Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка экспериментальных подходов к генетическому анализу хромосомы возбудителя сибирской язвы

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка экспериментальных подходов к генетическому анализу хромосомы возбудителя сибирской язвы"

Г Б ОД

т ш

IIa празах рукописи

МК1СШИС Наталия Иванова?

АЗРЛБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ПОДХОДОВ 1С ГЕНЕТИЧЕСКОМУ АНАЛИЗУ ХРОМОСОМЫ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ язвы

03.00.C7 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени . кандидата медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, старший

научный сотрудник A.C. СТЕПАНОВ

Саратов - 1996

Г- vi ы.голиека ь Российском ка>vio-исслелогс^ельскин аро'лц'.очумном институте " '

1!-учн;'й руководите;::,: доктор медящгчскгх тук. стар:шй

5.ауч!«:й сотрудник A.C. С у:ггл:и":

C0i,:,.::s-,.h::-- опг.ок«чпг:: доктор к«д.п".:нских наук.

профессор A.B. Литы• mm:'!:

кандидат медицинских наук, старший

научней сотрудник А. П. Анисимов

Всг:у,;;ая организация - Ставропольский научно-иселедовзтельою

противочумный институт

Автореферат разослан " г.

Защита диссертации состоится « г. s

часов на заседании Специализированного Совета Л 074.32.01 по задт диссертаций на соискание ученой степень доктора наук при Российско: научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" ¡410005, г. Саратоь, Университетская 46).

С диссертацией можно ознакомиться ' в научной библиотек! института "Микроб".

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор биологических наук.

Г.А.Корнее

- 3 -

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Вирулентность всьоу-итеяя сибирской яззы принято ассоциировать с синтезом трехкомпо-ентпого токсина и альфа-О-глютаминовой капсулы. Разработаные в пос-едние голы способы передачи наследственной информации (Battlstl L. t al. 1985: Stepanov A. et al. 1990; Thorne C.. 1968; Брагин И.В. с оавт., 1990) позволили доказать непосредственную связь синтеза ука-внных продуктов с наличием в геноме возбуд;1тсля двух высокомолеку-яр!!ых плазмид рХ01 и рХ02. в связи с чем указанные репликоны полу-или название плазмид вирулентности.

Вместе с тем накапливается все больше экспериментальных данных, называющих на недостаточность существующих представлений о детерми-антах вирулентности В. anthracis. Это касается даже не столько обственных плазмид сибиреязвенного микроба, кодирующая емкость ко-орых существенно превышает размер известных "классических" детерми-антов, сколько генов, локализованных в составе хромосомы, вопрос о рироде и функциях которых остается открытым. Известные на сегодняи-ий лень данные о существеыо сниженном уровне вирулентности близхо-одственных В. anthracis бактериальных видов. В. thurir.^iensis и В. ereus, унаследовавших в результате генетического переноса реплпконы Х01 и рХ02 (Степанов А.С., 1989), а также предварительные сведения, олученные при изучении некоторых не связанных с собственными плаз-идами возбудителя физиологических характеристик (Ivins В. et а]., 988; Worshara Р.. Cluttér М.. 19Э1), предполагают участие в патоге-етическом процессе при сибирской язве продуктов хромосомных генов, днако экспериментально обоснованного ответа на указанный вопрос до оследнего времени получено не было, что в значительной мере связано отсутствием генетически-маркированных штаммов возбудителя, приемлемых в качестве доноров и реципиентов наследственного материала.

В свою очередь, получение таких культур методами как спонта; го, так и индуцированного мутагенеза, возможно на основе штам; охарактеризованных по хромосомным генам, в частности; по детермю там ауксотрофности. Между тем. данный этап исследс.аний также не лучил своего развития. Имеющиеся единичные сообщения о зависимо! штаммов В. anthracis от источников органического азота в первую редь касаются оптимизации аминокислотного состава сред для обесп ния полноценного роста возбудителя, либо максимального выхода пр цируе.-:ь:х микробом биологически значимых макромолекул,, таких как тективный антиген, летальный и отечный факторы (Найманов П. И. с авт.. 1986; Gladstone G., 1939; Thorne С.,- I960; Rlstroph Т., I В., 1983).

Все вышеизложенное свидетельствует о крайне неполной разр таниости подходов к проведению направленных исследований хромосс детерминантов В. anthracis. что в значительной мере сдерживает е нение вопроса об -их конкретной роли в патогенетическом процесс( сибирской язве.

Перечисленное обусловило постановку цели настоящей ра< выражающейся в разработке подходов к изучению хромосомных, дет нантов возбудителя сибирской язвы.

Для ее реализации были сформулированы следующие осно задачи исследования:

1. Оценить достаточность детерминантов плазмидной докали для реализации полноценного инфекционного процесса у лаборат животных.

2. Оптимизировать состав синтетической среды для опреде питательных потребностей'В, anthracis.

3. Охарактеризовать зависимости от источников органиче

зота штаммов возбудителя сибирской язвы.

4. Разработать на модели В. апЯггсиНз метод инеерционнсп- :.:ута-енеза с использованием транспозона Тп917.

5. Создать коллекцию Тп-опосредованных ауксотрофних ь/тг.гтоа и рототрофных штаммоз В. апЬЪгас

6. Выяснить возможность обмена хромосомными маркерами ¡га конструированной системы "донор-решпиент".

7. Получить доказательства участия продуктов хромосомных генов

/

реализации патогенных характеристик микроба.

Научная новизна.

Вг.ерв'-з получены доказательства влияния продуктов хромосомных знов ка экспрессию вирулентности возбудителя сибирской язви.

На основе оптимизированного состава синтетической среды впервые характеризованы зависимости от источников органического азота 23 гэммов возбудителя сибирской язвы. Установлено, что возбудитель си-)р^кой яззи является обллгатным ауксотрофок по метьонину в сочета-¡л с зависимостью от одной-двух других аминокислот.

Разработан способ, позволяющий использовать чэкторы рТУиэ и Л7315 для проведения процедуры инее ционного мутагенеза транспозо-)м Тп917 ;а модели апГпгас1з.

Впервые с использованием изогенкой системы штаммов В. агП11гас1з •казана принципиальная возможность обмена маркерами ауксотрофности [рототрофности). •

Впервые установлена возможность обмена хромосомными генами меж' В. сегеиз и В. апШгас1ч.

Впервые установлено, что продукты локусов. тесно сцепленных с (^-областью хромосомы В. аптгас^-э, влияют на уровень вирулентности збудителя для белых мышей.

Практическая значимость работы.

Создана коллекция птачмса возбудителя сибирской язвы и бакте; близкородственных видов, вклэчающая в себя.

а) •:ксер::иснные ыоноауксотрофные и полиауксотрофные мутанты атПгсс.?;

б) :-;э имеете аналогов прототрофные штаммы;

в) пзогенные моно-, би- и бесплазмирные штаммы (включая сист "донор-реципиекТ"). удобные для проведения комплексного генетичес го исследования роли плагмхдны:; и хромосомных детерминантов в ви лентностн возбудителя.

Перечисленные штаммы могут быть использованы в генетическ у.олекулярно-гекетических, молекулярно-биологических, биохимически других исследованиях. а также для конструирования продуцентов физ логически-значимых продуктов жизнедеятельности В. апШгасХз. соз кия диагностических препаратов и вакцинных штаммов.

Полученные штаммы используются в научно-исследовательских и титутах Противочумной системы Российской Федерации, в лаборато генетики бацилл Иассачусеттского университета (США) и в лаборато экологии микроорганизмов Национальных Институтов Здоровья (Бетес Мэриленд, США).

В музее живых культур РосНИПЧИ "Микроб" депонирован 21 гене чески маркированный штамм В. antb.ra.cls.

Разработанный метод мутагенеза транспозоном Тп917. а также с соб определения питательных потребностей возбудителя сибирской я включены в состав оформленного и утвержденного по IV урозню внел ния "Методического пособия по генетике возбудителя - сибирской язе Саратов. 1990. . . .■■■'■

Предложен способ дифференциации В. апШтасХэ оч "близкородсТЕ

ix бактериальных видов, основанный.на различиях з питательных пот-гбностях. Ученым Советом РосНИПЧИ "Кикроб" утверждены методические ¡комендацки "Метод дифференциации стаммов В. anthracis от культур шзкородственных видов с использованием синтетической питательной ¡еды".

Апробация рабо.ы. Материалы диссертации представ-)лись на Всесоюзном совещании по программе "Плгзмида", Нальчик. ¡90; на XIII Пленарном заседании научно-методической межведомствен-)й комиссии по борьбе с сибирской язвой при Государственной Комис-ш Совета Министров СССР по продовольствию и закупкам я Кинистерс-¡е Здравоохранения СССР. Таикент. 1990; на Межведомственной конфе-шции, Киров. 1991; на теоретических семинарах Департамента микро-¡ологии Маесачусеттского университета. Амхерст (США), 1989. 1990; 1 семинарах лаборатории экологии микроорганизмов Не нональных Ннс-[тутов Здоровья (Бетесда. Мэриленд. США). 1993. 1994. 1995; на Гор-шовской конференции "Бактер гальные токсины и патогенез" (Андовер, )Ю-Хемпшир, США), 1994; на ежегодной конференции Американского со-щества Микробиологов (Вашингтон, ДС). 1995; на международном секн-зре по проблемам сибирской язвы (Винчестер, Великобритания). 1995;

также на научных конференциях РосНИПЧИ "Микроб". Саратов, 1991, Ш

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Структура диссертации. Работа состоит из 7 тав. включающих обзор литературы, описание исполосованных материа-)В и методов, результатов собственны" исследований, к завершается юодами и библиографическим указателем, включающим 24 отечественны.. 100 зарубежных источников. Общий объем диссертации 117 листов ма-«гописи. Текст иллюстрирован 17 таблицами и 1 рисунком.

Основные положения. выносимые н защиту:

1. Штаммы сибиреязвенного микроба являются облнгатными ауксо' рофами по метионину. Met" фенотип сочетается с Д1 :олнителькой зав: спмостью от одной-двух аминокислот. Показана возможность заме: L-треонина на глицин или на комбинацию L-цистеина и L-серина.

2. Векторы pTVlts pLTV3ts могут быть использованы для пров дения мутагенеза транспозоном 1п9П на модели В. anthracis.

3. Разработано два способа получения прототрофных штаммов во буднтеля сибирской язвы: с использованием спонтанного мутагенеза трансдукцконных скрещиваний между В. cereus и В. anthracis.

4. Продукты локусов, тесно сцепленных с met-областью хромосо В. anthracis, влияют на уровень вирулентности возбудителя для бех мышей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовано 70 штаммов В. anthracis.' а также штаь олизкородстзенных бактериальных видов (В. cereus, В. thuringiensi В. subtills. В. megatherium, В. mesentertcus).

Трансдуцирующиц Фаг CP51ts45 предоставлен профессором С.В.The пе (Массачусеттский университет, США), фаг Tgl3 получен от Р. Азизбекяна (ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизме ¡'. Москва), фаг CP54ant - из коллекции лаборатории изотопного ана. за.

В ходе выполнения работа использованы разнообразные бактерио. гичеокпе методы исследования свойств возбудителя сибирской язвы, также бактерий близкородственных видов; ¡генетические методы "фове, ния конъюгации, транедукции. трансформации, транспозонного мутаге

i; молекуляшо-биологичоскне методы веделения плазмидной ДНК. Виру-¡нтиссть исследуемых штаммов определяли при подкожном заражении бе-IX мышей и морских свинок по показателю LD^o-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Первый этап настоящей работы был посвящен выяснению вопроса об истин продуктов хромосомных генов В. antîirccls в реализации паточных свойств.

Основной отправной точкой для проведения работ аослужил усгашенный нами Факт существования 10 - 1000 красных различий в уров-IX вирулентности дшлазмидных штаммов дикого типа В. antîiracis: 71. К29. с одной стороны, и Z, Pasteur, 17JB, с другой (табл.1) В > же время, заключение о значимости хромосомных генов предстасля-)сь недостаточно оправданным без исключения ассоциированности прс-юса с локусами. кодируемыми репликонами рХ01 и рХ02. тем более, :о о наличии их разновидностей было сообщено C.B. Thorne (1991), С. Степановым (1992).

' ' Таблица 1

5ирулектность некоторых использованных в работе штампов В. anthracls

Штамм Величина LD50 (КОЕ' жизнеспособных спор)

белые мыши морские свинки

i. anthracls СТИ-1 >105 >105 >Г5 >105

i. anthracls Sterne 34F2 >105 >105 >105 >105

i. anthracls 81/1 5 5 5 36

anthracls M29 3 8 31 100

5. anthracls Z 10 20 1,99 X Î03 i,25 у. 104

î. anthracls Pastsur 12 20 4.59 х 103 1.25 X 105

3. anthracls 17J3 12 20 1.19 X 103 7.94 X Ю4

Примечания: в таблице приведены результаты двух независимых экс-

периментов

Наиболее доступным подходом к выяснению последнего обстоятел стза представлялось сравнение показателей LD50 рекс;.Йинантных шта у оз. полученных в результате трачсдукцксн!"1?! передачи репликона рХ из высоковирулентного штамма В. anthracis 81/1 в моноклазмидн (рХОГ) рецип/.енты: К!.:35. CTK-i и Pasteur cf. Вероятность альтерац плазмиди рХ02 з процессе переноса и в результате воздействия сист рестрикции-модификации нового хозяина была исключе а в эксперимент по реципрокной передаче в штамм КМ35. Резулт -аты экспериментов пок зали. что для биологической модели беспородных белых мышей показа? ли LD50 рекомбикантных кленов практически ..э отличались друг от др га и были аналогичны таков™ высоковирулентного штамма 81/1 (LD50 5-12 КОЕ спор). Вместе с тем уровни вирулентности для морских св нок произвол;.^ птаммоз СТИ-1 (рХ02-) к Pasteur Cf (рХ02*) (LD50 -X 102 -1.2-х 103 и 3.2 x 104 - более 1 0 х 10s КОЕ спор, соответ твопно) были существенно ски:::ены в сравнении с таковыми у штамм КМ35 (рХ02*) И 81/1 (LD50 - 5 - 12 КОЕ спор).

Различил в уровнях вирулентности рекомбинантннх штаммов мог свидетельствовать о наличии либо кодируемых хромосомными генами фа тсроз, участвующих в патогенетическом процессе при сибирской язв либо вариантов плазмиды pXOl. не обеспечивающих полноценной реализ ции вирулентных свойств.

Последнее послужило основанием для постановки экспериментов' конъюгационноП передаче обеих плазкид, pXOl и'рХ02, из высоковир лентного штамма 81/lcRMltkE34, устойчивого к ркфампицину и налиди совой кислоте и несущего трансмиссивную мобилизующую плазмиду рАМн з бесплазмидный производный штамма Pasteur - Pasteur pf cS9.

В ходе этих опытов установлено, что вирулентность для морен свинок диплозмидкых рекокбинантньк клонов на 1 - 2 порядка выше i

- и -

>зой i'.cxcznoro LJTZVxa В. cnlhracis .Pasteur cS9 (L350 - 4. С x *03 -3 " Ю5 КОЕ cnnp). не значительно ки:;:е уровня вирулентности craw. ./1 (LDSо - 5 - 33 КОЕ спор).

Полученные результата позволили сделать однозначное сакдзгежке ток. что хромосомные детерминанты оказывают существенное влияние \ уровень проявляемой возбудителем вирулентности.

Вместе с тем исследования данных локусов были затруднены ввиду гсутстзия охарактеризованных пар " донортрепипиент". в качестве ко-зрых могли выступать, с одной стороны. прототроФные'штаммы и поли-тсотрсфные, с другой. В свою очередь, отсутствие сведений о пита-гльных потребностях возбудителя присело к необходимости проведения сальных исследований именно в этом направлении.

На' начальных этапах в результате сравнительного анализа ряда кэ описанных солевых основ синтетических сред (Наймамов П.И. с со-зт., 1987; Brewer С. etal.. 1946; Rlstroph J., IvlnsB., 1Э83; югпе С.. 1960) было выяснено, что рост В. antkracis на синтетичес-зй среде, в основу которой положен минеральный состав, описанный ■ewer C.R. et al., по своим характеристикам является оптимальным.

Использование данного состава неорганических компонентов, а 1кке уточненных концентраций аминокислот (40мкг/мл) позволило впер-¿е определить питательные потребности различных штаммов В. anthra-ls. Установлено, что почти все культуры возбудителя сибирской язвы . ависимы в своем росте от двух-трех аминокислот. При этом, большинс-зо штампов сибиреязвенного микроба нуждались в L-метионине и L-тре-тне. Рост штамма И104 зависел только от L-метио: ина-. Удаление -метионина из состава синтетической среды полностью предотвращало • зет всех без исключения культур возбудителя и не компенсировалось ,1 одной другой добавкой. В то же время,.для L-треонина существовала

возможность замены на глицин, аналогично закономерности, описанн для возбудителя чумы (Классовский А. к. с соавт., 1971). Заме L-треонина на комбинацию L-серина и L-цистеина также-не приводила существенному изменении темпов формирования колонии.

Д.п: L-Еалина и L-лейцина установлена способность подазлять ро культур В. antb.ro.cis при условии раздельного добавления указанн аминокислот в синтетическую среду, что. вероятно, связано с особе костями механизмов регуляции синтеза биосинтетических ферментов.

В ходе экспериментов выявлена закономерность, выражающаяся относительном однообразии питательных потребностей большинства т пичных высоковирулентных штаммов (Met'Thr-)-. что, по всей видимост язляется результатом адаптации возбудителя, к особенностям метаболи ма макроорганизма хозяина. С другой стороны, для части вакцинн: культур, в том числе и диплазмидных, характеризующихся сникенн: уровнем^вирулентность для лабораторных животных по сравнению с вые ксвирулентньм итаммом 81/1, отмечена'дополнительная зависимость i L-фенилаланина. При этом отпечена взаимозаменяемость L-фенилалани: и L-орнитина. Штамм Sterne 34F2 помимо вышеперечисленного проязл: выраженную потребность в Ь-глютаминовой кислоте.

При проведении экспериментов по сравнительному анализу пит; тельных потребностей культур возбудителя сибирской язвы и штаммов J cereus. В. thuringiensis. В. subtilts, В. mesentericus. J megatherium, среди культур близкородственных видов Met" штаммов о< наружено не было. Полученные результаты положены в основу разраб( тайного способа дифференцирования сибиреязвенного микроба от бакт< рий близкородственных видов где в качестве таксономического призн; ка выступает потребность в L-метионине.

Таким образом, нами были охарактеризованы индивидуальные пит;

■елькыэ потребности широкого круга культур В. атпгааг. что от: ры::з •031-. ■-ккостп -ля создания коллекции ауксотрофшх мутантоп и протст-юфных штаммов возбудителя сибирский язвы, необходимо;'; для г.пет;--:еского анализа хромосомных детерминантов и установления их роли появлении патогенных свойств.

. Выбор способа мутагенного .воздействия для возбудителя сибирской :звы основывался на необходимости обеспечения изогенмости штаммов лкого и мутантного типа. Наиболее оправданным, на наш взгляд, предъявлялось использование Тп-опосредозанного мутагенеза.

В настоящее время наиболее широко используемыми транспозонам:: руппы Тп-элементов грамположительных бактерий являются Тп526 и п917. Для Тп91б показана возможность коньюгативной передачи в клет-:и В. апПггаМв (Шпз В. е1 а1., 1988), в то же время, методические :риемы работы с векторами рТУПэ и рШ^г. содер:уащими 1п917. на :одели возбудителя сибирской язвы описаны не были.

На начальном этапе предприняты попытки осуществления транспо-иции Тп917 в хромосому возбудителя с помощью известные методических :одходов, описанных для В. зиъиш (Гаврилова Е. В. с соавт.. 1989; 'оипдпап Р.. 1985). Однако при воспроизведении указанных методик на ;оделн В. апШгаМз все без исключения образовавшиеся клоны еохраня-:и маркеры устойчивости, кодируемые плазмидой рТУКв.

В качестве альтеркатирного подхода к осуществлению транспозиции п917 с параллельной элиминацией плазмиды рТУПэ использовали мето-.ический прием, суть которого выражается в пассировании культур в лдкой питательной среде на границе :ермиссквной и лепермиссивнол ля роста клеток В. an.thra.cls температур.

В ходе экспериментов было установлено, что максимальный уровень лиминации температурочувствитель ого репликона достигался не позд-

нее 3-<i часов :сультивирозакия при температуре 43°С и не превыше 10%. 3 то :::з время, существенного уве гчения уровня элимгкации г,et тора удалось добиться посредством последовательных- чзткрехчасовь пассажей культуры при 43° С в бульоне с селекгпв'.иЖ концентрац^ антибиотиков (Em - 1 мкг/мл, Lm-- 25 мкг/мл), при обязательной про; верительной индукции транспозиции добавлением в среду эритромицина концентрации 0,1 мкг/мл. В результате четвертого пересева не ме.>г 99% клеток приобретало фенотип ErarLmrCins, наряду с исчезновением :-электрофсрегракмах лизатов штаммов полос, с подвижностью, характе{ ной для ялазмиды pTVlts.

Аналогичные данные получены нами и при использования друге] Тп9!7-несущего вектора, pLTV3ts (MLSr Cnflc*).

Отбор ауксотрофных мутантов проводили в процессе высева, пол; ченных в результате четвертого пассана транспозон-содержащих клето! на синтетические пж-тельные среды с добавлением аминокислот согла< но амцногр имам исходных штаммов.

Частота образования ауксотрофных мутантов модельного штамма J anthracis СТИ-1 Delta Т4 не превышала 2 %. что соответствует данны; полученным для других бактериальных видов (Youngman P. et al. 1985). Клоны с фенотипами Mercys" и Met'Gly" составляли подавляющ большинство (62,7 % и 30л, соответственно). Ранее отмеченная на) взаимозаменяемость L-треслина, глицина и L-цистеина в данном случ; не обнаруживалась и штаммы проявляли выраженную избирательность отношении этих аминокислот. Единичные тракспозанты приобрели допо, нительные зависимости от L-фенилаланина, L-глютаминовой кислот! L-серина. Предпочтительное встраивание Тп917 в отдельные сайты хр мосомн В. anthracis. вероятно, объясняется существование!' "горяч точек" для данного транспозона. Косвенным свидетельством в поль

оследнего предположения может слунить также и тот Факт, что при озторном высесе на селективные среды, часть ауксотрсфных мутантов с ополнительными зависимостями з источниках органического азота при-бретали фенотлп Met"Суз", либо Met'Gly".

Другим из использованных в рамках денной работы Тп-элементов, влялся кок-: дативный транспозон Тп916 (Тсг). содержащийся в штамме nt. iaecalts DS5 (D.B. Clewell. Мичиганский университет, США.).

Максимальная частота образования опосредованных инсерцией Тг.916 уксотрофкых мутантов штамма СТИ-1 Delta Т4 составляла 10"3 в пергс-ете на количество образовавшихся ТсГ трансконътогантов. В результате ксмпери;.;еитов биле показано, что транспозон Тп916 способен внедрят-я в случайные сайты хромосомы В. anthracis. Получены ауксотрофиые утанты с дополнительными загисимосткми от L-фенилалакина, L-глпта-иновой кислоты. L-цистеина. L-изолейцина. L-аргинпна, L-серпна. -орнитина, а также, как и в случае с Тп917, с избирательным относе-нем к L-треонину и глицину.

Инсерционные Тп916-мутанты 'стабильно сохраняли приобретенные арактеристики в результате трех последовательных пересевов , а так-э в процессе епоруляции. В то же время, трансдукционный анализ ранспозагтов показал, что транспозон Тп916 в ряде случаев вкедряет-я в хромосому в количестве двух и более копий.

В результате проведанных экспериментов 8ыла получена коллекция ясерционных ауксотрофных мутантов. Вместе с тем в нашем распоря::;е-ии не было прототрофных штаммов В. anthracis, являющихся составной астыо изогенной системы "донор-реципиент ", необходимой для генетн-зского анализа хромосомы возбудителя.

Учитывая характер питательных потребностей большинства штаммов . anthracis, вкранаюпщйся в зависимости от одной - двух амикекче-

лот, были предприняты попытки получения спонтанных прото.трофных м; тантоз.

В качестве исходных в этих зксперимегтах использовали беспла: мидные производные штаммов СТИ-1 и 81/1 - СТИ-1 Delta Т4, КМЗЗ, зг висимые в росте от метионинг, и тгеснина. На селективной среде L-треонином Met'Thr" мутанты формировались с частотой 2,3 х 10"° 3.8 х 10"9 (штаммы СТИ-1 Delta Т4, КМЗЗ, соответственно). При высе] изолированных Met*Thr" мутантов на синтетическую среду без аминоки. лотных добавок образование спонтанных прототрофных мутантов наблюд: лось с частотой 5 х 10"9 для каждого из использованных моделью ктаммоз. При этом 93,1 % и 85.3 % (штаммы СТИ-1 Delta Т4 и КМЗЗ, с< ответственно) полученных клоков рэвертировали к исходному фенотип; В результате оыло отобрано по 8 мутантов каждого из модельных шта: мов, протсгрофные свойства которых с абильно сохранялись в процес пассажей на плотных и жидких питательных средах.

Кроме того, получены рекомбинантные штаммы В. anthracis СТИ Delta Т4„ унаследовавшие локус независимости в питательных' потре ностях в результате трансухциояной передачи хромосомных генов близкородственного вида В. cereus 569RA. Трянсдукцию проводили фаг СР51ts45. Селекцию трансдуктантов осуществляли на среде с L-метион ном или L-треонином, а также на среде "не содержащей аминокислот. К .лонии трансдуктантов на селективных чашках первых двух типов форм ровались с приблизительно одинаковой частотой, составляющей 7 х 1С КОЕ/мл. На среде не содержащей аминокислот частота образован трансдуктантов составляла 2,5 х 10"8 КОЕ/мл. В процессе пассажей плотных у. в жидких питательных средах, а также в ходе споруляции 75% трансдуктантов утратили способность к росту нч среде без амиг кислот' !ых добавок. Оставшиеся клоны были тестированы по видог

зойстааи возбудителя сибирской язви. Установлено, что часть отоб-1кг"ых клонов наряду с прототрофностыо по летионину и треонину призрели ряд сзойств, присущих донорпму штамму (гемолитическая, фос-атазкая и пенициллиназная активности). Факт котрансдукцки указанных ризнаков мо::сет свидетельствовать о том, что соответствуйте детер--етанты сосредоточены па участка хромосомы Б. cereus. тесно сиеплзн-зм с met-областьэ. Вместе с тем видовые характеристики отдельных экомбкнан'пка клонов полностью соответствовали таковым гозбудителя ибирской яззы. Именно эти культуры были использованы для дальнейше-о исследования.

На основании генетических экспериментов по трансдукцпонному крещиваниа отдельных ауксотрофны:: мутзнтоз и прототрофных культур становлена принципиальная возможность обмена хромосомными генами езду изогенкыки штаммами. В трансдукционнкх скрещ лниях были ис-ользованы дикие штаммы, отдельные изолированные ауксотроФные мутан-ы и прототрофнне культуры возбудителя (спонтанные мутанты).

В первой серии опытоз реципиентом слухз:л штамм СТИ-1 Delta Т4 Ket'Thr"). Донорами - клош инсерционных ауксо^сфных мутантов 3. nthracis СТИ-1 Delta Т4 tp27 (KefThrPhe"). tp30 (Met-ThrGlu"). ,p39 (Met"Gly"Phe"). стабильно наследующие приобретенные признаки. 1тбор трансдуктантов проводили на 1-агаре с селекцией по маркеру ан-'нбиотикорезистентности (Тог), с последующим переносом выросших ко-ганий на синтетическую среду лишенную соответствующих аминокислотных юбавок. В другой серии экспериментов в качестве донора использовали ггамм СТИ-1 Delta Т4 ptl2 (спонтанный прототроф). в качестве рецига:-;нта - СТИ-1 Delta Т4 (Met~Thr~). В последнем случае селекцию проводили на синтетической среде с метионином. В результате рекомбинант-ше клоны приобретали фенотипичесгсие характеристики, свойственные

доноркым штаммам. Проведенные эксперименты свидетельствовали в пол; зу перспективности использования сконструированных штаммов в генет; ческом анализе хромосомы В. mthracls.

Заключительный этап настоящего исследования был посвящен вопр> су влияния изолированных ауксотрофных мутаций и мутаций к прототро! ности на вирулентность В, anthracis.

Для этого плазмида рХ02 из штамма КМ34 была передана трансду: цией фагом CP5lts45 в ряд полученных инсерционных мутантов В. an hracis штамма СТИ-1 Delta Т4. а также в изолированные спонтанные рекомбинантные прототрофные производные. Вирулентность отобранн: Сар* трансдуктантов определяли на модели беспородных белых мышей.

Уровень вирулентности для указанной модели лабораторных живо ных спонтанных прототрофов и инсерционных ауксотрофных мутантов ; отличался от такового для исходных штаммов СТИ-i и СТИ-1 Delta Т несущих^ плазмиду рХ02. Вместе с тем уровень вирулентности для бесп родных белых мышей рекомбинантных прототрофных штаммов, унаследова тих репликон рХ02. был снижен в среднем на порядок по сравнению штаммами СТИ-1 и СТИ Delta Т4, содержащими ту же плазмиду. Получе. ные данные свидетельствовали о влиянии детерминантов, локализованн в met-области хромосомы В. anthracls, на экспрессию вирулентное для белых мышей.

Таким образом, в результате проведенных исследований разработ комплекс методических подходов, необходимых для проведения генет ческого анализа хромосомы возбудителя сибирской язвы. Обнаружение помощью разработанных подходов существенной для вирулентности те области хромосомы В. anthracis позволяет приступить к идентификац и детальному молекулярно-генетическому анализу конкретных -хромосо ных генов, принимающих участие в реализации патогенных свойств во будителя.

ВЫВОДЫ

1. Исследованные музейные культуры В. anthracis, несущие рези-;ентннз плазмиды рХ01 и рХ02 и .типичные по видовым свойствам, различаются по уровню вирулентности для морских свинок. Генетическим ана-¡изом указанных штаммов устгновлена роль в выявленных различиях >;ро-¡осомннх генов.

2. Возбудитель сибирской язвы является облкгачным аукеотрофом ю метионкну. Большинство штаммов зависимы в своем росте тагаз от ,-треонина. Показана возможность замены L-треонина ка глицин или на сомбикациэ L-циотеина и L-серина.

3. Ра.работай метод, позволяющий использовать векторы pTVits и )LTV3ts для проведения эффективной процедуры мутагенеза транспозсом :п917 на модели В. anthracis.

4. С использованием Тп916- и Тп917-опосредовачного мутагенеза галучены ауксотрофные мутанты В. anthracis. Инсерции Тп917 распределится на хромосоме возбудителя неравномерно. Среди ауксотрофиых мутантов подавляющее большинство составляют штаммы с фенотипом iet'Cys" и Met'Gly" . Транспозон 1п916 способен встраиваться з слу-4айные сайты хромосомы В. anthracis. j результате транспозиции Тп916 таает присутствовать на хромосоме возбудителя в количестве двух и 5олее копий.

5. На основании изолированных прототрофных и иолиауксотрофных производных штаммов В. anthracis сконструирована изогенная система "донор-реципиент", с помощью которой установлена принципиальная воз-ложность внутривидового обмена маркерами ауксотрофности (прстотроф-тости).

6. Установлена возможность эффективного обмена хромосомными ге-иами между В. cereus и В. anthracis.

7. С RC'iCÄS прямых трансдукцнскных скре^-жанкй между В. cere :: 8. anthracis сконструированы прстотрофиые штаммы возбудителя с Cä-cr.on язвы, характеризующиеся десятикратно! сниаенизм вирулентное для бег/jx :.ишей. Получены спонтанные прстотрофиые мутанты rrauv С*П:-1 Delta Т4 и КМЗЗ. не отличающиеся по вирулентности для бел мы;.:ей от родительских ауксотрофных штаммов. Генетические детермина ты гуксотрофности (прототрофности) непосредственно не участвуют экспрессии вирулентности для бел:лх мылей. но тесно сцеплены с дете мпнантзки вирулентности.

Перечень научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Микшио Н.И.. Степанов A.C. Экспериментальные подходы к гек тическому анализу хромосомального аппарата возбудителя сибирской я вы//ХП1 Пленарное заседание каучно-мзтодической межведомствен^ комиссии по борьбе с. сибирской язвой при Государственной Комисс Совета Министров СССР по продовольствию и закупкам и Министерст Здравоохранения СССР (Тез. докл. 23-24 октября 1990 г. ). - Ташке!: 1990. - С.137.

2. КикшисН.И.. Степанов A.C. Питательные потребности штам* Bacillus an thrac ^//Актуальные про'.лемы и задачи биохим., диагност ки и иимунопрофил. особо, опасных инф. - Саратов, 1991. - с. 122 127.

3. Степанов А.С., Пархоменко A.A., Болотникова М.Ф. Браг И.В.. Аксенов Д.А., Миюгис Н.И., 1'ихеева Т.А. Генетические детерг нантны синтеза экзопротеаз альбумина и казеина возбудителя сиблра язвы//Ген., микробиол. и совершенствование метсдов лаб.диагносп особо опасных инф. - Саратов, 1991. - С.13-18.

4. Степанов A.C.. Пузанова 0.Б., Гаврилоз C.B.. Брагин ИЛ

1архоменко А. А. Болотникова М. Ф Микшис Н. И.. Новикова Л. В. Разработ-са экспериментальных подходов для генетического анализа Факторов ви-)улентности Bacillus anthracls.// Всесоюзное совещание "Бактериаль-гае плазмиды". Нальчик.. 1990 г. - Тез. докл. Под общ. ред. Чл. Корр. АНН ХСР проф. Докарадского И. В. - Нальчик. 1990. - С. 14.

.5. Степанов А. С., Аксенов Д. А., Пархоменко А. А., Брагин И. В., Пикше Н. И. Получение коллекции опосредованных траяслозонами Тп917. Гп916 и Tn916 peltaE кнеерцяонных мутантов Bacillus anthrac^//Актуальные вопросы профилактики опасных инфекционных заболевания (Тез.докл. к Межведомств, конф. 26-28 марта 1991 г.). - Киров. 1991. - С. 154-155.

6. Stepanov A.S.. MlksMs N. I.. Bolotnlkova M. F. Chromosome-borne differences In virulence of Baclllls anthracls for mice and guinea pigs. In Abstr. 95th Gen. Meeting of Arner. Soc. Microbiol.. Washington. DC. 21-25 May 1995. p.223. Abstr.B-331.

1. Stepanov A.S.. Mlkshis tl. I., Bolotnlkova M.F. Role of chromosomally encoded factors In virulence of Bacillus anthracls for mice and guinea pigs. In International Workshop un anthrax. 19-21 September 1995, Winchester UK. p. 78.

v'ta?- Т.йл