Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Очистка и свойства пищеварительных ферментов белого толстолобика

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Очистка и свойства пищеварительных ферментов белого толстолобика"

- г г П 1 м I , » Л

, i v '< • •

, * ПРИ 153о

На правах рукописи

Зозуля Лада Владимировна

Очистка и свойства пищеварительных ферментов белого толстолобика

03.00.04 - Биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону 1996

Работа выполнена на кафедре биохимии и физиологии Кубанского государственного университета, г.Краснодар

Научные руководители: - доктор биологических наук,

профессор Проскуряков М.Т. - кандидат биологических наук, Хаблюк В. В.

Официальные оппоненты:

Ведущее предприятие:

- доктор биологических наук, профессор Шугалей B.C.

- кандидат биологических наук

*

Бирюкова A.A.

- Краснодарский НИИ рыбного хозяйства Государственно-кооперативного объединения рыбного хозяйства России (Росрыбхоз)

Защита диссертации состоится 26 декабря 1996 г. в

часов

на заседании диссертационного совета Д. 063.52.08 по биологическим наукам в Ростовском государственном университете (344006, г.Ростов-на-Дону, ул. Большая Садовая, 105).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского государственного университета. s-

Автореферат разослан

/

'1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

В.Н.Кирой

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время в рыбоводстве как у нас в стране, так и за рубежом особая роль отводится биохимии как теоретической основе науки о питании (Сорвачев, 1982). Формируется новое направление в науке - биохимия питания рыб. в числе прочих вопросов изучающая начальные этапы утилизации пищи в пищеварительном тракте. Многочисленные работы по изучению динамики активности пищеварительных ферментов рыб проводились, как правило, на неочищенных препаратах (Щербина. 1973; Коновалов, 1978; Ильина, 1985; Nagase, 1964); изучению же свойств самих ферментов внимания уделялось недостаточно. Зачастую свойства, присущие хорошо изученным ферментам высших позвоночных, некритически переносились и на ферменты рыб (Сорвачев. 1982). В то же время пищеварительные ферменты рыб по многим свойствам существенно отличаются от соответствующих ферментов млекопитающих (Колодзейская. Пивнен-ко. 1988).

Белый толстолобик (Hypophthalmlchthys molltrlx Val., сем. Cyprlnldae) относится к группе растительноядных рыб дальневосточного комплекса и в настоящее время широко акклиматизирован в естественных и искусственных водоемах юга России (Корнеев, 1982). Характерной особенностью строения пищеварительной системы карповых рыб является отсутствие желудка, причины которого до конца не ясны (Веригина. 1969; Кобегенова, 1988). У безжелудочных рыб отсутствуют начальные стадии пепсинового пищеварения белков, и вся нагрузка по перевариванию пищи приходится на кишечник. Природные ингибиторы ферментов попадают в полость кишечника в нативном состоянии. Однако, карповые рыбы успешно справляются с гидролизом белка. Логично предположить, что протеазы карповых рыб отличаются по своему составу и свойствам от соответствующих ферментов других позвоночных, что и было показано ранее рядом работ на примере карпа (Хаблюк, Проскуряков, 1988; Cohen et al.. 1981). Данные по свойствам пищеварительных ферментов белого толстолобика немногочисленны (Бузинова, 1971; Курлыкин. 1986; Jonas et al.. 1983).

Изучение строения и свойств сходных ферментов, выделенных из разных источников, дает дополнительные сведения об их происхождении и эволюции (Колодзейская, Пивненко. 1988), и с этой точки зрения белый толстолобик представляется нам интересным объектом

исследования, так как. с одной стороны, класс рыб занимает промежуточное систематическое положение мезду беспозвоночными и высшими позвоночными животными, а с другой, безжелудочное пищеварение - достаточно редкое явление в животном мире.

Белый толстолобик - важный объект прудового рыбоводства юга России; его удельный вес в балансе продукции прудовых хозяйств Краснодарского края достигает 60-70%. Ценность белого толстолобика. помимо получения полноценного относительно недорогого белка, заключается в его способности потреблять фитопланктон. В настоящее время в связи с интенсификацией рыбопроизводства стала актуальной проблема создания искусственных рационов для взрослых особей белого толстолобика, и данная работа может отчасти помочь в решении этого вопроса.

Своеобразие безжелудочного пищеварения карповый рыб, слабая изученность ферментов белого толстолобика и его ценность как объекта рыбоводства побудили нас к проведению этой работы.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось установление молекулярных механизмов, эволюционных приспособлений к безжелудочному пищеварению у белого толстолобика.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1) Выделение и очистка пищеварительных ферментов гепатопанк-реаса и слизистой оболочки кишечника белого толстолобика (трипсина. химотрипсина. коллагеназы, лейцинаминопептидазы, амилазы);

2) Исследование физико-химических свойств этих пищеварительных ферментов (молекулярная масса, количество изоформ и изоточки, оптимумы стабильности и активности, взаимодействие с ингибиторами) ;

3) Выявление сходства и различий пищеварительных ферментов белого толстолобика с соответствующими ферментами других животных.

Научная новизна. При проведении исследования пищеварительных ферментов гепатопанкреаса и слизистой оболочки кишечника белого толстолобика впервые установлено, что все ферменты гепатопанкреаса, кроме коллагеназы, представлены несколькими изоформами; определены значения изоэлектрических точек всех исследованных ферментов гепатопанкреаса. трипсина и лейцинаминопептидазы слизистой оболочки кишечника.

Найдены значения молекулярных масс всех исследованных ферментов гепатопанкреаса и химотрипсина слизистой кишечника.

Показано наличие проферментов у трипсина и химотрипсина гепатопанкреаса.

Рассчитаны оптимумы рН стабильности и активности пищевари тельных ферментов гепатопанкреаса с использованием природных синтетических субстратов.

Исследовано угнетение протеаз гепатопанкреаса природными ин гибиторами сериновых протеаз; показана высокая молярная актив ность протеаз белого толстолобика по сравнению с соответствующим!' кристаллическими ферментами быка. На основании ингибиторного ана лиза сделан вывод о типе строении активных центров трипсина, хи мотрипсина. коллагеназы и лейцинаминопептидазы.

В слизистой оболочке кишечника белого толстолобика, наряду протеазами панкреатического происхождения, установлено наличи.' более высокомолекулярных собственно кишечных ферментов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты, дополняя представления о свойствах пищеварительных ферментов безкелудочных рыб, представляют интерес в выявлении молекулярных механизмов эволюционных приспособлений к безжелудочно му пищеварению. Изучение физико-химических свойств ферментов расширяет знания об изменениях структуры и функции ферментов в процессе эволюции. В работе показано, что ряд свойств пищеварительных ферментов белого толстолобика значительно отличается от свойств соответствующих ферментов других животных, в частности, рыб. имеющих желудок. К этим свойствам относятся: наличие значительного количества изоформ протеиназ с предположительно различной субстратной специфичностью; высокая молярная активность панкреатических протеиназ;- широкие оптимумы рН-активности ферментов; наличие в слизистой кишечника собственно кишечных эндопептидаз. Эти особенности, по нашему мнению, направлены на компенсацию от-сутсвующего пепсинового пищеварения.

Благодаря высокой протеолитической и амилолитической активности ферментов пищеварительные органы белого толстолобика могут служить источником' недорогих ферментных препаратов с широким спектром применения. Ацетоновый порошок гепатопанкреаса может использоваться в качестве ферментной добавки в стартовых кормах для личинок карповых рыб. Химотрипсин белого толстолобика является эффективным молокоствораживающим ферментом, способными действовать и при высоких значениях рН. и может применяться в молочной

промышленности. Перспективно' использование препаратов высокоактивной амилазы белого толстолобика.

Результаты работы могут быть использованы при разработке искусственных кормов для карповых- рыб. В силу особенностей питания взрослых особей до последнего времени создавались лишь корма для личинок белого толстолобика. Однако, при интенсификации рыбопро-нзводства (выращивание рыбы на теплых водах в условиях плотной посадки) стала актуальной проблема разработки кормов и для взрослых толстолобиков. Принимая во внимание высокую молярную активность протеаз и амилазы белого толстолобика, а также отсутствие у Него желудка, необходимо контролировать искусственные корма по содержанию ингибиторов этих ферментов. Наличие в пищеварительном тракте белого толстолобика существенной коллагенолитической активности, теоретически обосновывает введение в кормовые смеси такого малодефицитного белка, как коллаген.

Материалы диссертации могут быть использованы при чтении спецкурсов "Биохимия пищеварения рыб" и "Экология рыб" студентам, специализирующимся по ихтиологии и гидробиологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. По своим физико-химическим свойствам пищеварительные ферменты белого толстолобика существенно отличаются от соответствующих ферментов других животных.

2. Эндопептидазы (трипсин и химотрипсин) гепатопанкреаса белого толстолобика, по данным ингибиторного анализа, обладают существенно большей, чем эндопептидазы млекопитающих, молярной активностью.

3.< В слизистой оболочке кишечника наряду с протеиназами, имеющими панкреатическое происхождение и адсорбировавшимися на кишечной стенке, имеются собственно кишечные трипсин и химотрипсин.

4. Ряд свойств, характерных для эндопептидаз белого толстолобика (большое количество изоформ с предположительно различной субстратной специфичностью, высокая молярная активность, наличие протеаз собственно кишечного происхождения), направлен на компенсацию отсутствующего пепсинового пищеварения в желудке.

5. И морфологические особенности строения желудочно-кишечного тракта, и физико-химические особенности пищеварительных фер-. ментов карповых рыб направлены на максимальное извлечение пита-

тельных веществ из пищевых объектов.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доклады вались на 8-ой научной конференции по экологической физиологии и биохимии рыб (Петрозаводск. 1992). на 3-ем Симпозиуме."Химия лрп-теолитических ферментов" (Москва, 1993). на межреспубликанской пчучно-практической конференции "Актуальные вопросы экологии и охраны природы предгорных экосистем" (Краснодар, 1993). на межреспубликанской научно-практической конференции "Актуальные воп^-росы экологии и охраны природы степных экосистем и сопредельных территорий (Краснодар. 1994), на конференции молодых ученых Северного Кавказа по физиологии (Ростов-на-Дону, 1995), на Всероссийской конференции "Современные достижения биотехнологии" (Ставрополь, 1996). на заседаниях Краснодарского биохимического общества (1993. 1996).

Публикация материалов исследования. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.. "

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литера- . туры, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения. ' заключения и выводов. Работа иллюстрирована 41 рисунком и 21 таблицей. Список ,исполб- • зованной литературы включает 262 источника-, из ни£ 162.на иностранных языках.

"2. МАТЕРИАЛ'И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом исследования служили гелатопанкреас и слизистая оболочка кишечника взрослых белых толстолобиков, выловленных в естественных и искусственных водоемах Краснодарского края.

При выделении и очистке пищеварительных ферментов использо-' вали следующие методы: приготовление ацетоновых порошков из reha-топанкреаса и слизистой оболочки кишечника, высаливание, сульфатом аммония, гель-хроматографию на сефадексах, ионообменную хроматографию на целлюлозах, изоэлектрическое фокусирование на колонке. Чистоту полученных препаратов определяли.' используя диск-электро-.. форез в полиакриламидном геле (Маурер, 1971). ' - . .

Молекулярную массу ферментов находили методом гель-хроматографии на сефадексах G-75 и G-200 (Andrews. 1964), изоточки '- ме-

тодом изоэлектрического фокусирования (Остермак,1983). Оптимумы pH стабильности и активности ферментов рассчитывали, применяя регрессионный анализ (Лакин.1990).•

Активность ферментов определяли, используя природные и синтетические субстраты. Протеолитическую активность трипсина и химотрипсина - методом Кунитца с использованием казеина и методом Ансона с денатурированным гемоглобином (Нортроп и др..1950). Мо-локосвертыватацую активность химотрипсина - по скорости створаживания молочно-ацетатной смеси (MAC) (Пятницкий, Проскуряков, 1969). Эстеразную активность трипсина измеряли спектрофотометри-■чески с использованием этилового эфира бензоиларгинина (БАЭЭ), химотрипсина - этилового эфира ацетилтирозина (АТЭЭ) (Schwert, Takenaka. 1955). Аыидазную активность трипсина определяли, используя бензоил-аргинин-п-нитроанилид (БАПНА). лейцинаминолепти-дазы - лейцин-п-нитроанилид (Tuppy et al.. 1962), химотрипсина -сукцинилфенилаланин-п-нитроанилид (СФПНА) (Erlanger et al., 1966). Для определения активности коллагеназы применяли азоколла-ген, активность амилазы измеряли декстринирующим методом (Мери-на-Глузскина, 1965). Белок определяли спектрофотометрически при длине волны Л=280 m (Егв0).

Ингибиторный анализ проводили, используя фенилмзтилсульфо-нилфторид (ФМСФ), ЭДТА. 1.10-фенантролин, а также природные ингибиторы: .соевый трипсиновый ингибитор, ингибитор трипсина и химотрипсина из клубней картофеля, утиный овомукоид.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ.ОБСУЖДЕНИЕ

3,1. Выделение и очистка пищеварительных ферментов белого толстолобика

Общая схема выделения и очиотки пищеварительных ферментов белого толстолобика представлена на рис.1.

отобранные гепатопанкреас и кишечник хранили в морозильной камере при температуре -17° С, однако, через 2-3 месяца активность ферментов начинала постепенно снижаться. Более целесообразным является приготовление ацетоновых порошков гепатопанкреаса и слизистой кишечника, которые хранятся длительное время без потери Ферментативной активности. При обработке ацетоном часть активное-

Рис.1. Схема выделения и очистки пищеварительных ферментов белого толстолобика

ти ферментов необратимо теряется (от 1% для амилазы до 55% для трипсина), но при этом выпадает в осадок и удаляется значительное количество балластных белков. Удельная активность ферментов в экстрактах из ацетоновых порошков возрастает в 1.2-2,4 раза по сравнению с экстрактами из свежих тканей (табл.1).

Трипсин и химотрипсин находятся в гепатопанкреасе в виде проферментов: в свежеприготовленном экстракте только что отобранной железы их активность практически отсутствует. В результате автоактивации экстракта активность трипсина и химотрипсина

Таблица 1

Активность пищеварительных ферментов белого толстолобика в экстрактах, приготовленных из свежего гепатопанкреаса и из его ацетонового порошка

Фермент Активность в экстракте, ед Удельная активность, ед/ед Выход % Степень очистки

Из свежей железы Из ацетонового порошка Из свежей железы Из ацетонового порошка

Трипсин 10,70 4,76 0,19 0,22 44.9 1.2 Химотрипсин 0,029 0,02 0.0005 0,0009 69.0 1,8 Лейцинамино- 13.07 5,94 0,23 0,27 45.5 1,2 ' пептидаза Амилаза 230.00 213.00 4,04 9,6в 92.6 2,4

значительно повышается на протяжении 3-4 суток, затеи начинает уменьшаться. Активность же лейцинаминопептидазы при инкубации экстракта гепатопанкреаса неуклонно снижается, через 5 суток составляя менее 45% от первоначальной. Активация протеаз в полости кишечника происходит значительно быстрее под воздействием кишечных Факторов.

При высаливании ферментов белого толстолобика сульфатом аммония рН поддерживали около 7,0. так как в предварительных опытах была установлена их кислотонеустойчивость. Большая часть активности трипсина и химотрипсина осаждается между 0,4 и 0.6 насыщения, коллагеназы - между о, 4-0,7 насыщения, лейцинаминопептидазы - между 0;5-0,8 насыщения раствора сульфатом аммония. Осадок 0.3-0,7 насыщения содержит 91% всей трипсиновой активности, . 98% химотршсиновой и 72% активности коллагеназы; степень очистки составляет 2,4-2,6. 91% активности лейцинаминопептидазы содержится в осадке 0,4-0,9 насыщения. Осадок 0-0,4 содержит 99% амилаз-ной активности, причем удельная активность амилазы после высаливания существенно понижается, что говорит об инактивации фермента под воздействием сульфата аммония.

При гель-хроматографии высоленных до 0.8 насыщения белков гепатопанкреаса на молселекте С-25 разделения исследуемых ферментов не происходит, все они элюируются в свободном объеме колонки. Степень очистки составляет 1,2-3,0 в расчете на белок высола. На сефадексе С-50 ферменты хоть и отделяются друг от друга, но пики их активности сильно перекрываются. Наилучшее разделение ферментов гепатопанкреаса и слизистой кишечника происходит при использовании сефадекса С-75 (рис.2,3). Лейдинаминопептидаза элюируется в пике 1 со свободным объемом колонки, трипсин, химотрипсин и коллагеназа в пике 2. амилаза - между 2 и 3 пиками (рис.2). Иначе разделяются ферменты слизистой оболочки кишечника: трипсин и химотрипсин представлены каждый двумя фракциями с различными молекулярными массами, незначительная трипсиновая актицдость пика 2 обусловлена, по-видимому, продуктами частичного гидролиза высокомолекулярных трипсинов (рис.3). При использовании сефадекса С-75 достигается степень очистки ферментов в 3-8 раз. очистку лейцина-минопептидазы целесообразно проводить, используя последовательно хроматографию на сефадексе С-75, а затем на' сефадексе 0-200, при этом удельная активность фермента возрастает в 110-130 раз в расчете на белок экстракта (табл.2).

Таблица 2

Количественная характеристика очистки лейцинаминопептидазы гепатопанкреаса белого толстолобика гель-хроматографией на сефадексах

Удель- Сте-

Стадия-, Белок, Объем, Всего Актив- Всего ная пень ВЫХОД,

очистки ед/мл мл белка. ность, ферме- актив- очи- %

ед ед/мл нта. ед ность, ед/ед стки

Экстраги- 29.2 200 5840 7.9 1580 0.27 1,0 100

рование

Высалива- 88.9 10 889 79,1 791 0.89 3,3 50

ние

Сефадекс '1.1 50 51 ' 11.0 550 10,80 40,0 35

С-75

Сефадекс 0,2 70 14 6.8 476 34,00 125.9 30

С-200

• трипсин

fO loo /SO ¿00 2so J00 eFte*,

Рис.2. Гель-хроматография белков гепатопанкреаса белого толстолобика, высоленных до 0,8 насыщения сульфатом аммония, на сефадексе G-75. Колонка 1.9x68 см. элюирование 0,01 М трис-НС1 буфером рН 8.2 со скоростью 12 мл/ч. Нанесено 290 ед белка. Показаны объемы выхода отдельных ферментов. — Еш

oxniufitccmt меилсилс/,

xi/мс три леиtfa . "а

•ф

ч 41

Л

/оо /УО „¿ее ¿JZ> s/>setfU(>M¿/* Poze/t,

Рис.3. Гель-хроматография белков слизистой кишечника белого толстолобика, высоленных до 0.8 насыщения, на колонке 1,9x70 см с, сефадексом G-75. Элюирование 0,01 М трис-HCl буфером рН 8,1 со скоростью 12 мл/.ч. Нанесено 85 ед белка. Показана активность три-' псина и химотрипсина.

При нанесении высоленных до 0.8 насыщения белков гепатопанк-реаса на ДЭАЭ-целлюлозу при рН 7.9 большая часть белков адсорбируется на колонке (рис.4). В катионкых фракциях пика 1 обнаружена слабая трипсиновая активность, большая часть активности коллаге-назы и химазная активность. При градиентном элюировании адсорбировавшиеся на ионообменнике белки делятся на 3 пика (рис.4, пики 3-5). В з пике найдены активности лейцинаминопептидазы. химотрип-сина, коллагеназы. частично трипсина; в 4 пике - лейцинаминопептидазы, трипсина, химотрипсина. В пиках 2 и 5 активности ферментов не обнаружено. Степень очистки для различных ферментов составила от 2.3 до 49.3, выход - от 1% до 38Ж. На ДЭАЭ-целлюлозе при рН 7.9 очищали лейцинаминопептидазу. От двух остальных изоформ хорошо отделяется лейцинаминопептидаза пика 3 (р1 З.р по данным изоэлектрофокусирования). самый анионный из всех исследованных нами ферментов (рис.5). Степень очистки составила 1,01-6.30, выход 8,5-52%. На ДЭАЭ-целлюлозе при рН 7,0 очищали трипсины гепа-' топанкреаса, полученные гель-хроматографией на сефадексе (3-75. После отмывки катионных белков анионные трипсины были элюированы градиентом ЫаС1 0-0,25 М и вышли общим раздвоенным пиком активности. Удельная активность очищенного таким образом трипсина в 270 раз превышает его удельную активность в экстракте (табл.3).

Таблица 3

Количественная характеристика очистки анионных трипсинов гепатопанкреаса белого толстолобика

Удель- Сте-

Стадия Белок, Объем, Всего Актив- Всего ная пень Выход,

очистки ед/мл мл белка. ность, ферме- актив- очи- %

ед ед/мл нта. ед ность, ед/ед стки

Экстраги- 22,00 200 4400,00 5.50 1100.00 0,25 1.00 100," 0

рование

Высали- 65.00 6 390,00 90,29 541.73 1.39 5,56 49,2

вание

Сефадекс 0. 45 34 15. 30 7,48 254.32 16.62 66, 48 23.1

С-79

ДЭАЭ-цел- 0,05 55 2.75 3,37 185.35 67,40 269,60 16,9

люлоза

I

эл/^уимныи схнен, /иа

Рис.4. Ионообменная хроматография высоленных до 0,8 степени насыщения белков гепатопанкреаса белого толстолобика на ДЭАЭ-цел-люлозе. Колонка 1.9x6 см. буфер 0.01 М трис-НС1 рН 7.9. Скорость элюдаи 25 мл/ч. Градиент №С1 0-0.4 М. Нанесено 75 ед белка.

Рис.5. Ионообменная хроматография Фракций, содержащих лей-цинаминопептидазу (рис.2. лик 1) на ЦЭАЭ-целлюлозе. Колонка 1,9x6 см. уравновешена 0,01 М трис-НС1 буфером рН 7,9. Скорость элюции 25 мл/ч. /Градиент НаС1 0-0.3 м. Нанесено 120 ед белка.

При изоэлектрическом фокусировании белков гепатопанкреаса выделили 3 изоформы трипсина (рис.6). 6 - химотрипсина, 3 - лей-цинаминопептидазы и 2 - амилазы (рис.7): коллагеназа представлена преимущественно одной изоформой с р1 9.4 (рис.6). В слизистой оболочке кишечника было обнаружено по 3 изоформы трипсина и лей-цинаминопептидазы. которые, предположительно, имеют панкреатическое происхождение. Степень очистки ферментов составляет от 0.3 до 1.9; она сильно зависит от значения изоточек, так как длительное действие высокого напряжения вне оптимума рН стабильности отрицательно сказывается на активности ферментов.

3.2. Свойства пищеварительных ферментов белого толстолобика

Трипсин. Трипсин гепатопанкреаса представлен тремя изоформа-ми с р1 4.4+0.03, 5.1+0.07 и 9. 4+0.07. причем на долю последнего фермента приходится лишь около 4% всей трипсиновой активности гепатопанкреаса (рис.6). В слизистой оболочке кишечника обнаружено также 3 изоформы. р1 этих трипсинов 4,4+0, ¿8, 5,1+0,18 и 9,6±0,4. Молекулярная масса трипсина гепатопанкреаса составляет 24000+300 Да. Трипсин слизистой кишечника представлен двумя фракциями с различными молекулярными массами (рис.3). Трипсин с меньшей молекулярной массой подобен панкреатическому, более высокомолекулярный трипсин, на долю которого приходится около 10% общей трипсиновой активности, является собственно кишечными. Трипсин стабилен при рН 5. 0-9,5 с оптимумом при рН 7.5; он быстро инактивируется при значениях рН ниже 4.5. Ионы Саг+ оказывают стабилизирующее действие на трипсин толстолобика, который, как и трипсин быка, имеет центр(ы) связывания кальция. Изучение термостабильности трипсина показало, что при инкубации в оптимуме рН стабильности при 50° С в течение 2 часов сохраняется более 80% активности, а при 60° С за 10 минут теряется уже более 75% активности. Оптимум рН активности трипсина при гидролизе денатурированного гемоглобина находится при рН 8.3, казеина - при рН 9,8 (рис.8). Трипсина с р1 4.4 наиболее активно гидролизует БАПНА при рН 9.8-9,9, трипсин с р1 5.1 - при рН 9,4-9,5. Оптимум рН действия трипсина толстолобика на природные и синтетические субстраты лежит в более щелочной области, чем у трипсинов млекопитающих. Трипсин толстолобика сохраняет более 50% протеолитической активности в широком диапа-

¿с 0 еОп ¿0 /00 /20

рЛвЧ, МЛ

Рис.6. Изоэлектрофокусирование фракций, содержащих трипсин и коллагеназу, полученных после гель-хроматографии высола гепато-панкреаса (рис.2, пик 2). Начальное напряжение 300 в (3 часа), конечное 800 в (47 часов). Нанесено 11 ед белка.

№ ¿0 /Р^ /ОС ■/£0

Рис.7. Изоэлектрофокусирование фракций, содержащих амилазу (рис.2), на колонке ШЗ-8100-1. Начальное напряжение 300 в (3 часа), конечное 800 в (25 часов). Нанесено 8 ед белка.

зоне - от 6,0-6,5 до 10,5-11,0, что может служить приспособлением к непостоянству рН кишечного содерзшмого. Оба анионных и катион-ный трипсины толстолобика обладают эстеразной активностью, гидро-лизуя БАЭЭ. Температурный оптимум действия трипсина (субстрат -БАПНА) при 60° с. Активность анионных и катионной изоформ трипсина полностью и необратимо угнетается ФМСФ; природные ингибиторы сериновых протеиназ - соевый трипсиновый ингибитор, ингибитор из клубней картофеля, утиный овомукоид - стехиометрически ингибируют трипсин толстолобика. Величина угнетаемой активности трипсина толстолобика в расчете на 1 мг добавленного ингибитора существенно превышает угнетаемую активное.ь бычьего трипсина (табл.4). Данные ингибиторного анализа свидетельствуют о значительно более высокой молярной активности трипсинов белого толстолобика по сравнению с бычьим трипсином.

Хшотприпсин. Химотрипсин гепатопанкреаса представлен шестью изоформами с р! 4,8+0. Об; 5.3±0.06; 5.8+0.11; 6,5±0,09; 7,2+0,08 и 7.7+0.09. Все они обладают молокосвертывающей активностью, расщепляют казеин и гемоглобин в щелочной среде'. Молекулярная масса химотрилсина 23000+400 Да. В слизистой кишечника обнаружено

Рис.8. Зависимость активности анионных форм трипсина гепатопанкреаса белого толстолобика и бычьего кристаллического трипсина при гидролизе гемоглобина (рис.а) и казеина (рис. б) от рН. —о— трипсин толстолобика —а— бычий трипсин

Таблица 4

Взаимодействие трипсина гепатопанкреаса белого толстолобика и трипсина быка с природными ингибиторами

Ингибитор 1 мг ингибитора угнетает Во сколько раз активнее угнетает трипсин толстолобика

трипсина быка, ед трипсина толстолобика. ед

Соевый ингибитор 115 1900 16,5

Ингибитор из клу- 125 2200 17.6

бней картофеля

Утиный овомукоид 1200 3200 2.7

2 фракции химотрипсина: фракция с молекулярной йассой около 29000 Да, характерная только для кишечника, и фракция с молекулярной массой 23000, имеющая панкреатическое происхождение (рис.3). Химотрипсин стабилен при рН 6,0-9,5 с максимумом при рН 8, 2 и быстро инактивируется при низких рН (рис. 9). Оптимум активности при гидролизе гемоглобина при рН 8.5, казеина при рН 9.5. Более 5035 своей активности химотрипсин толстолобика сохраняет в диапазоне 6.5-Ю. 0. химотрипсин быка - 6. 0-8,5. ФМСФ в количестве 2. 5-Ю"4 мг уменьшает активность химотрипсина толстолобика на 80%; ЗДТА не влияет на его активность. Природные ингибиторы угнетают химотрипсин толстолобика в 5-18 раз сильнее, нежели бычий химотрипсин. Потребность в высокоактивных панкреатических и кишечных протеазах возникает из-за отсутствия у карповых рыб желудка и связанного с ним пепсинового пищеварения.

Активность коллаге-назы гепатопанкреаса обусловлена, в основном,.

N

1

1

N •

V

1

6 ? ¿3/0

4

Рис.9. Стабильность химотрипсина. Показана остаточная активность после 24 часов инкубации при 4°С, рН от 5 до 10 -о— химотрипсин толстолобика -в— химотрипсин быка

действием единственного фермента с р1 9.4, который гидролизует также казеин. БАЭЭ и БАПНА. Незначительную коллагенолитическую активность проявляют также ферменты с р1 4,9 и 6,9 (рис.6). Молекулярная масса коллагеназы гепатопанкреаса 22000+600 Да; в слизистой кишечника имеется и более высокомолекулярный фермент, который на сефадексе й-75 элюируется со свободным объемом колонки. Коллагеназа стабильна* при рН 5,5-9.0 с максимумом при рН 7,2. наиболее активна при рН 8.6. На активность коллагеназы не влияет ' ЭДТА. но она угнетается ингибиторами сериновых протеиназ - ФМСФ и соевым ингибитором трипсина.

Лейиинашнопептдаза. Лейцинаминопептидаза гепатопанкреаса представлена, тремя формами с р! 3.9+0,08; 5.7+0,16 и 6,6+0,03; на долю фермента с р1 5.7 приходится около.60% всей активности. В слизистой оболочке кишечника обнаружены также 3 изоформы этого фермента (р1 4.15; 6.05 и 6,65). Молекулярная масса как фермента гепатопанкреаса, так и кишечной лейцинаминойептидазы лежит за пределами исключения сефадекса "и по'данным гель-хроматографии на . сефадексе (3-200 составляет 200000+3500 Да. Лейцинаминопептидаза стабильна при рН 4.'5-9.0 с оптимумом при рН 6,8. Оптимум активности при рН 7,2; при рН 9.5-10.0 фермент сохраняет менее 20% своей активности, в то время как трипсин при этих значениях рН наиболее активен. ЭДТА оказывает на лейцинаминопептидазу слабое ингибирующее действие вплоть до концентрации в реакционной смеси фермент-ингибитор 1 мг/мл. 1,10-фенантролин является более эффективным ингибитором. Ионы и Мпг* оказывают на лейцинаминопептидазу активирующее действие; таким образом, лейцинаминопептидаза Является типичным металлоферментом.

Амилаза. Амилаза,, экстрагируемая из 1 г свежего гепатопанкреаса, за 1 час при 30° С гидролизует около 2 г растворимого крахмала. Она представлена двумя изоформами с р1 8,4±0,04 и 9,5+0,07 (рис.7), молекулярная масса 20900+300 Да, что ниже.молекулярных масс большинства описанных амилаз. Амилаза толстолобика стабильна при рН 4,5-9.5; в этих пределах стабильность фермента мало зависит от рН. Оптимум рН активности в присутствии хлорида натрия при 6,8, температурный оптимум при 45° С. Амилаза сильно инактивируется под воздействием сульфата аммония.

Таким образом, среди исследованных особенностей пищеварительных ферментов белого толстолобика можно выделить свойства.

присущие соответствующим ферментам других позвоночных (наличие проферментов у эндопептидаз; молекулярные массы панкреатических форм эндопептидаз 22-25 кДа; активация лейцинаминопептидаз ионами магния и марганца); свойства, характерные, в основном, для пищеварительных ферментов рыб (отсутствие стабильности в кислой среде, наличие у эндопептидаз преимущественно анионных форм); свойства. характерные для ферментов именно безжелудочных рыб. К последним мы относим большое количество изоформ протеаз (не менее трех форм трипсина, не менее шести форм химотрипсина), высокую, по данным ингибиторного анализа, молярную активность трипсина я химотрипсика. наличие в слизистой оболочке кишечника собственно кишечных эндопептидаз. Эти особенности ферментов направлены на компенсацию отсутствующего пепсинового пищеварения.

ВЫВОДЫ

1. Из гепатопанкреаса белого толстолобика выделены и охарактеризованы трипсин, химотрипсин, коллагеназа, лейцинаминопептида-за, амилаза. Методы очистки включали обработку ацетоном, фракционирование сульфатом аммония, гель-хроматографию на сефадексах. ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе. изоэлектрическое фокусирование в градиенте плотности сахарозы.

2. Самую большую молекулярную массу из исследованных ферментов имеет лейцинаминопептидаза - около 200000 Да, остальные ферменты гепатопанкреаса - от 20900 до 24000 Да.

3. За исключением коллагеназы, все исследованные ферменты гепатопанкреаса представлены несколькими изоформами. Их изоэлект-рические точки лежат при следующих значениях рН: у трипсина при 4.4, 5,1 И 9,4; у химотрипсина при 4.8, 5.3, 5.8. 6.5, 7.2 и 7,7; у коллагеназы при 9.4; у лейцинаминопептидазы при 3,9, 5,7 и 6,6, у амилазы при 8.4 и 9, 5.

4. Все исследованные фермента кислотонеустойчивы и быстро инактивируются при значениях рН ниже 5,0, а также выше 9.5.

5. Оптимумы рН активности эндопептидаз гепатопанкреаса белого толстолобика лежат в более щелочной области, чем у соответствующих ферментов высших позвоночных, и выходят за пределы физиологических значений рН кишечного содержимого.

6. Оптимум рН активности экзопептидазы (лейцинамккспептида-зы) находится в менее щелочной области, чем у экзопептидаз млекопитающих.

7. Эндопептидазы белого толстолобика эффективно гидролизуют природные и синтетические субстраты в более широком диапазоне рН, чем соответствующие ферменты высших позвоночных. Это может являться приспособлением к непостоянству рН кишечного содержимого.

8. По результатам ингибиторного анализа трипсин, химотрип-син, коллагеназу белого толстолобика можно отнести к сериновым протеиназам. лейцинамкнопептидазу - к металлопротеиказам.

9. Активность трипсина и химотрилсина белого толстолобика угнетается природными ингибиторами как животного, так и растительного происхождения значительно сильнее, чем активность соответствующих ферментов млекопитающих. Это свидетельствует о более высокой молярной активности протеаз белого толстолобика, что может быть связано с компенсацией отсутствующего пепсинового' пищеварения.

10. Особенностью амилазы гепатопанкреаса белого толстолобика является ее высокая активность и значительно меньшая, чем у большинства описанных амилаз, молекулярная масса.

11. При исследовании слизистой оболочки кишечника установлено, что наряду с ферментами, синтезированными в гепатопанкреасе. там содержатся и собственно кишечные ферменты. Так, трипсин и химотркпсин слизистой оболочки кишечника представлены каждый двумя формами с различными молекулярными массами. Молекулярная масса химотрипсина слизистой кишечника около 29000 Да. Изоферментный состав •трипсина и лейцинаминопептидазы слизистой, кишечника, по-видимому, тот же. что и в гепатопанкреасе.

12. По некоторым свойствам (кислотонеустойчивость, преобладание анионных форм, высокие оптимумы рН активности) протеазы.белого толстолобика значительно отличаются от соответствующих ферментов высших позвоночных, и в то же время они весьма сходны с протеазами других рыб. и в особенности карпа.

13. Существенное сходство распределения и свойств пищеварительных ферментов белого толстолобика и карпа свидетельствует о том, что в процессе эволюции у этих родственных видов рыб возникли единые молекулярные механизмы приспособления к безжелудочному пищеварению.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зозуля Л.В., Проскуряков М.Т. Изоэлектрическое фокусирование некоторых пищеварительных ферментов белого толстолобика. - В сб.: Тез.докл. 8-ой научной конференции по экологической физиологии и биохимии рыб (30 сентября - 3 октября).-Т.1.- Петрозаводск. -1992.-С.120-121.

2. Зозуля Л. В., Проскуряков М.Т. Протеазы гепатопанкреаса белого толстолобика.- В сб.: Тез.докл. 3-его Симпозиума "Химия проте-олитических ферментов" (26-28 апреля).-Москва.-1993,- С.49.

3. Зозуля Л.В.. Проскуряков М.Т. Протеолигические ферменты гепатопанкреаса белого толстолобика. - В сб.: Тез.докл. межреспубликанской научно-практической конференции "Актуальные вопросы экологии и охраны природа предгорных экосистем".-' 4.2.-Краснодар. -1993. -С. 169-171.

4. Зозуля Л.В. ; Нечепуренко В.В.. Пустовалова И.В.. Проскуряков М.Т. Сравнительная характеристика спектров изоферментов высших и низших позвоночных.-В сб.:Актуальные вопросы экологии и охраны природы степных экосистем и сопредельных территорий. -Ч. 2. -Краснодар. -1994. -С. 349-353.

5. Зозуля Л;В.. Хаблюк В.В.. Проскуряков М.Т. Безяелудочное пищеварение белков у карповых рыб.-В сб. Физиологические исследования молодых ученых Северо-Кавказского региона. - Ростов-на-Дону. -1995. -С. 20-22.

6. Зозуля Л. В.. Пустовалова И. В., Хаблюк В. В.. Проскуряков М. Т. Взаимодействие трипсинов гепатопанкреаса карпа и белого толстолобика с природными ингибиторами протеаз.- В сб.: Материалы Всероссийской конференции " Современные достижения биотехнологии". -Ставрополь.-1996.-С.297.