Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка хемилкминесцентного анализа для иммунодиагностики сибирской язвы

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка хемилкминесцентного анализа для иммунодиагностики сибирской язвы"

Государственный комитет по санитарноэпвдемиологическоыу

надзору России РОССИЙСКИЙ' ОРДЕНА ТРУДОВОЮ КРАСНОГО. ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ЖСЛЕДОЗАТЕЛЬСКИЙ ПРОТИВОЧУМНЫЙ ИНСТИТУТ "МИКРОБ"

На правах рукописи Уда 616.981.51

КСВАЛЕНКО АЛЕКСАНДР АЛЕКСЕЕВИЧ »

РАЗРАБОТКА ХЕ:,:ЖГЖСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ЙШУНОДШТОСШИ

сибирской язвы

03.00.07- - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени-, кандидата биологических наук

Саратов 1992 г.

г

Работа выполнена в Волгоградском научно-исследог тальс-ком противочумном институте.

• Научный руководитель - доктор медицинских наук ЛИШВД-КИЙ A.B.

О ф и ц и а льнне оппоненты; Доктор медицинских наук, профессор АШСИМОВА Т.И.; Кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник СТЕПАНОВ A.C.

Ведущая организация - Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт.

Автореферат оазослан 1992 г.

Защита диссертации состоится " УУ^ 1992 г.

Д 074.32.01 при Российском ордена Трудового Красного Знамени Научно-исследовательском институте "Микроб"(410601, г.Саратов, ул.Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб".

Ученый секретарь. Специализированного Совета, доктор биологических наук,

профессор Г. А. Корнеев

специализированного совета

ОБЩАЯ ХАРАКЗЕЖТИКА РАБ01Н

Актуальность исследования. В последние годы значительно возрос интерес исследователей к использованию хемилшинесценции для различных аналитических целей. Регистрация спонтанного и усиленного свечения биологических субстратов позволила увеличить чувствительность по выявлению исследуемых веществ. Недавно хемилюминесцентные реакции начали применяться в имиукоаналиьах. Однако имеются липь единичные работы, посвященные применению хемилюминесценгного т.муноанализа в медицинской микробиологии. Показана возможность выявления бо-тулинического токсина, антигенов чумы, 'лептоспир, синегнойной палочки, антител к вирусу краснухи, цитомегаловирусу и возбудителю малярии (коровкин С.А. с соавт., 1991, М^ск^ез^ О. й^, 19С5). 3 то же время в доступной литературе отсутствуют работы по использованию анализа для лабораторной диагностики сибирской язвы."

Одновременно хемилюминесцекцию возможно использовать для изучения функциональной активности фагоцитов лабораторных животных и человека. Применительно к возбудителю сибирской язвы такие работы единичны, к тему же пока отсутствуют сравнительные данные по пригодности хемилюминесцентного метода исследования с визуальными для оценки функционального состояния фагоцитов при их контакте с возбудителем сибирской язвы.

Таким образом, применение хемклюминесцектного анализа для оценки клеточного и гуморального ии?",-'китета представляется заманчива.:, так как использование одного прибора для измерения сверхслабого свечения позволит не только'- ла. ранних этапах развития заболевания обнаруживать возбудитель сибирской язвы и антитела к нему, но и оценивать фагоцитарную активность макрофагов и лейкоцитов животного и человека.

Цель работы - разработка метода "хемшгюминесцент-ного анализа для иммунодиагностики сибирской язвы.

Основные задачи исследования: ' I. Оптимизация условий хемилюминесцентного иммуноанализа для эффективного обнаружения в. anthracis.

2. Оценка возможности использования хемилюминесцентного иммуноанализа для выявления антигенов и-антител в диагностике экспериментальной сибиреязвенной инфекции,

3. Хемилюминесцентный анализ активности фагоцитов in vitro лабораторных животных по отношению к клеткам_сибиреязвенного микроба различного антигенного состава.

Научная новизна

Разработан высокоэффективный катод хемилюминесцентного иммуноанализа для . .-¿явления антигенов и специфических иммуноглобулинов В. anthracis. 1

Впервые на основе хемилюминесцентного иммуноанализа разработана система дифференциальной оценки иммуноглобулинов к различным антигенным комплекса;.! возбудителя сибирской язвы.

Предложен тест-объект для хемилюминесцентного анализа функциональной активности фагоцитов in vitro лабораторных животных, инфицированных В» anthracis.

Показана динамика фагоцитарной активности полиморфноядер-ных лейкоцитов в процессе иммунизации лабораторных животных различными антигенными комплексами сибиреязвенного микроба с помощью хемилюминесценции.

Практическая ценность. Результатом проделанной работы явились методические рекомендации "Использование хемилюминесцентного иммуноанализа для лабораторной диагност.. :и особо опасных инфекций", утвержденные 25 сентября 1991 года заместителем начальника ГЭУ МЗ СССР Г.Г.Онищенко в

методическом пособии "Современные метода диагностики ОСИ и способы юс применения" под редакцией д.м.н.-проф. Л.Ф.Зыкина и к.м.н. ст.н.с. С.А.Коровкина. - Саратов, 1952.

Вышеуказанный документ используется в практической и научной работе ряда лабораторий Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены:

- на Симпозиуме с метдуна^.д.ым участием "Иммунодефициты и аллергия" (Москва, 1980;

- на ХУЛ съезде Всесоюзного общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов юл. И.й.Мечникова (Алма-Ата, 1989);

- на Р&бочем совещании "Состояние и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций" (Оболенск, 198^;

- на заседании секции "Инфекционная иммунология" Первого Всесоюзного иммунологического съезда (Сочи, 1989;

- на У 7 Всероссийском съезде микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Ниетий Новгород, 199Т1

ОСКОВШЕ ПОЛОНЕНЖ, ВЫНОСЖЕ НА ЗАЩИТУ:

I о Оптимизация и- адаптация условий проведения хемилшминес-цшткого иммуноанализа для иммунодиагностики си;" трской язвы.

4 '

2. Высокоэффективная детекция антигенов в. ап1;Ьгас1ви специфических иммуноглобулинов к ним при помощи хемилюминесцентно-го иммуноанализа.

2о Дифференциальная оценка иммуноглобулинов к различным антигенным комплексам возбудителя сибирской язвы на основе хемилю-минесценткого иммуноанализа.

4. Использование, хемилюминесцентне ■ иммуноанализа в качестве самостоятельного метода лабораторной диагностики сибирской язвы.

5. Возможность определения функциональной активности уаго-

цитов лабораторных животных, иммунизированных антигенами B,aath-racia с помощью хемилюминесцентного анализа.

Публикации. Основное содержание работы отражено в 9 опубликованных статьях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованных источников, в который входит 46 отечественных и :2Т иностранный источник. Работа изложена на 126 страницах машинописного тенета, включает 12 таблиц и IS рисунков.

С0ЛЗЙ7АНЖ РАБОТУ -,

Материалы и методы исследования. В работе были использованы вакцинные атакмы B.anthracis СТЙ и Стерне, а также £Р:/рулентный капсулообразующий штамм Дэвис, полученные из музея живых культур Волгоградского научно-исследовательского -ротивочумного института. Кроме вылеказЕаннкх, применяли шта.чмы КГ.' 33 и ¡С. 34, у которых были искусственно элиминированы факторы вирулентности, предоставленные Российским научно-исследовательским противочумным институтом "микроб".

Сибиреязвенный токсический, культуральный фильтрат получали после выращивания лта:?ма 34F2 на среде с гидролизатом казеина по методу В.*.Haines et al (1965).

Капсульное вещество выделяли из штамма Дэвис э условиях, оптимальных для капсулообразования, по методу О.Ы.Лспггкина.

Опыты проводили на беспородных кроликах "ииклилла" массой 2,5 - 4 кг (50 животных), беспородных морских свинких :.:ассой 300 - 400 г (250 животкыд из питомника Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.

Выявление и характеристику ант-тел и антигенов осуществляли методом двойной галгунодифЛузии по Сухтерлоки, непрямым методом

- б -

флюоресцирующих антител, методом твердофазного иммуно^ерентного анализа (ТИШ.

Из кроличьих антиснвороток выделяли иммуноглобулины с помощью полиэтиленгликоля (Bergquist 1!. еЪ а1> 1970), Препараты антител метили пероксидазой хрека методом перчодатного окисления (ша*Мезеп Ь. еЬ а1, 197?) . В качестве субстрата в 1ЖА использовали орто^енилендиамин. Дяя изучения функциональной „ активности фагоцитов применяли ШТ-тест и хемилюминесцентный метод.

Влияние сиби£зязвенного микроба на люминолзависимую хеш- -люминесценцию суспензии перитонеаликых.макрофагов и полиморфно-ядеоных лейкоцитов, а также квантовый выход хемилюминесцентного жя.:уноанализа (ХЛПА) измеряли на люминометре 1250 ЬКВ-'йаНао (Пвецкя).

Лолучекгые результаты обрабатывали методами вариационной статистики.

гезультш ЮСЛЕДВАНИй

Проведенные исследования показали, что наиболее элективным твердофазны:; носителем для ^остановки твердофазного ХЛИА являются полистироловые кюветы фирмы "СИгисоп" Швеция „ 'Показано, что для сенсибилизации полистироловнх измерительных кювет лучше всего использовать свежеприготовленные иммуноглобулины, однако применение лиофильно высушенных иммуноглобулинов возможно при добавлении в сенсибилизирующий раствор 4-5% полиэтиленгликоля.

Оптимальные параметра рН сенсибилизируище.. буферной систе-,-лы находятся в пределах 7,4 - 9,5, независимо от иошой силы буфера. Сравнительная оцеь.са качества сенсибилизирующих буферов 0,СБМ карбонатно-бикарбонатного и 0,11а фосфатного показала, что оба они млут быть использованы.

Для полистироловых измерительных кювет способность к специфическому связыванию с антигеном достигалась при сенсибилизации иммуноглобулинами в концентрации 50 - 100 мкг/мл. Дальнейшее увеличение концентрации приводило к снижению связываюцей 'активности. Сорбция белков на полистироловый носитель непосредственно зависи-ла от времени и температуры инкубации. Так, при 37°С сенсибилизация белка проходила вдвое эффективнее, чем при 4°С. Для уменьшения фс;;0Ес:о хемилюминесцентного излучения возможна обработка носителя альбумином или желатиной, которые позволяют заблокировать остаточные центры связывания, с которыми могли бы неспецифически взаимодействовать молекулы конъюгата.

Время, затрачиваемое на проведение ХЛИа, в основном, зависит от этапа, необходимо^ для специфического связывания антигена с антителом, доказано, что оптимальной температурой инкубанип является 57°С. При этой температуре за 2 ч .антигены взаимодейство' чали с сО*-' антител. Процесс образования комплекса "антиген-антитело" заз:;с-т от скорости перемекпгвания. Бь.!стрее всего равновесно в системе устанавливалось при'скорости перемешивания 1300 м;ш-1.

Основным отличием . .¡бранного нами варианта лЛИА и Т<йА, кроме аппаратурного обеспечения, является использование различите" субстратных комплексов. Регистрируемым параметром ХЛИА является интенсивность излучаемого света, которая зависит от начальных концентраций фермента и комп чентов субстрата» значений рЯ растворов и температуры. Изучена зависимость свечения от рК среда для реакции совместного окисления лттминола и р-йодфенола перекисью водорода в присутствии пероксидазы хрена. Кривая имеет четко выраженный макету при значениях рН 6,06 - ¿,15. Кроме этого исследована зависимость квантового- выхода света для реакции окисления лшинола перекисью водорода как в присутствии пероксидазы,-так и в отсутствие фермента. Оптимальные значения рН для окисле-

ния одаого люминола близки и находятся в предела Т2 - 13. Смещение рН к нейтральному значению для окисления люминола и р-йод-фенола значительно улучшает соотношение сигнала к уровню фона, что увеличивает чувствительность анализа. Отношение сигнала к уровню фона при использовании трехкомпонентного субстратного комплекса оказалось равным 120. Достоинством трехкомпонентного субстрата, кроме значительного увеличения ;гнтенсивности хемилюмине-сценции, является еще и длительно.. время стационарного участка свечения (15 - 30 мин). Вследствие этого результаты измерения интенсивности хемилюминесценции в реакции совместного окисления субстратов менее подвержены влиянию перемешивания реагентов, а также значительно облегчается учет результатов ХЛИА на люминомет-ре.

Проведенный подбор концентраций субстратов показал, что наиболее эффективный комплекс состоит из 1,3x10 М люминола, 2,7х • хЮ_3М Н202 и 6,0хЮ"СЫ р-йод-енола в 0.0БМ Трис-НС1 буфере рН 8,06. 3 этих условиях оценена зависимость интенсивности хемилюминесценции при различных концентрациях пероксидазы, а также построена калибровочная кривая чувствительности ХЛИА к пероксидазе хрена. Чувствительность.метода при использовании ~рехкомпонент-ного субстрата составила 5,0x10" ^ - Ю"^! пероксидазы хрена.

Значительное влияние на уровень фоновых реакций и коэффициент вариации ХЛИА оказывает степень очистки компонентов субстрата. Использование очищенного люминола от примесей аминофталатов 'снижало уровень фоновых реакций в 2,8 раза. Коэффициент вариации анализа при использовании очищенных реагентов и точных дозаторов не превышал 95.

Немаловажное значение для определения антигенов в ХЛИА имеет концентрация' меченных ферментом иммуноглобулинов, от чего в значительной степени завискт чувствительность метода при опкэдо-

лении конкретного антигена. При подборе концентрации конъюгата было замечено, что при чрезмерном увеличении концентрации меченных пероксидазсй антител в области высоких концентраций ¿леток наблюдается снижение регистрируемой интенсивности света. С учет вышесказанного определено оптимальное рабочее разведение конъюгата, которое позволяет избегать этого эффекта при максимальной чувствительности анализа.

П^ль^-.цена зависимость квантового выходг эмиссии света от концентрации водорастворимы.' антигенов В. anthracis. Аналитически, си^ал • находится в лрякопропоргшональной зависимости от коннент-рации анализируемого антигена. Нижний предел детекции составил 0,2 - 0.5 яг/мл.

При поиске антител в ^;зиологкческн>: жидкостях показано, чте оптимальная концентрация клеток для сенсибилизации твердой фазы

" 7 г7

составила 2,0x10 - 5,0х'О м.к./ил. Проведение иммобилизации центрифугированием по сравнению с пассивной сдсорбциеЛ имеет ряд преимуществ, т"к как насыщение поверхности полистирола антигенами происходило за 30 мин, а при обычном способе - более чем за 10 ч.

Анализируя достоверность результатов и принимая во внимание высокую чувствительность анализа, в качестве порогового уровня положительных результатов было принято четырехкратное превышение й^днего значения, определенного в с«рии отрицательных контролей.

Оценку возможности использования "TILI для обнаружения антигенов возбудителя сибирской язвы проводили на чистых культурах , музейных штаммов в. anthraci?,близкородственных микроорганизмах рода Bacillus и гетерологичных культурах. Для э^ого было приготовлено 8 серий сибиреязвенных иммунопероксидазных конъюгатов с рабочим разведением в ХЛИА 1:500 - 1:2000, тогда как в ТЖ-А рабочее разведение этих же конъюгатов оказалось 1:100 - 7:300, Чувствктель? ность ХЯИА с использованием этих экспериментальных тест-систем со-

V - 10 -

ставила 10'"- 10^м.к./мл, что на порядок превышало чувствительность ТШ>А. С помощью тест-системы на основе антител к живыы вегетативным клеткам штамма в. ап-№гас1з СТИ удалось в ХЩА выявить все II штаммов сибиреязвенного микроба. Однако данны" конъюгат оказался недостаточно специфичным, из II близкородственных микроорганизмов он позволял обнаруживать 7. Анализ специфичности использогг.я-ных конъюгатов в ТП5А позволил сделать вывод, что это связано с наличием перекрестно реагирующих антигенов изученных микроорганизмов, а не в результате использования ХЛИА.

Исследование проб воды из водоема, почвы и пыли, искусственный зараженных клетками Б.агиьгас1з,Ь1»лвило, что показатели эмиссии света в контрольных кюветах аналогичны опытным, то есть налицо значительное фоновое свечение контроля за счет компонентов проб, которые дают недостоверные результаты анализа. Поэтому эти ос-ьекты не поддехат исследованию в ХЛКА. Аналогичные результаты были получены в ЪИк.

Показано, что 'ЛИА имеет преимущество перед ТШ?А при обнарут.е-нии антигенов Б.еп1;11гас1з в крови лабораторных животных. При исследовании 450 проб крови иммунизированных различными антигенными комплексами кроликов в 'л2'2А положительных результатов было получено 25,3;, тогда как в Тй4?А - 23,5%. Изучая 25 проб крови морских свинок на наличие антигенов В.апгЬгас^з, были обнаружены в

Уи.и\ и ТЖА 2 стзоротки, имеющие антигены возбудителя сибирской

о

язвы. При анализе сибиреязвенных антител в 450 сыворотках кроликов с помощью Жй, ТИ5А и "ЛИА также показано преимущество ХЛИА, которое выражалось в более высоких титрах антител.

Несомненно, важной частью диагностики сибирской язвы яшш-.;т-зя определение в сывороа. ах человека и животных антител к различным антигенным детерминантам. Дкя определения им!.1уноглобулинов к различным антигенным комплексам Б.ап1;11гав1а была использована

дифференциальная система определения антител, в ХЛИА. Применяя микробные взвеси, отличающиеся по антигенному составу в качестве сен= ситинов и анализируя перекрестно исследуемые сыворотки против' каждого сенситина, показана возможность определения антитоксических и антикапсульных иммуноглобулинов. Использование ТЙ5А для дифференциальной оценки иммуноглобулинов в аналогичной системе не представляется возможным, так как достоверных превышений результатов, полученных с одной и той же сывороткой против различных антигенных комплексов, нет. Это является следствием небольшого диапазона отношения аналитический сигнал-^он фотометричес^го измерения хро-' могенннх субстратов. Значительно более высокое изменение•отношения сигнал-фон для ХЛИА позволяет сделать вывод о наличии специфических иммуноглобулинов к различным антигенным комплексам,

Вззультаты проведенных исследований свидетельствуют о преи-.муществе ХЛИА перед другими применяемыми методами. Они заключаются в более высокой чувствительности, 5ъективности, возможности автоматизации анализов и компьютеризации о6габотки результатов. Однако высокая чувствительность накладывает дополнительные требования к специфичности иммуноглобулинов, отбираемых для конструирования тест-систем.

Оче в., что указанные возможности ХЛИА позволяют получить " новую дополнительную информацию, важную в эпидемическом и эпизоо-тологичесуом аспектах. Поэтому лЛИА следит рекомендовать для применения в лабораторной диагностике сибирской язбы, особенно при наличии в исседуеыом материале небольшого количества антигенов и специфических иммуноглобулинов, а также для дифференциации иммуно-1 глобулинов к возбудителю сибирской язвы.

Интерес к использованию фагоцитарных реакций, совершенствованию методов их постановки и учета результатов вполне понятен. 8то объясняется той ролью, которую фагоцитоз играет как в неспе-'

цифических i,.jxaHH3nax защиты, так и в формировании иммунного ответа макроорганизма.

Несмотря на известную универсальность самого фагоцитарного акта, его наличие или отсутствие во многом заг 'сит от биологических свойств объекта фагоцитоза. Так, возбудитель сибирской язвы, как показано в- наших экспериментах, будучи в жизнеспособном состоянии, не фагоцитируется "in vitro" ни лейкоцитами, ни.макрофага-ми. Последнее объясняется наличием в клетках возбудителя токсических веществ, препятствующих ;агоцитс.'зу. Поэтому использованная кати методика - предварительная стерилизация бактериальной.взвеси ^-излучением радиоактивным кобальтом с последующей отмывкой для удаления токсически веществ, облегчает задачу фагоцитоза бактерий фагоцитами. Однако, как показано, далеко не все способы иная-тивации пригож-."' для этих целей. Так, хлороформ не позволил до-бн.зся полкой стерилизации культуры и дезактивации токсических веществ, формалин резко подавлял хемилюминесценцию, перекись водорода оказалась также непригодной для указанных целей.

Инакт-вированные клетки возбудителя, хотя и слабее клеток стафилококка, все же фагоцитируются. Дак показали проведенные нами эксперименты, эффективности самой реакции фагоцитоза.зависит от моргологических свойств возбудителя. Так, использованный нами вакцинный штамм возбудителя сибирской язвы СТИ при выращивании в статическом состоянии на плотных и жидких средах более 12 ч, образует длинные цепи клеток, которые практически не фагоцитируются, несмотря на опсонизацию микроорганизмов или-предварительную .иммунизацию животных - доноров фагоцитов. Это указы!_ло на необходимость тщательного отбора соответствующего штамма сибиреязвенного микроба, условий его куль геирования. В наших экспериментах удалось снизить цепеобразованио выращиванием штамма B.anthxacis СТИ при постоянном встряхивании в среде углекислого газа и при" сокра-

.дении времени культивирования до 3 - 4 ч. Однако полностью устранить цепеобразование мы не смогли.

Выраженным стимулирующим действием на процесс фагоцитоза к его интенсивность обладает опсонизация бактерий балками иммунной сибиреязвенной сызоротки. Так, в наших экспериментах интенсивность хеыттшесценции в пробах, содержащих опсонизированнкс клетки возбудителя сибирской язвы, возросла в 2,4 раза по с равнению с нптпсонизированными, увеличивалась интенсивность хе:.:и-люминесценции и при использовании фагоцитов животных, в крови которых содержатся антитела против данного возбудителя. Несмотря на ограниченность наших наблюдений, выявлена тенденция к повышению интенсивности квантового выхода света в зависимости от титров специфических иммуноглобулинов,, Отметим, что полимор£но-ядепные лейкоциты при оценке фагоцитарной'активности с помощью хемилюминесцентного теста имеют в 2 раза более внескую эмиссию света по сравнению с перитонеальннми макгюфагами, чо-видпгпму, за счет высокой миелопероксидазной активности, отсутствующей в макрофагах.

Анализ изменения функциональной активности- ¡¡олиморфноядер-ных лейкоцитов в процессе иммунизации лабораторных животных различными антигенными комплексами возбудителя сибирской язвы подтвердил наш вывод об увеличении фагоцитарной активности лейкоци-

#

тов по мере увеличения количества специфических иммуноглобулинов к различным антигенам в.anihraois. Интересен тот факт, wvo кал-сульное вещество возбудителя сибирской язвы способствовало подавлению выработки бактерицидных форм кислорода в экспериментах la vitro п, тогда как иммунизация этим компонентом приводила к увеличению хемилкетнесценции, индуцированной вакцинным штампом Б. anthrecis СТИ, инактивированкым у-сблучением.

Проведе-:::ые эксперименты по сравнительной опенке различных методов регистрации функциональной активности ф^оцитов показа-

■ли, что наибольшей эффективностью обладает хемшноминёсцентный, хотя он и требует предварительного подбора всех: условий, и параметров постановки реакции.

Использование феномена хемилюминесценцпи при обнаружении антигенных комплексов В.ап1;11гас18 !1 дифференциации антител, взаимодействия фагоцитирующих клеток с системами иммунитета позволяет расчитывать, что сфера применения этих методов будет расширяться. Возможность определек:'? клеточного и гуморального иммунитета животного и человека, взаимодействия иммунных систем, с конкретными микроорганизмами позволит в недалеком будущем оценивать с помощью хемилюкинесценции напряженность иммунитета макроорганизма. Хемилюминесцентный анализ следует использовать для целей иммунодиагностики сибирской язвы и других инфекционных заболевания.

заводи

1. Установлено, что для проведения ХЛИА наиболее эффективным твердофазным носителем является полистирол, сенсибилизированный специфически!.;:! иммуноглобулинам в концентрации 50 - 100 мкг/мл при температуре 37°0 г. рН буферной системы 7,4 - 9,5.

2. Показано преимущество трехкомпонентного субстратного комплекса перед двухкомпонентн'-.:, проявляющееся в значительном увеличении квантового выхода хемилюминесценции и удлинении времени стационарного участка свечения.

3. Разработанный ХЛИА позволил выявлять клетки В.агиьгас1а в концентрации 10**- Ю^м.к./мл, а водорастворимые антигены -0,2 - 0,5 нг/мл, что на порядок превышало чувствительность ТИ£А. ! 4. Высокая чувствительность ХЛИА в сравнении с ТИФА при выявлении специфических антител позволила дифференцировать ан-тикапсульные и антитоксические иммуноглобулины в сыворотках гаг-фицированных В.аггЬЬгас^з лабораторных животных. ■ _

5. Установлено, что эффективная оценка функциональной активности фагоцитов инфицированных возбудителем сибирской язвы лабораторных животных на основе хемилюминесцентного анализа возможна при использовании клеток В.ад-ЬЬгасга СТИ, инактивиро-ванкнх жестким ^-излучением.

6. Изучение динамики функциональной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов при помощи хемилюминесцентного анализа пока--зало зависимость интенсивности фагоцитарного процесса от напряженности иммунитета при сибирской язве,

7. ^зработанный комплекс хемилюминесце;-фного анализа может быть рекомендован в качестве высокоэффективного средства для иммунодиагностики сибирской язвы.

СШЕСК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Яковлев А.Т., Коваленко A.A., Липницкий A.B., Зыкин Л.Ф., Гаврилова Е.Й., Власенко С.В., Горовиц Е.Л., Егоров A.M. Эффективность хемилюминесцентного иммуноанализа в лабораторной диагностике некоторых бактериальных инфекций // Тезисы ХУЛ съезда Всесоюзного общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И.И.Мечникова. Алма-Ата, сентябрь 1989 г. -Ы. ,1989.-Т.П.-С. 136-137.

2. Яковлев А.Т., Коваленко A.A., Зыкин Л.Ф., Липницкий A.B. Предварительные итоги применения хемилюминесцентного иммуноанализа при обследовании природных очагов чумы // Материалы" рабочего совещания "Состояние, проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций? Оболенск, 1-2 ноября IS89 г. -Оболенск,I99Ö.-C.104.

3. Коваленко A.A., Яковлев А.Т., Липницкий A.B. Перспективы ис-' пользования хемилюминесцентного иммуноанализа для диагностики инфекционных заболеваний // Тезисы докладов Первого Всесоюзного иммунологического съезда. Сочи, 15-17 ноября 1989 г. -M.,I989„-T»I.-C.22I.

4. Яковлев А.Т., Коваленко A.A. Хемилюминесцентпкй иммунслализ и его применение в микробиологии // Биотехнология, иммунология и биохимия особо опасных инфекций.-Саратов,1989о-С.З-9.

5. Яковлев А.Т., Коваленко A.A., Липницкий A.B., Зыкин Л.Ф., -Гаврилова Е.Й., Власенко C.B., Горовиц Е.Л., Егоров A.M. Применение хемилюминесцентного иммуноанализа для ускоренной диагностики особо опасных инфекций // Особо опасные инфекционные заболевания: диагностика, профилактика и биологические свойства возбудителей.-Волгоград,1990о-С.262-265.

5. Лесовой B.C., Коваленко A.A. Сравнительная оценка различных методов изучения функционального состояния фагоцитов при сибирской язве // Особо опасные инфекционные заболевания: диа- • гностика, профилактика и биологические свойства возбудителей.-Волгоград,1990.-С.169-170.

7. Яковлев А.Т., Коваленко A.A., Липницкий A.B., Зыкин Л.Ф., . Гаврилова Е.К., Егоров A.M., Голубинский Е.П., Костюковский

B.М* Перспективы использования хемилюминесцентного иммуноанализа дня серодиагностики опасных инфекций // Тезисы конференции "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии". Махачкала, 29-30 мая 1990 г. -Махачкала,1990.-С.66-

C.П ' *

8. Зыкин Л.-З., Яковлев А.Т., Липницкий A.B., Коваленко A.A. Место хемилюминесцентного иммуноанализа среди методов экспресс-диагностики инфекционных болезней // Тезисы докладов У1 Всероссийского съезда микробиологов, эшОемлологов и паразитологов. Нижний Новгород, 1991 г, -М.,1991.-Т.П.-С.64-бБ.

I

9. Тихонов Н.Г., Кулик A.B., Коваленко A.A. Взаимосвязь некоторых иммунологических и нейрсгуморальных показателей при формировании иммунногЛответа у животных-продуцентов // Лаб. животные.-I992.-T.2, С.9-12. ' ' ■ ■

Подписако в печать 7.07.92г. Заказ Л 265. Тира к ЮС экз. Бумага офсетвэя. Усл«.-печ.л. 1,2. Формат 60x84 1/16. Печать плоская.

Менвузовсхий ротаприатадй утастск Волгоградсгого ордева Трудового Краевого Зваыеви пздитехяичесхий институт. Вол1 ^град-66, ул.Ссв*тсхая,35~