Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и характеристика нового репликативно-компетентного вектора и упаковочных клеток для ретровирусного переноса генов.

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и характеристика нового репликативно-компетентного вектора и упаковочных клеток для ретровирусного переноса генов."



Нащональна Академш наук У крайни 1нститут молекулярно!' бюлоги та генетики

/К-

/

< ^ №

Кайда 1рина Володимир1вна

/

УДК 577.21.578.828 517.15.516.858

Розробка та иарактеристика нового вектора та упаковочник кл1тин для ретров1русного переносу гешв

03.00.03 — молекулярна бюлогш

Автореферат

дясертацй" на здобутгя наукового ступеня кандидата бюлопчних наук

КиТв -1998

Дисертац1ею е рукопис

Робота виконана в 1нститут1 молекулярноХ б1ологИ i генетики HAH УкраХни, м. КиХв

Науковий кер1вник: доктор бхолог1чних наук, член-кореспондент HAH УкраХни A.B. Риндич 1нститут молекулярноХ бхологхх i генетики HAH УкраХни, м. КиХв

0фхцхйн1 опоненти: доктор бл.олог1чних наук

0.П. Соломко

1нститут молекулярноХ бл.олог1Х i генетики HAH УкраХни, м. КиХв

доктор 01олог1чних наук

1.A. Смирнова

Хнститут експериментальноХ патологхХ, онкологхХ, радд.об1олог1Х iM. 3.6. Кавецького HAH УкраХни, м. КиХв

Пров1дна установа: 1нститут мл.кробхолог1Х i в1русолог11

iM. Д.К. Заболотного HAH УкраХни, м. КиХв

ео

_ годин1 на

saciflaHHi спец1ал1зованоХ вченоХ ради Д.01.86.01 1нституту молекулярноХ

бхолог1Х i генетики HAH УкраХни за адресою:

252143, м. КиХв-143, вул. Академ1ка Заболотного, 150.

Захист вд_дбудеться 1998 р. о Ж

3 дисерта1иею можна ознайомитись у б1блаотецх 1нституту молекулярноХ бхолог1Х ± генетики HAH УкраХни.

//

Автореферат розхсланий/ t f 1998 р.

Вчений секретар спец1ал!зованоХ вченоХ ради кандидат б!олог1чних наук

Л.Л.Лукаш

Актуальн!сть теми. Ретрсиирусна система для переносу гетпа повинна бути високопродуктивною (тобто продукувати векторний Bipyc з високим тшром), щоб забезпечити високу множинтсть шфекцй in vitro та in vivo; решйкативно-дефектний Bipyc теля штеграцй у клтпш-мипет не повинен бути спроможним до повторних раундав реплкаци; наявтеть ретров1су у оргашзш тварини не повинна причиняти виникнення пухлин або шших вад.

1нтенсивна розробка реплжативно-дефектних ретров1русних систем на ochobí Bipycy лейкозу мишей (M-MuLV), насамперед задля щлей генно! TepaniT, показала, що пул векторного Bipycy, що продукують упаковочш клиини неминуче .чистить послщовносп Bipycy-пошчника в малй кшькосп котй, що не детектуеться в культур! клтш, але дае достатньо високий р1вень експресй Bipycy дикого типу in vivo - в opram3MÍ примам, що пов'язують з появою решшеативано-компетентного Bipycy та утворенням лшфом [Vanin Б. et al., 1994; Donahue R. et al., 1992]. Така небезпечна тенденщя примушуе вести пошук нових peTponipycin для переносу гешв у ссавщв. Пташиш peTpoBÍpyci: е одними з претендента на цю роль : завдяш змш хазяйсько! cпeцифiчнocтi через гено-шженерне модифгкування env, вектори на ochobí пташиних peTpoBipyciB успшшо застосовуються для переносу гешв у ссавщв [ Federspiel М. et al., 1994].

Мета та цЫ досл!докення.Метою uie'í роботи була розробка та характеристика ново! високопродуктивною peTpoBipycHoi системи для переносу гешв. Адаптований до качок Bapianr празського штаму Bipycy саркоми Раусу (daPr-RSV-C) мае env природним шляхом вщозмшений в процеа пасування на клипнах неспециф1чного хазяша [Кашуба та íh.,1993; Hlozanek I. et al., 1979], завдяки чому daPr-RSV-C заражае мигаи rrraxiB та ссавщв [Hlozanek I. et al., 1992]. Можляв1Сть застосування векторов на ochobí пташиного Bipycy для переносу генш до míthh ссавщв зумовила виб!р daPr-RSV-C - високопродуктивного пггаму RSV як основу для створення ново! peTpoBipycHoi системи для переносу гешв. Для досягнення мети роботи ncrrpi6HO виршшти деюлька задач:

1.Сгворити конструкщю реплжативно-компетентного вектору ptddaPr-RSV-Ce" та конструкцпо BÍpycy-noMÍ4HHKa ptddaPr-RSV-Ce~PS~Neo.

2. Шляхом введения послвдовностей Bipycy-пошчника ptddaPr-RSV-Ce'PS'Neo в QT6 кштини перешлки, вшьш вад ендогенних послщомностей, отримати упаковочш клтши, що продукують BipycHH бшки Gag, Pol, Env.

3. Шляхом зв'язування супернатанта та л1зату упаковочних клтш з anti p27gag моноклональними антитшами показати, що упаковочш юитини B3M03Í продукуваи eipycm бшки.

4. Пвдбрати ретров1русний решнкативно-дефектний вектор, що не мае далянок гомологй з BÍpycoM-помчником ptddaPr-RSV-CePSNeo з метою упередження рекомбшащй Mix послщовностями BÍpycy-noMÍ4HHKa в упаковочних клтшах.

5. Показати, що упаковочш клшши, sod експресують посшдовносп в1русу-ш»пчника ptddaPr-RSV-Ce"PS~Neo, стабильно продукують реплшативно-дефсктний вектор та визначити його титр.

6. Перевфити пул продукуемого упаковочними титанами решикативно-дефсктногс вектору на присутшсть последовностей Bipycy-пошчника.

Наукова новизна та практична цшшсть роботи. Новий реплкативно-компетентний вектор створено на ochobI високопродуктивного вар1анту адаптованого до качок Pr-RSV-C з розширеною хазяйською специф1чшстю, що дозволяе застосовувать цей вектор для транспорту гешв у ссавщв.

HoBi упаковочш клтши F18/pJD, яы шстять рекомбшантний Bipyc-пошчник ptddaPr-RSV-Ce'PS'Neo, продукують рсплжативно-дефектний рстров1русний вскторний Bipyc pJD214Hy С-шдгрупово! специф1чносп з титром 10л6 CFU/мл (колонш утворюючк одиниць i Miiuirrpi клтшного супернатанту), що перебшьшуе американсью аналога на основ1 RS\ [Boerkoel С. et al., 1993] та Bipycy некрозу селезшки (SNV) [ Dougherty J. et al., 1989] в 10-10C раз1в i однакова з продуктшстю голодного daPr-RSV-C на QT6 . Таи показники описаш дл* найбшышгоширених упаковочних клшш на ochobi Bipycy лейкозу мишей M-MuLV [Mann R.e' al., 1983] та пташиного лейкозу (ALV) - Isolde [Cosset F.-L. et al.,1990]. Упаковочш клггшп Haydee [Cosset F.-L. et al.,1991] продукують ретровхрусний вектор С-пщгрупово! специф1чност з титром 10л3 CFU/мл, що в 1000 разгв поступаеться продуктивное^ нашо! упаковочш!' лшй.

HoBi упаковочш клтши, що мктять вфус-пошчшж на ochobi адаптованого DapiaiiTi високопродуктивного штамму RSV , дають змогу виршшти ряд експериментальних проблем i ретров1русних реплжативно-дефектних системах для транспорту гешв: забруднення пул; рстров1русного вектору решшсативно-компетентним eipycoM; нсвисокий титр векторной: Bipycy на упаковочних иитинах; низький piecHb експресц вставленного гену.

Реплжативно-компетентний вектор tddaPr-RSV-Ce", завдяки наявносп env : розширеною хазяйською специф1чшстю , можна використовувати для переносу гешв у птахи та у ссавщв. Упаковочш клггини F18/pJD мають бути застосоваш для отриманш високопродуктивних стоив решикативно-дефектного вектору, що можна використовувати даи переносу гешв у птахЬ та ссавщв; а також як вектор для генно! терапй пухлин.

Робота виконувалась в рамках державно!' науково-техтчно! програми "Бютехнолопя" по тс Mi " Вивчсння принцитв формування та функщонування нових ретров1русних систем' 1.11.01/019-92 . Результатом u е високопродуктивна бютехнолопчна система для перенос; гешв.

Структура та обсяг роботи. Робота викладена на 105 сторшках друкованого тексту, жладаеться з введения, 4 глав основно! частини, виводав; шюстрована 12 малюнками та 5 габлицями. Список лггератури складае 150 poöiT вггчизняних та закордонних автор1в. 4

Апробащя роботи. Результата дослщженнь представляються на 25 ювшейному KOHipeci Европейського бююшчного товариства (липень 1998, Дашя) та шжлабораторному ceMÍHapi 1МБтаГ НАНУ (ачень 1998).

Публ!кацГь За темою дисертадй опубл1ковано 3 статп та тезюи конференцш.

Особистий внесок дпссртанта. Ochobhí результата , викладеш в робот-i,отримат пошукачем самоспйно. Автор вдячний к.б.н. B.B.Kaiuy6i, к.б.н. С.В.Зубаку та к.б.н. A.A. Михайлику за участь в створент конструкщй peTpoeipycmix векторов та к.б.н. С.М.Серову за цопомогу в створент упаковочних клиин.

МАТЕР1АЛИ ТА МЕТОДИ

В робой використовували фермента виробництва Boehringer Mannheim (ФРГ), Promega (США), реактиви Amersham (Англия), Sigma(CIUA).

Клони DF3 та DFtd7 геномно'1 б1блютеки качиних ембрюнальних ф1бробластт, грансформованих daPr-RSV-C , клоновано! в бактерюфаг ХЕМВЛЗ, отримат в наппй яабораторй [Рындич А. та íh., 1989]. При створенш peipoBipycHHX конструкцш використовували загальноприйнятт методики клонування с застосуванням векторш pUC19, pGEM-3Zf, pSV2-beta G, pBR322 Neo та реплжативно-дефектний ретров1русний вектор pJD 214 Ну , клонований в склада pBR322.

QT6 кл1тини ф^брюсаркоми перегйлки надаш д-м Калоти Г. (íh-t Кюри, Орсе, Париж); пбрщомш клггтш яшиНУ. 21.1, що продукують anti-p27gag антитма, люб'язно надаш ц-ром Гериком Я. (íh-t молек. генетики ЧАН, Прага). Трансфеыцю QT6 клтш та упаковочних клонш здшснювали методом електропорацЫ [Погребний П. та íh. , 1993] та з застосуванням липофектинового реагенту DOTAP Boehringer Mannheim (ФРГ) за рекомендовавши виробником протоколом.

Продукцию BipycHoro капсидного бшку p27gag визначали методом твердофазного ¡муноферментного анаийзу ELISA [Qark D. et al., 1980]. Моноклональш антитша anti-p27gag отримали шляхом пасування пбрщоми HY.21.1 на л^шйних мишах BALB/c з подальшим фракдиануванням ¡муноглобулнпв асцитноТ рздини мишей в 50% сульфата амонно [Monocl. Antibod. ed. by J. Goding, 1986].

Визначення зворотно! транскриптази проводили в 15 мкл клшашого супернатанту за методою [Tereba A. et al., 1977].

Титр рекомбшантного ретров1русного векторусного вектору визначали шляхом заражения QT6 клгган серШними розведеннями супсрнатанта упаковочних клошв [Svoboda J. st al., 1968] та подалыною селекщею на rirpoMimim Б Boehringer Mannheim (ФРГ).

Для визначення послщовностей в1русу-пом1чника в стоках ретровфусного вектор; BipycHy РНК, вщдлену з 30 мл супернатанту упаковочних кштин [Hajkova V.et al., 1982 використовували для дот-блот пбрвдзацй з плазмщними зондами [Boerkoel C.et al., 1993].

Для визначення гомологй кож послщомностями Bipycy-пошчника та реплжативно-дефектного вектору використовували бази даних Gene Bank з сервера Нацюнального 1нститутз Здоров'я (NIH, Washington D.C.,CUIA) та програму Genepro "Riverside Scientific"(CIIIA).

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ

PEIUltKA ТИВНО-КОМПЕТЕНТНИЙ ВЕКТОР НА OCHOBt АДАПТОВАНОГО ДО КА ЧОК ВАР1АНТУ Pr-RSV-C 3 РОЗШИРЕНОЮ ХАЗЯЙСЬКОЮ СПЕЦИФ1ЧН1СТЮ

Хозяйська специф!чшсть pexpoBipycuoro вектору та спектр клггин-мйненей заложить В1Д Env бшку оболонки BipioHy. Розширення хазяйсько! специфичности daPr-RS V-C вщбулось nij час пасування Pr-RSV-C на титанах условно-першсивного хазяша - качки. Огриманий таким чином Bipyc назвали адаптованим , вш вщр!3няеться вщ похщного Pr-RSV-C точковшш нуклеотидними замшами в послвдовностях латеральних инцевих повторив (LTR) та всиз Bipycmix гешв. Найбшьшу ильюсть замш винайдено в райош, що кодуе gp85 домен гену env, який вщповщае за узнавання BipycoM вщповщного рецептора на поверхш клггини [Кашуба та ш.,1993]. Завдяки таким змшам daPr-RSV-C може шфжувати кштини не тшьки курей та качок, але i кштини ссавщв [Hlozanek I. et al., 1992]. Посладовносп пташиного peTpoeipycy штегрують та стабшьно експресуються [Barsov Е. et al., 1996] в клшшах ссавщв, але BipycHa продукцй вщеутня з причини порушення транспорту повнорозм!рно1 РНК в цитоплазму [Knigt J. et al.. 1993] та нсможливост1 ефективного процесування, зборки та транспорту Gag попередника в lüiiTHHax ссавщв [Vogt V. et al., 1982].Птапшш peTpoBipycH повшепо реплжативно-дефсктн1 в клтшах ссавщв, що надае можлив1сть використання реплжапшно-компстентного вектору tddaPr-RSV-Ce" для переносу гешв у ссавщв.

3 ДНК клону DF3 гсномноТ б1бл1отеки ембрюнальних качиних ф!бробласт1в, що MicraTb повний npoBipyc daPR-RSV-C, видалили KpnI-Kpnl фрагмент, що м1стить послщомносп 5'LTR, gag, pol , та субклонували в pUC19. 3 клону DFtd7, що М1стить посладомносп трансформащйно-дсфектного мутанту td daPr-RSV-C, видшили KpnI-Dral фрагмент з послщовностями 3TL.TR, 3' некодуючого району, оберненого повтору Е, гену env, та субклонували в pUC19 (мал.1).

Д1шетування цис-акгивних посладовностей обернених повтор1в (Е), що фланкують sre проводили шляхом вилучення Ball - Mstll фрагменту роз\йром 100 н.п. . Отриману рекомбшантну плазмвду розщепляли по Kpnl сайту и лтрували з Kpnl-Kpnl фрагментом i3 плазмщи, що несе послщовносп 5'LTR, gag, pol. Конструкщя ptddaPr-RSV-Се" (рис.1) е npoeipycoM решикативно-компетентного вектора та основою для створення конструкци Bipycy-noMi4HHKa ptddaPr-RSV-Ce'PS'Neo.

gag pol env src E LTH ^ X. DFS (da PR-RSV-C)

1

+ Kpnl

+puc1»

£ Д gag pol env E LTH Я. DFtd 7 ( td da PH-RSV-C)

Kpnl ♦ pUC1»

£*LTR v gag pol "л

i

M*t Ball

T=3t-T

^ env E LTR 3

pt.O

h Kpnl

pi.«

LTR v gag pol env E L7R

^/Ei

+ Kpnl

p td da PR-RSV-C

fB.II tMitll

LTR "y

Uo

rLTRV

Dral/EeoRI

w

LTH ^

gag pol env LTR

p td da PR-RSV-C

p2.t + Kpnl

Рис. t. Снвма створення репл1кативно-компетен тного вектору ptddaPr-RSU-Ce-.

Частина конструкцП, що наложить до бактер1ального вектора означена тонкою 1зогнутою л1н1ею. gag, pol, enu - рвтров1рдсн1 гени; у -упаковочн! поел!довност!; LTR - латеральн! к1нцвв1 повтори; Е - обернений повтор. Стр1лками означен! сайти для в!дпов1днин ендонуклеа

Kpn I

ЯОВ/ УПАКОВОЧН1 КЛ1тшт НА ОСНОВ1 АДАПТОВАНОГО ДО КАЧОК ВАР1АНТУ Рг-ЯЯУ-С

Нов! упаковочт кштини повинт виршувати проблем, пов'язаш з продукщею решпкативно-дефектного рекомбшантного вектору С-шдгруппово1 специф1чкосп в кшькосп, пор1вняшй з титром похздного ¿аРт-ЯвУ-С на <УГ6 в ввдсутносп продукдй вipycy-пoмiчникa. Для розв'язання щеТ задач до складу реилжативно-дефектноЧ системи включили:

1) QT6 клшши ф!бросаркоми перепиши, вшьш вщ ендогенних peтpoвipycниx послщовностей;

2) в1рус-пом1чник Й с!аРг-115У-Се"Р8"Кео на основ! ааРг-ИБУ-С високопродуктивного пггаму ЯЭУ;

3) реплжативно-дефектний вектор рЛ)214Ну, що переносить ген г1гром11щнфосфотраисферази шд контролем промотору з 5'ЬТЯ втусу некрозу селезшки [8КУ) (Рис.2). Пор^вняння гомологЦ мж послвдовностй вектору рЛ5214Ну та в1русу-тошчника <1аРг-ЯЗУ-Се"Р8Гчтео не показало наявносп дшянок гомологи.

pJD214Ну

Рис.2. Ретров1русннй вектор üD214Hy. Г«н rlrpaы1ц<(ифосфотранефсрам (hygro) транекрибутся а промотору I» 5'ITR пташиного »Ipyey Htuposy е»л«»1кки (SNV).

Модифйсування вихвдного td daPr-RSV при створенш конструкцй Bipycy-потчника спрямовано на якнайбшыне зниження BiporiflHOCri включения РНК eipycy-пошчника до складу peTpoBipycHO'f частой, що продукуеться на упаковочних клтшах. Для цього в генокй peTpOBipycy делетують цис-активш посшдовносп, залучеш до процесу упаковки власнох геномноК РНК до peTpoBipycHO'í частки. У RSV до híx вщносять: \|/ упаковочш посладовносп

LTR у рад pol ^

♦ P« «pGH3ll

♦ Pit I

♦ bttll

i

P6.0 »?'!»« i

LTH » pG1

С

P°1 ^

С any LTR )

itORI

_I +EOORI

llZ^^Hi +Nhal

(S\liO Nao ^ bbw

pBRNao

p2.8 {

N•0 Кип I

LTR ' gag' роГ ^

рб.О PS'

+ Kpn I

♦ Kpn I

♦ Sac)

=n

LTH gag pol any SV4Q Neo LTR p td daPR-RSV-Ca'PS'Nao

Рис. 3. Снема створення конструкцП в1русу-пом)чника.

Чостмна конструкцК, що налвжить до бактер1ального вектора означена тонком 1зогнутою л1н1ею. gag, pol, enu - ретров1русн! гени; у -упаковочн! посл1довност1; LTR - латеральн! к1нцев1 повтори; Neo - reí г1гром1цинфосфотрансфврази; SU40 - промотор SU40 Blpycy. Стр1лкам» означен! сайти для в!дпов1днин ендонуклеаэ.

5'некодуючого району [Katz R. et al., 1986]; обернених повтор1в (E), що фланкуюгь src [Sorge J. et aL, 1983] та послщовносп вщкритих рамок зчитування 5'некодуючого району перед початком gag [Donze О. et al., 1986].

При створенш конструкцйГ в1'русу-пошчника ми обмежились мшшальними необхщними змшами геному вихадного tddaPr-RSV-C: делетували цис-активш послщовносп упаковочно! обласп та обернених повторш (Е), що фланкують src.

Конструкщю Bipycy-noMi4HHKa ptddaPr-RSV-Ce"PS"Neo створювали шляхом включения Nhe-EcoRI фрагменту pBR322 SV40Neo з послвдомностями гену неомщинфосфотрансферази гад промотором SV40 до ptddaPr-RSV-Ce' (рис.2). Делетування сигнал1в упаковки що розташоваш м1ж 5'LTR та gag шциюючим кодоном з метою упередження включения власно! РНК Bipycy-пошчника до складу pcTpoBipycHo'i частки проводили шляхом вилучення Bsteü-Pstl фрагменту довжиною 150 п.н. з 5' некодуючого району ptd daPr-RSV-Ce~Neo (рис 3).

Експресйо структурних гешв peTpoBipycie gag, pol, env було отримано шляхом введения в культуру перепелиних клшш QT6 клонованого в склада бактер1ально! плазмцщ pUC 19 npoßipycy в!русу-пом1чника ptddaPR-RSV-Ce'PS"Neo методом електропорацй . ГИсля тижневоГ селекщ! на середовипд з G418 вццбрали 18 шдивщуальних клошв . ГГродукщю , p27gag капсидного битку зокрема,

Клон упаковочных кллин p27gagв клпинному Л1зат1 (OD^j)1 p27gag в клгаинному супернатмгп TOD ,п,)2

F5 2,497 2,230

F9 2,507 -

F16 2,100 1,350

F18 3,050 1,520

F19 1,900 2,400

F20 1,508 2,250

F25 1,703 2,200

F26 1,823 2,300

F28 1,670 2,250

F34 1,413 1,600

QT6 1,480 1,100

QT6-daPr-RSV 2,341 2,601

КСА3 0,172 0.132

Табл. 1 . р27дад продукцйя упаковочннн клон1в. I) р27дад в кл1тннннн л1»атан упаковочннн клон1в, вмзначеннй ELIJA; 2) р27дад в супернатаитан упаковочннн клон1в, вмзначеннй ELISA; 31KCR -к1нський снроваточннй альбум1н, внкорнстаннй як негативний контроль.

та клшшного Л1зату упаковочних кштин з anti p27gag антитшами в реакци ELISA . Присутшсть p27gag виявили як в супернатантах, так i в клтшних л1затах упаковочних клошв . Даш , наведеш в табл.1 свщчать, що клони упаковочних кштин F5,F9,F16,F18 спроможш продукувати Bipycm бшки на piBHi, аналопчному з QT6 кл¡тинами, трансформованими похадним адаптованим Bapiam-ом daPr-RSV-C (QT6-daPR-RSV-C в табл. 1) та необхщному для упаковки реплткативно-дефектного ретров1русного вектору.

3 метою визначення продуктивное™ упаковочних кштин, 10 упаковочних клошв трансформували плазмздою pJD 214Ну з послвдовностями реплжативно-дефектного ретров1русного вектору, що несе ген неомщинфосфотрансферази пвд контролем промотору з 5'LTR Bipycy некрозу сслезшки (SNV). Ьщивщуальш клони кштин Fn/pJD культивували на протяз1 трьох шсящв для визначення ретров1русного вектору. Наявшсть peipoßipycy в супернатантах шдивщуальних клошв упаковочних юптин визначали шляхом тестування 'ix полшсразно! активносп . 3 75 культивованих шдивщуальних клона тшькв 5 клошв F18/pJD показали шдвшцення радюактивносп теля проведения пашмеразно! реакци, характерне для peTpoBipycHo'i реплйкацй (табл.2).

Титр отриманого peTpoßipycHoro вектору визначали шляхом шфнеування QT6 кштин сершними розведеннями стоив векторного Bipycy. Осшльки один i той самий сток похщного daPR-RSV-C показав однаковий титр на QT6 та CEF, то ми зваживши на те, що QT6 вшьш ввд ендогенних регров!русних посшдолшостей, ввддали Км перевагу при BHÖopi системы для визначення титру. Залежшсть мЪк включениям [^Н] ТТР в пол1меразнш реакци при визначенш зворотньо! транскриптази та кшыастю BipioHie peTpoBipycy, шо знаходиться в тсстуемому зразку супернатанту упаковочного клону така, що радиоактившеть в кшькосп 1500-16000 СРМ/хв. вщповщае присутнос-ri 10л5 - 10л6 BipiomB peTpoBipycy в MLninhpi тестуемого супернатанту [Teieba А. et al., 1977]. Саме тому клони N 3-4, що показали нижчий поршняно з клонами N1,2 р1вснь радюактивносп при визначенш зворотньо! транскриптази не показали значно! розбжносп в Tmpi Bipycy, визначенного шляхом заражения QT6 (табл. 2).

Пор1вняння продуктивно«! упаковочного клону F18/pJD з аналопчними (на 0CH0Bi QT6) упаковочними титанами QenvA [Boerkoel C.et al., 1993], яю кистять в1рус-ш»ичник на ocHosi BH-RSV штаму RSV показують шдвшцення продуктивносп пор^вняно з Boerkoel et al. в 10-100 paaiB, та пор1вняна з найбшьш продуктивними пташиними упаковочними клгганами Isolde[Cosset F.-L. et al.,1990], створеними на основ! Bipycy пташиного лейкозу (ALV). Титр

юдукуемого Р18/рЛ) псевдотипованого рЛ)214Н у не вщлзняеться вщ титру ааРг-ИвУ-С, що

щчить про вдалий виб)р типу хазяйських клтш та поеднання послвдовностей в1русу-пош'пшка

вектора, що забезпечуе високу продуктившсть системи. В процеа культивування клотв

аковочних юптин вже шд час перших двох-трьох тижтв часто детектують реплжативно-

мпетентний в1рус, що з'являеться в пул1 векторного В1русу завдяки рекомбшащям з в^русом-

шчником або з ендогенними ретров1русними послздовностями.

Застосування (2Т6 клггин, вшьних вщ ретров1русних послвдовностей та поеднання

ктору та певним чином модифкованого в1русу-пом1чника, ян не мають участив гомолога в

Клон Шипмеразна актавшсть супернатант1В упаковочшх клптш Р18/рЛ5 Титр векторного вирусу, (СТи/мл) на <2Т6

Номера пасааав

2й Зй 4й 5й бй 7й 8й

Радюакпвгасть, СРМ/хв.

РШрЛЭ

1 920 420 1276 4000 2108 12970 10408 5,4 х10лб

2 - - 2514 8392 2502 18860 27556 4,8 х10лб

3 1122 184 623 1696 968 986 4,9 х10л6

4 - - 1055 4132 1005 910 4,4 х10л6

5 - 1908 5004 1678 4610 5,1 х10лб

Р5/рГО 164

Р9/рЛ) 170

Р16/рГО 166

Р19/рЛ> 138

Р20/рГО 114

Р25/рЛ) 110

126

тгщт 225

Р34/рЛЭ 238

С)тб 180

ааРг- 16090

ЯвУ-С

Табл.2. Продукц1я ретров1русного вектора pJD214Hy

цив!дуальними клонами упаковочнин кл1тин.

Пол1меразна активн!сть супернатанПв упаковочнин клон1в

точено по включению ['НПТР в реакцН зворотньо! транскрипций . Титр гров1русного вектора рао214Ну виэначали шляном заражения 0Т6 кл!тнн 1йнмми разведеннями супернатант(д клон1в упаковочнин кл1тин Р18/р^.

сво!х геномах, зв1в до мипмуму можливкть забруднення пулу векторного В1русу |214Нучужинними послщовностями. 3 метою визначення В1русу-пом11гника в продукуемому

пут ретрсшрусного вектору, ми проводили довгострокове (бшыпе 3 мшящв) культивуванш в1рус-продукуючих кттин для поширення чужинного В1русу.

Для визначення послщовностей в1русу-гтом1чника в стоках решпкативно-дефектной вектору рЛ)214Ну використали метод дот-блот пбридизацй. РНК, що видшяли : концентрованих ультрацентрифугуванням в1русних стоив,

а) 6)

Рис.4. Дот-блот РНК з в1руснин ctokIb ретров1русного вектор; pJD2t4Hy, що продукуються |ндив|дуальними клонами N1-5 упаковочни! — кл1тин F18/pJD (Б-Е) та пражського штаму Blpycy саркоми Рауса CPr-RSD-C) (П' а також кл1тинно! РНК з ембр1онального мопсу людини (Ж), яку використал в якост! негативного контролю.

Блот г!бридизували с плазм1дними зондами:

а) - hygro - Sad фрагментом pJD2l4Hy (рис.2), який нес посл)довност1 г1гром1цинфосфотронсферази та з ptddaPR-RSU-Ce" (б) посл1довностями в1русу-пом1чника .

продукованих клонами N1-4 упаковочних клггин F18/pJD для визначенн посладовностей вектору пбридизували з зондом, що несе SacI фрагмент pJD214Hy (рис. 2) послвдовносп гигромщинфотрансферази (hygro) (рис.4, а); а для визначення посгадовносте Bipycy-потчника - з плазмщним зондом ptddaPr-RSV-Ce" (рис.4,б). Проби BipyCHO'i векторж РНК клошв N1-4 F18/pJD та РНК Bipycy Pr-RSV-C в илькосп 150нг, 80нг, 40 нг ,20 и наносили на нейлонову мембрану та пбридизували з вщповщним зондом. Тотальну кл1тинн

НК ембрюнального мозку людини використовували як негативний контроль, a BipycHy РНК •-RSV-C - як позитивней. Зразки BipycHO'i РНК з стоив векторного Bipycy, що продукують юни N1-5 F18/pJD показали позитивней сигнал в пбридизаци з hygro зондом та не показали бридизаци' з зондом з послздовностями в1русу-пом1чника. Це свадчить про те, що пул юдукуемого клонами N1-5 упаковочних клшш F18/pJD реплйсативно-дефектного вектора [D214Hy не мгстить послщовностей В1русу-пошчника.

Умови реакцй дозволяють отримати Ч1ткий позитивний сигнал при зв'язуванш 10 нг НК Pr-RSV-C з послщовностями Bipycy-noMi'nraKa (рис.4,б). Тому, ввдсутшсть позитивного пиалу в пбридизаци 150 нг BipycHO'i векторно! РНК з RSV послвдомностями дае змогу эипустити, що можливий недетектуемий дот-блот пбридизащоо BMicT в цих стоках РНК русу-подашика складае менше 10 нг, що складае менше б % вихадного пулу ретров1русного ¡ктору pJD214Hy. Аналопчш дат в пбридизаци РНК ретров1русного вектору з >слщовносгями в1русу-пом1чника, що продукуються упаковочними титанами f 2 на 6a3i М-luLV отримаш [Mann R.et al., 1983]. Показово, що при створенш конструкщТ в1русу-пошчника жористовували стратегйо мшмального модиф1хування геному M-MuLV та дилетування Ч7 иковочно! области геному.

ГЦцсумовуючи даш, отримаш для пташиних ретров1русних решпкативно-дефектнпх [стем на ochobi QT6 юитин, можна видиити ;цп груш експсриментальних проблем, що не ipiiuem попередшми авторами:

а) проблема високо! продуктивное^ упаковочних клипн;

б)вщсутшсть регопкативно-компетентного Bipycy в пул! продукуемого :комбшантного вектора.

Проблема упередження поновлення реплшативно- компетентного в]русу-пом1чника фйпувалась шляхом найбшьш повного делетування цис-активних упаковоч1шх послщовностей, яучетх до упаковки власно! РНК Bipyca-пошчника . Однак, вщсутшсть цис-активних эслщовностей повшстю не виключае упаковки РНК Bipyca-пошчника, а призводить лише до [иження проценту РНК Bipyca-noMi4HHKa, включенного до складу BipioHy. [Aronoff R. et al., )93]. Пшля трансформацц упаковочных клотш послщовностями реплйсативно-дефектного жтору, в продукуемому пул1 векторного Bipycy часто детектують посладовносп дефектного за иковочними послщовностям1 Bipyca-noMi4HHKa в малШ илькосп кошй та Jtnmnmy РНК. Для гиження в1ропдносп гомолопчно! рекомбшацц' мж псюлвдовностями nipycy-noMi'nnfKa та ¡кторного Bipycy при можливШ сумкшй упаковщ reHOMiB цих BipyciB в BipioH на упаковочних птинах, зменыпували довжину участив гомологй м1ж посл1ловноотя?.т вектора та Bipycy-)Mi4Hmca шляхом замши 3'LTR Bipycy-noMi4mnca polyA SV40. [Savatier P. et al., 1989 ]. або ляхом залучення послщовностей р1зних BipyciB до складу в1русу-по\пчндаа[ DoughertyJ. et al., '89]. Швидисть рекомбшащй вщновлення решшсативно-компентного Bipycy намагались

1 1

знизити також шляхом OKcnpeciï в1русних гешв в1русу-пом1чш!ка в склада двох плазмвд [Cosse F.-L. et al., 1990]. Наявшсть р1зних транскршгпв для gag-pol та env гешв в клггиш котю природний процес сплайсингу первинного транскрипту ретров1русного npoeipycy в юптит та, н думку авторш, знижуе в1ропдшсть взаемода гомолопчпих посладомносгей вектору т "розбитого" геному Bipycy помчшжа . Таке глибоке модифнсування Bipycy-noMiHiniKa призвел до зниження р1вня транскрипцц BipycHOÏ РНК та скспресй в1русних гешв пор1вняно з дики BipycoM[Savatier P. et al., 1989 ], а також зниження продуктивно«! упаковочних кшти nopiBHHHo з диким BipycoM на дешлька порядив[Воегкое1 C.et al., 1993]. 1стотний вклад зменшення р1вня транскрипцй модифкованого в1русу-пом1чника може вносити делетувшш 3'LTR, залученого до ре гуля цй енхансерно! активносп 5'LTR [Norton P. et al., 1987 ] ; a тако; 1щс-активних послщовностей з 3' некодуючого району, що приймають участь в специф1чш взаемоди з клтшними факторами [Molina R.-M. et al., 1995].

При створенш конструкцй' в1русу-пом1чника р tddaPr-RSV-Ce-PS-Neo ми обмежилис мшгмальними необхщними змшами, яю б упереджали залученню послщовностей Bipycj пошчника до складу псевдотипованого BipioHy: делетували цис-активш послщовносп 1 упаковочно! области 5' некодуючого району tddaPr-RSV-C та коротких noBTopiß (Е) фланкуючих sic. Такий тдхщ виявився гопдним та дав можливють виршшти задачу створенн клптшноТ лшц, що продукуе пул реплжативно-дефектного ретров1русного вектору, вшьний bî послщовностей Bipycy дикого типу. Упаковочш клггини показали продукщю nipycHHX бшюв i piBHi QT6, шфЬсованих daPr-RSV-C . Високий ргвень експресй в1русних гешв свщчить про те те що делстування цис-активних послщомностей \|/ упаковочно! обласп та коротких noBTopiB ! геному tddaPr-RSV-C не дало суттевого впливу на транскрипщю в1русу-пом1чника на QT( Продуктившсть упаковочних - клггин F18/pJD _ складас 10А6 CFU/мл, що аналопчно продуктившстю вихщного daPr-RSV-C на QT6.

Детальне вивчення процесу сборки peTpoBipycHGï частки показало, що геномна РН] peTpoBipycy, що мае певну вторинну структуру в упаковочшй обласп , включаеться до склад BipioHy в процеся взаемодй з Gag 6inKOM[Rnigt J.et al., 1994]. Участь р1зних продукпв гену ga RSV в ушзнавант геномно!" РНК peTpoBipycy була об'ектом уваги багатьох достдник! детальний анали po.ii окрсмих участив Gag в процесл сборки BipioHy показав, що делетуван» резких функщональних участив gag гену не призводить до значного зниження р1вня упаковк власши РНК peTpoBipyca [Sakalian M. et al., 1994]. A накопичення незначащих точкових замш gag призводить до значного збшьшення включения чужерщно!' РНК до складу BipioHy. Так, да добре дослвдженного дефектного за упаковкою ретровфусу SE21Qlb [Anderson D. et al., 1992 ввдомо, що втрата Bcix посладомносгей 5' некодуючо'1 обласп у в поеднанш з накопичення незначащих точкових замш в gag rem npoeipycy, яка вщбулася при пасуванш йога i ембрюнальних ф1бробластах перетлки, призвела до того, що переважна бшышсп

erpoBipycroix часток, продукованих цими природшми упаковочними клггинами шстила ужеродну (клтшну) РНК; власна РНК SE21Qlb детектувалась лише в 1% продукуемого ими природшми упаковочними клпинами Bipycy. daPr-RSV-C, як i SE21Qlb, е одшш з исокопродуктивних штам1в RSV (титр на QT6 10л6 FFU/мл), та мае точков1 залсни gag в айонах, аналопчних SE21Qlb [Кашуба та ш.,1993]. Виходячи з аналоги з SE21Qlb, природним ефектним за у упаковочною областю eapiairroM RSV, який мае точечш замши в gag геш, акопичеш в npoijeci пасування на ембрюнальних ф!бробластах перешлки, та npoBipycoM Bipycy-ом1чшжа ptddaPr-RSV-Ce"PS"Neo можна припустити, що упаковочш клггини, як1 мають ггегрований Bipyc-noMi4HHK на основ! адаптованого до качок вар!анту Pr-RSV-C, подабно E21Qlb, не повинн1 бути спроможними до упаковки власно! РНК . Дот-блот пбридизащя ¡дгвердила наше припущення та не показала присутноеп RSV послвдомностей в В1русних гоках решпкативно-дефектного вектору pJD 214Ну, що продукуеться упаковочними клинками 18/pJD (рис.2Б). Упаковочш клггини на основ1 tddaPr-RSV-C, подавно SE21Qlb, надають ще цин приклад того, що утрата у упаковочной' облас-ri та накопичення випадкових точкових замш gag reHi ретровирусу, що вщбуваються шд час пасування на кл1тинах неспециф1чного хазяша , даграють суттеву роль в здатносп peTpoBipycy включати власну РНК до складу perpoBipycHoi' астки. На це необхщно зважати при nn6opi ретров1русних послщовностей для створення нових :плжативно-дефектних систем.

Застосування адаптованих BapiamiB peTpoBipycie, яю пройшли селекщю на клггинах гспециф1чного хазя'та, в якосп основи для створення ретров1русних векторних систем надае ,югу знизити частоту випадкових мутащй та делещй, характерну для пасування peTpOBipycHoro гктору в культур! клггин [Barsov Е. et al., 1996]. Таким чином можливо гадтримувати високий вень експреси Bipycmix бишв в1русом-пом1чником та тдвшцити генетичну стабьтьшсть :тров1русного вектору, що переносить вставлений ген.

1 3

ОСНОВЫ РЕЗУЛЬТАТЫ РОБОТИ ТА ВИСНОВКИ

Розроблено та охарактергзовано новий реплкативно-компетентний вектор упаковочш клггини для ретров1русного переносу гешв на основ1 адаптованого до качок BapiaH празького штаму Bipycy саркоми Рауса (daPr-RSV-C) з розширеною хазяйською специф1чшстр

1.Ha основ! адаптованого до качок вар!анту празького штаму Bipycy саркоми Pay (daPr-RSV-C) з розширеною хазяйською спсциф^чшстю створено решикативно-компетентк вектор tddaPr-RSV-Ce".

2.На основ! мшшальним чином модифжованого адаптованого Bapiairry Bipy саркоми Рауса створили конструкций Bipycy-покочника ptddaPr-RSV-Ce"PS"Neo.

3. Упаковочш клггини взмоз1 продукувати Bipycmut p27gag на piBHi, аналогичному QT6 клшшами, трансформованими вихвдним адшггованим вар1антом daPr-RSV-C та необхвдно; для упаковки реплнеативно-дефектного ретров1русного вектору.

4. Показано, що упаковочш клггини F18/pJD продукують реплжативно-дефектн ретров1русний вектор pJD 214Ну на ochobi Bipycy некрозу селезшки з титром 10л6 CFU/r характерному для вихщного daPr-RSY-C в вщсутносп продукци в1русу-пом5чника.

5.В)Дсутшсть цис-активних послщомностей упаковочноТ облас-ri 5' некодуючого райо та обернених повтор1в Е, що фланкують sre, та накопичення випадкових точкових замш в g rem адаптованого варианту pcTpoeipycy, яга вщбулися шд час пасування на кштин неспециф1чного хазяша, ввдграють суттеву роль в здатносп peTpoeipycy включати чужерщ РНК до складу ретровгрусно! частки.

б.Застосування адаптованого Bapiamy ретров1русу в якосп основи для створен в1русу-пом1Ч1П1ка в нових упаковочних клтшах дало змогу обмсжитись мнпмальними змша; геному Bipycy дикого типу при створенш конструкцй Bipycy-noMi4HHKa та забезпечило висок. р1вень експресй BipycHRX гешв та продукцй векторного Bipycy упаковочними _ титанами ввдсутносп детсктуемо! продукцй Bipycy-noMiHHHKa. Створення нових peTpoBipycmix систем 0CH0Bi адаптованих BapiaHTie peTpoeipyciB вщкривас новий пщхад в виршкшш пробле] вщновлення решнкативно-компетентного Bipycy-noMi4Hroca в реплисативно-дефектн ретров1русних системах та надае HOBi можливосп для шдвшцення генетично!' стабшьнос ретров1русного вектору.

ПЕРЕЛЙС Р0Б1Т, ЩО ОПУБЛШОВАН! ЗА ТЕМОЮ ДГСЕРТАЦП

1. Кайда И.В., Рындич A.B. Применение ретровирусных векторов для ненаправленного переноса генов у птиц//Биополим. и кл. (Киев).- 1997.-1.-С.5-13.

2. Кайда И., Цыба Л., Болтовец П., Кашуба В. Создание системы для ретровирусного :реноса генов посредством векторного вируса на основе Pr-RSV-C с расширенной хозяйской [ецифичностью// Биополим. и кл.(Киев)-1997.-5-С.408-416.

3. Кайда И.В.,Серов С.М., Михайлик A.A., Болтовец П.Н., Кашуба В.В., Рындич A.B. овые упаковочные клетки на базе адаптированого варианта вируса саркомы Рауса// Биополим. кл.(Кисв)-1998, в печати.

Кайда Г.В.Розробка та характеристика нового решнкативно-компетентного :ктора та упаковочних клтш для ретров!русного переносу reHiB. Рукопис. Дисертащя l здобуття наукового ступеня кандидата бюлопчних наук за спещальшстю 03.00.03 -элекулярна бюлопя.-1нститут молекулярной бюлогп'та генетики HAH Украйш, Клв, 1998.

Новий регопкативно-компетентний вектор tddaPr-RSV-Ce" та упаковочш клшши L8/pJD створен! на основ! трансформацюнно-дефсктного мутанту адаптованого до качок piam-y празького пгтаму sipycy саркоми Рауса (td daPr-RSV-C) з розширеною хазяйською :ециф!чшстю. Застосування адаптованого Bapiairry RSV в якосп основи для створення Bipycy->Mi4HHKa дозволило отримати високу продукщю векторного Bipycy С пщгруповоТ специф!чносп итр 10л6 CFU/мл) в вщсутносп Bipycy-покпчника.

Упаковотн1 клггини F18/pJD надають ще один приклад того, що вщсуппсть \)/ аковочноТ обласп в поеднанш з накопиченням точкових мутащй в gag геш ретров1русу Йграють важливу роль в здатносп peTpoeipycy включать власну РНК до складу peTpoBipycHoi' стки.

Hoßi вектори можна застосовувати для переносу гетв у птах1в та ссавщв, а також для hhoI Tepanii пухлин.

Ключов! слова: ретров1русний вектор, упаковочш клшши, хазяйська специф1»шють.

Кайда И.В. Разработка и характеристика нового репликативно-компетентног вектора и упаковочных клеток для ретровирусного переноса генов. Рукопиа Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальное! 03.00.03 - молекулярная биология, Институт молекулярной биологии и генетики НА] Украины, Киев, 1998.

Новый репликативно-компетентный вектор tddaPr-RSV-Ce" и новые упаковочны клетки F18/pJD созданы на базе трансформационно-дефектного мутанта адаптированного уткам варианта пражского штама вируса саркомы Рауса (td daPr-RSV-C) с расширенно хазяйской специфичностью. Использование адаптированного варианта RSV как основы дл создания вируса-помощника позволило получить высокую продукцию векторного вируса С подгрупповой специфичности (титр 10л 6 CFU/мл) в отсутствии продукции вируса-помощника.

Упаковочные клетки F18/pJD представляют еще один пример того, что отсутствие упаковочной области в сочетании с накоплением точечных мутаций в гене gag играют важну] роль в способности ретровируса включать собственную РНК в состав ретровирусной частицы Новые векторы могут быть использованы для переноса генов у птш млекопитающих, для генной терапии опухолей человека.

Ключевые слова: ретровирусный вектор; супаковочные клетки; хазяйскг специфичность.

Kaida I.V. Development and characterization of new replicating vector and packagin cells for retroviral gene transfer.- Manuscript. Thesis for a degree of Doctor of Philosophy (Ph.D.) i Biology, specialty 03.00.03 - Molecular Biology.- Institute of Molecular Biology and Genetic

National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 1998._______

We have developed new replicating vector tddaPr-RSV-Ce" and new packaging eel F18/pJD on the base of transformation-defective mutant for duck-adapted variant of avian Rous sarcorr virus Prague strain subgroup С (td daPr-RSV-C) with the extended host range. The use of adapte variant avian RSV as the base for helper virus allowed to obtain a high productivity packaging eel F18/pJD (titer 10лб CFU/ml) and to avoid of the replicative-competent virus appearance in a same time Packaging cells F18/pJD give once more example that the loss of у packaging region an accumulation of point mutation in the retroviral gag gene play a substantial role in the ability I incorporate the own RNA to retroviral particle.

New vectors which have env gene with the extended host range can be used for gene transfi into birds and mammals, and for cancer gene therapy as well.

Key words: retroviral vector, packaging cells, host range