Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка энзимосенсоров на основе трипсина для количественного определения общего белка, пептидов и искусственных субстратов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка энзимосенсоров на основе трипсина для количественного определения общего белка, пептидов и искусственных субстратов"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЙ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ ШОХІМІУ ім. О.ІІ. ІІАЛЛАДІІІА

На правах рукопису

БІЛОШАН Ольга Лиатоліїшіа

РОЗРОБКА ЕНЗИМОСЕНСОРІВ НА ОСНОВІ ТРИПСИНУ ДЛЯ КІЛЬКІСНОГО ВИЗНАЧЕННІ! ЗАГАЛЬНОГО БІЛІЛА, ПЕПТИДІВ ТА ШТУЧНИХ СУБСТРАТІВ

03.00.23 — біотехнологін

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук .

Робота викопана в відділі механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології та генетики НАМ України (м. Київ).

Наукові керівники: доктор біологічних наук, професор

СТА РОДУ І» Микола Федорович кандідпт біологічних ішук, СТ. II. співр. СОЛДАТКПІ Олексій Петрович

Офіційні опоненти: доктор бологічиих наук, професор

Провідна установа: Інститут біооргапічноТ хімії та нафтохімії НА1І України '

Захист дисертації відбудеться 21 квітня 1997 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої ради Д 01.84.01 в Інституті біохімії ім О.В. Палладіна НАН України за адресою: 252601, м. Київ —ЗО, вул.

Леоитовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у біблиотеці Інституту біохімії ім.О.В. Палладіна НАН України

Автореферат дисертації розіслано 18 марта 1997 р.

Вчений секретар '

спеціалізованої вченої ради

Дмитрснко Микола Петрович кяндндпт біологічних наук А|ітюх Валерій Петрович

кандидат біологічних наук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

АіСГуи,'іі»ііІи'і'і»_Л|К)б,’іеміи Кількісний аналіз білкіп - важливий напрямок аналітичної практики, іц» мас місце и клінічній медицині, при біотехнологічному ии|>обництиі та и ха|>чоиііі промисловості, для екологічного моніторингу оточуючого сє|н‘до[ііііцц та ііі.. На сьогоднншній день існує досить багато біохімічних та спект|ю<1ютометрнчннх методів кількісного аналізу білка. Але використанні! цих методів пов'язане з досить значними зат|міта.ми часу, необхідністю о до|югому обладнанні, реактивах, спеціалістах високої кваліфікації. Розробка біосенсора для ексіі|>ес-аналізу имісту білка та пеіітндіи поиинни вирішити багато з цих щюблем. Ідея створення такого біосенсора полягає и застосуванні протеолітичних <]нфміштін у якості чутливого елемента датчика, іцо реєструє зміну загальної провідності чи локальної концентрації протонів в наслідок протеолітичного гід|юлізу білків та пептидів.

Існуючі розробки такого приладу на основі протеолітичних <|>ермеіітів, а саме трипсину і хімотрннсішу носять обмежений характер. Показана лише принципова можливість їх застосування у якості чутливого елемента біосенсора для визначення вмісту штучних субстратів. Повиє вирішення задачі щодо розробки приладу для визначення вмісту білків та пептидів у реальних рідинах вимагає проведення комнлесннх досліджень та аналізу існуїочнх можливостей сенсорної технології по таких напрямках, як вибір відповідного ферменту та методу його інтеграції з поверхнею датчика, вивчення властивостей іммобілізованого ферменту та з’ясування відповідності реєегрусмнх процесів ферментному гідролізу, вибір перетворювача та засобу реєстрації біохімічного сигналу, що забезпечать чутливість і надійність вимірювань, з’ясування оптимальних умов проведення вимірів та робочих характеристик отриманого сенсора та іи.

Мстп_тп_____¡шняшіїїн....д<хмі;иі«чнін, Мстою даної роботи було

створення лабораторних іі|ютотішіи еизіїмосснсоріп на оснопі ферменту тріїпгііну для визначення концсііт]>лції псігтпдпих субот) ніті» та білка в рОЗЧІІНОХ.

Осііошііім завданням ¡юботн було:

1. Вніїченші умо» іитсі^ніції т]>ішсішу до складу аналітичних

іі])ііст])оїп без суттєвих змчі ііого властивостей. .

2. Конструювання ішрішітіп “ніютеолітичних“ сенсорів на основі рН-чутлишіх польових транзисторів та планерних елект]юдш.

3. Вничения елскт]>охімічіінх властивостей сконструйованих сенсорних систем .

4. Розробка методики кількісного шізначсііня білка за допомогою еіізимосснсо|>а о [М'яльних рідинах.

иііукоіа^іоііНзіі<і_тіі_)і|мцші,іна_циінісхь_4шСка:!и Розроблено метод іммобілізації т])ннснну на напівпровідниковій поверхні зшиттю в парах глутарового альдегіду в білковій мембрані. Досліджено властивості іммобілізованого даним методом трнненну та умови його стабілізації. Показано, що отримані мембрани стабільні иротлгом місяця, мають достатньо високу ензнмиу активність без суттєвої зміїні кінетичних параметрів реакції гідролізу та достатню адгезію до напівпровідникової поверхні. .

Створені лабораторні прототипи ферментних потенціометричних та кондуктометричннх біосенсорів для експресного визначення концентрацій штучних субстратів та білків. Різнобічно досліджені електрохімічні властивості створених сенсорних пристроїв. Підібрані оптимальні умови для проведення вимірювань в модельних розчинах, наближених за своїми властивостями до реальних рідин. Встановлено, що межа чутливості для розроблених пристроїв складає 50 мкг/мл аналіту. Підібрані оптимальні умови зберігання отриманих сенсорних датчиків та показана їх

з

стабільність при зберіганні зануреними в 20 мМ <|к>с<|ютіінй 6ycJ>ep (pH 7,8) при 4°С нротигом міс mui.

Роз|>облсно методику вимірювання концепт]»ації загального білка за допомогою снинмоссисора на основі <|>срмснту т])ііііснну та pH-чутливих польових т|шн:шсторіи и {жильних рідинах, ;юк|Н‘ми u молоці. П|юисдено порівннініл |>езультатін іпсіпаченіпі пмісту білка u молоці, одержаних за допомогою методу 1>|>сд(|и>рда та еаимо«.‘іісо|>а. Отримані результати вказують на перспективність |юзробленого прототипу снзнмосо|>а для практичного застосування.

Структура та об’см [юботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, експериментальної частини, результатів, обговорення, висновків та списку літератури, іікніі включає I3G найменувань. Робота викладена па 106 сторінках машинописного тексту та містить 27 рисунків та 7 таблиць.

Аіцюбпцін |юботи. Матеріали дисертації доповідались на міжінстнтутському семінарі при Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАМ України "Актуальні проблеми біотехнології, біоеенсорики та біомеднчної оптшш".

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 3 статті.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ.

В роботі використовували препарат трипсину (ЕС 3.4.21.4) з підшлункової залози свині активністю 1.000-2.000 од. БАЕЕ/мг виробництва фірми “Sigma”, субстрати Na-6eH3o'úi-L-apriniii етиловий ефір (БАЕЕ) фірми "Siginn" і №-бензош-пь-аргіиін-р-нітроанілід (БАПНА), синтезований в лабораторії біосинтезу біологічно активних речовин ІМБіГ ПАН України, бичачий сироватковий альбумін (БСА) та сироваткоий альбумін людини (ЛСА) фірми "Serva", 25%-вин глутаровий

альдегід (І’Л) фірми "Ііикп", піл і та інші |>сяктнви ші|>обшіцтіт країн СПД з квалнфнкацісю "осч" та "хч".

Длл визначений онтіїмшії.іінх умов іммобілізації трипсину визначали активність вільного та іммобілізованого трипсину і адгезію мемб|нш до пош’рхні К|К'мнісшіх пластин, що вкриті Бі02 і йі3^.

Актішність т])ііік'ііну інізначилн (|ктімст|)ичним методом по кількості р-нітроаніліду, що утиоркхться и наслідок гід|>олізу субстрату БАПІІА [КНандог сі а].,1961]. Значення Кпі іюзрахоиуиалн за методом Лаіінуївера-Берка {Ілііе\лсп\чт, 1934]. Адгезію біомптрнць до поверхні визначали візуально після струшування к|н'мнісііих пластин з мембранами в буфері протягом 24 годнії но співвідношенню кількості! мемб]мш, які залишилися на поверхні шіастин, до вихідної кількості створених з|>азків. Протеолітичне розіцепленіїіі білка в часі конт]хілюваліі за допомогою електрофорезу [Ьасшш1і,1970]. Концентрацію білка в розчинах визначали за методом Брсдфорда (ВгоііГопі,1976].

Для створення лабо]юторних прототипів сенсорів застосовували перетворювачі віі|х>бнііитва НД1 "Мікропроцесор” (м. Київ), що складались з пари рН-чутливих польових транзисторі)!, розміщених на одному кристалі (рН-ПТ). Також використовували перетворювачі виробництва інноваційного центру "Емокон” (м. Київ), які мали керамічну основу і дві нари ідентичних золотих гребінчастих планаріиос електродів, нансссіпіх шляхом вакуумного напилення на н поверхню (ПЕ).

Біоматрицю, що вміщувала трипсин, іммобілізований в білковому шарі за допомогою ГА, та референтну мембрану формували крапельньїм засобом на підзатворнііі області рН-ПТ або чутливій області золотих плиішрних електродів. Для цього криті і відповідних розчинів : а) 2% трипсину, 8% БСА та 6)10% БСА - у 20 мМ фосфатному буфері, рН 7,5, з додаванням 2,5% гліцерину наносили на чутливі області перетворювачів

і інкубуналп протягом 2,0 годнії н парах ГА. Після цього мембрани шісушушині при кіміштніГі темне|ютурі і т|шчі промивали в зазначеному

ВНЩС б)Ч|№|>І.

Кондуїггометричпі шімірюшшші проводили прикладаючи до кожної парн г|>ебиічастнх елект|юдів змінну сішусоідальну напругу малої амплітуди (10 мВ) з частотою 100 kHz, яка генерувалася за допомогою низькочастотного генератори G3-117 ("Мінприлад” СРСР). Змінну

напругу малої амплітуди в експериментальній установці застосовували для того, щоб уникнути фарадеєвських щюцесів та концентраційної поляризації пн елект(юдах [Slnil’ga et аі.,1992]. Виміри проводили як у диференцпіному режимі так і у монорежимі з одним ПБ (при застосуванні ]юзчипііого <)>ерменту).

Виміри проводили в різних буферних розчинах нри кімнатній темнератуі>і в відкритому об’ємі з інтенсивним переміщуванням. Для вивчення залежності максимальної величини сигналів від pH досліджуваного ¡юзчину застосовували універсальний буфер, що має практично однакову буі}к:рну ємність та іонну силу в широкому діапазоні pH (4,0-12,0). Перед роботою датчики інкубувалн деякий пас в буферному розчині до отримання стабільного сигналу. Концентрації субстратів змінювали шляхом додавання певних аліквот концентрованих розчинів. Зміну напруги на сенсорному датчику реєстрували за допомогою самописця.

. Величина сигналу сенсора після ного стабілізації служила мірою концентрації аналізованої і>ечовини в розчині. Оскільки товщина мембран не була стандартизована, порівняння абсолютних значень велн'шн сигналів проводилось окремо для кожного сенсора.

J- Ї'Ш

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Сшоїхгшш______шкіл ¡гіршої___системи____длл___кількісною_____шіплізх

исітиіии_о^ктіадтііьтіі_біак<иіп_»сішиі_ІІЕ_т(і.і>та,інііиоі»_сІ>5,р.мсіітїі

На першому стані досліджень по ство|х;ііню “п|ютеолітнчного“ ссіісо(>а було шікорнстаїт аналітична система іш основі І1Е та розчинного Т|)НПСІІІіу ? мстою з'ясування ПрИИЦІІПОВОЇ можлніюсті отримання біосснсорного сигналу у відповідь на процесс протеолізу та вивчення ха|Ш{тсру зміни величини цього сигналу під шілішом факторів, таких як pH, іонна сила та буїрсрпа смність середовища. Процес протеолізу модслюпався за допомогою штучного субст|>ату. Реакція протеолітичного гідролізу БАЕЕ суп | ю во джусться звільненням одного протону та утворенням зарядженого кислотного залишку за рівнянням:

О О О О

// // трипсин // // '

С,Н5С-Ш-СН С ОСз»І5 + 11,0 ....> С,НіС-1^-С!1-С О' + СзІІзОІІ + ІҐ

І 1

(СНа)3 (СН2),

1 1

N11 N11

1 1

^-С-МЬ ІШ-С-МІ,

Завдяки цьому субстрат БАЕЕ є доброю моделлю для вивчення електрохімічних властивостей “протеолітичного“ сенсора.

Після внесення БАЕЕ в розчин трипсину спостерігався кондуктометричннн сигнал, 90% максимальної величини якого досягалося за 2 - 5 хв. Залежність початкової швидкості зміни величніш

кондуктометрнчного сигналу на внесення аліквоти БАЕЕ від концентрації трипешіу в робочому буфері була лінійною в межах концентрацій трипсину 0,1 — 0,5 мг/мл. Залежності зміни провідності розчину від коїщеігграції БАЕЕ в пробі представлені на рис. 1. Лінійна ділянка

залежності величини сигналу иід концентрації субстрату в пробі спостерігалась у межах 0,1-0,5 мМ ВАЕЕ при проведенні вимірів у дистильованШ воді та у межах 0,1-1,0 мМ НАЕЕ при вимірюванні у 1-2 мМ ті>*»с-ІICI 6уі|к;рі’ (pH 7,5) (криві 2, 3). Було визначено, що трнс-IIQ буфер (pH 7,5) з концентрацією 1-2 мМ с оптимальним для здійснення кондуктометрнчшіх вимірів. Подальше підинщеннл концен-цмщи ¡юбочого буферу сприяло різкому зниженню величини копдуктометричного сигналу.

Виміри залежності копдуктометричного сигналу від pH проводили u універсальному буфері, бус|к:рна ємність якого практично не змінюється в широкому- діинозопі pH (pH 4,0 - 12,0). Визначений в кондуктометричнііі комірці р!І-оптимум трипсинового гідролізу БАЕЕ відповідав визначеному біохімічним методом і знаходився в межах 7,0-7,5 [Ленинджер, 1970}.

|БАЕЕ|, мМ

(СА людніш], мг/мл

Рис. 1. Залежності величини копдуктометричного сигналу aid концентрації ПА ЕЕ. Диміри проводились в водному розчині трипсину (0,5мг/мл) (1), ІмМ (І), 2м!\ї (3) трис-НСІ буфері, pH 7,5.

Рис. 2. Залежність величини копдуктометричного сигналу від концентрації ЛСА в пробі. Виміри проводились в забуференому 2мМ трис-НСІ буфером, ріі 7,5, розчині трипсину (0.5мг/мл).

Отримані результати дозволи нам з|юбііти припущення щодо можливості використання кондуїстометричного методу для |>есст|>ації процесу <|к'рм(‘іггптііпного гід|хілізу іісптндннх субот[>атш. Оптимальні умови для щюводення вимірювань рули визначені, як застосування розчину тішпгішу з копцинтімщігю в межах 0,1-0,5 мг/мл у 2мМ трис-11(3 буі|>срі, pli 7,5. Результати вимірів концснт|>лцій білка J1CA за допомогою IIта |кмчнпноіт> трипсину показали можливість визначення концснт}иіції ЛСЛ у діапазоні 100-200 мкг/мл (рис. 2).

Лналітичпа сіктсма із застосуванням |юзчннного трипсину мас ряд суттєвих недоліків для щтктичного застосування. По перше - цс необхідність використання »]>ормснту у досить великих кількостях. По друге • неможливість проведення вимірів у дж|>ерснцінному |)СЖІІМІ, який дозволяє знизити вплив сто|юнніх <]мікторів на результати вимірювань. Тому наступним станом нашої роботи була (хкцюбка сенсору на основі іммобілізованого т|)нпснну.

Віізііпчсііин оптнмп-и,них умов і>і?іобі.іімш*^ріінс»иіуі_ц_01дкаиу мембрішу*

До ензнминх матриць для біосенсорів ставиться ряд вимог: технологічність їх виготовлення, забезпечення адгезії <|>ерментативної мембрани до поверхні перетворювача, дифузна проникливість щодо молекул субстратів і п]юдуктів, високий рівень включення ферменту в мембрану та збереження ііого античності в ній прн іммобілізації та зберіганні [Стародуб и др., 1990]. Враховуючи сказане вище, було визначено, що найбільш перспектнвішм для створення даного ензимосенсора є метод іммобілізації ферментів у білкову мембрану в парах глугаропого альдегіду, що був роз]юблениіі раніше для уреази та глюкозооксидази [Kimura J., el а].,1988].

На першому етапі наших досліджень з метою вибору оптимальних умов ¡мобілізації трипсину, щодо збереженій! Пою активності та адгезії до кремнієвої поверхні, були проаналізовані умови с|юрмуванші білкової мембрани, такі як співвідношення концентрацій трипсину і БСЛ у вихідній суміші та час інкубації в насичених парах ГА.

Максимальна активність іммобілізованого трипсину (28% від активності вільного (|>ермснту) та задовільна адгезія до поверхні (0,5 відн. од.) були отримані при співвідношенні триисин:БСА - 1:4 (табл.1) відповідно (концент[шціи сумарного білка в вихідній суміші складала 10%) та після 2,0 годин інкубаці в нарах ГА (рнс.З).

Таблиця 1.

Активність іммобілізованого у білкову мембрану трипсину за різних умов ії формування (% від активності вихідного вільного фермента)

Час інкубації ц ' Актішність трипсину (%) при співвідношенні концентрацій трішсин:ІіСЛ у мембімиїі

іш|шх ГА", ч 1:4 1:1 4:1

0,5 4,0 . 1.5 1,5

1,0 17,0 1,5 2,0

2,0 28,0 3,0 2,5

2,5 23,0 - -

Рис. 3. Залежність активності ілшобілізованого в білкову мембрану трипсину від часу інкубації а парах ГА. Співвідношення 'трипсин: БСА і мембрані 1:4.

Введення до складу мембран гліцерину в концентрації 2,5-5,0% сприяло підвищенню залишкової ферментної активності іммобілізованого З ~ / - ІІСЬ

Час, год.

трипсину в 1,5 -1,7 ¡>&зи (рис.4, крива 1) то покращенню адгезії мсбраи до поверхні в 2 раан. Лнплі.і мемб|>ан під мікроскопом показав, що додавання гліцерину сприяє поліпшенню їх структури, робить більш гомогенними та запобігає руйнуванню при висушуванні. При включенні сахарози до складу мсмб|шнн спостерігалось погіршення Гі властивостей (рис.4., кривд 2).

Рис. 4. Вплив різних концентрацій стабілізуючих додатків на

активність іммобілізованого

т/нінсину: /- гліцерину 2г сахарози.За ¡00 % взята макси.ч<ільна активність 1.ч.чоС*.іізов<іного т/шпеину.

Шів^еішн^тстниостаимпобілізоїщноп^ііиісшіу!

Як відомо, властивості ферменту після іммобілізації можуть суттєво змінюватись. Тому вважалось за необхідне вивчити основні кінетичні характеристики іммобілізованого в білкових мембранах трипсину в порівнянні з вільним с))ермснтом, зокрема залежність його активності від pH, іонної сили, буферної ємності, а також оцінити Кпі та стабільність іммобілізованого ферменту при збереженні.

Розраховані значення Кпі для вільного та уявної Кш для іммобілізованого трипсину в 20 мМ фосфатному буфері, pH 7,5, 30°С, несуттєво відрізнялись між собою та знаходились в межах 0,7-1,0 мМ, що може свідчити про збереження однакової спорідненості до субстрату в мембрані. '

Залежність активності іммобілізованого в білкову мембрану трипсину від pH робочого б\(|>е|)а мала куполоподібний вигляд з

НонцпгтрацЫ, %

максимумом при рН 7,0 - 8,0 (рис.5), що фактично співпав з рН-оптимумом для вільного трипсину [Ленипджер, 1970J.

Рис. S. Залежність активності Іммобілізованою трипсину від рІІ. ¡іимірювапня проводились у 20 мМ ацетатному (рН 4,0-5,0),

фосфатному (рН в, 0-8,0) та

бо/нітпому (pli 9,0) буферах.

І’нс. в. Залежність активності трипсину від концентрації

фосфатного буфера (рІІ 7,5): І - для вільного ферменту, 2 - для

іммобілізованого ферменту.

Рис. 7. Залежність активності Іммобілізованого трипсину від концентрації сульфату натрію у 20 мМ-ному фосфатному буфері (pH 7,5).

В процесі досліджень памп також були вивчені залежності активності вільного та іммобілізованого трипсину від буферної ємності' (рис. 6) та іонної сили фосфатного буфера (рис. 7). Результати вимірювань показали, що па відміну під вільного «¡юрменту, активність З"

pH

І Буфері, и.М

INajSOfl, мМ

якого практично ис змінювалась іа збільшенням концепті >а ції та іонної сили фосфатного буі}>ера, аісгниність іммобілізованого т])ипгнпу в цих умовах суттєво падала. Причиною падіння активності (]юрмсіггів в цих випадках може бути зміна іі|мникності мсмб|шн, оскільки збільшення концсігг]шції та іонної сили б\(|*‘|)а обмежус Гі набрякання [Огародуб и д])., 1990].

Також була проаналізована зміна активності іммобілізованого трипсину при збс|)іганні іі|ютпгом міслііп в різних умовах (рис.8). Проведені експерименти показали, що іммобілізиція трипсину в білкову мембрану иідвіпцус його стабільність. Іммобілізований трипсин ({мштичпо не втрачав своєї активності при зберіганні за умов: +4°С, в сухому вигляді - протягом 10 днів, +4°С, в 20 мМ фосфатному буч]>срі (рН 7,8) - протягом місяця.

І’нс. 8. Зміна активності ім.чобілі-зованого трипсину при зберіганні за різних умов: І, 2 - в

сухому вигляді при кімнатній температурі та при +4^С відповідно, З

- під іцаром гліце/мюу при +4^С, 4-е в 20 мМ фосфатному буфері (pH 7,8). За 100% взята вихідна акпшвність іммобілізованого ферменту.

Таким чином, дослідження властивостей іммобілізованого у білкову мембрану трипсину дозволили зробити висновок про можливість застосування цих мембран у якости чутливого елемента протеолітичного біосенсора. Було показано, що трипсин у складі отриманої білкової мембрани зберігає До 45% активності від активності вільного ферменту

' Час, доба

без суттєвої зміїні кінетичних параметрів реакції гідролізу. Отримані мсмб|шнн мшоть добру адгезію до кремнієвої поверхні та стабільні при зберіганні зануреними п 20 мМ фосфатний буфер (рН 7,8) при 4°С протягом довгого часу. '

Визначення концентрацій БЛЕЕ та ЛСА за допомогою ПЕ та Ьтобідішнпюшлїчиїсішуі

Вніі]юбу»аііі мембрани було застосовано прн створенні кондуктометричного ензимоссисору для вимірювашш концентрації субстрату БЛЕЕ та білку ЛСЛ (рис.9,10).

|БЛБВ), мМ

[СЛ людини), иг/ил

Рис. 9. Залежність величини сигналу біосенсора па основі ПЕ та Іммобілізованого трипсину від концентрації субстрату БЛЕЕ в пробі. Вимірювання проводили у 2 мМ трис-ІІСІ буфері, рІІ 7,5.

' *

Рис. 10. Залежність сигналу протеолітичного біосенсору па основі ПЕ та Іммобілізованого трипсину від коїщентрації ЛСЛ у 2 мМ трис-ІІСІ буфері, рН 7,5.

БЛЕЕ та велігшною межах 0,1-1,0 мМ, що

Лінійна залежність між концентрацією кондуктометрнчного відгуку спостерігалась в

відповідає даним, одержаним при вимірах концентрації субстрату з використанням розчинного ферменту (рис.1). ГІрн вимірюваннях залежності величини кондуктометричного відгуку від концентрації ЛСА спостерігалось розширення діапазону лінійності отриманої залежності порівняно з даними, одержаними з розчинним ферментом (рис. 2), що можна пояснити наявністю дифузійних обмежень в мембрані по відношенню до високомолекулярних субст)>атів.

Для подальших досліджень по розробці “протеолітичного“ сенсори було вирішено випробувати в «кости перетворювача рН-чутливий польовий транзистор, оскільки він забезпечує вимірювання саме локальної зміни pH в мембрані, що, на наш погляд, може підвищити точність вимірювань та специфічність сигналу сенсору при проведеній визначення концентрації білку в багатокомпонентних рідинах.

“Протеолітичний“ сенсор на основі рН-ПТ був створений шляхом іммобілізації трипсину на поверхню перетворювача. Визначення робочих характеристик “протеолітичного“ біосенсора проводилось із застосуванням у якості аналіту штучного водороз'шіщого субстрату БАЕЕ, що, як уже зазначалось вище, є для цього доброю моделлю.

Типовий вигляд часової залежності величини відгуку біосенсора на зміну концентрації БАЕЕ у розчині показано на рис. 11. Після внесення субстрату максимальне зничення відгуку досягалось на протязі 1,5-5,0 хвилин: Такі коливання часу відгуру обумовлені як складом буферного розчину та кількістю вносимого субстрату, т^к і різницею у товщині біомембраїї. Оптимальним значеннями pH для роботи біосенсора виявилися 7,0-7,5 (рис. 12), що практично відповідало pH-оптимуму для іммобілізованою трипсину, визначеного біохімічним шляхом (рис. 5).

и

Мис, ія.

Рис. II. Типовий сигнал біосенсора па внесення ВіХЕЕ (0,5 мМ) в 10 мМ фосфатному буфері, pH 7,0. Момент внесення субстрату позначений стрілкою.

Рис. 12. Залежність величина сигналу біосенсора на 1 мМ ВАЕЕ від рІІ універсального буфера.

Рис. 13. Залежність величини сигналу біосенсора від

концентрації субстрату ВАЕЕ у розчині: І - в 10 мМ

фосфатному буфері (pli 7,5); 2

- в універсальному буфері

(рН7,5).

Рис. 14. Залежність величини сигналу біосенсора від часу зберігання в різних умовах: 1-е сухому вигляді при

кімнатній температурі; 2-е сухому вигляді при +4°С; 3 - в 10 мМ

фосфатному буфері (pH 7,5) при +4“С. Виміри проводились у 10 мМ фосфатному буфері (рП 7,5) при концентрації ВАЕЕ в пробі - 0,5 мМ.

Результати експериментів показали, що діапазон концентрацій субстрату, що можна вимірювати, змінюється и залежності иід складу та буферної ємності середоишца (рис. 13). Ділянка пропорційної залежності величини відгуку сенсора иід концентрацї субст|>ату були 0,12,0 мМ в ЮмМ (¡юс<1щтному бу(|юрі (pH 7,0)(крива 1) , ти - 0,1 -5,0 мМ п уиіие[>сальному буфері (pH 7,0)(крива 2) . Таке зрушення діапазоііу може бути пов’язине з більш високою буферною ємністю універсального 6y<J>epa.

З метою визначення оптимальних умов проведення вимірів та впливу факторів реальних розчинів на показання сенсори також була досліджена залежність величини відгуку сенсора від концентрації робочого буферу та вмісту в ньому NaQ. Як виявилось, збільшення концентрації фосфатного буферу (pH 7,5) вище за 10 мМ призводило до різкого нидіння величини сигналу. Ці дині повністю співпадають з результатами біохімічних вимірювань залежності активності іммобілізованого трипсину від концентрації фосфатного буфери (рис. 6, 7). Зріст концентрації NaQ від 0 до 150 мМ призводив до пидішш величини відгуку більш ніж у 2,0 - 2,5 ризи. При більш високих концентраціях NaQ відгук стабілізувався, що може бути важливим для проведення вимірів концентрацій білків у біологічних рідинах.

Було також визначено стабільність ензнмосенсора при зберіганні протягом місяця в різних умовах (рис. 14). Дані вимірювань відповідали результатам, що були отримані в процесі вивчення умов зберігшим іммобілізованого фермента (рис. 8).

Таким чином, створено лабораторний прототип ензнмосенсора на основі рН-ИТ та трипсину і вивчені його робочі характеристики. Показана відповідність характеру зміїні сигналу сенсора від pH, буферної ємності та юної сили розчинів результатам, що були отримані біохімічним шляхом- по визначенню активности іммобілізованого трипсину.

Встановлено, ідо |юз/х>бленн/і макет ензнмосенсора дозволяє вимірювати концентрації низькомолекулярного штучного субстрату ВЛЕЕ в межах

0,1 - 5,0 мМ. Оіітіімальннмн умовами для проведения вимірів е 10 мМ <|юс<|>атшш бу<|>ер (pH 7,0 -7,5) у якості робочого розчину. Розроблений ензимосенсор мас високу стабільність і не зміїнос своїх характеристик протягом місяця при ного зберіганні у 20 мМ <]юсфатному бу(]>ері (pH 7,5) при +4°С .

І’оліюГжа _пі;іхо(иі»„:ші___ииміркчмшт______і«оиіісіиряіш_5ілкій-_н

розчмиахзд______яопо>і<>л>іо^_сіі;і)і>іоссцсора

трипеиііутд рій 1Хі ,

Створена памп модель ензимосенсора на основі іммобілізованого на рП-ПТ т]іі!ііснііу була досліджена з мстою встановлення придатності для вимірювання амідних, пептидних та білкових субстратів. Як відомо, в білках за участю п|>отсолітнчшіх ферментів гідролізуються так звані пентидні чи амідні зв'язки. Лмідіїі зв’язки в білковій молекулі практично не відрізняються від таких у низькомолекулярних сполуках за своїм параметрами [Антонов, 1991]. Істотною відміною білків, як субстратів протеаз, с недоступність багатьох потенційно придатних для взаємодії з ферментами пептидннх зв’язків через різного роду стерігші фактори, викликані структурою білкової глобули.

Визначення концентрації амідних субстратіп за допомогою розробленого сенсору було проведено, перш за все, на синтетичному субстраті БАПНА (рис. 15, крива 1) та низькомолекулярному білку протаміні, що с стандартним субстратом для визначення протеолітичної активності трипсиноподібних протеал (рис. 15, крива 2). Чутливість сенсору до цих субстратів знаходилась в межах концентрацій від 10 до 250 мкг/мл.

Результати визначення залежності ислігшші сигналу ензнмосенсора від концентрації ЛСА ішисдено на рис. 16. ІІк і у випадку ішмірюїтнь за участю коидуктометричного сенсору (рис. 10) діапазон лінійності залежності спостерігайся в межах концентрацій від 0,1 до 8,0 мг/мл. Така зміна чутливості та зсув діапазону визначення відносно субстратів з меншею молекулярною вашю можуть бути иишшкині наявністю дифузійних обмежень в мембрані по відношенню до инсокомолекулярних субстраті!!. '

Рис. 15. Залежність величини сигналу епзимосепсора на основі рІІ-ПТ та іммобілізованого трипсину від концентрації ВАПНА (і) та протаміну (2). Вимірювання проводили у 10 мМ фосфатному буфері, pH 7,8.

Рис. 10. Залежність вeJшчuнu сигналу біосенсора на основі рІІ-ПТ та імлюбілізованого трипсину від концентрації ЛСА. Вимірювання проводили у 10 мМ фосфатному буфері, рІІ 7,8.

З метою з'ясування впливу дифузійних обмежень на результати шшірющшь ензпмосенсору були визначені залежності величини його сигналу від концентрації ряду білків, що відрізнялись за молекулярною

Концентрація, мкг/мл

вагою: протаміну (М.в. біля 5 кД), цитохрому С з ссрдця копя (М.в.12 кД), лізоциму (М.п. 14 кД), овшіьбуміну (М.в 43 кД), ЛСЛ (68 кД) (рнс. 17. криві 1,2,3,4,5 відповідно). Результати вимірювань показали, що кут нахилу лінійних відрізків отриманих кривих був практично однаковий для овальбуміну та ЛСЛ (криві 4,5), що близькі за складом та молекулярною вагою і з|хкггап відповідно зменшенню молекулярної ваш у випадку цнтох|>ому С (крина 2) та протаміну (криви 1). Виключення складає крива 3, отримана для лізоциму, молекулярна вага якого близька до цитохрому С (крива 2). Кут нахилу кривої 3 був значно менший ніж для інших білків. Можна припустити, що на результати вимірювань ензнмосенсору впливас також склад, конформаційниіі стан чи заряд білку. Вплив цих факторів на величину сигналу можна зменшити, якщо підвищити іонну енлу робочого буферу та застосовувати менші концентрації білків, що аналізуються.

Рис. 17. Залежності величини сигналу біосенсора від концентрації : І -протаміну, 2 - цитохрому С з сердця коня, З - лізоциму, 4 - овальбуміну, 5 -ЛСЛ. Виміри проводили у 10 мМ

фосфатному буфері, pH 7,8.

КоїіЦеїГТІШЦІЯ, мг/мл

Результати наведених досліджень свідчать, що застосувати “протеолітичного“ біосенсору на базі рН-ПТ для вимірювання внеокомолекулярних субстратів порівняно з низькомолекулярними субстратами пов'язане з рядом проблем. Це може бути зумовлено, перш за все, тим, що ферментативна активність трипсину неоднакова по відношенню до різних субстратів. Крім того, участь іммобілізованого трипсину в протеолізі білків пов’язана з наявністю стерігших та дифузійних обмежень по відношенню до субстрату та продуктів реакції.

Відомо, що іцютсоліз біліші за участю іммобілізованого трипсину проходить в основному ни поверхні мембран, внаслідок чого локальна зміни pH на підзитворній облисті рН-ГІТ буде також залежати від товщини цієї мембрани. Треби враховувати іі тс, що білки мають свій заряд та буферну ємність і можуть взаємодіяти з мемб|шною та оточуючим бу(|ю|юм. Таким <иіпом, отриманий за допомогою розробленого біосснсору сигнал, є результатам сшіидної взаємодії субстрату та продуктів протеолізу з ([юрментною мембраною. Це необхідно враховувати прн роз|юбці алгоритму аналізу концентрації білку в реальних рідинах. Необхідно ретельно онтимізувати умоии проведення вимірів, та попередньо калібрувати снзимосенсор з використавшім розчинів білку, що знаходиться в пробі, або ж пршшіімі складає переважну більшість білків и зразках, що передбачається тестувати.

Отриманий макет сенсора було також випробувано для визначення концентрації білка в реальних рідинах, зокрема в молоці. Як відомо, молоко вмішує казеїни, що сіиіадає біля 80%, « також, мінорні білки та деякі ферменти. Залежність величини сигналу ензимосенсора від концентрації білка в молоці представлена на рис. 18. Концентрацію білка в підданих аналізу. зразках контролювали за допомогою метода Бредфорда.

Вимірювання сигналів сенсора проводили у 10 мМ фосфатному буфері з додаванням до кінцевої концентрації 150 мМ в пробі з

метою знизити вплив на величину сигналу коливань іоної сили розміну. Необхідна концентрація КаСІ була визначена нами раніше в дослідах з модельними розчинами.

Рис. 18. Залежність величніш сигналу ензимоосенсора від

концентрації білка в молоці. Виміри проводили у 10 мМ фосфатному буфері, рН 7,8, що вміїцувао ISO мМ NaCl .

На рис. 19 представлені залежності оптичної густими при 595 нм(1) та величини вимірюваних сигналів еизимосенсора (2) від ступеню

розведення молока в бу<|мфі. Ділянки лінійності двох кривих відрізнялись несуттсво. Наведені результати свідчать, що сенсорний метод при вимірюванні концентрації білка в молоці можна порівняти за чутливістю з методом Пред<|юрда. Було визначено оптимальне розведення молока для проведення вимірів - в 100 - 300 разіп до вмісту білка в пробі 100-250

Рис. 19. Порівняння залежностей

величин оптичної густини (за методом Бредфорда) (крива 1) та сигналу біосенсора (крива 2) від ступеню

розведення молока в зразках.

Отримана каліброно'ша крива була використана нами для визначення концентрації білка за допомогою еизимосенсора в інших зразках молока. Паралельно концентрація білка визначалась методом Бред(|юрда (табл. 2). Середнє відхилення'між результатами, отриманими за методом Бредфорда та визначеними біосенсорним методом не перевищувало 3,5%.

мкг/мл.

Ступінь розведення

Концеїгтрація білка, мкг/мл

Табл. 2

Результати кількісного визначення загального білка и молоці.

Концентрацій білки, мг/мл (за методом 1і|м:д(|н»|іди) А КоїІЦСІГфІЩІИ білі,'11, мг/мл (біосснсор) п Підхиленії», % (АЛ)ХІШ) А

17.85 10.(10 0.44

22.45 22.10 1.50

28.50 27.00 5.20

31.75 32.20 1.42

37.50 30.70 2.13

Таким чином, була понизана принципова можливість визначення коцентрації загального білка и реальних рідинах за допомогою розробленого сизимосеисора.

‘ ВИСНОВКИ

1. Розроблено метод включенні! трипсину до білкової мемб|мшн, використовуючи нари глутарового альдегіду та бича<шн сироватковий альбумін. Отримані мембрани миють задовільну адіезію до металокерамічної поверхні, трипсин зберігає в них високу активність без суттєвої зміни Кпі. Властивості мембран не змінюються при їх зберіганні протягом міелцп у фосфатному буфері (pH 7,8) прн +4°С.

2. Розроблені аналітичні системи на основі тонконлівчастих пленарних електродів з використанням розчинів трипсину та іммобілізованого трипсину для визначення концентрацій пептидних субстратів та білків. Визначені оптимальні умови для проведения вимірів. Діапазон лінійної залежності кондуктометрнчного сигналу від концентрації Ка-бензоїл-ь-аргініп етилового ефіру знаходиться в межах

0,1-1,0 мМ прн використанні як розчинів трипсину так і іммобілізованого препарату. У випадку аналізу сироваткового альбуміну людний цей

діапазон лежить в межах 0,1-2,0 мг/мл та 0,1-8,0 мг/мл при

застосуванні розчинів трипсину та іммобілізованого щкзпарату відповідно.

3. Роз|юблсно лабораторний п|ютотни снзимосенсора на основі

іммобілізованого в білкову мембрану трипсину та pi І-чутливих польових транзисторів Для визначення концентрацій білків та пептидів. Показана можливість визначення за допомогою розробленого прототипу ензнмосенсора концентрацій штучних субстратів: Ми-бепзош-ь-пргінін

етилового ефіру, Na-6eii3oiji-iJL-upriiiiii-p-iiiTpoaiiLiii;iy та білків: протаміну, сн|юваткового альбуміну людини, овальбуміну, цитохрому С, лізоциму в модельних розчинах.

4. Доведена принципова можливість використання розробленого прототипу ензнмосенсора на основі pH-чутливих польових транзисторів для визначення концентрації загального білка В реальних рідинах. Чутливість розробленого ензнмосенсора для визначенні! білка в молоці становить 100 мкг/мл.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Бслоиван O.A., Солдаткин А.П., С/гародуб И.Ф., Ельская A.B. ПротеолитіРіескин сенсор на основе pH-ПТ. 1. Изучение сравнительных характеристик нативного и иммобилизованного трипсина // биополимеры и клетка. - 1996. - 12,№3. - С.24-27.

2. Белоиван O.A., Солдаткин А.П., Стародуб Н.Ф., Ельская A.B. Протеолнтическии сенсор на основе рН-ПТ. 2. Характеристика работы в модельных условиях // Биополимеры и клетка. - 1996.-12,№4.- С.25-31.

3. Білоіван O.A., Дзядевнч C.B., Солдаткін О.П., М.Ф. С/тародуб, Єльська Г. В. Розробка ензнмосенсора для визначення вмісту білків та пептидіпгх субстратів в водних розчинах на основі трипсину та кондуктометрії™их пленарних електродів // Укр. біох. жури. - 1997.- 09,№2. - С. 25-30.

и

Bcloivan О. A. Development of tri|wm based enzyme sensors for quantativ determination of total protein, peptides and artificial substrates .

Dissertation for u degree of Candidate of Biological Sciences, specialization

03.00.23 - biotechnology, Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyev, 1997.

The thesis 'contains the results 011 elaboration of laboratory prototy(>es of trypsin based biosensors for qualitative determination of total protein, peptides and artificial substrutes. Conditions of tripsin immobilization 011 transducers surfasc and propeties of inuuobilized tripsin were studid. The influence of sample buffer capacity, ion strength and pll on the sensor response, as well as storage stability were investigated. It was shown that the sensor sensitivity is enough to determine total protein concentration in milk.

Белоиван О.А. Разработка эшимосеисорои на осиоие трипсина для

количественного определения общего белка, пептидои и искусственных

субстратов.

Диссертация па соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.23 - биотехнология, Институт биохимии им. А.В. Палладии« НАН Украины, Киев, 1997.

В диссертационной работе представлены результаты но разработке лабораторных макетов ензимосенсоров на основе трипсина для

количественного определения общего белка, пеитидов и искусственных

субстратов. Разработан метод интеграции трипсина с поверхностью

преобразователей в парах ГА. Изучены свойства иммобилизованного фермента. Исследована зависимость величины сигнала сенсора от буферной емкости, ионной силы И pH раствора, а также стабильность при хранении. Установлено, что чувствительность разработаных ензимосенсоров достаточна для ощюделения общего белка в молоке.

11лючов1 слова: еизимосенсор, трипсин, загальний биюк, рН-чутлнш польош трапзнстори, плапирш електроди.