Разработка и применение иммуноферментной тест-системы для обнаружения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови крупного рогатого скота

Яковлева, Анастасия Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка и применение иммуноферментной тест-системы для обнаружения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови крупного рогатого скота
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и применение иммуноферментной тест-системы для обнаружения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови крупного рогатого скота"

На правах рукописи

ЯКОВЛЕВА Анастасия Сергеевна

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ К НЕСТРУКТУРНЫМ БЕЛКАМ ВИРУСА ЯЩУРА В СЫВОРОТКАХ КРОВИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.00.06. «Вирусология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владимир-2005

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Научный руководитель - кандидат биологических наук

ЩЕРБАКОВ Алексей Владимирович

Официальные оппоненты:- РУСАЛЕЕВ Владимир Сергеевич, доктор

ветеринарных наук, профессор (ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных, г.Владимир); - ЦЫБАНОВ Содном Жамьянович, доктор биологических наук, профессор (ВНИИВВиМ, г. Покров)

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский и

технологический институт биологической промышленности (ВНИТИБП, г. Щелково)

Зашита диссертации состоится 2003 года в часов на

заседании диссертационного совета Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, п. Юрьевец.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Автореферат разослан

2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук, л _

старший научный сотрудник •<эйгС&^.егге-**' г.М. Семенова

т*зз9

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Яшур - высококонтагиозное вирусное заболевание парнокопытных, способное вызывать эпизоотии и наносить большой экономический ущерб. Для России постоянно существует опасность проникновения этой болезни из сопредельных азиатских государств, свидетельством чего являются вспышки ящура на территории РФ в 1995, 2000, 2004 и 2005г.г., вызванные заносом инфекции из Китая (A.B. Щербаков, 2002; J.F. Valarcher, 2005). В этой ситуации разработка и совершенствование средств и методов диагностики ящура напрямую связаны с проблемой обеспечения зоосанитарной и экономической безопасности страны.

Возбудитель ящура - безоболочечный РНК-содержащий вирус семейства Picomaviridae, рода Aphthovirus. Геном вируса кодирует четыре структурных и восемь неструктурных белков. Обе труппы белков вызывают выработку антител у жиьотных во время инфекции. Однако у вакцинированных животных обнаруживаются антитела, в основном, к структурным протеинам. Это объясняется тем, что при изготовлении вакцины проводится частичная очистка вируса, в процессе которой большинство неструктурных белков удаляется вместе с клеточным дебрисом (Clavijo, 2004).

Обнаружение антител к неструктурным белкам вируса ящура является важным инструментом контроля за заболеванием. Этот метод позволяет дифференцировать вакцинированных животных от реконвалесцентов и выявлять бессимптомных вирусоносителей среди вакцинированного поголовья. В связи с тем, что Россия применяет политику противоящурной вакцинации скота вдоль своих южных границ, наличие диагностических средств, позволяющих обнаруживать в вакцинированных стадах инфицированных животных, чрезвычайно актуально.

В настоящее время на мировом рынке ветеринарных диагностикумов представлено несколько коммерческих тест-систем для выявления антител к неструктурным белкам вируса ящура. Они основаны на использовании в качестве антигенов синтетических пептидов или рекомбинантных белков вируса ящура, экспрессированных в E.coii или в бакуловирусной системе. Однако отечественных

тест-систем до сих пор создано не было.

Цели и задачи исследования. Основная цель нашей работы заключалась в получении рекомбинантных антигенов и разработке на их основе иммуноферментной тест-системы, позволяющей выявлять антитела к неструктурным белкам вируса яшура.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести молекулярное клонирование и экспрессию в Е.соН генов неструктурных белков ЗА, ЗВ и ЗАВ вируса ящура;

- отработать условия экспрессии и очистки, обеспечивающие высокий выход рекомбинантных белков;

- исследовать антигенную активность и специфичность полученных белков;

- разработать на основе рекомбинантных белков ЗА, ЗВ и ЗАВ иммуноферментные тест-системы для определения антител к неструктурным белкам ВЯ и сравнить их по чувствительности и специфичности между собой и с коммерческими наборами;

- на основе наиболее чувствительной и специфичной тест-системы разработать диагностические наборы для выявления антител к неструктурным белкам вируса яшура в сыворотках крови крупного рогатого скота;

- оценить с помощью разработанных наборов отечественные противоящурные вакцины на способность индуцировать антитела к неструктурным белкам вируса ящура у животных;

- применить разработанные наборы в диагностических исследованиях. Научная новизна исследования. Впервые в России получены

рекомбинантные неструктурные белки ЗА, ЗВ и ЗАВ вируса ящура и на их основе разработаны иммуноферментные тест-системы для дифференциации вакцинированного и инфицированного КРС.

Показано, что ИФА на основе белка ЗА превосходит по диагностической чувствительности и специфичности ИФА на основе белков ЗВ и ЗАВ.

На основе ЗА-ИФА разработаны два отечественных диагностических набора для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках

крови КРС иммуноферментны.м метолом, позволяющие дифференцировать вакцинированный против ящура и инфицированный вирусом ящура КРС.

Практическая значимость исследований. В результате проведенных исследований были разработаны следующие методики:

«Методика определения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках КРС иммуноферментным методом», одобренная ученым советом и утвержденная директором Центра 30.09.04;

«Методика определения антител к неструктурным белкам вируса ящура иммуноферментным методом при тестировании сывороток крови КРС в одном разведении», одобренная ученым советом и утвержденная директором Центра 21.12.04.

На основе этих методик разработаны два диагностических набора; «Набор для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови КРС иммуноферментным методом», одобренный ученым советом и утвержденный директором Центра 30.09.04;

«Набор для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура иммуноферментным методом при тестировании сывороток крови КРС в одном разведению», одобренный ученым советом и утвержденный директором Центра 21.12.04.

Разработанные наборы используются для проведения серомониторинга ящура.

Публикации научных работ. По теме диссертации опубликовано три научных работы.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научной конференции «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных» в 2004 году, на заседаниях ученого совета в 2003-2005 гг. Основные положения, выносимые на защиту: Рекомбинантные антигены ЗА, ЗВ и ЗАВ вируса ящура. Иммуноферментные тест-системы на основе рекомбинантных белков ЗА, ЗВ и ЗАВ для выявления антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови КРС и результаты их сравнительных испытаний.

Диагностический набор для выявления антител к неструктурным белкам вируса яшура методом последовательного разведения сывороток крови КРС.

Диагностический набор для выявления антител к неструктурным белкам вируса ящура методом одного разведения сывороток крови КРС.

Результаты серомониторинга ящура с использованием разработанных диагностических наборов за 2004-2005гг.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 110 страницах, иллюстрирована 12 рисунками и 12 таблицами. Список используемой литературы включает 192 источника, из которых 171 иностранный.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.L Материалы и методы

Вирусы. В работе использовали штамм Ац 550 вируса ящура, полученный из коллекции вирусов ФГУ Федерального центра охраны здоровья животных.

Бактериальные штаммы. Для трансформации и экспрессии рекомбинантных плазмид использовался штамм М15 [pREP4] E.coli К12 (nal*, str*, rif, lac", ara', gal", mil'. F", recA+, uvr+, Ion4) pREP4 - kanr. Источник штамма - фирма «Qiagen».

Плазмиды. В качестве экспрессирующей конструкции использовали плазмиду pQE (фирма «Qiagen»).

Сыворотки. В качестве сывороток с заведомо известным статусом использовали 30 сывороток от клинически здорового КРС, невакцинированного против ВЯ, 20 сывороток от коров, вакцинированных против яшура (однократно вакцинированных моноваленпюй вакциной производства фирмы «Bayer» (Германия) или многократно вакцинированных бивалентной противоящурной вакциной производства ФГУ ВНИИЗЖ (отбирали на 14-120 дни после вакцинации), 108 сывороток, отобранных у КРС, экспериментально зараженного вирусом ящура разных серотипов (А, О, Азия), на 5-й и 7-й ДЛИ и 17 сывороток, отобранных у КРС, экспериментально зараженного вирусом ящура разных серотипов (А, О, С, Азия), на 21-й ДЛИ.

Кроме того, в работе исследовали полевые сыворотки от КРС из различных регионов РФ и Монголии.

Пероксндазнын конъюгат. В исследованиях использовали коммерческий пероксидазный конъюгат против иммуноглобулина IgG КРС, выпускаемый НИИЭМ имени Н.Ф. Гамалеи (г. Москва).

Выделение вирусной РНК из вируссодержащего материала и очистка продуктов ПЦР и вектора. Выделение вирусной РНК из вируссодержащего материала и очистку продуктов ПЦР и вектора для клонирования проводили по модифицированному методу Грибанова и соавт. (1997).

Расчет и синтез праймеров. Расчет праймеров проводили на основе нуклеотидной последовательности ВЯ Ац550, представленной в биоинформационной системе GenBank (Accession Х74812). Для амплификации и клонирования генов ЗА, ЗВ и ЗАВ ВЯ были рассчитаны следующие праймеры: 3AF 5'-GGATCCATTCCTTCCCAAAAGTC-3* 3AR 5'-AAGCmTCAGCTTGTGGTTG-3 ' 3BF 5'-GGATCCTACACCGGGCCACT 3BR 5'-AAGCTTCTCAGTGACAATCAA

Синтез праймеров осуществляла фирма «Синтол» (Москва).

ОТ-ПЦР. ОТ-ПЦР проводили в одной реакционной смеси. Реакционная смесь содержала 5 мкл 10* буфера для Pfu-полимеразы, 4мМ Mg2*, ОДмМ дНТФ, 5 ед. AMV-ревертазы, 2 ед. Plu ДНК-полимеразы, по 20 тюль праймеров, 10 мкл раствора вирусной РНК и воду до конечного объема 50 мкл. Реакцию проводили на ДНК-амплификаторе Minicycler РТС-100 (MJ Research, США). Программа включала 15 мин при 42°С (обратная транскрипция), 2 мин при 94"С (денатурация комплекса РНК-ДНК) и 35 циклов собственно ПЦР при следующем температурном режиме: 30 сек денатурации при 94"С, 30 сек отжига праймеров при 55°С и I мин элонгации при 72°С. Продукты реакции анализировали с помощью электорофореза в 0,8% агарозном геле, содержащем 0.001% бромистого этидия, 1фи силе тока 50 мА.

Молекулярное клонирование продуктов ПЦР. Продукты ПЦР очищали от компонентов реакционной смеси по методике, аналогичной выделению РНК. Реакции рестрикции и лигирования проводили в соответствии с рекомендациями фирм-изготовителей ферментов. Трансформацию и приготовление компетентных клеток E.coli проводили по методике Ханаана (1988). Культивирование E.coli

проводили в среде LB и на LB-arape при 37°С. Скрининг клонов, несущих рекомбинантные плазмнлы. проводили с помощью аналитического выделения плазмид и последующего рестрикиионного анализа. Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coii осуществляли методом щелочного лизиса по методу Бирнбойма и Доли, модифицированного Холодиловым Н.Г. (1990).

Нуклеотидное секвенирование. Секвенирование рекомбннантных плазмид проводили с использованием набора fmol DNA Cycle Sequencing System (Promega) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.

Экспрессия рекомбннантных белков. Экспрессию рекомбинантных белков проводили добавлением индуктора (Hl ш) в культуру клеток, достигшую логарифмической фазы роста.

Очистка рекомбинантных белков. Очистку рекомбинантных белков проводили с помощью металл-хелатной хроматографии. Осадок клеток E.coii обрабатывали лизирующим буфером, затем центрифугировали 5 мин при 12000 об мин. К надосадку добавляли Ni-NTA агарозу («Qiagen») и инкубировали при помешивании 15 мин. Сорбент дважды промывали лизирующим буфером. Белки переводили в раствор с помощью элюирующего буфера. Уровень экспрессии и степень очистки препарата белка оценивали с помощью электрофореза в ПААГе. Концентрацию белков определяли по Бредфорду (Дарбре, 1989).

Электрофорез белков в ПААГе. Электрофорез белков проводили по методу Лэммли (Гаапь, 1982).

Непрямой вариант ИФА детально описан в «Результатах собственных исследований».

Коммерческие диагностические наборы: в работе использовали наборы «Chekit FMD-3ABC» (Bommeli Diagnostics, Швейцария) и «Ceditest FMDV-NS ELISA» (Cedi-Diagnostics, Нидерланды). Постановку и интерпретацию результатов реакции проводили в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.

Статистическая обработка результатов. Определение среднего

арифметического (дг) при количестве опытов (п), среднего квадратичного отклонения (а) средней арифметической проводили согласно руководству И.В.Полякова (1975).

Для обработки данных ИФА использовали компьютерную программу Згатиса. с помощью которой рассчитывали значения параметров уравнения А. В и значение коэффициента корреляции Я.

Диагностическую чувствительность и специфичность вычисляли по формулам, рекомендованным Международным Эпизоотическим Бюро:

Дчув = (ИП / (ИП + ЛО))хЮО%;

Дспец = (ИО / (ИО + ЛП))х100%, где

ИП-истинноположительный рез> льтат, ЛО- ложноотрицательный результат,

ИО-истинноотрииательный результат, ЛП- ложноположительный результат.

При расчете Дчув сомнительные результаты учитывали как ложноотрицательные, а при расчете Дспец сомнительные результаты учитывали как ложноположительные.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Получение рекомбинантных неструктурных белков ЗА, ЗВ и ЗАВ вируса яшура, их экспрессия и очистка

Схема конструирования гпазмид, экспрессирующих рекомбинантные белки ВЯ показана на рис.1.

геном вируса яшура

5' Ур( —11 | 1А | 15 | 1С | 16 &>д| 2в| 2С| За| Зв| ЗС | ЗЩ— поли(А) 3 •

ВашН! НикПН

N. /

ЗА(ЗВ, ЗАВ)

ЗА (ЗВ,ЗАВ)

Рис. 1. Схема клонирования генов ЗА, ЗВ и ЗАВ вируса ящура в плазмиду р<2Е

Для получения рекомбинантных неструктурных белков был использован штамм А:: 550 вируса яшура. ДНК-кошш генов ЗА. ЗВ и ЗАВ вируса были пол\ чены метолом ОТ-ПЦР. При амплификации использовали праймеры, в стр\ ктуру которых были заложены сайты рестрикции ВашН! и HindIIl. Для амплификации гена ЗА применяли праймеры 3AF и 3AR. гена ЗВ - 3BF и 3BR, гена ЗАВ -3AF и 3BR. После обработки соответствуюшими рестрикгазами продукты ПЦР были встроены в экспрессирующую плазмиду pQE.

В результате трансформации иггамма М15 E.coli были получены клоны, экспрессируюшие рекомбинантные белки ЗА, ЗВ и ЗАВ вируса яшура. содержащие на N-конце шесть остатков гистидина. Молекулярная масса рекомбинантных белков соответствовала расчетной (рис.2). Из клонов, экспрессируюших белки ВЯ, были выделены рекомбинантные плазмиды и проверены методом нуклеотидного секвенирования на отсутствие нуклеотидных замен и сдвигов в рамке считывания, приводящих к изменению аминокислотного состава рекомбинантных белков.

кДа

40,0 -31,0 — 21,5 -14,4-

Рис. 2. Электрофоретический анализ белков в 12%-ном

полиакриламидном геле:

М - маркер молекулярного веса белков (кДа); 1,4,7 - лизат Е.соП до индукции;

2, 5,8 - экспрессия рекомбинантных белков ЗА. ЗВ и ЗАВ, соответственно:

3, б, 9 - очищенные рекомбинантные белки ЗА. ЗВ и ЗАВ. соответственно.

С целью повышения уровня накопления рекомбинантных белков в клетках Е.соН были проведены эксперименты по оптимизации условий экспрессии.

Оптимизацию проводили по двум параметрам: концентрации индуктора и времени экспрессии.

Влияние концентрации индуктора на уровень экспрессии изучали в диапазоне от 0,01 до 2мМ. Накопление рекомбинантных белков В Я достигало максимума при концентрации 1РТС 0.2мМ и при дальнейшем повышении концентрации индуктора не менялось.

Для исследования кинетики экспрессии белков аликвоты культуры отбирали через 0,25; 0,5; 1; 2; 4 и 18 часов после индукшш и анализировали в ПААГе. Было обнаружено, что все белки являются относительно стабильными, поскольку даже после 18 часов экспресс™ не наблюдалось их протеолпза. Электрофореграмма показала, что накопление белков ЗВ и ЗАВ достигало максимума через 4 часа посте индукции и далее не менялось. Максимальный уровень накопления белка ЗА наблюдался после 18 часов индукции. Через 4 часа посте внесения индуктора количество белка ЗА в клетках было лишь незначительно меньше, чем через 18 часов, поэтому 4 часа было принято за достаточное время экспрессии для всех белков, и все последующие эксперименты проводились именно с таким временным режимом.

Следующий этап исследований заключался в отработке условий очистки и концентрирования рекомбинантных белков ВЯ. Все три рекомбинантных белка накапливались в клетках в нерастворимой форме, поэтому их очистку проводили в денатурирующих условиях. При использовании в качестве денатурирующего агента 8М мочевины в раствор переходила лишь незначительная часть рекомбинантных белков, большая же часть их при центрифугировании выпадала в осадок с клеточным дебрисом. С помощью 6М гуанидинхлорида белок ЗВ удалось перевести в растворимое состояние полностью, белки ЗА и ЗАВ растворялись в гуанидинхлориде значительно лучше, чем в мочевине. В связи с этим. 6М гуанидинхлорид был включен в состав буфера для лизиса клеток и промывки.

Очистку растворенных рекомбинантных белков проводили методом металл-хелатной хроматографии с применением МьЭТА агарозы («(^¡аееп»). Условия элюции рекомбинантных белков, рекомендуемые фирмой-изготовителем сорбента, оказались непригодными, поскольку все три белка не снимались с сорбента при использовании стандартных условий: низких значений рН или 0,2М имидазола.

Лишь при повышении концентрации имидаюла в элюнруюшем буфере до 0,4М \далось добиться элюшш большей части каждого из белков. Но даже в этих жестких условиях значительное количество белков ЗВ и ЗАВ оставалось связанным с сорбентом. Вероятно, поэтому конечная концентрация очищенных препаратов рекомбинантных белков сильно различалась, несмотря на примерно одинаковый уровень их экспрессии. Выход очищенного протеина со 100 мл культуры Е.соН составлял 5 мг для ЗА. 1 мг для ЗВ и 1,5 мг для ЗАВ.

2.2.2. Исследование антигенной активности и специфичности рекомбинантных белков ЗА, ЗВ и ЗАВ.

Очищенные препараты рекомбинантных белков использовали для изучения их антигенной активности и специфичности.

| м

\ 1 а

V и

X 0.9

—ж--ж

84 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0,0625

Концентрация антигена (мкг/мл)

■ ЗА (сыв.положпт) -Ж—ЗА (сыв-отрицат.)

—а— - ЗВ (сыв.пажккпт.) —•—ЗВ (сыв-отрипат.)

*ЗАВ (сывлоложят.) -ЗАВ (сы&ятрицат.)

Рис. 3. Антигенная активность белков ЗА, ЗВ и ЗАВ в непрямом варианте ИФА с контрольными сыворотками

Активность белков проверяли в непрямом варианте ИФА с референтными сыворотками КРС. В качестве положительного контроля использовали сыворотку реконвалесцентов в разведении 1:100. в качестве отрицательного - нормальную сыворотку КРС в разведении 1:100. Результаты проверю! антигенной активности рекомбинантных белков отражены в графической форме на рис 3.

Все три белка обладали специфической антигенной активностью, однако минимальные концентрации белков, при которых ОП положительной сыворотки в 2 раза превышала ОП отрицательной сыворотки, были различными и составляли 0,25 мкг/мл для белка ЗА, 2.2 мкг/мл для ЗВ и 0.7 мкг/мл для ЗАВ. Это соотвествует разведениям 1:32000 хтя ЗА. 1:800 для ЗВ и 1:3200 для ЗАВ.

Антигенную специфичность рекомбинантных белков проверяли в непрямом варианте ИФА с сыворотками крови КРС, содержащих антитела к вирусам лейкоза, парагриппа, инфекционного ринотрахеита и коронавирусу КРС. Активность всех трех белков с гетерологнчными сыворотками не превышала фоновый уровень, полученный в реакции с неиммунной сывороткой.

2.2.3. Разработка непрямого варианта ИФА

Разработка непрямого варианта ИФА на основе полученных рекомбинантных антигенов заключалась в определении рабочих концентраций антигенов и конъюгата. оптимального состава блокирующего раствора, а также в оценке воспроизводимости результатов ИФА и определении позитивно-негативного порога реакции.

Рабочую концентрацию антигенов и конъюгата анти-Г^ КРС с пероксидазой определяли шахматным титрованием с использованием положительной и отрицательной контрольных сывороток в разведениях 1:100. Было установлено, что оптимальная сенсибилизирующая концентрация для всех трех рекомбинантных антигенов приблизительно одинакова и составляет 4-8 мкг/мл. Увеличение концентрации антигена свыше 8 мкг/мл приводило к повышению оптической плотности в отрицательном контроле, значительно увеличивало расход антигена и оказалось экономически неоправданным. Таким образом, рабочее разведение белков составило 1:1000 для ЗА, 1:400 для ЗВ и ЗАВ. Рабочее разведение конъюгата анти-1§0 КРС с пероксидазой составляло 1:500.

При выборе блокирующего раствора использовали 1-10%-ный дрожжевой экстракт, 1-10%-ное обезжиренное молоко. 1-10%-ную сыворотку лошади и 1-10%-ную сыворотку кролика, приготовленные на основе буфера ТБСТ. Для постановки реакций использовали положительные и отрицательные сыворотки КРС в разведениях 1:100. В каждом случае рассчитывали среднее отношение оптической плотности положительной сыворотки (Б) к оптической плотности отрицательной

сыворотки (N). Наибольшее значение S/N получили в случае с 10%-ной лошадиной сывороткой.

Коэффициент вариации при постановке реакции на одном планшете составил 4,7%. при постановке реакции в разное время на 10 разных планшетах -6,4%. что указывает на хорошую воспроизводимость результатов.

Для определения позитивно-негативного порога в непрямом варианте ИФА было исследовано в трёх повторностях 80 сывороток с различным уровнем антител. Титр антител к неструктурным белкам ВЯ в сыворотках крови от невакцинированного, однократно- и многократно вакцинированного против ВЯ КРС. а также в гетерологичных сыворотках не превышал 1:200, а уровень антител в сыворотках КРС - реконвалесценгов был 1:800 и выше. В качестве позшивно-негативного порога был выбран титр антител сыворотки 1:400; сыворотки с титром, меньшим 1:400 считали отрицательными; сыворотки с титром антител 1:800 и более - положительными, сыворотки с титром 1:400 - сомнительными.

2.2.4. Сравнение тест-систем на основе ЗА-, ЗВ- и ЗАВ-антнгенов

В трех тест-системах, именуемых далее как ЗА-, ЗВ- и ЗАВ-ИФА, исследовали четыре группы сывороток: сыворотки от невакцинированного против ящура КРС, сыворотки от однократно и многократно вакцинированных коров и сыворотки от экспериментально заражённых вирусом ящура животных, взятые на 5-й, 7-й и 21-й дни после инфицирования (группы 5ДЛИ, 7ДПИ, 21ДПИ). Результаты исследования отражены в табл.1. Данные результаты были использованы для определения диагностической специфичности и чувствительности разработанных тест-систем.

По результатам тестирования 59 заведомо отрицательных сывороток специфичность составляла 100% для «Chekit FMD-3ABC» и 94,92% для ЗА-ИФА. Для ЗВ- и ЗАВ-ИФА она равнялась 91,53% и 89.83% соответственно.

Для оценки чувствительности тест-систем исследовали около 100 проб сывороток от экспериментально зараженных ВЯ животных. 74 из которых были взяты на 7-й ДЛИ и 17 на 21-й ДЛИ.

Чувствительность всех четырех тест-систем при тестировании сывороток группы 21 ДЛИ составляла 100%. При исследовании сывороток группы 7ДПИ

значения диагностической чувствнтельносш были значительно ниже: 77,03% для ЗА-ИФА. 71,62% для ЗВ- и ЗАВ-ИФА и только 17.57% для «СЬекп ИМО-ЗАВС».

Таблица 1

Результаты исследования сывороток КРС в различных тест-системах

Статус животного | ЗА-ИФА 1 ЗВ-ИФА ЗАВ-ИФА СЬекН РМБ-ЗАВС

Здоровые (30 сывороток) отр.-29 СОМН.-1 отр.-29 СОМН.-1 отр.-28 сомн.-2 отр.-ЗО

Однократно и многократно вакцинированные (29 сывороток) отр.-27 сомн.-2 отр.-26 сомн.-2 ПОЛ.-1 отр.-25 сомн.-З ПОЛ.-1 отр.-29

Экспериментально заражённые ВЯ, 5ДЛИ (34 сыворотки) отр.-34 отр.-34 отр.-34 отр.-34

Экспериментально заражённые ВЯ, 7ДПИ (74 сыворотки) ПОЛ.-57 СОМН.-11 отр.-б пол.-53 сомн.-18 отр.-З пол.-53 сомн.-8 отр.-13 пол.-13 сомн.-10 отр.-51

Экспериментально заражённые ВЯ, 21ДПИ (17 сывороток) пол.-17 пол.-17 пол.-17 пол.-17

Несмотря на то, что некоторые исследователи сообщали о возможности обнаружения антител к неструктурным белкам ВЯ уже на 6-й день после заражения (С1ауцо и соавт., 2004), существующие на сегодняшний день коммерческие тест-системы не предназначены для выявления антител в такие ранние сроки. По описанию разработчиков, набор «СЬекИ РМБ-ЗАВС» позволяет уверенно выявлять антитела к ВЯ. начиная с 10-14 ДЛИ. То обстоятельство, что с помощью ЗА-, ЗВ- и ЗАВ-ИФА антитела к ВЯ выявляли в большинстве сывороток группы 7ДЛИ, свидетельствует о высокой чувствительности разработанных нами тест-систем.

Таким образом, результаты сравнительного исследования показали, что все три разработанные тест-системы (ЗА-, ЗВ- и ЗАВ-ИФА) пригодны для дифференциации вакцинированного и инфицированного вирусом КРС, однако лучшие показатели диагностической специфичности и чл вствительности были присущи ЗА-ИФА. «Методика определения анпггел к неструктурным белкам

присущи ЗА-ИФА. «Методика определения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови КРС иммуноферментным методом», разработанная на основе ЗА-ИФА. прошла комиссионные испытания, была одобрена ученым советом и утверждена директором ФГУ ВНИИЗЖ.

2.2.5. Разработка диагностического набора для определения антител к неструктурным белкам вируса яшура в сыворотках крови КРС

На основе ЗА-ИФА. как наиболее специфичной и чувствительной тест-системы, был разработан диагностический набор для определения антител к неструктурным белкам вируса яшура в сыворотках крови КРС. Данная работа включала в себя отработку технологических вопросов изготовления биологических и химических компонентов набора, а также комиссионные испытания опытных серий набора.

Одним из этапов работы было исследование стабильности биологических компонентов набора. Срок хранения планшетов с рекомбинантным белком составил не менее 1 года. Для консервации контрольных сывороток крови и антивидового конъюгата добавляли азид натрия до конечной концентрации 0,05%. Данные компоненты набора хранили при температуре 4°С в течение года. Активность этих компонентов не уменьшалась, что указывает на возможность использования данных условий консервации при изготовлении набора.

В окончательном варианте набор включал необходимые биологические компоненты и химические реагенты, рассчитанные на диагностические исследования в ИФА 50 сывороток крови КРС.

В декабре 2004 года «Набор для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови КРС иммуноферментным методом» прошел комиссионные испытания в Центре и утвержден директором ФГУ ВНИИЗЖ. В феврале 2005 года были успешно проведены межведомственные комиссионные испытания разработанного набора.

2.2.6. Разработка непрямого варианта ИФА для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура по одному разведению сывороток крови

КРС

Описанная в разделах 2.2.3. и 2.2.5. тест-система позволяет дифференцировать вакцинированных и инфицированных ВЯ животных в

каждой сыворотки делается восемь последовательных разведений. Такой метод удобен тем. что позволяет проводить визуальную оценку результатов реакции, что важно при использовании набора в условиях диагностических лабораторий, не оснащенных приборами для учета результатов ИФА. Однако для массовых серологических исследований более предпочтительным является метод определения антител по одному разведению сыворотки, так как он позволяет значительно сократить объем работы и стоимость анализа каждой сыворотки.

В связи с этим, были проведены исследования по разработке иммуноферментного метода для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура по одному разведению сыворотки крови КРС. Метод разрабатывался на основе рекомбинангного антигена ЗА.

Выбор оптимального рабочего разведения сывороток. На первом этапе определяли оптимальное рабочее разведение сывороток. Зависимость между величиной S/P и значением титра сыворотки выражалась формулой:

In Т = А + В х In S/P, где А, В - коэффициенты реакции, установленные опытным путем.

В непрямом варианте ИФА при тестировании сывороток метолом последовательных разведений определяли значения оптической плотности 107 сывороток с различным уровнем антител к неструктурным белкам вируса ящура в четырех различных разведениях: 1:100,1:200,1:400 и 1:800.

Для каждого разведения сывороток определяли величину (S/P) по формуле:

S/P = (ОП - NCJ/(PC, - NCJ, где

ОП - средняя оптическая плотность исследуемой сыворотки;

NC, - средняя оптическая плотность отрицательной контрольной сыворотки;

PC, - средняя оптическая плотность положительной контрольной сыворотки.

Затем рассчитывали In S/P и In Т для каждого разведения. Полученные данные обрабатывали с помощью компьютерной программы Statistica. В результате были определены коэффициент корреляции, значения А и В. стандартная ошибка. Наибольший коэффициент корреляции R=0,89782 при наименьшей стандартной ошибке 0,36560 получили при разведении сывороток 1:400. В связи с этим данное разведение было выбрано в качестве рабочего.

Определение допустимых величии оптической плотности контрольных сывороток. Диапазоны оптических плотностей контрольных сывороток определяли как среднее значение ОП контрольных сывороток, тестированных в 18 повторностях с учетом стандартного отклонения.

Согласно полученным результатам, допустимые значения ОП контрольных сывороток должны находится в пределах 0,068-0,088 для отрицательного контроля и 0,646-0,906 для положительного контроля.

Для учета результатов реакции рассчитывали процент позитивности по формуле:

ПП = ((ОП - ¡ЧСЖУ(РСХ- ^„»хМО0/«., где

ОП - средняя оптическая плотность исследуемой сыворотки;

N0, - средняя оптическая плотность отрицательной контрольной сыворотки;

РС, - средняя оптическая плотность положительной контрольной сыворотки.

Определение позитивно - негативного порога реакция непрямого варианта ИФА. Для определения позитивно-негативного порога реакции исследовали 99 заведомо отрицательных сывороток крови КРС. ПНП определяли, вычисляя средние значения оптической плотности отрицательных сывороток, прибавляя три значения среднего квадратичного отклонения (для расчета верхней границы ПНП) и два значения среднего квадратичного отклонения (дня расчета нижней границы ПНП). В качестве положительного и отрицательного контролей были использованы стандартные контрольные сыворотки.

Среднее значение оптической плотности отрицательных сывороток, суммированное с утроенным и с удвоенным значениями среднего квадратичного отклонения, составило 0,250 и 0,210 соответственно. Нижняя граница ПНП соответствовала проценту позитивности, равному 20%, верхняя граница ПНП соответствовала проценту позитивности, равному 25%. Таким образом, сыворотки с процентом позитивности в пределах 0-20% считались отрицательными, 20-25% -сомнительными, от 25% и выше - положительными.

В результате проведенной работы была разработана «Методика определения антител к неструктурным белкам вируса ящура иммуноферментным методом при тестировании сывороток крови КРС в одном разведении». Методика прошла комиссионные испытания и утверждена директором ФГУ ВНИИЗЖ.

Определение диагностической чувствительности и специфичности тест-сиаемы. С использованием разработанной тест-системы была исследована панель

из 150 референтных сывороток. Результаты исследований представлены в таблице 2.

С учетом полученных результатов был произведен расчет диагностической чувствительности и специфичности тест-системы. Специфичность составила 98,31%, чувствительность - 75,68% и 100% при исследовании сывороток групп 7ДПИ и 21 ДЛИ. соответственно.

Таблица 2

Диагностическая чувствительность и специфичность ЗА-ИФА при тестировании сывороток крови КРС в одном разведении

Статус животного Результаты исследований Дспец, % Дчув, %

Здоровые невакпинированные (30 сывороток) отр. - 30 98,3

Однократно и многократно вакцинированные (29 сывороток) отр.-28 сомн. -1

Экспериментально заражённые ВЯ, 7 ДЛИ (74 сыворотки) пол. - 56 сомн. -12 отр.-6 — 75,7

Экспериментально заражённые ВЯ, 21 ДЛИ (17 сывороток) пол -17 — 100

2.2.7. Разработка набора для определения антител к неструктурным белкам вируса яшура по одному разведению сыворотки крови КРС в непрямом

варианте ИФА

На основе метода определения антител к неструктурным белкам вируса ящура по одному разведению сывороток крови КРС был разработан диагностический набор.

В декабре 2004 года набор прошел комиссионные испытания в Центре и утвержден директором ФГУ ВНИИЗЖ. В феврале 2005 года были проведены межведомственные комиссионные испытания разработанного набора.

2.2.8. Использование наборов в серологических исследованиях

В 2005 г. набор для определения антител к неструктурным белкам ВЯ по одному разведению сывороток крови КРС был использован в диагностических исследованиях. В соответствии с программой мониторинга ящура в декабре 2004 года в А.м\ рекой области. Еврейской АО, Хабаровском и Приморском краях было отобрано для исследований окаю 2000 сывороток крови КРС и овец. С использованием ЗА-ИФА было исследовано 1607 сывороток крови от вакцинированного и неваюшнированного против ящура КРС. Все сыворотки параллельно исследовались в лаборатории ящура и везикулярных болезней ФГУ ВНИИЗЖ с использованием коммерческой тест-системы «Chekit FMD-3ABC». Результаты исследования представлены в табл.3.

Таблица 3

Результаты исследований полевых сывороток крови КРС с использованием

разработанного набора (ЗА-ИФА) и коммерческого набора «Chekit FMD-3ABC»

ЗА-ИФА Chekit FMD-3 ABC

Вакцинированные животные Отрицательные результаты Положительные результаты 1231 8 1231 8

Девакцинированные клинически здоровые животные Отрицательные результаты Положительные результаты 368 0 365 3

Как видно из таблицы, в каждой тест-системе по 8 сывороток от вакцинированного КРС имели положительный результат, причем сыворотки, положительные в ЗА-ИФА, были отрицательными в «СИек^ ШЛ-ЗАВС» и наоборот. Это обстоятельство, а также то, что положительные сыворотки были от животных из разных стад, позволило классифицировать эти результаты как ложноположительные.

При исследовании 368 сывороток от невакцинированного клинически здорового КРС в разработанной нами тест-системе не было ни одного ложиоположительного результата, тогда как в наборе СЬекк три сыворотки были ложиоположительными.

Таким образом, в ходе серомониторинга разработанный набор подтвердил свою высокую специфичность.

Таблица 4

Результаты исследований сывороток от КРС из частного сектора Амурской

области

Номер Результаты исследований

сыворотки ЗА-ИФА Ceditest Chekit FMD- , РМН

(ПП,%) FMDV-NS-ELISA (ПИ,%) ЗАВС ; i 1 1

1 5,5 н/и отриц. 1 отрип.

2 17,7 25,7 отриц. 1 отрип.

3 3,3 13,7 отриц. | отриц.

4 46,9 79,5 сомнит. 1 положит.

5 2,9 н/и отриц. | отриц.

6 2,2 н/и отриц. | отриц.

7 0,4 н/и отриц. I отриц.

8 38,2 71,38 отриц. | положит.

Примечание: н/и-не исследовали;

результат ПП в ЗА-ИФА - >25% - положительный; <20% - отрицательный: 20-25% - сомнительный;

результат ПИ в Ceditest - >50% - положительный; <50% - отрицательный.

Летом 2005 г. в Амурской области, Хабаровском и Приморском краях РФ, а также в Монголии были зарегистрированы вспышки ящура типа Азия-1. Набор ЗА-ИФА был использован для выявления животных, инфицированных ВЯ.

В таблице 4 отражены результаты исследований сывороток от коров из с. Коспоковка Свободненского района Амурской области. Наличие антител к неструктурным белкам ВЯ определяли с использованием трех диагностических тест-систем: нашего набора (ЗА-ИФА), «Chekit FMD-3ABC» и «Ceditest FMDV-NS ELISA». Вируснейтрализующие антитела к ВЯ типа Азия-1 определяли в реакции микронейтрализации. Исследования в тест-системе Chekit и РМН проводились в лаборатории ящура и везикулярных болезней ФГУ ВНИИЗЖ.

Как видно из таблицы 4, с помощью наборов ЗА-ИФА и «Ceditest FMDV-NS ELISA» у двух коров из 8 были обнаружены антитела к неструктурным белкам ВЯ. У этих же животных в РМН были выявлены вируснейтрализующие анпгтела к ВЯ типа Азия-1 (против данного типа ВЯ животные не вакцинировались). В наборе «Chekit FMD-3ABC» сыворотка №4 показала сомнительный результат, а сыворотка №8 - отрицательный.

При анализе сывороток крови КРС из Хабаровского края и Монголии использовали разработанный нами набор и «Ceditest FMDV-NS ELISA». Результаты представлены в табл.5. В обеих тест-системах положительными были все сыворотки от КРС из села Видное Хабаровского края и 2 из 10 сывороток из Монголии.

Таблица 5

Результаты исследований сывороток КРС из Хабаровского края и Монголии в ЗА-ИФА и «Ceditest FMDV-NS ELISA» _

Регион Результаты исследований а

ЗА-ИФА Ceditest FMDV-NS ELISA

Хабаровский край, Вяземский р-н, с.Видное (7 сывороток) пол. - 7 пал. - 7

Хабаровский край, Бакинский р-н, ГУ СП «Лермонтовское» (б сывороток) отр. -6 отр.-6

Хабаровский край, Бпкинский р-н, ГУСП «Лончаково» (14 сывороток) отр. -14 отр. -14

Хабаровский край, Бикинский р-н, отд. Д/Восток (б сывороток) отр. -6 отр.-6

Монголия, Восточный аймак (10 сывороток) отр.-8 пол.-2 (№3,4) отр.-8 пол.-2 (№3,4)

Таким образом, использование разработанного набора в исследованиях полевых сывороток подтвердило его высокую специфичность и чувствительность, продемонстрированную на стадии его разработки на панели референтных сывороток.

Результаты сравнения с коммерческими тест-системами свидетельствуют о том. разработанные диагностические наборы превосходят по чувствительности тест-систему «Chekit FMD-3ABC» и сравнимы по этому показателю с тест-системой «Ceditest FMDV-NS ELISA».

Проведенные исследования позволили сделать еще один важный вывод: российские противоящурные вакцинные препараты с ответствуют требованиям МЭБ по отсутствию в вакцинах неструктурных белков ВЯ. Результаты исследований более 1200 сывороток крови КРС, вакцинированного против ящура, свидетельствуют о том, что вакцины производства ФГУ ВНИИЗЖ и Щелковского биокомбината не вызывают у животных выработки антител к неструктурным белкам ВЯ на уровне, детектируемом современными тест-системами.

Таким образом, полученные в ходе исследований результаты свидетельствуют о том, что разработанные наборы могут использоваться в качестве диагностического теста, позволяющего выявлять инфицированный вирусом ящура КРС, дифференцировать инфицированных и вакцинированных животных, а также осуществлять контроль выпускаемых противоящурных вакцин на соответствие требованию МЭБ по отсутствию в них неструктурных белков ВЯ.

3. ВЫВОДЫ

1. Проведено молекулярное клонирование и экспрессия в E.coli генов ЗА, ЗВ и ЗАВ вируса ящура. Определены условия экспрессии и очистки, обеспечивающие высокий выход рекомбинантных белков;

2. На основе полученных рекомбинантных антигенов разработан непрямой вариант ИФА для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови КРС;

3. Проведен сравнительный анализ диагностической чувствительности и специфичности ИФА на основе белков ЗА, ЗВ и ЗАВ. Установлено, что ЗА-ИФА обладает лучшими показателями диагностической чувствительности и специфичности и позволяет наиболее достоверно дифференцировать инфицированных и вакцинированных животных;

4. На основе ЗА-ИФА разработан набор для определения анпгтел к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови КРС методом последовательных разведений;

5. На основе рекомбинантного белка ЗА разработан иммуноферментный метод и диагностический набор для определения антител к неструктурным белкам вируса яшура по одному разведению сывороток крови КРС;

6. Результаты сравнения с зарубежными аналогами показали, что разработанные наборы превосходят по чувствительности тест-систему «Chekit FMD-3ABC» (Bommeli Diagnostics, Швейцария) и сравнимы с тест-системой «Ceditest FMDV-NS ELISA» (Cedí Diagnostics, Нидерланды);

7. С использованием разработанных наборов исследовано более 1200 сывороток крови КРС, вакцинированного против яшура. Установлено, что противояшурные вакцины производства ФГУ ВНИИЗЖ и ФГУП «Щелковский биокомбинат» не вызывают у животных выработку антател к неструктурным белкам вируса ящура и соответствуют по этому показателю требованиям МЭБ.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕД ЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагаются:

«Методика определения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках КРС иммуноферментным методом»;

«Методика определения анптгел к неструктурным белкам вируса ящура иммуноферментным методом при тестировании сывороток крови КРС в одном разведении»;

«Набор для определения антител к неструктурным белкам вируса яшура в сыворотках крови КРС иммуноферментным методом»;

«Набор для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура иммуноферментным методом при тестировании сывороток крови КРС в одном разведении».

Разработанные наборы используются для проведения серомониторинга ящура.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Использование рекомбинантных белков ЗА, ЗВ и ЗАВ вируса ящура в непрямом варианте ИФА для дифференциации инфицированного и вакцинированного крупного рогатого скота / A.C. Яковлева, A.B. Каныпина, A.B. Щербаков. Н.С. Мудрак, Т.А. Фомина // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2005. - Т.З. - С.115-126.

2. Получение рекомбинантного неструктурного ЗА белка вируса ящура и его использование для дифференциации постинфекционных и поствакцинальных антител в непрямом варианте ИФА / С.Н. Фомина, A.C. Яковлева, АЛ. Щербаков, Т.А. Фомина, Н.Е. Камалова // Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных: материалы Междунар. науч. конф. молодых ученых, 24-26 марта 2004 года. -Владимир, 2004. - С.67-69.

3. Яковлева, A.C. Экспрессия в E.coli рекомбинантных белков ЗА, ЗВ и ЗАВ вируса ящура / A.C. Яковлева, A.B. Каныпина, A.B. Щербаков // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2005. - Т.З. -С.105-114.

Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Тираж 90 экз., 2005г.

»23233

РЫБ Русский фонд

2006-4 26152

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Яковлева, Анастасия Сергеевна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Структурная организация капсида ВЯ.

2.2. Структурно-функциональная организация генома ВЯ.

2.3. Патогенез]ящура.

2.4. Вакцинопрофилактика.

2.5. Серодиагностика ящура.

2.5.1. Выявление и типирование вируса.

2.5.2. Дифференциация постинфекционных и поствакцинальных антител.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и применение иммуноферментной тест-системы для обнаружения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови крупного рогатого скота"

Актуальность темы. Ящур - высококонтагиозное вирусное заболевание парнокопытных, способное вызывать эпизоотии и наносить большой экономический ущерб. Для России постоянно существует опасность проникновения этой болезни из сопредельных азиатских государств, свидетельством чего являются вспышки ящура на территории РФ в 1995, 2000, 2004 и 2005г.г., вызванные заносом инфекции из Китая (20, 153). В этой ситуации разработка и совершенствование средств и методов диагностики ящура напрямую связаны с проблемой обеспечения зоосанитарной и экономической безопасности страны.

Возбудитель ящура - безоболочечный РНК-содержащий вирус семейства Picornaviridae, рода Aphthovirus. Геном вируса кодирует четыре структурных и восемь неструктурных белков. Обе группы белков вызывают выработку антител у животных во время инфекции. Однако у вакцинированных животных обнаруживаются антитела, в основном, к структурным протеинам. Это объясняется тем, что при изготовлении вакцины проводится частичная очистка вируса, в процессе которой большинство неструктурных белков удаляется вместе с клеточным дебрисом (40).

Обнаружение антител к неструктурным белкам вируса ящура является важным инструментом контроля за заболеванием. Этот метод позволяет дифференцировать вакцинированных животных от реконвалесцентов и выявлять бессимптомных вирусоносителей среди вакцинированного поголовья. В связи с тем, что Россия проводит политику противоящурной вакцинации скота вдоль своих южных границ, наличие диагностических средств, позволяющих обнаруживать в вакцинированных стадах инфицированных животных, чрезвычайно актуально.

В настоящее время на мировом рынке ветеринарных диагностикумов представлено несколько иностранных коммерческих тест-систем для выявления антител к неструктурным белкам вируса ящура. Они основаны на использовании в качестве антигенов синтетических пептидов или рекомбинантных белков вируса ящура, экспрессированных в E.coli или в бакуловирусной системе. Однако отечественных тест-систем до сих пор создано не было.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести молекулярное клонирование и экспрессию в E.coli генов неструктурных белков ЗА, ЗВ и ЗАВ вируса ящура;

- отработать условия экспрессии и очистки, обеспечивающие высокий выход рекомбинантных белков;

- исследовать антигенную активность и специфичность полученных белков;

- разработать на основе рекомбинантных белков ЗА, ЗВ и ЗАВ иммуноферментные тест-системы для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура и сравнить их по чувствительности и специфичности между собой и с коммерческими наборами;

- на основе наиболее чувствительной и специфичной тест-системы разработать диагностические наборы для выявления антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови крупного рогатого скота;

- применить разработанные наборы в диагностических исследованиях. Научная новизна исследования. Впервые в России получены рекомбинантные неструктурные белки ЗА, ЗВ и ЗАВ вируса ящура и на их основе разработаны иммуноферментные тест-системы для дифференциации вакцинированного и инфицированного КРС.

На основе ЗА-ИФА разработаны два отечественных диагностических набора для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови КРС иммуноферментным методом, позволяющие дифференцировать вакцинированный против ящура и инфицированный вирусом ящура КРС.

Методика определения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках КРС иммуноферментным методом», одобренная ученым советом и утвержденная директором Центра 30.09.04;

Методика определения антител к неструктурным белкам вируса ящура иммуноферментным методом при тестировании сывороток крови КРС в одном разведении», одобренная ученым советом и утвержденная директором Центра 21.12.04.

На основе этих методик разработаны два диагностических набора: «Набор для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови КРС иммуноферментным методом», одобренный ученым советом и утвержденный директором Центра 30.09.04;

Набор для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура иммуноферментным методом при тестировании сывороток крови КРС в одном разведении», одобренный ученым советом и утвержденный директором Центра 21.12.04.

Публикации научных работ. По теме диссертации опубликовано три научных работы.

Основные положения, выносимые на защиту.

Рекомбинантные антигены ЗА, ЗВ и ЗАВ вируса ящура.

Иммуноферментные тест-системы на основе рекомбинантных белков ЗА, ЗВ и ЗАВ для выявления антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови КРС и результаты их сравнительных испытаний.

Диагностический набор для выявления антител к неструктурным белкам вируса ящура методом последовательного разведения сывороток крови КРС.

Результаты серомониторинга ящура с использованием разработанных диагностических наборов за 2004-2005гг.

Структура и объем работы. Диссертация изложена 110 на страницах, иллюстрирована 12 рисунками и 12 таблицами. Список используемой литературы включает 192 источника, из которых 171 иностранный.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 2002-2005гг. в Федеральном центре охраны здоровья животных (ФГУ ВНИИЗЖ, г. Владимир).

Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю к.б.н. А.В. Щербакову и сотрудникам института: д.в.н. B.JI. Узюмову, к.в.н. А.В. Каньшиной, С.Р. Кременчугской, к.б.н. Н.С. Мудрак, вед. биологу Н.В. Вавиловой, вед. вет. врачу Фоминой С.Н. - за практическую помощь в выполнении отдельных этапов работы и оформлении диссертации.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Яковлева, Анастасия Сергеевна

5. ВЫВОДЫ

4. На основе ЗА-ИФА разработан набор для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови КРС методом последовательных разведений.

5. На основе рекомбинантного белка ЗА разработан иммуноферментный метод и диагностический набор для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура по одному разведению сывороток крови КРС;

6. Результаты сравнения с зарубежными аналогами показали, что разработанные наборы превосходят по чувствительности тест-систему «Chekit FMD-ЗАВС» (Bommeli Diagnostics, Щвейцария) и сравнимы с тест-системой «Ceditest FMDV-NS ELISA» (Cedi Diagnostics, Нидерланды);

7. С использованием разработанных наборов исследовано более 1200 сывороток крови КРС, вакцинированного против ящура. Установлено, что противоящурные вакцины производства ФГУ ВНИИЗЖ и ФГУП «Щелковский биокомбинат» не вызывают у животных выработку антител к неструктурным белкам вируса ящура и соответствуют по этому показателю требованиям МЭБ.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагаются:

Методика определения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках КРС иммуноферментным методом»;

Методика определения антител к неструктурным белкам вируса ящура иммуноферментным методом при тестировании сывороток крови КРС в одном разведении»;

Набор для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови КРС иммуноферментным методом»;

Набор для определения антител к неструктурным белкам вируса ящура иммуноферментным методом при тестировании сывороток крови КРС в одном разведении».

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Яковлева, Анастасия Сергеевна, Владимир

1. Аминев, А.Г. Выделение и очистка экспрессированных в E.coli ЗС и 3D белков вируса ящура / А.Г. Аминев, Т.А. Сатина, Г.М. Фалина // Вирусн. болезни с.-х. животных: тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. — Владимир, 1995. С. 5.

2. Вакцинопрофилактика ящура в Российской Федерации / Т.З. Байбиков,

3. B.М. Захаров, Н.А. Пронина и др. // Вирусн. болезни с.-х. животных: тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. Владимир, 1995. - С. 160.

4. Гааль, Э. Электрофорез в разделении биологических молекул / Э. Гааль, Г. Медьеши, Л. Верецкеи. М.: Мир, 1982.

5. Дудников, А.И. Биотехнология противоящурных вакцин / А.И. Дудников // Животноводство России. 2004. - №9. — С. 42-44.

6. Захаров, В.М. Ящур: новые концепции борьбы и профилактики / В.М. Захаров // Актуальные проблемы инфекционной патологии животных: матер. Междунар. науч. конф. ФГУ ВНИИЗЖ. Владимир, 2003. - С. 11-14.

7. Изучение возможности использования синтетических пептидов для выявления антител к VIA-антигену вируса ящура / А.А. Луговской,

8. C.С. Рыбаков, Ж.А. Шажко и др. // К новой стратегии борьбы с ящуром: матер. Междунар. науч. конф. ВНИЯИ. Владимир, 1991. - С. 165-166.

9. Использование аэросила А-300 и фильтров GF/F (GF/C) для очистки фрагментов ДНК, ДНК-плазмид и РНК / О.Г. Грибанов, А.В. Щербаков, Н.А. Перевозчикова и др. // Биохимия. 1996. - Т.21, вып. 6.-С. 1064-1070.

10. Использование синтезированных в E.coli гибридных белков протеазы Зс и РНК-полимеразы вируса ящура для диагностики / А.Г. Аминев, С.П. Аминева, Н.С. Мудрак и др. // Молекулярная биология. 1997. -Т.31, №3. - С.568-572.

11. Использование VIA-антигена из культурального вируса ящура в ИФМ / Е.К. Дудникова, В.В. Дрыгин, JI.A. Дудников, Ж.А. Шажко // Вопр. вет. вирусол., микробиол., эпизоотол.: матер, науч. конф. ВНИИВВиМ. -Покров, 1992.-4.1.-С. 186-187.

12. К вопросу о персистировании вируса ящура в организме животных / Д.Г. Мусиев, М.М. Ахмедов, Т.Б. Саркисова, Н.М. Салихова // Вестн. ветеринарии. 1996. - №2. - С.34-36.

13. Маниатис, Т. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Д. Сэмбрук М.: Мир, 1984.

14. Медик, В.А. Статистика в медицине и биологии / В.А. Медик, М.С. Токмачев, Б.Б. Фишман- М.: Медицина, 2000.

15. Молекулярная эпизоотология ящура в России и странах СНГ / А.В. Щербаков, В.Г. Андреев, В.В. Дрыгин, А.А. Гусев // Аграрная Россия. -2002.-№2. -С. 8-11.

16. Поляков, И.О. Практическое пособие по медицинской статистике / И.О. Поляков JL: Медицина, 1975.

17. Практическая химия белка / под ред. А. Дарбре. -М.: Мир, 1989.

18. Теория и практика иммуноферментного анализа / A.M. Егоров, А.П. Осипов, Д.Д. Дзантиева и др. -М.: Высшая школа, 1991.

19. Фомина, Т.А. Лабораторная диагностика ящура и других болезней, протекающих с везикулярным синдромом. Обзор литературы / Т.А. Фомина, Е.В. Гусева. Владимир, 1995.

20. Ханаан, Д. Методы трансформации. Клонирование ДНК / под ред. Д. Гловера М.: Мир, 1988.- С.140- 173.

21. Холодилов, Н.Г. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса. Методы молекулярной генетики и генной инженерии / под ред А.В. Мазина, К.Д. Кузнеделова, А.С. Краева и др. Новосибирск: Наука, 1990.

22. A pathogenesis study of foot-and-mouth disease in cattle, using in situ hybridization / C.C. Brown, R.F. Meyer, H.J. Olander et al. // Can. J. Vet. Res. 1992. - V.56. - P. 189-193.

23. A solid-based competition ELISA for measuring antibody to foot-and-mouth disease virus / D.K.J Mackay., A.N. Bulut, T. Rendle et al. // J. Virol. Methods. 2001. - V.97 . - P. 33-48.

24. Absence of protein 2C from clarified foot-and-mouth disease virus vaccines provides the basis from distinguishing convalescent from vaccinanted animals / J. Lubroth, M.J. Grubman, T.G. Burrage et al. // Vaccine 1996. - V.14. — P.419-426.

25. Alexandersen, S. Aspects of the persistence of foot-and-mouth disease virus in animals the carrier problem / S. Alexandersen, Z. Zhang, A.I. Donaldson // Microbes Infect. - 2002. - V.4. - P.1099-1110.

26. All foot and mouth disease serotypes initiate protein synthesis at two separate AUGs / D.V. Sangar, S.E. Newton, D.J. Rowlands et al. // Nucleic Acids Res. 1987. - V.15. -P. 3305-3315.

27. Analysis of neutralizing epitopes on foot-and-mouth disease virus / E. Pfaff, M. Mussgay, H.O. Bohm et al. // J. Virol. 1988. - V.62. - P.2033-2040.

28. Baculovirus expressed 2C of foot-and-mouth disease virus has the potential for differentiating convalescent from vaccinated animals / R.F. Meyer, G.D.

29. Badcock, F.E. Newman et al. // J. Virol. Methods. 1997. - V.65. - P. 3343.

30. Barteling, S.J. Development and performance of inactivated vaccines against foot and mouth disease / S.J. Barteling // Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 2002. - V. 21. - P. 577-588.

31. Barton, D.J. Synchronous replication of poliovirus RNA: initiation of negative-strand RNA synthesis requiers the guanidine-inhibited activity of protein 2C / D.J. Barton, J.B. Flanegan // J.Virol. 1997. - V.71. - P. 84828489.

32. Beard, C.W. Genetic determinants of altered virulence of Taiwanese foot-and-mouth disease virus / C.W. Beard, P.W. Mason // J. Virol. 2000. -V.74.-P. 987-991.

33. Bedard, K.M. Regulation of picornavirus gene expression / K.M. Bedard, B.L. Semler // Microbes Infect. 2004. - V.6. - P.702-713.

34. Belsham, G.J. Distinctive features of foot-and-mouth disease virus, a member of the picornavirus family; aspects of virus protein synthesis, protein processing and structure / G.J. Belsham // Prog. Biophys. Molec. Biol. 1993.-V.60.-P.241-260.

35. Belsham, G.J. Foot-and-mouth disease virus 3C protease induces cleavage of translation initiation factors eIF4A and eIF4G within infected cells / G.J. Belsham, G.M. Mclnerney, N. Ross-Smith // J. Virol. 2000. - V.74. - P. 272-280.

36. Biochemical and structural studies with neutralizing antibodies raised against foot-and-mouth disease virus / E. Domingo, N. Verdaguer, W.F. Ochoa et al. // Virus Res. 1999. - V.62.- P.169-175.

37. Burrows, R. Excretion of foot-and-mouth disease virus prior to the development of lesions / R. Burrows // Vet. Rec. 1968. - V.82. - P. 387388.

38. Cell-free synthesis of poliovirus: 14S subunits are the key intermediates in the encapsidation of poliovirus RNA / Y. Verlinden, A. Cuconati, E. Wimmer et al. // J. Gen. Virol. 2000. - V.81. - P.2751-2754.

39. Chinsangaram, J. Protection of swine by live and inactivated vaccines prepared from a leader proteinase-deficient serotype A12 foot-and-mouth disease virus / J. Chinsangaram, P.W. Mason, M.J. Grubman // Vaccine. -1998. -V.16.- 1516-1522.

40. Clavijo, A. Developments in diagnostic techniques for differentiating infection from vaccination in foot-and-mouth disease / A. Clavijo, P. Wright, P. Kitching // Vet.J. 2004. - V.167. - P.9-22.

41. Collen, T. Induction of antibody to foot-and-mouth disease virus in a mouth model / T. Collen, K.C. McCullough, T.R. Doel // J. Virol. V.52. - P.650-655.

42. Comparison of two ЗАВС ELISAs for diagnosis of multiple-serotype foot-and-mouth disease in cattle population in an Area of endemicity / B.M.C. Bronsvoort, K.J. Sorensen, J. Andersen et al. // J. Clin. Microbiol. 2004. -V.42.-P. 2108-2114.

43. Complete protein linkage map of poliovirus P3 proteins: interaction of polymerase 3Dpol with VPg and with genetic variants of ЗАВ / W. Xiang,

44. A. Cuconati, D. Hope et al. // J. Virol. 1998. - V.72. - P. 6732-6741.

45. Conservation of the secondary structure elements of the 5'-untranslated region of cardio- and aphthovirus RNAs / E.V. Pilipenko, V.M. Blinov,

46. B.K. Chernov et al. // Nucleic Acids Res. 1989. - V.17. - P. 5701-5711.

47. Conserved structural domains in the 5'- untranslated region of picornaviral genomes: an analysis of the segment controlling translation and neurovirulence / E.V. Pilipenko, V.M. Blinov, L.I. Romanova et al. // Virology. 1989. -V. 168. - P. 201-209.

48. Coxsackievirus protein 2D modifies endoplasmic reticulum membrane and plasma membrane permeability and facilitates virus release / F.J.van Kuppeveld, J.G. Hoenderop, R.L. Smeets et al. // EMBO J. 1997. - V.16. -P. 3519-3532.

49. Crowther, J.R. The use of non-structural (NS) antigens of FMD virus to assess antibodies in vaccinanted and infected livestock / J.R. Crowther // Foot-and-mouth disease: control strategies: symposium proceedings. — Lyons, 2002.-P. 377.

50. De Clercq, K. Overiew on foot-and-mouth disease diagnistic techniques / K. De Clercq // Foot-and-mouth disease: control strategies: symposium proceedings. Lyons, 2002. - P. 345-352.

51. Deletion of substitution of the aphthovirus 3' NCR abrogates infectivity and virus replication / M. Saiz, S. Gomez, E. Martinez-Salas et al. // J. Gen. Virol. 2001. - V.82. - P.93-101.

52. Detection of carriers of foot-and-mouth disease virus among vaccinated cattle / P. Moonen, L. Jacobs, A. Crienen, A. Dekker // Vet. Microbiol. — 2004.-V. 103. -P.151-160.

53. Detection of cattle exposed to foot-and-mouth disease virus by means of an indirect ELISA test using bioengineered nonstructural polyprotein ЗАВС /

54. V. Malirat, E. Neitzer, I.E. Bergmann et al. // Vet. Q. 1998 - V.20. - P. 24-26.

55. Detection of virus infection-associated antigen and 3D antibodies in cattle vaccinated against foot-and-mouth disease / V.K. O'Donnell, E. Smitsaart, B. Cetra et al. // Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 1997. -V.16. -P.833-840.

56. Development of a foot-and-mouth disease NSP ELISA and its comparison with differential diagnostic methods / C.H. Kweon, Y.J. Ко, W. Kim et al. // Vaccine 2003. - V.21. - P. 1409-1414.

57. Dever, Т.Е. GTP-binding domain: three consensus sequence elements with distinct spacing / Т.Е. Dever, M.J. Glynias, W.C. Merrick // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - V.84. - P. 1814-1818.

58. Diagnistic potential of mab-based ELISAs for antibodies to non-structural proteins of foot-and-mouth disease virus to differentiate infection from vaccination / E. Brocchi, M.I. De Diego, A. Berlinzani et al. // Vet. Q. -1998-V.20.-P. 20-24.

59. Differential restrictions on antigenic variation among antigenic sites of foot-and-mouth disease virus in the absence of antibody selection / A. Holguin, J.

60. Hernandez, M.A. Martinez et al. // J. Gen. Virol. 1997. - V.78. - P.601-609.

61. Differentiating infection from vaccination in foot-and-mouth disease using a panel of recombinant, non-stuctural proteins in ELISA / D.K.J. Mackay, M.A. Forsyth, P.R. Davies et al. // Vaccine 1998. - V.16. -P.446-459.

62. Differentiation of convalescent animals from those vaccinated against foot-and-mouth disease by a peptide ELISA / F. Shen, P.D. Chen, A.M. Walfield et al. // Vaccine 1999. - V.17. - P.3039-3049.

63. Dmitrieva, T.M. Encephalomyocarditis virus RNA polymerase preparations, with and without RNA helicase activity / T.M. Dmitrieva, K.B. Norkina, V.I. Agol // J. Virol. 1991. - V.65. - P. 2714-2717.

64. Doedens, J.R. Inhibition of cellular protein secretion by poliovirus proteins 2B and ЗА / J.R. Doedens, K. Kirkegaard // EMBO J. 1995. - V.14. - P. 894-907.

65. Doel, T.R. Natural and vaccine-induced immunity to foot-and-mouth disease: the prospects for improved vaccines / T.R. Doel // Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 1996. - V.15.-P.883-911.

66. Donaldson, A.I. Foot-and-mouth disease: the principal features /А.1. Donaldson // Irish Vet. J. 1987. - V.41. - P. 325-327.

67. Donaldson, A.I. The virological determinants of the epidemiology of foot-and-mouth disease / A.I. Donaldson, S. Alexandersen // Foot-and-mouth disease: control strategies: symposium proceedings Lyons, 2002. - P. 173 -181.

68. Duke, G.M. Sequence and structural elements that contribute to efficient encephalomyocarditis virus RNA translation / G.M. Duke, M.A. Hoffman, A.C. Palmenberg // J. Virol. 1992. - V.66. - P. 1602-1609.

69. Dyrting, K.C. Evaluation and use of foot-and-mouth disease virus nonstructural protein ELISA in pigs in Hong Kong / K.C. Dyrting, C.H. Chow, T.M. Ellis // Proceeding of EUFMD Research Group Meeting. — Chania, 2004.-P.45.

70. E.coli expressed proteins as diagnostic reagents for typing of foot-and-mouth disease virus / V.V.S. Suryanarayana, S. Viswanathan, G. Ratish et al. // Arch. Virol. 1999 - V. 144. - P. 1701-1712.

71. Engineering cowpea mosaic virus RNA-2 into a vector to express heterologous proteins in plants / K. Gopinath, J. Wellink, C. Porta et al. // Virology. 2000. - V.267. - P. 159-173.

72. Evans, DJ. Cell receptors for picornaviruses as determinants of cell tropism and pathogenesis / DJ. Evans, J.W. Almond // Trends Microbiol. 1998. -V.6.-P. 198-202.

73. Evolution of foot-and-mouth disease virus / E. Domingo, C. Escarmis, E. Baranowski et al. // Virus Res. 2003. - V.91. - P. 47-63.

74. Expression of a foreign protein by influenza A virus / N. Percy, W.S. Barclay, A. Garcia-Sastre et al. // J. Virol. 1994. - V.68. - P.4486-4492.

75. Falk, M.M. VPg gene amplification correlates with infective particle formation in foot-and-mouth disease virus / M.M. Falk, F. Sobrino, E. Beck // J. Virol. 1992. - V.66. - P. 2251-2260.

76. Foot-and-mouth disease virus / E. Domingo, E. Baranowski, C. Escarmis, F. Sobrino // Сотр. Immunol. Microbiol. Infect. Diseases. 2002. - V.25. - P. 297-308.

77. Foot-and-mouth disease virus 2A protease mediates cleavage in attenuated Sabin 3 poliovirus vectors engineered for delivery of foreign antigens / N.M. Mattion, E.C. Harnish, J.C. Crowley et al. // J. Virol. 1996. - V.70. -P.8124-8127.

78. Foot-and-mouth disease virus: a long known vims, but a current threat / F. Sobrino, M. Saiz, M.A. Jimenez-Clavero et al. // Vet. Res. 2001. - V.32. -P. 1-30.

79. Foot-and-mouth disease virus: biology and prospects for disease control / M. Saiz, J.I. Nunez, M.A. Jimenez-Clavero et al. // Microbes Infect. 2002. -V.4.-P. 1183-1192.

80. Foot-and-mouth disease virus-infected but not vaccinanted cattle develop antibodies against recombinant 3AB1 nonstructural protein / E. Silberstein, G. Kaplan, O. Taboga et al. // Arch. Virol. 1997 - V.142. - P. 795-805.

81. Foot-and-mouth disease vims infection of sheep: implications for diagnosis and control / G.J. Hughes, V. Mioulet, R.P. Kitching et al. // Vet Rec. -2002.-V.150.-P. 724-727.

82. Foot-and-mouth disease virus virulent for cattle utilazes the integrin alpha(v)beta(3) as its receptor / S. Neff., D. Sa-Carvalho, E. Rieder et al. // J. Virol. 1998. - V.74. -P.3587-3594.

83. Forss, S. A tandem repeat gene in a picornavirus / S. Forss, H. Schaller // Nucleic Acids Res. 1982. - V. 10. - P. 6441-6450.

84. Gailiunas, P. Presence and persistence of foot-and-mouth disease virus in bovine skin / P. Gailiunas, G.E. Cottral // J. Bacteriol. 1966. - V.91. - P. 2333-2338.

85. Genetically engineered foot-and-mouth disease viruses with poly(C) tracts of two nucleotides are virulent in mice / E. Rieder, T. Bunch, F. Brown et al. // J. Virol. 1993. - V.67. - P. 5139-5145.

86. Gorbalenya, A.E. Viral proteins containing the purine NTP-binding sequence pattern / A.E.Gorbalenya, E.V. Koonin // Nucleic Acids Res. -1989.-V.17.-P. 8413-8440.

87. Groot Bramel-Verheije, M.H. Expression of a foreign epitope by porcine reproductive and respiratory syndrome vims / M.H Groot Bramel-Verheije., P J. Rottier, J.J. Meulenberg // Virology. 2000. - V.278. - P. 380-389.

88. Grubman, M.J. Foot-and-mouth disease / MJ. Grubman, B. Baxt // Clin. Microbiol. Rew. 2004. - V.17, №2. - P.465-493.

89. Hamblin, C. A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus / C. Hamblin, I.T. Barnett, J.R. Crowther // J. Immunol. Methods. 1986. - V.93. - P. 123129.

90. Hansen, J.L. Structure of the RNA-dependent RNA polymerase of poliovirus / J.L. Hansen, A.M. Long, S.C. Schultz // Structure. 1997 - V.5. -P. 1109-1122.

91. Haydon, D.T. The generation and persistence of genetic variation in foot-and-mouth disease virus / D.T. Haydon, A.R. Samuel, N.J. Knowles // Prev. Vet. Med. 2001. - V.51. — P. 111-124.

92. High-level expression of recombinant 3AB1 non-structural protein from FMDV in insect larvae / M.G. Lopez, A. Peralta, A. Berinstein et al. // J. Virol. Methods. 2005. - V.124. - P. 221-224.

93. Hope, D.A. Genetic dissection of interaction between poliovirus 3D polymerase and viral protein ЗАВ / D.A. Hope, S.E. Diamond, K. Kirkegaard // J.Virol. 1997. - V.71. - - P.9490-9498.

94. Identification of a nucleotide deletion in parts of polypeptide ЗА in two independent attenuated apthovirus strains / A.T. Giraudo, E. Beck, K. Strebel et al. // Virology. 1990. - V.177. - P. 780-783.

95. Identification of foot-and-mouth disease vims replication in vaccinated cattle by antibodies to non-structural viral proteins / H.G. Berger, O.C. Straub, R. Ahl et al. // Vaccine 1990. - V.8. - P.213-216.

96. Identification of foot-and-mouth disease virus-srecific linear B-cell epitopes to differentiate between infected and vaccinated cattle / B.J. Hohlich, K.H. Wiesmuller et al. // J. Virol. 2003. - V.77, №16. - P.8633-8639.

97. Identification of T-cell epitopes in nonstructural proteins of foot-and-mouth disease virus / E. Blanco, G.B. Briones, A. Sanz-Parra et al. // J. Virol. -2001. V.75, №7. -P.3164-3174.

98. IgA response of cattle to FMDV infection in probang and saliva samples / M. Amadori, B. Haas, A. Moos, I. Zerbini // Proceeding of EUFMD Research Group Meeting. Borovets, 2000. - P. 88-106.

99. Immunogenicity of non-structural proteins of foot-and-mouth disease virus: differences between infected and vaccinated swine / A. Rodriguez, J. Dopazo, J.C. Saiz et al. //Arch. Virol. 1994 -V. 136. - P. 123-131.

100. IRES-driven translation is stimulated separately by the FMDV 3'-NCR and poly(A) sequences / S. Lopez de Quinto, M. Saiz, D. de la Morena, et al. // Nucleic Acids Res. 2002. - V.30. - P. 4398-4405.

101. Jacobs, L. The FMD-NS ELISA, the most sensitive test to detect FMDV infected animals in a vaccinated population / L. Jacobs, P. Moonen // Proceeding of EUFMD Research Group Meeting. Chania, 2004. - P.415.

102. Jacobson, R.H. Validation of serological assays for diagnosis of infectious diseases / R.H. Jacobson // Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 1998. - V.17.-P.469-526.

103. Jecht, M. Membrane permeability induced by hepatitis A virus proteins 2B and 2BC and proteolytic processing of HAV 2BC / M. Jecht, C. Probst, V. Gauss-Muller // Virology. 1998. - V.252. - P. 218-227.

104. Kitching, R.P. Identification of foot-and-mouth disease virus carrier and subclinically infected animals and differentiation from vaccinated animals / R.P. Kitching // Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 2002.-V.21.-P.531-538.

105. Kitching, R.P. Future research on foot and mouth. disease / R.P. Kitching//Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. -2002.-V.21.-P.885-889.

106. Kitching, R.P. Problems of diagnosis of foot-and-mouth disease in domestic animals / R.P. Kitching // Foot-and-mouth disease: control strategies: symposium proceedings. — Lyons, 2002. — P. 353-360.

107. Klein, M. Echovirus 9 strain barty non-structural protein 2C has NTPase activity / M. Klein, H.J. Eggers, B. Nelsen-Salz // Virus Res. -1999.-V.65.-P. 155-160.

108. Kuhn, R. Functional analysis of the internal translation initiation site of foot-and-mouth disease virus / R. Kuhn, N. Luz, E. Beck // J. Virol. -1990. V.64. - P.4625-4631.

109. Lama, J. A role for ЗАВ protein in poliovirus genome replication / J. Lama, M.A. Sanz, P.L Rodrigues. // J. Biol. Chem. 1995. - V.270. - P. 14430-14438.

110. Leader protein of foot-and-mouth disease virus is requiered for cleavage of the p220 component of the cap-binding protein complex / M.A. Devaney, V.N. Vakharia, R.E. Lloyd et al. // J. Virol. 1988. - V.62. - P. 4407-4409.

111. Lee, F. Comparison of ELISA for detection of porcine serum antibodies to non-structural proteins of foot-and-mouth disease virus / F. Lee, Y.L. Lin, M.H. Jong // J. Virol. Methods. 2004. - V.U6. - P. 155159.

112. Lubroth, J. Identification of native foot-and-mouth disease virus nonstructural protein 2C as serological indicator to differentiate infected from vaccinated livestock / J. Lubroth, F. Brown // Res. Vet. Sci. 1995. - V.59. - P.70-78.

113. Marquardt, O. FMDV proteinase 3C inhibits translation in recombinant Escherichia coli / O. Marquardt // FEMS Microbiol. Lett. -1993. V.107. — P.279-286.

114. Marquardt, О. FMDV protease ЗС lacks linear epitopes for bovine antibodies, while such epitopes are present in 2C and ЗА / О. Marquardt // Report of the Third Annual Meeting, Tubingen, 4-5 March, 1996.

115. Mason, P.W. Identification and characterization of a cis-acting replication element (ere) adjacent to the internal ribosome entry site of foot-and-mouth disease virus / P.W. Mason, S.V. Bezborodova, T.M Henry. // J. Virol. 2002. - V.76. - P.9686-9694.

116. Mason, P.W. Molecular basis of pathogenesis of FMDV / P.W. Mason, M.J. Grubman, B. Baxt // Virus Res. 2003. - V.91. - P.9-32.

117. McKnight, K.L. The rhinovirus type 14 genome contains an internally located RNA structure that is requered for viral replication / K.L. McKnight, S.M. Lemon // RNA. 1998. - V.4. - P. 1569-1584.

118. McVicar, J.W. Foot-and-mouth disease: the agar gel diffusion precipitin test for antibody to virus-infection-associated (VIA) antigen as a tool for epizootiologic surveys / J.W. Mc Vicar, P. Sutmoller // Am. J. Epidemiol. 1970. - V.92. - P. 273-278.

119. Nucleotide sequence and genome organization of foot-and-mouth disease virus / S. Forss, K. Strebel, E. Beck et al. // Nucleic Acids Res. -1984.- V.12.-P. 6587-6601.

120. Observations on the carrier state of cattle exposed to foot-and-mouth disease virus / J.G. van Bekkum, H.S. Frenkel, HJ. Frederiks et al. // Tijdschr. Diergeneeskd. 1959. - V.84. - P. 1159-1164.

121. OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines. 5thed. -Paris, 2004.

122. Oleksiewicz, M.B. Development a novel real-time RT-PCR assay for quantitation of foot-and-mouth disease virus in diverse porcine tissues / M.B. Oleksiewicz, A.I. Donaldson, S. Alexandersen // J. Virol. Methods. -2001.-V.92.-P. 23-35.

123. Pathogenesis of wild-type and leaderless foot-and-mouth disease virus in cattle / C.C. Brown, M.E. Piccone, P.W. Mason et al. // J. Virol. 1996. -V.70.- P. 5638-5641.

124. Paton, D.J. Post-vaccinal serosurveillance for FMD: a European perspective on progress and problems / D.J. Paton, K. de Clerq, A. Dekker // Proceeding of EUFMD Research Group Meeting. Chania, 2004. - P. 6871.

125. Perry, B.D. The economics of foot-and-mouth disease, its control and its eradication / B.D. Perry, T.F. Randolph // Foot-and-mouth disease: control strategies: symposium proceedings. Lyons, 2002. - P. 23-42.

126. Persson, K. The development of an indirect ELISA for the detection of antibodies to the non-structural protein ЗАВС of the foot-and-mouth disease virus / K. Persson, M. Merza // Proceeding of EUFMD Research Group Meeting. Chania, 2004. - P.71.

127. Pfister, Т. A cysteine-rich motif in poliovirus protein 2C (ATPase) is involved in RNA replication and binds zinc in vitro / T. Pfister, K.W. Jones, E. Wimmer// J. Virol. 2000. - V.74. - P.334-343.

128. Point mutations within the pG-pH loop of foot-and-mouth disease virus OIK affect virus attachment to target cells / M. Leippert, E. Beck, F. Weiland, E. Pfaff// J. Virol. 1997. - V.71. - P. 1046-1051.

129. Polatnick, J. Foot-and-mouth disease virus-induced ribonucleic acid polymerase in baby hamster kidney cells / J. Polatnick, R.B. Arlinghaus // Virology 1967. - V.31. - P. 601-608.

130. Poliovirus RNA synthesis utilizes an RNA complex formed around the 5'-end of viral RNA / R. Andino, G.H. Rieckhof, P.L. Achacoso et al. // EMBO J. 1993. - V.12. - P. 3587-3598.

131. Poly(C) in animal viral RNAs / F. Brown, J. Newman, J. Stott et al. // Nature. 1974. - V.251. - P. 342-344.

132. Poly (rC) binding proteins with the 5' noncoding region of poliovirus RNA and the viral 3CD proteinase / T.B. Parsley, J.S. Towner, L.B. Blyn et al. // RNA. 1997. - V.3. - P. 1124-1134.

133. Potential secondary and tertiary structure in the genomic RNA of foot-and-mouth disease virus / B.E. Clarke, A.L. Brown, K.M. Currey et al. // Nucleic Acids Res. 1987. - V. 15. - P. 7067-7079.

134. Production of biologically active, heterodimeric porcine interleukin-12 using a monocistronic baculoviral expression system / T. Kokuho, S. Watanabe, Y. Yokomizo et al. // Vet. Immunol. Immunopathol. 1999. -V. 72. - P. 289-302.

135. Proteolytic processing of foot-and-mouth disease virus polyproteins expressed in a cell-free system from clone-derived transcripts / V.N. Vakharia, M.A.Devaney, D.M. Moore et al. // J. Virol. 1987. - V.61. -P. 3199-3207.

136. Radial immuno-diffusion and seroneutralization techniques for the assay of antibodies to swine vesicular disease / S.M. Golding, R.S. Hedger, P. Talbot et al. // Res. Vet. Sci. 1976. - V.20. - P. 142-147.

137. Ratish, G. C-terminal region of VP1 of selected foot-and-mouth disease virus serotypes: expression in E.coli and affinity purification / G. Ratish, S. Viswanathan, V.V.S. Suryanarayana // Acta Virologica. 1999. -V.43.-P. 205-211.

138. Recent spread of FMD virus serotype Asia 1 / J.F. Valarcher, N.J. Knowles, N.P. Ferris, D.J. Paton // Vet. Rec. 2005. - V.2. - P.30.

139. Recently generated data with the CHEKIT-FMD-3ABC ELISA kit and methods to monitor the operational perfomance of a ЗАВС ELISA / L. Schalch, D.E. Rebeski, H. Samaras et al. // Proceeding of EUFMD Research Group Meeting. Izmir, 2002. - P. 283-303.

140. Remond M., Diagnosis and screening of foot-and-mouth disease virus / M. Remond, C. Kaiser, F. Lebreton // Сотр. Immunol. Microbiol. Infect. Diseases. 2002. - V.25. - P. 309-320.

141. Report of workshop on validation of NSP-ELISAs: a comparison of 6 assays / K. De Clercq, E. Brocchi, S. Grazioli et al. // Proceding of EUFMD Research Group Meeting. Chania, 2004. - P.44.

142. Richards, O.C. Effects of poliovirus 3Ab protein on 3D polymerase-catalyzed reaction / O.C. Richards, E. Ehrenfeld // J. Biol. Chem 1998. -V.273.-P. 12832-12840.

143. Rivera, V.M. Comparative sequence analysis of the 5' noncoding region of the enteroviruses and rhinoviruses / V.M. Rivera, J.D. Welsh, J.V. Maizel // Virology. 1988. - V.165. - P. 42-50.

144. Rodriguez, P.L. Poliovirus protein 2C has ATPase and GTPase activities / P.L. Rodriguez, L. Carrasco // J. Biol. Chem. 1993. - V.268. -P. 8105-8110.

145. Role of nonstructural proteins ЗА and 3B in host range and pathogenicity of foot-and-mouth disease virus / J.M. Pacheco, T.M. Henry, V. O'Donnell et al. //J. Virol. -2003. -V.77. P. 13017-13027.

146. Rueckert, R.R. Systematic nomenclature of picornavirus proteins / R.R. Rueckert, E. Wimmer // J. Virol. 1984. - V.50. - P. 957-959.

147. Ryan, M.D. Cleavage of foot-and-mouth disease virus polyprotein is mediated by residues located within a 19 amino acid sequence / M.D. Ryan, A.M. King, G.P. Thomas // J. Gen. Virol. 1991. - V.72. - P.2727-2732.

148. Salt, J.S. The carrier state in foot and mouth disease an immunological review / J.S. Salt // Brit. Vet. J. - 1993. - V.149. - P.207-223.

149. Schneider-Shaulies, J. Cellular receptors for viruses: links to tropism and pathogenesis / J. Schneider-Shaulies // J. Gen. Virol. 2000. - V.81. -P.1413-1429.

150. Secretory IgA as an indicator of orofharyngeal FMDV replication / S. Parida, D. Paton, S. Cox et al. // Proceeding of EUFMD Research Group Meeting. Chania, 2004. - P. 440-446.

151. Sequence analysis of the RNA polymerase gene of foot-and-mouth disease virus serotype Asial / M. George, R. Venkataramanan, B. Pattnaik et al. // Virus Genes. 2001. - V.22. - P. 21-26.

152. Serial release testing for FMD ELISA kits: necessity of official control / K. Luyten, N. Goris, A.B. Caij, K. De Clercq // Proceeding of EUFMD Research Group Meeting. Chania, 2004. - P.46.

153. Serodiagnostic strategy for estimation of foot-and-mouth disease viral activity through highly sensitive immunoassays using bioengineered nonstructural proteins / I.E. Bergmann, V. Astudillo, V. Malirat, E. Neitzert // Vet. Q. 1998 - V.20. - P. 6-8.

154. Serological and cellular immune responses to non-structural proteins in animals infected with FMDV / M. Foster, A. Cook, L Cedillo et al. // Vet. Q. 1998 - V.20. - P. 28-30.

155. Strebel, K. A second protease of foot-and-mouth disease virus / K. Strebel, E. Beck // J. Virol. 1986. - V.58. - P. 893-899.

156. Stewart, S.R. RNA determinants of picornavirus cap-independent translation initiation / S.R. Stewart, B.L. Semler // Semin. Virol. 1997. -V.8.-P. 242-255.

157. Structure and receptor binding / T. Jackson, A.M.Q. King, D.I.Stuart, E. Fry // Virus Res. 2003. - V.91. - P.33-46.

158. Studies with poliovirus polymerase 3Dpol. Stimulation of poly(U) synthesis in vitro by purified poliovirus protein ЗАВ / A.V. Paul, X. Cao, K.S. Harris et al. // J. Biol. Chem. 1994. - V.269. - P. 29173-29181.

159. Sun, T. Localization of infection-related epitopes on the non-structural protein ЗАВС of foot-and-mouth disease virus and the application of tandem epitopes / T. Sun, P. Lu, X. Wang // J. Virol. Methods. 2004. - V.l 19. - P. 79-86.

160. Sutmoller, P. Pathogenesis of foot-and-mouth disease: the lung as an additional portal of entry of the virus / P. Sutmoller, J.W. Mc Vicar // J. Hyg. (London). 1976. - V.77. - P. 235-243.

161. Sutmoller, P. Unapparent foot and mouth disease infection (subclinical infections and carriers): implications for control / P. Sutmoller, R.C. Olascoaga // Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. -2002.-V.21.-P.519-529.

162. Synthenic peptide-based serosuveillance and vaccine system for FMD / S. Liu, T.Y. Chang, A.M. Walfield et al. // Proceding of EUFMD Research Group Meeting. Izmir, 2002. - P. 303-321.

163. Synthetic peptide-based vaccine and diagnostic system for effective control of FMD / C.Y. Wang, T.Y. Chang, A.M. Walfield et al. // Biologicals. 2001. - V.29. - P.221-228.

164. The 3' untranslated region of picornavirus RNA: features requiered for efficient genome replication / J.B. Rohll, D.H. Moon, D.J. Evans et al. // J. Virol. 1995. - V.69. - P. 7835-7844.

165. The cell attachment site on foot-and-mouth disease virus includes the amino acid sequence RGD (arginine-glycine-aspartic acid) / G. Fox, N.R. Parry, P.V. Barnett et al. // J. Gen. Virol. 1989. - V.70. - P.625-637.

166. The foot-and-mouth disease virus leader proteinase gene is not required for viral replication / M.E. Piccone, E. Rieder, P.W. Mason, M.J. Grubman // J. Virol. 1995. - V.69. - P.5376-5382.

167. The non-structural polyprotein ЗАВС of foot-and-mouth disease virus as a diagnostic antigen in ELISA to differentiate infected from vaccinanted cattle / M. De Diego, E. Brocchi, D. Mackay et al. // Arch. Virol. 1997 -V.142. — P. 2021-2033.

168. The pathogenesis and diagnosis of foot-and- mouth disease / S. Alexandersen, Z. Zhang, A.I. Donaldson et al. // J. Сотр. Pathol. 2003. -V.129.-P. 1-36.

169. The sequence of foot-and-mouth disease virus RNA to the 5' side of the poly(C) tract / S.E. Newton, A.R. Carroll, R.O. Campbell et al. // Gene. 1985.-V.40.-P. 331-336.

170. The two species of the foot-and-mouth disease virus leader protein, expressed individually, exhibit the same activities / M. Medina, E. Domingo, J.K. Brangwyn et al. // Virology. 1993. - V. 194. - P. 355-359.

171. Tissue culture adaptation of FMDV selects viruses that bind to heparin and are attenuated in cattle / D. Sa-Carvalho, D.E. Rieder, B. Baxt et al. // J. Virol. 1997. - V.71. - P.5115-5123.

172. Villaverde, A. 3D gene of foot-and-mouth disease virus. Conservation by convergence of average sequences / A. Villaverde, E. Martinez-Salas, E. Domingo // J. Mol. Biol. 1988. - V.204. - P. 771-776.

173. Wimmer, E. Genome-linked proteins of viruses / E. Wimmer // Cell. — 19 82.-V.28.-P. 199-201.

174. Zhang, Z.D. The localization of persistent foot-and-mouht disease virus in the epithelial cells of the soft palate and pharynx / Z.D. Zhang, R.P. Kitching // J. Сотр. Pathol. 2001. - V.124. - P. 89-94.

Информация о работе

Яковлева, Анастасия Сергеевна
кандидата биологических наук
Владимир, 2005
ВАК 03.00.06

Диссертация

Разработка и применение иммуноферментной тест-системы для обнаружения антител к неструктурным белкам вируса ящура в сыворотках крови крупного рогатого скота - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы