Разработка диагностических тест-систем при фасциолезе крупного рогатого скота на основе иммуноферментного анализа

Коробов, Артем Игоревич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка диагностических тест-систем при фасциолезе крупного рогатого скота на основе иммуноферментного анализа
ВАК РФ 03.02.11, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Разработка диагностических тест-систем при фасциолезе крупного рогатого скота на основе иммуноферментного анализа"

На правах рукописи

уочо ^ —

Коробов Артем Игоревич

РАЗРАБОТКА ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ ПРИ ФАСЦИОЛЕЗЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА НА ОСНОВЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

Специальность: 03.02.11 - паразитология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

1 3 НОЯ 2010

Москва-

2010

004613120

Работа выполнена на кафедре инфекционных и паразитарных болезней ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии»

Научный руководитель:

Гламаздин Игорь Геннадьевич

доктор ветеринарных наук

Официальные оппоненты:

Курочкина Карниз Гегамовна

доктор ветеринарных наук

Новак Михаил Дмитриевич

доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Вологодская государственная

молочно-хозяйственная академия имени Н.В. Верещагина»

Защита диссертации состоится «08» декабря 2010 года в 14.00 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д.006.011.01 при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии имени К.И. Скрябина» (ГНУ ВИГИС) Россельхозакадемии по адресу: 117218, г. Москва, ул. Большая Черемушкинская, 28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИГИС.

Автореферат разослан «08» ноября 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

Бережко Вера Кузьминична

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Фасциолез крупного рогатого скота - зооноз, который характеризуется течением болезни без проявления специфических симптомов с преимущественным поражением печени и желчевыводящих путей. Данный биогельминтоз широко распространен на территории РФ. Однако степень его распространения и поражения животных неоднозначна в различных природно-климатических зонах нашей страны (H.A. Яременко, И.Ф. Кленова, В.В. Горохов, Н.П. Сорокина, И.А. Молчанов, 2005). На основании научных публикаций (И.Ф. Кленова, H.A. Яременко, В.В. Горохов, У.Г. Тайчинов, А.Н. Воличев, B.C. Любавин, 2002; A.A. Атаев, 1990; М.М. Бочарова, 1996; Н.И. Кошеваров, 2006; В.В. Репетун, 2004) можно утверждать, что в отдельных регионах до 30 % и более поголовья скота заражены фасциолезом. В связи, с чем фасциолезная инвазия наносит значительный экономический ущерб скотоводству России, экономические потери при этом складываются из сокращения удоев молока, часто снижения его качества, уменьшения привесов и утилизации ценного пищевого продукта - печени. Актуальность разработки тест-системы для прижизненной диагностики фасциолеза крупного рогатого скота на основе дот-ИФА обусловлена необходимостью создания биологической безопасности среды засчет своевременного выявления больных животных и проведения оздоровительно-профилактических мероприятий в хозяйствах. Копрологическими методами диагностики на сегодняшний день фасциолез можно выявлять только через 3-4 месяца после начала инвазии. К этому времени фасциола уже является болезнетворным агентом, который вызывает тяжело протекающий воспалительный процесс в печени, переходящий в хронический гепатит по пролиферативному типу, что ведет к патологическому состоянию организма и снижает продуктивность крупного рогатого скота. Данная патология обуславливает плохое откармливание и ухудшение качества получаемой от животных продукции, а также сокращение сроков хранения продуктов убоя.

Цели и задачи исследования. Основной целью работы было разработать иммуноферментную тест-систему на основе дот-ИФА для эффективной прижизненной диагностики фасциолеза крупного рогатого скота.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Получить водно-солевые экстракты фасциол и испытать их в качестве диагностического антигена.

2. Разработать метод очистки антигенов фасциол на основе аффинной хроматографии.

3. Отработать режимы постановки дот-ИФА при различной степени инвазии у фасциолезных животных.

4. Провести испытания дот-ИФА и ИФА с различными антигенами при фасциолезе крупного рогатого скота.

5. Дать оценку сравнительной диагностической эффективности тестов на

основе дот-ИФА, ИФА и копрологических методов. Научная новизна. Научная новизна заключается в разработке диагностической тест-системы на основе дот-ИФА с помощью аффинно очищенного антигена для обнаружения антител в крови к возбудителю фасциолеза крупного рогатого скота Fasciola hepatica и определении ее сравнительной диагностической эффективности с другими методами прижизненной диагностики.

Практическая значимость. Разработанный тест на основе иммуноферментной реакции (дот-ИФА) может использоваться органами ветеринарного контроля для оценки эпизоотической ситуации по фасциолезу крупного рогатого скота и закупочными организациями для формирования благополучных сырьевых баз. Он экономичен по затратам, прост в исполнении и перспективен для массовых обследований в полевых условиях, так как позволяет диагностировать данную болезнь уже через 3-4 недели после начала инвазии, что дает возможность разработать эффективные меры по борьбе с фасциолезом в хозяйствах. Результаты исследований использованы при разработке «Методических рекомендаций по иммунодиагностике фасциолеза крупного рогатого скота реакцией дот-ИФА», одобренных секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 21.05.2010.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены на международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Современный метод диагностики хронического фасциолеза продуктивных животных, Москва, 2008), XVI московском международном ветеринарном конгрессе (Диагностика фасциолеза крупного рогатого скота иммуноферментной реакцией, Москва, 2008). Основные положения, выносимые на защиту.

1. Экстенсивность и интенсивность фасциолезной инвазии при послеубойном обследовании.

2. Антигены фасциол и их диагностическое значение.

3. Разработка диагностической тест-системы на основе дот-ИФА при фасциолезе крупного рогатого скота.

является результатом четырехлетних научных исследований аспиранта. Основная экспериментальная часть исследований по разработке диагностической тест-системы на основе дот-ИФА при фасциолезе крупного рогатого скота выполнена автором лично. Работа выполнялась под руководством доктора ветеринарных наук, профессора кафедры инфекционных и паразитарных болезней ГОУ ВПО МГУПБ И.Г. Гламаздина, который оказывал научно-методическую помощь в проведении исследований и анализе

полученных результатов. В четырех совместных публикациях личный вклад автора составлял не менее 75 %.

Публикации. По теме диссертации и результатам исследований опубликовано 6 научных статей, в том числе 2 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов по кандидатским диссертациям: в Российском паразитологическом журнале (№ 3, 2010), журнале «Овцы, козы и шерстяное дело» (№ 4, 2009). Результаты научных исследований также опубликованы в материалах международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (2007, 2008, 2010) и XVI московского международного ветеринарного конгресса (2008).

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 120 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, заключение, а также выводов, практических предложений, списка литературы и приложений. Список литературы содержит 182 источника, из них 49 отечественных и 133 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 7 рисунками.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена на кафедре инфекционных и паразитарных болезней ветеринарно-санитарного факультета МГУПБ, в убойном цехе ОАО «Коломенский опытный мясокомбинат», в ветеринарном диагностическом центре «Аргумент» при МГУПБ в 2005-2009 годах.

Объектом исследования служила коллекция из 411 сывороток крупного рогатого скота, включавшая:

• 150 сывороток крови от крупного рогатого скота, спонтанно зараженного Fasciola hepatica;

• 200 сывороток крови от крупного рогатого скота, при ветсанэкспертизе продуктов убоя которого не было обнаружено следов ни Fasciola hepatica, ни каких-либо гельминтов других видов;

• 24 сыворотки крови от крупного рогатого скота, естественно зараженного Echinococcus granulosus;

• 26 сывороток крови от крупного рогатого скота, спонтанно инвазированного Dicrocoelium lanceatum;

• 11 сывороток крови от крупного рогатого скота, спонтанно зараженного Cysticercus taenuicollis.

Отбор сывороток крови проводили на ОАО «Коломенский опытный мясокомбинат» во время убоя крупного рогатого скота с последующей обязательной ветеринарно-санитарной экспертизой внутренних органов.

Таким образом, 150 образцов крови естественно инвазированного фасциолезом скота были разделены натри серологические группы:

• 47 сывороток крови от коров с интенсивностью инвазии свыше 50 фасциол,

• 61 сыворотка крови от животных с интенсивностью от 3 до 10 паразитов,

• 42 сыворотки крови от крупного рогатого скота со средней степенью инвазии от 10 до 50 трематод.

В качестве антигена использовали полный водно-солевой экстракт фасциол, а также сырой соматический антиген, истощенный посредством аффинной хроматографии против общих белков с Cysticercus taenuicollis и антисывороткой к биологически активным компонентам печени крупного рогатого скота с признаками гепатита неинвазионной этиологии.

Антивидовым конъюгатом являлись антитела быка к IgG (H+L), меченные пероксидазой хрена, производства НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи. Твердофазным адсорбентом (носителем), на котором осуществлялась реакция микроагглютинации, в дот-ИФА (dot-ELISA) выбрали нитроцеллюлозную мембрану производства фирмы «Serva», а в ИФА (ELISA) -полистироловые микротитровальные планшеты разных производителей.

Для определения сравнительной эффективности диагностики с традиционными копрологическими методами параллельно было отобрано 150 проб фекалий от крупного рогатого скота, после убоя которого в печени обнаружены фасциолы и отсутствовали следы каких-либо гельминтов других видов.

2.1.1. Получение инвазионного материала и приготовление соматического антигена

Трематод F. hepatica собирали из желчных протоков печени зараженного фасциолезом крупного рогатого скота на точке осмотра и ветеринарно-санитарной экспертизы внутренних органов в убойном цехе ОАО «Коломенский опытный мясокомбинат» Московской области (г. Коломна). Живых фасциол доставляли в лабораторию в термосе со льдом, после чего пять раз промывали от желчи и других загрязнений в фосфатно-солевом буфере рН 7,2. Для удаления содержимого кишечника проводили инкубацию трематод в растворе Stephenson (150 mM NaCI, 10 mM KCI, 1 шМ СаС12, 6 шМ боратный буфер и 30 шМ глюкоза) рН 8.6 при 37 °С в течение 6 часов (Stephenson W., 1947а). Помещали фасциол в фарфоровую ступку и заливали 0,01 М фосфатно-солевым буфером рН 7,2 в соотношении 1:2. Гомогенизировали биомассу, растирая пестиком около 10 минут до получения однородной консистенции с последующим трехкратным замораживанием и оттаиванием. С целью более полного перехода в раствор поверхностных мембранных белков добавляли 3 М KCI и твин 20 - 0, 05 % и перемешивали вручную стеклянной палочкой при 22 °С 30 минут. Затем проводили центрифугирование в течение 20 минут при 15000 об/мин, при t = 4 °С. Пипеткой отбирали надосадочную жидкость.

Концентрацию белка в полученном супернатанте устанавливали методом определения общего белка по Лоури (Lowry О.Н. et al., 1951).

2.1.2. Получение гипериммунной сыворотки

Предварительно иммунизировали кролика внутримышечно 2 мл экстракта личинок С. taenuicollis без внутрипузырной жидкости с концентрацией белка 2 мг/мл в полном адъюванте Фрейнда, а также экстрактом печеночной ткани крупного рогатого скота (с концентрацией белка 2 мг/мл) с признаками воспаления негельминтозной этиологии. Кровь отбирали через 7 дней после двукратной инокуляции с интервалом в 2 недели. Для хранения сыворотку крови от иммунизированного кролика лиофилизировали.

Иммуноглобулины из полученной сыворотки выделяли методом осаждения насыщенным раствором сульфата аммония (NH^SC^. Использовали 30 см3 лиофилизированной сыворотки крови, которую растворяли в 30 мл дистиллированной воды. Насыщенный раствор сульфата аммония в объеме 6 мл по каплям добавляли в 12 мл разведенной сыворотки при непрерывном перемешивании на магнитной мешалке. Для полного образования преципитата, сыворотку оставляли на 1 час при комнатной температуре, а затем центрифугировали 15 минут при 15000 об/мин. В дальнейшей работе использовали осадок, который трижды промывали 40 % раствором сульфата аммония. Супернатант удалялся и не использовался в работе. Затем преципитат растворяли в 12 мл физиологического раствора и повторяли описанный этап обработки 40 % раствором (NH4)2S04.

Полученный вторичный преципитат растворяли в 12 мл буфера - 0,1 М NaHCCb с добавлением 0,5 М NaCl рН 8,3. Спектрофотометрическим методом по Варбургу и Христиану (Warburg О., Christian W., 1941) определяли концентрацию белка в полученном растворе.

2.1.3. Истощение сырого антигена фасциол с помощью аффинной хроматографии

Антитела связывали с CNBr-активированной сефарозой согласно методическим рекомендациям фирмы «Pharmacia». А именно, 1 грамм сухой CNBr-активированной сефарозы 4В промывали от декстрана и лактозы на стеклянном фильтре № 3 300 мл 1 мМ НС1 и для связывания обрабатывали 10 мл 0,1 М NaHC03 рН 8,3 с добавлением 0,5 М NaCl. Далее к полученному гелю в количестве 3,5 мл добавляли 7 мл приготовленного раствора иммуноглобулинов кролика и 2 часа перемешивали в аппарате для встряхивания типа WU-3.

Затем жидкую фазу отделяли с помощью стеклянного фильтра, а для блокирования оставшихся активных групп на сефарозе гель переносили в колбу с 10 мл 1 М этаноламина рН 8,0 и инкубировали 2 часа при 22 °С в аппарате типа WU-3. Для удаления нековалентно связанных молекул гель промывали ацетатным буфером рН 4,0. На заключительном этапе сорбент помещали в

фосфатно-солевой буфер и оставляли на 12 часов в холодильнике при + 4 °С. Через колонку с загруженным готовым сорбентом в течение часа прокачивали полный водно-солевой экстракт фасциол со скоростью 5 мл/час (замкнутая циркуляция). Несвязавшиеся антигенные компоненты вымывали фосфатно-солевым буфером, осуществляя контроль по показаниям спектрофотометра при 280 нм. Элюцию проводили со скоростью 5 мл/час 0,1 М глицин-HCl буфером рН 2,4. Элюат собирали с помощью коллектора фракций в пробирки и нейтрализовали 1 н NaOH. Анализ выделенных фракций проводили в иммуноферментной реакции.

2.1.4.0воскопическое исследование фекалий крупного рогатого скота, зараженного F. hepatica

Для обнаружения яиц в пробах фекалий фасциолезного скота использовали комбинированный метод Н.В. Демидова. Около 5 г. фекалий помещали в большой стакан объемом 250 мл и заливали насыщенным раствором поваренной соли, тщательно размешивая стеклянной палочкой до получения равномерной взвеси. После чего ей давали отстояться 20 минут, по истечении которых удаляли с поверхности всплывшие грубые частицы. А надосадочную жидкость отсасывали спринцовкой или осторожно сливали, оставляя 20-30 мл над осадком. Затем добавляли воду до полного объема стакана, размешивая палочкой. Далее взвесь фильтровали через металлическое сито с размером ячеек 0,25 мм и отстаивали в течение 5 минут. Жидкость из стаканов отсасывали, оставляя на дне 15-20 мл осадка, который впоследующем переливали в конические стаканчики объемом 40 мл. При этом большие стаканы ополаскивали, и смыв опять выливали в маленькие конические. После отстаивания в течение 5 минут надосадочную жидкость отсасывали, и этап промывания осадка проводили несколько раз. Потом осадок переносили на предметное стекло и микроскопировали.

Помимо метода Н.В. Демидова применяли метод М. Бреза с использованием тиосульфата натрия (M.Breza, J.Cobra, 1976). Пробу гомогенизировали с водой (10-15 мл воды), фильтровали через сито в центрифужную пробирку и центрифугировали 1 минуту при 1500-2000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляли. К осадку добавляли флотационный раствор тиосульфата натрия с плотностью 1,400-1,415 и вновь центрифугировали. Взвесь, содержащую яйца гельминтов, сливали в стакан емкостью 150 мл, содержавший 2/3 воды. Отстаивали 5 минут, надосадочный слой удаляли, осадок микроскопировали.

Таким образом, было исследовано 150 проб фекалий фасциолезного крупного рогатого скота.

2.1.5. Постановка и учет результатов ИФА (ELISA) при фасциолезе крупного рогатого скота

Постановку иммуноферментной реакции проводили в непрямом варианте с целью выявления антител в сыворотке крови животных. Параметры и режимы постановки ИФА с полным водно-солевым экстрактом фасциол и истощенным в аффинной хроматографии соматическим антигеном отрабатывали в предварительных экспериментах на сыворотках крупного рогатого скота с гомологичной, гетерологичной инвазией и отрицательным контролем. Твердой фазой служили полистироловые планшеты производства фирмы «Медполимер», Санкт-Петербург. Учет результатов реакции вели с помощью полуавтоматического иммуноферментного микропланшетного анализатора.

Результаты серологического исследования сопоставляли с данными послеубойной экспертизы.

Определение оптимальной концентрации антигена. Исходная концентрация белка в полном водно-солевом экстракте фасциол составила 4,5 мг/мл по Лоури, а в истощенном соматическом антигене - 0,75 мг/мл. Тестировались рабочие разведения диагностических препаратов с концентрацией по белку от 1 мкг/мл до 20 мкг/мл в 0,01 М карбоната о-бикарбонатном буфере рН 9,6.

Определение оптимального режима сорбции антигена на планшетах. Испытали следующие варианты сенсибилизации: 4 часа при 4 °С; 4 часа при 18-24 °С; 4 часа при 37 °С; 18-20 часов при 4 °С; 18-20 часов при 18-24 °С; 1 час при 37 °С. Наиболее оптимальным, на наш взгляд, являлся 1 час при 37 °С с последующей экспозицией в течение 18-20 часов при 4 °С с 10 % лошадиной сывороткой.

Определение оптимального диагностического титра исследуемых сывороток крови крупного рогатого скота. Определение оптимального диагностического титра проводили на сыворотках спонтанно зараженных F. hepatica животных с учетом интенсивности инвазии в печени. В качестве отрицательного контроля использовали сыворотки крови от животных, при ветсанэкспертизе продуктов убоя которых не было обнаружено следов каких-либо гельминтов, а также гетерологичные сыворотки от скота, спонтанно зараженного Echinoccocus granulosus и Dicrocoelium lanceatum, для проверки на возможность перекрестных реакций. Испытали разведения сывороток от 1:10 до 1:300. В дальнейшем в каждом серологическом тесте использовали положительные и отрицательные референс-сыворотки.

2.1.6. Разработка дот-ИФА (dot-ELISA) при фасциолезе крупного рогатого скота

Постановку дот-ИФА также осуществляли в непрямом варианте для выявления антител в сыворотке крови крупного рогатого скота с учетом предложений Pappas M.G. (1988) и Zimmerman G.L. (1985). Оптимальные параметры и режимы постановки дот-ИФА с истощенным соматическим

антигеном из водно-солевого экстракта отрабатывали в предварительных экспериментах на той же коллекции сывороток, что и в ИФА на пластиковых планшетах. Микропористый нитроцеллюлозный адсорбент разрезался на полоски (стрипы) и в случае постановки единичных реакций готовили небольшие нарезки для их применения в 96-луночных планшетах. Операции с мембранами на каждом этапе осуществлялись посредством пинцетов.

Определение оптимальной концентрации антигена и диагностического титра. Антиген разводили от 750 мкг/мл до 50 мкг/мл, сыворотки - от 1:5 до 1:150. Контролем являлись слабо и сильно положительные, а также негативные референс-сыворотки по результатам предварительных испытаний в ИФА (ELISA). За оптимальный диагностический титр принимали такое разведение, при котором отмечали пероксидазную активность в изменении цвета субстрата от светло-коричневого до темно-коричневого с сыворотками крови от спонтанно зараженных животных. Притом, что одновременно изменение окраски отсутствовало или было весьма незначительным (бежевый фон) с сыворотками от крупного рогатого скота, непораженного фасциолезом.

Определение режима сенсибилизации мембран антигеном. При отработке режимов адсорбции на нитроцеллюлозных мембранах использовали четыре раствора (фосфатно-солевой буфер, карбонатно-бикарбонатный буфер, трис-HCl буфер, триэтаноламиновый буфер) для разведения антигена и два варианта экспозиции (инкубирования). Мембрану с нанесенным антигеном высушивали либо в течение 30 минут при комнатной температуре, либо в термостате при 56 °С в течение 10-15 минут.

Определение режима инактивации сенсибилизированных мембран. Для исключения неспецифического взаимодействия оставшиеся свободными участки на мембране блокировали 10 % лошадиной сывороткой крови, инкубируя 1 час при 37 °С в шейкере.

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Результаты исследований по постановке и учету ИФА (ELISA) при фасциолезе крупного рогатого скота

Определение оптимальной концентрации антигена. Опыты по определению оптимальной концентрации антигенов проводили на сыворотках крови крупного рогатого скота, спонтанно зараженного F. hepatica с сильной, средней и слабой интенсивностью инвазии, и с отрицательным контролем по данным послеубойной ветсанэкспертизы печени. Исходя из анализа данных научной литературы, мы использовали разведение сыворотки крови крупного рогатого скота 1:150, что позволяет провести оценку диагностической эффективности антигенов при паразитарных болезнях животных (Гламаздин И.Г., 1990, 2005; Написанова JI.A., 2004). Как видно из таблицы № 1, нами установлено, что с повышением концентрации антигена с 1 мкг/мл до 20 мкг/мл чувствительность реакции заметно повышается, достигая оптимума при 10 мкг/мл. Дальнейшее увеличение концентрации до 20 мкг/мл снижало

специфичность реакции. Разница между положительным и отрицательным контролями сокращалась, а в некоторых случаях уровень их ответа был сопоставим. Таким образом, появлялись ложноположительные ответы от сывороток крови незараженных животных. Чувствительность при концентрации белка 15 и 20 мкг/мл оставалась на прежнем уровне, то есть переставала повышаться (табл. № 1).

При определении оптимальной концентрации антигена мы учитывали также скорость сорбции антигена в планшетах для иммуноферментной реакции и эффективность обнаружения антител в исследуемых сыворотках, которую определяли по разнице между положительными и отрицательными ответами.

Таблица № 1

Определение оптимальных концентраций антигенов в ИФА

Концентрация белка в антигенном препарате в мкг/мл Величина оптической плотности сывороток крови животных, зараженных Р.Ьерайса со средней степенью инвазии Величина оптической плотности сывороток крови животных, незараженных ни Р.Иерайса, ни гельминтами других видов

20 0.48 ±0.05 0.35 ± 0.04

15 0.32 ±0.03 0.28 ± 0.03

5 0.15 ±0.02 0.10 ±0.01

1 0.10 ± 0.01 0.08 ±0.01

Р < 0.05

* - диагностическая концентрация антигена определялась при разведении сыворотки крови 1:150.

После вышеописанного этапа была проведена предварительная серия исследований по оценке сравнительной диагностической эффективности двух вариантов антигенов сырого и истощенного с помощью аффинной хроматографии. Оценка антигенов проводилась по показателям специфичности и чувствительности в ИФА. Апробация осуществлялась на референс-сыворотках в титре 1:100 из собранной серологической коллекции от крупного рогатого скота с заранее известным профилем иммуноглобулинов. Как видно из таблицы 2 чувствительность ИФА-тестов оказалась на 3 % выше с истощенным антигеном, так как с его помощью к позитивно реагирующим было отнесено на 4 сыворотки крови больше. То есть наблюдалось более полное совпадение результатов серологических реакций с эталонными данными послеубойной ветеринарно-санитарной экспертизы печени. Использование антигена после хроматографии привело и к повышению специфичности теста с 82 до 90 %. Антиген, истощенный антителами против С. 1аепшсоШз и антисывороткой к компонентам печени с признаками воспаления негельминтозной этиологии оказался более специфичным и давал меньшее количество перекрестных реакций с гетерологичной инвазией и ложноположительных ответов.

Аффинная хроматография, основанная на принципах истощения полного антигенного экстракта антителами к наиболее часто встречающимся неспецифическим белкам, позволила существенно улучшить специфичность антигенного препарата.

ТаблицаМя 2

Сравнительная диагностическая эффективность антигенов в ИФА

Сыворотки крови крупного рогатого скота Сырой соматический антиген Истощенный соматический антиген

Положительные ответы Отрицательные ответы Положительные ответы Отрицательные ответы

Фасциолез, п* = 150 130 20 134 16

Дикроцелиоз, п = 26 7 19 4 22

Тонкошейный цистицеркоз, п= 11 3 8 0 11

Эхинококкоз, п = 24 5 19 2 22

здоровые животные, п = 200 33 167 21 179

* - п - количество сывороток крови

Таким образом, в дальнейшей своей работе мы использовали истощенный соматический антиген, как более специфичный и обладающий высокой чувствительностью.

Определение оптимального диагностического титра сывороток крови крупного рогатого скота. Оптимальное разведение сыворотки для исследований в ИФА определяли на основе выявления максимальной разницы между значениями оптической плотности (коэффициента экстинкции) сывороток с фасциолезной, гетерологичной инвазией (Е. granulosus, D. lanceatum) и отрицательным контролем. Сыворотки исследовали в разведениях 1:10, 1:50; 1:100; 1:150; 1:200; 1:250; 1:300. Как видно из таблицы № 3, исследования показали, что в разведениях 1:10, 1:50 сыворотки крови давали слишком интенсивную, мало отличающуюся реакцию. В то же время в разведениях сывороток больше, чем 1:200 получена недостаточно убедительная разница в значениях коэффициента экстинкции между гомологичной и гетерологичной инвазией, а также низкая интенсивность реакции в сыворотках от фасциолезного скота со слабой и средней интенсивностью инвазии. В проведенных исследованиях нами был установлен необходимый титр сыворотки крови, который обеспечивал оптимальное соотношение

компонентов иммуноферментной реакции. Чувствительность и специфичность теста обуславливается необходимым соотношением, прежде всего антигенов и антител. Современные варианты иммуноферментного анализа позволяют проводить диагностические исследования, используя единичное разведение сыворотки даже в случае количественного определения антител.

Таблица № 3

Определение оптимального диагностического титра сывороток крови

Титр сыворотки Коэффициенты экстинкции оптической плотности

Интенсивность инвазии F.hepatica Гетерологичная инвазия Незаражен-ные

Слабая Средняя Сильная D.lanceatum E.granulosus

1: 10 1.69±0.07 1.71±0.08 1.76 ± 0.1 1.02 ±0.04 0.97 ±0.05 0.72 ±0.05

1: 50 0.70±0.05 0.85±0.07 0.98±0.08 0.53 ±0.03 0.59 ±0.03 0.26 ± 0.02

1 100 1ЯИ5НЯ0И 1(*ШIIt!«lí WílItU 0.15 ±0.01 0.13 ±0.01 0.12 ±0.01

1 150 0.21-.0.02 fi27-.0.¡)5 0.1V 0.0-1 '1.13 ±0.01 0.11 ±0.01 0.13 ±0.01

1 200 0.17±0.02 0.19±0.02 0.24±0.03 0.12 ±0.01 0.10 ±0.01 0.10 ±0.01

1 250 0.12±0.01 0.15±0.02 0.17±0.02 0.09± 0.008 0.08 ±0.007 0.08± 0.007

1 300 0.10±0.01 0.11±0.01 0.14±0.01 0.07± 0.006 0.06 ± 0.006 0.05± 0.004

Р < 0.05

Титр сыворотки крови 1:150 обеспечивал удовлетворительную величину разницы между положительными и отрицательными ответами. Однако максимальная разница между результатами реакции с сыворотками крови от фасциолезных животных и от животных с гетерологичной инвазией была получена в титре 1:100. Таким образом, за оптимальный диагностический титр при фасциолезе крупного рогатого скота в дальнейшей работе мы использовали 1:100 (табл. № 3).

Режим постановки реакции. При отработке режима постановки ИФА установили, что оптимальным является вариант инкубации с сыворотками и с конъюгатом по 30 минут при 37 °С. Увеличение времени инкубации на каком-либо из этих двух этапов заметно снижало специфичность. Режим постановки реакции выстроили следующим образом:

1. Для сенсибилизации планшетов применяли антиген в количестве 200 мкл на лунку, разведенном в 0,01 М карбонатно-бикарбонатном буфере с рН 9,6 до концентрации 10 мкг/мл. Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37 °С в шейкере, после этого - удаление несвязавшихся антигенных компонентов двукратным отмыванием дистиллированной водой с 0,05 % содержанием твина -20. Отмывку этим раствором проводили после каждого этапа реакции. Затем вносили по 200 мкл 10 % лошадиной сыворотки и инкубировали в холодильнике при 4 °С с закрытыми крышками в течение 18-20 часов.

2. Исследуемые и контрольные сыворотки разводили 0,01 М фосфатно-солевым буфером рН 7,2 с 0,05 % содержанием твина-20 до диагностического

титра 1:100 и вносили в лунки в объеме 100 мкл. Инкубировали в течение 30 минут при 37 °С. Отрицательным и положительным контролем служили сыворотки крови крупного рогатого скота с заранее известными характеристиками.

3. На следующем этапе постановки ИФА вносили конъюгат по 100 мкл в каждую лунку в рекомендуемом рабочем разведении на 0,01 М фосфатно-солевом буфере рН 7,2 с 0,05 % содержанием твина-20. Инкубировали в течение 30 минут при 37 °С.

4. Проявление реакции проводили внесением 100 мкл/лунку субстратной смеси, состоящей из цитратного буфера рН 5,0 с добавлением стабилизированной 30 % перекиси водорода и ортофенилендиамина. Раствор субстрата готовился каждый раз и использовался немедленно. После проявления - инкубации в течение 10 минут при 37 °С или 15 минут при комнатной температуре - реакцию останавливали 2 М раствором серной кислоты по 50 мкл на лунку.

5. Визуальную оценку реакции проводили по интенсивности окрашивания субстрата в лунках. Положительная реакция характеризовалась потемнением субстратной смеси до желтого цвета с оттенком буроватого. При отсутствии изменения цвета реакцию оценивали как отрицательную, то есть в исследуемой сыворотке антител к данному антигену не обнаруживали. Интенсивность окраски при положительной реакции заметно превосходила отрицательный контроль и была сопоставимой с положительным контролем. Сыворотка, незначительно превосходящая по интенсивности окраски отрицательный контроль, считалась сомнительной. Сомнительную сыворотку исследовали повторно. Дважды сомнительную считали положительной. При автоматическом учете на иммуноферментном микропланшетном анализаторе использовали волну длиной 492 нм. Положительной считали сыворотку с оптической плотностью от 0,2 и выше.

2.2.2. Результаты исследований по разработке дот-ИФА (сМ-ЕЫвА) при фасциолезе крупного рогатого скота

Диагностическую тест-систему на основе дот-ИФА разрабатывали с целью получения мобильного и недорогого метода иммунодиагностики фасциолеза крупного рогатого скота в полевых условиях. Исследования по отработке параметров и режимов постановки дот-ИФА нами проводились многократно. Изначально имели антигены с концентрацией по белку 0,75 мг/мл. Оптимальной концентрацией антигена была 1,5 мкг/дот (1 определение) в объеме 3 мкл/дот, что в пересчете составляет 500 мкг/мл. В этих условиях оптимальным диагностическим титром был выбран титр 1:50. Эта концентрация позволяла максимально разграничить отрицательный контроль и сыворотки скота с гетерологичной инвазией с одной стороны от положительного контроля и сывороток зараженных животных с другой стороны.

Определение режима сенсибилизации мембран антигеном. При

отработке режимов адсорбции иитроцеллюлозными мембранами антигена использовали два режима и 4 раствора для его разведения: 0,01 М фосфатно-солевой буфер рН 7,2; 0,01 М карбонатно-бикарбонатный буфер рН 9,6; 0,01 М трис-НС1 буфер рН 7,4; 0,01 М триэтаноламиновый буфер рН 8,2. В дальнейшей работе при сенсибилизации нитроцеллюлозных мембран антигенами фасциол мы использовали для их разведения 0,01 М карбонатно-бикарбонатный буфер рН 9,6. Несколько хуже были результаты с другими буферными растворами. Испытали два режима сенсибилизации: высушивание после нанесения антигена при комнатной температуре (18-24 °С) и высушивание в термостате при 56 °С в течение 15 минут. Предпочтение отдали второму варианту, в результате которого положительные реакции проявлялись пятном с более четкими контурами.

Определение режима инактивации сенсибилизированных мембран. После адсорбции антигенного материала, как правило, часть участков мембраны остаются свободными, которые необходимо инактивировать, чтобы исключить в дальнейшем неспецифическую сорбцию антител и других реагентов. Блокирование проводили 10 % лошадиной сывороткой инкубированием в течение 1 часа при 37 °С.

Режим постановки реакции. При отработке режима постановки дот-ИФА установили, что оптимальным режимом является вариант инкубации с сыворотками 30 минут при комнатной температуре (18-24 °С) во влажной камере и 30 минут в рабочем растворе конъюгата при комнатной температуре (18—24 °С). Увеличение времени инкубации усиливало неспецифическое взаимодействие, и, соответственно, возрастало количество ложных ответов. Постановку дот-ИФА осуществляли в непрямом варианте с целью выявления антител к Б. Иера^са в сыворотке крови крупного рогатого скота. Результаты по отработке параметров и режима постановки реакции следующие:

1.Для адсорбции антигена мембраной в качестве буферного раствора применяли 0,01 М карбонатно-бикарбонатный буфер рН 9,6. Антигенный материал наносили на мембрану в объеме 3 мкл на размеченные простым карандашом точки-доты. Затем мембрану высушивали 15 минут при 56 °С.

2. Блокирование проводили в 0,01 М фосфатно-солевом буфере рН 7,2 с 10 % лошадиной сывороткой в течение 1 часов при 37 °С. Затем мембрану отмывали один раз 5 минут в отмывающем растворе, состоящим из 0,01 М фосфатно-солевого буфера с 0,05 % содержанием твина-20.

3. На следующем этапе контрольные и исследуемые сыворотки, разведенные в 0,01 М ФСБ рН 7,2 с 0,05 % содержанием твина-20, наносили на мембрану в объеме 3 мкл/дот с помощью полуавтоматической пипетки. Инкубирование в течение 30 минут проводили при комнатной температуре (1824 °С) во влажной камере, состоящей из чашки Петри с тонким слоем поролона (0,5 см) и листа фильтровальной бумаги на нем, смоченных отмывающим раствором. По окончании инкубации непрореагировавшие компоненты удаляли

с мембраны трехкратным отмыванием ее по 5 минут вышеуказанным в пункте 2 раствором в чашке Петри, периодически потряхивая емкость.

4. Конъюгат использовали в рекомендуемом производителем рабочем разведении на 0,01 М фосфатно-солевом буфере рН 7,2 с 0,05 % содержанием твина-20. Мембрану помещали в раствор конъюгата и инкубировали при комнатной температуре (18-24 °С) в течение 30 минут, затем отмывали.

5. На заключительном этапе мембрану помещали в раствор субстратной смеси и выдерживали 5-10 минут в темноте. Субстратную смесь готовили следующим образом: 5 мг 3,3'-диаминобензидина растворяли, тщательно перемешивая, в 20 мл 0,1 М трис-НС1 буфера рН 7,4 и отфильтровывали через бумажный фильтр. Раствор хранили не более 3 дней при температуре 4 °С в темном месте. Непосредственно перед использованием в раствор субстрата добавляли 10 мкл 30 % стабилизированной перекиси водорода. После проявления реакцию останавливали промыванием мембраны в водопроводной воде. Оценку реакции проводили визуально по интенсивности окрашивания точек-дотов в сравнении с контрольными сыворотками. Результат считали отрицательным, если на месте нанесения сыворотки пятно не проявлялось или появлялось фоновое светло-бежевое окрашивание. Результат считали положительным, если на месте нанесения сыворотки появлялось коричневое пятно с четким контуром, по интенсивности окраски сопоставимое со слабоположительным контролем.

Шкала оценки:

• « +++ » - сильноположительная реакция - темно-коричневое пятно;

• « ++ » - положительная реакция - коричневое пятно;

• « + » - слабоположительная реакция - светло-коричневое пятно;

• « - » - отрицательная реакция - пятно не проявляется.

2.2.3. Диагностическая эффективность дот-ИФА и ИФА с истощенным соматическим антигеном из водно-солевого экстракта фасциол

Определение чувствительности ИФА проводили на основании сопоставления результатов реакции и данных послеубойной ветеринарно-санитарной экспертизы печени (табл. № 4). Из 47 сывороток крови от скота с интенсивностью инвазии более 50 фасциол на печень 46 реагировали с диагностическим препаратом в титрах 1:100-200. Из 61 сыворотки крови от крупного рогатого скота с интенсивностью инвазии от 3 до 10 фасциол 50 реагировали в титре 1:100, а из 42 сывороток крови с интенсивностью инвазии от 10 до 50 трематод на печень - 38 в титре 1:100-150. Наличие 16 ложноотрицательных реакций можно объяснить невысокими показателями интенсивности инвазии, снижением иммунореактивности организма при хроническом течении болезни, нейтрализацией специфическими иммуноглобулинами циркулирующих растворимых и корпускулярных антигенов. Чувствительность составила в среднем 89 % и зависела от степени интенсивности инвазии.

Таблица № 4

Чувствительность ИФА при исследовании сывороток крови крупного рогатого скота с различной степенью инвазии

Степень интенсивности фасциолезной инвазии Количество исследованных сывороток крови Количество положительных реакций Чувствительность, %

Слабая (от 3 до 10) 61 50 82

Средняя (от 10 до 50) 42 38 90

Сильная (свыше 50) 47 46 98

Итого: 150 134 89

Специфичность диагностического препарата изучали в ИФА с использованием положительной сыворотки крупного рогатого скота к Dicrocoelium lanceatum с рабочим титром 1:100; положительной сыворотки крови крупного рогатого скота к Echinococcus granulosus с рабочим титром 1:100; положительной сывороткой крови к Cysticercus taenuicollis, а также отрицательной на фасциолез, дикроцелиоз, тонкошейный цистицеркоз и эхинококкоз сывороткой крови крупного рогатого скота (табл. № 5).

Таблица № 5

Специфичность ИФА при исследовании сывороток крови крупного рогатого

скота, зараженного разными гельминтами

Заболевание Обследовано животных Количество ложноположительных реакций Специфичность, %

Дикроцелиоз 26 4 85

Эхинококкоз 24 2 92

Цистицеркоз тонкошейный 11 0 100

Здоровые животные (контроль) 200 21 90

Итого: 261 27 90

Исследования на специфичность показали, что из 26 сывороток крови от дикроцелиозных животных 4 реагировали с диагностическим препаратом из истощенного экстракта фасциол сомнительно (коэффициент экстинкции 0,150,2). С сыворотками крови от эхинококкозных животных также было выявлено 2 перекрестные реакции. При оценке отрицательного контроля с негативной

сывороткой крупного рогатого скота на фасциолез, дикроцелиоз, тонкошейный цистицеркоз и эхинококкоз было выявлено 21 ложноположительная реакция. Полученные ложноположительные результаты в сыворотках крови от животных, в печени которых при послеубойной экспертизе не обнаружены половозрелые трематоды, можно объяснить проведенной дегельминтизацией, длительной сенсибилизацией тканей организма метаболитами фасциол. Мы не исключаем наличие общих антигенных детерминант у гельминтов разных видов, а также возможного присутствия в паренхиме печени мигрирующих юных форм фасциол, резистентных к некоторым ангельминтикам. Таким образом, специфичность составила 90 %.

Для оценки диагностической эффективности тестов на основе дот-ИФА исходили из шкалы визуальной оценки реакции, указанной выше. Испытания проводили на той коллекции сывороток крови, что и при ИФА. Как видно из таблицы № 6, чувствительность при испытании дот-ИФА была сопоставима с таковой при ИФА, зависела от степени интенсивности инвазии и составила в среднем 87 %.

Таблица № 6

Чувствительность дот-ИФА при исследовании сывороток крови крупного рогатого скота с различной степенью инвазии

Слабая (отЗ до 10) 61 18 + 30++ Всего: 48 79

Средняя (от 10 до 50) 42 21 ++ 16+++ Всего: 37 88

Сильная (свыше 50) 47 34+++ 12++ Всего: 46 98

Итого: 150 131 87

При этом наименьшей чувствительность в 79 % оказалась при слабой степени инвазии, из 61 сыворотки крови 18 реагировали на 1 крест и 30 на 2. Гораздо выше чувствительность и интенсивность проявления реакции регистрировалась при средней степени инвазии, достигая максимума при сильной степени более 50 фасциол на печень.

При изучении специфичности отмечались перекрестные реакции в пределах 11 % , которые оценивались, как правило, в 1 крест. Однако вцелом она оказалась на уровне 92 % несколько выше, чем в ИФА (табл. № 7).

Таблица № 7

Специфичность дот-ИФА при исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, зараженного разными гельминтами

Заболевание Обследовано животных Количество ложноположительных реакций Специфичность, %

Дикроцелиоз 26 2 + 1 ++ Всего: 3 89

Эхинококкоз 24 2 + 92

Цистицеркоз тонкошейный 11 0 100

Здоровые животные (контроль) 200 13 + 4++ Всего: 17 91

Итого: 261 22 92

Таким образом, результаты наших исследований позволяют нам утверждать о равноценной диагностической эффективности дот-ИФА и классической иммуноферментной реакции на пластике. Дот-ИФА для выявления антител в крови к возбудителю фасциолеза имеет высокий уровень соответствия специфичности и чувствительности. К тому же дот-ИФА обладает рядом преимуществ в сравнении с ИФА. Проведение анализа занимает меньше времени и не требует дорогого оборудования. А простота в применении и экономичность данного теста по затратам делают его более подходящим для диагностики фасциолеза в полевых условиях.

2.2.4. Экстенсивность и интенсивность фасциолезной инвазии при послеубойном обследовании

Проведенные нами исследования при отборе проб на ОАО «Коломенский Опытный Мясокомбинат» в 2005-2007 годах в городе Коломна показали, что практически каждая партия крупного рогатого скота, доставляемая на убой из хозяйств Московской, Рязанской, Брянской, Курской, Вологодской, Владимирской, Тульской, Кировской областей в той или иной степени была поражена фасциолезом. Это согласуется с анализом данных ветеринарной отчетности по отдельным регионам. Однако официальные данные отчетности не всегда отражают реальную обстановку по фасциолезу, о чем свидетельствуют результаты послеубойных экспертиз печени, проведенных нами. Зараженность крупного рогатого скота в результате анализа данных отчетов мясокомбината за 2005-2007 годы колебалась от 20,7 до 32,2% (табл. №8).

Таблица № 8

Данные о количестве выявленных случаев фасциолеза крупного рогатого скота на ОАО «Коломенский опытный мясокомбинат» по данным журналов

формы 5-вет

годы 2005 2006 2007

Количество крупного рогатого скота, подвергнутого убою 9858 6944 7206

Количество крупного рогатого скота, зараженного Р.ЬераИса 2151 2242 1493

Экстенсивность инвазии, % 21,8 32,2 20,7

Таким образом, очевидно, что на сегодняшний день наиболее яркой и визуально определяемой паразитологической проблемой на мясокомбинатах является фасциолез крупного рогатого скота.

Самая высокая экстенсивность фасциолезной инвазии регистрировалась в декабре-январе и составляла более 50 %. Интенсивность инвазии также колебалась в течение года (рис. № 1).

Рисунок № I

График интенсивности фасциолезной инвазии крупного рогатого скота при послеубойном обследовании

В конце июня наблюдался первый пик увеличения числа случаев диагностики фасциолеза при проведении послеубойного обследования. В данный период животные заражаются в результате поедания с травой церкариев (адолескариев), вышедших из организма перезимовавших малых прудовиков (Кузьмичев В.В., 1997). В июле экстенсивность инвазии среди скота, доставлявшегося на убой, зависела от метеорологических факторов, и, как правило, снижалась, при условии длительного воздействия на пастбищах ультрафиолетового спектра лучей солнца, вызывающих гибель адолескариев. Второй более крутой подъем экстенсивности фасциолезной инвазии отмечали в сентябре-октябре. По данным В.В. Кузьмичева (1997) с середины августа и до окончания пастбищного сезона поголовье заражается при заглатывании адолескариев, сформировавшихся из церкариев, вышедших из моллюсков, инвазировавшихся мирацидиями в мае-июле текущего года. Пик регистрации случаев фасциолеза совпадал с максимальными значениями интенсивности и приходился на декабрь-февраль. В период с марта по май кривая интенсивности инвазии резко снижалась, что возможно объяснялось с проведением профилактической дегельминтизации в хозяйствах. Первые пять месяцев в году у зараженного фасциолезом скота обнаруживали только половозрелые имаго фасциол. Далее в июне-июле выявляли первые преимагинальные формы с количественным доминированием половозрелых. В конце лета начале сентября ситуация в половозрастной структуре популяции паразитирующих фасциол менялась на диаметрально противоположную. Наблюдали преобладание уже ювенальных трематод над половозрелыми. В ноябре отмечали резкий одновременный подъем экстенсивности и интенсивности инвазии.

Наши результаты по изучению интенсивности и экстенсивности фасциолезной инвазии среди крупного рогатого скота при послеубойном обследовании в течение года на мясокомбинате согласуются с данными В.В. Кузьмичева (1997) по особенностям эпизоотологии фасциолеза в центральном Нечерноземье РФ.

2.2.5. Результаты копроовоскопичекого исследования и сравнения их с серологическими и данными послеубойной ветеринарно-санитарной

экспертизы

Овоскопическое исследование фекалий крупного рогатого скота фекалий методом Демидова и Бреза проводили с целью выяснения эффективности диагностики традиционных прижизненных копрологических методов при фасциолезе и ее сопоставления с полученными результатами серологических исследований. В итоге из 150 проб фекалий, отобранных от скота, при убое которого в печени были обнаружены фасциолы, методом Демидова были выявлены яйца F. hepatica лишь в 53 образцах, а методом Бреза - в 65, что составляет всего лишь 35 и 43 %, соответственно (табл. № 9). Из чего мы сделали вывод о том, что иммуноферментная реакция и ее точечный вариант эффективны для диагностики фасциолеза более чем в 2 раза.

Таблица Лг 9

Результаты сопоставления серологического, копрологического исследований с данными ветеринарно-санитарной экспертизы

Метод исследования Количество обследованных животных Количество фасциолезных животных Эффективность диагностики, %

Ветеринарно-санитарная экспертиза печени 150 150 100

Метод Демидова 150 53 35

Метод Бреза 150 65 43

Иммуноферментный анализ (ELISA) 150 134 89

Дот-ИФА (dot-ELISA) 150 131 87

3. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработаны Методические рекомендации по иммунодиагностике фасциолеза крупного рогатого скота реакцией дот-ИФА, одобренные секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 21.05.2010.

Рекомендовать в ветеринарных лабораториях использовать дот-ИФА для прижизненной диагностики фасциолеза крупного рогатого скота с целью уточнения эпизоотической обстановки, как более эффективный и современный метод.

4. ВЫВОДЫ

1. Разработана диагностическая тест-система на основе дот-ИФА при фасциолезе крупного рогатого скота с соматическим антигеном фасциол, очищенным с помощью аффинной хроматографии. Данная тест-система является более удобной для проведения исследований в полевых условиях.

2. Отработана методика получения соматического антигена из полного водно-солевого экстракта фасциол с последующим истощением против антигенов цистицерков (С. 1аепшсоШз), а так же биологически активных компонентов и белков воспаления при гепатитах неизвестной этиологии.

3. Установлено, что истощенный с помощью аффинной хроматографии антигенный экстракт имеет высокую диагностическую ценность, о чем свидетельствует повышение специфичности в ИФА с 82 до 90 % при его применении.

4. Проведен анализ диагностической эффективности ИФА и дот-ИФА при фасциолезе крупного рогатого скота. Установлена сопоставимость результатов

по чувствительности и специфичности сравниваемых тестов. Специфичность ИФА и дот-ИФА составила 90 % и 92 %, а чувствительность - 89 и 87, соответственно.

5. Определена сравнительная диагностическая эффективность копрологических методов Демидова и Бреза и иммунологических тестов на основе ИФА и дот-ИФА при фасциолезе крупного рогатого скота. Диагностика серологическими методами оказалась эффективней в 2 раза по сравнению с копроовоскопическими методами.

6. Установлено, что дот-ИФА экономичен по затратам и может быть рекомендован для проведения массовых обследований в полевых условиях с целью уточнения эпизоотической ситуации по фасциолезу в хозяйствах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Коробов А.И., Гламаздин И.Г. Разработка диагностической тест-системы при фасциолезе крупного рогатого скота на основе дот-ИФА. // Российский паразитологичекий журнал. - М., 2010. - № 3. - с.88-92.

2. Коробов А.И., Гламаздин И.Г. Механизмы снижения продуктивных качеств крупного рогатого скота при фасциолезной инвазии. // Материалы VI международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения». - М., 2007. - с.274-275.

3. Коробов А.И., Гламаздин И.Г. Режимы дот-ИФР при фасциолезе крупного рогатого скота. // Материалы VII международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения». - М., 2008. - с.294-295.

4. Коробов А.И., Гламаздин И.Г. Сравнительный анализ эффективности серологических методов диагностики фасциолеза крупного рогатого скота на основе ИФА. // Материалы международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения». -М., 2010. - с.279-281.

5. Коробов А.И. Диагностика фасциолеза крупного рогатого скота иммуноферментной реакцией. // Труды XVI московского международного ветеринарного конгресса. - М., 2008. - с. 147.

6. Римиханов Н.И., Коробов А.И., Гламаздин И.Г., Сысоева Н.Ю. Качество мяса овец, зараженных фасциолезом и его диагностика. // Журнал Овцы, козы и шерстяное дело. - М., 2009. - №4. - с.81-84.

Подписано в печать: 03.11.10

Объем: 1,5усл.п.л. Тираж: 70 экз. Заказ № 103 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Коробов, Артем Игоревич

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Иммунологические методы диагностики фасциолеза животных.

2.2. Использование дот-ИФА в диагностике фасциолеза.

3. Собственные исследования.

3.1. Материалы и методы.

3.1.1. Получение инвазионного материала и приготовление соматического антигена.

3.1.2. Получение гипериммунной сыворотки.

3.1.3. Истощение сырого антигена фасциол с помощью аффинной хроматографии.

3.1.4. Овоскопическое исследование фекалий крупного рогатого скота, зараженного F. hepatica.54,

3.1.5. Постановка и учет результатов ИФА (ELISA) при фасциолезе крупного рогатого скота.

3.1.6. Разработка дот-ИФА (dot-ELISA) при фасциолезе крупного рогатого скота.

3.1.7. Статистическая обработка данных.

3.2. Результаты исследований:.

3.2.1. Результаты исследований по постановке и учету ИФА (ELISA) при фасциолезе крупного рогатого скота.

3.2.2. Результаты исследований по разработке дот-ИФА (dot-ELISA) при фасциолезе крупного рогатого скота.

3.2.3. Диагностическая эффективность дот-ИФА и ИФА с истощенным соматическим антигеном из водно-солевого экстракта фасциол.

3.2.4. Экстенсивность и интенсивность фасциолезной инвазии при послеубойном обследовании.

3.2.5. Результаты копроовоскопичекого исследования и сравнения их с серологическими и данными послеубойной ветеринарно-санитарной экспертизы.

4. Обсуяадение.

5. Практические предложения.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка диагностических тест-систем при фасциолезе крупного рогатого скота на основе иммуноферментного анализа"

Актуальность темы. Фасциолез крупного рогатого скота — зооноз, который характеризуется течением болезни без проявления специфических симптомов с преимущественным поражением гепатобилиарной системы. Возбудителями являются трематоды Fasciola hepatica и Fasciola gigantica, локализующиеся в имагинальной стадии в желчных ходах печени. Данный биогельминтоз широко распространен на территории РФ. Однако степень его распространения и поражения животных неоднозначна в различных природно-климатических зонах нашей страны (H.A. Яременко, И.Ф. Кленова, В.В. Горохов, Н.П. Сорокина, И.А. Молчанов, 2005). На основании научных публикаций (И.Ф. Кленова, H.A. Яременко, В.В. Горохов, У.Г. Тайчинов, А.Н. Воличев, B.C. Любавин, 2002; A.A. Атаев, 1990; М.М. Бочарова, 1996; Н.И. Кошеваров, 2006; В.В. Репетун, 2004) можно утверждать, что в отдельных регионах до 30 % и более поголовья скота заражены фасциолезом. В связи, с чем фасциолезная инвазия наносит значительный экономический ущерб скотоводству России, экономические потери при этом складываются из сокращения удоев молока, часто снижения его качества, уменьшения привесов и утилизации ценного пищевого продукта - печени.

Актуальность разработки тест-системы для прижизненной диагностики фасциолеза крупного рогатого скота на основе дот-ИФА обусловлена необходимостью создания биологической безопасности среды засчет своевременного выявления больных животных и проведения оздоровительно-профилактических мероприятий в хозяйствах. Существующими же на сегодняшний день копрологическими методами диагностики фасциолез можно диагностировать только через 3-4 месяца после начала инвазии. К этому времени фасциола уже является болезнетворным агентом, который вызывает тяжело протекающий воспалительный процесс в печени, переходящий в хронический гепатит по пролиферативному типу, что ведет к патологическому состоянию организма и снижает продуктивные качества крупного рогатого скота. Данная патология обуславливает плохое откармливание и ухудшение качества получаемой от животных продукции, а также сокращение сроков хранения продуктов убоя.

Цели и задачи исследования. Основной целью нашей работы было разработать тест-систему на основе дот-ИФА для эффективной прижизненной диагностики фасциолеза крупного рогатого скота. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Получить водно-солевые экстракты фасциол и испытать их в качестве диагностического антигена.

2. Разработать метод очистки антигенов фасциол на основе аффинной хроматографии.

3. Отработать режимы постановки дот-ИФА при различной степени инвазии у фасциолезных животных.

4. Провести испытания дот-ИФА и ИФА с различными антигенами при фасциолезе крупного рогатого скота.

5. Дать оценку сравнительной диагностической эффективности тестов на основе дот-ИФА, ИФА и копрологических методов.

Научная новизна. Заключается в разработке диагностической тест-системы на основе дот-ИФА с помощью аффинно очищенного антигена для обнаружения антител в крови к возбудителю фасциолеза крупного рогатого скота РаБСю1а Ьерайса и определении ее сравнительной диагностической эффективности с другими методами прижизненной диагностики.

Практическая значимость. Разработанный тест на основе иммуно ферментной реакции (дот-ИФА) может использоваться органами ветеринарного контроля для оценки эпизоотической ситуации по фасциолезу крупного рогатого скота и закупочными организациями для формирования благополучных сырьевых баз. Он экономичен по затратам, прост в исполнении и перспективен для массовых обследований в полевых условиях, так как позволяет диагностировать данную болезнь уже через 3-4 недели после начала инвазии, что дает возможность разработать эффективные меры по борьбе с фасциолезом в хозяйствах. Результаты исследований использованы при разработке «Методических рекомендаций по иммунодиагностике фасциолеза крупного рогатого скота реакцией дот-ИФА», одобренных секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 21.05.2010.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертационной работы были доложены на международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Современный метод диагностики хронического фасциолеза продуктивных животных, Москва, 2008), XVI московском международном ветеринарном1 конгрессе (Диагностика фасциолеза крупного рогатого скота иммуноферментной реакцией, Москва, 2008). По теме диссертации и результатам исследований опубликовано 6 научных статей, в том числе 2 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов по кандидатским диссертациям: в Российском паразитологическом журнале (№ 3, 2010), журнале «Овцы, козы и шерстяное дело» (№ 4, 2009), а также в материалах международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (2007, 2008, 2010) и XVI московского международного ветеринарного конгресса (2008). Основные положения, выносимые на защиту:

1. Экстенсивность и интенсивность фасциолезной инвазии при послеубойном обследовании.

2. Антигены фасциол и их диагностическое значение.

3. Разработка диагностической тест-системы на основе дот-ИФА при фасциолезе крупного рогатого скота.

4. Сравнительный анализ эффективности классических копрологических исследований и серологических тестов на основе ИФА и дот-ИФА. Личный вклад соискателя. Представленная диссертационная работа является результатом четырехлетних научных исследований аспиранта. Основная экспериментальная часть исследований по разработке диагностической тест-системы на основе дот-ИФА при фасциолезе крупного рогатого скота выполнена автором лично. Работа выполнялась под руководством доктора ветеринарных наук, профессора кафедры инфекционных и паразитарных болезней ГОУ ВПО МГУПБ И.Г. Гламаздина, который оказывал научно-методическую помощь в проведении исследований и анализе полученных результатов. В четырех совместных публикациях личный вклад автора составлял не менее 75 %.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 120 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, заключения, а также выводов, практических предложений, списка литературы и приложений. Список литературы содержит 182 источника, из них 49 отечественных и 133 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 7 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Паразитология", Коробов, Артем Игоревич

7. ВЫВОДЫ

4. Проведен анализ диагностической эффективности ИФА и дот-ИФА при фасциолезе крупного рогатого скота. Установлена сопоставимость результатов по чувствительности и специфичности сравниваемых тестов. Специфичность ИФА и дот-ИФА составила 90 % и 92 %, а чувствительность - 89 и 87, соответственно.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Отработаны режимы постановки и учета результатов тест-системы на основе дот-иммуноферментного анализа с аффинно очищенным антигенным соматическим экстрактом для обнаружения антител в сыворотке крови против возбудителя фасциолеза крупного рогатого скота РаБсю1а Иерайса. Данная тест-система позволяет ставить диагноз на фасциолез в течение 3 месяцев острой преимагинальной стадии инвазии, когда трематоды еще не выделяют яйца в пищеварительный тракт и гельминтоовоскопические неэффективны. Апробация на собранной коллекции сывороток крови от крупного рогатого скота показала, что дот-ИФА не уступает в диагностической эффективности иммуноферментной реакции на планшетах.

В результате проведенного нами в течение года мониторинга серологических исследований на обнаружение антител и гельминтоовоскопических анализов фекалий от крупного рогатого скота, зараженного фасциолезом по данным ветеринарно-санитарной экспертизы специфические иммуноглобулины против Б. Ьерайса в ИФА выявлялись в период с июня по март, а яйца трематод находили с ноября по февраль. То есть время, в которое инвазированные серопозитивные животные имели копрологическое подтверждение диагноза, ограничивалось 4 месяцами. Положительные реакции в дот-ИФА отсутствовали лишь в марте-апреле.

На основании этого мы считаем, что применение ветеринарными лабораториями дот-ИФА для диагностики фасциолеза крупного рогатого скота в комплексе с трацидионными методами может оказаться более результативным с точки зрения установления острого фасциолеза у индивидумов и выявления хронической болезни на уровне стада. Это подтверждается фактом наличия антител длительный промежуток времени после дегельминтизации. Что позволит более точно определять неблагополучные по фасциолезу поголовья скота и регионы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата ветеринарных наук, Коробов, Артем Игоревич, Москва

1. Атаев A.A. Эколого—эпизоотологический анализ фасциолеза животных и совершенствование мер борьбы с ним в юго-восточном регионе Северного Кавказа: дисс.докт. вет. наук. — М., 1990. 540с.

2. Белозеров С.Н. Пути повышения эффективности метода иммуноферментного анализа и перспективы его применения при некоторых гельминтозах сельскохозяйственных животных. //

3. Иммуноферментный анализ в ветеринарии. Бюллетень Всесоюзного ордена Ленина НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко. -М.: 1985. выпуск 58. -с.55-57.

4. Бережко В.К. Иммунологические методы диагностики гельминтозов животных (краткий обзор). // Труды Всероссийского ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. — 2000. — т.36. с. 10-26.

5. Бережко В.К. Видоспецифические антигены гельминтов и иммуноферментная реакция в диагностике гельминтозов. // Труды всесоюзного ордена трудового красного знамени ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. 1988. -т.29. - с.8-22.

6. Бочарова М.М. Эколого-популяционный анализ трематод D.lanceatum, Stiles et Hassal, 1885, F. hepatica L., 1758, и их хозяев в условиях северных склонов Центрального Кавказа и Восточного Предкавказья: дисс.докт.биол. наук. М., 1996. - 546с.

7. Веренич С.И. Получение антигена для диагностики фасциолеза. // Вет наука производству. - Минск. - 1993. — выпуск 31.- с.136-137.

8. Гламаздин И.Г. Диагностика цистицеркоза крупного рогатого скота иммуноферментной реакцией: дисс.канд. вет. наук. — М., 1990. 144с.101

9. Гламаздин И.Г. Цистицеркозы жвачных и свиней, тениидозы плотоядных (физико-химическая характеристика антигенов возбудителей, иммуногенез и принципы иммунодиагностики): дисс.док. вет. наук. — М., 2005.-333с.

10. Ершов B.C., Наумычева М.И., Михайлов П.Н. Иммуноферментный анализ и его применение в паразитологии. // Труды всесоюзного ордена трудового красного знамени ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. — 1983. -Т.26. — с.47-53.

11. Золоткова Т.С., Новак М.Д. Пути повышения эффективности диагностики ' фасциолеза животных. // Труды Костромской государственнойсельскохозяйственной академии. Кострома. - 2001. - выпуск 59. - с. 1924.

12. Кленова И.Ф., Яременко H.A., Горохов В.В., Тайчинов У.Г., Воличев А.Н, Любавин B.C. Проблема гельминтозов животных в современных условиях. // Труды Всероссийского ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. 2002. - т.38. - с.53-77.

13. Клименко В.В., Лукеш Ш. Перспективы использования иммуноблоттинга для дифференциальной диагностики. // Труды Всероссийского ин-таIгельминтологии им. К.И. Скрябина. 2004. - т.40. - с. 125-138.

14. Клименко В.В. Объективные факторы, ограничивающие диагностическую эффективность паразитарных антигенов, и пути их преодоления. // Труды Всероссийского ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. 2004. - т.40. - с.116-124.

15. Клименко В.В. Иммунохимический анализ антигенов гельминтов, способы их получения и перспективы практического использования. // Труды Всероссийского ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. 2002.-т.38. с.78-129.

16. Клименко В.В. Опыт использования биоспецифической адсорбционной (аффинной) хроматографии для очистки диагностических гельминтов. //

17. Труды Всероссийского ин-та гельминтологии им; К.И; Скрябина. — 2000. •-Т.36.--С.65-81.

18. Клименко В.В; Обнаружение в желчи специфического антигена Fasciola hepatica диагностический критерий фасциолеза. // Паразитология. - JI:

19. Наука. 1980. - т. 14. - вып.5. - с.444-451.

20. Клименко В.В. Сравнительное исследование антигенной активности белковых экстрактов фасциол и продуктов их метаболизма. // Труды всесоюзного ордена трудового красного: знамени ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. 1977. -т.23. - с.75-81.

21. Клименко В.В. Получение антигенных препаратов из БаБсшк Ьерайса и Раэсюк gigantica и их испытание при экспериментальном фасциолезе. // В кн.: Иммунитет сельскохозяйственных животных. М.: Колос. - 1973. -с.296-299.

22. Клименко В.В. Разделение и характеристика* функциональных антигенов Раясюк Ьерайса и РаБсю1а gigantica. // Труды всесоюзного ордена трудового красного знамени ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. -1971. т. 18. - с. 129-143.

23. Клименко В.В. Исследование динамики антител при экспериментальном фасциолезе овец. // Труды всесоюзного ордена трудового красного знамени ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. 1971. - т.18. - с.145-151.

24. Клименко В.В. Содержание белка в экстрактах РаБсЫа Иерайса и РаБсю1а gigantica и некоторые факторы, влияющие на его определение. // Труды всесоюзного ордена трудового красного знамени ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. 1969. -т.15. - с.153-158.

25. Котельников Г.А. Гельминтоовоскопические исследования животных и | окружающей среды. М.: Колос, 1984. - с.7-9.

26. Кошеваров Н.И. Распространение трематодозов крупного рогатого скота в нечерноземной зоне России. // Труды Всероссийского ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. 2006. - т.42. - с. 158-162.

27. Кузьмичев В.В. Фасциолез животных в Центральном районе Нечерноземья Российской Федерации (эпизоотология, динамика формирования микропаразитоценозов, патогенез, лечение): Автореф. дис.док. вет. наук. Уфа, 1997. - 40с.

28. Мартыненко Л.Д., Лысенко А.Я., Васильев В.И. Реакция энзиммеченныхантител в иммунодиагностике паразитарных болезней. Сообщение 5.

29. Тест-система для диагностики фасциолеза. // Медицинская паразитология104и паразитарные болезни. Москва: - Медицина. — 1982. — т.60. - № 6. — с.41-46.

30. Мартыненко Л. Д., Клименко В!В. Разработка тест-системы для ^ диагностики фасциолеза на основе реакции энзим-меченных антител. //

31. Бюллетень всесоюзного ордена трудового красного > знамени ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. 1981. — вып.ЗО. - с.52-55.

32. Михайлов А.Т., Симирский В.Н. Методы иммунохимического анализа,в биологии развития. // М.: Наука. 1991. - 288с.

33. Написанова Л.А. Диагностическая эффективность иммуноферментных тест-систем (ИФР и дот-ИФА) при трихинеллезе свиней: Автореф. дис. . канд. биол. наук. — М., 2004. -24с.

34. Онуфриенко М.Э. Диагностика фасциолеза крупного рогатого скота. // Ветеринария. 2003. - № 3. - с.30-33.

35. Петров Ю.Ф., Абдуллаев Х.С., Кузнецов В.М., Кузьмичев В.В., Садов , K.M., Еремеева О.Р. Распространение трематодозов крупного рогатого ^ скота в центральных районах Нечерноземья РФ Данные за 1975-2005 гг.

36. Труды Всероссийского ин-та гельминтологии — 2006 т.44. - с. 182-186.

37. Савицкий И.Г., Бенедиктов И.И. Иммуноферментный анализ антигенных фракций Dicrocoelium lanceatum. // Труды всесоюзного ордена трудового1.105красного знамени ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. — 1989. — т.ЗО. -с.105-111.

38. Сивкова Т.Н. Диагностическая эффективность ELISA и dot-ELISA с антигенами клеточных культур при цистном гидатидозе Эхинококкоз.: Автореф. дис.канд. биол. наук. М., 2002. — 24с.

39. Тимербаева P.P. Использование иммунологических методов в диагностике фасциолеза крупного рогатого скота. // Матер, науч.-практ. конф., посвящ. 75-летию образования зооинженер. Факультета. — Казань. -2005. -с.185-187.

40. Трус И.А. Изучение эффективности аллергической диагностики фасциолеза крупного рогатого скота. // Вет наука — производству. — Минск. 2007. - выпуск 39. - с.256-262.

41. Шемякова С.А. Иммунодиагностика острого фасциолеза крупного роатого скота. // Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии, сборник научных трудов молодых ученых. — Москва. 2006. - выпуск 3. - с. 123124.

42. Шемякова С.А. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) для диагностики фасциолеза крупного рогатого скота. // Труды Всероссийского ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. Москва. -2004. - т.40. — с.402-404.

43. Шемякова С.А. Сопоставление результатов серологического, копроовоскопического и послеубойного исследований крупного рогатогоскота на фасциолез. // Труды Всероссийского ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. Москва. - 2007. - т.45. - с.270-275.

44. Уркхарт Г. Ветеринарная паразитология: Учебник / пер. с англ. М.: Аквариум ЛТД, 2000. - 3 52с.

45. Яременко Н.А., Кленова И.Ф., Горохов В.В., Сорокина Н.П., Молчанов И.А. Эпизоотологический анализ фасциолеза крупного рогатого скота. // Ветеринария. 2005. - № 4. - с.30-31.I

46. Abrous M., Rondelaud D., Dreyfuss G. Paramphistomum daubneyi and Fasciola hepatica: influence of temperature changes on shedding of cercariae from dually infected Lymnaea truncatula. // Parasitol. Res. 1999. - v.85(8/9). -p.765-769.

47. Afshar A., Dubuc C., Dulac G.C., Thomas F.C., Nielsen K., Henning D. Dotimmunoperoxidase assay using monoclonal antibody for detection of bluetongue virus antigens. // J. Virol. Methods. 1991. - v.31. - p. 105-112.

48. Allan J.C., Avila G., Garcia N.J., Flisser A., Craig P.S. Immunodiagnosis of taeniasis by coproantigen detection. // Parasitology. 1990. - v. 101. - p.473-477.

49. Almazan C., Avila G., Quiroz H., Ibarra F., Ochoa P. Effect of parasite burden on detection of Fasciola hepatica antigens in sera and feces of experimentally infected sheep. // Veterinary parasitology. 2001. - v.97. - p.101-112.

50. Anderson N., Luong T.T., Vo N.G., Bui K.L., Smooker P.M., Spithill T.W. The sensitivity and specificity of two methods for detecting Fasciola infections in cattle. // Veterinary parasitology. 1999. - v.83. - p.l5-24.

51. Veterinary parasitology. 1989. - v.30. - p.l97-203.107

52. Augot D., Rondelaud D., Dreyfuss G., Cabaret J. Fasciola hepatica: in vitro production of daughter rediae and cercariae from first and second generation rediae. // Parasitol. Res. 1997. - v.83. - № 4. - p.383-385.

53. Barbieri M., Sterla S., Battistoni J., Nieto A. High performance latex reagent for hydatid serology using an Echinococcus granulosus lipoprotein antigen fraction purified from cyst fluid in one step. // Int. J. Parasit. — 1993. v.23.p.565-572.

54. Barsoum I.S., Kamal K.A., Bassily S., Deelder A.M., Colley D.G. Diagnosis of human shistosomiasis by detection of circulating cathodic antigen with monoclonal antibody. // J. Infect. Dis. 1991. - v. 164. - p. 1010-1013.

55. Baronet D., Waltner-Toews D. Echinococcus granulosus infections in dogs of Kathmandu, Nepal. // Ann. Trop. Med. Parasitol. 1994. - v.88. - p.485-492.

56. Batteiger B., Newhall W.J., Jones R.B. The use of Tween 20 as blocking agent in the immunological detection of proteins transferred to nitrocellulose membranes. // J. Immunol. Methods. 1982. - v.55. - p.297-307.I

57. Berasain P., Goni F., McGonigle S., Dowd A., Dalton J.P., Frangione B., Carmona C. Proteinases secreted by Fasciola hepatica degrade extracellular matrix and basement membrane components. // J. Parasitol. 1997. - v.83. -p.1-5.

58. Biguet J., Capron A., Tranvanky P., Haussy P. Comparative immuno-electrophoretic study of antigen from various helminths. // C. R. Acad. Sci. -1962. v.254. -p.3600-3602.

59. Boctor F.N., Fabrid Z., El-Scherif N. Using whole bacteria, LPS and soluble antigens to detect IgG, IgM, IgA in human brucellosis by dot-ELISA with nitrocellulose as a solid phase. // Clin. Chemistry. 1987. - v.33. - p. 15701571.

60. Boray J.C., Pearson- I.G. The anthelmintic efficiency of tetrachlorodifluoroethane in sheep infected with Fasciola hepatica. // Aust. Vet. J. 1960. - v.36. - p.331-337.

61. Boray J.C. Studies on relative susceptibility of some lymnaeids to infection with F.hepatica and F.gigantica and on adaption of Fasciola spp. // Ann. Trop. Med. Parasitol. 1964. - v.60. -p.l 14-124.

62. Bossaert K., Farnir F., Leclipteux T., Protz M., Lonneux J.-F., Losson B.

63. Humoral immune responses in calves to single-dose, trickle and challengeinfections with Fasciola hepatica. // Veterinary parasitology. 2000. - v.87. -p.103-123.

64. Bulgin M.S., Anderson B.C. Serum gamma transpeptidase activity in cattle with induced fascioliasis. // Res. Vet. Sci. 1984. — v.37. — p.167-171.

65. Carmona C., Dowd A.J., Smith A.M., Dalton J.P. Cathepsin L proteinase secreted by Fasciola hepatica in vitro prevents antibody-mediated eosinophil attachment to newly excysted juveniles. // Mol. Biochem. Parasitol. 1993. -v.62. -p.9-17.i

66. Castro E., Freyre A., Hernandez Z. Serological responses of cattle after treatment and during re-infection with Fasciola hepatica, as measured with a dot-ELISA system. // Veterinary parasitology. 2000. - v.90. - p.201-208.

67. Castro E., Freyre A., Falcon D., Molinari C. Posibilidades del dot-ELISA para el diagnostico de la fascioliasis bovina. // Vet. Uruguay. — 1995. v.30. - p.8-16.

68. Castro J., Dumenigo B., Espino A.M. Detección de coproantigenos para evaluar infección active por Fasciola, hepatica en ganado bovino. // Parasitol. Dia. -1994. -v.l 8. -p.33-38.

69. Chapman C.B., Mitchell G.F. Proteolytic cleavage of immunoglobulin by enzymes released by Fasciola hepatica. // Vet. Parasitol. 1982. - v.ll. -p.165-178.

70. Chauvin A., Moreau E., Boulard C. Responses of Fasciola hepatica infected sheep to various infection levels. // Veterinary research. 2001. - v.32. — p.87-92.

71. Chauvin A., Bouvet G., Boulard C. Humoral and cellular immune responses tof

72. Fasciola hepatica experimental primary and secondary infection in sheep. // Int. J. Parasitol. 1995. — v.25. -p.1227-1241.

73. Clery D., Torgerson P., Mulcahy G. Immune responses of chronically infectedadult cattle to Fasciola hepatica. // Vet. Parasitol. 1996. - v.62. - p.71-82. i .

74. Cohen S., Warren K.S. Immunology of parastic infection, 2 edition. //

75. Blackwell Scientific, Oxford. 1982. -220pp.

76. Cordova M., Herrera P., Nopo L., Bellatin J., Naquira C., Guerra H., Espinoza J.R. Fasciola hepatica cysteine proteinases: immunodominant antigens in human fascioliasis. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1997. - v.57. -p.600-666.

77. Cordova M., Reategui L., Espinoza J.R. Immunodiagnosis of human fascioliasis with Fasciola hepatica cysteine proteinases. // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1999. - v.93. -p.54-57.

78. Dalton J.P., Heffernan M. Thiol proteases released in vitro by Fasciola hepatica. // Mol. Biochem. Parasitol. 1989. — v.15. - p.161-166.

79. De Jonge N., Fillie Y.E., Deelder A.M. A simple and rapid treatment (trichloroacetic acid precipitation) of serum samples to prevent non-specific reactions in the immunoassays of a proteoglycan. // J. Immunol. Methods. — 1987. —v.99. —p. 195-197.

80. Deplazes P., Eckert J., Paulowski S., Machowska L., Gottstein B. An enzyme-linked immunosorbent assay for diagnostic of Taenia saginata coproantigens in humans. // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1990. - v.85. - p.391-396.

81. Doy T.G., Hughes D.L. Fasciola hepatica: site of resistance to reinfection in' cattle. // Exp. Parasitol. 1984. - v.57. -p.274-278.

82. Doyle J.J. Acquired immunity to experimental infection with Fasciola hepatica in cattle. // Res. Vet. Sci. 1971. - v. 12. - p.527-534.

83. Dumenigo B.E., Espino A.M., Finlay C.M. Detection of Fasciola hepatica antigen in cattle faeces by a monoclonal-based sandwich immunoassay. // Res.

84. Vet. Sci. 1996. - v.60. - p.278-279.

85. Dumenigo B.E., Espino A.M., Finlay C.M., Mezo M. Kinetics of antibody-based antigen detection in serum and feces of sheep experimentally infected with Fasciola hepatica. // Veterinary parasitology. 1999. - v.86. - p.23-31.

86. Ellis T.M., Gregory A., Turnor M., Kalknoven M., Wroth R.H. Detection of Haemonchus contortus surface antigens in faeces from infected sheep. // Vet. Parasitol. 1993. - v.51. - p.85-97.

87. Espino A.M., Finlay C.M. Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for detection of excretory-secretory antigens in humans with fasciolosis. // J. Clin.

88. Microbiol.- 1994.-v.32.-p.190-193.

89. Espino A.M., Marcet R., Finlay C.M. Fasciola hepatica: detection of antigenemia and coproantigens in experimentally infected rats. // Experim. Parasitol. 1997. - v.85. -p.l 17-120.

90. Fagbemi B.O., Obarisiagbon I.O., Mbuh J.V. Detection of circulating antigen in sera of Fasciola gigantica-infected cattle with antibodies reactive with a Fasciola-specific 88-kDa antigen. // Veterinary parasitology. 1995. - v.58. -p.235-246.

91. Fagbemi B.O., Guobadia E.E. Immunodiagnosis of fasciolosis in ruminants ' using a 28-kDa cysteine protease of Fasciola gigantica adult worms. //

92. Veterinary parasitology. 1995. - v.57. - p.309-318.

93. Fagbemi B.O., Hillyer G.V. The purification and characterization of a cysteine protease of Fasciola gigantica adult worms. // Vet. Parasitol. — 1992. v.43. -p.223-232.

94. Ferre I., Lopez P., Gonzalo-Orden M., Julian M.D., Rojo-Vazquez F.A., Gonzalez-Gallego J. The effects of subclinical fasciolosis on hepatic secretory function in sheep. //Parasitol. Res. 1995a. - v.81. - p. 127-131.

95. Ferre I., Ortega-Mora L.M., Rojo-Vazquez F.A. Seroprevalence of Fasciola hepatica infection in sheep in northwestern Spain. // Parasitol. Res. 1995b. -v.81. -p.137-142.

96. Gundlach J.L., Sandizikowaski A. Precipitin dynamics and use of sérodiagnostic reactions of immunoelectroprecipitation and double diffusion in fasciolosis in sheep. // Medycyna-Weteiynaryjan. 1980. — v.36. -p.21-26.

97. Guobadia E.E., Fagbemi B.O. Time-course analysis of antibody response by EITB and ELISA before and after chemotherapy in sheep infected with Fasciola gigantica. // Veterinary parasitology. 1995. - v.58. - p.247-253.

98. Halton D.W. Observations on the nutrition of digenetic trematodes. // Parasitology. 1967. - v.57. -p.639-660.

99. Hanna E.R., Hillyer G.V. Fasciola hepatica and Schistosoma mansoni: I immunoflourescent antigen localization and cross-reactivity. // Exp. Parasitol.1984.-v.57.-p.1-4.

100. HannaE.R.B., Hughes D.E., Taylor S.M. Fasciola hepatica: antibody levels in sheep serum before and after treatment with anthelmintic. // Res. Vet. Sci. —1.1982. v.33. -p:328-332.

101. Hanna E.R.B'. Fasciola-hepatica: glycocalyx replacement in the juvenile as possible mechanism^ for protection against host immunity. // Exp: Parasitol. — 1980a. v.50. — p.103-114*.

102. Hanna E.R.B'. Fasciola hepatica: an immunofluorescent study of antigenic changes in the tegument during development in the rat and. the sheep. // Exp. Parasitol. 1980b. - v.50. - p. 155-170.

103. Haroun E.M., Hillyer G.V. Resistance to fascioliasis A review. // Vet. Parasitol. - 1986. - v.20. - p.63-93.

104. Hardman E., Jarvis H.M. Nitrocellulose-based assays for the detection of glucolipids and other antigens: mechanism of binding to nitrocellulose. // J. Immunol. Methods. 1985. - v.33. -p.l 13-123.

105. Hawkes R., Niday E., Gordan J.A. A dot immunobinding assay for monoclonal and other antibodies. // Analyt. Biochem. 1982. - v. 119. - p. 142147.

106. Hillyer G.V., Galanes M.S. Identification of potential sérodiagnostic Fasciola hepatica antigens by electroelution by polyacrylamide gels. // Am. J. Trop. Med. Hyg.- 1988. — v.32. -p.1210-1217.

107. Hillyer G.V., Sanchez Z.D. Immunodiagnosis of bovine fascioliasis by enzyme linked immunosorbent assay and immunoprecipitation methods. // J.

108. Parasitol. 1985. - v.71. -p.449-454.113

109. Hillyer G.V., Santiago de Weil N. Use of immunologic techniques to detect chemotherapeutic success in infections with Fasciola hepatica. The enzymej linked immunosorbent assay in infected rats, and rabbits. // J*. Parasitol. — 1979.- v.65. p.680-684.

110. Hughes D.L., Hanna R.E.B., Symonds H.W. Fasciola hepatica: IgG and IgA levels in serum and bile of infected cattle. // Exp. Parasitol. 1981. - v.52 — 'p.271-279,

111. Ibarra F., Montenegro N., Vera Y., Boulard C., Quiroz H., Flores J., Ochoa P. Comparison of three ELISA tests for seroepidemiology of bovine fasciolosis. // Veterinary parasitology. 1998. - v.77. -p.229-236.

112. Jonson M.J., Benke J.M. Detection of gastrointestinal nematodes by a | coproantigen capture ELISA. // Res. Vet. Sci. 1996. - v.60. - p.7-12.

113. Keegan P.S., Trudgett A. Fasciola hepatica in the rat: immune responses associated with the development of resistance to infection. // Parasite Immunol.- 1992. v.14. -p.657-669.

114. Langley R.J., Hillyer G.V. Detection of circulating immune complexes by enzyme-linked immunosorbent assay in sera from cattle infected with Fasciola hepatica. // J. Parasitol. 1989a. - v.75. - p.690-695.

115. Langley R.J., Hillyer G.V. Detection of circulating parasite antigen in murine fasciolosis by two-site enzyme-linked immunosorbent assays. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1989b. -v.41. -p.480-486.

116. Lee C.G., Zimmerman G.L., Mulrooney D.M. Isoelectric focusing of soluble proteins from Fasciola hepatica L, 1758 and Fascioloides magna B, 1975. // Am. J. Vet. Res. 1992. - v.53. - p.246-250.

117. Levieux D., Levieux A. Early immunodiagnosis of caprine fasciolosis using the specific £2 antigen in a passive hemagglutination test. // Vet. Parasitol. — 1994. -v.53. -p.59-66.

118. Levieux D., Levieux A., Mage C., Garel J.P. Immunological detection ofchemotherapeutic success in bovine fascioliasis using the specific antigen F2. //

119. Vet. Parasitol. 1992. - v.45. -p.81-88. 1 114

120. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.I., Randall R.J. Protein measurement with Folin-phenol reagent. I I Journal biological chemistry. 1951 — v. 193. -p.265-275.

121. Maisonnave J. Standardization of a dot immunoperoxidase assay for field diagnosis of Fasciola hepatica infected cattle. // Veterinary parasitology. -1999: v.85. - p.259-268.

122. Maisonnave J., Hernandez S., Rossi S., Acosta D., Yarzabal L. Immunodiagnostico de fascioliasis. // Proc. 3rd Cong. Latin american Assoc. of Immunology (ALAI), 15-17 April, Santiago, Chile. 1993. - p. 101.

123. Mandal S., Yadav S.C., Sharma R.L. An evaluation of seroreactivity of antigenic preparations of Fasciola gigantica in goats. // Indian journal of animal sciences. v.69. -№11.- p.875-879.

124. Martin S.W., Meek A.H., Willeberg P. (Eds.) Measurements of disease frequency and production. // In: Veterinary epidemiology, Iowa State University Press, Ames. 1987. -p.48-76.

125. McKerrow J.H. Parasite proteases. // Exp. Parasitol. 1989. - v.68. - p. 111 -115.

126. Moreau E., Chauvin A., Boulard C. IFNy and IL-10 production by local and peripheral lymphocytes in Fasciola hepatica infected sheep. // Parasite. 1998. - v.5. -p.307-315.

127. Mousa W.M. Evaluation of cercarial antigen for the serodiagnosis of fasciolosis in experimentally and naturally infected sheep. // Veterinary parasitology. 2001. - v.91. - p.47-54.

128. Mousa W.M., Fouad S., Saad A., Saad A.H. Evaluation of the different development stages of F. gigantica for serodiagnosis of human fascioliasis. // Egypt J. Immunol. 1996. - v.3. - № 1. - p.63-68.

129. Nati A., Cárdozo H. Prevalencia y distribución geográfica de la fascioliasis hepato-billiar en bovines de carne del Uruguay. // Veterinaria, Uruguay. 1976: -v.13.-p.H-16.

130. Neyra V., Chavarry E., Espinoza J.R. Cysteine proteinases Fas 1 and Fas2 are diagnostic markers for Fasciola hepatica infection in alpacas (Lama pacos). // Veterinary parasitology. — 2002. — v. 105. p.21-32.

131. Nodet P., Grange J., Fevre M. Dot-blot. assays and their use as direct antigenbinding method to screen monoclonal antibodies to 1,4-B and 1,3-B glucan sunthases. // Analyt. Biochem. 1988. - v. 174. - p.662-666.

132. Ortiz P.L.,1 Cláxton JiRl, Clárksonf M:J:, McGany J;, Williams. D;Ji Specificity of antibody responses in cattle: naturally exposed to Fasciola hepatica. // Vet. Parasitol. 2000. - v.93. - p.121-134.

133. Pappas M.G. Recent applications of the Dot-ELISA in immunoparasitology. // Vet. Parasitol. 1988. - v.29. - p.105-129.

134. Pappas M.G., Hajkowski R., Hockmeyer; W.T. Dot enzyme-linked immunosorbent assay (dot-ELISA): a micro technique for the rapid diagnosis of visceral leishmaniasis. // J. Immunol. Methods. 1983. —v.64. -p.205-214.

135. Prosad S., Thraves P. A dot-blot method for screening polyclonal and monoclonal antisera to poly (ADP-ribose). // J. Immunol. Methods. 1989. -v.116. — p.79-85.

136. Quiroz R.H. Impacto economico, epidemiología, control y prevención de Fasciola hepatica en la ganadería. // En: Trematodiasis Transmitidas por Alimentos: Epidemiología, Manejo Clinico y Control. Ed. OPS-OMS, Santiago de Chile. 1995. -pp.81-101.

137. Randall G.R., Goldsmith R.S., Shek J., Mehalko S., Haneyman D. Use of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of Entamoeba histolytica antigen in feacal samples. // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. — 1984. v.78. - p.593-595.

138. Rickard L.G. Development of a dot-ELISA test for detection of serum antibodies to Fasciola hepatica antigens in llamas. // Veterinary parasitology. -1995.-v.58.-p.9-15.

139. Rivera Marrero C.A., Santiago N., Hillyer G.V. // J. Parasitol. 1998. -v.74(4). - p.646-652.

140. Rodriguez-Perez J., Hillyer G.V. Detection of excretory-secretory circulating antigens in sheep infected with Fasciola hepatica and with Shistosoma mansoni and Fasciola hepatica. // Vet. Parasitol. 1995. — v.56 — p.57-66.

141. Ross J.G. Experimental infections of cattle with Fasciola hepatica. Challenge infections. //Nature. 1966. - v.212. -p.1464-1465.

142. Sampaio-Silva M.L., Da Costa J.M., Da Costa A.M., Pires M.A., Lopes S.A., Castro A.M., Monjour L. Antigenic compounds of excretory-secretory products of adult F.hepatica recognized in human infections. // Am. J. Trop.

143. Med. Hyg. 1996. - v.54. 2. -p.146-148.117

144. Sanches-Andrade R., Morondo P., Lopez C., Panadero R., Diez P. Evaluation of Fasciola hepatica infection prevalence in cattle in Galicia (Northwest Spain) by enzyme linked immunosorbent assay. // Res. Rev. Parasitol. 1995. - v. 55. -p.103-107.

145. Sandeman R.M., Howell MJ. Response of sheep to challenge infection with Fasciola hepatica. // Res. Vet. Sci. 1981. - v.30. - p.294-297.

146. Sandeman R.M., Howell M.J. In vitro studies of the response of sheep to infection with Fasciola hepatica. // Vet. Parasitol. 1980. - v.6. - p.347-357.

147. Santiago de Weil N., Hillyer G.V. Antibody profiles by EITB and ELISA of cattle and sheep infected with Fasciola hepatica. // J. Parasitol. 1988. - v.74 — № 5. — p.810-818.

148. Santiago de Weil N., Hillyer G.V. Isolation of potential serodiagnosis of F.hepatica antigens by electro-elution from polyacrylamide gels. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1986. - v.35. 6. -p.1210-1215.

149. Scicchitano R., Husband A. J., Cripps A.W. Biliary transport of serum IgA in sheep. //Immunology. 1984. -v.53. -p.121-129.

150. Smith A.M., Dowd A.J., Heffernan M., Robertson C.D., Dalton J.P. Fasciola hepatica: a secreted cathepsin L-like proteinase cleaves host immunoglobulin. // Int. J. Parasitol. 1993. - v.23 -p.977-983.

151. Sood M., Kaur G., Parmar A., Kapur J. Development of Dot-ELISA for detection of Haemonchus contortus antigen. // Helmintology. 1996. - v.33. -p.73-75.

152. Soulsby E.J.L. Textbooks of veterinary clinical parasitology. I. Helminths. // Blackwell Scientific, Oxford. 1965. - 1120pp.

153. Spithill T.W., Peidrafita D., Smooker P.M. Immunological approaches forthe control of fasciolosis. // Int. J. Parasitol. 1997. - v.27. - p.1221-1235.118

154. Straus W., O'Neill S.M:, Parkinson M., Angles R., Dalton J:P. Short report: diagnosis of human fascioliasis: detection of anti-cathepsin L antibodies« in blood samples collected on filter paper. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1999: — v.60. -p.746-748.

155. Stephenson W. Physiological and histochemical observations on the adult liver fluke, Fasciola hepatica L. // Parasitology. 1947a. - v.38. - p.l 16-122.

156. Stibbs H.H., Mansour S., Foster M. Enzyme immunoassay for detection of Giardia lamblia cyst antigen in formalin-fixed and unfixed human stool. // J. Clin. Microbiol. 1988. -v.26. - p. 1665-1669.

157. Swarup D., Pachauri S.P., Sharma B., Bandhopadhyay S.K. Serodiagnosis of Fasciola gigantica infection in bufalloes. // Vet. Parasitol. 1987. - v.24. -p.67-74.

158. Thienpont D., Rochette F., Vanparijs O.F. Diagnosing helminthiasis through coprological examination. // Janssen Reseach Foundation, Beerse, Belgium. -1979. 180pp.

159. Tsang V.C., Peralta J.M., Simmons A.R. Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot technique (EITB) for studying the specificities and antibodies separated by gel electrophoresis. // Methods Enzymol. 1983.• v.92. — p.377-391.

160. Vertosich F.T., Kelly R.H. Antibodies to native and denatured DNA. Quantitation using on immuno slot-blot technique. // J. Immunol. Methods. -1987.-v. 102.-p. 15-21.

161. Wassail D.A., Sinclair I J. The serum antibody response of infected rats, rabbits, lambs and calves to Fasciola hepatica adult antigen fractions separated by preparative flatbed iso-electrofocussing. // Parasite Immunol. 1985. - v.7. -p.359-366.

162. Warburg O., Christian W. Isolierung und kristallisattiondes Garunsferments Enolase. // Biochem. Z. 1941. - v.310. - s.384-421.

163. Wedrychowicz H., Turner K. Antibody isotypes involved in local and« systemic humoral-response in rats to primary and secondary infections with Fasciola hepatica. // Acta parasitologica — Polonica. 1987. - v.32. - p.369382.

164. Welch R.D., Smith P.H., Malone J.B., Holmes R.A., Geaghan J.P. Herd evalution of Fasciola hepatica infection levels in Louisiana cattle by an enzyme-linked immunosorbent assay. // Am. J. Vet. Res. 1987. - v.48. -p.345-347.

165. Wycoff J.H., Bradley R.E. An optimised enzyme-linked immunosorbent assay for quantitative diagnosis of bovine fascioliasis. // J. Parasitol. — 1986. — v.72. — p.439-444.

166. Yadav S.C., Gupta S.C. Immune response of goats against Fasciola giganticai irradiated metacercariae. // Journal of veterinary parasitology: 1989. — v.3. p.121-123.

167. Yamasaki A., Hiroshi H., Aoki T., Aya H. A cysteine proteinase from the liver fluke Fasciola spp.: purification, characterization, localization and application to immunodiagnosis. // J. Parasitol. 1989. - v.38. - № 6. — p.373-384.

168. Zimmerman G.L., Nelson M.J., Clark C.R.B. Diagnosis of ovine fascioliasis by a dot enzyme-linked immunosorbent assay: a rapid microdiagnostic technique. // Am. J. Vet. Res. 1985. - v.46. -p.1513-1515.

169. Zimmerman G.L., Hjen L.W., Cerro J.W., Farasworth B.S., Wescott R.B. Diagnosis of Fasciola hepatica infections in sheep by an enzyme-linked immunosorbent assay. // Am. J. Vet. Res. 1982. - v.43. - p.2097-2100.

170. Zimmerman G.L., Nelson M.J. Diagnosis of ovine-fascioliasis by a dot enzyme-linked immunosorbent assay: a rapid microdiagnostic technique. // Am. J. Vet. Res. 1981. - v.42. -p.237-240.

Информация о работе

Коробов, Артем Игоревич
кандидата ветеринарных наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.11

Диссертация

Разработка диагностических тест-систем при фасциолезе крупного рогатого скота на основе иммуноферментного анализа - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы