Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и получение донорского противопаротитного иммуноглобулина

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и получение донорского противопаротитного иммуноглобулина"

... А ^ *

ч

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР ТОМСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВАКЦИН И СЫВОРОТОК

На правах рукописи

БОГДАШИНА

Елена Васильевна

РАЗРАБОТКА И ПОЛУЧЕНИЕ ДОНОРСКОГО ПРОТИВОПАРОТИТНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА

03.00.06 — вир'

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ТОМСК 1991

с\ А^/рр

Работа выполнена в Томском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте вакцин н сывороток.

Научный руководитель: доктор медицинских наук IН. Б. Альбицкая(

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор 3. М. Землякова

кандидат медицинских науг, старший научный сотрудник Г. М. Ратнер

Ведущее учреждение: Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича.

Защита состоится —» 1992 года в_ час.

на заседании Специализированного совета К 098.11.01 по присуждению ученой степени кандидата наук при Томском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте вакцин и сывороток (634050, г. Томск, пр. Ленина, 32).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Томского ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского института вакцин и сывороток.

Автореферат разослан « 1991 г>

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат биологических наук Л. Н. Полещук

""ТВугултьяост?-. стюблр'яя. Создание иовн:: ч говнзенве эффективности оупетсвугщнх специфических пмчунопрепапатов для профилактики и терапии инфекционных заболеваний остается актуальной проблемой современного здравоохранения. Это касается п эпп-демического паротита (3F1 - чшроко распространенной вкруснэЯ инфекции, характеризующееся 3ucoxot контагпозностьп и очаговостью (В.'Л.ЕолотовскнП с соавт., 1983; А.П.Казаьпев, 1983, D.Isaacs , 1990). В СССР до начала массовой вакачног;ро>лзктйптт эпидемическим паротитом ежегодно болело свыше 1 "X . челоЕок (В.'З.Гопов с соавт., 1973; Г. 5,Лазпкова, 1977). Вследствие высокой неЧротрогности вируса ЭП и трспяостп его к железистой ткани, при паротите практически всегда в то:5 иди икоЗ с. .пони возникает поражения центральной нервно.1 систегты, подг.елудочной и половых желез, паренхиматозных органов. Тяжелые манифестные фор:,ты ЭП (ке.'шнгиты, менингоэщефалиты, орхлтн, панкреатиты) зачастую приводят к развитию резидуалышх явлений, имеюпзи большое социальное значение (Г.А.Тимофеева с соавт., 1983; В.И.Бельд'/Л'с соавт., 1987: А.СЛартинкин с соавт., 1937;

B.Н.Тимченко с соаьт., 1987; НЛПегшзпп , 1980; v.r-rinz , 1981; A.statz., 1983).

Существенной uiepoi, снит.акпей заболеваемость ЭП, является взкпичопрогилгктпка детей .тавоЛ паротитной культуральной вакци- . ной лз стажа Ленинград-3. Однако, несмотря нг ее проведение, заболеваемость остается в настоящее время на довольно высоком уровне, что связано с многочислегашми отводами детей от вакцинации по медицинским показаниям и формированием среди населения значительной (до 2СЙ и более) неиммунноР прослойки (В.П.Сергиев,

C.Г.Дзагуров, 1984). Кроме того, некоторая часть привитых не мо--••ет ответить на ва'ппшапип выработкой полноценного иммунитета

в силу чндгвидуальннх, генетически обусловленных особенностей пгпуиного реагирования (Р.В.Петров, 1931). Массп&я лммунира-шш детеЛ, чарлду с нэссмнен-'of пользой, приводит к появлению больной популяции взрослых ляп, не имеющих естественного иммунитета, у которых лри заболевании наиболее вероятно развитие ос-лепнвний ( L.Winserson , 1982; A.Gray „ 1988).

Элективным средством профилактики л лечения менингитов, менингоэшефалитов, орхитов и других тяжелых форм паротитнсД инфекпии мог бы стать донорский противопаротитнчй иммуноглобу-

шя, особенно для больных о иммунодефшштнимл состояниями и угрозой снижения, шмунигета. Коммерческие протьвопаротг.тпне

ИММуНОГЛОбуЛПНН "РагЪиИп ", "Рвг-§вшаа " И другие Выпускаются рядом зарубе.тных фирм, и широко используются в клинической практике (В.-Л.Русанов, Л.Ч.Скобелев, 1983; У.Соре1от-1с1 , 1979).

В нашей стране аналогичный специфический иммуноглобулин отсутствует. Создание такого препарата и явилось главным направлением настоящей работы,

Гропесс получения сгетаф'/ческих иммуноглобулинов обычно предполагает вакцинацию доноров соответствующими антигенами по специально разработанным, безопасным схемам. В этой связи значительней интерес в практическом и научном плане представляют исследования состояния функциональных систем организма, а также особенностей иммунологической реактивности доноров иммунной плазмы.

Цель и задачи иоследоранил. Целью яастолгцего исследования являлись научное обоснование а разработка путей создания нового специфического препарата - донорского противопаротитного иммуноглобулина .

В соответствии с поставленной целью были определены конкретные задачи работы:

1. Обосновать и разработать способ получения иммунной про-тивопаротитней плазмы для изготовления специфического иммуноглобулина.

2. Исследовать влияние живой парститной культуральной вагатинн из штамма Ленинград-З на функциональные скотеш организма допоров, привитых с целью получения иммунной прстивопаро-титной ПЛЕЗМЫ. -

3. Изучить'особенности иммунологической реактивности привитых паротитной вакциной.

4. Получить &кспернмептально-прзгвводственнце серии противопаротитного иммуноглобулина человека.

Научная новизна. .Впервые разработан способ получения иммунной донорской плазмы для изготовления противопаротитного иммуноглобулина; научно обоснована целесообразность направленной вакцинации доноров паротдтной вакциной.

Изучена эффективность различных схем вумунязашш допоров жпв£й паротптгой культуральной вакциной из птамма Л-З. 1токпза-

но, что однократное введете паротнтноА вакпины в лсзе 0,5 мл является оптимальным, так кав. фор?.гпрует высоки Л уровень специфических антител и безвредно для организм? привитого.

Проведен сопоставительный анализ различных серологических 'Авторов выявления паротнтнпх антител в сыворотке крови; выявлена высокая чувствительность и:.г.7ноферчентчого анализа и реакции тор'лочянкл гемагглгатиигции. Эмпирическим путом установлено, что при представлении результатов титрования в Биде отрицательных натуральных логарифмов, зависимость Me-jciy ними приобретает липзГ;ныГ; характер п мояет быть выражена липвГшыми уравнениями .

Впервые с использование».* комплекса современных метоттов изучены особенности иммунологической реактивности взрослых, привитых яиво?. паротптно^ вакцино*. Поствакшшальнн^ период характеризуется активацией системы неспещфпчесг.ой резистентности II этапностьп кзменени.1 со стороны плеточных и гуморальных реакций иммунитета. На 7-21 сутки отмечено снижение относительного содержания Т- и В-лглйохитов и их функциональной активности в ответ на поллклональные митогенн, уменызенЕе антигенспе-шйлческой проли$ерашш лготроцитов. Через 5-6 педель после прививки, наряду с нормализацией боль'пинства показателей клеточного иммунитета, в организме привитого формируется напряженны;! гуморальный специфический инмунптот.

По результатам работы охормлепа заявка на изобретение "Способ получения противопаротнтного иглошоглобулина" (й 4944558), новизна заявляемого реппзния подтверждена приоритетной справкой ВНШГГЭ от 13.Ой.91 г.

ГрагУпчесчая значимость влботк. Получены три экспериментально-производственные серии нового препарата - пг.^гупоглобу-лина противспаротитного человека, обладающего высокой специфп--ческо.1 активностью (тнтв паротктных антител в FiTA - 1:320, в рээкпкп ясПтралпьлпяп - 1: 32 ). Tic физико-хг'-.^чеекпм и ш-дик^-биологическ'.ъм свойствам препарат соответствует вссл требо-' впнпям, предъявляемым к иммуноглобулинам для парентерального введения.

На противопарститний ягя«уиоглобу-2Н офорилена нормэтпвно-тохлическая докумсптатцш - Временная ЗармэкопеЛная Статья и Инструкция по применения.

Материал! с зусо. j. z -/го.тгкческо'! yJfeKTimKocwi твоЪ паротитней: \ вшишг d ¿ззе 0,5 мл для взрослых был j использованы при ооо. чпл&ачп изменения в "Инструкцию по применению живой поротое .ja .»уль*/ « ильной вакцины пз шташа Л-3", каезчзщо-гося вакринй. :i в пре$; .тактических полях подростков и взрослых, но приьптнх :: не Оолвзтшх паротитом, утвержденного Комитетом медицинских : г..'л,/!ю0яологкчоск1х препаратов МЗ СССР 23.10.91 г.

На защну "ичосятсп сл-".";но'",'1° положения:

1. ОбосноЛипс спосооа получения иумушюй противопаротит-ной плазмы fju; изготовления специфического пл?»1уноглобулпна.

2. Есг-'.".,опос_ч однократной инъекции яшвоЯ паротитной вагцпна в 0,5 гл (ЮОСО ГЛДЬ50) для организма допоров, направленно твитыт: с целью получения специфического иммуноглобулина .

3. Кос. -овашш особенностей лимнологической роактявпсстя доноров, пт-1 ти живой гаротиткон вакплио'З.

Апроб-n л .работы. Результаты работы доложены и обсугдеш на научно-*-,- "тичоских конфоренцчях ТомНШВС в 1988 и 3989 гг., а также не оодании Всесоюзной проблемкой комиссии АМН СССР "Корь, кра' паротит" в 1990 г. а Гешшграде.

Лубликиция результатов исо.пдловачия. По материалам диссертации опубликовано 3 научпне статьи; оформлена заявка на изобретение ''Способ получения протнвопар 'тптного иммуноглобулина" 4Э«М558, приоритет от 13.СЮ.91 г.).

Объем я структура работы. Диссертация изложена па 118 страницах текста (без описка литература), включает Грисунков и 10 таблиц. Работа состоит кз введения, обзора литературу, 3 гла" собственных исследований, обсудцёшш результатов и выводов. Библиография-содержит 90 работ отечественных я 94 - зару-беглшх авторов. .

Выражаю искреннюю благодарность научном/ руководителю, доктору медицинских наук Н.Б.Альбицкой, сотрудникам дабораторип экспериментального производства, донорского отдела IMS! вакцин л сывороток НПО "Вирисн" и лаборатории детских вирусных инфег,-пий ПИИ вирусных препаратов АМН СССР (зав.лаб, - проф. В.Л.Ля-ао.чко) за помощь в выполнении различных разделов представленной работы.

Материалы it метопы. Для направленной вакцинации доноров •

при получении прогивопаротитного иммуноглобулина применяла коммерческий препарат - живую паротлткую культуральяую вакцину из аттенуирозанкого штамма Ленинград-З производства Московского НИИ вирусных препаратов А'Я СССР. В работе использовали серпа вакготаы К® 0526, 0398, 0424, 0325, доза препарата составляла 0,5 мл,. '

Подбор контингента доноров-добровольцев осуществляли в соответствии с "Инструкцией по медицинскому освидетельствовать доноров крови" (1978). Для вакцинации отбирали лиц мужского гола в возрасте 16-22 лет, однотипных по физическому развитию п условиям проживания.

При изучении возможности использования плазмы направите доноров для производства противопароткткого иммуноглобулина титры специфических антител определяли в крови 1060 доноров в возрасте 18-55 лет, не вакцинированных против паротита.

Исследовали специфическую активность 134 коммерческих донорских иммуноглобулинов (120 серий нормального'донорского иммуноглобулина и 14 серий иммуноглобулинов против клепевого гчпефаллтэ и .'противогриппозных) производства НПО "Барисн".

В хода разработки оптимальной схемы направленной иг.мунизз-ЕГ.Л доноров и получении гротивопарститного Иммуноглобулина проведены наблюдения 268 привитых в динамике. С целью выявления латентных субклинических реакций и опенки безвредности вакцинации наблюдения включали тщательный врачебный контроль, опроо, осмотр, термометрию, взятие проб крови до прививая я на 7, 21, 42 сутки после иммунизации,

' Специфические паротитяне антитела в сыворотке крови определяли с использованием четырех серологических методов: иммуно-фермоптяого анализа, реакции торможения гемагглютинапии, реакции радиального гемолиза я реакции нейтрализации. Результаты выражала в титрах и в виде отрицательных логарифмов по основанию 2 ( iog2 ) • Иммунофермеитннй анализ (ИМ) ставили по классическому варианту в обьеме 100 мы. В качестве имчуносороектя были применены 96-луночные пластиковые шинпгатн, сенсибилизированные коммерческим антиге"ом вируса паротита ("virion ФРГ) и стандартным антигеном, изготовлениям в Московском НИИ вирусных препаратов A.'5î СССР. Постановку рчзкпни тормскепия гемаггллгпнают (РТГА) осуществляли мгкрометодом (В.З.готяя,

1984) с 2 ГЕ паротнтного дпагностикума для РТТЛ ЛанНИИЗМ км. Пастера. Реакцию радиального гемолиза (РРГ) проводили по методике, описанной Г.Боллекс с соавт. (1936). Реакцию нейтрализации (РН) ставили на однослойной культура клеток перевиваемой линии " Vero ", учитывая результаты по подавлению гемадсорбпки (А.ТС.Щубладзе, С.Я.Гайдамович, 1954).

Состояние иммунной системы привитых оценивали с использованием комплекса современных игмунологических методов (JÍ.B.Ko-вальчук, А.НЛерадоив, 1990). Количественное содержание Т- и В-лимЬоцитов определяли по методу Ji.Jondol (1976), функциональную активности лимрсцитов исследовала в реакциях митогенчнду-цированпой и антигенспзцифичоской бластной трансформации (В.В.Хоробрых с соавт., 1983). В качество полпклоиалыюго активатора Т-лимфоцитов использовали фитогемагглютинин ("serva ") в концентрации 25 мкг/мл; для стимуляции В-лпм.роцитоз применяли митоген лаконооа ("Sei-va ") в конечной концентрации 2 мкг/мл. Реакцию антигенспецифической бласттранс^ормации проводили с применением паротитного диагностккума в конечном разведении 1:256. Цитотонспческую активность лимфоцитов по отношению к перевиваемой клеточной линии К-562 исследовали в соответствии с высокочувствительной техникой тестирования, предложенной И.П.Рыковой с соавт. (1981). Концентрата сывороточных иммуноглобулинов классов М, С, А определяли методом радиальной им-мунодиЗЛузии- в агаре по G.Usnohini (1968).

Гематологические методы включали об:гц;й клинический анализ крови: определение кошентрапии гемоглобина в 1 л крови, подсчет количества эритроцитов и лейкоцитов, исследование лейкоцитарной формулы (процентного соотношения лимфоцитов, моноцитов, эозинофалов, базофилов, сегментоядарных и галочкоядер-ных нейтрофплов), определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ) в миллиметрах за час.

Определение, содержания общего белка, билирубина, ферментативной активности /-амилазы, аспартат- я алашшампнотранс-фераз, гашаглутаигалтрансфарази в сыворотка крови, постановку тимолог1й пробы проводили при помощи коммерческих наборов химических реагентов Бпо-Ла-Тест ("Лахем«", ЧССР).

Бее исследования по разработке и получению донорского противопаротиты'ого иммуноглобулина проведены под контролем со-

ГТ

держания нъз -антигена и ГЛП-антител в донорских сыворотках, иммунной плазма и готовом препарата.

Полученные результаты вираяали з Международной Система .Единиц СИ.

Математическую обработку результатов (вычисление математического ожидания средней с ошибкой, факторный дисперсионный анализ) проводили, используя оригинальный пакет прикладных статистических программ, совместимых с программой "

для ИБМ-ЭБМ.

РЕЗУЛЬТАТА И ОБСУЖДЕНИЕ

' Сопоставительный анализ сгрологнческях методов выявления паротитных антител. Немалова%ш:м моментом получения новых специфических гомологичных препаратов (рекомендации ЕОЗ, 1983) является выбор и характеристика адекватного метода определения специфических антител в донорских сыворотках л готовом препарат э. Специфическую активность определяли в пробах сывороток, взятых до прививки (фон) и после вакцинации. Использование ИМ позволило выявить паротитные антитела У '46е' доноров,. „ РТГА и РРГ - у 41/5 доноров, тогда как по данным РЯ серопозиспв-ными до вакцинации были только 12,? обследованных» При исследовании поствакцннальных сывороток методом П5А процент серополо-гл^ельных результатов составил 1001, специфические антитела были выявлены в разведении 1:61440, антигемагглзз' иншш в этих йе пробах обнаружены в разведении сыворотки 1:320, нейтрализующие антитела - в разведении сыворотки 1:256. ргакция нейтрализации, по сравнении с остальными методами, характеризовалась наиболее низкими значениями ссропознтлвянх результатов яри исследовании поствакцинпльных -проб (92$).

Такал образом, наиболее чувствительным из использованных методов оказался :г.г?уноферментгс'Л анализ, что мояет быть обусловлено идентификацией в чем антител к различиям антигенным детерминантам зпруса паротита.' Ислутопяыв материалы сопосгавл-мы с данными некоторых зарубе:-шнх последователе»-. (в.РеЛоуа et я1. . 1987; К.Овак! ее а*. . 1989).

Представлялось интересно-! изучит?, взаимосвязь между результатами, полученными в реаюлга нейтрализации, являпдейся наиболе- информативным методом и отра аюлдей резистентность организма п вирусу эпидемического паротита и результата''™

РТГЛ, ИМ, ?РГ.' Вычисление парных коэффициентов корреляции показало, что'степень связи мд.зду результатами невелика, а мак-оьмалыше значения коэффициента корреляции отмечены мезэдг ИМ и РН ( г =+0,4 р^0,С5). Эмпирическим путем удалось установить, что при представлении результатов титрования з виде отрицательных кату читьных логарифмов, зависимость мэяду дан hip,та РН и ИМ, РН г PITA, РН и РРГ приобретает линейный хзрактер и можот быть Елраг.ена лине'шыш уравнениями типа у=ах + в, где у - титр нейтрализующих антител, представленный в виде отрицательного натурального логарифма, ах- титр антигемагглю-тининов, гемол?зинои, либо И'5А - антител в исследуемой пробе.

Ра,зработ-"а способа получения иммунной нлотквопатотитной плазмы. Иммунную донорскую плазму для изготовления специфических йг-глуногдо^улинов можно получе ть несколькими методам: направленны;.! с- алогическим скринингом донорской крови, тчтрова-нпем и отборе коммерческих препаратов иммуноглобулинов, однако чаще испол ?уот активную пк^ккзашш доноров (Н.В.Холчев, lS76-vH.B.Ji,CM дова, 1987; Н.Б.Алъбидкая, 1989).

Среди С', тздозанного взроспого населения, иевакцанировап-пого в отно"<паротита, серореготивкыми оказалось 31,2% (титр антител, г.о данным РТГА менее, чем 1:10). У 30,2?? доноров выявлен минимальный .диагностический титр - 1:10, у 21,85? титр антител составил 1:"0, у 6,8$ - 1:40. Высокий уровень специфических антктол (1:80 п 1:160) отмечен ликъ у 2$ всэх •обследованных. К категории шмуноакт^вных доноров нами были отнесены липа, содер-кщио антитела в титрах," соответствующих защитного (1:20 п выше в РТГА) (Т.Р.Захарова с соавт., 199С). Таким образом, большая часть способного к донорству населения (69,451) не имеет в крови паротитпых антител дате в защитных .титрах, то есть не является пкчуноактивяой. Преобладание ореди иммунных доноров лап с минимальным защитным титром (1:20) ограничивает возможность использования их плазмы для получения противопаротитного иммуноглобулина, так как может привести к снижению активности готового препарата.

Изучении коммерческих препаратов иммуноглобулинов показало, что содержание паротитннх антител в них невелико и значительно варьирует. Максимальный выявленный ти?т> антител, соот-ветегаупцлй 1:80 в РТГА, обнаружен только в 14,1$ всох иммуно-

о

глобулинов; в остальных препаратах содержание Еаротатнн* аятть-тел било меньше. При это?* в 9,5? всех серий сгещфпесше ая-титсла отсутствовал».

Полученные результата о незначительно! величине иммунной, прослойки к вирусу ЗП среди взрослых ляц п небольшом содержании паротиткнх антител в вхш?ерческих препаратах и\«уноглобу— личоз послужили обоснованием необходимости направленного антигенного воздействия ва организм допоров при получении противо-гаротитного гг'1^уноглобулзна.

Предложены н апробированы три схемы направленно!! и-тмуни-ззтши. доноров ютеой паротитной вакциной пз штамма Я-3, приют-пяемой для вакципопрофилактики ЭП у детей: схема Е 1 - однократное введение паротитной вакцины в дозе 0,5 ил (10000 ГАЛЕзд) (привито 60 человек); схема Л 2 - двукратное введение епкгцны го 0,5 ».и с "нтервалотя 14 суток (привито 36 человек); с::ег.-а Г? 3 - двукратное введение вакцины'но 0,5 мл с интервалом 30 суток (привито 32 человека). При выборе дозн и кратности введения препарата мн руководствовались данными литературы о безвредности доз паротитной ваяпины, содержащих 20000 и 40000 ШЕ5С (Н.П.Граяданов, З.О.Готтов, 1981), а при определения интервалов ме^ду иньекштага препарата исходили пз теоретических предпосылок развития иммунного ответа на антигенный стимул. Врачебное наблэденив за прявтттнми показало, что как однократное, тая и дгукратпое введение живой паротитной вакпинн донорам не сопровождалось развитием каких-либо местных я выражении* общих реакций а являлось практически ареактогенкым. Наибольшая эффективность обнаружена у схем И? 1 и 3 (рас.1 а, б). Через 6 недель после окончания вакциначии выход привитых в и?.эдуноак-тивние доноры составил по этим схемам соответственно СО,2 и 100*, а средняя геометрическая титров антител достигала Б,5 и 6,3 1о,%2' Однако при сравнении этих двух схем ггггдпочтитель-нее оказалась схема № 1, предполагавшая однократное введение вакшнн в дозе 0,5 мл, вследствие того, что сна болов щадязая для организма, достаточно короткая (высокий уровень антител отмечен уже через 4-6 недель после вэкплвагая), а также требует меньпего расхода вакцины, что особеню гря массовой иммунизации в процессе протззодстйгклого вкгуекя препарат"..

Таким образом, в качестве ооиогпс;! с/ят получения игс.гуя-

б)

0 7 сут. 21 сут., 6 нед. 3 мае,

Т

Рис. 1. а)Динамика содержания парогиткых антител (М±пг) б) выход в Ешуноактивные доноры {%) среди привитых по предложенным схемам. На оси абсцисс - период наблвдения, на оси орцинат-а)средная геометрическая-титров в logo , б)процент йьлуноактивкых доноров. 1 - схе'.л 1Ь 1, 2 - схема № 2, 3 -схема i 3.

ной протгвопаротптной плазмы предложено однократное введение донорам живой паротитной вакцины из шташа .1-3 в дозе 0,5 мл с последующим взятием крови через 5-6 недель после вакцинации. -

Углубленное изучение состояния основных функциональных систем организма привитых позволили установить незначительность побочного воздействия паротптной вакцины. Аппликация вакцины, практически не влляя на состояние "красной крови" (содеряание эритроцитов и гемоглобина), индуцировала статистически значл-ыыз изменения числа лейкоцитов. На 7 сутки после прививки выявлено значительное повышение процентного содержания моноцитов (17,5*2,1^, р-^О.Об^а через 6 недель - увеличение относительного числа лимфоцитов (44,1-2,3;"?, р^-0,01). Иакбопее характерным изменением со стороны периферической кроЕИ было повышение • средних значений СОЭ до 14-15 мл/ч ка 7-21 сутки, впоследствии снизившиеся до фоновых величин. Транзиторный, кратковременный характер изменений гематологических показателей позволяет рассматривать их, как свидетельство активирующего влияния живой паротитной вакцины на систем неспецпфической резистентности привитых, подтверждает высокие адаптационные возможности взрослого организма при контакте с ;гивой гирусной вакциной.

Исследования биохимических показателей сыворотки крови привитых не выявили каких-либо достоверных, вых. дящих за пределы возрастной физиологической нормы отклонений активностей аспартат- п аланпяаминотрансфераз, геммаглюташлтрансферазы и '¿-амилазы. Показана стабильность содержания общего оелка и билирубина на всех этапах наблюдения. В целом, можно заключить, что однократная иммунизация взрослых живой паротитной вакииной в дозе 0,5 мл не вызывает метаболических и функциональных нарушений в системе гемопозза, со стороны печени, поджелудочной келезы и безвредна для организма привитых-.

Особенности имт.тукологпческой реактивности привитых. Б связи с тем, что рцп вирусов (кори, гриппа, паротч а и др.) обла-г даг.т тропностью к лнмфондно,. ткани и их аттеьушгая^не всегда сопрово'цгается утратой имчукомодулирующей активности (Б.Ф.Симонов с соав^., 1989; К.йсСЬеспе/ , 1986, 1937) актуальным, на наш взгляд, было изучение особеннг-.тей иммунного отвота на живую паротитнув вакцину из шташа Л-3.

Однократная инъекция вакцины в дозе 0,5 мл приводила к

активации гуморального звена юлукяого ответа. На 21 сутки после прививгм средняя геометрическая тктров антител в группе привитых составила 4,5 к 0,4 Xog2 , а через 6 недель достигала максимальных значений - 5,5 + 0,4 1оз2 (рис.2), оставаясь на. том же уровне в течение 3 месяцев (период наблюдения). Повышение содержания в крови иммуноглобулинов классов А и М обнаружено на 21 сутки, а увеличение концентрации (18,8±0,2) г/л, (р^ 0,01) - через 6 недель поело иммунизации.

Рис.2. Динамика антитолообразовашш у доноров, привитых кипой паротгтной вакциной. По оси абсписс - период наблюдения, по оси ординат - средняя геометрическая титров антител, (СГТ), ioe2 ,

Изучение показателей клеточного иммунитета позволило установить некоторое снижение численности основных субпопуляций иммунокомпетвнтных клеток на 21 сутки. Относительное содержание Т-лимфоиитов в этот период составило 29,4+5,0л, процентное содержание В-лимфоцктов - 23,7+2,1Í. Через 6 недель после прививки относительлоо и абсолютное количество Т-клеток значимо возрастало ((49,5+3,52), (1,6±0,09)-109дь тоща как численность В-дт£о1штов оставалась достоверно пониженной.

На 21 сутки после пививки обнаружено достоверное, пб сравнению с фоном, уменьшение пролифератигной активности лимфоцитов. Индекс стимуляции (ИО) Т-лшлфоцитов составил 5,9+1,5, В-лимфо-цитов - 3,3+1,1. Через 6 недель значения КС как Т-, так и В-лимфоцитов возросли до первоначального уровня (10,1+1,8 и 4,п±-0,6 соответственно).На 7 сутки после иммунизации снизилась про-лиферативная активность лимфоцитов в реакции антигенспецифичвскоЙ бласттрансформации. ИС составил в этот период 1,67+0,18, а на 21 сутки и через 6 недель его значения возросли до 3,02+ 0,37. Полученные результаты соответствуют данным литературы, свидетельствующим о снижении численности и функциональной активности имму-ноксмпетеитннх клеток под влиянием живых вирусных вакцин( С.Н.Ьу-ковская, 1989; Р.АгпеЬогп , 1960; A.Fagraeus 193¿) , однако, по-видимому,не могут быть отнесены за счет иммунодепр-зссигного действия вакцины. Этой интерпретации противоречит как времен- ■ ный характер угнетения показателей клеточного иммунитета , так и выявленная активация гуморального звена иммунного ответа, сопровождающаяся продукцией специфических антител. Скорее всего, под воздействием вакцины происходит аппвная взръ&шя лпм1онатоа е центральные органы иммунной системы; высказывается мнение об усилении пролиферации в !* рус специей че с ких супрессоров на ралних этапах иммунного ответа (G.Ada , 199U*

Учитывая важное значение субпопуляцки естественных киллер-пых клеток в противовирусной резистентности организма ( G.Lopea et al., 1984; R. Welsk , 1985 ) , проведоно изучение цатоток-сической активности ЕКК у привитых паротитной вакциной. Не было выявлено каких-либо достоверных, отличных от контрольных величин, изменений цитотокспчноста киллерных клеток, что косвенно свидетельствует сб отсутствии диссеминации вакцинного вируса, подтверждает безвредность живой паротитной вакцдны.

Комплексная оценка иг.з/унобиологической реактивности привитых с использованием факторного дисперсионного анализа позволила установить увеличение числа достоверных связей мезду уровнем антителоооразования и некоторыми клинико-лабораторпыми показателями на 7 сутки вакцинации. В этот период с уровнем антител коррелируют гематологические показатели: COI, количество лейкоцитов и моноцитов. На более гозднпх птапах наблюдения 21 я 4У. сутки количество значимых коррелята;! вновь снижается,

достигая исходного, доьакшшальното уровня, причем преобладающими оказываются показатели, отражающие состояние ютлунпой системы организма (концентрация сывороточных иммуноглобулинов А и G-, индекс стимуляции в антигенспепифической РБТЛ). На наш взгляд, динамика формирования корреляционных взаимосвязей ма-аду исследуемыми показателями отражает этагы адаптационной перестройки организма, выход на ноеый гомеостатический уровень, соответствующий становлению противовирусного иммунитета.

Таким образом, комплексные биохиотческис, гематологические и иммунологические "'.сследования, проведенные в динамике вакцинального процесса, гозволшш подтвердить безвредность живой паротитр:ой вакцины для основных функциональных систем организма, отсутствие у препарата Емглунодепресс-ивных свойств, доказали высокую иммунологическую эффективность вакцины при иммунизации взрослых, гозможность ее использования при получении иммуноглобулина направленного действия.

Получение донорского противопаротитного иммуноглобулина Логическим завершением проведенных исследований явилось получение в производственных условиях нового препарата - донорского противопаротитного иммуноглобулина. С этой целью был сформирован контингент доноров из 140 человек, однократно привитых нивой паротитной вакциной сер. 2424 в дезе 0,5 г/л. Через 5 недель, в период максимального антителообрезованпя, било организовано взятке крови в объеме 350-150 мл от каждого донора и отбор именной плазмы, содертагой паротптные антитела в регламентируемых титрах (1:20 и вше). Иммуноактивнытш в момент проводачи было й2% привитых. 1'ммунная гротивопаротитная плазма, сформированная из индивидуальных сывороток, вмела титр паротит-ных антител 1:40 и использовалась в дальнейшем в качестве сырья для изготовления иммуноглобулина, Три серии противопаротитного иммуноглобулина получены в условиях производства по методу Кона, путем спиртового■ фракционирования белков плазш крови при отрицательном температурном реяиме. Объем а краткая характеристика полученных серий препарата представлены в таблице.

И муноглобулца протпвопаротптнкй человека представляет собой иммунологии см активную фракции белка, в'щеленяую из плазш крови доноров, в которой содержание иммуноглобулинов составляет не менее 97$. Препарат являемся стерильным, аток-

Характеристика'йиыунной плззш и полученных серий иммуноглобулина лротизопзротзтного человеке

Серия иммуноглобулина

Походная пказиа

Характеристика иммуноглобулина-

Колич-ео pH Содержа- Колич-зо Содер- Прииеси Титр Титр

(л)

ние бедна ш.шуно- кзние % глобулк- белка на (л) (55)

(%) паро- пзро-тпишх титных антител антител з РТГА з РИ

I 10,0 7,S 5,4 0*3 12,1 1,8 Г.ЙО 1:32

л С. 10,0 7,6 ■ 5,5 0,3 12 Д 1,9 1:320 1-32

3 12,0 7,5 5,7 0,4 12,1 ■ 1,3 1:320 X: 32

1.6

сичным, аплрогенным, безвредным и во физико-химическим, и медико-биологическим свойствам соответствует требованиям, предъявляемым к иммуноглобулинам для парентерального введения. Проти-вопаротптный иммуноглобулин облапает высокой специфической активностью - титр паротитных антител в нем составляет 1'? 1:640 (в РТГА) к 1: 32 (в РН). На препарат оформлена нормативно-техническая документация — Временная Фармакопейная Статья и Инструкция по применению.

Э.

•выводы

1. Впервые разработан спосос получения иммунной донорской плазмы для изготовления протквопаротитного иммуноглобулина; научно обоснована целесообразность направленной иммунизации доноров паротктной вакциной.

2. Оптимальной схемой вакцинации при получении именной противопаротитной плазмы является однократное введение донорам вакцины в лозе 0,5 мл с последующи взятием крови через 5-6 недель. К этом!' периоду средняя геометрическая титров антител достигает 5,5 1о£г , а количество иммуногктивных лиц возрастает до 88%.

3. Однократная иммунизация доноров паротитной вакциной не сопровождается возникновением выраженных местных либо системных субклинических реакций со стороны основных функциональных систем, что позволяет считать ее безопасной для организма привитых.

4. В сравнительных исследованиях различных методов выявления паротитных антител установлена высокая чувствительность иммуноферентного анализа и реакции тормокения гемагглвтинации, определен линейный характер зависимости между результатах!, полученными различными методами.

5. Паротитнкй вакцинальный процесс у взрослых характеризуется активацией система неспецифической резистентности и некоторыми особенностями иммунологического реагирования. На 7-21 сутки после введения вакпнны происходит кратковременное снижение относительного содержания Т- и В-лимфоцитов в. периферической крова и функциональной активности субпопуляций лпфоцитов в реакциях мптогеницдушрованной и антигенспёцифической бласт-

ной транс¿срмакин, с послеэтвдей нормализацией большинства показателей. Черег 6 недель отмечено новь-пение содержания спе-пк^посс;:; антител п концентрации иммуноглобулинов класса (3- ч сыворотка хсрорп ттряишнх.

Г. Голучон ногь'Л препарат - донорский нротиьопаротитный тплмучоглобулин с высокой спешфческой активностью (титр яаро-тктпнх г.нтител но даншм РТГЛ составляет 1:320-1:640) для иммунопрофилактики п Е»1уяотерэпип эпидемического паротита. На препарат оформлена нормативно-техническая документация - Временная ■"армакогсй'.ая Статья п Рлструкиия го применения.

список РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Е.В.Вотдаиина, Н.Б.Альбитсая. Сравнение пувстт^-лзяос-ти и информативности мотодоп выявления ттарототних антител з сыворотке- крови привитых// Медико-биологические препараты и гглу-яолсгпческая реактивность организма: :.:ат-лз 26 итогово" л коп1-грешлта Том'ПИВС и ТГУ. - Томск: Пзд-во университета. -1991. - С.22-24.

2. Е.В.Еогдапипа, Н.Г.Дльбпцкая. Проблемы создания специфического тиуноглобулпна для лечения осложненных фор1,? зстде-мпческого паротита// Актуальные вопросы медппинскоЛ технологии: Мат-ли научной конференции ТомНШГОС . - Томск, Пзд-во университета, часть 2. - 1990. - С.8-9.

3. Е.В.Еогдатгина, Н.Б.Альбишсая, Н.В.Яминова, В.П.1Срас;ю-ез, Б.А.Лшпеяко. Сравнительная характеристика различных методов выявления антител к гирусу эпидемического паротита// Вопр. вирусологии. - 1991, К 4. - С.339-341.