Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и изучение свойств липосомальной формы цитарабина

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и изучение свойств липосомальной формы цитарабина"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

Специализированный совет Д 063.41.01

На правах рукописи

ПЛЕТЕНЕВА Ольга Павловна

РАЗРАБОТКА И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ ЦИТАРАБИНА

03.00.23 — Биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва — 1992

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте клинической и экспериментальной иммунологии Минздрава Российской Федерации.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ — доктор мед. наук профессор Н. И. АФОНИН.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

Доктор хим. наук профессор И. А. ВАСИЛЕНКО.

Доктор фарм. наук Ю. М. КРАСНОПОЛЬСКИЙ.

Ведущая организация — НПО «Биотехнология».

Защита диссертации состоится 1992 г.

в £О часов на заседании специализированного совета Д 063.41.01 при Московском институте тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова по адресу: 117571, Москва, проспект Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского института тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова (119831, г. Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1).

Автореферат разослан «_» _ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

А. И. ЛЮТИК

РОСТ'" '"''/■ "

"л,К, И. . -

____ВВЕДЕНИЕ

Л 7

- — • • дуальность темы. В последнее время больнее вик-.'лк::« уделяется поиску способов и сред -е псьдаекяя зф^-эктишостк .т,

няемьк в ¡-цинической практике лекарств. Одним из перспект::"к:л: направлений исследований является создание липоссмальних форч лекарственных препаратов и практическое их. примея<?я::э з кач-.с:1 г переиесчккоз лекарственных средств.

Использование лгаюсом позволяет защитить препарат ст пр девремённого разрушения, значительно уменьшить побочные организма на вводимый препарат, доставить лекарство непосредственно внутрь клетки. Чрезвычайно интересными в отсм плане приставляется лкпоссмельниз формы с включе иными иитотоксичйсг.:'.::'.; средствами, которые в обычных условиях обладает, кса: г.р:\ь/.~о, ьы-раязннсй токсичностью и коротким периодом лизни в организме.

Особенно перспективным является получение в лппоссмальнул форме препаратов, которые при поступлении в организм в обычной форме под действием ферментов быстро разрушаются и теряют своп активность.

К соединениям такого рода относится цитарабик (Ц?), широко применяемый в клинической практике для лечения Сольных с острыми к хроническими миелоидными лейкозами. ГТротиволейкозная активность цитарабина связана с тем, что его фсс^орилированное производное является ингибитором синтеза Д1Н, Эффективность противолейкозного действия цитарабина прямо пропорционально зависит от длительности нахождения цитарабина з организме. Однако, в связи с быстрым де-заминированкем цитарабина в организме (10-12 минут в начальной £а?е и около двух часов во второй фазе элиминации) и превращением его в антибластически неакг: "¿кый'арабинозилурацил и его произвол-

ные, цитарабин имеет короткий период циркуляции в кровеносном русле, что'является его существенным недостатком.

Кроме того, ЦР, как к все проивоопухолевыз препараты, обладает еысокой обцей токсичностью и цитотоксичнсстью, а у больных в процессе лечения развивается резистентность к цитарабкну. Оффек-т;:ы10сть искольвованик ЦР. . как противолейкозного препарата можно суаэстьекко повысить, используя липосомь; в качестве переносчика лекарства.

Поэтому, работы по созданию и использованию в клинической лилесоьадышх лекарственных форм противолейкозных препа-ритеь, в частности, цитарабина являются весьма актуальными. .

Каио исследование по разработке и изучению активности липо-ссмалькой формы цитарабина (ЛФЦ) проводилась в соответствии с целевой межотраслевой научно-технической ' программой ГКНТ при СМ CCCF 0. 69.05. "Разработать и внедрить в практику патогенетические методы и средства профилактики и лечения лейкозоЕ человека, сельскохозяйственных тавотных и птиц" на 1936-1990 годы и научно-технической программой ГНТУ Ыйнмедярома СССР на 1991-1995 годы.

- исследование эффективности включения цитарабина ь лппосомы при их получении и хранении, разработка на этой ое-hOi-j оптимального лкг.идного состава липосом, технологии получения стерильной лиофилизкрованной ЛЩ к изучение ее свойств.

Научная новизна. В литературе имеются сведения о возможности повышения лечебной эффективности известных медицинских препаратов путем их включения в липосоми. Однако, большая часть этих исследований была проведена на экспериментальных образцах, которые ис-лолььоьались сразу после их получения и таким образом не отвечали

требованиям, предъявляемым к препаратам для внутривенного введения по стерильности и длительности хранения.

Научная .новизна диссертационной работы состоит' в том, что а ней: ■

- Исследована эффективность включения ЦР в липосомы при их получении и хранении. ^

- Разработаны оптимальный липидный состав и лабораторная технология получения стерильной лиофилизированной'ЛФЦ как новой лекарственной формы ЦР.

- Разработан метод определения содержания ЦР в липосомальнсй дисперсии и в плазме животных с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке для гель-проникающей хроматографии.

- Разработанная методика определения ЦР с помощью ВЭЖХ позволила провести сравнительную оценку динамики выведения ЦР иа кровеносного русла при введении его в липосомалыюй и обычной формах.

- Показана высокая эффективность использования разработанной ЛФЦ в качестве новой лекарственной формы цитарабина.

Практическая значимость. Разработана методика определения ЦР в липосомальной дисперсии и в крови с использованием ВЭЖХ. В результате работы рекомендовано применение ЛФЦ в качестве новой л«-' карстьенной формы этого препарата. Результаты диссертационной ра-, боты . легли в основу проекта МО на ЛФЦ и лабораторного технологического регламента получения ЛФЦ, а также будут' использованы при составлении рекомендаций по клиническому изучению ЛФЦ.

Материалы работы использовались при составлении заявки на

- А -

получение патента на Л'Щ.

Клиническое применение ' ЛФЦ поаволит осуществить лечение больных в амбулаторных условиях, назначая его не ежедневно, . а с определенном интервалами, экономить препарат за счет снижения его дозировки при одновременном достижении' более высокой терапевтической эффективности.

Положения, выносимые на ааяцггу. .

1. Изучена эффективность включения ЦР в липосомы при их получении и хранении. Разработана рецептура и лабораторная технология получения новой лекарственной формы ЦР в виде стерильных, ли-; оЬплгаированных образцов ЛФЦ .которые могут храниться длительное. ..рем;;.

?.. Разработан метод количественной оценки включения ЦР в липосомы и ЦР, циркулирующего в кровеносном русле, с использованием ЕоЖХ. '

3. Показана возможность 1 применения для фармакокинетических исследований разработанного метода-количественного определения ЦР г. крови с использованием ¡ЕШХ. Проведена сравнительная оценка динамики визедения ЦР из кровеносного русла-крыс при введении его в лниооомалыюй и обычной формах. . '■

4. На основании экспериментов на животных показано, что Л'Щ по сравнению с обычной формой препарата в той же дозе' обладает большим чем' в два раза терапевтическим эффектом действия. Кроме того, использование ЛФЦ позволит назначать его не ежедневно, а с определенными интервалами, и получать, по сравнению с обычной формой препарата, более высокий лечебный эффект.

Анробация райоты. Материалы работы были доложены на научных

конференциях молодых ученых и специалистов Ц1ЕИИГПК (I место), ВНИИТКГП (III место), на 59-ой научной сессии ЦНИИГПК, на конференции "Современные проблемы получения лекарственных препаратов" во ВЮ:. ,1АФ (Ленинград), на заседаниях Ученого Совета ВНИИНСТП и НИИКЭИ.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 3 статьи, 6 тезисов докладов на конференциях.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводое, списка использованных источников из ... наименований. Общий объем работы... страниц машинописного текста, 5 таблиц и 10 рисунков. ^ , .

В работе использовали цитарабин (синонимы: цитозар, араСнно-зилцитоаин, Ара-Ц) во флаконах фирмы "Upjohn" (США) и цитарабин проиеводства экспериментального завода' института органического синтеза АН Латвии г.Рига.' Цитарабин является синтетическим нукле-озидом, по структуре очень близким к природным нуклеозндам - ци-тидину и дезокпицитидину.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Ort

КО ОН

ОМ

UnTapii.iH

Цмтидпм

Acic

- б -

Для получения липосом использовали фосфолипиды яичного желтка (ЯМО содержащие яичный фос^атидилхолин (ЯФХ) (не менее 75%) i фосфатидилэтанолнмин, сфингомиелин,' триглицериды, лизофосфатидил-холин; кардиолипшг (KJI); плацентарные липиды (ГШ); '"лецитин-стан--дарт", содержащий 95Х. ЯФХ и 5% фосфатидилэтаноламина производства Харьковского предприятия по производству бактерийных препаратов Минмэдпрома; холестерин (ХЛ), фирмы "Merck" (ФРГ); DL-токоферол (ТЛ) фирмы "Serva" (ФРГ). В качестве криопротекторов применяли трегалозу фирмы "Sigma" и сахарозу (ЧДА) (СССР).

При выборе способа' получения ЛФЦ липосомы получали следующими методами (см. схему):

- обработкой ультразвуком (УЗ) водной дисперсии липидов на 'ультразвуковом диспергаторе фирмы "Branson" •( США), мощность 450 ватт, частота 20 кГц, в течение 4 минут (метод 1);

- методом "обращения фаз" (метод 2);

- модифицированным методом "обращения фаз" с замораживанием-оттанванием (метод 3);

- замораживанием-оттаиванием без обращения фаз (метод 4). При этом отмеренное количество спиртового' раствора липидов и раствора холестерина в хлороформе упаривали на роторном испарителе до образования пленки, которую просушивали в токе азота, а за-1ем гидратироьали водным раствором цитарабина с ; концентра;шей 10 мг/мл путем встряхивания в течение 1Б минут'. Полученную дист??Г£нию многократно (10 раз) замораживали в жидком азоте и оттаивали в горячей воде. ,

Размер липосом определяли на автокорреляционном спектрометре "N'ano-Sizer" фирмы "Cultiorucs", (Франция).

Методы получение лцаосом

В некоторых сериях экспериментов, проводившихся с ЛФЦ in vivo, полученную ЛФЦ перед лиофильной сушкой подвергали трехкратному центрифугированию в течение 15 минут при 10000 оО/мин с предварительным разбавлением объема липосоы в 2 раза дистиллированной водой с целью отделения не включенного в липосомы цитара-бина. Такие липосомы обозначили ЛФЦц.

При подборе условий лиофильной сушки ЛФЦ липосомы получали из двух липидных композиций методом замораживания-оттаивания. К 1 ил полученных липосом добавляли 60 мг криопротектора (трегалоза

или сахароза), замораживали при температуре -ЕО^С и лиофилпзиро-вали в течение 24 часов на приборе СМЖ "ЮЗИФРУЛ" (Франция). При формировании липосом, содержащих криопротекторы во внутренней Фазе липосом, эти вещества с концентрацией 60 мг/мл вносили в водный раствор вместе с ЦР при гидратировании плешей лшшдов. 'Хлако-ны с высушенными липосомами заполняли азотом и герметизировали. Стерилизацию проводили с помощью У-облученил в дозе 1-1,5 !,!рад при температуре гадкого азота. Липосоми хранились при +4сС в холодильнике.

Поскольку получение липосом содержащих большое количество лекарственного препарата является необходимым условием для их применения в качестве переносчика лекарства и доктккенвя зыряязи-ного терапевтического эффекта, то в качестве одного из основных критериев оптимальности разрабатываемых рецептуры и технологии получения ЛФЦ избрали эффективность включения (Зв) цитарабина в формируемые липосомы. Для количественного определения Эв, пред : тавляющей собой процентное соотношение ЦР, находящегося внутри и вне липосом, необходимо с оделить низкомолекулярный ЦР, находящийся вне липосом от значительно более крупных частиц липосом с включенным ЦР. Обычно такого рода задачи разрешаются путем использования методики жидкостной хроматографии на колонках с декс-трановыми носителями типа Сефадекса Б-50, Сефарозы 4В и подобных. В наших предварительных экспериментах мы провели сравнительную оценку указанного метода и метода гель-проникающей хроматографии с использованием БЭЖХ. Оказалось, что метод ВЭИ обеспечивает не менее эффективное разделение ЦР и липосом с включенным ЦР, чем метод хроматографии низкого давления, но, кроме того, обладает

- 9 -

некоторыми преимуществами. Среди них:

- бытрота анализа;

- меньшее количество образца, необходимого для ан-.^иза.

В соответствии с поставленной задачей количественного определения Эв ЦР в липосомы наш! были разработаны условия хрома-тографического анализа, который проводили на хроматографе "Du Pont 0823 AD" (США), оснащенном ультрафиолетовым детектором с переменной длиной волны, на колонке TSK-G 3000SW (7,5x300 мм). Детектирование осуществляли при 280 нм. В качестве элюента применяли воду,полученную на установке "Milli-Ro" и < дополнительно пропущенную через колонку с ионообменной смолой фирмы "Millipore" (США), скорость элюирования 1ип/мин.

Эв ЦР внутрь липосоы рассчитывали по формуле;

Эв - (1-(Ссн. /Сисх. ))*100%, где:

Сен. - содержание ЦР вне липосом, рассчитанное по методу абсолютной калибровки;

Сисх. - исходная концентрация цитарабииа в дипосомальной дисперсии до получения липосом.

Определение показателей выведения цитарабина из кровеносного русла после применения препарата в липосомальной и обычной формах были выполнены на белых беспородных крысах-самцах массой 100-150 грамм. Исследуемые образцы в дозе 25 мг цитарабина на 100 грамм массы тела животного вводили внутривенно. Пробы крови для анализов брали из хвостовой вены животного в Интервале б-30 минут после введения и затем через каждый час до 7 часов.

Содержание цитарабина в плазме определяли с помощью метода ЕЭЖХ путем прямого ввода образцов плазмы в хроматограф. Хроматог-

рафический анализ проводили при тех же условиях, что и при определении количества ЦР, включенного в липосомы. Фоновый уровень содержания природных нуклеозидов в плазме был значительно меньше определявшихся значений концентрации цитарабина.

Статистическую обработку результатов проводили на микро-ЭВМ НР-85 .фирмы "Hewlett Packard" (США).

Для экспериментов in vivo использовали следующие препараты: цитарабин, ЛФЦ, ЛФЦц и "пустые" липосомы - липосомы не содержащие цитарабин.

Противолейкозную активность ЛФЦ изучали на мышах гибридах BDF массой 12-22 грамма с перевитым лейтзом L-1210.

Липосомальную и обычную формы цитарабина вводили внутрибрю-шинно в разовых дозах от 4,2 до 138 мг/кг в объеме 0,2-0,3 мл на животное. Пустые липосомы вводили в объеме, равном вводимой ЛФЦ. Препараты применяли 1,2,3 или 5 раз после перевивки штамма.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУКД01ЙЕ

1. Разработка рецсдтуры и лабораторной технологии получешиз стерильной лшфилыю выеуиюшюй лилосомалыга!! фок-гы цитарабина.

1.1. Выбор оптимального метода получения ЛФЦ.

Первоначальный зтап работы состоял в разработке оптимального метода получения липосом с включенным цитарабином.

Липосомы получали методами, представленными на схеме. В ¡качестве липидной основы использовали фосфолипиды яичного желтка (ЯФЛ). Известно, что липосомы, йе имеющие в своем составе холестерина, обладают низкой стабильностью в кровеносном русле. Добав-

- п -

ление холестерина стабилизирует липидный бислой, уменьшая вытекание включенного лекарства. Для получения липосом к ЯХ>Л добавляли рассчитанное количество холестерина так, Чтобы получить эквимо-лярное соотношение мевду лецитином и холестерином. Концентрация липидов в образцах липосом составляла 50 мг/мл.

Оказалось, что наиболее эффективным способом вшшчения цитарабина в липосомы является метод "обращения фаз", который позволяет дост,. 1Ь эффективности включения (Эв.) ДР в липосомы равной 63+4,0% при размере липосом 340+28 нм (см. схему). Эв при получении липосом по методам 3 и 4 ниже и равна соответственно 41,8+2,6 7. и 47,5+2,27.. .Однако, следует иметь в виду, что при получении липосом по методу "обращения фаз" возможна химическая деградация липидов И инактивация лекарства при использовании УЗ, а при модифицированном методе "обращения фаз" необходимо тщательно очищать эфир от перекисей. Наиболее перспективным и технологичным представляется метод 4, который лишен недостатков методов 2 и 3 и позволяет получать липосомы с удовлетворительным процентом встраивания ЦР.

1.2. Подбор состава и концентрация липидов.

При получении липосомальных форм лекарств состав и концентрация липидной фазы оказывают существенное влияние на все характеристики конечного препарата.

Для получения липосом можно воспользоваться как липидами, выделяемыми из природных источников, так и синтетическими липидами, получаемыми методами химического синтеза. И хотя использование синтетических липидов, имеющих известную химическую структуру, предпочтительнее, их высокая стоимость и невозможность

получения в больших количествах, делает их экономически невыгодным!! для формирования липосом, предполагаемых к использованию в качестве коммерческих фармацевтических препаратов, Поэтому для решения поставленной задачи разработки новой лекарственной формы цитарабина использовали липиды, получаемые из природных источни-. ков в промышленных масштабах.

В таблице 1 приведены данные по влиянию липидного состава и концентрации липидов на Эв ЦР и размер липосом, полученных по методу 4.

Таблица 1.

Влияние липидного состава и концентрации липидов на Эв ЦР и размер липосом.

Липидный • Суммарная Эффективность Средний диаметр

состав ли- концентрация включения цитара- липосом, Б, нм,

посом, липидов, бина, Эв,%,М±т М±ш

(моль/моль) (мг/мл)

Я'ГХ 50 43,5±6,9 394¿30

ял-х 100 75,0*2,9 610160

ЯФХ 200 ' 82,0±1,4 980156

я:'Х/7Л-1/1 50 19,01.3,5 2241+238

Я'1-Х/ХЛ-2/1 100 49,0+2,7 151б±122 '

Я*Х/КЛ=5/1 100 56,6+4,3 458120

. гл 100 65,115,7 1131178

При использовании в качестве липидной основы ЯФХ наблюдается резкое увеличение Эв ЦР с 43,5 до 75£ и размера липосом при возрастании концентрации ЯФХ от 50 до 100 мг/мл. При дальнейшем уве-

личении концентрации липидов до 200 мг/мл происходит незначительное увеличение Эв до 82%, а средний диаметр липосом возрастает в 3 раза по сравнению с малой липидной концентрацией,

Введение в состав липидной основы холестерина оиводит к снижению Эв ЦР в 1,5-2 раза и к увеличению размера липосом. Присутствие в составе липидной основы отрицательно заряженных липидов - кардислипина (КЛ), либо фосфатидилсерина - в плацентарных липидах (ПЛ) не приводит к существенному изменению Эв.

На дан.юм этапе работы решено было использовать в дальнейшем две липидные композиции:

- ЯФХ с концентрацией 100 мг/мл;

- ЯФХ/ХЛ - 2/1 (мольное соотношение) с суммарной концентрацией липидов равной 100 мг/мл.

Однако, окончательное решение об оптимальном составе липидной фазы для получения липосом с инкапсулированным цитарабином можно было сделать только после изучения характеристик липосом в процессе их длительного хранения.

1.3. Разработка условий лиофильной сушкч, стерилизации_и

хранения липосом с включенным цитарабином.

Многочисленные исследования стабильности липосом при хранении показали, что наиболее эффективным способом является хранение липосом в лиофилизироьанном виде, который позволяет сохранять ли-офильно высушенные липосомы рри комнатной температуре с лучшими показателями, чем в замороженном виде.

Учитывая известные требования, предъявляемые к отдельным этапам технологического процесса лиофилизации липосом, обеспечивающие минимальные структурные и функциональные изменения липид-

ного бислоя, для лиофилизации ЛФЦ решили использовать уже применяемый на практике режим получения сухого тромбина.

Для повышения устойчивости липосом во время лиофилизации ис-

/ < пользовали криопр'отекторЫ: трегалозу и сахарозу, которые обеспечивали для липосом, сформированных как из чистого ЯФХ (с добавками антиоксиданта - ТЛ ), так й смеси ЯФХ/ХЛ сохранение основного количества ЦР внутри липосом (см. табл.2). Если без кри-опротектора содержание ЦР внутри липосом в ходе сушки, стерилизации и хранения в течение года уменьшается примерно в два раза (р$0,05), то при использовании сахарозы Или трегалозы в липосомах сохраняется исходное количество цитарабина. Определенную стабильность липосом даже без добавок Сахаров можно объяснить возможным протекторйым действием самого ЦР, который специально не удалялся из внешней еодной фазы липосом.

Из литературных данных известно,', что для достижения максимальной стабилизации липосом в время лиофильной сушки требуется присутствие криопротек. ,>ра во внутренней и внешней водных фазах липосом. Для проверки этого наблюдения относительно получаемого препарата липосом с включенным ЦР, нами были проведены эксперименты, когда криопротектор - сахароза присутствовал только снаружи липосом, а также внутри и снаружи липосом.' Из таблицы 2 видно, что такие липосомы .не имеет различий по уровню вытекания ЦР из липосом в процессе получения препарата и его хранения в течение года.

Получение липосом в присутствии сахарозы приводит к уменьшению эффективности включения ЦР, однако у липосом на основе ЯК/ХЛ •^2/1 наблюдается неожиданное уменьшение количества ЦР во внешней

Таблица 2»

Влияние лппндного состава лилосом, криопротектора, способа его введения на сохранность липосом в процессе получения пре1. „рата.

Л.глидныЯ состав Криолпотекгор Э$$ШИВКОСТЬ ШЛШЕНШ ЦИТАРАЮНА В Ж10С0ЫЫ,

~ * Эв, %, М±м; Ы (Ы - число партий препарата)

после полу- после лио- после стери- после

чения филизации лизации хранения

1. с добавками -токоферола» — 41,1±3,8 г! = Й 21,6±3,9* = ё 24,914,3* й = —

> 11 сахатзоза снаружи М = ё 35,6±Ю,8 Й = 4 Й = 3' 20,614.5 й = 5 -

л. я трегалоза снаружи 41,113,8 г! = 6 32,3±Ю Й = 5 35.517 Ы = 5 43,010,6й* 11 = 1

ч. и сахароза снаружи и внутри ¿ЗЛ±2,6 =3 27,214.5 Ы = 5 26,8+5,4 . ¿1 = 2 21 ,111,3 А = к

6. ;и\/ХЛ = 2/1 с до— оавк&мн -токоферола - = & 21.714,7* Й = ё 18.516,7* Й = 5 15.511,0* й = 2

6. « сахароза снаружи 35,б13,9 11 = & 36,612.5 11 = ё 35,312,б 11 = ё й = 4

о п сахароза снаружи и 13,816.2 11 = 3 . 31,0+5.2 х! = 3 28,310.5 й = к 49,0±2,5 г! = к

внутри

* к*

- р40,0о по сравнешш с исходном содержанием ЦР внутри липоссм после их получения.

- среднее из пяти анализов.

фазе липосом после их регидратации и хранения в течение года, что возможно, связано или с адсорбцией ЦР на поверхности липосом, или с его вхождением внутрь липосом.

Проведенные исследования показали, что сохранность липосом в ходе технологического процесса получения лекарственной формы во многом зависит от липидного состава липосом, используемых криоп-, ротекторов и способа их введения.

■ 1.4. Разработка лабораторной технологии получения ЛФЦ как новой лекарственной формы цитарабина. Проделанные исследования позволили выбрать следующий оптимальный состав липидной фазы для получения ЛФЦ: ЯФХ/ХЛ-2/1 с добавками ТЛ. Такое соотношение липидов обеспечивает наименьшее вытекание ЦР ^з липосом во время их получения, лиофилизации,. сте-1 рилизации и хранения, а также, максимальную стабильность липосом к действию компонентов крови, продлевает время циркуляции липосом в кровеносном русле. . Для увеличения устойчивости липидов к окислению, \ происходящему в результате воздействия света и кислорода воздуха, в состав препарата добавляется природный антиоксидан'т -

витамин Е в количестве 1,35*10*3мо.м на моль фосфатидилхолина. В

ч

качестве криопротектора была выбрана сахароза, которая позволяет сохранить основное количество цитарабина от вытекания из липосом в процессе получения ЛФЦ, и которая в ?о же время дешевле и доступней, чем трегалова.

Способ введения сахарозы избрали тот, когда сахароза присутствует вне липосом, поскольку в атом случае, с одной стороны, • 1

не уменьшается эффективность включения цитарабина в.липосомы во время их получения, что наблюдается при присутствии сахарозы вне

и внутри липоеом,' а с другой стороны, сахароза при ее нахождении снаружи липоеом позволяет сохранить основное количество инкапсулированного в липосомы цитарабина (см. табл. Ь). ( Поскольку, Л'Щ с отделенным из внешней водный фазы липоеом невключешшм в липосомы цитарабином не имела каких-либо, преимуществ по эффективности действия ln vivo, то было решено не включать стадию по отделению невключенного в липосомы ЦР в разрабатываемую лабораторную технологию получения ЛФЦ.

Таким образом, разработанная лабораторная технология получения Л'1'Ц состоит из следующих операций:

1. Смешивание в определенных количествах спиртового раствора "лецитин-стандарта", хлороформенного раствора холестерина и витамина Е.

2. Формирование пленки липидов на стенках круглодонной колбы путем упаривания органических растворителей в вакууме при температуре не выше 40 °С.

3. Диспергирование липидной плэнки водным раствором цитарабина путем встряхивания колбы в течение 15 минут.

4. Многократное (до 10 раз) замораживание липосомальной дисперсии в жидком азоте и оттаивание в горячей воде.

5. Добавление к полученным липосомам криопротектора сахарозы в соотношении 60 мг сахарозы на 1 г.ш липосомальной дисперсии.

6. Роулив полученной липосомальной дисперсии по 1 мл во флаконы емкостью 10 мл.

7. Лиофилизация липоеом.

0. Заполнение флаконов с лиофилизиров.чмой Л1Ц инертным

Г.. 18 -

газом - азотом или аргоном.

9. Герметизаций флаконов.

' 10. Стерилизация липосом в герметизированных флаконах Г-облучением в жидком азоте при общей дозе 1,5 Мрад.

Перед применением во флакон добавляют 0,85 мл стерильного апирогенного физиологического раствора и флакон .встряхивают до образования однородной дисперсии липосом молочно-белого цвета с 'желтоватым оттенком.

2. Некоторые биологические свойства липосомальной формы ци-тарабина.

2.1. Изучение выведения цитарабина из кровеносного русла в липосомальной и обычной формах.

В ходе разработки технологии получения ЛФЦ была исследована специфическая. активность ЛФЦ, которая вводились животным сразу после их получения без лиофильной сушки и стерилизации. Оказалось, что СПЖ мышей с перевитым лейкозом 1.-1210 после применения таких липосом значительно больше по сравнению с таковой при лечении по той же схеме обычным препаратом ЦР.

С целью объяснения различий ь'^йствии ЛФЦ и ЦР в обычном виде нами было проведено сравнительное изучение выведения ЦР в липосомах и без них из кровеносного русла крыс. Установлено, что уже в первый момент после введения содержание цитарабина в плазма при введении его в обычном виде и в виде ЛФЦ достоверно отличается (рис.1), к четвертому, часу ЦР в плазме практически не обнаруживается в первом случае, а в случае ЛФЦ количество ЦР от введенной довы составляет около 81, и даже к седьмому часу ЦР в плазме животных продолжает наблюдаться. Проведенные нами расчеты показа-

Процент от введенной .ддзы,;'.

19 -

0 1 2 3 4 5 5 7

Врвпя, часы.

Рисунок.L Изменение содержания цитарабина з яламе после aro введения а липосо-мальней и обичной формах. I - цитарабин а липсссмах; ¿ - цитарабин з физиолс "ическо.м растворе.

ли, что константы скорости виведеппл ЦГ в обычной и липосомашюй формах со срока i час и далее отличаются более чем в 2 раза. Таким образом, введение ЦР в яипосомалъной форме существенно прод-леьает время циркуляции ЦР в кровеносной русло.

Поскольку терапевтическая эффективность непосредственно связана с концентрацией препарата в крови, го } данной случае эффект действия Л-ЭД, пэ-ыданам;' может быть обыюцен тин, что лппосош позволяют поддерлиьать более высокую концентрацию лекарства в кроьи в длительные сроки.

2. 2. Изучение специфической активности ЛЩ.

Со стерильными лнофилыю высушенными образцами ЛФЦ были проведены исследования ю изучению их специфической эффективности.

Па рисунке 2 графически представлены данные сравнительного изучении действия цитарабина в липосомальной и обычной формах на развитие лейкоза L-12JQ.

СПЖ больных мышей, но не получавших лечение (контроль) составляла 9, Oj; 1,0 день. При лечении ЦР СПЖ мышей не зависела от дозы и схемы введения и составляла ь среднем 13,5+1,5 день. Црные-нение ЛФЦ для лечения шшей с перевитым лейкозом L-1210 позволило увеличить продолжительность одзни животных в I группе до 23,212, О Д1 во II группе до 2б.Ц0,б дней ив III группе до 25,4+1,8 дней. Таким образом, ЛФЦ оказывает более эффективное воздействие на развитие лейкоза L-121Q, увеличивая СПЖ мышей с лейкозом в 2-2,5 раза по сравнению с обычным ЦР в такой же дозе.

Поскольку ЛФЦц не имеет преимуществ по эффективности действия по сравнению с ЛЩ, то ь разработанную лабораторную технологию получения Л1Ц не включили стадию по отделению цитарабина, не

Средняя продолштельность яизин, дни

:онтролъ

пусти С ЛИ" .. . ..— .1100 0-

СИ

зторабни

ЛФЦ ЛХ'Цц

15

и*

ГсЧ

Г.<

'V

V;

ш

т

]__..V

ТТрут-.ла

:;•/' л/А

П гругш-1.

III группа

Гвсунск Я. 'Лулчг'^---» тееднвй ир!:до.тт^;те,-ц.кос'хи .тазик ляюой о лейкозом Ь-1210 г.ш звздежи -.тм "-пусхнх ляиоосм", цитарабина, ЛХ-Ц и ЛФЦц.

I грутша - с~од::пвкое шгг:п:р.тпк» штениэ в курсовой /о я о

'¡Я ;т.':сг;

II гвукиа- с.'пс-диспнс" тт.тглкртгнсо кродоиио в курсолой дозо

75 иг/го:;

III гру1Ш!1-_,щг.':скратноэ п]у;-донпо__тз курсспой дсзо 168 _мг/кг. Средняя гхоодатзтитпльностъ "спз-пт, дни 25

20 15 10 5

Н 2

Курсовая доза, иг/кг

2Х 37 5 42 75 150

Г>Ису110К 3- СШ мышей о перевитым лейкозом Ь-12Г0

1 - контроль; 2 - цитарабин; 3 - 21Ц. н-шш,

включенного в липосомы. Исключение этой стадии экономит стоимость и трудоемкость предложенной лабораторной технологии..

"Пустые липосош" при введении мышам в объеме, равном объему вводимой ДФЦ, не оказывают какого-либо воздействия на СПЖ мышей по сравнению с контролен.

В одной серии экспериментов в качестве контроля действия ли-посом, провели смешивание стерильных доюфильно высушенных "пустых липосом" с водным раствором цитарабина непосредственно перед введением мышам. Такой приготовляемый ех Ьеирого препарат вводили мышам с перевитым лейкозом 1--1210 по пятикратной схеме введения в дозе, равной дозе вводимого цитарабина и ЛФЦ. Оказалось, что СПЖ животных в этом случае равнялась 15,110,2, что достоверно больше С ГШ животных при введении им цитарабиниа (13,8±0,3), но значительно меньше, чем при введении ЛЩ (25,0*1,5). ■

При изучении зависимости эффекта от дозы ЛФЦ применяли в ди-апозоне курсовых доз от 21 до 150 мг/кг, которые вводили ежедневно в течение щти дней после перевивки штамма лейкоза. Как видно на рисунке 3, наибольший терапевтический эффект отмечался при введении ЛФЦ в курсовой дозе 75 мг/кг (5 раз по 15 мг/кг) - показатель угла животных равнялся 216,4%, по отношению к контролю. Таким образом, оптимальной терапевтической дозой ЛФЦ при экспериментальном лейкозе 1-1210 следует считать 15,мг/кг при курсовоц пятиразовоы введении.

Следует отметить, что применение ЛФЦ в той же оптимальной курсовой дове 75 иг/кг, но ^ режиме 3 введений по 25 мг/кг (в 1,3 и 7 дни после перевивки штамма лейкоза) сопровождалось также значительным увеличением СПЖ (до 234,5Х) подопытных мышей с сохране-

нием нормальных ■показателей гемопоэза в течение 25 дней опыта. Применение ке ЦР в обычной форме по этой схеме приводило к увеличению СПЖ мышей всего лишь на 35,8%, в периферической" крови у них отмечалась анемия, как и у контрольных .животных и лейкоцитов.

Такям образом, анализ результатов, полученных при изучении равных схем лечения перевитых лейкозов цитарабином в обычной ц липосомальной формах позволяет сделать вывод о большей активности Л'ГЦ. Кроме тоге, использование ЛГЦ позволяет назначать его не .ежедневно в клинических "условиях, а амбулаторно, с определенными, интервалами, и получать, 'по сравнению с обычной формой цитараби-на, более высокий терапевтический эффект.

13 Ы В О Д Ы:

1. Изучена эффективность включения ЦР в липосомы при их получении и хранении. Разработана рецептура й лабораторная технология получения новой лекарственной формы-ЦР в виде стерильных, лп-офилизированкых образцов ЛТЦ .которые могут храниться•длительное время.

2. Разработан метод количественной оценки включения ЦР в липосомы и ЦР, циркулирующиего в кровеносном русле, с использованием ВЗЖХ.

3. Показана возмо.таость применения для фармакокинетических исследований разработанного метода количественного определения IIP в крови о использованием ВЗЖХ. Проведена сравнительная оценгл динамики выведения 1(Р из кровеносного русла kp,v: при введении его в липосомальной и обычной формах.

4. На основании экспериментов на животных показано, что Ш1 по сравнению с обычной формой препарата в той те дозе обладает

большим чем в два раза терапевтическим аффектом действия. Кроме того, использование ЛЩ позволит назначать его не ежедневно, а с определенными интервалами, и получать, по сравнению с обычной, формой препарата, более высокий лечебный эффект.

. Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях: •

1. Афонин К И. , Ермакова Л. Е , ПЛетенева О. П. , Рыболовлев Ю. Р., Рещиков В. П. , . Оертукова ИМ. , Забелина В. Д. , Козинец Г. И. Получение, свойства и противолейкозная активность препаратов в ' липосомальной'форме.// Сборник "Материалы 57-й научной сессии ЦШШГПК". - Москва. 1985. - С. 116-117.

; 2. Оксинойд 0..Э., Ермакова Л.Е , Плетенева О. П., Лазаренко Е. К Изучение свойств липосом с включенным цитостатическим препаратом. // Сборник "Материалы 58-й научной сессии ЦНИИГЛК", - Москва. 1986. - С. 77-78.

3. Плетенева О. Е Изучение выведения из кровеносного русла цитара-бина в липосомальной форме. // Тезисы доклада. XV научная конференция ЦНИИКПК. Сборник "Актуальные вопросы гематологии и тран-сфуэиологии". г Москва. 1986. - С. 82-83. '

4. Плетенева О. Е Влияние липидного состава и способа получения на эффективность включения цитарабина в липосомы. // Сборник "Материалы 59-й научной сессии ЦНИИГПК". - Москва. 1987. - С. 131-132.

5. Оксинойд О. Э., Плетенева 0. Е , Афонин Е И. Перспективы практического применения липосом. // Гематология и трансфузиология. -

1Р37. - No б. - С. 54-58.

6. Оксинойд 0. 3. , Плетенева О. П. , Афонин НИ. Эффективность включения цитарабина в липосомы в зависимости от их липидногп состава и способа получения.// Х»и<:ико-фармацевтический курнал.1 19РЗ. - No 5. - С. 593-600.

7. ..летексва 0. Н Некоторые аспекты создания лекарственной ;Ьормы липосомалншго препарата цитарабипа. // Тезисы доклада. Кэпфере-шшя молодых ученых "Современные проблемы получения лекарственных препаратов". - Ленинград. 1990. ■- С. 98.

8. Плетенега О. П. , Оксинсйд 0. Э. , Афонин ¡L Я. Некоторые аспекты создания лекарственной Сормы липосомалыюго препарата ь.ггарпби-на. // Вестник Академии Медицинских паук СССР. - 1990. - fío 8. -

. С. 33-24.

9. ;1г.етене-а О. П. , Сертукопа 11 М., Афонин Н. И., Реадков В. IL Новая лекарственная Фсрмз. цитарзбпнз на основе липосом. // Тезисы конгресса. Первый Российский национальный конгресс "Человек и ле-

• карство". - Москва. 199". - No 233.

Зак.3 /

Тип. Минздрав» РФ Тир.\Q0