Разработка и применение методов производной спектроскопии высокого порядка для выявления тонкой структуры оптических спектров фотосинтетических пигмент-белковых комплексов

Михайлюк, Игорь Константинович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка и применение методов производной спектроскопии высокого порядка для выявления тонкой структуры оптических спектров фотосинтетических пигмент-белковых комплексов
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Разработка и применение методов производной спектроскопии высокого порядка для выявления тонкой структуры оптических спектров фотосинтетических пигмент-белковых комплексов"

На правах рукописи

Михайлюк Игорь Константинович

Разработка и применение методов производной спектроскопии высокого порядка для выявления тонкой структуры оптических спектров фотосинтетических пигмент-белковых комплексов

Специальность 03.00.02 - "Биофизика"

Автореферат

диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 2003

I ОБЯЗАН • :.ЫИ I БЕС Г: Г .¡Й ; яг"-'- О

Работа выполнена в НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор физико-математических наук

А.П. Разживин

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук

С.М. Першин

кандидат физико-математических наук ТА Доленко

Ведущая организация: Институт фундаментальных проблем

биологии РАН

Защита диссертации состоится 20 ноября 2003 г. в 15 часов 30 мин на заседании Диссертационного совета Д.501.001.96 биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992 Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, ауд. "новая".

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 20 октября 2003 года

Учёный секретарь Диссертационного Совета Доктор биологических наук профессор

2ооз-А

ТЩ

Общая характеристика работы.

Актуальность темы.

Фотосинтез является одним из наиболее важных процессов в биосфере Земли. Растения и различные фотосинтезирующие бактерии обладают способностью эффективно преобразовывать и запасать солнечную энергию в форме энергии химических связей органических соединений. Изучение этого жизненно важного процесса, являющегося основным источником кислорода и органических веществ для всех живых организмов, представляет собой одну из актуальных задач биофизики и биохимии.

Наиболее просто фотосинтетический аппарат устроен у пурпурных бактерий, являющихся классическим объектом исследований фотосинтеза. В структуре фотосинтетического аппарата этих бактерий можно выделить две основные части - реакционный центр (РЦ) и светособирающую антенну. РЦ и антенна представляют собой сложные пигмент-белковые комплексы (ПБК) высокого молекулярного веса, располагающиеся во внутренних мембранах клетки. В РЦ происходит преобразование энергии из физической формы синглетного возбужденого состояния в химическую форму разделённых зарядов разного знака. Основная функция светособирающей антенны заключается в поглощении квантов света и передаче энергии возбуждения в РЦ. Наличие антенны позволяет увеличить светосбор РЦ и согласовать скорость поглощения квантов света со скоростью преобразования их энергии в системе. Для работы фотосинтетического аппарата характерна очень высокая эффективность (по крайней мере, на первичных стадиях). Около 90% возбужденных состояний, возникающих в антенне при поглощении квантов света, попадает в РЦ. Эффективность преобразования энергии в РЦ ещё выше и составляет почти 100% при разделении зарядов. Столь эффективное преобразование солнечной энергии давно привлекает внимание учёных. Очевидно, что эффективная работа фотосинтетического аппарата достигается благодаря согласованной работе светособирающей антенны и РЦ. В связи с этим изучение структурных и функциональных свойств фотосинтетических пигмент-белковых комплексов, в частности их спектральных свойств, является важнейшей проблемой при исследовании первичных процессов фотосинтеза. Для построения количественных спектрально-кинетических моделей переноса энергии в антенне и от антенны к РЦ необходимо знание тонкой структуры оптических спектров

изучаемых комплексов.

Одним из широко применяемых способов выявления тонкой структуры оптических спектров является метод производной спектроскопии. Но, несмотря на возрастающий интерес исследователей к производной спектроскопии, за последнее время появилось очень мало работ, направленных на развитие этого метода. Редко в современных публикациях обсуждается и вопрос об искажениях производных спектров, вносимых различными процедурами получения производных, хотя такие искажения могут привести к неверной интерпретации результатов. Столь же редко публикуются работы, авторы которых используют производные оптических спектров высокого (четвёртого и выше) порядка. С другой стороны, появление персональных компьютеров и бурный рост их производительности в 90-е годы привели к появлению совершенно новых возможностей для применения вычислительных методов в обычной лабораторной практике. Следовательно развитие одного из самых эффективных методов анализа оптических спектров - метода производной спектроскопии - может представлять значительный интерес для широкого круга исследователей в области биофизики и биохимии.

Цели и задачи диссертационной работы.

Целью диссертационной работы являлась разработка методов производной спектроскопии высокого порядка и применение разработанных методов для выявления тонкой структуры оптических спектров важнейших фотосинтетических объектов.

В диссертационной работе решались следующие задачи:

1. Разработка методов производной спектроскопии для анализа оптических спектров:

• метода получения неискажённых производных оптических спектров;

• метода разложения спектров на полосы по исходному спектру и набору его производных;

• метода определения концентрации одного из компонентов многокомпонентной сильно рассеивающей смеси с помощью абсорбционной производной спектроскопии высокого порядка;

• методов вычитания фона в одномерных (двумерных) массивах экспериментальных данных с помощью анализирующей окружности (сферы) и с помощью производной спектроскопии.

2. Создание программного пакета, позволяющего реализовать на персональном компьютере методы обработки экспериментальных спектров, описанные в первом пункте.

3. Определение набора полос стандартной формы необходимого для аппроксимации Оу-полосы поглощения (бакгерио)хлорофилла и её производных.

4. Определение тонкой структуры спектров оптического поглощения различных фотосинтетических ПБЮ основного светособирающего комплекса высших растений (ШС II); периферического светособирающего комплекса (1_Н2) и реакционного центра из различных пурпурных бактерий.

Научная новизна.

Разработаны новые методы производной спектроскопии для анализа оптических спектров: метод получения неискажённых производных оптических спектров, метод разложения спектров на полосы по исходному спектру и набору его производных, метод определения концентрации одного из компонентов многокомпонентной сильно рассеивающей смеси с помощью абсорбционной производной спектроскопии высокого порядка, метод вычитания фона в одномерных (двумерных) массивах экспериментальных данных с помощью анализирующей окружности (сферы), метод вычитания фона с помощью производной спектроскопии. Определена тонкая структура спектров поглощения ряда фотосинтетических ПБК с помощью метода разложения спектров на полосы по исходному спектру и набору его производных. Для пигмент-белковых комплексов пурпурных бактерий оценены физические характеристики комплексов (диагональный беспорядок для кольца В850 комплекса Ш2 и электрохромный сдвиг мономерного бактериохлорофилла РЦ) на основании полученных численных параметров (положения максимумов, амплитуды и ширины) спектральных компонентов спектров поглощения.

Практическая значимость.

Разработанные методы производной спектроскопии имеют существенное практическое значение для широкого круга исследований в области биофизики и биохимии, так как их применение расширяет возможности спектрального анализа.

Полученные параметры спектральных компонентов спектров поглощения ряда фотосинтетических ПБК могут быть использованы для проверки

существующих теоретических моделей, описывающих спектрально-кинетические свойства ПБК.

Личный вклад.

Все основные результаты, изложенные в диссертационной работе, получены автором самостоятельно. Постановка задач исследований и интерпретация полученных результатов осуществлялись автором совместно с научным руководителем - доктором физ. - мат. наук А. П. Разживиным.

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы были представлены на конференции ММТТ-2000 (Москва); конференции ICONO-2001 (Минск); конференции Ломоносов-2001 (Москва); III Съезде фотобиологов России (Воронеж-2001); на научных семинарах в НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского, на кафедре биофизики Биологического факультета МГУ и в Институте нелинейной огттики и импульсной спектроскопии им. Макса Борна (Берлин).

Публикации.

По материалам диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ. Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 190 страницах, содержит 108 рисунков и 11 таблиц. Список литературы включает 176 источников.

Содержание работы.

Введение.

Рассмотрена актуальность выбранной темы, обоснована практическая значимость, сформулирована цель работы и определены задачи исследования.

Глава 1. Обзор литературы.

Глава состоит из трёх разделов.

В первом разделе рассматривается современное состояние производной спектроскопии. Описывается применение производных оптических спектров для повышения разрешения, измерения концентраций отдельных компонентов многокомпонентных растворов и подавления фонового сигнала в оптических спектрах. Отмечаются преимущества и недостатки рассмотренных методик.

Во втором разделе рассматриваются другие численные методы анализа оптических спектров: метод наименьших квадратов, метод деконволюированных спектров, метод искусственных нейронных сетей и метод Аленцева-Фока. Показано, что каждый из этих методов обладает рядом существенных ограничений применимости.

В третьем разделе рассматривается структура фотосинтетического аппарата высших растений и пурпурных бактерий. Приводится описание оптических свойств основных фотосинтетических пигментов: хлорофилла и бактериохлорофилла. Описаны пространственные структуры и спектральные свойства РЦ пурпурных бактерий, периферического светособирающего комплекса пурпурных бактерий (Ш2) и основного светособирающего комплекса высших растений (ШС II). Отмечается, что в спектре поглощения РЦ пурпурных бактерий в настоящее время остаётся невыясненным точное спектральное положение верхнего экситонного уровня Ру+ молекул БХл специальной пары. Также остаётся недостаточно исследованным вопрос о величине электрохромного сдвига полос мономерных БХл при окислении РЦ. Для комплекса Ш2 в настоящее время публикуется много теоретических исследований спектрально-кинетических свойств, качественно объясняющих экспериментальные данные. Однако точные значения численных параметров экситонных компонентов, составляющих спектр поглощения данного комплекса, до настоящего времени остаются не выясненными, что затрудняет разработку количественной спектрально-кинетической теории данного комплекса. Также нет единого мнения и о тонкой

структуре спектра поглощения комплекса 1_НС II. В опубликованных работах можно найти как теоретические расчёты тонкой структуры спектра поглощения данного комплекса, так и разложение спектра поглощения комплекса ШС II на полосы с помощью метода наименьших квадратов. Однако результаты, приведённые в этих работах, не согласуются друг с другом.

Глава 2. Разработка методов анализа оптических спектров, основанных на производной спектроскопии.

В первом разделе описан метод получения неискажённых производных экспериментальных спектров. Чтобы производные экспериментального спектра остались неискажёнными, необходимо подобрать оптимальные параметры сглаживающего фильтра. Наиболее широкий фурье-спекгр имеют наиболее узкие полосы и их производные. Поэтому при фильтрации высоких частот в первую очередь могут искажаться производные узких полос. Задача подбора оптимальных параметров фильтра может быть решена следующим образом. Сначала, исходя из вида экспериментального спектра или некоторой дополнительной информации, выбирается одна из стандартных форм для модельных полос. Далее оценивается ширина самой узкой полосы спектра. Оценку удобнее производить по графику второй или четвёртой производной спектра, полученной при минимально возможном сглаживании (во избежание искажений). Затем строится модельный спектр, не содержащий шума и состоящий из одной полосы выбранной формы с шириной, соответствующей оценке. Для этого спектра рассчитывается производная некоторого порядка N. После этого подбираются параметры фильтра высоких частот таким образом, чтобы с одной стороны применение фильтра не искажало Ы-ю производную модельного спектра, а с другой стороны наиболее эффективно подавлялись высокие частоты. В результате определяются оптимальные параметры фильтра, необходимого для получения производной спектра порядка N. После подбора параметров фильтра проводятся операции сглаживания (фильтрации) и ^кратного дифференцирования экспериментального спектра и оценивается вклад шума в полученную производную. Если вклад шума невелик (не превышает, например, 10% от величины максимального пика), то полученная производная может рассматриваться как неискажённая. Если же вклад шума значителен, то неискажённая производная Ы-го порядка для данного экспериментального спектра получена быть не может.

Во втором разделе описан метод разложения спектров на полосы по исходному спектру и набору его производных. Идея метода состоит в том, чтобы подобрать систему модельных полос таким образом, чтобы нормированная в максимуме производная любого порядка системы модельных полос хорошо аппроксимировала соответствующую нормированную в максимуме неискажённую производную анализируемого спектра (в том числе и производную нулевого порядка, то есть сам модельный спектр). При таком разложении получается минимальный набор полос, описывающий все особенности (максимумы, провалы и плечи), проявляющиеся в доступном наборе неискажённых производных экспериментального спектра. Таким образом, вся информация о тонкой структуре экспериментального спектра, предоставляемая набором неискажённых производных, будет использована. Необходимо отметить, что для успешной реализации данного метода необходимы спектры без фонового сигнала или с минимальным вкладом фона. Также во втором разделе приводятся примеры применения данного метода к модельным спектрам и исследованы аналитические кривые, применяемые для описания полос спектров оптического поглощения, и их производных.

В третьем разделе описан метод определения концентрации одного из компонентов многокомпонентной сильно рассеивающей смеси с помощью абсорбционной производной спектроскопии высокого порядка. Метод основан на том, что при дифференцировании спектра оптического поглощения, состоящего из отдельных полос различной ширины, относительный вклад узких полос возрастает, а широких - убывает. Основной вклад в высокие производные оптического спектра вносят наиболее узкие полосы, а вклад широких полос может быть пренебрежимо мал. При дифференцировании экспериментальных спектров также эффективно подавляется вклад фонового сигнала. Если один из компонентов имеет значительно более узкие полосы поглощения, чем у других компонентов, и имеется раствор одного этого компонента известной концентрации, тогда неискажённая производная спектра поглощения смеси, начиная с некоторого порядка производной, будет практически полностью определяться производной этого компонента. При этом вклад остальных компонентов и фона будет незначительным (если неискажённую производную такого порядка удастся получить). Другими словами, начиная с некоторого порядка неискажённой производной, графики для смеси и раствора чистого компонента станут практически одинаковыми. Сопоставляя амплитуды

производных этого компонента в смеси и чистом растворе можно сразу определить концентрацию данного компонента в смеси. Эффективность предложенного метода продемонстрирована на модельном спектре сильно рассеивающего раствора.

В четвёртом разделе описаны два метода вычитания фонового сигнала в оптических спектрах. Метод вычитания фона в одномерных (двумерных) массивах экспериментальных данных с помощью анализирующей окружности (сферы) основан на различии геометрических свойств (разной кривизне) кривых полезного сигнала и фона на графике. Интуитивно данный алгоритм можно представить как процесс "качения" окружности под кривой (сферы под поверхностью) входных данных и "стирания" областей, которые покрывает окружность (сфера). Разработанный метод позволяет разделять полезный сигнал и фон, используя различия геометрических свойств кривых полезного сигнала и фона на графике -их разную кривизну, которая определяется второй производной. Эффективность предложенного метода продемонстрирована на модельном спектре, на спектре комбинационного рассеяние водного раствора белка химотрипсина и на двумерной флуоресцентной гельэлектрофореграмме фрагментов ДНК гепатита В, прокрашенных этидиумбромидом. В этом же разделе описан метод вычитания вклада релеевского светорассеяния из спектров оптического поглощения. Метод основан на пятикратном дифференцировании и последующем пятикратном интегрировании экспериментального спектра. Эффективность метода продемонстрирована на модельном спектре.

Глава 3. Изучение фотосинтетических пигмент-белковых комплексов с помощью производной спектроскопии.

Третья глава состоит из девяти разделов. В первом разделе для того чтобы выяснить, какие модельные полосы и их производные подходят для аппроксимации Qy-полосы поглощения хлорофилла и её соответствующих производных, приводится исследование Qy-полосы поглощения Хл а в спектре светособирающего комплекса перидинин-хлорофилл-белок (PCP) из Amphidinium carterae, содержащего две практически не взаимодействующих между собой молекулы Хла. Показано, что Qy полоса поглощения Хл а в белковом микроокружении и её нормированные производные вплоть до восьмого порядка не могут быть аппроксимированы единственной модельной полосой стандартной формы (гауссовой, лоренцевой, фойтовской или

логнормальной) и её нормированными производными. Удовлетворительная аппроксимация может быть достигнута лишь с помощью группы (из 2-х - 4-х) модельных гауссовых полос, причём доминирует наиболее узкая модельная полоса (см. рис. 1а - 1е). Удовлетворительная аппроксимация группой модельных лоренцевых или логнормальных полос невозможна, так как высокие производные полос этих форм сильно отличаются от соответствующих производных гауссовых полос. Важно отметить, что высокие производные Оу-полосы поглощения Хл а близки к соответствующим производным единственной (самой узкой и имеющей большую амплитуду) гауссовой модельной полосы. Низкие производные Оу-полосы поглощения хлорофилла не могут быть аппроксимированы соответствующими производными единственной модельной полосы стандартной формы. Требуется добавлять две-три дополнительных широких гауссовых полосы небольшой амплитуды. Это означает, что подобрать систему модельных полос для аппроксимации высоких производных оптического спектра объекта, пигментами которого являются молекулы Хл, проще, чем для аппроксимации низких производных. Кроме того, амплитуда производной гауссовой полосы сильно зависит от ширины этой полосы (Ац - 1/у\Л где Ам - амплитуда Ы-й производной полосы, V/ - ширина полосы, N - порядок производной). Таким образом, только наиболее узкие полосы оптического спектра будут давать существенный вклад в высокие производные спектра, и вклад каждой из полос может быть аппроксимирован производной единственной гауссовой модельной полосы того же порядка. Если количество полос в каком-либо оптическом спектре невелико, то, применяя описанную процедуру, можно оценить параметры наиболее узких полос этого спектра с высокой достоверностью.

Длины волн, нм 675 650

14000

700

15000 Волновые числа, см

Рис. 1а

Длины волн, нм 675 650

15000

Волновые числа, см"

Рис. 1в

Длины волн, ни (76 650

16000

Волновые числа, см'

Рис. 1д

Длины волн, нм 700 675 650

16000

14000

15000 Волновые числа, см

РИС. 16

Длины волн, нм 675 650

15000 Волновые числа, см1

700

Рис. 1г

Длины волн, нм

075

650

15000 Волновые числа, см"

Рис. 1е

16000

Рис. 1 Разложение спектра оптического поглощения светособирающего комплекса PCP в области Qy-полосы Хл а. Нормированные производные спектра поглощения комплекса PCP показаны открытыми кружками, производные модельных полос тонкими линиями, а производные огибающей модельных полос -толстыми линиями, а) Нулевые производные, б) Первые производные, в) Вторые производные, г) Четвёртые производные, д) Шестые производные, е) Восьмые производные.

Второй раздел посвящён аналогичному исследованию спектра оптического поглощения полосы В800 периферического светособирающего комплекса Ш2 (полосы поглощения мономерного бактериохлорофилла). Показано, что все выводы, сделанные в предыдущем разделе о возможности аппроксимации Оу-полосы поглощения хлорофилла и её производных полосами стандартной формы справедливы и для С1у-попосы поглощения бактерихлорофилла.

В третьем разделе приведено разложение спектра оптического поглощения (зарегистрированного при комнатной температуре) основного светособирающего комплекса высших растений (ШС II). Из представленных рисунков 2а - 2г видно, что каждая из модельных полос необходима для описания той или иной особенности одной из производных исходного спектра. Сопоставление разложения спектра для комнатной температуры с низкотемпературным спектром того же объекта (зарегистрированным при 4 К°) показывает, что часть полос, полученных при разложении спектра для комнатной температуры, проявляются в низкотемпературном спектре. Интересно отметить некоторое сходство наборов модельных полос в областях поглощения Хл а и Хл Ь. В обеих областях видна пара узких и близких по амплитуде полос (на рис. 2а номера 1 и 3 в области поглощения Хл а и номера 6 и 7 в области поглощения Хл Ь), причём в каждой паре полоса, смещённая в коротковолновую область, несколько шире. Амплитуды полос номер 6 и 7 составляют 65-70% от амплитуд полос номер 1 и 3, что коррелирует с дипольными силами соответствующих полос(дипольная сила Хл Ь составляет примерно 70% от дипольной силы Хл а). Ширины полос номер 1 и 6 отличаются примерно на 15%. Спектральные расстояния между максимумами полос, составляющих пары, равны 147 см"1 и 125 см'1, соответственно, то есть также отличаются лишь на 15%. В обоих случаях видна также одна широкая полоса (на рис. 2а номер 2 в области поглощения Хл а и номер 5 в области поглощения Хл Ь). Ширины этих полос отличаются лишь на 10%.

Если считать, что хлорофиллы комплекса ШС II двух разных видов (Хл а и Хл Ь) образуют два разных кластера, то возможным объяснением обнаруженного сходства наборов модельных полос в областях поглощения Хл а и Хл Ь может служить предположение о сходстве организации этих кластеров.

700

Длины воли, им 650

600

{«ООО

15000 16000 Волновые числа, см"'

Дпиш волн, нм 700 675 650

14000

625

15000 Волновые числа, см'1

16000

Рис. 2а

Рис. 26

Длины волн, нм 700 675 650

14ООО

15000 Волновые числа, см"1

625

16 ООО

Длины волн, нм 700 675 650

14000

15000 Волновые числа, см"1

625

16000

Рис. 2в

Рис. 2г

Рис. 2 Разложение спектра поглощения основного светособирающего комплекса высших растений (ШСII). Нормированные производные спектра поглощения комплекса ШС II показаны открытыми кружками, производные модельных полос - тонкими линиями, а производные огибающей модельных полос - толстыми линиями, а) Нулевые производные (спектр оптического поглощения ШС II, зарегистрированный при 4°К, показан штриховой линией), б) Вторые производные, в) Четвёртые производные, г) Шестые производные.

В четвёртом разделе приводится разложение на полосы низкотемпературного спектра оптического поглощения (зарегистрированного при 77К) перифирического светособирающего комплекса Ш2, выделенного из пурпурной фотосинтезирующей бактерии ЙЬоборзеиботопаз асШорЬИа. На положение экситонных уровней данного комплекса влияют такие важнейшие физические факторы, как энергии взаимодействия между пигментами и статистический беспорядок. Проведенный анализ спектра поглощения комплекса 1.Н2 с помощью высоких производных позволяет установить положения максимумов двух полос в районе 870 нм (868 нм и 873 нм). Предполагая, что эти полосы соответствуют теоретически предсказанным экситонным компонентам (в районе 870 нм) и используя теоретическую зависимость между разностью положений максимумов этих полос и беспорядком, получена оценка диагонального беспорядка: 480 см"1.

В пятом разделе приводится сравнение спектров оптического поглощения и их производных перифирических светособирающих комплексов 1_Н2, выделенных из пурпурных фотосинтезирующих бактерий ЯЬодорвеидотопаБ аа'с1орЫ1а, ЯЬобозртНит то^апит, №ос!оЬаЫег зрЬаегоМез, и ТЛ/ог/гас/оБр/га яЫпса. Из представленных результатов сделан вывод, что производные спектров поглощения комплексов Ш2, выделенных из бактерий ЯНобоэртНит тоНзЬапит и ЯЬобоЬасХег зраего/Уев, похожи на соответствующие производные комплекса Ш2, выделенного из бактерии Я/кх/орвеис/о/ггалав аайорМа. Следовательно, различия тонкой структуры спектров поглощения комплексов Ш2, выделенных из этих бактерий, с помощью абсорбционной производной спектроскопии не , обнаруживаются. По видимому, это свидетельствует о близости молекулярной организации данных комплексов Ш2. Сравнение тонкой структуры спектров поглощения комплексов Ш2, выделенных из НЬоборъеиботопаз асМорЫа и

1ЫогЬодо$$га яЫпса, позволяет предположить, что комплекс Ш2 из ТЛ/огЛосУозр/га яЫпса может иметь структуру несколько отличающуюся от структуры комплексов из других бактерий.

В шестом разделе приведён анализ спектра оптического поглощения периферического светособирающего комплекса Ш2 с экстрагированными молекулами спектральной формы В800 (называемый рВ850) с целью определения количества следовых молекул БХл800, которые необходимо учитывать при интерпретации экспериментальных данных. В исследованном

образце комплекса рВ850 удалось обнаружить следовые количества молекул БХл800 (2.2%±0.7% от нормального количества молекул БХл800).

Седьмой раздел посвящен анализу спектров оптического поглощения в ближней ИК области восстановленных и окисленных реакционных центров, выделенных из пурпурных фотосинтезирующих бактерий Rhodobacter sphaeroides (содержащих БХл а) и Blastochlorii viridis (содержащих БХл Ь). Спектры поглощения восстановленных и окисленных РЦ из Rhodobacter sphaeroides приведены на рис. За, модельные полосы, на которые разлагаются эти спектры -на рис. 36 и Зв. Показано, что основное различие наборов модельных полос, полученных при разложении спектров поглощения восстановленных и окисленных РЦ, состоит в исчезновении двух полос (при 865 нм и 810 нм для Rhodobacter sphaeroides и при 962 нм и при 842 нм для Blastochlorii viridis). Также некоторые изменения претерпевают и наиболее широкие полосы спектров. Последнее объясняется тем, что Qy-полоса поглощения БХл а или b и её производные может быть аппроксимирована суммой модельных гауссовых полос и её соответствующими производными. При этом доминирующий вклад в её аппроксимацию вносит наиболее узкая модельная гауссова полоса, остальные модельные полосы имеют значительно меньшую амплитуду и большую ширину. Также приведено сравнение производных спектров поглощения восстановленных и окисленных РЦ с соответствующими производными суммы всех модельных полос, описывающих спектр поглощения восстановленных РЦ, за исключением полосы при 810 нм (для Rhodobacter sphaeroides) / при 842 нм (для Blastochlorii viridis). Показано, что в обоих случаях высокие (начиная с четвёртого порядка) производные такой суммы модельных полос почти не отличаются от производных » тех же порядков спектра поглощения окисленных РЦ (см. рис. Зг для Rhodobacter sphaeroides). Учитывая всё выше сказанное, можно сделать вывод, что , исчезающие в спектре поглощения полосы при окислении РЦ представляют собой экситонные компоненты специальной пары (Р/ и Ру"). Поскольку положение максимума полосы Ру" в спектрах поглощения РЦ обеих бактерий хорошо известны (около 865 нм для Rhodobacter sphaeroides и около 960 для Blastochlorii viridis), следовательно, оставшиеся полосы являются экситонными компонентами специальной пары Р/ (при 810 нм для Rhodobacter sphaeroides и при 842 нм для Blastochlorii viridis).

Длины волн, нм 850 800 790

11000 12000 13000

Волновые числа, см'1

Рис. За

Длины Волн, нм 890 80О 730

13000 13000 Волновые числа, см*

Рис. 36

Длины волн, нм 900 830 800 730

12000 13000 14000 Волновые числа, сми

1И00

Длины волн, нм 828 800

12000 12500 Волновые числа, см"1

Рис. Зв

Рис. ЗГ

Рис. 3 (а) Спектры оптического поглощения восстановленных (сплошная кривая) и окисленных (штриховая кривая) РЦ, выделенных из бактерии ИЬодоЬасЛег 5рЬаего1с1ез. Спектры зарегистрированы при комнатной температуре. Разложение на полосы гауссовой формы спектра оптического поглощения восстановленных (б) и окисленных (в) РЦ, выделенных из бактерии ЯЬос1оЬаЫег 8рЬаего1с1е8. Тонкими кривыми показаны модельные полосы, толстой кривой показана их огибающая, а кружками - экспериментальный спектр оптического поглощения РЦ. (г) Четвёртые производные для огибающей суммы модельных полос, изображённых на рис. 3 (б) (штриховая кривая), для спектра оптического поглощения окисленных РЦ (пунктирная линия) и для огибающей суммы модельных полос, изображённых на рис. 36, но за исключением полосы №2 (сплошная кривая).

)

I I

Кроме того, показано, что наблюдаемое при окислении РЦ коротковолновое смещение максимума спектра поглощения РЦ обусловлено, прежде всего, исчезновением Р/ -экситонного компонента специальной пары, а сдвиг полос поглощения мономерных БХл при окислении РЦ практически отсутствует (около 10 см'1). Данный факт необходимо принимать во внимание при оценке величины электрохромного эффекта, которым обычно принято объяснять этот коротковолновый сдвиг. Интересно отметить, что как у содержащих Бхл а бактерий Rb. sphaeroides, так и у содержащей Бхл b бактерии В. viridis, определённая величина электрохромного сдвига полос поглощения мономерных БХл при окислении РЦ оказывается близкой и составляет около 10 см'1.

В восьмом разделе приводится анализ и сравнение спектров поглощения фикобилипротеидов: аллофикоцианина, С-фикоцианина и денатурированного С-фикоцианина. Показано, что все три спектра имеют схожий набор полос, состоящий из четырёх групп. Эти группы полос становятся хорошо видными при наложении определенным образом сдвинутых наборов полос этих спектров друг на друга. Поскольку каждый хромофор этих ПБК имеет четыре полосы в видимой области спектра, можно предположить, что эти группы формируются соответствующими полосами разных хромофоров. Сдвиг полос одной группы друг относительно друга отражает различия микроокружения разных хромофоров.

В девятом разделе приведено разложение на полосы спектра оптического поглощения цитохрома с (в видимой области). Показано присутствие очень узких модельных полос (с шириной 4-5 нм при комнатной температуре), определяющих вид высоких производных данного спектра. Присутствие в спектре поглощения цитохрома с таких узких полос делает этот объект удобным для измерения его ' концентрации в многокомпонентных мутных растворах.

Заключение.

В работе разработаны методы производной спектроскопии высокого порядка для анализа оптических спектров:

• метод получения неискажённых производных оптических спектров;

• метод разложения спектров на полосы по исходному спектру и набору его производных;

• метод определения концентрации одного из компонентов многокомпонентной сильно рассеивающей смеси с помощью абсорбционной производной спектроскопии высокого порядка;

• метод вычитания фона в одномерных (двумерных) массивах экспериментальных данных с помощью анализирующей окружности (сферы);

• метод вычитания вклада релеевского светорассеяния из спектров оптического поглощения с помощью производной спектроскопии.

Эффективность предложенных методов продемонстрирована как на модельных, так и на экспериментально зарегистрированных спектрах различного происхождения. Разработанные методы имеют существенное практическое значение, так как они расширяют возможности спектрального анализа. В частности, информация о тонкой структуре спектров поглощения исследуемых объектов является необходимой для построения количественных спектрально-кинетических моделей светособирающих пигмент-белковых комплексов.

При исследовании спектров поглощения комплекса РСР в области Qr полосы хлорофилла а и полосы В800 комплекса LH2 (из Rhodopseudomonas acidophils) показано, что низкие производные (включая нулевую) Qy-полосы поглощения (при комнатной температуре) (Б)Хл не могут бьггь аппроксимированы соответствующими производными единственной модельной полосы стандартной формы. В то же время высокие производные Qy-полосы поглощения (Б)Хл близки к соответствующим производным единственной гауссовой модельной полосы.

При исследовании спектра поглощения комплекса высших растений LHC II - оценены параметры ряда полос, составляющих этот спектр. Показано, что некоторые модельные полосы, полученные при разложении спектра LHC II, зарегистрированного при комнатной температуре, соответствуют отдельным пикам низкотемпературного спектра того же объекта. Показано сходство полученных наборов модельных полос в областях поглощения Хл а и Хл Ь. Если считать, что хлорофиллы комплекса LHC II двух разных видов (Хл а и Хл Ь) образуют два разных кластера, то возможным объяснением обнаруженного сходства может служить предположение о сходстве организации этих кластеров. Кроме того, полученный набор спектральных компонентов комплекса LHC II и их количественные характеристики могут быть использованы для проверки предлагаемых теоретических моделей.

При исследовании низкотемпературного спектра поглощения комплекса пурпурных бактерий LH2 (из Rhodopseudomonas addophila) получены положения максимумов двух экситонных компонентов этого спектра (868 нм и 873 нм) Показано, что одна из полученных модельных полос соответствует зарегистрированной экспериментально полосе В870. При этом вопрос о количестве значительных по амплитуде индивидуальных полос (экситонных компонентов) спектра поглощения комплекса пурпурных бактерий LH2 остаётся открытым. Используя теоретическую зависимость между спектральным расщеплением значительных по амплитуде экситонных компонентов в районе 870 нм и беспорядком, получена оценка диагонального беспорядка 480 см'1.

Сравнение неискажённых производных спектров поглощения комплексов пурпурных бактерий LH2 из Rhodopseudomonas acidophila, Rhodospirillum molishanum и Rhodobacter sphaeroides показало сходство этих кривых. Следовательно, различия тонкой структуры спектров поглощения комплексов LH2, выделенных из этих бактерий, с помощью абсорбционной производной спектроскопии не обнаруживаются. Набор неискаженных производных комплекса LH2 из Thiorhodospira sibirica существенно отличается от соответствующих производных для LH2 из других бактерий. Это свидетельствует о структурных отличиях этого комплекса. На примере комплекса LH2 с экстрагированными молекулами спектральной формы В800 (рВ850) продемонстрирована возможность контроля количества остаточных молекул пигментов (в данном случае - молекул БХл спектральной формы В800).

При исследовании спектров поглощения в ближней ИК области восстановленных и окисленных реакционных центров из Rb. sphaeroides и S. ' viridis показано, что элекгрохромный сдвиг полос поглощения мономерных БХл при окислении РЦ незначителен (в обоих случаях около 10 см'1), а наблюдаемое смещение максимумов спектров поглощения (3,5 нм у Rb. sphaeroides и 2 нм у S. viridis) объясняется, прежде всего, выцветанием экситонного компонента специальной пары Ру*. Для обеих бактерий определены положения максимумов экситонного компонента специальной пары Ру+ при комнатной температуре (при 810 нм у Rb. sphaeroides и при 842 нм у В. viridis).

количественные характеристики могут быть использованы для построения теоретических моделей.

При исследовании спектра поглощения цитохрома с показано, что в наборе полученных модельных полос присутствуют очень узкие модельные полосы (с шириной 4-5 нм при комнатной температуре). Присутствие в спектре поглощения цитохрома с таких узких полос делает этот объект удобным для измерения его концентрации в многокомпонентных мутных растворах.

Выводы.

1. Разработаны новые методы производной спектроскопии: метод получения неискажённых производных оптических спектров; метод разложения спектров на полосы по исходному спектру и набору его производных; метод определения концентрации одного из компонентов многокомпонентной сильно рассеивающей смеси; метод вычитания фона в одномерных (двумерных) массивах экспериментальных данных с помощью анализирующей окружности (сферы); метод вычитания вклада релеевского светорассеяния из спектров оптического поглощения. Эффективность предложенных методов продемонстрирована как на модельных, так и на экспериментально зарегистрированных спектрах различного происхождения.

2. Создан программный пакет "ОегЗрес", позволяющий проводить численную обработку экспериментально зарегистрированных спектров и их моделирование. В функциональные возможности программного пакета "Оегврес"

. входит реализация всех методов, описанных в п. 1.

3. Показано, что высокие производные Оу-полосы поглощения (бактерио)хлорофилла хорошо аппроксимируются производными единственной гауссовой модельной полосы, а для аппроксимации низких производных Оу-полосы необходимо вводить дополнительно 2-3 широких гауссовых модельных полосы, не проявляющихся в высоких производных.

4. Определена тонкая структура спектра поглощения комплекса высших растений ШС II. Показано сходство полученных наборов модельных полос в областях поглощения Хл а и Хл Ь.

5. Определена тонкая структура спектров поглощения (при 77К и при 300К) комплекса пурпурных бактерий Ш2 (из ЯЬоборзеиботопаз аас!орЫ1а). Определено положение двух экситонных компонентов низкотемпературного (77К)

спектра при 870 нм (868 нм и 873 нм). Получена оценка диагонального беспорядка в кольце В850 - 480 см"1. Проведено сравнение тонкой структуры спектров поглощения комплексов LH2 из Rhodopseudomonas acidophila, Rhodospirillum molishanum, Rhodobacter sphaeroides. Показано сходство тонкой структуры спектров поглощения всех перечисленных комплексов LH2.

6 Определена тонкая структура спектров поглощения восстановленных и окисленных реакционных центров из Rb. sphaeroides и В. viridis в ближней ПК области. Показано, что элекгрохромный сдвиг полос поглощения мономерных БХл при окислении РЦ незначителен (в обоих случаях около 10 см"1), а наблюдаемое смещение максимумов спектров поглощения объясняется, прежде всего, выцветанием экситонного компонента специальной пары Р/. Для обеих бактерий определены положения максимумов экситонного компонента специальной пары Ру+ при комнатной темпера^ре (при 810 нм у Rb. sphaeroides и при 842 нм у В. viridis). Л/^Г?

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Михайлюк И.К.. Разживин А.П. Способ вычитания низкочастотного фона из

двумерных массивов данных биологического происхождения / Международный лазерный центр МГУ. - М. 2000. - 18 с. - Деп. В ВИНИТИ РАН 28.11.2000, № 3033-В00.

2. Михайлюк И.К.. Разживин А.П. Способ вычитания низкочастотного фона из

массивов (спектральных) данных биологического происхождения / Международный лазерный центр МГУ. - М. 2000. - 22 с. - Деп. В ВИНИТИ РАН 04.07.2000, № 1851-В00 от 04.07.2000.

3. Михайлюк И.К.. Разживин А.П. Вычитание вклада релеевского рассеяния с

помощью производной спектроскопии / Международный лазерный центр МГУ. - М. 2000. -12 с. - Деп. В ВИНИТИ РАН 28.11.2000, 3034-В00.

4. Михайлюк И.К.. Разживин А.П. Использование производных для устранения

вклада светорассеяния при спектрофотометрических измерениях // «Водные экосистемы и организмы -2» / Материалы научной конференции 23-24 июня 2000 г., Москва. - М.: Max Press, 2000. - Т. 3. - С. 53.

5. Mikhailuk I.K.. Razjivin А. P. Background subtraction method for Raman spectra II

Technical digest of XVII International Conference on Coherent and Nonlinear Optics (Minsk, Belarus, June 26 - July 1, 2001). - 2001. - ThN19.

6. Михайлюк И.К. Вычитание фона из одно- и двумерных массивов данных II

Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов». М.: Изд. Московского университета, 2001. - Вып. 6. - С. 29.

7. Михайлюк И.К.. Пищальников Р.Ю, Стадничук И.Н., Разживин А.П.. Метод

разложения оптических спектров на полосы по исходному спектру и набору его производных / Международный лазерный центр МГУ. - М. 2002. - 40 с. -Деп. В ВИНИТИ РАН 22.10.2002, № 1804-В2002.

8. Михайлюк И.К.. Разживин А П. Метод устранения светорассеяния при

спектрофотометрических измерениях в мутных средах с помощью производных // Материалы III съезда фотобиологов России (Воронеж, 28 июня - 4 июля 2001 г.). - Воронеж: ЗАО «ТЭФА», 2001. С. 138-139.

9. Михайлюк И.К.. Разживин А П. Метод разложения спектров на полосы по

исходному спектру и набору его производных II Биофизика. - 2003. - Т. 48. -С. 405-410.

10. Михайлюк И.К.. Разживин А.П. Метод определения концентрации одного из

компонентов многокомпонентной сильно рассеивающей смеси с помощью абсорбционной производной спектроскопии высокого порядка // Вестник МГУ, серия биологическая. - 2003. - Вып. 3. - С. 24-28.

11. Михайлюк И.К.. Разживин А.П. Вычитание фона в одномерных и двумерных

массивах экспериментальных данных на примерах спектров комбинационного рассеяния и снимков флуоресцентного гель-электрофореза Н Приборы и техника эксперимента. - 2003. - №. 6. - С. 43-47 (в печати).

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 14.10.2003 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ 809. Тел. 939-3890,939-3891, 928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В .Ломоносова.

2©

i 1 б 5 6 7

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Михайлюк, Игорь Константинович

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 Методы анализа оптических спектров с помощью производной спектроскопии.

1.1.1 Производные оптических спектров.

1.1.2 Применение производных для повышения разрешения оптических спектров.

1.1.3 Применение производных для измерения концентраций отдельных компонентов многокомпонентных растворов.

1.1.4 Применение производных для подавления фонового сигнала в оптических спектрах.

1.2 Другие численные методы анализа оптических спектров.

1.2.1 Метод наименьших квадратов.

1.2.2 Метод деконволюированных спектров.

1.2.3 Метод искусственных нейронных сетей.

1.2.4 Метод Аленцева-Фока.

1.3 Структура фотосинтетического аппарата.

1.3.1 Бактериальный и растительный фотосинтез.

1.3.2 (Бактерио)хлорофилл.

1.3.3 Структура фотосинтетического аппарата пурпурных бактерий.

1.3.4 Реакционные центры пурпурных бактерий.

1.3.5 Периферический светособирающий комплекс пурпурных бактерий (LH2).

1.3.6 Структура фотосинтетического аппарата высших растений.

1.3.7 Основной светособирающий комплекс высших растений (LHC II).

Глава 2. Разработка методов анализа оптических спектров, основанных на производной спектроскопии.

2.1 Метод получения неискажённых производных.

2.1.1 Искажения производных экспериментальных спектров.

2.1.2 Описание метода получения неискажённых производных.

2.2 Метод разложения спектров на полосы по исходному спектру и набору его производных.

2.2.1 Описание метода.

2.2.2 Примеры применения метода разложения спектров на полосы по исходному спектру и набору его производных.

2.2.2.1 Математическая модель экспериментального спектра.

2.2.2.2 Спектр, составленный из полос пропускания интерференционных фильтров.

2.2.3 Исследование свойств стандартных, кривых, применяемых для описания полос спектров оптического поглощения, и их производных.

2.3 Метод определения концентрации одного из компонентов многокомпонентной сильно рассеивающей смеси с помощью абсорбционной производной спектроскопии высокого порядка.

2.3.1 Описание метода.

2.3.2 Применение производной спектроскопии высокого порядка для определения концентрации цитохрома с в мутных смесях на примере модельного спектра.

2.4 Методы вычитания фонового сигнала в оптических спектрах.

2.4.1 Метод вычитания фона в одномерных (двумерных) массивах экспериментальных данных с помощью анализирующей окружности (сферы).

2.4.2 Примеры применения.

2.4.2.1 Математическая модель экспериментального спектра.

2.4.2.2 Вычитание фонового сигнала из спектра комбинационного рассеяния.

2.4.2.3 Вычитание фонового сигнала из гельэлектрофореграммы.

2.4.3 Метод вычитания вклада релеевского светорассеяния из спектров оптического поглощения с помощью производной спектроскопии.

2.4.4 Применение метода вычитания вклада релеевского светорассеяния из спектров оптического поглощения на примере модельного спектра.

Глава 3. Изучение фотосинтетических пигмент-белковых комплексов с помощью производной спектроскопии.юв

3.1 Анализ спектра оптического поглощения перидинин - Хл а - белкового комплекса динофлагеллятов (РСР) в области Qy-полосы хлорофилла а.

3.2 Анализ полосы В800 спектра оптического поглощения периферического светособирающего комплекса LH2, выделенного из пурпурной фотосинтезирующей бактерии Rhodopseudomonas acidophils.

3.3 Анализ спектра оптического поглощения основного светособирающего комплекса высших растений (LHC II).

3.4 Анализ низкотемпературного спектра оптического поглощения периферического светособирающего комплекса LH2, выделенного из пурпурной фотосинтезирующей бактерии Rhodopseudomonas acidophils.

3.5 Сравнение спектров оптического поглощения и их производных периферических светособирающих комплексов LH2, выделенных из пурпурных фотосинтезирующих бактерий Rhodopseudomonas acidophils, Rhodospirillum molishanum, Rhodobacter sphaeroides, и Thiorhodospira sibirica.

3.6 Анализ спектра оптического поглощения периферического светособирающего комплекса LH2 с экстрагированными молекулами спектральной формы В800 (рВ850).

3.7 Анализ спектров оптического поглощения восстановленных и окисленных реакционных центров, выделенных из пурпурных фотосинтезирующих бактерий Rhodobacter sphaeroides и Blastochlorii viridis.

3.8 Анализ спектров оптического поглощения аллофикоцианина, С-фикоцианина и денатурированного С-фикоцианина.

3.9 Анализектра оптического поглощения цитохрома

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и применение методов производной спектроскопии высокого порядка для выявления тонкой структуры оптических спектров фотосинтетических пигмент-белковых комплексов"

Актуальность темы.

Наиболее просто фотосинтетический аппарат устроен у пурпурных бактерий, являющихся классическим объектом исследований фотосинтеза. В структуре фотосинтетического аппарата этих бактерий можно выделить две основные части -реакционный центр (РЦ) и светособирающую антенну. РЦ и антенна представляют собой сложные пигмент-белковые комплексы (ПБК) высокого молекулярного веса, располагающиеся во внутренних мембранах клетки. В РЦ происходит преобразование энергии из физической формы синглетного возбужденого состояния в химическую форму разделённых зарядов разного знака. Основная функция светособирающей антенны заключается в поглощении квантов света и передаче энергии возбуждения в РЦ. Наличие антенны позволяет увеличить светосбор РЦ и согласовать скорость поглощения квантов света со скоростью преобразования их энергии в системе. Для работы фотосинтетического аппарата характерна очень высокая эффективность (по крайней мере, на первичных стадиях). Около 90% возбужденных состояний, возникающих в антенне при поглощении квантов света, попадает в РЦ. Эффективность преобразования энергии в РЦ ещё выше и составляет почти 100% при разделении зарядов. Столь эффективное преобразование солнечной энергии давно привлекает внимание учёных. Очевидно, что эффективная работа фотосинтетического аппарата достигается благодаря согласованной работе светособирающей антенны и РЦ. В связи с этим изучение структурных и функциональных свойств фотосинтетических пигмент-белковых комплексов, в частности их спектральных свойств, является важнейшей проблемой при исследовании первичных процессов фотосинтеза. Для построения количественных спектрально-кинетических моделей переноса энергии в антенне и от антенны к РЦ необходимо знание тонкой структуры оптических спектров изучаемых комплексов.

Цели и задачи диссертационной работы.

В диссертационной работе решались следующие задачи:

1. Разработка методов производной спектроскопии для анализа оптических спектров:

• метода получения неискажённых производных оптических спектров;

• метода разложения спектров на полосы по исходному спектру и набору его производных;

3. Определение набора полос стандартной формы необходимого для аппроксимации Qy-полосы поглощения (бактерио)хлорофилла и её производных.

4. Определение тонкой структуры спектров оптического поглощения различных фотосинтетических ПБК: основного светособирающего комплекса высших растений (LHCII); периферического светособирающего комплекса (LH2) и реакционного центра из различных пурпурных бактерий.

Научная новизна.

Разработаны/новые методы производной спектроскопии для анализа оптических спектров: метод получения неискажённых производных оптических спектров, метод разложения спектров на полосы по исходному спектру и набору его производных,' метод определения концентрации одного из компонентов многокомпонентной сильно рассеивающей смеси с помощью абсорбционной производной спектроскопии высокого порядка, метод вычитания фона в одномерных (двумерных) массивах экспериментальных данных с помощью анализирующей окружности (сферы), метод вычитания фона с помощью производной спектроскопии. Определена тонкая структура спектров поглощения ряда фотосинтетических ПБК с помощью метода разложения спектров на полосы по исходному спектру и набору его производных. Для пигмент-белковых комплексов пурпурных бактерий оценены физические характеристики комплексов (диагональный беспорядок для кольца В850 комплекса LH2 и электрохромный сдвиг мономерного бактериохлорофилла РЦ) на основании полученных численных параметров (положения максимумов, амплитуды и ширины) спектральных компонентов спектров поглощения.

Практическая значимость.

Полученные параметры спектральных компонентов спектров поглощения ряда фотосинтетических ПБК могут быть использованы для проверки существующих теоретических моделей, описывающих спектрально-кинетические свойства ПБК.

Личный рклад.

Все основные результаты, изложенные в диссертационной работе, получены автором самостоятельно. Постановка задач исследований и интерпретация полученных' результатов осуществлялись автором совместно с научным руководителем - доктором физ. - мат. наук А. П. Разживиным.

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы были представлены на конференции ММТТ-2000 (Москва); конференции ICONO-2001 (Минск); конференции Ломоносов-2001 (Москва); III Съезде фотобиологов России (Воронеж-2001); на научных семинарах в НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского, на кафедре биофизики Биологического факультета МГУ и в Институте нелинейной оптики и импульсной спектроскопии им. Макса Борна (Берлин).

Публикации.

По материалам диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ. Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения,

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Михайлюк, Игорь Константинович

Выводы.

1. Разработаны новые методы производной спектроскопии: метод получения неискажённых производных оптических спектров; метод разложения спектров на полосы по исходному спектру и набору его производных; метод определения концентрации одного из компонентов многокомпонентной сильно рассеивающей смеси; метод вычитания фона в одномерных . (двумерных) массивах экспериментальных данных с помощью анализирующей окружности (сферы); метод вычитания вклада релеевского светорассеяния из спектров , оптического поглощения. Эффективность предложенных методов продемонстрирована как на модельных, так и на экспериментально зарегистрированных спектрах различного происхождения.

2. Создан программный пакет "DerSpec", позволяющий проводить численную обработку экспериментально зарегистрированных спектров и их моделирование. В функциональные возможности программного пакета "DerSpec" входит реализация всех методов, описанных в п. 1.

3. Показано, что высокие производные Qy-полосы поглощения (бактерио)хлорофилла хорошо аппроксимируются производными единственной гауссовой модельной полосы, а для аппроксимации низких производных Qy-полосы необходимо вводить дополнительно 2-3 широких гауссовых модельных полосы, не проявляющихся в высоких производных.

4. Определена тонкая структура спектра поглощения комплекса высших растений LHC II. Показано сходство полученных наборов модельных полос в областях поглощения Хл а и Хл Ь.

5. Определена тонкая структура спектров поглощения (при 77К и при 300К) комплекса пурпурных бактерий LH2 (из Rhodopseudomonas acidophila). Определено положение двух экситонных компонентов низкотемпературного (77К) спектра при 870 нм (868 нм и 873 нм). Получена оценка диагонального беспорядка в кольце В850 - 480 см'1. Проведено сравнение тонкой структуры спектров поглощения комплексов LH2 из Rhodopseudomonas acidophila, Rhodospirillum molishanum, Rhodobacter sphaeroides. Показано сходство тонкой структуры спектров поглощения всех перечисленных комплексов LH2.

6 Определена тонкая структура спектров поглощения восстановленных и окисленных реакционных центров из Rb. sphaeroides и В. viridis в ближней ИК области. Показано, что электрохромный сдвиг полос поглощения мономерных БХл при окислении РЦ незначителен (в обоих случаях около 10 см"1), а наблюдаемое смещение максимумов спектров поглощения объясняется, прежде всего, выцветанием экситонного компонента специальной пары Р/. Для обеих бактерий определены положения максимумов экситонного компонента специальной пары Ру+ при комнатной температуре (при 810 нм у Rb. sphaeroides и при 842 нм у 6. viridis).

Заключение.

В работе разработаны методы производной спектроскопии высокого порядка для анализа оптических спектров:

• метод получения неискажённых производных оптических спектров;

• метод разложения спектров на полосы по исходному спектру и набору его производных;

При исследовании спектров поглощения комплекса РСР в области Qy-полосы хлорофилла а и полосы В800 комплекса LH2 (из Rhodopseudomonas acidophila) показано, что низкие производные (включая нулевую) Qy-полосы поглощения (при комнатной температуре) (Б)Хл не могут быть аппроксимированы соответствующими производными единственной модельной полосы стандартной формы. В то же время высокие производные Qy^-полосы поглощения (Б)Хл близки к соответствующим производным единственной гауссовой модельной полосы.

При исследовании спектра поглощения комплекса высших растений LHC II оценены параметры ряда полос, составляющих этот спектр. Показано, что некоторые модельные полосы, полученные при разложении спектра LHC II, зарегистрированного при комнатной температуре, соответствуют отдельным пикам низкотемпературного спектра того же объекта. Показано сходство полученных наборов модельных полос в областях поглощения Хл а и Хл Ь. Если считать, что хлорофиллы комплекса LHC II двух разных видов (Хл а и Хл Ь) образуют два разных кластера, то возможным объяснением обнаруженного сходства может служить предположение о сходстве организации этих кластеров. Кроме того, полученный набор спектральных компонентов комплекса LHC II и их количественные характеристики могут быть использованы для проверки предлагаемых теоретических моделей.

При исследовании низкотемпературного спектра поглощения комплекса пурпурных бактерий LH2 (из Rhodopseudomonas acidophila) получены положения максимумов двух экситонных компонентов этого спектра (868 нм и 873 нм). Показано, что одна из полученных модельных полос соответствует зарегистрированной экспериментально полосе В870. При этом вопрос о количестве значительных по амплитуде индивидуальных полос (экситонных компонентов) спектра поглощения комплекса пурпурных бактерий LH2 остаётся открытым. Используя теоретическую зависимость между спектральным расщеплением значительных по амплитуде экситонных компонентов в районе 870 нм и беспорядком, получена оценка диагонального беспорядка 480 см*1.

Сравнение неискажённых производных спектров поглощения комплексов пурпурных бактерий LH2 из Rhodopseudomonas acidophila, Rhodospirilium molishanum и Rhodobacter sphaeroides показало сходство этих кривых. Следовательно, различия тонкой структуры спектров поглощения комплексов LH2, выделенных из этих бактерий, с помощью абсорбционной производной спектроскопии не обнаруживаются. Набор неискаженных производных комплекса LH2 из Thiorhodospira sibirica существенно отличается от соответствующих производных для LH2 из других бактерий. Это свидетельствует о структурных отличиях этого комплекса. На примере комплекса LH2 с экстрагированными молекулами спектральной формы В800 (рВ850) продемонстрирована возможность контроля количества остаточных молекул пигментов (в данном случае - молекул БХл спектральной формы В800).

При исследовании спектров поглощения в ближней И К области восстановленных и окисленных реакционных центров из Rb. sphaeroides и В. viridis показано, что электрохромный сдвиг полос поглощения мономерных БХл при окислении РЦ незначителен (в обоих случаях около 10 см"1), а наблюдаемое смещение максимумов спектров поглощения (3,5 нм у Rb. sphaeroides и 2 нм у В. viridis) объясняется, прежде всего, выцветанием экситонного компонента специальной пары Ру+. Для обеих бактерий определены положения максимумов экситонного компонента специальной пары Р/ при комнатной температуре (при 810 нм у Rb. sphaeroides и при 842 нм у В. viridis).

Проведено сравнение тонкой структуры спектров поглощения фикобилипротеидов: аллофикоцианина, нативного и денатурированного С-фикоцианина. Полученные наборы спектральных компонентов этих объектов и их количественные характеристики могут быть использованы для построения теоретических моделей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Михайлюк, Игорь Константинович, Москва

1. G. Talsky, Derivative spectroscopy: low and higher order. 1994, Weinheim, Basel, Cambridge, New York, Tokyo: VCH Publishers, 1.c. 228.

2. И.М. Дубровкин.В.Г. Беликов, Производная спектрометрия. Теория, техника, применение. 1988, Ростов-на-Дону: Издательство Ростовского университета. 143.

3. С.М. Stellman, Bucholtz F., Suppression of fluorescence interference via wavelength shift-keyed Raman spectroscopy using an argon ion laser and acousto-optic tunable filter, Spectrochimica Acta Part A 54 (1998), 1041-1047.

4. G. Stewart, C. Tandy, D. Moodie, M.A. Morante.F. Dong, Design of a fibre optic multi-point sensor for gas detection, Sensors and Actuators В 51 (1998), 227-232.

5. A. Savitzky,M.J.E. Golay, Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures, Anal Chem 36 (1964), 1627-1638.

6. J. Steinier, Y. Termonia.J. Deltour, Comments on smoothing and differentiation of data by simplified least square procedure, Anal Chem 44 (1972), 19061909.

7. A.C. Norris, Computational Chemistry. 1981, Chichester: Wiley.

8. Mixed-signal processing design seminar. 1991, Printed in the USA: Published by Analog Devices.

9. H.M. Астафьева, Вейвлет-анализ: основы теории и примеры применения, УФН 166 (1996), 1146-1170.

10. L. Antonov, Fourth derivative spectroscopy a critical view, Analitica Chimica Acta 349 (1997), 295-301.

11. L. Antonov.S. Stoyanov, Step by step filter an approach for noise reduction in the derivative UV-visible spectra, Analytica Chimica Acta 324 (1996), 77-83.

12. A. Petrov, L. Antonov, H. Ehara.N. Harada, Step by step filter based program for calculations of highly informative derivative curves, Computers and Chemistry 24 (2000), 562-569.

13. D.M. Lewis,J.C. Wang, The use of Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopy to study the state of heterobifunctional reactive dyes, Dyes and Pigments 39 (1998), 111-123.

14. В.Г. Ладыгин, Флуоресценция, формы хлорофилла и число реакционных центров фотосистем I и II у chlorotica мутантов Pisum sativum L., Биофизика 47 (2002), 1032-1043.

15. Ф.Ф. Литвин, В.В. Шубин,В.А. Синещёков, Исследование различных типов агрегатов хлорофилла а в растворах и плёнках методом абсорбционной и люминесцентной производной спектроскопии, Биофизика 20 (1975), 202-207.

16. Ф.Ф. Литвин,И.Н. Стадничук, Спектры поглощения, флуоресценции и возбуждения флуоресценции хлорофилла с в клетке при -196С, Биофизика 221977), 541-542.

17. И.Н. Стадничук,Ф.Ф. Литвин, Разложение на компоненты спектров поглощения и флуоресценции зелёных бактерий, Биофизика 22 (1977), 170-174.

18. Н.А. Мамлеева.Л.И. Некрасов, Спектры поглощения хлорофилла а, адсорбированного на аэросиле, Биофизика 22 (1977), 403-406.

19. Ф.Ф. Литвин, И.Н. Стадничук, Круглов В. П. Разложение на компоненты спектров флуоресценции и поглощения хлорофилла а в клетке, Биофизика 231978), 450-455.

20. Ф.Ф. Литвин,И.Н. Стадничук, О соблюдении соотношения Степанова для параметров спектров поглощения и флуоресценции хлорофилла а в растворе и клетке, Биофизика 24 (1979), 651-655.

21. И.Н. Стадничук, Л.А. Минеева, Гусев М.В. Хромофорный состав и природа спектров поглощения фикобилипротеидов, Биохимия 45 (1980), 1560-1567.

22. B.C. Сааков, Особенности действия гамма-излучения на тонкую структуру фотосинтетического аппарата; оценка характера нарушений in vivo с помощью производных спектров высоких порядков, ДАН 387 (2002), 265-271.

23. B.C. Сааков, Специфика изменения тонкой структуры фотосинтетического аппарата под влиянием гамма-облучения. Характер изменения производных спектров зелёного листа in vivo в красной области спектра, ДАН 388 (2003), 265-271.

24. Б.А. Гуляев, Ф.Ф. Литвин,Е.П. Веденеев, Разложение сложных спектральных кривых биологических объектов на компоненты с использованием производных спектров, Научн. докл. высшей школы. Биол. науки 4 (1971), 49-57.

25. T.R. Griffiths, К. King, Hubbard H.V. A., M.J. Schwing-Weill.J. Meullemeestre, Some aspects of the slope and limitations of derivative spectroscopy, Analytica Chimica Acta 143 (1982), 163-176.

26. R.A. Videira, M.C. Antunes-Madeira, J.B.A. Custodio.V.M.C. Madeira, Partition of DDE in synthetic and native membranes determined by ultraviolet derivative spectroscopy, Biochimica et Biophysica Acta 1238 (1995), 22-28.

27. D. Ozer.H. Senel, Determination of lisinopril from pharmaceutical preparations by derivative UV spectrophotometry, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 21 (1999), 691-695.

28. B. Miralles, B. Bartolome, M. Ramos.L. Amigo, Determination of whey protein to total ratio in UHT milk using fourth derivative spectroscopy, International Dairy Journal 10(2000), 191-197.

29. V. De Filippis, V.B. Vassiliev, M. Beltramini, A. Fontana, B. Salvato.V.S. Gaitskhoki, Evidence for the molten globule state of human apo-ceruloplasmin, Biochimica et Biophysica Acta 1297 (1996), 119-123.

30. Q. Luthi-Peng,Z. Puhan, Determination of protein and casein in milk by fourth derivative UV spectrophotometry, Analytica Chimica Acta 393 (1999), 227-234.

31. N. Mateeva, L. Antonov, M. Mitewa.S. Miteva, Application of the first derivative spectra method for investigation of the complexation of some aza-15-crown-5-containing chromoionophores with Sr2+, Talanta 43 (1996), 275-279.

32. N. Erk, Assay of ephedrine hydrochloride and theophylline in pharmaceutical formulations by differential-derivative spectroscopy, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 25 (2000), 255-261.

33. C.V.N. Prasad, C. Parihar, K. Sunil.P. Parimoo, Simultaneous determination of amiloride HCI, hydrochlorothiazide and atenolol in combined formulations by derivative spectroscopy, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 17 (1998), 877-884.

34. T.R. Griffiths, D.A. Nerukh.S.A. Eremenko, The application of theoretical models of complex shape to the fitting of experimental spectra having closely overlapping bands, Phys. Chem. Chem. Phys. 1 (1999), 3199-3208.

35. А. Беккиев, T.A. Гоголинская,В.В. Фадеев, Одновременное определение температуры и солености морской воды методом лазерной КР-спектроскопии, ДАН СССР 271 (1983), 849-852.

36. G. Georgiev, Т. Kalkanjiev.V. Petrov, Deconvolution Technique Application to Spectral Contour Analysis, Spectr. Lett. 16 (1983), 753-763.

37. H.-M. Wu, N.R.S. Reddy.G.J. Small, Direct Observation and Hole Burning of the Lowest Exiton Level (B870) of the LH2 Antenna Complex of Rhodopseudomonas acidophila (Strain 10050), J. Phys. Chem. В 101 (1997), 651-656.

38. C.M. Harris, R.J. Johnson,D.E. Metzler, Band-shape analysis and resolution of electronic spectra of pyridoxal phosphate and other 3-hydroxypyridine-4-aldehydes, Biochimica et Biophysica Acta 421 (1976), 181-194.

39. D.E. Metzler, C.M. Harris, R.J. Johnson,D.B. Siano, Spectra of 3-Hydroxypyridines, Band-Shape Analysis and Evaluation of tautomeric Equilibria, Biochemistry 12 (1973), 5377-5392.

40. R. Fletcher, Practical Methods of Optimization. 1987, New York: Wiley.

41. H. Kupper, М. Spiller.F.C. Kupper, Photometric Method for the Quantification of Chlorophylls and Their Derivatives in Complex Mixtures: Fitting with Gauss-Peak Spectra, Analytical Biochemistry 286 (2000), 247-256.

42. H. Rogl, R. Schodel, H. Lokstein, W. Kuhlbrandt.A. Schubert, Assignment of spectral substructures to pigment-binding sites in higher plant light-harvesting complex LHC-II, Biochemistry 41 (2002), 2281-2287.

43. X. Zhang, J. Zheng,H. Gao, Curve fitting using wavelet transform for resolving simulated overlapped spectra, Analytica Chimica Acta 443 (2001), 117-125.

44. D.I. Arnon, Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenyl oxidase in Beta vulgaris, Plant Physiol. 24 (1949), 1-15.

45. R.C. White, I.D. Jones, E. Gibbs.L.S. Butler, Estimation of copper pheophytins, chlorophylls, and pheophytins in mixtures in diethyl ether, J. Agric. Food Chem. 25 (1997), 143-146.

46. R.C. White, I.D. Jones, E. Gibbs.L.S. Butler, Estimation of zinc pheophytins, chlorophylls, and pheophytins in mixtures in diethyl ether or 80% acetone by spectrophotometry and fluorometry, J. Agric. Food Chem. 73 (1997), 146-149.

47. J.K. Kauppinen, D.J. Moffatt, H.H. Mantsch.D.G. Cameron, Fourier self-deconvolution: a method for resolving intrinsically overlapped bands, Appl. Spectr. 35 (1981), 271-276.

48. J.K. Kauppinen, D.J. Moffatt, H.H. Mantsch.D.G. Cameron, Fourier self-deconvolution and its applications, Anal. Chem. 53 (1981), 1454-1457.

49. J.К. Kauppinen, D.J. Moffatt.H.H. Mantsch, Noise in Fourier self-deconvolution, Applied Optics 20 (1981), 1866-1879.

50. R.N. Jones,K. Shimokoshi, Some observations on the resolution enhancement of spectral data by the method of self-deconvolution, Appl. Spectr. 37 (1983), 59.

51. G.M. Georgiev, Т.К. Kalkanjiev, V.P. Petrov, Z. Nickolov.M. Miteva, Concentration dependence studies of water Raman spectra by the method of self-deconvolution, Chem. Phys. Lett. 103 (1983), 83-98.

52. Т.К. Kalkanjiev, V.P. Petrov, G.M. Georgiev, M.I. Miteva,Z. Nickolov, A New Approach to the Analysis of the Effect of Dissolved Salts on the Raman Spectrum of Water, Journal of Molecular Structure 115 (1984), 409-412.

53. И.Г. Иванов, В. В. Фадеев, Дистанционная лазерная диагностика фитопланктона, Вестник МГУ, серия биологическая 6 (1989), 882-889.

54. АН. Ежов,С.А. Шумский, Нейрокомпьютинг и его приложение в экономике и бизнесе. 1998, Москва: Изд-во МФТИ.

55. C.A. Доленко, И.В. Гердова, Т.А. Доленко,В.В. Фадеев, Лазерная флуориметрия смесей сложных органических соединений с использованием искусственных нейронных сетей, Квантовая электроника 31 (2001), 834-838.

56. Т.А. Dolenko, V.V. Fadeev, I.V. Gerdova, S.A. Dolenko,R. Reuter, Fluorescence Diagnostics of Oil Pollution in Coastal Marine Waters by Use of Artificial Neural Networks, Applied Optics 41 (2002), 5155-5166.

57. М.В. Фок, Разделение сложных спектров на индивидуальные полосы при помощи обобщенного метода Аленцева, Труды ФИАН 59 (1972), 3-24.

58. Е.Е. Букке, Т.И. Вознесенская, Н.П. Голубева, Н.А. Горбачёва, З.П. Илюхина, Е.И. Панасюк,М.В. Фок, Применение обобщённого метода Аленцева для анализа спектра сине-голубой люминесценции ZnS, Труды ФИАН 59 (1972), 25-37.

59. Р. Клейтон, Фотосинтез. Физические механизмы и химические модели. 1984, Москва: Мир. 350.

60. М. Gouterman, Spectra of porphyrins, Journal of molecular Spectroscopy 6 (1961), 138.

61. M. Gouterman, G.H. Wagniere.L.C. Snyder, Spectra of porphyrins. II. Four orbital model, Journal of Molecular Spectroscopy 11 (1963), 108.

62. A. Scherz.W.W. Parson, Exciton interactions in dimers of bacteriochlorophyll and related molecules, Biochimica et Biophysica Acta 766 (1984), 666-678.

63. A. Warshel,W.W. Parson, Spectroscopic properties of photosynthetic reaction centers. I. Theory, J. Am. Chem. Soc. 109 (1987), 6143-6152.

64. H. Sheer, Chlorophylls. 1991, London: CRC Press.

65. R.J. Cogdell, N.W. Isaacs, T.D. Howard, K. McLuskey, N.J. Fraser.S.M. Prince, How photosynthetic bacteria harvest solar energy, Journal of Bacteriology 181 (1999), 3869-3879.

66. X. Hu, A. Damjanovic, T. Ritz,K. Schulten, Architecture and mechanism of the light-harvesting apparatus of purple bacteria, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998), 5935-5941.

67. S. Karrasch, P.A. Bullough.R. Ghosh, The 8.5-Angstrom projection map of the light-harvesting complex 1 from Rhodospirillum rubrum reveals a ring composed of 16 subunits, EMBO J. 14 (1995), 631-638.

68. S.J. Jamieson, P.Y. Wang, P. Qian, J.Y. Kirkland, M.J. Conroy, C.N. Hunter,P.A. Bullough, Projection structure of the photosynthetic reaction centre-antenna complex of Rhodospirillum rubrum at 8.5 angstrom resolution, EMBO J. 21 (2002), 39273935.

69. L.N.M. Duysens, Reversible changes in the light absorption of purple bactiria caused by illumination, Carnegie Inst. Wash. Yb. 52 (1953), 157.

70. L.N.M. Duysens, Reversible photooxidation of a cytochrome pigment in photosynthesizing R. rubrum, Nature 173 (1954), 692-693.

71. L.N.M. Duysens, W.J. Huiscamp, Vos J. J., van der Hart J. M., Reversible changes in bactiriochlorophyllin purple bactiria upon illumination, Biochimica et Biophysica Acta 19(1956), 188-190.

72. J.P. Allen, G. Feher, Т.О. Yeates, H. Komiya.D.C. Rees, Structure of the reaction centers from Rb. sphaeroides R-26: The cofactors., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 5730-5734.

73. J.P. Allen, G. Feher, Т.О. Yeates, H. Komiya.D.C. Rees, Structure of reaction center from rhodobacter sphaeroide R-26: The protein subunits, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 6162-6166.

74. J. Deisenhofer, О. Epp, K. Miki.R. Huber, Structure of protein subunits in the photosynthetic reaction centers of Rhodopseudomonas viridis at 3 A resolution, Nature 318(1985), 118-124.

75. J. Deisenhofer.H. Michel, The photosynthetic reaction center from the purple bacterium Rps. viridis, The EMBO J. 8 (1989), 2149-2170.

76. J. Deisenhofer, O. Epp, I. Shinnig.H. Michel, Crystallographic refement at 2,3 A resolution and refined model of the photosynthetic reaction center from Rhodopseudomonas viridis, J. Mol. Biol. 246 (1995), .429-457.

77. М.И. Окамура, Г. Фехер.Н. Нельсон, Реакционные центры, in Фотосинтез, Говинджи, Editor. 1987, Мир: Москва, р. 316-402.

78. C.R.D. Lancaster, U. Ermler.H. Michel, in Anoxygenic Photosynthetic Bacteria, R.E. Blankenship, M.T. Madigan, and C.E. Bauer, Editors. 1995, Kluwer Acad. Publ.: Netherlands, p. 503-526.

79. B.B. Парсон.Б. Ke, Первичные фотохимические реакции, in Фотосинтез, Говинджи, Editor. 1987, Мир: Москва, р. 472-539.

80. N.W. Woodbury.J.P. Allen, in Anoxygenic Photosynthetic Bacteria, R.E. Blankenship, M.T. Madigan, and C.E. Bauer, Editors. 1995, Kluwer Acad. Publ.: Netherlands, p. 527-557.

81. А.Б. Рубин, Биофизика. Vol. 2. 1987, Москва: Высшая школа. 304.

82. D.C. Arnett, Moser С. С., Dutton P. L., Scherer N. F., The First Events in Photosynthesis: Electronic Coupling and Energy Transfer Dynamics in the Photosynthetic

83. Reaction Center from Rhodobacter sphaeroides, J. Phys. Chem. В 103 (1999), 20142032.

84. A. de Winter,S.G. Boxer, The mechanism of triplet energy transfer from the special pair to the carotenoid in bacterial photosynthetic reaction centers, J. Phys. Chem. 103 (1999), 8786-8789.

85. B.A. King, T.B. McAnaney, A. de Winter,S.G. Boxer, Excited state energy transfer pathways in photosynthetic reaction centers. 3. Ultrafast emission from the monomeric bacteriochlorophylls, J. Phys. Chem. 104 (2000), 8895-8902.

86. X.J. Jordanides, G.D. Scholes.G.R. Fleming, The Mechanism of Energy Transfer in the Bacterial Photosynthetic Reaction Center, J. Phys. Chem. В 105 (2001), 1652-1669.

87. V.A. Shuvalov.A.G. Yakovlev, Coupling of nuclear wavepacket motion and charge separation in bacterial reaction centers, Febs Letters 540 (2003), 26-34.

88. J. Breton, in The Photosynthetic Bacterial Reaction Center : Structure and Dynamics, J. Breton and A. Vermiglio, Editors. 1988, Plenum Press: New York. p. 59.

89. S.G. Johnson, D. Tang, R. Jankowiak, J.M. Hayes, G.J. Small,D.M. Tiede, Structure and Marked Mode of the Primary Electron Donor State Absorption of Photosynthetic Bacteria: Hole-Burned Spectra, J. Phys. Chem. 93 (1989), 5953-5957.

90. S.R. Meech, A.J. Hoff.D.A. Wiersma, Role of the charge-transfer states in bacterial photosynthesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 9464-9468.

91. G. Hartwich, H. Scheer, V. Aust.A. Angerhofer, Absorption and ADMR studies on bacterial photosynthetic reaction centres with modified pigments, Biochimica et Biophysica Acta 1230 (1995), 97-113.

92. G. McDermott, S. Prince, A. Freer, A. Hawthornthwaite-Lawless, M. Papiz, R. Cogdell.N. Isaacs, Crystal structure of an integral membrane light-harvesting complex from photosynthetic bacteria, Nature 374 (1995), 517-521.

93. J. Коерке, X. Ни, C. Munke, K. Schulten.H. Michel, The crystal structure of the light harvesting complex II (B800-850) from Rhodospirillum molischianum, Structure 4 (1996), 581-597.

94. V.I. Novoderezhkin.A.P. Razjivin, Excitonic interactions in the light-harvesting antenna of photosynthetic purple bacteria and their influence on picosecond absorbance difference spectra, Febs Letters 330 (1993), 5-7.

95. V.I. Novoderezhkin.A.P. Razjivin, Exiton dynamics in circular aggregates: application to antenna of photosynthetic purple bacteria, Biophysical Journal 68 (1995), 1089-1100.

96. P. Ю. Пищальников.А.П. Разживин, Спектры оптического поглощения и кругового дихроизма светособирающих комплексов из Rhodopseudomonasacidophils, рассчитанные на основе рентгеноструктурных данных, Биофизика 48 (2003), 221-226.

97. B.P. Krueger, G.D. Scholes.G.R. Fleming, Calculation of Couplings and Energy-Transfer Pathways between the Pigments of LH2 by the ab Initio Transition Density Cube Method, J. Phys. Chem. В 102 (1998), 5378-5386.

98. G.D. Scholes, I.R. Gould, R.J. Cogdell,G.R. Fleming, Ab Initio Molecular Orbital Calculations of Electronic Couplings in the LH2 Bacterial Light-Harvesting Complex of Rps. Acidophila, J. Phys. Chem. В 103 (1999), 2543-2553.

99. S. Tretiak, C. Middleton, V. Chernyak.S. Mukamel, Bacteriochlorophyll and Carotenoid Exitonic Coupling in the LH2 System of Purple Bacteria, J. Phys. Chem. В 104 (2000), 9540-9553.

100. S. Georgakopoulou, R.N. Frese, E. Johnson, C. Koolhaas, R.J. Cogdell, R. van Grondelle.G. van der Zwan, Absorption and CD Spectroscopy and Modeling of Various LH2 Complexes from Purple Bacteria, Biophysical Journal 82 (2002), 2184-2197.

101. T.V. Dracheva, V. Novoderezhkin,A.P. Razjivin, Exiton derealization in the antenna of purple bacteria: Exiton spectrum calculations using X-ray data and experimental site inhomogeneity, Febs Letters 387 (1996), 81-84.

102. M.H.C. Koolhaas, G. van der Zwan, R.N. Frese,R. van Grondelle, Red Shift of the Zero Crossing in the CD Spectra of the LH2 Antenna Complex of Rhodopseudomonas acidophila: A Structure-Based Study, J. Phys. Chem. В 101 (1997), 7262-7270.

103. H.-M. Wu,G.J. Small, Symmetry adapted basis defect patterns for analysis of the effects of energy disorder on cyclic arrays of coupled chromophores, Chemical Physics 218 (1997), 225-234.

104. A.P. Razjivin, A.A. Moskalenko.V.I. Novoderezhkin, Model of detergent-induced spectral changes of the B800-850 complex from Chromatium minutissimum, lubmb Life 50 (2000), 115-117.

105. R.G. Alden, E. Johnson, V. Nagarajan, W.W. Parson, C.J. Law.R.G. Cogdell, Calculations of Spectroscopic Properties of the LH2 Bacteriochlorophyll-Protein Antenna Complex from Rhodopseudomonas acidophila, J. Phys. Chem. В 101 (1997), 4667-4680.

106. M.B. Evans, A.M. Hawthornthwaite.R. Cogdell, Isolation and characterization of the different B800-850 light harvesting complexes from low- and high-light grown cells of Rhodopseudomonas cryptolactis, Biochimica et Biophysica Acta 1016 (1990), 71-76.

107. J.N. Sturgis, G. Hagemann, M.H. Tardos.B. Robert, Biochemical and spectroscopic characterization of the B800-850 light-harvesting complex from Rhodobacter sulphidophilus and its B800-830 spectral form, Biochemistry 34 (1995), 10519-10524.

108. A.A. Москаленко, H. Кузнецова, Щ.Е. Ерохин.ОА Торопыгина, Структурные особенности и конформационные переходы в комплексе В800-850 из Chromatium minutissimum, Биохимия 61 (1996), 318-325.

109. A. Freiberg, A. Ellervee, P. Kukk, A. Laisaar, M. Tars,K. Timpmann, Pressure effects on spectra of photosynthetic light-harvesting pigment-protein complexes, Chem. Phys. Lett. 214 (1994), 10-16.

110. G.D. Scholes.G.R. Fleming, On the Mechanism of Light Harvesting in Photosynthetic Purple Bacteria: B800 to B850 Energy Transfer, J. Phys. Chem. В 104 (2000), 1854-1868.

111. M. Dahlbom, T. Pullerits, S. Mukamel.V. Sundstrom, Exciton Derealization in the B850 Light-Harvesting Complex : Comparison of Different Measures, J. Phys. Chem. В 105 (2001), 5515-5524.

112. R. Jimenez, F. van Mourik, J.Y. Yu.G.R. Fleming, Three-Pulse Photon Echo Measurements on LH1 and LH2 Complexes of Rhodobacter sphaeroides: A Nonlinear Spectroscopic Probe of Energy Transfer, J. Phys. Chem. В 101 (1997), 7350-7359.

113. W.V. Nicholson, R.C. Ford,A. Holzenburg, A current assessment of photosystem II structue, Bioscience reports 16 (1996), 159-187.

114. S. Jansson, The light-harvesting chlorophyll a/b-binding proteins, Biochimica et Biophysica Acta 1184 (1994), 1-19.

115. H. van Amerongen.R. van Grondelle, Understanding the energy transfer function of LHCII, the major light-harvesting complex of green plants, J. Phys. Chem. В 105 (2001), 604-617.

116. W. Kuhlbrandt.D.N. Wang, Three-dimensional structure of plant light-harvesting complex determined by electron crystallography, Nature 350 (1991), 478-480.

117. W. Kuhlbrandt, D.N. Wang.Y. Fujiyoshi, Atomic model of plant light-harvesting complex by electron crystallography., Nature 367 (1994), 614-621.

118. J.P. Connelly, M.G. Muller, M. Hucke, G. Gatzen, C.W. Mullineaux, Ruban A.V., Horton P.A.R. Holzwarth, Ultrafast spectroscopy of trimeric light-harvesting comlex II from higher plants, J. Phys. Chem. В 101 (1997), 1902-1909.

119. E.I. Iceri.D. Gulen, Chlorophyll transition dipole moment orientations and pathways for flow of excitation energy among the chlorophylls of the major plant antenna, LHCII, Eur. Biophys. J. 30 (2001), 344-353.

120. V. Novoderezhkin, J.M. Salverda, H. van Amerongen.R. van Grondelle, Exiton modeling of energy-transfer dynamics in the LHCII complex of higher plants: a Redfield theory approach, J. Phys. Chem. В 107 (2003), 1893-1912.

121. G. Zucchelli, P. Dainese, R.C. Jennings, J. Breton, F.M. Garlaschi.R. Bassi, Gaussian Decomposition of Absorption and Linear Dichroism Spectra of Outer Antenna Complexes of Photosystem II, Biochemistry 33 (1994), 8982-8990.

122. G. Zucchelli, F.M. Garlaschi.R.C. Jennings, Thermal Broadening Analysis of the Light Harvesting Complex II Absorption Spectrum, Biochemistry 35 (1996), 1624716254.

123. N. Ozaltin, Determination of Lansoprazole in pharmaceutical dosage forms by two different spectroscopic methods, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 20 (1999), 599-606.

124. В.В. Лебедева, Техника оптической спектроскопии. 1986, Москва: Издательство Московского университета.

125. S. Mukamel, Principles of Nonlinear Optical Spectroscopy. 1995, New York: Oxford University Press. 523.

126. G. Zucchelli, R.C. Jennings, F.M. Garlaschi, G. Cinque, R. Bassi.O. Cremonesi, The calculated in vitro and in vivo chlorophyll a absorption bandshape, Biophysical Journal 82 (2002), 378-390.

127. D.B. Siano.D.E. Metzler, Band Shapes of the Electronic Spectra of Complex Molecules, J. Chem. Phys. 51 (1969), 1856-1861.

128. D. Green,J. Reed, Mitochondria and apoptosis, Science 281 (1998), 13091312.

129. S. Desager, A. Osen-Sand, A. Nicols, R. Eskes, S. Montessuit, K. Maundrell,i

130. B. Antonsson.J.C. Martinou, Bid-induced conformational change of Bax is responsible for mitochondrial cytochrome с release during apoptosis, J. Cell Biol. 144 (1999), 891-901.

131. P.E. Bernardi, Mitochondria in cell death, Biochimica et Biophysica Acta 1366 (1998), 1-234.

132. I. Martinou, S. Desagher, R. Eskes, B. Antonsson, E. Andre, S. Fakan.J.C. Martinou, The release of cytochrome с from mitochondria during apoptosis of NGF-deprived sympathetic neurons is a reversible event, J. Cell Biol. 144 (1999), 883-889.

133. A.E. Kuzminova, B.F. Krasnikov, N.S. Melik-Nubarov, A.V. Zhuravlyova, L.D. Zorova, N.K. Isaev, A.E. Prishepova, M.Y. Vyssokikh.D.B. Zorov, Interplay between polyanions and cytochrome с in mitochondria, Biophysical Journal 76 (1999), A270.

134. И.К. Михайлюк.А.П. Разживин, Способ вычитания низкочастотного фона из массивов (спектральных) данных биологического происхождения, in Депонировано в ВИНИТИ. 2000. р. 1-22.

135. И.К. Михайлюк,А.П. Разживин, Способ вычитания низкочастотного фона из двумерных массивов данных биологического происхождения, in Депонировано в ВИНИТИ. 2000. р. 1-18.

136. И.К. Михайлюк.А.П. Разживин, Вычитание фона в одномерных и двумерных массивах экспериментальных данных на примерах спектров комбинационного рассеяния и снимков флуоресцентного гель-электрофореза, Приборы и техника эксперимента 6 (2003), 43-47.

137. Г. ван де Хюлст, Рассеяние света малыми частицами. 1961, Москва: Издательство иностранной литературы. 537.

138. В.В. Тучин, Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях. 1998, Саратов: изд-во Саратовского ун-та. 384.

139. E. Hoffmann, P. Wrench, F. Sharpies, F. Hiller, W. Welte.K. Diederichs, Structural basis of light hervesting by carotenoids: peridinin-chlorophyll-protein from Amphidium carterae., Science 272 (1996), 1788-1791.

140. F.J. Kleima, Light-harvesting and excitation energy transfer in oxygenic photosynthesis. 1999, Virji University: Amsterdam.

141. A.C. Давыдов, Теория молекулярных экситонов. 1968, Москва: Наука.296.

142. М. Krikunova, В. Voigt,H. Lokstein, Direct evidence for exitonically coupled chlorophylls a and b in LHC II of higher plants by nonlinear polarization spectroscopy in the frequency domain, Biochimica et Biophysica Acta 1556 (2002), 1-5.

143. K. Sauer, J.R. Lindsay-Smith,A.J. Schultz, The Dimerization of Chlorophyll a, Chlorophyll b, and Bacteriochlorophyll in Solution, J. Am. Chem. Soc. 88 (1966), 26812688.

144. R. van Grondelle,V. Novoderezhkin, Dynamics of Exitation Transfer in the LH1 and LH2 Light-Harvesting Complexes of Photosynthetic Bacteria, Biochemistry 40 (2001), 15059-15068.

145. А.А. Москаленко, З.К. Махнева.З.А. Журавлева, Ю. Е. Ерохин, Некоторые спектральные характеристики пигмент-белковых комплексов из Thiorhodospira sibirica и их взаимодействия в мембранах, ДАН 382 (2002), 836-839.

146. D.M. Tiede, E. Kellog.J. Breton, Conformational changes following reduction of the bacteriopheophytin electron acceptor in reaction centers of Rhodopseudomonas viridis, Biochimica et Biophysica Acta 892 (1987), 294-302.

147. P.O.J. Scherer, S.F. Fischer, C.R.D. Lancaster, G. Fritzsch, S. Schmidt, T. Arlt, K. Dressier,W. Zinth, Time-resolved spectroscopy of the exited electron state of reaction centers of Rhodopseudomonas viridis, Chem. Phys. Letters 223 (1994), 110-115.

148. A.N. Glazer, J. Lundell, G. Yamanaka.R.C. Williams, The structure of a simple phycobilisome, Ann. Microbiol. 134 (1983), 159-180.

149. W. Reuter.C. Nickel-Reuter, Molecular assembly of the phycobilisomes from the cyanobacterium Mastigocladus laminosus, J. Photochem. Photobiol. 18 (1993), 51-66.

150. J. Grabowski.E. Gantt, Photophysical properties of phycobiliproteins from phycobilisomes: Fluorescence lifetimes, quantum yields, and polarization spectra, Photochem. Photobiol. 28 (1978), 39-45.

151. V.T. Oi, A.N. Glazer,L. Stryer, Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cell and molecules, J. Cell Biol. 93 (1982), 981-986.

152. M.N. Kronick.P.D. Grossman, Immunoassay techniques with fluorescent phycobiliprotein conjugates, Clin. Chem. 29 (1983), 1582-1586.

153. I.N. Stadnichuk, Phycobiliproteins: Determination of Chromophore Composition and Content, Phytochemical Analysis 6 (1995), 281-288.

154. K. Sauer, H. Scheer.P. Sauer, Forster transfer calculations based on crystal structure data from Agmenellum quadruplicatum c-phycocyanin, Photocem. Photobiol. 46 (1987), 427-440.

155. J.P. Thornber, D.T. Morishige, S. Anadan.G.F. Peter, in The Chlorophylls, H. Scheer, Editor. 1991, CRC Press, p. 549-586.

156. Н.И. Захарова,И. Чурбанова, Методы получения реакционных центров фотосинтетических пурпурных бактерий (обзор), Биохимия 65 (2000), 181-193.

Информация о работе

Михайлюк, Игорь Константинович
кандидата физико-математических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.02

Диссертация

Разработка и применение методов производной спектроскопии высокого порядка для выявления тонкой структуры оптических спектров фотосинтетических пигмент-белковых комплексов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы