эта погрешность может быть заметной при использовании аналитиком только положительной шкалы.весов и небольшой массы пробы. При использовании проб массой 100 мг и выше, а также при считывании веса как с положительной, так и с отрицательной шкалы этой погрешностью можно пренебречь.

- 21 -

6. Неравноплечность весов.Влиянием этой погрешности по проведенным расчетам можно пренебречь.

7. Изменение плотности воздуха. За период времени между двумя взвешиваниями бюкс с влажной и сухой пробами может измениться атмосферное давление, температура в помещении или то и другое одновременно. Это приведет согласно уравнению Клапейрона-Менделеева к изменению плотности воздуха, вследствие чего изменится архимедова сила при взвешивании тел другой плотности нежели плотность гирь, в частности, стекла бюксы, которая и приведет к погрешности анализа влажности, формула которой представлена ниже:

ДХ, = Мс-лР( Рг - Рс) . ш ' Рс- Рг-Мп

где Мс - масса стекла, г;

д Р - изменение плотности воздурса; fr - плотность гирь; Р с - плотность стекла;

Мп - масса пробы, г.

Подставляя значения, полученные в опытах, например: Мс = = 12,5 г, Рс = 2,5г/см3, Рг = 8 г/см3, Лр= 0,000035 г/см3, ;оответствующее изменению температуры от 20 до 30° или изменению цавления примерно на 23 мм рт.ст. (Енохович A.C., 1976), Мп = = 0,1 г, получим Д Ху = 0,12%.

При анализе влажности ускоренным методом, когда период вре-«ени между двумя взвешиваниями составляет около 2-х часов, приеденное изменение плотности воздуха может иметь место лишь в отельных случаях, однако, если анализ продолжается сутки или нес-солько суток, тогда изменение плотности воздуха может достигать (начительно больших значений и соответственно возрастет погреш-юсть определения влажности. Погрешность возрастет также при 'величении массы бюксы. •.

-228. Величина массы пробы в бюксе. В бюксах размером 25 х 30 мм определяли влажность различных сухих биообъектов массой 0,1 и I г ускоренным методом. Ошибка определения влажности проб массой I г составила: 0,17% для сухого молока, 1,86% для вакцины ЛТФ-13С 1,51/6 для сухой сахарозо-желатиновой среды и 0,2% для сухой сыворотки. Эти данные свидетельствуют о необходимости подбора бюкс в соответствии с массой пробы таким образом, чтобы высота столба пробы в бюксе оставалась минимальной и примерно одинаковой независимо от применяемой массы пробы, то есть масса пробы должна быть пропорциональна квадрату диаметра бюксы. На основании проведенных рассчетов выведена соответствующая формула:

d = 64,5- Ум где d - диаметр бюксы, мм; М - масса пробы, г.

9. Температура сушки проб (100 и 105°). На ряде вакцин и модельных объектов показано, что режим сушки проб при 105° дает более высокие значения влажности: от 0,06% для сахарозо-желатиновой среды до 0,36% для антирабической вакцины, поэтому недопустимо использовать разные температуры для высушивания проб. Предпочтение было отдано температуре 105°, поскольку эта температура наиболее часто употребляется при анализе влажности.

Характеристика ГОСТ 24061-80 На основании проведенных автором исследований был разработан стандартный метод определения массовой доли влаги сухих биопрепаратов, применяемых в ветеринарии - ГОСТ 24061-80. В разработке стандарта также принимали участие Ю.П.Чернецкий (руководитель темы), Б.С.Ерхов и Л.М.Шалова.

Сущность метода заключается в определении уменьшения массы пробы препарата после ее высушивания в течение I часа при 105°.

- 23 -

Наиболее существенные доработки метода заключаются в строгой регламентации температуры сушки (105°), соответствия массы пробы и размера бюксы, ограничение применения бюкс для анализа по высоте (не более 45 мм), увеличение пределов массы, использу-мой для анализа пробы (от 0,1 до 3 г), увеличение продолжительности охлаждения бюкс в эксикаторе (не менее 30 минут).

Стандарт внедрен в 1980 г на всех биопредприятиях СССР, а также в НИИ и лабораториях, что положительно отразилось на качестве выпускаемых биопрепаратов.

Сравнение разных методов определения влажности

Были проведены сравнительные анализы остаточной влажности ряда сухих биопрепаратов и пищевых продуктов тремя методами: по ГОСТ 24061-80, вакуумным (60° 3 часа) и методом Фишера (Табл. 3). Результаты определения влажности 14 объектов, называемых в дальней-' зем по их порядковым номерам, позволяют оценить не только точность и надежность метода контроля, но и специфику отдельных препаратов ;io отношению к этим методам. Так, например, результаты определения злашости порошкообразных пищевых продуктов - В* 13 и 14, оказа-шсь примерно одинаковыми для всех трех методов, но поскольку стандартный метод наиболее простой и доступный, его применение ;ля этих продуктов следует считать более целесообразным. Вполне удовлетворительная сходимость результатов анализа влажности полугена стандартным методом и методом Фишера для большой группы испыту*-;мых биопрепаратов под 1-5, 7, 12, что свидетельствует о равно-шнности этих методов контроля влажности для данных препаратов. !енее точным для этой группы препаратов оказался вакуумный метод, ie обеспечивший полного удаления воды из образцов, что подтверж-,ают результаты дополнительной сушки при 105° в колонке "е". Зна-ения величин влажности, полученные при анализе препаратов под

Таблигтя 3

Результаты анализа влажности сухих биопрепаратов и пищевых продуктов разными методами %

Наименование препарата

:СтандартныЙ:Вакууыный + Стан: 105°+ 105°: 60° :1 час I час: 3 часа

ныи

Метод Фишер

а б в : г : д : е : к

I. Вакцина против листериоза из штамма "АУФ" 3,37 3,36 3.46 3.47 2,76 • 2,80 3,44 3,99 L.52

2. Вакцина против сальмонел-леза водоплавающих птиц 1,66 1,64 1,72 1,74 1,25 1,24 1,61 1,63 1,75

3. Вакцина против болезни Ауэски 2,22 2,30 2,37 2,46 1.46 1.47 2,27 2,31 2,35

4. 5. Вакцина против контагиозного пустулезного дерматита овец Вакцина ДТФ-130 4,25 4,09 4,16 4,18 4.25 4,09 4,21 4.26 2,91 3,00 3,39 3,38 3,95 4,05 4,25 4,17 4,30 4,11

6. Вакцина против инфекционного ларинготрахе! та 3,05 3,09 3,36 3,38 2,10 2,19 3,04 3,04 2,79

7. Вакцина против бруцеллеза из штамма "19" 1,65 1,67 1,78 1^80 1,20 1,13 1,71 l|69' 1,66

8. Вакцина против бруцеллеза из штамма "82" 1,84 1,84 2,30 2,33 1,55 1,44 2,36 2,34 0,94

9. Антирабическая вакцина 1,32 1,32 1.85 1.86 0,78 0,75 1,60 1,62 0,40

10. Вакцина против чуш свиней (АСВ) из штамма "К" 0,57 0,55 0,57 0,55 0,43 0,44 0,46 0,47 0,70

II. Комплемент для РСК 0,20 0,19 0,36 0,34 0,70 0,67 0,33 0,29 3,99

12. 13. Вакцина против болезни * Ньюкасла из шт. "Ла-Сота" колоко порошкообразное 1,80 6,47 : ' 1,18 6,38 - 1,85 6,41

14. Холокно овсяное 9,00 - 9,25 - 9,17

5, 8, 9 свидетельствуют, по нашему мнению, о меньшей точности летода Фишера. По-видимому, в этих случаях происходит частичная изоляция электродов, служащих для электрометрического определения конца титрования. Чтобы уменьшить изоляцию электродов необходимо было использовать пробы с малой массой и соответствующий гитр реактива Фишера. Анализ влажности препаратов №8 и № 9, >ставшихся от наших опытов, был проведен В.А.Дубинской и Научно-1сследовательском центре биологических структур НПО "ВИЛАР" ме-■одом Фишера с использованием отечественного реактива с титром ),56 мг/мл и стандартным методом. Результаты анализа влажности ю стандартному методу совпали с нашими результатами, полученными аналогичным методом, и составили по антирабической вакцине 1,32%, . по бруцеллезной - 1,87%. Это свидетельствует о надежности мето-,ики приготовления больших масс препаратов с одинаковой влажностью, езультаты по методу Фишера, в котором использовали навески от О до 100 иг и ручное титрование (более точное), оказались выше аших и составили для этих вакцин 1,06% и 1,89% соответственно.

Результаты исследований показали, что разработанный нами тандартный метод дает удовлетворительные результаты анализа влаж-ости большинства препаратов, выпускаемых в ветеринарии, является ростым, доступным и экспрессным. Его основа легла в проект стан-арта СЭВ.

Особенности стандарта СЭВ

В стандарт СЭВ 6279-89 и отечественный ГОСТ 24061-89 внесены экоторые изменения. Предусмотрено измерение влажности препаратов, 1сса которых в ампулах составляет менее 0,1 г. Для проведения та-эго анализа содержимое двух или нескольких ампул объединяют с 1ким расчетом, чтобы суммарная масса пробы была более 0,1 г. :ли в ГОСТ 24061-80 рекомендовалось строгйе соответствие массы эобы и диаметра бюксы, то в новом стандарте диаметр бюксы указан

в некотором интервале, что связано с возможным отличием зарубежных стандартов на бюксы от стандарта в РФ.

Результаты испытания методики нормирования влажности сухих биопрепаратов

Результаты двух опытов со штаммом "ТВВА-П8" показали влияние остаточной влажности на выживаемость штамма после х^-.нения в течение года при 4-6°. В 1-м опыте значениям влажности 5,88, 4,61, 2,54, 1,02 и 0,97% соответствовала выживаемость штамма 20,1, 28,6, 37,1, 25,7 и 14,3%. Во 2-м опыте значениям влажности 5,70, 3,57, 3,28 и 1,40% соответствовала выживаемость штамма 17,1 32,6, 37,6 и 40,0%. Оптимальной нормой влажности можно принять диапазон от 1,4 до 3,5%, при котором выживаемость к концу года примерно в 1,5-2 раза выше, чем у препаратов с крайними значения! влажности.

Результаты трех опытов со штаммом иЛа-Сотаи показали несуще! твенное изменение активности вируса при хранении его в течение года при 4-6° с.влажностыо от 0,95 до 4,3%. Учитывая, что шестимесячное хранение этого вируса с остаточной влажностью от I до 3,5% заметно не снижало титр при комнатной температуре, можно заключить, что оптимальная норма влажности для этого штамма, сохраняемого под вакуумом при 4-6°, составляет 1-3,5%.

ОСНОВНЫЕ вывода

I. Метод электропроводности не пригоден для измерения Т пл замороженных растворов неэлектролитов и не позволяет достаточно точно измерять Т пл растворов со слабой ионной активностью, к которым относится большинство биопрепаратов и защитных сред. Результаты измерения Т пл методом электропроводности в значительно: мере зависят от типа применяемого прибора, в частности, от его рабочей частоты.

. - 27 -

2. Разработана и сконструирована установка для ДТА, обладающая высокой чувствительностью и позволяющая более точно измерять Т пл замороженных растворов биоматериалов, чем методом электропроводности.■

3. Методами ДТА и электропроводности установлено снижение активности ионов солей при плавлении замороженных высокогидрофильных растворов таких веществ как сахароза, глюкоза и сорбит, зто может объяснять один из механизмов их криозащитного действия.

4. Разработан принципиально новый метод (метод нагруженного :тержня) для определения Т пл замороженных биопрепаратов и пище-зых продуктов, который позволяет более быстро и точно определять " пл, чем другими методами. На его основе разработан и изготов-[ен опытно-промышленный образец прибора ПИТП-1, с помощью которо-•о и поправочной формулы можно определять температурную зону суб-[имации льда в биопрепаратах.

5. Разработан стандартный метод контроля остаточной влаж-юсти биопрепаратов (ГОСТ 24061-80 и ГОСТ 24061-89), который яв-яется простым, доступным, экспрессным и достаточно точным для ольшинства биопрепаратов, применяемых в ветеринарии.

6. Методические погрешности определения остаточной влажнос-и стандартным методом не превышают 10%, они связаны с точностью звешивания проб в бюксах, на которую влияют, главным образом, оотношение массы пробы и объема бюксы и полнота их охлаждения осле выгрузки из сушильного шкафа.

7. Разработана и утверждена методика нормирования влажности ухих биопрепаратов, испытание которой в опытах со штаммами ГВВА-П8" и "Ла-Сота" показало ее надежность и полезность. При-энение методики позволит избежать включение в НТД необоснованных эрм влажности.

8. Рекомендуемые нормы влажности для штаммов "ТВВА-П8" и 1а-Сота" составляют соответственно 1,4-3,5% и 1-3,5%.

- 28 -

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Чернецкий Ю.П., Опарин Ю.Г., Ерхов Б.С. Стандартизация контроля влажности биологических препаратов // Труда ВГНКИ вет-препаратов. - М., 1980. - Т. 29. - С. 133-140. ,

2. Опарин Ю.Г. Новые методы определения эвтектических температур биопрепаратов // Разработка методов проверки биологических свойств производственных штаммов микроорганизмов и диагностических препаратов. - М., 1983. - С. 129-130.

3. Чернецкий Ю.П., Опарин Ю.Г. Метод контроля температуры плавления замороженных жидких биоматериалов // Контроль качества и стандартизация биопрепаратов, фармакологических средств, кормовых добавок, применяемых в ветеринарии и животноводстве. - М., 1982. - С. 77-80.

4. Чернецкий Ю.П., Опарин Ю.Г. Сравнительная оценка методов контроля влажности сухих биопрепаратов // Контроль и стандартизация средств специфической профилактики и диагностики инфекционные болезней животных. - М., 1984. - С. 101-108.

5. Опарин Ю.Г., Чернецкий Ю.П. Пути уменьшения погрешностей гравиметрических методов контроля влажности биопрепаратов // Контроль, стандартизация и применение химиотерапевтических и биологические* активных препаратов, кормовых добавок и премиксов. -М., 1985. - С. 100-107.

6. Опарин Ю.Г., Чернецкий Ю.П. Новый метод контроля температуры плавления замороженных биоматериалов // Применение химиотерапевтических и белковых препаратов в животноводстве и ветеринарии. - М., 1986. - С. 95-99.

7. Опарин Ю.Г., Яблочник Б.М., Чернецкий Ю.П. Установка дифференциального термического анализа //Холодильная техника. -1988. - Ш -II. - С. 33-34.

- 29 -

8. Опарин Ю.Г., Чернецкий Ю.П. Выбор надежных методов определения температуры плавления замороженных биоматериалов // Холодильная техника. - 1988. - № 12. - С. 37-39.

9. Опарин Ю.Г., Чернецкий Ю.П. О методах измерения влажности сухих биопрепаратов // Применение химиотерапевтических препаратов в ветеринарии и- разработка методов их контроля. - М., 1989. -3. 116-119.

10. Опарин Ю.Г., Яблочник Б.М., Богаутдинов З.Ф. Возможности фименения метода, электропроводности для измерения эвтектических температур биопрепаратов и защитных сред // Рукопись деп. в ¡НИИТЭИ агропромышленного комплекса £ 422. - М., 1990. - 8 с.

11. Опарин Ю.Г. Подходы к определению оптимального режима :иофилизации биопрепаратов // Биотехнология. - 1997. - I? 7-8. -

ёВ'М

12. Опарин Ю.Г. Определение температурной зоны сублимации ьда в биопрепаратах с помощью прибора ПИТП-1 // Биотехнология.

1997. - № 7-8. - с~т5~-1Ъ

Подп. в печать 26.04.98. Формат 60x84/16 Объем 2,0

Заказ 132_Тираж 115

Типографа РАСХН