Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка эффективной системы генетической трансформации мягкой пшеницы

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка эффективной системы генетической трансформации мягкой пшеницы"

На правах рукописи

ФИЛИППОВ Михаил Викторович

Разработка эффективной системы генетической трансформация мягкой пшеницы (ТгШсит аевНтт Ь.)

Специальность 03.00.23. Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

МОСКВА-2007

003068595

Работа выполнена в Филиале Института биоорганической химия им. МЖ Шемякина н ЮЛ. Овчинникова РАН.

Научные руководители:

кандидат сельскохозяйственных наук Долгов Сергей Владимирович кандидат биологических наук Мирошниченко Дмитрий Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Хрусталева Людмила Ивановна кандидат биологических наук Шульга Ольга Альбертовна

Ведущая организация:

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт риса, РАСХН

заседании диссертационного совета Д.006.027.01 при ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д.42, Тел: (495)976-65-44, Факс: (495) 977-09-47

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Автореферат разослан«_»_2007.

Ученый се!фетарь диссертационного совета

»

2007 г. в И

часов на

кандидат биологических наук

С .А. Меликова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Пшеница - одна из важнейших сельскохозяйственных культур в мире, представляющая собой основной продукт питания в 43 странах. Ежегодно в мире собирают более 500 млн. тонн зерна с площади 230 млн. га. Увеличение валового сбора с/х продукции, ранее достигавшееся за счет роста посевных площадей, на сегодняшний день невозможно из-за ограниченности пахотных земель, и вследствие их активной деградации. Сейчас, рост урожайности основных с/х культур, в том числе пшеницы, гораздо меньше скорости роста населения земли, которое по прогнозам РАО к 2030 году достигнет 8 миллиардов человек. Для решения продовольственной проблемы необходимо в первую очередь повышение урожайности основных продовольственных культур, в числе которых -пшеница.

Генофонд пшеницы ограничен, и приток в него новых генов является сложной задачей, которая в традиционных селекционных программах решается преимущественно за счет отдаленной гибридизации. Современные методы генной инженерии дают возможность значительно ускорить процессы создания высокопродуктивных сортов пшеницы за счет вовлечения в селекционный процесс тех генов, которые невозможно ввести с помощью традиционной селекции.

Несмотря на то, что первые трансгенные растения пшеницы были получены в 1992 году, до сих пор существует целый ряд проблем, ограничивающих возможности трансформации пшеницы. С одной стороны эффективность трансформации пшеницы в значительной степени определяется генотипом. С другой стороны селекция трансгенных тканей на фосфинотрицине, наиболее популярном селективном агенте при трансформации пшеницы, является низко-продуктивной, так как наблюдается большой процент регенерации (до 90%) нетрансгенных растений, что усложняет и удорожает получение трансгенных растений. Кроме того, существует проблема закрепления гетерологичных признаков в семенном потомстве трансгенных линий пшеницы, поскольку часто наблюдается инактивация встраиваемых генов с частичной или полной потерей их экспрессии. Уровень экспрессии гетерологичных генов в полевых условиях часто оказывается более низким в сравнении с условиями защищенного грунта. Эти и другие причины вызывают необходимость разработки эффективной генотип-независимой системы трансформации сортов пшеницы отечественной селекции.

Цели и задачи исследований. Целью наших исследований являлись разработка эффективной системы генетической трансформации отечественных сортов мягкой пшеницы, включающей этапы от регенерации растений из соматических тканей до полевых испытаний трансгенных линий пшеницы, а также получение трансгенных линий пшеницы, устойчивых к гербицидам на основе фосфинотрицине, стабильно наследующих

гетсрологичные пршиаки в потомстве. Для достижения поставленных целей выполнялись следующие задачи:

1. Оптимизировать условия индукции соматического эмбриогенеза и регенерации in vitro растений нескольких сортов пшеницы отечественной селекции.

2. Определить оптимальные параметры баллистической трансформации пшеницы на основе транзиентной экспрессии репортерных генов gfp и gus.

3. Разработать эффективную методику селекции трансгенных тканей пшеницы.

4. Изучить характер наследования гетерологичных генов в нескольких поколениях трансгенных линий пшеницы и отобрать линии, стабильно наследующие перенесенные признаки.

5. Оценить устойчивость трансгенных линий пшеницы к действию гербицида «Баста» в условиях защищенного грунта.

6. Провести полевые испытания гомозиготных популяций трансгенных растений пшеницы с целью:

а) оценки фенотипа трансгенных растений на соответствие исходному сорту.

б) оценки влияния обработки гербицидом «Баста» на основные агрономические характеристики трансгенных линий пшеницы. Научная ноэцзца.

Впервые в России с помощью баллистического метода трансформации получены трансгенные линии пшеницы отечественных сортов с генами bar, gfp я gus.

Разработана эффективная система двойного отбора трансгенных тканей пшеницы, позволяющая значительно снизить долю нетрансгенных побегов среди первичных регенератов.

Впервые проведен сравнительный анализ стабильности экспрессии репортерных генов gfp и gus, при одновременном наследовании в трансгенных растениях пшеницы.

Впервые в России проведены полевые испытания трансгенных зерновых культур, на примере пшеницы. Практическая ценность работы.

Разработана высокоэффективная система баллистической трансформации пшеницы, применимая к различным сортам.

Разработана методика быстрого скрининга трансгенного потомства пшеницы, позволяющая в условиях защищенного грунта анализировать до двух-трех поколений в год.

Получены гомозиготные линии трансгенной пшеницы, стабильно наследующие гетсрологичные признаки, которые могут использоваться в качестве исходного материала в традиционных селекционных программах.

Разработана методика полевых испытаний трансгенных форм пшеницы, применимая к различным злаковым культурам.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов н методов исследований, результатов исследований, заключения и выводов, Рабата изложена на 147 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц и 19 рисунков. Библиография включает 229 источников, из них 226 на английском языке.

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовало 8 печатных работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследований. Исследования по регенерации проводили на семи сортах яровой пшеницы: Андрос, Лада, Люба, Норис, Приокская, Таёжная и Энита; и четырех озимых сортах шпеяицы: Батъко, Дельта, Краснодарская и Крошка. В экспериментах по трансформации были задействованы сорта Андрос, Норис н Энита. Донорные растения выращивались в условиях зимних теплиц при 16-часовом световом цикле, и температуре 21-24°С днем и 16-18°С ~ ночью. В качестве эхеплаятоя использовали незрелые зародыши пшеницы.

Соматический эмбриогенез и регенерация растений пшеницы.

В качестве экетлантов для индукции соматического эмбриогенеза использовали незрелые зародыши, изолированные на 11-14 день после опыления. Зародыши, размером 0,5-1,5 мм, помещали щитком вверх на питательную среду MS (Murashige н Skoog., 1962) с добавлением различных гормонов. Зародыши культивировали при температуре 26°С в темноте в течение 28 дней. Регенерацию растений осуществляли на свету на безгормональеой среде MS в течение 28 дней.

Баллистическая трансформация пшеницы. В экспериментах по [рапсформации пшеницы использовали вектора; psGFP-BAR, содержащий геи gfp под промотором Actl из риса (McElroy и др., 1990) и ген bar под промотором Ubil из кукурузы (Christensen и др., 1992) и вектор pActl-F, содержащий репортерный ген gus под Actl-промотором (рис, 1).

Actl gus

РА«» ¡.„т-щаищ:

Actl gfp Ubil bar

psGFPBAR 1

Рисунок 1. Векторы, используемые для трансформации пшеницы

Зародыши культивировали на индукционной питательной среде (ИПС), содержащей соли MS и дополненной 150 мг/л L-аспарагина и 2 мг/я 2,4-Д, в течение 5-13 дней. За 4-6 часов до обстрела частицами, зародыши перекладывали на среду ИПС, дополнительно содержащую 0,4М матгитола, мальтозы или сахарозы. Обстрел зародышей производили с использованием

устройства FIG (particle inflow gun) по модифицированной методике (Finer и др., 1992) вольфрамовыми частицами с нанесенной на них плазмидной ДНК После обстрела экспланты культивировали дополнительно 12 часов на среде с маннитолом. Эффективность транзиентной экспрессии репортерных генов gfp и gus определяли по степени покрытия площади экспланта участками ткани с экспрессией этих генов.

Далее зародыши перекладывали на селективную среду (ИПС + 3 мг/л фосфинотрицина). Через 3 недели каллусы с экспрессией гена gfp переносили на ту же среду, но с уменьшенным содержанием 2,4-Д (до 1,5 мг/л). Еще через 3 недели каллусы, сохранившие экспрессию гена gfp, переносили на безгормональную среду MS, содержащую 3 мг/л фосфинотрицина. Через 3-5 недель регенераты с экспрессией гена gfp отделяли от каллусов и помещали на безгормональную среду MS, содержащую 2 мг/л фосфинотрицина. В течение всего времени селекции на фосфинотрицине проводился мониторинг тканей и растений на наличие экспрессии гена gfp. Флуоресценцию продукта гена gfp детектировали с помощью флуоресцентного микроскопа ICM 405 фирмы Opton (Германия) со светофильтрами 450-490 нм (длина волны возбуждения белка GFP) и 515-530 нм (длина волны зкстинкции белка GFP).

Молекулярно-генетичсский анализ. Интеграция гетерологичных последовательностей в геном пшеницы определялась методом ПЦР. Гистохимическое определение активности GUS проводили по методике Jefferson (1987), с использованием 5-бром-4-хлор-3-ивдолилглюкуронида (X-GLUC, Duchefa).

Анализ устойчивости трансгенных линий к действию гербицида «Баста». Листья анализируемых растений обрабатывали 2,5%-ным раствором гербицида «Баста». Оценку степени повреждения листа производили через 10 дней после обработай. Степень повреждения листа определяли по условной шкале от 0 до 5 баллов, где 0 баллов соответствовали полной гибели листа, а 5 баллов - листьям без признаков повреждения.

Полевые испытания. Испытания проводили на сертифицированном полигоне, созданном на базе карантинного питомника ВНИИСПК, г. Орла. Для анализа использовали семь гомозиготных линий сорта Андрос (А-3, А-б, А-18, А-20, А-34, А-37 и А-46) и одну гомозиготную линию сорта Норис (N-6).

Посев трансгенных линий и контрольных растений проводили в четырех повторностях с рандомизированным расположением делянок.

Семена высевали в третьей декаде апреля по 100 штук на делянку. Обработку посевов проводили гербицидом «Баста» из расчета б л/га в фазу кущения пшеницы (вторая декада мая). Через 10 дней после обработки гербицидом производили оценку степени повреждения контрольных и трансгенных растений.

Оценку урожайных характеристик пшеницы производили перед уборкой урожая. На каждой делянке определяли густоту стеблестоя и отбирали произвольно по 25 растений, у которых учитывали высоту стебля и

массу зерна с колоса. Дополнительно определяли урожайность с каждой делянки.

Статистическая обработка экспёщшентальттм^ даррл

При математической обработке экспериментальных данных использовались основные матемахико-статистические методы, применяемые в биологических исследованиях (Плохинский, 1970; Лакин, 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Оптимизация соматического эмбриогенеза в культуре ткани пшеницы

Для успешной генетической трансформации пшеницы необходимо располагать эффективной методикой регенерации растений из соматических тканей. Поскольку эффективность соматического эмбриогенеза в культуре ткани пшеницы является в высокой степени генотип-зависимой (Lufars and Lorz, 1987), нашей первоначальной задачей являлась оптимизация условий регенерации незрелых зародышей озимой и яровой форм пшеницы различных сортов отечественной селекции. Мы проанализировали влияние различных ауксинов: 4-ХФУК (4-хлорфеноксиуксусная кислота), 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота), 2,4,5-Т (2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота) и Дикамбы на эффективность соматического эмбриогенеза. Обнаружено, что наибольшая частота формирования эмбриогенного каллуса (72-79%) наблюдается на средах с 2 мг/л 2,4-Д либо с 2-4 мг/л Дикамбы. Однако каллусы, полученные на среде с 2,4-Д регенерировали больше побегов (12,9 побегов с каллуса), чем каллусы, образовавшиеся в присутствии Дикамбы (9,0-9,9 побегов с каллуса).

Тип и концентрация углевода могут значительно влиять на эффективность регенерации растений. Среди проанализированных углеводов (глюкоза, мальтоза, сахароза) сахароза при концентрации 3% обеспечивала наибольший процент эмбриогенного каллуса (75%), тогда как наибольшее количество побегов с одного каллуса было получено на среде с 4%-ным содержанием мальтозы (13,9 пгг/каллус).

Аминокислоты часто используются в культуре ткани для повышения эффективности эмбриогенеза. Мы проанализировали влияние аспарапша, гдютамина и прелина на регенерационную способность незрелых зародышей. Аспарагин в концентрации 150 мг/л способствовал значительному увеличению частоты соматического эмбриогенеза в сравнении с другими аминокислотами и контролем (с 56 до 72%).

Оптимизированная питательная среда, включающая 2 мг/л 2,4-Д, 150 мг/л аспарагина и 30 г/л сахарозы была протестирована на 10 сортах отечественной селекции. Эффективность соматического эмбриогенеза была значительно выше у большинства сортов яровой пшеницы (46-96%), по сравнению с озимыми сортами (25-78%) (Табл. 1). Менее выраженные различия наблюдались между озимыми и яровыми сортами в количестве побегов с одного эмбриогенного каллуса.

Таблица 1.

Влияние генотипа на частоту соматического эмбриогенеза и регенерацию побегов из незрелых зародышей пшеницы

Генотип Каллус, % Эмбриогенез, % Побеги, шт.

Яровые

Андрос 95 ±9 72 ±9 12,9 ±1,2

Энита 95 ±7 95 ±6 15,3 ±1,7

Норис 93 ±8 92 ±7 13,7 ±1,0

Лада 90±5 89 ±10 16,0 ±0,9

Приокская 98 ±4 96 ±8 16,5 ±1,8

Та&кная 95 ±2 95 ±4 18,4 ±2,3

Люба 92 ±9 46 ±8 9,8 ±1,6

Озимые

Батько 94 ±8 49 ±11 12,2 ±1,0

Дельта 69 ±12 25 ±3 8,5 ±0,8

Краснодарская 94±8 65 ±6 9,3 ± 1,3

Крошка 100±1 78 ±12 12,8 ± 1,7

В дальнейших исследованиях использовали сорта со средней (сорт Андрос) или высокой (сорта Норис и Энита) эмбриогенной способностью.

2. Баллистическая трансформация шпенипы

2.1. Подбор оптимальных условий переноса гетерологичных генов в клетки пшену™

Для подбора оптимальных параметров баллистической трансформации использовали репортерные гены ф и экспрессию которых можно легко детектировать в трансформированных тканях. Давление гелия, размер частиц, тип экспланта и способ осмотической предобработки эксплаягов относятся к наиболее критическим факторам, определяющим эффективность переноса гетерологачной ДНК в клетки.

Давление гелия, определяющее силу, с которой частицы проникают в ткани экспланта, оказывает значительное влияние на уровень транзиентной экспрессии гена & (Рис. 2А). Повышение давления гелия с 3 до б кгс/см2 приводило к увеличению уровня транзиентной экспрессии гена Максимальный уровень транзиентной экспрессии наблюдался при давлении 5 кгс/см2. При этом значении 64% эксплантов имели высокий (более половины площади экспланта) уровень транзиентной экспрессии. Дальнейшее повышение давления гелия не влияло на уровень транзиентной экспрессии, однако из-за сильных повреждений обстреливаемой ткани значительно снижался регенераЦионный потенциал эксплантов.

60%

40%

0%

ЯЙР ;

§Н§~ 53 Щ 'Ш -Ш- Щг

м М

ш® ■ 34 Ж щ т

44 . 30 __ 37

25

4 6 5

ГХ ГЧ <4

я V. ж г

и о о и

ё 111

100% -

30%

60% -

■ Ж

-'

ш

1

40%

32

20% -

0% - А~

л -

0

1 й

В

2 т о

я

и

Я

е

л

ъ £

а

1

Л

2 '

в» >75% площади икспламта 50-75% гшшцади же план га 15-50°™ щи щада э иишант» <25И шющади экс плата леспяан™ без экспрессии СУР

100%

И

В0% -:■.'■■ д

15

1*

60%

40%

20%

зз —

«з

о% - I -

100% - . 2

30%

60% -

95

40% -

20% -

43

0%

3 12

-в £

е- с"

Ь а

1

О

а

т :-'75% площади зкеплапта ££ 50-75% площади :?ксплата 25-50% площади эксплаша <25% площади эхепланга ЗЮПдашЫ без экспрессии Сия

Рисунок 2. Оценка влияния различных параметров баллистической трансформации на уровень тражэиевтиоЭ экспрессии генов (А,Б,В) а gus (Г). А —давление гелия, Б - тип экспланта и размер частиц, В-Г - тип осмотака

Перенос гетерологичной ДНК в растительные клетки осуществляли на вольфрамовых частицах двух калибров N10 и N17 со средним диаметром частиц 0,7 и 1,1 мкм, соответственно. Размер частиц, на которых осуществлялся перенос гетеролошчной ДНК, не оказывал значительного влияния на уровень транзиентной экспрессии гена gfp независимо от типа эхспланта (Рис. 2Б).

В экспериментах по трансформации мы использовали два типа эксплангов, отличающихся по типу формирования соматических эмбрионов. Для эксплангов первого типа характерно образование соматических эмбрионов непосредственно на щитке незрелого зародыша, а у эксплангов второго типа соматические эмбрионы формировались на поверхности каллуса. Тип эксппанта значительно влиял на уровень экспрессии гена gfp. Количество эксплангов с высоким уровнем транзиентной экспрессии составляло 23-25% для эксплангов первого типа и 14-16% - для эксплангов второго типа.

Осмотическая предобработка эксплангов способствует повышению уровня транзиентной экспрессии гетерологичных генов за счет облегчения проникновения частиц в клетку и предотвращения их гибели при сильных повреждениях. Мы провели сравнение влияния трех веществ: маннигола, сахарозы и мальтозы, в концентрации 0,4М, на эффективность переноса репортерных генов gfp и gus. В сравнении с контрольной средой, содержащей 30 г/л (0,09М) сахарозы, осмотический шок эксплангов значительно повышал уровень транзиентной экспрессии обоих репортерных генов (Рис. 2 В-Г)-Среди анализируемых веществ, сахароза и маннитол обеспечивали больший процент эксплангов с высоким уровнем транзиентной экспрессии (54-60% для гена gfp и 18-26% для гена gus) по сравнению с мальтозой (40 и 12%, соответственно). Однако дальнейшие исследования показали, что высокие концентрации сахарозы, как и мальтозы, подавляли образование трансгенных побегов, поэтому в последующей работе мы использовали маннитол.

Сравнение эффективности транзиентной экспрессии репортерных генов gfp и gus, одновременно переносимых в клетки пшеницы, показало, что продукт гена gfp детектируется в растительных тканях намного легче, чем продукт гена gus, несмотря на то, что оба гена находились под одним и тем же промотором (Рис. 2 В-Г)- Ранее прямое сравнение эффективности экспрессии двух репортерных генов при трансформации злаковых культур не проводилось.

2.2. Генетическая трансформация пшенипы репортерными генами

В результате оптимизации параметров трансформации незрелых зародышей пшеницы сорта Андрос, было отобрано 48 регенератов, растущих на селективной среде. Молекулярно-генетический анализ методом ПЦР подтвердил трансгенный статус 43 линий. Наибольшая частота трансформации (1,2%) конструкцией psGFP-BAR наблюдалась при обстреливании эксплангов второго типа частицами N17 (Табл. 2), несмотря

на то, что уровень транзиентной экспрессии у эксплантов первого типа был значительно выше.

Таблица 2.

Влияние размера частиц и типа экспланта на эффективность трансформации сорта Андрос, с использованием дополнительной, визуальной селекции по (НФ

Размер частиц Тип эксплантов Количество зародышей Кол-во отобранных растений Кол-во трансгенных линий Частота трансформации

0,7 мкм I 805 6 5 0,62

(N10) П 625 4 4 0,64

1,1 мкм I 1947 17 14 0,72

(N17) II 1663 21 20 1,20

Основным недостатком селективного гена bar при трансформации злаковых культур является регенерация большого количества (до 90%) нетрансгенных побегов в присутствии селективного агента -фосфинотрицина. Нами предложена система двойной селекции, заключающаяся в отборе трансгенных тканей на фосфинотрицине в сочетании с визуальной селекцией по экспрессии гена gfp. (рис. 3). Данная система селекции обеспечила снижение доли нетрансгенных побегов среди отобранных растений до 16% или полного их отсутствия (табл. 2 и 3).

Таблица 3.

Эффективность трансформации и ко-трансформации трех сортов пшеницы с использованием стратегии двойной селекции

Вектор/ сорт psGFP-BAR psGFP-BA] R/pActl-F*

Андрос Энита Андрос Норис

Кол-во эксплантов 969 96 4070 1806

Кол-во регенерантов 14 1 38 9

Кол-во трансгенных растений (подтв. ПЦР) 12 • 1 32 (19)** 9(7)

Частота трансформации, % 1,24 1,04 0,79 0,50

Частота ко-интеграции % - - 59 76

* - молярное соотношение векторов psGFP-BAR/ pActl-F составило 1:2 *♦ - в скобках - количество линий, несущих оба репортерных гена

Рисунок 3. Визуальная селекция траясгеиных тканей по экспресс™ гена gfp. К ~ каллус, Б - соматический эмбрион, В и Г - развитие традсгекного регенеранта

С целью изучения закономерностей совместного переноса генов из разных векторных конструкций мы провели ко-трансформацию сортов Авдрос и Норис вектором psGFP-BAR, несущим оба селективных гена (gfp и bar), и вектором pActl-F. В данном эксперименте частота трансформация сорта Андрос составила 0,79%, тогда как для сорта Норис этот показатель составил 0,50% (Табл. 3). Однако, доля растений сорта Норис несущих гены обоих векторов (частота ко-трансформации) была выше (79%), чем у сорта Андрос (59%).

Частота трансформации сорта Андрос при одновременном переносе двух векторных конструкций оказалась ниже, чем при переносе вектора psGFP-BAR. Это может быть связано с тем, что в экспериментах по ко трансформации количество плазмиды psGFP-BAR, несущей оба сеяемданш: гена, было снижено в три раза, поскольку на частицах, которыми производится обстрел эхеплантов, одновременно можно перекосить только определенное количество ДНК.

В результате проведенных экспериментов по оптнмизшщи баллистического метода трансформации и ко-трансформации пшеницы было получено 72 регенерат® трех сортов пшеницы. ПЦР-анализ подтвердил

вставку гетерологичных генов у 64 линий (54 линий сорта Андрос, 9 линий сорта Норне и 1 линии сорта Энита) (Рис. 4),

Я ® &

S 6 i

3

a

Рисунок 4. ПЦР-анализ геномной ДНК некоторых траяепешшх линий (Т0) ншеници copra Андрос. Агарозпый гель содержит ПЦР-продукты гена bar

2J. Анализ наследования гетерологичных признаков в потомстве трансгенных линий пшеницы

23 травегенных лилии сорта Андрос и 5 линий сорта Норис, обладавших детектируемым уровнем экспрессии гена gfp были выбраны для дальнейших исследований. Потомство трансгенных линий анализировали на присутствие экспрессии гена gfp. Линии, полеченные в результате ко-грансформации, дополнительно анализировали на наличие экспрессии гена gas с помощью гистохимического анализа.

Для определения характера наследования экспрессии реггортерных генов gfp и gl«- нами разработана экспресс-методика скрининга трансгеныого потомства, позволяющая за год последовательно анализировать до двух -трех поколений трансгенных линий пшеницы, полученных в результате самоопыления. Для этого незрелые зародыши изолировали на 20-25 день после опыления и помещали на питательную среду MS, содержащую 0,1 мг/л гибберелловой кислоты (ГКз). После прорастания зародышей проводили анализ экспрессии репортерных генов (Рис. 5 и 6). За время исследований было проанализировано 1,5 тыс. зародышей поколения Т\ и порядка 10 тыс. зародышей поколения Т2.Анализ потомства Т] трансгенных линий пшеницы выявил разнообразные характеры наследования гетерологичных признаков. В большинстве случаев статистический анализ на соответствие между наблюдаемыми » ожидаемыми распре делениями его критерию соответствия X выявил соответствие однолокусной Е-енетаческой модели наследования гетерологичных признаков (табл. 4),

Рисунок 5. Анализ траксге иного потомства Т1т полученного в результате самоопыления линий пшеницы То, на основе экспрессии гена А -- незрелей зародыш без экспрессии гена ¡$р\ Б - асзреный зародыш с экспрессии гена; В-Г проросшие зародшпи шиетщы в ультрафиолетовом (В) и обычном (Г) свете.

/ ✓ (V я с в #

)4 - * Ф • Ф Зародыши

/ ■■ = \ ^ 1

у у ч \ ч /

Колеоптиле ^ ' 'S,, у Корни

Рисунок б. Анализ трансгеяного потомства Ть полученного а результате самоопыления яи.тгй пшеницы То, на основе экспрессии ген» в различных гканях зародышей (зародыши, колеоптиле, корни)

Наследование гена gfp у линий А-3, А-39, А-40 и N-9 статистически соответствовало двухфокусной модели встраивания генов. Также обнаружены линии (А-5, A-ll, А-15, А-48 по гену gfp и А-37 по гену gm), для которых статистический анализ ае подтвердил соответствие ни одной из предполагаемых моделей встраивания. Данное явление может быть связано с нестабильностью вставки гегерологкчных генов в геноме, инактивацией генов в потомстве, с многолокуеншм характером встраивания гетерологичных генов и другими причинами.

Таблица 4.

Экспрессия генов gfp и gus и вычисление теоретических частот и критерия соответствия & для расщепления семенного потомства Ъ независимых трансгенных линий пшеницы сортов Авдрос и Норис

Лини» Ген Кол-во эмбрионовс экспрессией Кол-во эмбрионов без экспрессии Наблюдаемое расщепление Соотвегсп расщепления * ие модели по критерию

3:1 (однолокусн ая) 15:1 (двуХДОЦФН ая)

А-3 Ф 80 7 11:1 ОД

А-5 Ф 8 20 0,5:1 32.2 203,0

А-б Ф 49 15 ■ 3 1 0.1 32,3

А-И Ф 71 10 7 1 6,9 5.1

А-13 Ф 40 20 2 1 гл 75,1

А-15 Ф 23 16 1 1 ЬЗ 80.5

А-16 Ф 71 24 3 1 ол 58,6

А-17 Ф 39 13 3 1 од 31Д

циз 32 15 2 1 и 52,9

А-18 Ф 30 14 2 1 и 49.1

киз 16 10 2 1 24 46.0

А-20 ф 47 16 3 1 ©л 39,4

ЦШ 45 18 3 1 0,4 53,6

А-27 ф 10 5 2 1 <м> 18.8

циг 9 3 3 1 од 12

А-31 ф 8 3 3 1 ол 8,3

А-34 ф 28 12 2 1 0.5 38,5

Vи 13 4 3 1 ОЛ 8,7

А-37 Ф 31 13 2 1 05 40,8

ЯШ 9 8 1 1 4.4 48,3

А-39 Ф 21 1 21:1 49 0.1

низ 9 6 2:1 1Я 29,6

А-40 Ф 27 1 27:1 6.9 03

№ 20 8 3 1 0.2 23,8

А-42 Ф 35 10 4 1 0.2 19.6

А-47 Ф 29 16 2. 1 2.7 66,0

А-48 Ф 21 18 1 1 93 106,0

А-50 Ф 33 19 2 1 3.7 81.4

А-53 Ф 18 4 5 1 0* 5,3

А-55 Ф 15 7 2 1 05 24.5

кш 12 9 . 1 1 3,6 48,0

А-56 Ф 15 9 2 1 2.0 40,0

N-2 Ф 12 6 2 1 0.7 223

N-4 Ф 30 8 4 1 03 14.2

яиз 25 9 3 1 ОЛ 23,7

N-6 ф 13 7 г 1 1Д 28,2

N-8 ф 5 1 5 1 ОД 1.1

кш 5 1 5 1 0л 1,1

N-9 ф 51 7 7 1 5.2 3.4

низ 37 10 4 1 03 18,1

У большинства линий, подученных в результате ко-трансформации, отмечалось соответствие моделей наследования для гена ц/р и гена ¿га. Исключение было обнаружено у линий А-37, А-40 и N-9, у которых характер наследования экспрессии генов и £1« статистически не соответствовал друг другу.

Следует отметить, что в результате исследований не были выявлены растения, которые бы независимо наследовали гены ф и Это позволяет сделать вывод о совместном наследовании этих генов, являющимся результатом их интеграции в од ин локус хромосомы.

Анализ поколения Тг подтвердил для большинства анализируемых линий предполагаемый характер встраивания. В ходе анализа выяснилось, что часть эмбрионов Т2 не проявляла СШ-активность при неизменном уровне экспрессии гена В таблице 5 суммированы данные по эффективности экспрессии репоргерных генов ¿р и gus в поколении некоторых линий трансгенной пшеницы. Для определения причины потери экспрессии гена был проведен ПЦР-анализ геномной ДНК тех линий, в которых наблюдалась экспрессия гена ф и не детектировалась экспрессия гена gus. Результаты этого анализа показали, что во всех случаях потеря экспрессии гена gus не была связана с его элиминацией из генома.

Таблица 5.

Сравнение эффективности экспрессии репоргерных генов £/р и до в Т2 поколении

Линия Кол-во СБР+ эмбрионов, проанализированных на вШ. пгг. Кол-во ОРР+ЮШ- эмбрионов, шт. Доля вРР+ЮШ- эмбрионов, % ПЦР-анализ некоторых линий ОЕР+ЛЗте- на присутствие гена Киз

ПЦР+ ПЦР-

А17 448 79 18 16 0

А20 1126 8 1 7 0

А27 65 6 9 6 0

А34 105 2 2 2 0

А37 92 50 54 14 0

Стабильность наследования экспрессии гена gus зависела от анализируемой линии. Так, у линий А-20 и А-34 экспрессия гена gus была относительно стабильной. У линий А-17 и А-27 доля ОТР+ТОШ- эмбрионов была значительна, а у линии А-37 более половины проанализированных зародышей утратили экспрессию гена gus. Можно сделать вывод, что использование гена ф в качестве репортерного предпочтительнее, поскольку для него характерна более стабильная экспрессия в поколениях.

В результате мы получили более ста гомозиготных по гетерологичным генам линий поколения Т2, стабильно наследующих гетерологичные признаки.

24. Анализ устойчивости трансгенных линий пшеницы к гербициду «Баста» в условиях защищенного грунта

Существуют данные, что увеличение дозы гена в геноме за счет его гомозиготности может повышать уровень экспрессии (Bliffeld и др., 1999; Russell и др., 1997). Сравнение 15-ти линий пшеницы поколения Ti не выявило коррелятивной связи между зиготностью растения и уровнем экспрессии гена ¿er у большинства линий (Табл. б).

Таблица б.

Степень устойчивости трансгенных линий пшеницы к гербициду «Баста» (2,5%-ный раствор) в зависимости от зиготности растений по гетерологичному признаку

Сорт Линия Наследование Кол-во исследованых Ti растений Среднее значение устойчивости согласно шкапе

Гетеро-зиготы Гомозиготы Среднее по линии

Андрос A3 15:1 10 2,60 3,20 2,90

Аб 3 1 10 2,90 3,40 3,00

А15 3 1 17 2,95 3,18 3,05

А 16 3 1 И 4,13 3,54 3,82

А17 3 1 19 2,47 4,25 2,84

А 18 3 1 20 3,30 3,38 3,15

А 20 3 1 35 2,65 3,17 2,83

А27 3 1 7 4,25 3,67 4,00

А34 3 1 10 3,00 3,67 3,20

А 37 3 1 15 3,60 3,20 3,47

А 40 15:1 15 2,92 3,00 2,93

А 42 3 1 18 3.91 4,57 4,17

А 47 3 1 20 3,26 4,00 3,30

А 48 3 1 9 4.25 4,80 4,33

А 53 3 1 10 3,22 3,00 3,20

Норис N2 3 1 7 3,71 н.а 3,71

N4 3 1 15 0,54 2,00 0,73

N6 3 1 11 4.60 4,00 4,55

N8 3 1 5 3,80 н.а 3,80

N9 3 1 12 3,33 3,33 3,33

Анализ эффективности экспрессии гена bar в условиях защищенного грунта позволил выявить 4 линии (А-27, А-42, А-48 и N 6) с высоким (более 4-х баллов) уровнем устойчивости к гербициду «Баста». Очень низкая устойчивость к гербициду (0,73 балла) была обнаружена у лини» N4, что может быть связано с повреждением самого гена либо его регуляторных элементов при встраивании вектора в геном растения, либо со встраиванием вектора в слабо транскрибируемый участок генома (Meyer, 1995).

2.5. Нолевые испытания трансгенных линий поколений Т^ и Т* пшеницы.

Полевые испытания являются необходимым этапом при трансформации злаковых культур, поскольку призваны выявить реальный эффект от применения методов генетической инженерии. Впервые в России нами проведены полевые испытания трансгеяной пшеницы. Осуществлен анализ гомозиготного поколения Т2-Т3 семи трансгенных линий сорта Андрос и одной трансгенной линии сорта Норис на сертифицированном полигоне, «мданньш на базе карантинного питомника ВНИИСПК, г. Орла.

В полевых условиях изучалось: соответствие сортовой идентичности трансгенных линий и исходного сорта; влияние полевых условий на экспрессию гена bar, влияние обработки гербицидом на основные агрономические характеристики трансгенных растений пшеншда.

Следует отметить, что обработка гербицидом «Баста» оказала сильное токсическое действие ¡ia нетравегенные растения сортов Андрос и Норис. Надземная часть обработанных растений пожелтела и нотабла в течение двух недель, тогда как большинство трансгенных растений не проявили никаких признаков поврежедения (рис. 7).

Рисунок 7, Влияние обработки гербицидом «Баста» на растения пшеннды сорта Андрос. А — необработанные растения, Б - растения, обработанные 2£%-ньж раствором гербицида «Баста», Контроль - нетрансгенные расгекия.

Сравнительный анализ морфологических характеристик растений в конце периода вегетации показал, что большинство трансгенных линий не

имело отличий от исходных сортов, за исключением линии А-46-1. Данную линию следует признать сомакпональным вариантом сорта Андрос, поскольку растения этой линии демонстрировали изменение морфологии колоса, ставшего более компактным, а также снижение высоты растений до 0,81 м (контроль -1,13 м). Результаты проведенных измерений показали, что урожайность большинства трансгенных и контрольных растений сравнимы и статистически не отличаются. Тем не менее, две трансгенные линии (А-18-47 и N-6-20) из шестнадцати анализируемых проявляли отличия от оригинальных сортов (табл. 7).

Таблица 7.

Влияние обработки гербицидом «Баста» на урожайность трансгенных линий пшеницы

Урожайность, ц/га Отношение

Сорт Линия Без обработки С обработкой урожайности обработанных растений к необработанным, %

Андрос Контроль 51,0 ±7,5 11,8 ±5,2 23

А-б-12 553 ±0,4 44,0 ±2,7 79

А-18-47 33,7 ±7,4 38,5 ±4,9 114

А-20-26 46,6 ±9,7 50,0 ±7,7 107

А-20-28 68,2 ±1,0 59,2 ±3,1 87

А-20-36 59,6 ±9,1 58,5 ±2,7 98

А-20-38 66,0 ±2,3 55,3 ±2,1 84

А-20-40 46,9 ±5.2 54,7 ±8,5 117

А-34-9 60,5 ±0,9 58,4 ±7,0 97

А-37-28 54Д±4,7 49,9 ±2,3 92

А-37-30 563 ±4,3 59,8 ±3,8 106

А-37-39 51,4 ±2,4 52,2 ±2,8 102

А-37-45 61,0 ±3,2 50,0 ±0,4 82

А-46-1 54,6 ±2,5 403 ±33 74

А-3-4 48,3 ±3,7 63,2 ±9,7 131

А-3-34 59,6 ±0,2 53,0 ±5,7 89

Норис Контроль 74,1 ±0,9 18,5 ±3,0 25

N-6-20 38,2 ±9,7 28,0 ±7,3 73

У линии А-18-47 расчетная урожайность составила 33,7 ± 7,4 ц/га, что на 34% меньше, чем урожайность контроля Андрос. У линии N-6-20 урожайность (38,2 ± 9,7 ц/га) оказалась почти в два раза меньше, чем у

контрольного copra Норис (74,1 ± 0,9). Наблюдаемое снижение урожайности скорее всего также является следствием сомаклональных вариаций.

В результате обработки гербицидом «Баста» опытных посевов не наблюдалось статистически достоверной разницы по большинству показателей между необработанными трансгенными/нетрансгенными растениями и' обработанными трансгенными растениями. На контрольных делянках наблюдали 4-х кратное снижение урожайности обоих сортов, тогда как у большинства трансгенных линий показатель урожайности варьировал в пределах ошибки опыта. Исключение составили линии А-46-1 и N-6-20, у которых урожайность снизилась на 26 и 27%, соответственно. У данных линий снижение урожайности может быть следствием либо недостаточной экспрессии гетерологичного гена bar (линия N-6-20) либо следствием сомаклональных вариаций, возникших во время соматического эмбриогенеза при трансформации (линия А-46-1).

В целом, анализируемые линии проявили высокую степень устойчивости к действию гербицида «Баста». Более того, шесть линий (А-18-47, А-20-26, А-20-40, А-37-30, А-37-39 и А-3-4) показали некоторый прирост урожайности на делянках, обработанных гербицидом, в сравнении с делянками этих линий, необработанных гербицидом. Одиннадцать трансгенных линий показали снижение урожайности после обработки гербицидом по сравнению с вариантом, не подвергшимся обработке. Однако, у большинства линий (А-20-28, А-20-36, А-20-38, А-34-9, А-37-28, А-37-45 и А-3-34) это снижение составляло лишь несколько процентов и по результатам статистического анализа признано не достоверным. Тем более что по сравнению с делянками контрольного сорта Андрос падение урожайности у данных линий не наблюдалось.

Полученные результаты указывают на эффективную экспрессию гена bar в полевых условиях и предполагают такую же эффективную экспрессию других гетерологичных генов.

ВЫВОДЫ:

1. Разработана эффективная система трансформации отечественных, сортов пшеницы.

2. Подобраны оптимальные условия регенерации растений нескольких сортов пшеницы из незрелых зародышей.

3. Разработана система двойной селекции трансгенных тканей, позволяющая значительно снизить долю нетрансгенных побегов среди первичных регенератов.

4. Проанализирован характер расщепления репортерных генов и %и$ в поколении Т} 28-ми независимых трансгенных линий и в поколении Т2 13-ти линий сортов Андрос и Норис, и установлено, что характер наследования большинства линий соответствует однолокусной генетической модели наследования признаков.

5. Получены трансгенные растения пшеницы сортов Андрос и Норис и проведена их оценка в полевых условиях, показавшая высокую устойчивость анализируемых линий к действию гербицида «Баста».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Филиппов М.В., Мирошниченко Д.Н., Слнвохотова А.А., Долгов С.В. Разработка системы трансформации и получение форм пшеницы (Triticwn aestivum L.), устойчивых к гербициду // Достижения науки и техники АПК - 2004. - Т.1. - С. 10-12.

2. Филиппов МЛ., Мирошниченко Д.Н., Берниковская Д.И., Долгов С.В. Подбор оптимальных параметров баллистической трансформации генома мягкой пшеницы // Сельскохозяйственная биология - 2006. - Т.1. - С.67-73.

3. Ffllppov М., Miroshnichenko D., Vernikovskaya D., Dolgov S. The effect of auxins, time exposure to auxin and genotypes on somatic embryogenesis from mature embryos of wheat // Plant Cell, Tissue and Organ Culture - 2006. - V.84. - P.192 - 201.

4. Miroshnichenko D., Filippov M., Dolgov S. Genetic transformation of wheat in Russia // Proceedings of Tenth International Wheat Genetic Symposium. Paestum, Italy, 2003. - V.l. - P.185-189.

5. Мирошниченко Д.Н., Филиппов MA., Долгов С.В. Экспрессия гетерояогичных генов в растениях пшеницы (Triticwn aestivum L.), полученных методом баллистической трансформации // Тезисы П Московского международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва,

2003.-Т. 1.-С.204.

6. Филиппов М.В., Мирошниченко Д.Н., Долгов С.В. Генетическая трансформация пшеницы // Тезисы 8-ой Международной Путинской школы-конференции молодых ученых. Пущино,

2004.-С.268.

7. Miroshnichenko D., Filippov М., Dolgov S. Genetic transformation of Russian wheat varieties for the biotic and abiotic stress resistance // Abstracts of the 4th International Crop Science Congress. - Brisbane, Australia, 2004. -P.290.

8. Мирошниченко ДЛ., Филиппов M.B., Берниковская Д.И., Чернобровкина М.А., Харченко П.А., Долгов С.В. Генетическая инженерия в повышении устойчивости зерновых культур к биотическим и абиотическим стрессам: от пробирки до поля // ГП Московский международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва, 2005. - Т.1. -С.57.

Отпечатано: ИПА. А. Кулаков, г. Серпухов, Борисовское шоссе, 18, тел.: 8-915-200-86-98 Подписано в печать: 28.03.2007г. Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Филиппов, Михаил Викторович

Введение

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. История культуры.

1.2. Культура ткани пшеницы in vitro.

1.2.1. Использование культуры ткани пшеницы в традиционной селекции.

1.2.2. Регенерация растений пшеницы из соматических тканей.

1.3. Методы генетической трансформации пшеницы.

1.3.1. Баллистический метод переноса генов.

1.3.2. Агробактериальный метод переноса генов.

1.3.3. Другие методы переноса генов.

1.3.4. Особенности векторных конструкций, используемых для трансформации однодольных культур.

1.4. Основные генно-инженерные направления по улучшению сортов пшеницы.

1.4.1. Придание устойчивости к грибным заболеваниям.

1.4.2. Придание устойчивости к вирусным заболеваниям.

1.4.3. Придание устойчивости к вредителям.

1.4.4. Придание устойчивости к гербицидам.

1.4.5. Придание устойчивости к засухе.

1.4.6. Улучшение качества зерна.

1.5. Проблема наследования гетерологичных генов.

1.5.1. Транскрипционная инактивация генов.

1.5.2. Посттранскрипционная инактивация генов.

1.5.3. Пути решения проблем, связанных с нестабильным наследованием переносимых генов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка эффективной системы генетической трансформации мягкой пшеницы"

Пшеница является одной из важнейших сельскохозяйственных культур в мире и представляет собой основной продукт питания в 43 странах мира.

Как пищевой продукт пшеница, подобно другим хлебным злакам, обладает многими природными преимуществами. Она питательна, калорийна, ее легко хранить, транспортировать и перерабатывать в высокоочищенное сырье. Среди большого разнообразия подвидов пшеницы (22 подвида), наибольшее распространение получили только два, а именно: пшеница мягкая (Triticum aestivum L.), площади посева которой составляют 95% от всей площади занятой пшеницей, и пшеница твердая {Т. durum), занимающая менее 5% площади (Patnaik и Khurana, 2001). Пшеница мягкая является основным ингредиентом при производстве различных видов хлеба, булочек, печенья, бисквитов и многих других продуктов питания. Твердая пшеница идет на производство высококачественных макаронных изделий. Зародыши, отруби и солод являются дополнительными формами пшеничных продуктов.

Помимо значительного пищевого значения, пшеница является важной кормовой культурой, особенно в птицеводстве, благодаря высокому содержанию белка (Табл. 1). Пшеничная солома используется в животноводстве в качестве компонента грубого корма, а также применяется в качестве подстилки.

Промышленное использование зерна пшеницы включает получение крахмала для изготовления клейстера, спирта, масла и клейковины. Солома может быть использована для получения газетной бумаги, картона, упаковочного материала и предметов искусства.

Таким образом, использование пшеницы чрезвычайно широко и разнообразно и перечислить все виды ее использования просто невозможно.

Таблица 1. Примерный химический состав пшеницы и трех продуктов ее помола, %*

Компонент Пшеница Мука, извлечение

Цельное зерно Только зародыш 72% 80%

Сырой белок 13,3 26,6 11,8 12,0

Жир 2,0 10,9 1,2 1,3

Минеральные вещества 1,7 4,3 0,46 0,65

Клетчатка 2,3 2,5 0,40 0,50

Др. углеводы 68,7 44,2 74,1 73,6

Вода 12,0 11,5 12,0 12,0

-ШОА, 1965г.

На земном шаре пшеницу ежегодно убирают примерно с 230 млн. га. При этом сбор зерна составляет свыше 500 млн. т. Благодаря достижениям науки и техники среднемировая урожайность пшеницы неуклонно растет из года в год. Однако скорость роста урожайности пшеницы и других продовольственных культур гораздо меньше скорости роста населения земли. По данным Б АО к 2030 году ожидается увеличение населения планеты до 8 миллиардов. В связи с этим уже в первой половине 21-го века человечество столкнется с рядом новых трудностей, для решения которых потребуются принципиально новые подходы. Основная проблема, ожидающая человечество в ближайшие десятилетия - продовольственная. Эффективность современного с/х производства не позволит удовлетворить постоянно растущие потребности человечества. Увеличение валового сбора с/х продукции, ранее достигавшееся за счет роста посевных площадей, на сегодняшний день невозможно из-за ограниченности площадей пахотных земель, а также вследствие активной деградации уже используемых земель. Поэтому для решения продовольственной проблемы необходимо в первую очередь повышение урожайности основных продовольственных культур, в числе которых - пшеница.

Пшеница относится к высокоурожайным культурам. Современные сорта пшеницы способны давать более ста центнеров с одного гектара при соблюдении всех необходимых агротехнических приемов. Так в США в 1964 году сорт озимой мягкой пшеницы Гейне при орошении дал 142 ц/га. Однако средняя урожайность пшеницы в мире не превышает 23 ц/га, что объясняется сильной подверженностью пшеницы различным неблагоприятным факторам биотического и абиотического происхождения. Из абиотических факторов следует выделить недостаток влаги и засоленность почв, а из биотических -наибольший урон причиняют грибные болезни и вредители.

Усилиями традиционной селекции получают сорта пшеницы с относительно высокой устойчивостью к тем или иным неблагоприятным факторам, однако в целом проблема повышения урожайности пшеницы и ее устойчивости, стоит по-прежнему остро. Некоторые проблемы решить с помощью классической селекции невозможно или очень сложно. Так на создание сорта пшеницы, используя обычные селекционные приемы, затрачивается 6-8 лет, что при быстрой смене расового состава возбудителей болезней резко снижает эффективность. В то же время, с помощью генно-инженерных методов можно придать растению устойчивость к целому ряду штаммов грибных патогенов, тем самым, повысив урожайность и долговечность уже существующих сортов. Поэтому, особые надежды возлагаются на генную инженерию, которая, по сути, продолжает направление традиционной селекции по улучшению генотипов полезных растений, но достигает тех же целей более эффективным и быстрым путем. Однако главным преимуществом генной инженерии растений является возможность привносить признаки, которые невозможно перенести с помощью обычной селекции.

В настоящее время получены различные трансгенные формы пшеницы с новыми хозяйственно-ценными признаками, однако в большинстве работ по переносу целевых генов в качестве объекта трансформации был использован американский модельный сорт ВоЬ\УЪке, утративший практическое значение. Лишь в некоторых исследованиях были получены трансгенные растения ограниченного числа коммерческих сортов пшеницы зарубежной селекции. Поскольку эффективность трансформации пшеницы в значительной степени определяется генотипом, необходима разработка эффективной генотип-независимой системы трансформации отечественных сортов пшеницы.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Филиппов, Михаил Викторович

ВЫВОДЫ

1. Разработана эффективная система трансформации отечественных сортов пшеницы.

2. Подобраны оптимальные условия регенерации растений нескольких сортов пшеницы из незрелых зародышей.

3. Разработана система двойной селекции трансгенных тканей, позволяющая значительно снизить долю нетрансгенных побегов среди первичных регенерантов.

4. Проанализирован характер расщепления репортерных генов gfp и gus в поколении Т) 28-ми независимых трансгенных линий и в поколении

13-ти линий сортов Андрос и Норис, и установлено, что характер наследования большинства линий соответствует однолокусной генетической модели наследования признаков.

5. Получены трансгенные растения пшеницы сортов Андрос и Норис и проведена их оценка в полевых условиях, показавшая высокую устойчивость анализируемых линий к действию гербицида «Баста».

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Филиппов, Михаил Викторович, Пущино

1. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений и биотехнологии на их основе. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999 - С. 84-85

2. Гуляев Г.В. Генетика. М.: «Колос», 1977. - С. 266-275

3. Пирузян Э.С., Андрианов В.М. Плазмиды агробактерий и генетическая инженерия. М.: Наука, 1985. - С. 79-96.

4. Ainsley P.J., Aryan A.P. Efficient plant regeneration system for immature embryos of triticale (x Triticosecale Wittmack) // Plant Growth Regulators 1998. - V.24. - P.23-30.

5. Altpeter F., Diaz I., McAuslane H., Gaddour K., Carbonero P., Vasil I.K. Increased insect resistance in transgenic wheat stably expressing trypsin inhibitor Сте II Molecular Breeding 1999. - V.5. - P.53-63.

6. Altpeter F., Vasil V., Srivastava V., Vasil I.K. Integration and expression of the high-molecular-weight glutenin subunit lAxl gene into wheat // Nature Biotechnol 1996. - V.14. - P.l 155 -1159.

7. Altpeter F., Vasil V., Srivastava V., Stöger E., Vasil I.K. Accelerated production of transgenic wheat (Triticum aestivum L.) plants // Plant Cell Reports 1996. -V.16. -P.12-17.

8. Alvarez M.L., Guelman S., Haiford N.G., Lustig S., Reggiardo M.I., Ryabushkina N., Shewry P., Stein J., Vallejos R.H. Silencing of HMW glutenins in transgenic wheat expressing extra HMW subunits // Theor Appl Genet 2000. - V.100. -P.319-327.

9. Barro F., Cannell M.E., Lazzeri P.A., Barcelo P. The influence of auxins on transformation of wheat and tritordeum and analysis of transgene integration patterns in transformants // Theor Appl Genet 1998. - V.97. - P.684-695.

10. Benkirane H., Sabounji K., Chlyah A., Chlyah H. Somatic embryogenesis and plant regeneration from fragments of immature inflorescences and coleoptiles of durum wheat // Plant Cell, Tissue and Organ Culture 2000. - V.61. - P. 107-113.

11. Bennett M.D., Leitch I.J. Nuclear DNA amounts in Angiosperms // Ann. Bot. -1995 V.76. - P. 113-176.

12. Bieri S., Potrykus I., Fiitterer J. Expression of active barley seed ribosome-inactivating protein in transgenic wheat // Theor Appl Genet 2000. - V.100. -P.755-763.

13. Borrelli G.M., Lupotto E., Locatelli F., Wittmer G. Long-term optimized embryogenic cultures in durum wheat (Triticum durum Desf.) // Plant cell reports 1991. - V. 10. - N.6-7. - P.296-299.

14. Bourdon V., Harvey A., Lonsdale D.M. Introns and their positions affect the translational activity of mRNA in plant cells // EMBO Rep. 2001. - V.2. - N.5. -P. 394-398.

15. Brinch-Pedersen H., Olesen A., Rasmussen S.K., Holm P.B. Generation of transgenic wheat (Triticum aestivum L.) for constitutive accumulation of an Aspergillus phytase // Molecular Breeding 2000. - V.6. - P. 195-206.

16. Brisibe E.A., Gajdosova A., Olesen A., Andersen S.B. Cytodifferentiation and transformation of embryogenic callus lines derived from anther culture of wheat // J Exp Bot. 2000. - V.51. - N.343. - P. 187-96.

17. Brown C., Brooks F. J., Pearson D., Mathias R.J. Control of embryogenesis and organogenesis in immature wheat embryo callus using increased medium osmolarity and abscisic acid // Journal of Plant Physiology 1989. - V.133. -P.727-733.

18. Callis J., Fromm M., Walbot V. Introns increase gene expression in cultured maize cells // Genes Dev. 1987. - V.l. - P. 1183-1200.

19. Campbell B.T., Baenziger P.S., Mitra A., Sato S., Clemente T. Inheritance of multiple transgenes in wheat // Crop Science 2000. - V.40. - P. 1133-1141.

20. Cannell M.E., Doherty A., Lazzeri P.A., Barcelo P. A population of wheat and tritordeum transformants showing a high degree of marker gene stability and heritability // Theor. Appl. Genet. 1999. - V.99. - P.772-784.

21. Carman J., Jefferson N., Campbell W. Induction of embryogenic Triticum aestivum L. calli. II Quantification of organic addenda and other culture variable effects I I Plant Cell, Tissue and Organ Culture 1989. - V.12. - P.97-110.

22. Caswell K. L., Leung N. L., Chibbar R. N. An efficient method for in vitro regeneration from immature inflorescence explants of Canadian wheat cultivars // Plant Cell, Tissue and Organ Culture 2000. - V.60. - P.69-73.

23. Chan M., Cheng H., Ho S., Tong W., Xu S. Agrobacterium-mediated production of transgenic rice plants expressing a chimeric a-amylase promoter/ /?-glucuronidase gene // Plant Molecular Biology -1993. V.22. - P.491-506.

24. Chareonpornwattana S., Thara K.V., Wang L., Datta S.K., Panbangred W., Muthukrishnan S. Inheritance, expression, and silencing of a chitinase transgene in rice // Theor Appl Genet 1999. - V.98. - P.371-378.

25. Chen D.F., Dale P.J. A comparison of methods for delivering DNA to wheat: the application of wheat dwarf virus DNA to seeds with exposed apical meristems // Transgenic Research 1992. - V.l. - P.93-100.

26. Cheng M., Fry J.E., Pang S., Zhou H., Hironaka C.M., Duncan D.R., Conner T.W., Wan Y. Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens II Plant. Physiol. 1997. - V.l 15. - P.971-980.

27. Chibbar R.N., Kartha K.K., Leung N., Qureshi J., Caswell K. Transient expression of marker genes in immature zygotic embryos of spring wheat (Triticum aestivum L.) through microprojectile bombardment // Genome 1991. - V.34. - P.453-460.

28. Chiu W.L., Niwa Y., Zeng W., Hirano T., Kobayashi H., Sheen J. Engineered GFP as a vital reporter in plants // Curr. Biol. 1996. - V.6. - P.325-330.

29. Christensen A.H., Quail P.H. Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants // Transgenic Res 1996. - V.5. - P.213-218.

30. Christou P. Strategies for variety-independent genetic transformation of important cereals, legumes and woody species utilizing particle bombardment // Euphytica -1995.-V.85.-P. 13-27.

31. Christou P., McCabe D.E., Swain W.F. Stable transformation of soybean callus by DNA coated particles // Plant Physiol. 1988. - V.87. - P.671-674.

32. Chu C.C., Wang C.C., Sun C.S., Hsu C., Yin K.C., Chu C.Y. Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen sources // Scientia Sinica 1975. - V.l8. - P.659-668.

33. Chugh A., Khurana P. Regeneration via somatic embryogenesis from leaf basal segments and genetic transformation of bread and emmer wheat by particle bombardment // Plant Cell, Tissue and Organ Culture 2003. - V.74. - P.151-161.

34. Close K.R, Ludeman L.A. The effect of auxin-like plant growth regulators and osmotic regulation on induction of somatic embryogenesis from elite maize inbreds // Plant Sci. 1987. - V.52. - P.81-89.

35. De Block M., Debrouwer D., Moens T. The development of a nuclear male sterility system in wheat. Expression of the barnasegene under the control of tapetum specific promoters // Theor Appl Genet 1997. - V.95. - P. 125-131.

36. Delporte F., Mostade 0., Jacquemin J.M. Plant regeneration through callus initiation from thin mature embryo fragments of wheat // Plant Cell Tiss. Org. Cult. 2001. - V.67. - P.73-80.

37. Demeke T., Hucl P., Baga M., Caswell K., Leung N., Chibbar R.N. Transgene inheritance and silencing in hexaploid spring wheat // Theor. Appl. Genet. 1999. - V.99.-P.947-953.

38. Dixon R.A., Harrison M. Activation, structure and organization of genes involved in microbial defence in plants // Adv Genet 1990. - V.28. - P. 165-234.

39. Donath M., Mendel R., Cerff R., Martin W. Intron-dependent transient expression of the maize GapAl gene // Plant Mol Biol. 1995. -V.28. - P.667-676.

40. Dunstan D.I., Short K.C., Thomas E. The anatomy of secondary morphogenesis in cultured scutellum tissue of Sorghum bicolor II Protoplasma 1978. - V.97. -P.251-260.

41. Elliot A.R., Campbell J.A., Brettell I.S., Grof P.L. Agrobacterium-mQdiated transformation of sugarcane using GFP as a screenable marker // Aust. J. Plant. Physiol. 1998. - V.25. - P.739-743.

42. Fennel S., Bohoroba N., Crossa J., Hoisington D., Van-Ginkel M. Plant regeneration from immature embryos of 48 elite CIMMYT bread wheats // Theor Appl Genet 1996. - V.92. - P. 163-169.

43. Fernandez S., Michaux-Ferrier N., Coumans M. The embryogenic response of immature embryo cultures of durum wheat (Triticum durum Desf.): histology and improvement by AgN03 // Plant Growth Regulation 1999. - V.28. - P. 147-155.

44. Finer J.J., Vain P., Jones M.W., McMullen M.D. Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells // Plant Cell Reports 1992. — V. 11. — P.232-238.

45. Fire A., Xu S., Montgomery M., Kostas S., Driver S. et al. Potent and specifi c genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans I I Nature 1998. — V.391. — P.806—811.

46. Folling L., Olesen A. Transformation of wheat (Triticum aestivum L.) microspore-derived callus and microspores by particle bombardment // Plant Cell Rep 2001. -V.20.-P.629-636.

47. Fu X., Kohli A., Twyman R.M., Christou P. Alternative silencing effects involve distinct types of non-spreading cytosine methylation at a three-gene, single-copy transgenic locus in rice // Mol Gen Genet 2000. - V.263. - P. 106-118. O Springer-Verlag.

48. Fueng C., Mumma R.O., Hamilton R.H. Metabolism of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid. VI. Biological properties of amino acid conjugates // J. Agr. Food Chem. 1974. - V.22. - P.307-309.

49. Galiba G., Erdei L. Dependence of wheat callus growth, differentiation and mineral content on carbohydrate supply // Plant Sci. 1986. - V.45. - P.65-70.

50. Ghorbel R., Juarez J., Navarro L., Pena L. Green fluorescent protein as a screenable marker to increase the efficiency of generating transgenic woody fruit plants // Theor. Appl. Genet. 1999. - V.99. - P.350-358.

51. Haccius B. Question of unicellular origin of nonzigotic embryos in callus culture // Phytomorphology 1978. - V.28. - P.74-81.

52. Hadi M. Z., McMullen M.D., Finner J.J. Transformation of 12 different plasmids into soybean via particle bombardment // Plant Cell Reports 1996. - V.15. -P.500-503.

53. Hammond J.,McGarvey P., Yusibov V. Plant biotechnology: new products and applications Eds., New York, Springer, pp. 95-115 (2000)

54. Harper B.K., Mabon S.A., Leffel S.M., Halfhill M.D., Richards H.A., Moyer

55. K.A., Stewart C.N. Jr. Green fluorescent protein as a marker for expression of a second gene in transgenic plants // Nat. Biotechnol. 1999. - V.17. - P.1125-1129.

56. Hart J.H. Role of phytostilbenes in decay and disease resistance // Annu Rev Phytopathol 1981. - V.19. - P.437-458.

57. Haseloff J., Amos B. GFP in plants // Trends Genet. -1995 V.l 1. -P.328-329.

58. He D.G., Yang Y.M., Scott K.J. A comparison of scutellum callus and epiblast callus induction in wheat: the effect of genotype, embryo age and medium // Plant Sci. 1988. - V.57. - P.225-233.

59. He D.G., Mouradev A., Yang Y.M., Mouradeva E., Scott K.J. Transformation of wheat (Triticum aestivum L.) through electroporation of protoplasts // Plant Cell Reports 1994. - V. 14. - P. 192-196.

60. He G.Y., Lazzeri P.A. Analysis and optimization of DNA delivery into wheat scutellum and tritordeum inflorescence explants by tissue elctroporation // Plant Cell Reports 1998. - V. 18. - P.64-70.

61. Hiei Y., Ohta S., Komari T., Kumashiro T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA // Plant Journal 1994. - V.6. - P.271-282.

62. Hu W., Cheng C-L. Expression of Aequorea green fluorescent protein in plant cells // FEBS Lett 1995. - V.369. - P.331-334.

63. Hu C.-Y., Chee P.P., Chesney R.H. et al. Intrinsic GUS-like activities in seed plants // Plant Cell Rep. 1990. - V.9. - P. 1-5.

64. Jones L., Ratcliff F., Baulcombe D.C. RNA-directed transcriptional gene silencing in plants can be inherited independently of the RNA trigger and requires Metl for maintenance // Curr. Biol. 2001. - V. 11. - P. 1-20.

65. Jordan M.C. Green fluorescent protein as a visual marker for wheat transformation // Plant Cell Reports 2000. - V.19. - P. 1069-1075.

66. Kass S.U., Pruss D., Wolffe A.P. How does DNA methylation repress transcription? // Trends Genet 1997. - V.13. - P.444-449.

67. Kavi Kishor P.B., Reddy G.M. Retention and revival of regenerating ability by osmotic adjustment in long-term cultures of four varieties of rice // Plant Physiol. -1986.-V.126.-P.49-54.

68. Khanna H.K., Daggard G.E. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of wheat using a superbinary vector and a polyamine-supplemented regeneration medium // Plant Cell Rep 2003. -V.21. - P.429-436.

69. Khurana P., Sehgal A., Chugh A. Transgene interactions in transgenics // In: Srivastava, P.S., ed. Plant Tissue Culture and Molecular Biology-Applications and Prospects. Narosa Publishing House, New Delhi, India. 1998 - P.728-750.

70. Klein T.M., Jones T.J. Methods of genetic transformation: the gene gun // In: Vasil IK (ed) Molecular Improvement of Cereal Crop 1999. - P.21-42. Kluwer Academic, London

71. Klein T.M., Harper E.C., Svab Z., Sanford J.C., Fromm M.E., Maliga P. Stable genetic transformation of intact Nicotiana cell by the particle bombardment process // Proc Natl Acad Sci USA 1988. - V.85. - P.8502-8505.

72. Klein T.M., Wolf E.D., Wu R., Sanford J.C. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells // Nature 1987. - V.327. - P.70-73.

73. Kloti A., Iglesias V.A., Wijnn J., Burkhardt P.K., Datta S.K., Potrykus I. Gene transfer by electroporation into intact scutellum cells of wheat embryos // Plant Cell Reports 1993. - V.12. - P.671-675.

74. Koltin Y. Viruses of fungi and simple eukariotes // Mycology Series 1988. -V.7. - (eds Koltin Y., and Leibowitz M J.) P.209-242 (Marsel Dekker, New York, NY, 1988).

75. Korber-Grohne U. (1988) Nutzpflanzen in Deutschland Kulturgeschichte und Biologie. Theiss Verlag, Stuttgart, Germany.

76. Koziel M.G., Carozzi N.B., Desai N. Optimizing expression of transgenes with an emphasis on post-transcriptional events // Plant Mol. Biol. 1996. - V.32. -P.393-405.

77. Krysiak C., Mazu's B., Buchowicz J. Generation of DNA double-strand breaks and inhibition of somatic embryogenesis by tungsten microparticles in wheat // Plant Cell, Tissue and Organ Culture 1999. - V.58. - P.163-170.

78. Kumpatla S.P., Teng W., Bucholz W.G., Hall T.C. Epigenetic transcriptional silencing and 5-azacytidine mediated reactivation of a complex transgene in rice // Plant Physiol. -1997. V.l 15. - P.361-373.

79. Leckband G., Lorz H. Transformation and expression of a stilbene synthase gene of Vitis vinifera L. in barley and wheat for increased fungal resistance // Theoretical and Applied Genetics 1998. - V.96. - P.1004-1012.

80. Lee B., Murdoch K., Topping J., Kreis M., Jones M.G.K. Transient gene expression in aleurone protoplasts isolated from developing caryopses of barley and wheat // Plant Molecular Biology 1989. - V.13. - P.21-29.

81. Leffel S.M., Mabon S.A., Stewart C.N Jr. Applications of green fluorescent protein in plants // Biotechniques -1997. V.23. - P.912-918.

82. Li Z., Upadhyaya N.M., Meena S., Gibbs A J., Waterhouse P.M. Comparison of promoters and selectable marker genes for use in Indica rice transformation // Molecular Breeding 1997. - V.3. - P. 1-14.

83. Limanton-Grevet A., Jullien M. Agrobacterium-mQdmtQd transformation of Asparagus officinalis L.: molecular and genetic analysis of transgenic plants // Mol. Breed. 2001. - V.7. - P. 141-150.

84. Linacero R., Lopez-Bilbao M.G., Romero C., Laurie D.A., Vazquez A.M. Genotypic differences in polyembryo formation and somatic embryogenesis increment in wheat (Triticum aestivum L.), following 2,4-D treatment // Euphytica 1996. - V.89. - P.345-348.

85. Liu H.S., Jan M.S., Chou C.K., Chen P.H., Ke H.J. Is green fluorescent protein toxic to the living cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. - V.260. -P.712-717.

86. Loeb T.A., Reynolds T.L. Transient expression of the uidA gene in pollen embryoids of wheat following microprojectile bombardment // Plant Science -1994. V.104. -P.81-91.

87. Lonsdale D.M., Lindup S., Moisan J., Harvey A. Using firefly luciferase to identify the transition from transient to stable expression in bombarded wheat scutellar tissue // Physiologia Plantarum 1998. - V.102. - P.447-453.

88. Lorz H., Becker D., Liitticke S. Molecular wheat breeding by direct gene transfer // Euphytica 1998. - V.100. - P.219-223.

89. Lorz H., Backer B., and Schell J. Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation // Molecular and General Genetics 1985. - V.199. -P. 178-192.

90. Luhrs R., Lorz H. Plant regeneration in vitro from embryogenic cultures of spring- and winter-type barley {Hordeum vulgare L.) // Theor Appl Genet 1987. - V.82. - P.74-80.

91. Mahalakshmi A., Chugh A., Khurana P. Exogenous DNA uptake via cellular perneabilization and expression of foreign gene in wheat zygotic embryos // Plant Biotechnogy 2000. - V.17. - P.235-240.

92. Mahalakshmi A., Maheshwari S.C., Khurana P. High frequency divisions in leaf base protoplasts of wheat (Triticum aestivum L.) // Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology 1993. - V.2. - P.61-65.

93. Mathias R.T., Boyd L.A. Cefotaxime stimulates callus growth embryogenesis and regeneration in hexaploid bread wheat (Triticum aestivum L) // Plant Sci -1986. V.46. - P.217-223.

94. Matzke M.A., Matzke A.J.M., Eggleston W.B. Paramutation and transgene silensing: a common response to invasive DNA // Trends Plant Sci 1996. - V.l. -P.382-388.

95. Matzke M.A., Matzke A.J.M. How and why do plants inactivate homologous (trans)genes? // Plant Physiol. 1995. - V.107. - P.679-685.

96. McElroy D., Zhang W., Ca J., Wu R. Isolation of and efficient Actin promoter for use in rice transformation // Plant Cell 1990. - V.2. - P. 163-171.

97. Mentewab A., Letellier V., Marque C., Sarrafi A. Use of anthocyanin biosynthesis stimulatory genes as marker for the genetic transformation of haploid embryos and isolated microspores in wheat // Cereal Res Commun 1999. -V.27. -P.l-2.

98. Meyer P. Variation of transgene expression in plants // Euphytica 1995. -V.85. -P.359-366.

99. Mlynarova L., Keizer L.C.P., Stiekema W.J., Nap J.P. Approaching the lower limits of transgene variability // Plant Cell 1996. - V.8. - P.1589-1599.

100. Mohanty A., Sarma N.P., Tyagi A.K. Agrobacterium-mQdiatQd high frequency transformation of an elite indica rice varity Pusa Basmati 1 and transmission of the transgenes to R2 progeny // Plant Sci. 1999. - V.147. - P.127-137.

101. Molinier J., Himber C., Hahne G. Use of green fluorescent protein for detection of transformed shoots and homozygous offspring // Plant Cell Rep 2000. - V.19. -P.219-223.

102. Mooney P.A., Goodwin P.B. Adherence of Agrobacterium tumefaciens to the cells of immature wheat embryos // Plant Cell Tissue Organ Culture 1991. -V.25.-P.199-208.

103. Moore T.C. Biochemistry and physiology of plant hormones // Springer, Berlin Heidelberg New York, 1989.- P.330.

104. Muller E., Lorz H., Liitticke S. Variability of transgene expression in clonal cell lines of wheat // Plant Sci. 1996. - V.l 14. - P.71-82.

105. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant 1962. - V.15. - P.473-497.

106. Murray F., Brettell R., Matthews P., Bishop D., Jacobsen J. Comparison of Agrobacterium-mediatQd transformation of four barley cultivars using the GFP and GUS reporter genes // Plant Cell Rep 2004. - V.22. - P.397-402.

107. Nehlin L., Möller C., Bergman P., Glimelius K. Transient ß-gus and gfp gene expression and viability analysis of microprojectile bombarded microspores of Brassica napus L. I IJ Plant Physiol 2000. - V. 156. - P. 175-183.

108. Niedz R.P., Sussman M.R., Satterlee J.S. Green fluorescent protein: an in vivo reporter of plant gene expression // Plant Cell Reports 1995. - V.14. - P.403-406.

109. Nissen P. Stimulation of somatic embryogemesis by ethylene: Effects of modulators of ethylene biosynthesis and action // Physiol Plant 1994. - V.92. -P.397-403.

110. Oard J.H., Paige D., Dvorak J. Chimeric gene expression using maize intron in cultured cells of bread wheat // Plant Cell Reports 1989. - V.8. - P.156-160.

111. O'Kennedy M.M., Burger J.T., Botha F.C. Pearl millet transformation system using the positive selectable marker gene phosphomannose isomerase // Plant Cell Rep 2004. - V.22. - P.684-690.

112. Orshinsky B.R., Sadasivaiah R.S. Effect of plant growth conditions, plating density, and genotype on the anther culture response of soft white spring wheat hybrids // Plant Cell Reports 1997. - V.16. - P.758-762.

113. Ozias-Akins P., Vasil I.K. Plant regeneration from cultured embryos and inflorescence of Triticum aestivum (wheat): Evidence for somatic embryogenesis // Protoplasma 1982. - V.l 10. - P.95-105.

114. Palauqui J., Elmayan T., Pollien J., Vaucheret H. Systemic acquired silencing: Transgene specific post-transcriptional silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to non-silenced scions // EMBO J -1997. V.16. - P.4738-4745.

115. Papenfus J.M., Carman J.G. Enhanced regeneration from wheat callus cultures using dicamba and kinetin // Crop Sci. 1987. - V.27. - P.588-593.

116. Pastori G.M., Wilkinson M.D., Steele S.H., Sparks C.A., Jones H.D., Parry M.A.J. Age-dependent transformation frequency in elite wheat varieties // J. of Experimental Botany 2001. -V.52. -N.357. - P.857-863.

117. Patnaik D., Khurana P. Wheat biotechnology: A minireview // Electronic J of Biotechnology 2001. - V.4. - N.2. - P. 1-29.

118. Pawlowski W.P., Somers D.A. Transgene inheritance in plants genetically engineered by microprojectile bombardment // Mol. Biotechnol. 1996. - V.6. -P.17-30.

119. Pawlowski W.P., Torbert K.A., Rines H.W., Somers D.A. Irregular patterns of transgene silencing in allohexaploid oat // Plant Mol Biol 1998. - V.38. -P.597-607.

120. Punja Z.K. Genetic engineering of plants to enhance resistance to fungal pathogens-a review of progress and future prospects // Can. J. Plant Pathol. -2001. V.23. -P.216-235.

121. Rasco-Gaunt S., Riley A., Barcelo P., Lazzeri P.A. Analysis of particle bombardment parameters to optimise DNA delivery into wheat tissues // Plant Cell Reports 1999a. - V.19. - P. 118-127.

122. Razin A. CpG methylation, chromatin structure and gene silencing- the three way interaction // EMBO Journal 1998. - V.7. - P.4905-4908.

123. Redway F.A., Vasil V., Lu D., Vasil I.K. Identification of callus types for long-term maintenance and regeneration from commercial cultivars of wheat (Triticum aestivum L.) // Theor. Appl. Genet. 1990. - V.79. - P.609-617.

124. Rethmeier N., Seurinck J., Van Montagu M., Cornelissen M. Intron-mediated enhancement of transgene expression in maize is a nuclear, gene-dependent process // Plant J. 1997. - V.12. - P.895-899.

125. Rhodes C., Pierce D., Mettler I., et.al. Genetically transformed maize plants from protoplasts // Sci. 1988. - V.240. - P.204-207.

126. Rogers S., Bendich A. Extraction of total cellular DNA from plants, algae and fungi // Gelvin S., Schiperoort R. Plant Molecular Biology Manual. A Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, Boston, London. - 1995. - Section 7-1.

127. Rooke L., Bekes F., Fido R., Barro F., Gras P., Tatham A. S., Barcelo P., Lazzeri P., Shewry P. R. Overexpression of a gluten protein in pransgenic wheat results in greatly increased dough strength // Journal of Cereal Science 1999. -V.30.-P.115-120.

128. Rose A.B., Beliakoff J.A. Intron-mediated enhancement of gene expression independent of unique intron sequences and splicing // Plant Physiology. 2000. -V.122. -P.535-542.

129. Russell D.A., Fromm M.E. Tissue-specific expression in transgenic maize of four endosperm promoters from maize and rice // Transgenic Res 1997. - V.6. -P.157-168.

130. Russell J.A., Roy M.K., Sanford J.C. Physical trauma and tungsten toxicity reduce the efficiency of biolistic transformation // Plant Physiol. 1992. - V.98. -P.1050—1056.

131. Sanford J.C. The biolistic process // Trends Biotechnol. 1988. - V.6. - P.299-302.

132. Schoffl F., Schroder G., Kliem M., Rieping M. An SAR sequence containing 395 bp DNA fragment mediates enhanced, gene-dosage-correlated expression of a chimaeric heat shock gene in transgenic tobacco plants // Transgenic Res 1993.- V.2. -P.93-100.

133. Scott A., Woodfield D., White D.W.R. Allelic composition and genetic background effects on transgene expression and inheritance in white clover // Mol Breed 1998. - V.4. - P.479^90.

134. Sears R.G., Deckard E.L. Tissue culture variability in wheat: callus induction and plant regeneration // Crop Sci 1982. - V.22. - P.546-550.

135. Sela-Buurlage M.B.B., Ponstein A.S., Bres-Vloemans S.A., Melchers L.S., van den Elzen P.J.M., Cornelissen B.J.C. Only specific tobacco (Nico tabacum) chitinases and b-l,3-glucanases exhibit antifungal activity // Plant Physiol 1993.- V.101.-P.857-863.

136. Sheen J., Hwang S.B., Niwa Y., Kobayashi H., Galbraith D.W. Green fluorescent protein as a new vital marker in plant cells // Plant J 1995. - V.8. -P.777-784.

137. Shewry P.R., Lazzery P. Molecular approaches to wheat quality improvement // Chemistry and Industry 1997. - V.21. - P.559-562.

138. Shirsat A.H., Wilford N., Cray R.R.D. Gene copy number and levels of expression in transgenic plants of a seed-specific gene // Plant Sei 1989. - V.61.- P.75-80.

139. Simpson G.G., Filipowicz W. Splicing of precursors to mRNA in higher plants: mechanism, regulation and subnuclear organization of the spliceosomal machinery // Plant Mol. Biol. 1996. - V.32. - P.l^l.

140. Sitte P., Ziegler H., Ehrendorfer F., Bresinsky A. Lehrbuch der Botanik für Hochschulen // Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, Jena, New York, 33. Auflage, -1991. -P.514-115.

141. Sivamani E., Brey Ch.W., Talbert L.E., Young M.A., Dyer W.E., Kaniewski W.K., Qu R. Resistance to wheat streak mosaic virus in transgenic wheat engineered with the viral coat protein gene // Transgenic Research 2002. - V.l 1. -P.31-41.

142. Sivamani E., Brey Ch.W., Talbert L.E., Dyer W.E., Qu R. Resistance to wheat streak mosaic virus in transgenic wheat expressing the viral replicase (Nib) gene // Molecular Breeding 2000. - V.6. - P.469-477.

143. Smith H.A., Swaney S.L., Parks T.D., Wernsmann E.A., Dougherty W.G. Transgenic plant virus resistance mediated by un- translatable sense RNAs: expression, regulation, and fate of nonessential RNAs // Plant Cell 1994. - V.6.1. P.1441—1453.

144. Sorokin A.P., Ke X.Y., Chen D.F., Elliott M.C. Production of fertile transgenic wheat plants via tissue electroporation // Plant Science 2000. - V.l56. - P.227-233.

145. Srivastava V., Anderson O.D., Ow D.W. Singlecopy transgenic wheat generated through the resolution of complex integration patterns // Proceedings in National Academy of Science of the United States of America 1999. - V.96. — P.lll 17— 11121.

146. Srivastava V., Vasil V., Vasil I.K. Molecular characterization of the fate of transgenes in transformed wheat (Triticum aestivum L.) // Theor. Appl. Genet.1996.-V.92.-P.1031-1037.

147. Stark-Lorenzen P., Nelke B., Ha" nler G., Mu" hlbach H.P., Thomzik J.E. Transfer of a stilbene synthase gene to rice (Oryza sativa L.) // Plant Cell Rep1997. V.16. -P.668-673.

148. Stewart C.N Jr. The utility of green fluorescent protein in transgenic plants // Plant Cell Rep. 2001. - V.20. - P.376-382.

149. Stewart C.N. Jr. Monitoring transgenic plants using in vivo markers // Nat Biotechnol 1996. -V.14. - P.682 Cell Rep - V.14. - P.403^106.

150. Stoger E., Williams S., Keen D., Christou P. Molecular characteristics of transgenic wheat and the effect on transgene expression // Transgenic Research1998.- V.7. P.463-471.

151. Takano M., Egawa H., Ikeda J-E., Wakasa K. The structures of integration sites in transgenic rice // Plant J. 1997. - V. 11. - P.353-361.

152. Takumi S., Murai K., Mori N., Nakamura C. Trans-activation of a maize Ds transposable element in transgenic wheat plants expressing the Ac transposase gene // Theoretical and Applied Genetics 1999. - V.98. - P.947-953.

153. Takumi S., Shimada T. Variation in transformation frequencies among six common wheat cultivate through particle bombardment of scutellar tissues // Genes Genet Syst- 1997. V.72. - P.63-69.

154. Thomas M.R., Scott KJ. Plant regeneration by somatic embryogenesis from callus initiated from immature embryos and immature inflorescences of Hordeum vulgarQ //J. Plant Physiol. 1985. - V. 121. - P. 159-169.

155. Topfer R., Gronenborn B., Schell J., Steinbiss H.H. Uptake and transient expression of chimeric genes in seed-derived embryos // Plant Cell. 1989. - V.l. -N.1.-P.133-139.

156. Uze M., Potrykus I., Sautter C. Single-stranded DNA in the genetic transformation of wheat (Triticum aestivum L.): transformation frequency and integration pattern // Theor Appl Genet 1999. - V.99. - P .487-495.

157. Vain P., Flament P., Soudain P. Role of ethylene in embryogenic callus initiation and regeneration in Zea mays L. // J Plant Physiol 1989. - P.537-540. N?

158. Vasil I.K., Anderson O.D. Genetic engineering of wheat glutein // Journal? -1997. V.2. - N.8. - P.292-297.

159. Vasil V., Castillo A.M., Fromm M.E., Vasil I.K. Herbicide resistant fertile transgenic wheat plants obtained by microprojectile bombardment of regenerable embryogenic callus // Biotechnology 1992. - V.10. - P.667-674.

160. Vasil V., Brown S.M., Re D., Fromm M.E., Vasil I.K. Stably transformed callus lines from microprojectile bombardment of cell suspension cultures of wheat // Biotechnology 1991. - V.9. - P.743-747.

161. Vasil V., Srivastava V., Castillo A.M., Fromm M.E., Vasil, I.K. Rapid production of transgenic wheat plants by direct bombardment of cultured immature embryos // Biotechnology 1993. - V. 11. - P. 1553-1558.

162. Voinnet O. RNA silencing as a plant immune system against viruses // Trends in Genetics 2001 - V.l7. - N.8. - P.449-459.

163. Walters D.A., Vetsch C.S., Potts D.E., Lundquist R.C. Transformation and inheritance of a hygromycin phosphotransferase gene in maize plants // Plant Mol. Biol. 1992. - V.18. - P. 189-200.

164. Wang Y.C., Klein T.M., Fromm M., Cao J., Sanford J.C., Wu R. Transient expression of foreign genes in rice, wheat and soybean cells following particle bombardment // Plant Molecular Biology 1988. - V. 11. - P .433^139.

165. Watanabe Y., Ogawa T., Takahashi H., Ishida I., Takeuchi Y., Yamamoto M., Okada Y. Resistance against multiple viruses in plant mediated by a double stranded-RNA specific ribonuclease // FEBS Letters 1995. - V.372. - P. 165168.

166. Webb K.J., Morris P. Methodologies of plant transformation. In: Plant genetic manipulations for crop protection // Biotechnology in Agricultural series 1992 -N.7. - Gatehouse (Ed.). - CAB International-P.7-43.

167. Weeks J.T., Anderson O.D., BlechI A.E. Rapid production of multiple independent lines of fertile transgenic wheat (Triticum aestivum) II Plant Physiol -1993. V.102. -P.1077-1084.

168. Wernicke W., Brettel. R., Wakizuka T., Potrycus I. Adventitious embryoid and root formation from rice leaves // Z. Pfllazenphysiol. 1981. - V.103. - P.361-365.

169. Werr W., Lorz H. Transient gene expression in a Gramineae cell line // Molecular and General Genetics 1986. - V.202. - P.471^175.

170. Wheeller A.W. Changes in growth-substances contents during growth of wheat grains // Ann Appl Biol -1972. V.72. - P.327-334.

171. Wilmink A., Dons J. Selective agents and marker genes for use in transformation of monocotyledonous plants // Plant Mol Biol Rep 1993. - V.l 1. -P.165-185.

172. Witrzens B., Brettell R.I.S., Murray F.R., McElroy D., Li Z., Dennis E.S. Comparison of three selectable marker genes for transformation of wheat bymicroprojectile bombardment // Australian J. Plant Physiol. 1998. - V.25. -P.39—44.

173. Woolston C.J., Barker R., Gunn H., Boulton M.I., Mullineaux P.M. Agroinfection and nucleotide sequence of cloned wheat dwarf virus DNA // Plant Molecular Biology 1988. - V.l 1. - P.35-43.

174. Xu Y., Yu H., Hall T.C. Rice triosephosphate isomerase gene 59 sequence directs b-glucuronidase activity in transgenic tobacco but requires an intron for expression in rice // Plant Physiol. 1994. - V.106. - P.459-467.

175. Yang S.F., Hoffman N.E. Ethylene biosynthesis and its regulation in higher plants //Ann. Rev. Plant Physiol. 1984. -V.35. - P. 155-189.

176. Yu H., Kumar P. P. Post-transcriptional gene silencing in plants by RNA // Plant Cell Rep 2003. - V.22. - P. 167-174.

177. Zaghmout O.M.F. Transformation of protoplasts and intact cells from slowly growing embryogenic callus of wheat (Triticum aestivum L.) // Theoretical and Applied Genetics 1994. - V.89. - P.577-582.

178. Zeller F., Friebe B. Evolution und zuchtung des saatweizens (Triticum aestivum L.) // Biologie in unserer Zeit 1991. - V.5. - P.248-254.

179. Zhang L., French R., Langenberg W.G.,. Mitra A. Accumulation of barley stripe mosaic virus is significantly reduced in transgenic wheat plants expressing a bacterial ribonuclease // Transgenic Research 2001. - V. 10. - P. 13-19.

180. Zhang S-H., Lawton M.A., Hunter T., Lamb C.J. Atpkl, a novel ribosomal protein kinase gene from Arabidopsis: I. Isolation, characterization, and expression // J. Biol. Chem. 1994. - V.269. - P.17586-17592.

181. Zhou H., Stiff C.M., KonzakC.F. Stably transformed callus of wheat by electroporation- induced direct gene transfer // Plant Cell Reports 1993. - V.12. -P.612-616.

182. Zhu Z., Sun B., Liu C., Xiao G., Li X. Transformation of wheat protoplasts mediated by cationic liposome and regeneration of transgenic plantlets // Chinese Journal of Biotechnology 1993.-V.9.-P.257-261.