Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ АНАЛИТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ ДИАГНОСТИКИ МАРКЕРНЫХ ГЕНОВ ПЛОДОВИТОСТИ СВИНЕЙ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ АНАЛИТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ ДИАГНОСТИКИ МАРКЕРНЫХ ГЕНОВ ПЛОДОВИТОСТИ СВИНЕЙ"

еЯ^ъъз

На правах рукописи

КУНАЕВА Елена Константиновна

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ АНАЛИТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ ДИАГНОСТИКИ МАРКЕРНЫХ ГЕНОВ ПЛОДОВИТОСТИ СВИНЕЙ

03.00.23 - Биотехнология

06,02.01 - Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дубровицы- 2007

Диссертационная работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики Всероссийского государственного научно-исследовательского института животноводства и на кафедре зоотехнии Российского университета дружбы народов.

Научные руководители: кандидат биологических наук

Гладырь Елена Александровна

кандидат сельскохозяйственных наук Державина Галина Павловна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Шихов Игорь Яковлевич

доктор сельскохозяйственных наук, академик РАСХН (иностранный член) Глазко Валерий Иванович

Ведущая организация: Московская государственная академия

ветеринарной медицины и биотехнологий имени К.И. Скрябина

Защита состоится « 29 » мая 2007 г, в 10.22 часов на заседании диссертационного совета Д 006.013.01 во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте животноводства (ВИЖ)

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район,

пос. Дубровицы, ВИЖ, Факс: 8 (4967) 65ПОІ

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВИЖа Автореферат разослан » апреля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного ос кандидат биологических наук / Губанова

з

І. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Развитие свиноводства является наиболее перспективным направлением возрождения мясного комплекса России, так как эта отрасль животноводства позволяет в короткие сроки при высокой конверсии корма получать мясную продукцию (Ведомственная целевая программа «Развитие свиноводства в Российской Федерации на период 2006 -2010 г.г. и до 2015 года, 2005). Производство мяса и эффективность селекции свиней могут быть увеличены за счет повышения многоплодия свиноматок (Зиновьева H.A., Эрнст Л.К., 2006).

Одним из путей повышения эффективности ведения отрасли свиноводства, является маркерная селекция, существенная роль в которой отводится полиморфным ДНК-маркерам. В настоящее время широкое применение в качестве маркера плодовитости свиней нашел ген ESR. Его применяют в селекционных программах в России, Белоруссии и ряде зарубежных фирм (PIC international Group, JSR Fanning Group, Cotswoid Pig Development Company Rattlerow Seghers, ARK-Genomics Рослинского института Великобритании). Но использование полиморфизма гена ESR в качестве маркера плодовитости свиней в большинстве европейских пород свиней лимитируется отсутствием желательного аллеля В гена ESR (Зиновьева H.A.,

Научные разработки американских ученых 1л N1^, \V.tJ. Changxiп, и др (2001) показали, что аллельные варианты гена Р-субъединицы фолликулостимулирующего гормона могут применяться в качестве маркеров плодовитости свиней.

В нашей стране подобные исследования проводились лишь на ограниченном поголовье свиней, импортированных из-за рубежа (Адаменко В „А,, 2004). Дальнейшее изучение полиморфизма гена р-субъединицы фолликулостимулирующего гормона и возможность его использования в качестве маркера плодовитости у наиболее распространенной в России крупной белой породы и ряда локальных пород свиней имеет большое научное и практическое значение.

Цель и задачи исследований. Цель диссертационной работы состояла в разработке аналитической системы диагностики полиморфизма гена р-субъединицы фолликулостимулирующего гормона (РвНВ) и использование ее самостоятельно и в комплексе с геном ESR в качестве критерия опенки воспроизводительных качеств свиней различных пород.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1- Разработать тест-систему анализа полиморфизма гена р-субьединицы фолликулостимулирующего гормона с использованием метода ПЦР.

2. Выполнить генотипированне свиней различных пород по гену РБНВ.

3. Провести анализ генетической структуры популяций свиней различных пород по гену РЗНВ. _

4. Выявить ассоциативные связи полиморфных ва{Щ)№вМ&К& РБНВ с хозяйственно-полезными признаками. имени К.А. Тимирязева

2001).

ЦНБ имени Н.И. Железнова Фонд научный литературы №

5. Апробировать методы сравнительной оценки комплексного влияния генотипов по генам Р8НВ и ЕБК. на воспроизводительные качества свиней. Научная новизна, Разработана тест-система диагностики полиморфизма гена-кандидата плодовитости (РБНВ), выявлен полиморфизм у свиней пород крупная белая, черно-пестрая* уржумская, ливенская, эстонская беконная, дюрок, белорусская мясная и помесных свиноматок. Изучена плодовитость свиноматок различных пород в зависимости от генотипов по гену Р5НВ. Впервые выполнен анализ комплексного влияния генотипов по генам плодовитости РйНВ и ЕБК на воспроизводительные качества свиней.

Практическая значимость. Разработана тсст-система диагностики полиморфизма гена РБНВ, являющегося потенциальным маркером плодовитости свиней. Проведена апробация системы для определения частоты встречаемости аллелей и генотипов изучаемого гена в ] 1 популяциях свиней пород крупная белая, черно-пестрая, уржумская, дюрок, ливенская, эстонская беконная, белорусская мясная и помесных свиноматок. Показано предпочтение комплексной опенки воспроизводительных качеств свиней по двум генам плодовитости (РЭИВ и ЕБП).

Основные положения, выносимые на защиту:

• Аналитическая тест-система диагностики полиморфизма гена РЭИВ.

• Популяционно-генетическая характеристика исследуемых популяций свиней по гену РЗНВ.

• Ассоциации полиморфных вариантов гена РБНВ с воспроизводительными качествами свиней исследуемых пород.

• Эффективность использования комплексной системы диагностики генов НБНВ и Е8К. для оценки воспроизводительных качеств свиней. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных

работ, в том числе одна в журнале, рекомендованном ВАК («Зоотехния», №4, 2007).

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были заслушаны и обсуждены на:

• V международной научной школе-конференции «Новые методы генодиагностики и генотерапии: современное состояние и перспективы использования в сохранении генофонда сельскохозяйственных животных», ВИЖ, Дубровицы, 2005 г.;

• научных конференциях Центра биотехнологии и молекулярной диагностики ВИЖ 2005,2006 гг.;

• студенческом научном кружке кафедры зоотехнии аграрного факультета РУДН, 2006,2007 гг.;

• межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Молодые ученые в решении актуальных проблем современной науки», Чебоксары, 2006 г.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 120 страницах, содержит 27 таблиц, 37 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов,

практического предложения. Список использованной литературы включает 170 источников, втом числе 80 на иностранных языках,

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились в лаборатории молекулярной генетики и цитогенетики животных в период с 2003 по 2006 гг, в соответствии с планом научно-исследовательской работы Центра биотехнологии и молекулярной диагностики ВИЖа и на кафедре зоотехнии Российского университета дружбы народов.

Обшая схема исследований приведена на рисунке I, Исследования были выполнены на 703 свиньях ] 1 популяций 7 пород:

1. Крупная белая (п=59), СГЦ «Заднєпровский» Оршанский район, Витебская область Республики Беларусь;

2. Крупная белая (п=155), РСУГТ «Свинокомплекс Борисовский» Республики Беларусь;

3. Крупная белая (п=73), ЗАО «Нарцизово» Республики Беларусь;

4. Черно-пестрая (п=1П). РСУП «Свинокомплекс Борисовский» Республики Беларусь;

5. Эстонская беконная (п=15), с.-к. «Южный» Гомельского района Республики Беларусь;

6. Эстонская беконная (n= 11), ЗАО «Нарцизово» Республики Беларусь;

7. Уржумская (п=89), ГПЗ «Мухикский» Кировская область;

8. Ливенская (п=70), ГПЗ «им. Георгиевского A.C.» Орловская область;

9. Белорусская мясная (п=7), ЗАО «Нарцизово» Республики Беларусь;

10. Дюрок (п=7), ЗАО «Нарцизово» Республики Беларусь;

1 ¡.Помесные (трехпородные свиноматки, крупная белая х белорусская мясная х эстонская беконная) (п=10б), ЗАО «Нарцизово» Республики Беларусь.

Для получения образцов ДНК были использованы пробы ткани (ушные вы шипы)- Консервирование проб проводили замораживанием при температуре -20°С непосредственно после взятия или помещали на время транспортировки в 96%-й спирт, далее хранили при -20°С до момента использования. (Зиновьева H.A., Попов А.Н.и др., 1998).

ПОРОДЫ И ПОПУЛЯЦИИ СВИНЕИ I

8 І

9>!

л i

X I

£<

5" £1

Получение образцов ткани. Обновление Банка ДНК

РАЗРАБОТКА АНАЛИТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ ДИАГНОСТИКИ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕКА Р5НВ

ПЦР анализ гена РбНВ

Изучение поауляционно-генетической структуры исследуемых пород свиней по гену Г5НВ

Выявление ассоциативных сея признаками свиней крупной бе пород и помеси зей с хозяйственно-полезными л ой, черно-пестрой, уржумской ых свиноматок

Метод описательной статистики

Индексный метод

Сравнительная оценка комплексного влияния генотипов по генам РБНВ и ЕЭЯ на воспроизводительные качества свиноматок крупной белой и уржумской город

Рис. I. Схема исследований

Выделение ДНК проводили посредством лизиса в буфере Кавасаки или перхлоратным методом С модификациями (Зиновьева H.A., Гладырь- Е.А. и др., 2002; Зиновьева H.A., Попов А.Н. и др., 1998). Концентрацию ДНК и степень ее очистки определяли по методике Зиновьевой H.A. с соавторами (1998). Выделенную ДНК тестировали по 2 аллелям гена FSHB методом ПЦР-анализа с модификациями.

Исследование полиморфизма гена ESR выполнено совместно Кайлачаковой О.Н. (2005).

Оценку продуктивных качеств свиней проводили по данным зоотехнического учета (карточка племенной свиноматки - форма 2-СВ),

Генетическое рзвновесие оценивали по уравнению Харди-Вайнберга; проверку нулевой гипотезы проводили по критерию х и* к вад par (хг) (Меркурьева Е.К., 1983). Кластерный анализ проводили на основе Эвклидовых метрик с использованием стратегии агломерации (метод кластеризации Joining) и пакета программ STATISTICA 6.0 (Боровиков В.П., 2001).

Описательную статистическую обработку проводили по стандартным методикам с использованием STATISTICA 6.0 и Exel Office 2003. Достоверность разности между признаками определяли на основании критерия Уайта для несопряженных (непарных) наблюдений. (Гатаулин A.M., 1970),

Индексную оценку свиноматок по комплексу воспроизводительных качеств проводили с использованием методики профессора Михайлова Н.В. (1989,2000).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Разработка тест-снсгемы молекулярной дна гностики полиморфизма гена ß-субъединнцы фолл икулостн мул пру ю ше го гормона (FSHB)

Для решения поставленной задачи нами была разработана система молекулярной диагностики полиморфизма гена ß-субъединицы фолликулостимулируюшего гормона (FSHB) с использованием метода ПЦР.

Система состоит из четырех этапов:

• подбор необходимых для проведения реакции олн гонуклеотидн ых прайм еров;

• определение температур но-временного режима проведения полимеразной цепной реакции;

• оптимизация реакционной смеси ПЦР;

• идентификация и интерпретация полученных результатов.

Для детектирования полиморфных аллелей гена FSHB были выбраны два ол и гон у к леотидн ых праймера, фланкирующие фрагмент длиной 525 п.о., содержащий внутри себя ретропозон.

Для проведения полимеразной цепной реакции был подобран состав реакционной смеси. Реакции проводили в конечном объеме 15 мкл. В пробирки объемом 0,5 смЗ (типа Eppendorf) вносили, соответственно, по 14 мкл реакционной смеси, состоящей из 1х ПЦР буфера (16,6 мМ (NH4)2S04; 67,7

мМ Трис - НСІ, рН = 8,8; 0,1 (v/v) Tween 20); 1,5 мМ MgC12; 200мкМ ди оксинукл еоз идтрифос фато в; 30 пмоль каждого из праймеров и 1 ЕД Taq -полимеразы; и добавляли 1мкл исследуемой геномной ДНК и сверху наслаивали 25 мкл минерального масла для предотвращения испарения.

Исходя из температуры плавления праймеров и типа ПЦР-прибора были определены температури о-временные режимы анализа: после начальной денатурации при 95° С в течение 5 минут выполняли 40 циклов амплификации в следующем режиме:

Температура Время

95°С 1 минута

5б°С I минута

72°С 1 минута

Для идентификации амплифицированных фрагментов ДНК использовали метод горизонтального гель-электрофореза (рис. 2). Электрофоретическое разделение проводили при напряжении 120 вольт в 2,2 % агарозном геле с добавлением бромистого димидия до конечной концентрации 30 мг/ см3 в буфере ТАЕ, после чего визуализировали ПЦР-продукты под ультрафиолетовым светом. Документацию результатов осуществляли, используя программу Bio Test.

АЛ АВ ИВ ВВ АВ ВВ ВВ

_ 525 п.о.

— 233 п.о.

Рис, 2. ПЦР- анализ вариантов гена ГЗКВ свиней

Верхний фрагмент, содержащий ретропозон соответствует аллелю А, нижний - аллелю В. Для генотипа АА характерно наличие одной верхней полосы, для генотипа ВВ * одной нижней. Гетерозиготный генотип АВ характеризуется наличием двух фрагментов.

3.2 Генотиппрованне свиней различных пород по гену РЗІШ

Результаты популяционно-генетических исследований свиней семи пород и помесных свиноматок по вариантам гена РБИВ представлены в таблице 1.

Свиньи характеризовались наличием трех генотипов АА, АВ и ВВ. Полученные данные показали высокую частоту генотипа ВВ, которая колебалась от 45,71% у свиноматок лнвенской породы до 100% у хряков породы дюрок. Не установлено животных, носителей генотипа АА в популяциях свиней пород дюрок, крупкой белой, белорусской мясной (ЗАО «Нарцнзово»), а так же у хряков черно-пестрой породы (РСУП

«Свинокомплекс Борисовский»), У других популяций свиней на долю животных с данным генотипом приходилось от 0,9 (у свиноматок крупной белой породы РСУП «Свинокомплекс Борисовский) до 20,2% (у свиноматок уржумской породы).

Однако даже в пределах одной породы, но в разных хозяйствах были выявлены значительные различия по распределению генотипов. Так в ЗЛО «Нарцизово» и РСУП «Свинокомплекс Борисовский» на долю животных крупной белой породы с генотипом АА приходится соответственно 0-0,90%, то в СГЦ «Ззднепровский» этот показатель равен 3,39%.

Таблица /

Частоты встречаемости генотипов гена Р8НН у свиней различных пород

№ п/п Порода, хозяйство. ПОЛ п Частота генотипа, % Генетическое равновесие

АА АВ ВО Xі Р

I Крупная белая', свиноматки 59 3.39 32,20 64,41 0 >0,05

2 Крупная белая1 в том числе: свиноматки хряки 155 1.29 1,94 96,77 0 >0,05

109 0,90 1.80 97.30

46 2,18 2.] 8 95,64

3 Крупная белая3 втом числе: свиноматки хряки 73 0 6.85 93,15 0 >0,05

63 0 6,35 93,65

10 0 10.00 90,00

4 Черно-пестрая1 втом числе: свиноматки хряки 1ІІ 1,80 1,80 96,40 0 >0,05

ко 2,50 1,25 96.25

31 0 3,23 96.77

5 Лив? некая , свиноматки 70 15,71 38,57 45,71 0,41 >0.05

6 Эстонская беконная5, свиноматки 15 6.67 6.67 86,76 0 >0.05

7 Эстонская беконная3, хряки 11 18.18 9,10 72.72 1.62 >0,05

Белорусская мясная1, хряки 7 0 14,29 85.71 0 >0.05

9 Дюрок'1, хряки 7 0 0 100,00 0 >0,05

10 Уржуме кая*1, свиноматки 89 20,20 19.10 60,70 0 >0,05

11 Помесные3, свиноматки 106 1,90 7.50 90.60 0 >0,05

'Крупная Белая: СГЦ «ЗаднепровскиП» республики Беларусь: 1 Крупная белая и черно-пестрая: РСУП «(Свинокомплекс Борисоаский»; ' Крупная белая, эстонская беконная, белорусская млсна*. Ак|рок и помесные свиньи: ЗАО «Нарцтоео» Республики Беларусь; и вене пая: ГШ «им. Георгиевского А, Си Орловская область, РФ; * Эстонская беконная с- К'. аЮжныЙ» Республики Беларусь; ь Уржумская; ГШ вМухимский» Кировская область РФ.

Частота встречаемости гетерозиготного генотипа АВ в исследованных выборках пород свиней колебалась от 0 до 38,57%. Статистический анализ показал, что все анализируемые популяции находятся в генетическом равновесии. Распределение аллелей гена Р5НВ в этих популяциях свиней представлено на рисунке 3.

1«% [ 90%

[ ао% 70% 60% | 50% ! 40% 1 30%

I 20% ■ 10% 0%

(0,977

0,973

0.966

0,900

0,690

0,860

0,805

0,700

0.550

0,550

/ / У / У У У

!Ь к

/ ^

/

■ АОВ

Рис. 3. Частота встречаемости аллелей в исследованных породах

Частота встречаемости аллеля Л колебалась от 0% у хряков породы дюрок до 45% у эстонской беконной из РСУП «Свинокомплекс Борисовский» Максимальной частотой встречаемости предпочтительного аллеля В характеризовались хряки породы дюрок, белорусской селекции.

33 Анализ генетической структуры популяции свиней различных пород по гену КвНВ

Для оценки генетического сходства исследованных выборок животных, был проведен кластерный анализ. Метод основан на критерии минимума генетического расстояния. В качестве переменных были выбраны частоты встречаемости аллелей гена Р5НВ (рис. 4).

Крупная ф*ла* 3 Ч.рио-п.стр.. 3

Длр» Крупная бяляя э Поыес* Э

Эстонская в*коыы*н Э

Эстонская вакомняя 5 Ур*сумск»я 6

0.1О «,19

0,25

Рис. 4. Дендрограмма генетических расстояний между 11 популяциями свиней по гену РвН В

Кластерный анализ показал наибольшее сходство между собой свиной пород эстонская беконная, белорусская мясная, дюрок, крупная белая и помесных свиноматок ЗАО «Нарцизово», которые образуют общий кластер с животными пород крупной белой и черно-пестрой РСУП «Свинокомплекс Борисовский». Несколько удалены от них свиньи уржумской породы ГПЗ «Мухинский» и популяции эстонской беконной из с.-к. «Южный», образующие общий кластер. Наиболее удалены от всех свиньи крупной белой породы из СГЦ «Заднепровский» и свиноматки локальной ливенской породы, разводимые в ГПЗ «им. Георгиевского А. С,».

3.4. Ассоциативная связь генотипов по гену РЗНВ с воспроизводительным» качествами свиноматок различных пород

Для изучения преимущества принадлежности к тому или иному генотипу по воспроизводительным качествам нами был проведен сравнительный анализ средних показателей за весь период продуктивного использования у свиноматок с генотипами АА, АВ и ВВ. Для анализа были взяты свиноматки двух пород: крупной белой (СГЦ «Заднепровский»), уржумской и трехпородные помеси. Крупная белая была выбрана, как самая распространенная в России и Беларуси порода. Она участвовала в создании ряда отечественных пород, в том числе исследованных нами уржумской и белорусской черно-пестрой. Уржумская является уникальной породой отечественной селекции, приспособленной к районам Предуралья, Анализ помесных животных представляет интерес при решении вопросов применения генетических маркеров в товарном свиноводстве.

Средние показатели реализации генетического потенциала по воспроизводительным качествам за весь период использования свиноматок крупной белой породы из СГЦ «Заднепровский» представлены в таблице 2. В исследованной выборке гомозиготы по аллелю А отсутствовали.

Таблица 2

Средние показатели воспроизводительных качеств у свиноматок

крупной белой породы с различными генотипами

АВ ВВ Разница

- .. x±Sx ВВк АВ

Многоплодие, ГОЛОВ • ] 1,52*0,40 12,17*0,58* +0,65

Масса поросенка л pit рождении, кг 1,34*0.06 1.40±0.05 +0,06

Молочность 37,32*1,83 58,32*1,99* +1,00

Голое при отъеме <45 дней) 9.13 ±0.3 7 9.32*0.21 +0.19

Масса гнеша при отъеме, кг 109,66*5,96* 106,71*3.90 -2.95

Сохранность поросят к отъему „ % 79,25 76.58 -2,67

*) Здесь и далее достоверность разницы в показателях продуктивности у свиноматок различных генотипов рассчитывалась ло критерию для непараметрических данных Уайта. Разность достоверна при Р<0,05.

Матки с генотипом ВВ по ИЗНВ достоверно превосходили гетерозиготных свиноматок (Р<0,05) по многоплодию и молочности. Установлена достоверная корреляционная зависимость между молочностью и принадлежностью к генотипу ВВ свиноматок крупной белой породы СГЦ «Заднепровский» (г=0,36).

Характеристика воспроизводительных качеств свиноматок уржумской породы в среднем за весь период использования приведена в таблице 3. Среди исследованных свиноматок помимо животных с генотипами ВВ и Л В присутствовали гомозиготы по аллею А, также включенные в анализ.

Таблица 3

Средние показатели воспроизводительных качеств свиноматок

уржумской породы с различным» генотипами

Пока]ател1| Генотипы Раїнииа В В

АА АО Ш) к АА к АВ

Многоплодие, голов П .55 ±0.39 12.16 + 0.85 12,58 ±0,32* +1.03 +0.42

Масса поросенка при рождении, кг 1,03 ±0,01 1.08 ±0,01 1.06 ±0,04 +0.03 -0,02

Молочность, кг 51.00 ±1,6) 51,14 ±0,85 50,55 + 0,94 -0,45 -0.59

Голоя при отъеме (60 дней) 7,05 ± 0.87 7.21 ±0,79 7,55 ± 0,25* +0,50 +0,34

Масса гнезда при отъеме, к( 115.81 ± 14.56 120,7® ± 16.71 122,54 ± 6,70* +6.74 + 1,76

Сохранность поросят к отъему, % 61.00 59,30 60.00 -1,00 +0.70

По многоплодию, массе гнезда и количеству поросят при отъеме уржумские свиноматки генотипа ВВ превосходили гомо- и гетерозигот по аллелю Л (Р<0,05).

Сравнение показателей воспроизводительных качеств помесных свиней из ЗАО «Нарцизово» гомозиготных и гетерозиготных по аллелю В не выявило достоверных различий между анализируемыми группами. Средние значения исследованных признаков у свиноматок обоих генотипов находились практически на одном уровне.

Анализ результатов индексной оценки свиноматок крупной белой породы С ГЦ «Заднепровский» показал, что более желательным является генотип ВВ, Количество животных с этим генотипом, имеющих индекс выше средних показателей «о стаду, составило 60,6%, что на 4,35% выше, чем у особей с генотипом АВ (56,25%) (рис. 3).

150 | 100 І 50

X X

о

-50

І

-150

-——-^-^г

Iі " » I

I і* 10 ЛО 30

- и

§ -50 «Г ^ ■ ♦

* вв ■ АВ

Ь)

Рис. 5. Распределение индексов (а) и процент свиноматок (Ь) с положительным индексом среди свиней крупной белой породы СГЦ

«Заднепропскни»_

Таким образом, свиноматки с генотипом ВВ как при индексной оценке, так и при оценке методами описателыюй статистики обладают лучшими показателями воспроизводства по сравнению с гетерочиготнымн животными.

Распределение свиней уржумской породы по индексам выявило максимальное число животных с отрицательными значениями среди свиней с генотипом АА. Анализ полученных результатов показал, что 50% свиноматок, имеющих гетерозиготный генотип, имеют индекс, превышающий средний по стаду (рис. 6). У свиноматок с генотипом ВВ этот показатель составил 44,4%.

100 £0

I

1 о

г

л м

3

І

Я

-100

♦ ♦

^ ю ♦ го зо

-

»

♦ вв

• АВ ' аа

а)

60

50 I 40

А

і 30

X 10

¿20 10 о

Ь)

□ ал

□ ав Швв

Рис. б. Распределение индексов (я) н процент свиноматок (Ь) положительным индексом среди свиней уржумской породы ГПЗ «Мух и некий»

Таким образом, анализ репродуктивных качеств у свиноматок крупной белой и уржумской пород с использованием как методов описательной статистики, так и индексной оценки показал, что свиноматки — носители ал л ел я А имеют показатели воспроизводства ниже, чем свиноматки, несущие В-аллель.

В результате проведенного индексного анализа помесных свиноматок из ЗАО «Нарцизово» установлено, что 70% свиней с генотипом ВВ имеют положительный индекс, что на 28% выше, чем у гетерозиготных животных {рис.7). При этом наибольшее число свиноматок с генотипом ВВ имеют индекс в пределах от 10 ло 60 и лишь треть имеют показатели воспроизводства ниже средних по стаду.

Вероятно, у помесных свиноматок различных генотипов значительно нивелируются различия в многоплодии и сопряженных с ним признаках, вызванные влиянием главных генов.

150 100 g so

! 0 i -so

j.uo

= -1S0 •200 -250

у

— • ♦

♦ ♦

_

♦ ее

• AS

Ямс. 7. Распределение индексов (а) и процент свиноматок (Ь) с положительным индексом среди помесных свиней ЗАО «Наршпово»_

Суммируя полученные данные, можно говорить о том, что ассоциативная связь аллелей гена FSHB с признаками, характеризующими репродуктивные качества свиноматок, проявляется четко лишь при чистопородном разведении. При скрещивании нескольких пород этот эффект, вероятно, сглаживается в результате проявления эффекта гетерозиса.

3.5 Сравнительная оценка комплексного влияния генотипов по генам р-субъединицы фоллнкулостимулнруюшего гормона (FSHВ) и эетрогенового рецептора (ESR) на воспроизводительные качества свиноматок

На многоплодие и другие воспроизводительные качества свиноматок влияет целый ряд ДНК-маркеров (ESR, FSHB, FSHR, NCOA1, OPN, RBP4, PRLR), но для практического применения необходимо знать эффективность использования одних ДНК-маркеров по сравнению с другими.

Ген, аналогичный по фенотип и чес кому проявлению гену FSHB, был ранее выявлен у свиней породы мейшан. Было показано, что различие в многоплодии у них связано с полиморфизмом по гену эетрогенового рецептора (ESR): матки с генотипом ВВ превосходили по многоплодию животных, гомозиготных по аллелю АА, в среднем на 1,5 поросенка по трем опоросам (Rothschild, et al„ 1994,1996).

Для характеристики пород свиней по частоте встречаемости аллелей генов FSHB и ESR был проведен кластерный анализ генетических расстояний (рис. 8).

Согласно рисунку 8 животные эстонской беконной и трехпородные помеси ЗАО «Нарцизово» встали в один общий кластер, что можно объяснить тем, что в процессе получения помесей были использованы свиньи крупной белой, белорусской мясной и эстонской беконной породы. Свиньи уржумской и л и вене кой пород формируют второй кластер к которому примыкают свиньи крупной белой породы из СГЦ «Заднепровский», что было показано при кластерном анализе по гену FSHB.

FSHB M ESR

Крупная 6»П8Я 1 Уржумская 6 Ливе некая Л Эстонская бенотвя 3

Помеси 3

0.10 0.1 S 0,20 0,15 о.ЭО 0.Э5 Гене1име«ие расстояния

Рис.8, Деидрограмма генетических расстояний между 5 выборками свиноматок по гену FSHB н ESR

Ряд авторов (Rothschild, et al, 1994, 1996; Хейн Ван дер Стии, 1998; Зиновьева H.A. с соант 2000; Гладырь Е.А. с соавт, 2002; Волкова П.В., Гладырь Е.А„ 2003; Кайлачакова О.Н., 2005) в своих работах многократно упоминали об использовании гена эстрогенового рецептора в качестве маркера плодовитости свиней. На основе данных Li Ning (2001) и материалов данной работы было выявлено положительное влияние В аллеля гена ß-субъединицы фолликулостимулирующего гормона на воспроизводительные качества свиноматок. Для изучения эффективности использования в селекции по воспроизводительным качествам свиноматок маркеров FSHB, ESR, и возможности их совместного применения был выполнен сравнительный анализ показателей воспроизводства свиноматок крупной белой и уржумской пород, имевших разные сочетания генотипов.

Анализ был проведен на свиноматках двух пород: крупной белой и уржумской. Уржумская представляет в этом плане интерес не только как уникальная порода отечественной селекции, но и как имеющая генетическое сходство по генам FSHB и ESR с животными ли венской и крупной белой пород. Следовательно, полученные закономерности на основе анализа эффектовности использования ДНК-маркеров плодовитости на свиноматках этих двух выборок можно применять и к популяциям, имеющим с ними генетическое сходство.

Для выявления лучших сочетаний изучаемых генов мы проанализировали многоплодие за весь период использования свиноматок по выявленным сочетаниям аллелей генов FSHB и ESR.

Многоплодие свиноматок крупной белой породы СГЦ «Заднелровский» в зависимости от принадлежности к разным генотипам по генам FSHB и ESR представлено на рисунке 9,

Многоплодие, голов

0,00 Р5НВ+Е8К

АВ-АА

АВ-АВ

АВ-ВВ

ВВ-АА

ВВ-АЗ

вв-вв

31 опорос 13 опорос

>в среднем за весь п«рисщ использований

і 12 опорос . - А- - в среднем за 3 опороса

Рис.9 Многоплодие свиноматок крупной белой породы с различными сочетаниями генотипов по гену РБНВ и ЕЗИ в динамике по опоросам

Наибольшим многоплодием характеризуются свиноматки крупной белой породы, имеющие генотип ВВ по двум маркерам, как в первом-третьем опоросе, так и в среднем за весь период продуктивного использования. Так разница между этим показателем у свиноматок с сочетанием генотипов АВ-АА и ВВ-ВВ составила в первом, втором и третьем опоросе, соответственно 1,00; 3,42 и 2,07 головы, а в среднем за весь период продуктивного использования 2,53 поросенка.

На рисунке 10 приведены данные по многоплодию свиноматок уржумской породы из ГПЗ «Мухинекий» в зависимости от их принадлежности к разным генотипам по генам ИЗНВ и ЕЭЯ. В исследованной популяции выявлено 8 различных сочетаний. Свиноматки с комплексными генотипами АА-ВВ, АВ-АА, АВ-АВ и АВ-ВВ встречались крайне редко.

Разница между многоплодием свиней с генотипами АА-АВ и ВВ-ВВ составила по первым трем опоросам 0,59; 2,14 и 1,28 поросенка, соответственно. В среднем за весь период продуктивного использования от свиноматок желательной комбинацией генотипов за один опорос получено на 0,95 поросенка больше.

Анализ этих данных однозначно указывает на то, что у свиноматок как крупной белой, так и уржумской породы двойные гомозиготы по аллелю В за весь период их использования стабильно превосходят животных, в генотипе которых преобладает аллель А. В зависимости от опороса и породы свиней это превосходство составляло 0,59 - 3,42 поросенка.

16,00 ИОО 11,00 10,00 ; в,00 6,00 4,00 1.00 0,00

11,50

' 11,» / ГУГ

Многмшади*. голов 12,17

13,00

10,92

11,00

I:

л'

Ш

9

£

г1

t

*

11,36

12,00

3

I

! КНВ*ЕЗД АМВ АА-В8* АВ-АА" АВ-АВ" А8-В8" ВВ-АА

12.20 | -К

I

12,00

! I

I

- 11,оо ;

10,00

9,00

ВВ-АВ ВЗВВ

□ 1 опорос ■ 3 опорос

•В Срзднач период ИСГТЗДЬЭ0В*Н№1

ВЗ! опорос - л • а средней )в 3 опс^ося

*) данные сочетания генотипов представлены I головой свиноматок **) данные сочетания генотипов представлены 2 головами свиноматок

Рис. 10 Многоплодие свиноматок уржумской породы с различными сочетаниями генотипов по гену Г81Ш и ЕЯ!} в динамике по опоросам

С целью детального изучения эффективности влияния этих генов на показатели собственной продуктивности мы проанализировали данные по воспроизводству свиноматок с генотипом ВВ по генам Р5НВ и Е5Я по отдельности к в сочетании за весь период продуктивного использования свиней. Результаты обработки представлены в таблицах 4 и 5,

Таблица 4

Средине показатели воспроизводства у свиноматок крупной белой породы СГЦ «Заднепровский» в зависимости от принадлежности к генотипам по

гвнв»

Генотип В В

Показатели но гену КйПВ но гену СБП гепв + вдк

(п-34) (п-13> (п=8)

Многоплодие, голов 12.17*0.58 11,96±0.54 13,«±2,10*

Масса гнезда при рождении, кг 16.69*0.81 16.37*1.11 18,23*3,40*

Количество голов в 21 день 9.57*0,21 9.55*0.14 8.93*0.63

Масса гнезда в 21 день, кг 58,32*1.99 57,95*2,07 57,03*6.87

Количество голов при отъеме 9,32*0,21* 9,14 ±0,20 8.92*042

Сохранность поросят к отъему, % 72.60 76,42 66.42

Из приведенных данных видно, что преимущество по многоплодию и массе гнезда имеют свиноматки желательного генотипа по обоим маркерам. Разница в многоплодии у этих свиноматок в сравнении со свиноматками генотипа ВВ по РЗНВ составляет 0,6 поросенка и 1,44 поросенка - со свиноматками генотипа ВВ по Е5И (при Р<0,05). При этом самая высокая сохранность поросят у гомозигот В по Е5Я, имевших меньшее многоплодие (табл. 4),

Следует отметить, что свиноматки желательного генотипа по гену Р5НВ имеют преимущество по молочности, достоверно (Р<0,05) превышая на 1,3 кг свиноматок с желательным генотипом по двум генам и на 370 г свиноматок с генотипом ВВ по гену Е5Я.

Данные, характеризующие воспроизводительные качества уржумских свиноматок за весь период их продуктивного использования, представлены в таблице 5.

Таблица 5

Средние показатели воспроизводства у свиноматок уржумской породы ГПЗ «Мухинский» в зависимости от принадлежности к генотипам по _маркерам Г8НВ и Е5К_

Показатели Генотип ВВ

по гену Г8НВ(п=44) по гену Е8ЇІ(«=12) Г8НВ + Е5Н

Многоплодие, голов 12,58 ¿«,32* 12,4±0.б 12-2±0,5

Масса Поросенка при рождении, кг 1.06 ±0.04 1,03±0.01 ].03±0.01

Молочность, кг 50.55 ± 0,94 53.3±и 53,5±1.б

Количество голов при отъеме (60 дней) 7,55*0,25 8.03±0.3 8Д7±0,4*

Масса гнезда при отъеме, кг 122,54± 6.70 140±8 14^10*

Масса поросенка при отъеме, кг 15,94 ± 0.65 17.1 ¿0,5 17,7і03*

Сохранность, % 60.00 64,75 67.80

По многоплодию и массе поросенка при рождении преимущество имеют уржумские свиноматки с генотипом ВВ по гену РЗНВ. У этих животных повышенное количество полученных поросят не приводило к снижению их живой массы при рождении. Однако сохранность поросят оказалась ниже по сравнению со свиноматками с генотипом ВВ по Е5К и по двум маркерам (60 против 64ч8 и 67,8%, соответственно).

Масса поросенка при отъеме у свиноматок с желательным генотипом по двум маркерам на 1,76 кг больше, чем у гомозигот В по гену РБНВ (Р<0,05). У свиноматок желательного генотипа по обоим маркерам обнаружена и высокая молочность - 53,5 кг, что на 3 кг больше, чем у свиноматок с генотипом ВВ по гену Р8НВ(Р<0,05).

Проведенный сравнительный анализ крупной белой и уржумской пород позволяет заключить, что выбор того или иного гена в качестве маркера зависит от целей селекции. Для свиноматок уржумской породы при необходимости проведения селекции на многоплодие достаточно проводить ее

по одному маркеру — по гену РЙНС. Если же необходимо улучшить молочность, сохранность и массу поросенка при отъеме, то лучше использовать в селекции 2 маркера.

При селекции свиноматок крупной белой породы по многоплодию и массе гнезда при рождении, а значит и массе поросенка, лучше использовать два ДНК-маркера - ген эстрогенового рецептора и ген р-субъединицы фолликулостимулирующего гормона. Если необходимо увеличить только массу гнезда к отъему и молочность свиноматок - достаточно провести оценку свиноматок по гену р-субъединицы фолликулостимулирующего гормона и провести селекцию с учетом желательного генотипа по этому маркеру,

ВЫВОДЫ

1. Разработана тест-система диагностики аллелей А и В гена р-субъединицы фолликулостимулирующего гормона с использованием метода ИЦР. Методика экспериментально апробирована на 703 головах свиней 1] популяций 7 пород и помесных животных.

2. Выявлен полиморфизм гена Р5НВ у свиней крупной белой, черно-пестрой, уржумской, л и вене кой, эстонской беконной, белорусской мясной пород, а так же помесных свиноматок. Частота встречаемости желательного аллеля В колебалась от 0,55 у хряков эстонской беконной породы до 1,00 у хряков породы дюрок. Доли предпочтительных генотипов ВВ варьировали в зависимости от породы от 45,71% (ливенская) до 100,00% (дюрок). Установлены большие межпопуляционные различия у свиней крупной белой (рп=0,805-0,977) и эстонской беконной (рв=0,550-0,900) пород. Все анализируемые популяции находятся в генетическом равновесии.

3. Кластерный анализ по частотам аллелей гена Р5ПВ выявил наименьшие генетические расстояния между породами свиней эстонская беконная, белорусская мясная, дюрок, крупная белая и помесными свиноматками ЗАО «Нарцизово», которые образуют общий кластер с животными пород крупной белой и черно-пестрой РСУП «Свинокомплекс Борисовский» (0,02-0,08), Наиболее удалена от всех пород популяция ливенских свиней (0,23).

4. Выявлены ассоциативные связи аллеля В гена РБНВ с показателями воспроизводства у чистопородных свиноматок (Р£0,05). В среднем по всем опросам достоверное превосходство свиноматок с генотипом ВВ над животными с генотипами АВ и АЛ составило в крупной белой породе (СГЦ «Заднепровскнй») 0,65 поросенка (ВВ>АВ), в уржумской породе (ГПЗ «Мухинский») - 0,42 и 1,03 поросенка (ВВ>АВ и ВВ>АА). У помесных животных не установлено влияния генотипа ВВ на показатели вое про извод ства.

5. Установлена достоверная корреляционная зависимость между молочностью и принадлежностью к генотипу ВВ свиноматок крупной белой породы СГЦ «Зад непро веки Й» (г=0,36).

6. Оценка свиноматок по индексу воспроизводительных качеств подтвердила предпочтительность использования в племенном свиноводстве животных-носителей генотипа В В по гену РБНВ, обеспечивающего превышение многоплодия, молочности м массы поросенка при рождении над среднепопуляцнонными значениями.

7. Оценено комплексное влияние генотипов по генам РБНВ и Е$К с использованием разработанной аналитической системы диагностики. Показано, что при отборе по двум генам в сочетании ВВ-ВВ установлено достоверное увеличение: многоплодия и массы гнезда при рождении у свиней крупной белой породы, и массы гнезда при отъеме у уржумской. Превосходство по многоплодию за весь период использования составило у крупной белой породы 2,53 поросенка (ВВ-ВВ>АВ-АА), у уржумской 0,95 поросенка (ВВ-ВВ>АА-АВ> на опорос,

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Лабораториям, занимающимся мол е кул ярно-генетическим и

исследованиями свиней рекомендуем использовать предложенную нами тест-систему.

Племенным предприятиям Российской Федерации и Республики Беларуси с целью повышения плодовитости рекомендуем проводить мониторинг популяций свиней по генам Р5НВ и ЕЗЛ с использованием предложенной комплексной аналитической системы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Гладырь Е.А., Использование гена фолликулостнмулирующего гормона бета-субъединицы (FSHß) как генетического маркера в селекции свиней / Е.А. Гладырь, Г.П. Державина, Е.К. Кунаева, Г,Т, Сафина, H.A. Зиновьева// Материалы межвузовской научно-практической конференции студентов, аспирантов и преподавателей аграрных вузов РФ. - М.: РУДН,

2005. - с 144-146-(Сб. материалов конференции).

2. Зиновьева H.A., ДНК-маркеры как рычаг повышения многоплодия свиней/ H.A. Зиновьева, Е.А. Гладырь, О.В. Костюнина, K.M. Шавырина, Е.К. Кунаева // Промышленное и племенное свиноводство. -2005. - N 5. -С. 18-21.

3. Кунаева Е.К., Влияние полиморфизма гена бета-субъсдиницы фолликулостимулируюшего гормона на воспроизводительные качества свиней / Е.К. Кунаева, Е.А. Гладырь, Г.П. Державина, Г.Т. Сафина, H.A. Зиновьева !! Методы исследований в биотехногии сельскохозяйственных животных, Дубровицы, 2005. - с.94-99 - (Сб. материалов школы-практикума, под ред. профессора, доктора биологический наук Зиновьевой H.A.).

4. Кунаева Е.К., Использование гена фолликулостимулируюшего гормона бета-субъединицы (FSHß) как генетического маркера в свиноводстве / Е.К. Кунаева, Н.А.Зиновьева, Е.Л. Гладырь, Г.П. Державина И Молодые ученые в решении актуальных проблем современной науки. - Чебоксары, Изд. ЧГСХА, март 2006 г. - с.204-206 — (Материалы межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов),

5. Зиновьева H.A., Методы маркер-зависимой селекции / H.A. Зиновьева, Е.А. Гладырь, Г.П. Державина, Е.К. Кунаева // Животноводство России. -

2006,-№5,-С. 29-31.

6. Кунаева Е.К., Использование гена фолликулостимулируюшего гормона бета-субъединицы (FSHß) как потенциального маркера воспроизводительных качеств в свиноводстве / Е.К. Кунаева, Е.А. Гладырь, Г.П, Державина, H.A. Зиновьева // Чебоксары: ЧГСХА, 2006. -с. 269-272. (Материалы Всероссийской конференции, посвященной 75-летию со дня открытия Чувашской государственной сельскохозяйственной конференции).

7. Кунаева Е.К., Повышение эффективности селекции свиней с использованием генов FSHB и ESR / Е.К. Кунаева, Г.П. Державина, Е.А, Гладырь, Е.П. Кудина, H.A. Зиновьева //Зоотехния. - №4, - 2007, - с. 1619.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1 -00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 27.04.07. Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,32 Печать авторефератов (495) 730-47-74, 778-45-60