Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка биоинформационной модели апоптоза и некроза у растений

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка биоинформационной модели апоптоза и некроза у растений"

На правах рукописи

ГРИНБЛАТ АНТОН ИОСИФОВИЧ

РАЗРАБОТКА БИОИНФОРМАЦИОННОЙ МОДЕЛИ АПОПТОЗА И НЕКРОЗА У РАСТЕНИЙ

03 00 23 — Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

□ОЗигигио

Орел - 2007

003070706

Работа выполнена на базе Орловского регионального центра биотехнологии ФГОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Павловская Нинэль Ефимовна

доктор биологических наук, профессор Таканаев Александр Абдуллаевич,

кандидат сельскохозяйственных наук, Джигадло Михаил Иосифович

Ведущая организация:

ГНУ ГНЦ Всероссийский научно-исследовательский институт зернобобовых и крупяных культур РАСХН

Защита состоится 30 мая 2007 г в 14 30 часов на заседании диссертационного совета КМ 220 052 01 в ФГОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет» по адресу 302019, г Орел, ул Генерала Родина, 69

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Орловского государственного аграрного университета

Автореферат разослан « » дус^игл-р 2оо?т

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат сельскохозяйственных наук, доцент

Макеева Т Ф

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы До изобретения компьютеров изучение биологических явлений основывалось на экспериментах in vivo и in vitro С появлением и развитием ЭВМ, компьютерный анализ превратился в самостоятельную область науки - биоинформатику Исследования in silico, то есть в компьютере, уже. привели ко многим важным достижениям биоинформатики

Представляемая работа посвящена разработке биоинформационной системы на базе результатов собственного эксперимента, связанного с различными формами клеточной гибели в растениях, такими как некроз и апоптоз

У растений относительно давно доказано существование запрограммированной гибели клеток (ЗГК), в том числе и апоптоза Однако изучение ЗГК растений до сих пор слабо развито из-за малого удельного веса биохимии растений в естественных науках и сильного перевеса активности исследований в области ЗГК животных и человека Изучение апоптоза у растений - относительно новая и потому еще слабо наполненная данными область науки До недавнего времени существование запрограммированной гибели клеток часто не только игнорировали, но иногда и вовсе не признавали, подобно тому, как существование биологических часов и генов смерти вообще считались абсурдным и это также является причиной неполноты данных в области ЗГК вообще и апоптоза у растений в частности Исследование механизмов старения и гибели клетки откроет возможность управления временем жизни и создания препаратов-фитоиммуномодуляторов направленного действия

Цель н задачи исследований. Цель работы - разработать биоинформационную модель апоптоза и некроза растений на примере пшеницы и гороха Задачи

1 Исследовать антиоксидантную систему пшеницы и гороха в норме, при апоптозе и при некрозе

2 Исследовать влияние апоптоза и некроза на фрагментацию ДНК методом ПЦР-анализа

3 Установить влияние биотических факторов на проявления апоптоза и некроза у пшеницы и гороха

4 Установить влияние абиотических факторов на проявления апоптоза и некроза у пшеницы и гороха

5 Установить влияние апоптоза и некроза на состав белков пшеницы и гороха

6 На основе полученных данных идентифицировать тип клеточной гибели в опадающих плодоэлементах люпина.

7 Разработать компьютерный программный комплекс для администрирования и обработки собственных экспериментальных данных

8 Создать биоинформационную модель апоптоза и некроза пшеницы и гороха

Научная новизна работы Впервые на примере растений проведен достаточно широкоспектрапьный динамический биохимический анализ процессов естественного и индуцированного апоптоза и некроза, вызванного как биотическими, так и абиотическими факторами Впервые на основе корреляционного и дифференциального анализа построена биоинформационная модель апоптоза и некроза растений

Практическая значимость работы. Изучение механизмов запрограммированной и спонтанной гибели клеток растения и базированная на полученных данных разработка средств управления обеими формами гибели клеток растения имеют крайне важное значение как для фундаментальной, так и для прикладной биотехнологии Контроль над некрозом и апоптозом позволит повышать устойчивость растений к патогенам, увеличивать урожайность сельскохозяйственных культур, бортоться с сорной растительностью, ускорять или увеличивать синхронность созревания урожая, обеспечит возможность управлять длительностью вегетационного периода и упростит работу селекционеров

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на научно-методической конференции "Физиологические аспекты продуктивности растений", Орел 2004, на 2 съезде Общества биотехнологов России им Ю А Овчинникова, Москва, 2004, на 4 съезде Общества биотехнологов России им Ю А Овчинникова, Пущино, 2006 и на конференции, посвященной 40-летию отдела биохимии и молекулярной биологии ВИР им НИ Вавилова, С -Петербург, 2007

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 1 патент на изобретение

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 156 листах компьютерного текста, 88 страницах приложений и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, предложений производству, списка литературы, включающего 58

отечественных и 93 иностранных источников Работа иллюстрирована 79 таблицами и 146 рисунками

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Диссертационная работа выполнена в период с 2003 по 2006 гг. в рамках программы 04 02 01 РАСХН "Разработать новые эффективные методы оценки мирового разнообразия культурных растений по признакам качества, устойчивости к неблагоприятным абиотическим факторам среды, болезням и вредителям"

Экспериментальная работа проводилась на базе Орловского регионального центра биотехнологии ФГОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет»

Материалом исследований являлись образцы пшеницы, гороха и люпина селекции ВНИИ ЗБК Схема эксперимента представлена на рис 1 на следующей странице

Активность супероксиддисмутазы определяли фотохимическим методом (С N Giannopohties, S К Ries, 1977) на приборе, разработанном автором (патент № 2293969), активность пероксидазы -спектрофотометрическим методом по Бояркину (А И Ермаков, 1983), активность каталазы - волюмометрическим методом (А И Ермаков, 1983) Все методы анализа активностей ферментов были модифицированы

Концентрации витамина С и глутатиона определяли методом Петта в модификации Прокошева (H H Третьяков, 1990)

Для определения концентрации токоферола была использована объединенная спектрофотометрическая методика (ГОСТ 30417-96, 1996 и www sibpatent ru, 2006)

Анализ белковых фракций проводили методом SDS-ПААГ электрофореза (А В Конарев и др 2000), анализ ДНК - методом ПЦР в модификации, статистическую обработку результатов проводили методами дисперсионного анализа с использованием компьютерных программ «Excel», «Biotest-D» и собственного программного комплекса соискателя (разд 9)

Биоинформационная модель была построена с помощью встроенных в "Excel" функций статистической обработки данных

естеств апоптоз (в колеоптиле)

общий контроль (лист)

некроз, индуцированный ионами кадмия

индуцированныи апоптоз (6-БАП изб)

контроль по В-БАП - конц, близкая к 1п уто

индуцирование апоптоза экстрактом колеоптилей пшеницы

Рис 1 Схема эксперимента

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I Контрольный процесс апоптоза в колеоптиле пшеницы

В качестве контрольного процесса был изучен апоптоз в колеоптиле пшеницы Также для контроля были изучены процессы нормальной жизнедеятельности листьев гороха и пшеницы

В качестве абиотических факторов воздействия на экспериментальные растения использовались ионы кадмия (индуктор некроза), 6-БАП в избытке (индуктор апоптоза), 6-БАП с концентрацией, близкой к m vivo (контроль)

В качестве биотических факторов воздействия на экспериментальные растения использовались экстракт колеоптилей пшеницы (индуктор апоптоза в горохе), экстракт листьев гороха (ингибитор апоптоза в пшенице), культуры грибов Fusarium oxysporum (потенциальный индуктор некроза), Ascochyta pisi (индуктор некроза в горохе) После завершения эксперимента данные были отфильтрованы, нормированы и включены в биоинформационную модель

1 1 Высокомолекулярные антиоксид анты при апоптозе

СОД —в—каталаза А пероксидаза

г, сут

Рис 2 Динамика активности высокомолекулярных антиоксидантов при апоптозе в колеоптиле пшеницы

Полученные данные показали (рис 2), что в течение 9 суток в колеоптилях пшеницы резко падает активность супероксиддисмутазы

- это может служить одним из признаков апоптоза Возможно, супероксиддисмутаза разрушается активирующимися в процессе характерного для апоптоза каспазного каскада сериновыми и цистеиновыми протеазами или действие супероксиддисмутазы блокируется специфичными ингибиторами указанного фермента Индуцированное снижение активности супероксиддисмутазы приводит к накоплению супероксидных радикалов, что способствует супероксидной деструкции компонентов клетки Контролируемую внутриклеточными химическими механизмами супероксидную деструкцию компонентов клетки можно считать одной из "подпрограмм" апоптоза известно, что при инкубации проростков пшеницы в условиях недостатка супероксид-радикалов в колеоптилях апоптотическая фрагментация ДНК блокируется полностью (Б Ю Шорнинг и др , 2000)

Пероксидазная система клеток колеоптилей пшеницы при апоптозе активно работает до 8-9 суток - значения активности растут, проходя через максимум, а затем активность начинает медленно снижаться до момента гибели, что можно считать антиоксидантным маркером апоптоза Первоначальное прохождение пероксидазной активности через максимум можно объяснить апоптотическим усилением перекисной деструкции низкомолекулярных компонентов антиоксидантной системы, являющихся субстратами пероксидазы Низкомолекулярные антиоксиданты и пероксидаза входят в единую систему антиоксидантной защиты растений

Пероксидаза, являясь окислительно-восстановительным ферментом, контролирует уровень перекиси водорода и низкомолекулярных антиоксидантов в колеоптилях пшеницы При этом низкомолекулярные антиоксиданты могут регулировать активность пероксидазы, осуществляя, таким образом, общий контроль над деятельностью системы антиоксидантной защиты, плавно отключаемой в период апоптоза за счет перекисной деструкции низкомолекулярных антиоксидантов и снижения активности пероксидазы после прохождения через максимум

Из полученных данных можно сделать вывод о том, что накопление перекисей в колеоптиле на начальных стадиях апоптоза (38 сут) тормозится повышающейся активностью пероксидазы, затем, (8-е сутки и далее) пероксидазная активность снижается в связи с отсутствием необходимости дезактивации пероксидов в прогрессирующих условиях клеточной гибели, а также с целью накопления перекисей в помощь аутодеструкции клетки

Активность каталазы растет до максимума в 4-е сутки жизни колеоптиля, затем начинает практически линейно падать Первоначальное повышение активности каталазы может иметь компенсаторный характер и являться следствием падения активности супероксиддисмутазы

Возможно, каталаза разрушается активирующимися в процессе каспазного каскада сериновыми и цистеиновыми протеазами или действие каталазы блокируется избытком субстрата, или другими ингибиторами указанного фермента Индуцированное снижение активности каталазы приводит к накоплению пероксидов, возможно, необходимых пероксидазе для дезактивации низкомолекулярных антиоксидантов, способных реактивировать оксидоредуктазы Снижение активности каталазы при апоптозе, также как и снижение активности пероксидазы, начинающееся по времени несколько позднее, свидетельствует о прекращении каталитической деструкции перекисей в программировано отмирающей клетке

1 2 Низкочочекулярные антиоксиданты при апоптозе

аскорбат-•-глутатион токоферот

t, сут

Рис 3 Динамика активности низкомолекулярных антиоксидантов при апоптозе в колеоптиле пшеницы

В процессе апоптоза наблюдается обеднение колеоптилей всеми изученными нами низкомолекулярными антиоксидантами (рис 3) Особенно четко это прослеживается на глутатионе, где после всплеска

концентрации до 9.21 мг% в 4-е сутки жизни колеоптиля, содержание глутатиона падает до нулевых значений в 9-е сутки, что связано с апоптотической активацией протеолитических ферментов, расщепляющих белки и пептиды, в том числе и глутатион, который также разрушается супероксидами и перекисями, в избытке образующимися вследствие падения активности оксидоредуктаз.

Обеднение аскорбиновой кислотой связано в основном с превращением аскорбат-иона в дегидроаскорбат под действием активных форм кислорода. Аскорбат окисляется обратимо, поэтому графическая интерпретация динамики концентраций аскорбиновой кислоты имеет характер кривой с насыщением - скорость падения концентрации аскорбата со временем уменьшается, однако в целом концентрация падает.

Токоферол является липофильным антиоксидантом, способным окисляться под действием активных форм кислорода. Общее снижение активности оксидоредуктаз приводит к обеднению колеоптилей пшеницы токоферолом, но оно не столь существенно, как обеднение глутатионом и аскорбиновой кислотой.

Рис. 4. Системная (программированная) деградация ДНК при апоптозе в колеопгиле пшеницы. Справа - линейный профиль электрофореграммы ДНК семидневного колеоптиля.

По электрофоре грамме и линейным профилям можно наблюдать типичную для апоптоза картину - лестницеобразные фрагменты на электр о форе грамме (рис. 4), связанные с особой (апоптотической) формой деградации ДНК и хроматина. Деградация ДНК при апоптозе происходит ступенчато под действием эндонуклеаз. При электрофоретическом разделении в агарозном геле такая ДНК выглядит в виде некой лестницы. В отличие от некоторых обратимых начальных стадий апоптоза у растений такая фрагментация ДНК

является уже одной из терминальных и необратимых стадий апоптоза, за которой следует дальнейшая быстрая, уже относительно неспецифическая и глубокая деградация ДНК нуклеазами Полученные нами данные вполне согласуются с полученными в предшествующих исследованиях (Б Ф Ванюшин, 2001)

2 Контрочьный процесс нормальной жизнедеятельности в листе пшеницы

Для контроля процесс апоптоза в колеоптиле пшеницы сравнивали с процессом нормальной жизнедеятельности в первом листе При нормальной жизнедеятельности в листе пшеницы наблюдается обогащение листа всеми изученными антиоксидантами Стабильная ДНК не подвергается расщеплению. Все полученные данные резко отличаются от таковых при апоптозе

3 Некроз в листе пшеницы, обработанной ионами кадмия

При кадмий-индуцированном некрозе в листе пшеницы наблюдается обеднение листа всеми антиоксидантами, кроме каталазы, но рост активности каталазы очень незначителен и составляет лишь порядка 30% от такового в контрольном листе В некротизированном листе пшеницы заметна неспецифичная глубокая деструкция ДНК

4 Действие б-бензиламинопурина на проростки пшеницы

При действии избыточной концентрации 6-БАП на листья пшеницы, наблюдается сходная с апоптотической (разд 1) динамика активности антиоксидантов Динамика расщепления ДНК также сходна с таковой при апоптозе - на 5-е сутки заметно лестницеобразное фрагментирование электрофореграммы и образование суперпозиции группы малых пиков и нисходящей ветви главного на линейном профиле Таким образом, удалось индуцировать апоптоз в листе пшеницы, действием избытка 6-БАП При действии 6-БАП, концентрацией, близкой к in vivo, получены данные, сходные с таковыми для контрольного (интактного) листа пшеницы с той лишь разницей, что накопление антиоксидантов и ДНК несколько ускорено

5 Ингибирование апоптоза в колеоптшях пшенииы действием вытяжки листьев гороха

Динамика активности антиоксидантов в колеоптиле пшеницы под действием экстракта листьев гороха, представляют собой суперпозиции контрольной и апоптотической динамики Результаты ПЦР-анализа ДНК указывают на то, что с помощью экстракта листьев гороха удалось задержать апоптоз в колеоптилях пшеницы на 2 суток, однако не удалось заблокировать полностью

б Динамика белкового комплекса при различных формах клеточной

гибели

Среди всех белковых компонентов клетки ключевая роль принадлежит сигнальному белку-индуктору апоптоза р53 (F van Rhee, 1996, М Oren, 1999, R Sionov, 2001) Поэтому растения были подвержены электрофоретическому исследованию белкового состава с целью выявить дополнительный маркер апоптоза - полосу р53 в белковом спектре Важнейшие результаты исследований представлены на рис 5 и рис 6 На электрофореграммах белков органов растений, подверженных запрограммированной клеточной гибели, всегда проявляется полоса фракции, молярная масса которой, судя по спектру белков сои, близка к 50 кДа, что свидетельствует о присутствии апоптозного сигнального белка р53 В случаях некроза и нормальной жизнедеятельности полоса р53 в электрофоретическом спектре белков отсутствует

Рис. 5. Электрофореграмма белков листьев гороха, обработанного экстрактом

кодеаптапей пшеницы, а ьотрасте от 4 до ! 1 суток. Отмечена фракция сигнального белка р53

7. Другие исследования

Растения гороха были подвергнуты исследованию, аналогичному таковому для пшеницы. С помощью экстракта колеоптилей пшеницы удалось индуцировать необратимый апоптоз в листьях гороха, подтвердившийся анализом состояния антиоксидантной системы, ДНК и белков. Тип клеточной гибели в листьях гороха под действием инфицирования патогенным грибом Ascochyta pisi, согласно анализу состояния антиоксидантной системы, ДНК и белков, был расклассифицирован как некроз.

В наших исследованиях была предпринята попытка индуцировать клеточную гибель в листьях пшеницы и гороха под действием гриба Fusarium oxysporum, однако, в виду неспецифичности данного вида грибковой инфекции к растениям пшеницы и к листьям гороха, биоинформационный массив был изучен только на оксидоредуктазах. На базе полученных данных, статистически не отличающихся от данных для контрольного листа, был сделан вывод о

Рис. 6. Электрофореграмма белков колеоптиля пшеницы а возрасте от 4 до 10 с>ток. Отмечена фракция сигнального белка

р53

том, что микотоксины Fusarium oxysporum не способны запускать механизмы клеточной гибели в листьях пшеницы и гороха в пределах исследуемого периода

Для идентификации типа клеточной гибели в опадающих плодоэлементах люпина, они были распределены по степеням отмирания (визуально) Затем был проведен анализ состояния антиоксидантной системы и ДНК При сопоставлении биохимических данных данная форма клеточной гибели была идентифицирована как некроз

8 Фильтраиш данных для построения биоинформационной модели

Для получения биоинформационных моделей апоптоза и некроза у растений, из экспериментальной части настоящей работы в качестве ключевых были отобраны наиболее просто индуцируемые явления апоптоза и некроза, такие как естественный апоптоз колеоптилей пшеницы, некроз листьев пшеницы под действием ионов кадмия, апоптоз листьев гороха под действием вытяжки колеоптилей пшеницы, некроз листьев гороха под действием ионов кадмия

Для облегчения сопоставления данных по динамике активности ферментов, а также динамике концентраций низкомолекулярных антиоксидантов, полученные числа были преобразованы по следующему алгоритму нормирования

1 Выбирали максимум активности фермента либо концентрации низкомолекулярного антиоксиданта в условных единицах или мг% соответственно за весь период анализа (с 3 по 11 сутки)

2 Все числа делили на максимум, получая, таким образом, показатели активности фермента или низкомолекулярного антиоксиданта рА - безразмерные величины

3 Выстраивали таблицы зависимости показателей активности от времени

После осуществления релятивизации, полученные данные расширяли результатами электрофоретического анализа белков (рис 5-6), затем составляли матрицу показателей биоинформационной модели апоптоза и некроза на базе дифференциального и корреляционного анализов Корреляция рассчитывалась между массивами чисел, представляющих собой дискретные значения функций зависимости активности

Таблиц-*. 1

Матрица показателей бпоинформгцноннон модели апоптоза и некроза пшеницы

критерии ПРОЦЕСС Коэффициенты корреляции между.масси-еалт дтитх по елоптозу и по мгкрау

норма ансптоз (естественный) некроз

общая нормированная разность наличие пика общая нормированная разность наличие пика общая нормированная разность наличие пика

СОД + 0 23 НЕТ -0 52 НЕТ -0 21 НЕТ + 0 7002

Кагал аза + 0 27 НЕТ -0 27 ДА + 013 НЕТ - 0 8960

Пероксндаза + 0 19 НЕТ + 0 68 ДА -0 17 ДА - 0 2091

Вигаглнн С + 0 93 НЕТ -0 82 НЕТ -0 88 НЕТ + 0 7280

ВнтампнЕ + 037 НЕТ -0 30 НЕТ -0 77 НЕТ + 0 9101

Глутатнон + 0 75 НЕТ -0 33 ДА - 1 0 НЕТ + 0 3592

Белок Р53 не обнаруживается обнаруживается не обнаруживается 0

ДНК- "лесенка" не обнаруживаем? обнаруживается не обнаруживается. 0

л>

я С4 °

а 03 я 54 п

ОД» ш 3 о § -о

в О Ы

и

о\ а я и >5 н _ £ я» Г ~ ы К) о 2 ч—' о в

общая норшгроЕанн-кяразномъ показывает степень н характер изменения Л;ТНГ5Ь::Г1; компонента за весь исследуеный период

П> Я

Ы

Я

о 2 о ы

2 2 -

»

К -О ' Я

я

■3 о

ю р

я

X

о 2

£ Я

и ж ч к о я о

к »

Я

ч о га

о ч

о я ч о

и

<и и тз Я п 2

Я Л

тз я я я

я я

ы Я О 2 О Ьа Л я

V;

а а ■о

X £

й о о

4 (а Н

О к

л ы X

° н

м М

5 о» Е а о

о

я >—

V:

3

а И ч я о я о Я )э ш Я ч о

ЕЯ

О

а

п> •и о я о я ы ь я о

2 ><

н

В)

я

К)

ш я й я о

ь я я

2 к к -

я я си л> я

со ТЗ я о н я о я о о н я

Таблица 2

Матрица показателей биоинформационной модели апоптоза и некроза гороха

критерии ПРОЦЕСС Коэффициенты корреляции между масси-саяги бшших по апоптозу и по нецрозу

норма апоптоз (индуцированный) некроз

общая нормированная разность наличие пика общая нормированная разность наличие пика общая нормированная разность наличие пика

сод + 0 29 НЕТ -0 42 НЕТ -0 33 НЕТ + 0 9561

Каталаза + 0 36 НЕТ -041 ДА + 033 НЕТ - 0 8144

Пероксидаза + 0 34 НЕТ + 051 ДА + 0 36 ДА + 0 6936

Внтаынн С + 0 25 НЕТ -0 16 НЕТ -0 93 НЕТ + 0 9091

Витамин Е + 0 24 ДА -0 69 НЕТ -0 97 НЕТ + 0 8422

Глутатион + 0 80 НЕТ -0 25 ДА - 1 0 НЕТ + 0 5175

Белок Р53 не обнаруживается обнаруживается не обнаруживается 0

ДНК-"лесенка" не обнаруживается обнаруживается не обнаруживается 0

о

общая нормированная разность поуазывает степень н хараетер тиснения йгтуьностн компонентам весь иеследуеиый период

каталазы, однако существенно различаются по наличию р53 и лестницеобразной фрагментации электрофореграм ДНК. Кроме того, динамика активности пероксидазы при естественном апоптозе не коррелирует с таковой при некрозе, чего нельзя сказать об индушарованном апоптозе.

Для построения биоинформационной модели с помощью ЭВМ было проанализировано 14.5 тыс. экспериментальных данных, существенная часть которых была обработана программным комплексом, разработанным соискателем (разд. 9).

9. Программный комплекс, разработанный соискателем

Для расчета результатов анализа активности каталазы по волюмометрическим данным соискателем была разработана компьютерная программа "Катал азоинформер", позволяющая осуществлять групповой ввод данных, аппроксимацию, спрямление и множественный анализ кинетических кривых (рис. N-12). Программа подходит также для расчета активности некоторых других ферментов позволяя, таким образом, осуществлять администрирование биохимических данных.

КАглла'йинфориер • «под данных

Файл Сгдодеа

ЕЗ Се»ч | У П|мгисс'«|

V р«чет

Аьтивкая биомхсл "44. ■ тЩ г «И. г

озео оза озос 03» оэоо

Вре*»а гит ¡1] 4021 мл 12) УЩ, МП 13] 402! МП 1«! 4021 мл |5] 402]. мл

3 3$ 27 50 15 43

6 80 73 104 52 100

юг 107 13? Э.4 13.7

12 11 3 122 15? 121 1? 7

15 ш 135 16.8 149 158

Рис. 11. Окно ввода данных программы "Каталазоинформер"

Екдалпрскскмирук.щеА крЧЁзЯ ,= 1Л1М-Ш) -3 0563 0 9965

Акт ьшн до биомасса

тп= ОЗОООг А/ Г1Ш Н О СП» КЯТДВ ОЭ Ш а 24 5278 У'я ед

Рис. 12. Окно вывода и экспорта результатов расчета программы "Катал азоинформер".

Для анализа электрофореграмм белка и ДНК автором настоящей работы была разработана программа "ОгарЬогеБ^, работающая подобно модулю построения линейных профилей, встроенному в программу "ВиЛявМУ (Вюкот) и отличающаяся тем, что помимо построения графических линейных профилей также способна осуществлять их математический анализ, что дополнительно обеспечивает возможность количественного анализа пленарных хроматограмм. Помимо того, в отличие от "ВюСе$1-0" программа не требует регистрации и инсталляции и имеет небольшой размер (рис. 12-13).

Graphotest - Выбор участка рисунка яшввш -!П|х|

Файл Справка

чвщщрр ^тЩК — oj[rt4T" ej j

1 ir-j——.

;

flfc mm mm гДанные рисунка—

zl yf Обработать j

-Цвет селектора---—

if Обработать Нвстроить |

- -------

Рис, 12. Окно выбора участка электрофореграммы программы "ОгарЫЛез!"

штт

0'Ч Ч1Н

- агр7*,-,;н:.'.г..........- -Данные-.......- —-------------------------Загод екн дпэграиыы

Число vicimikbSTv« ¿BMSEtceil Е^ртиш-у I О В текст ---

1 Ti --ГТТ;-- У Попенял

1 —' > JBliHBtpciM |_У1/рояищуидц И ■■ —" '

Рис. 13, Окно вывода, обработки и экспорта результатов расчета программы 'ЧЗгар(кпе5Г

ВЫВОДЫ

1 Проведен широкоспектральный динамический биохимический анализ процессов естественного и индуцированного апоптоза и некроза, вызванного как биотическими, так и абиотическими факторами на примере пшеницы, гороха, люпина

2 Разработан и подтвержден нашими исследованиями метод искусственной индукции апоптоза в листьях гороха действием вытяжки колеоптилей пшеницы

3 Разработан и подтвержден метод искусственного частичного ингибирования апоптоза в колеоптилях пшеницы действием вытяжки листьев гороха

4 Выявлены антиоксидантные, белковые и ДНК-маркеры апоптоза, некроза и нормальной жизнедеятельности растительных клеток

5 Усовершенствованы методы анализа активности антиоксидантной системы

6 Разработан программный комплекс, рассчитанный на администрирование и анализ биологических данных

7 Создана биоинформационная модель апоптоза и некроза на базе дифференциального и корреляционного анализов

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1 С помощью выявленных в ходе работы естественных индукторов апоптоза или их аналогов можно.

■ управлять длительностью вегетационного периода,

■ ускорять или увеличивать синхронность созревания урожая и

повышать продуктивность зеленой массы растений

■ повышать безопасность процесса дефолиации растений

■ создавать экологически безопасные биогербициды направленного

действия и бороться с засорением культурных растений,

■ повышать устойчивость растений к патогенам

2 Усовершенствованные методы анализа активности антиоксидантной системы, а также разработанный программный комплекс можно рекомендовать биохимикам, молекулярным биологам, а также специалистам, работающим в области биоинформатики

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1 Гринблат, А И Динамика пероксидазной активности растений гороха на ранних этапах взаимодействия с клубеньковыми бактериями /НЕ Павловская, А И Гринблат, А В Вольховский // Физиологические аспекты продуктивности растений материалы научно-методической конференции (в 2 частях, ч 1) -Орел -2004 - С 71-76

2 Гринблат, А И Роль апоптоза и некроза в патогенезе растений / А И Гринблат, О А Шалимова // Материалы II съезда Общества биотехнологов России им Ю А. Овчинникова Москва, 13-15 окт 2004 г /Подред РГ Василова-М МАКС Пресс -2004 -С 83-84

3 Лабораторный практикум по биохимии растений уч пособ для студ спец Агрономия 310200 Агроэкология 320400 / [Н Е Павловская, В П Наумкин, И В Горькова, И Н Гагарина, А И Гринблат] -Орел -2005 - 136с

4 Гринблат, А И Изучение активности окислительно-восстановительных ферментов в проростках пшеницы в предапоптозный период с помощью модифицированных методик /НЕ Павловская, А И Гринблат, О А Шалимова // Научные основы повышения эффективности сельскохозяйственного производства Изд-во ОГАУ - Орел -2005 - С 128-135

5 Гринблат, А И Биоинформационная модель апоптоза и некроза у растений /НЕ Павловская, А И Гринблат // Материалы IV съезда Общества биотехнологов России им Ю А Овчинникова Пущино, 6-7 дек 2006 г / Под ред Р Г Василова - М МАКС Пресс -2006 - С 191-192

6 Гринблат А И Патент на изобретение №2293969 Способ определения активности фермента - 20.02 2007

7 Гринблат, А И Фрагментация ДНК под влиянием естественного и индуцированного апоптоза у растений /НЕ Павловская, А И Гринблат, Е В Курулева // Сорбционные и хроматографические процессы - вып 2, т 7 - Воронеж Изд-во ВГУ -2007 - С 309-314

Издательство ОрелГАУ, 2007, Орел, Бульвар Победы, 19 Заказ 4/3 Тираж 100 экз

Содержание диссертации, кандидата сельскохозяйственных наук, Гринблат, Антон Иосифович

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР: ТЕРМОДИНАМИКА, БИОХИМИЯ И БИОИНФОРМАТИКА СТАРЕНИЯ И СМЕРТИ.

1.1. Биология старения и смерти.

1.2. Старение и продолжительность жизни.

1.3. Роль генетических особенностей и факторов внешней среды в старении и продолжительности жизни.

1.4. Механизмы старения и смерти.

1.5. Роль свободных радикалов, повреждений, липидов, нуклеиновых кислот, белков и антиоксидантной системы в старении.

1.6. Типы смерти.

1.7. Отличия апоптоза от некроза.

1.8. Функции апоптоза у растений.29,

1.9. Высокие технологии в изучении явлений апоптоза.

1.10. Перспективы продления жизни, омоложения. Способы индуцировать деление клеток.

1.11. Актуальность изучения старения и гибели клеток у растений.

1.12. Выводы из литературных данных.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Исследуемые растения.

2.2. Условия выращивания.

2.3. Факторы воздействия на экспериментальные растения.

2.4. Биохимические методы исследования.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Контрольное исследование естественного апоптоза в колеоптилях и нормальной жизнедеятельности в листьях пшеницы.

3.2. Исследование проявлений клеточной гибели в листьях пшеницы под действием абиотических факторов.

3.3. Исследование проявлений клеточной гибели в листьях и колеоптилях пшеницы под действием биотических факторов.

3.4. Контрольное исследование биохимических процессов в листьях гороха в норме.

3.5. Исследование проявлений клеточной гибели в листьях гороха под действием абиотических факторов.

3.6. Исследование биохимических явлений в листьях гороха под действием биотических факторов.

3.7. Исследование биохимических параметров плодоэлементов люпина разных ярусов.

3.8. Визуальные данные апоптоза и некроза у исследуемых растений.

4. БИОИНФОРМАЦИОННАЯ ЧАСТЬ.

4.1. Фильтрация данных для составления биоинформационной модели.

4.2.Расширение массива данных для составления биоинформационной модели.

4.4. Матрицы показателей биоинформационной модели апоптоза и некроза.

Выводы.

Предложения производству.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка биоинформационной модели апоптоза и некроза у растений"

В течение 100 лет изучение биологических явлений основывалось на экспериментах in vivo и in vitro. Появившиеся в 60-е годы компьютеры были лишь вспомогательным средством для обработки и хранения данных. С конца 80-х началось создание баз данных, в которых хранится информация о миллионах последовательностей нуклеотидов в ДНК и РНК или аминокислот в белках, и они еще ждут обработки и последующего практического применения. Компьютерный анализ превратился в самостоятельную область науки - биоинформатику. Исследования in silico, то есть в компьютере, уже привели к расшифровке многих "слов" генетического текста - команд, записанных в ДНК и управляющих жизнью и смертью клетки (Янковский и др., 2001).

Изучение биохимических явлений, в том числе апоптоза, с помощью высоких технологий (биоинформатики) базируется на теоретических основах анализа генных сетей, а также на особенности построения генной сети как основы математической модели. Анализ сверхмощного массива полученной на сегодняшний день экспериментальной информации невозможен без компьютерных методов ее систематизации и математического моделирования. В основе построения генных сетей лежит химико-кинетический подход, позволяющий представить любые процессы как сумму элементарных событий, оперируя концентрациями молекул и скоростями реакций, т.е. при моделировании генных сетей используется обобщенный химико-кинетический метод (Лихошвай и др., 2001).

В 1996 г. в Колумбийском университете была разработана технология углубленного изучения фактического материала, посвященного раку и апоптозу и создан АЛИ (автоматизированный поисковый инструмент), который выполняет рутинную работу по анализу большого массива данных (публикаций). С его помощью можно проводить машинные исследования, когда компьютерный комплекс сам находит закономерности в таком объеме информации, который не под силу переработать человеку. Идея АПИ принадлежит математику-биологу Андрею Ржетскому и его научному консультанту Масатоши Ней и базирована на теме молекулярных сетей (так называют узор, получающийся при взаимодействии отдельных генов и белков). АПИ получил название Gene Ways (Стикс, 2005).

Биоинформационные и биохимические исследования апоптоза сопряжены с поиском методов лечения опасных заболеваний - ключевым направлением геронтологии, актуальность которого очевидна, но, в связи с этим, долгое время наблюдался сильный перевес активности исследований в области апоптоза у животных и человека (Fadel et al., 1999) по сравнению с растениями.

Изучение апоптоза у растений - относительно новая и потому еще слабо наполненная данными область науки. В России единственный ученый, который усиленно занимается исследованиями в этой области - профессор МГУ, д.б.н. Б.Ф. Ванюшин (Замятнина, Ванюшин и др., 2002; Ванюшин и др., 2001; Ванюшин, 2001).

К сожалению, исследования апоптоза у животных и растений слабо связаны друг с другом, несмотря на то, что в этих процессах есть много общих черт.

Изучение механизмов запрограммированной и спонтанной гибели клеток растения и базированная на полученных данных разработка средств управления обеими формами гибели клеток растения имеют крайне важное значение как для фундаментальной, так и для прикладной биотехнологии. Контроль над некрозом и апоптозом позволит повышать устойчивость растений к патогенам, увеличивать урожайность сельскохозяйственных культур, ускорять или увеличивать синхронность созревания урожая, обеспечит возможность управлять длительностью вегетационного периода и упростит работу селекционеров.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Поскольку исследования, связанные с апоптозом и некрозом в растительных тканях до конца не расшифрованы и не систематизированы, нашей целью было создать биоинформационную модель на основе собственных экспериментов, связанных с апоптозом и некрозом. Это имеет как фундаментальное значение, так и прикладное, так как сопряжено с изучением механизмов устойчивости растений.

В связи с поставленными целями, задачами являются

1. Исследовать антиоксидантную систему пшеницы и гороха в норме, при апоптозе и при некрозе

2. Исследовать влияние апоптоза и некроза на фрагментацию ДНК методом ПЦР-анализа

3. Установить влияние биотических факторов на проявления апоптоза и некроза у пшеницы и гороха

4. Установить влияние абиотических факторов на проявления апоптоза и некроза у пшеницы и гороха

5. Установить влияние апоптоза и некроза на состав белков пшеницы и гороха

6. На основе полученных данных идентифицировать тип клеточной гибели в опадающих плодоэлементах люпина

7. Разработать компьютерный программный комплекс для администрирования и обработки собственных экспериментальных данных

8. Создать биоинформационную модель апоптоза и некроза пшеницы и гороха.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Гринблат, Антон Иосифович

140 Выводы

1.Проведен широкоспектральный динамический биохимический анализ процессов естественного и индуцированного апоптоза и некроза, вызванного как биотическими так и абиотическими факторами на примере пшеницы, гороха, люпина.

Выявлены антиоксидантные, белковые и ДНК-маркеры апоптоза на примере естественного апоптоза в колеоптилях пшеницы: резко падает активность супероксиддисмутазы (от 436 у.е. в до 211 у.е.); активность пероксидазы растет от 2407 у.е. до максимума 12789 у.е., а затем снижается до 11154 у.е.; активность каталазы растет до максимума 23 у.е., затем падает до 11 у.е.; содержание глутатиона после всплеска концентрации до 9.2 мг% падает до нулевых значений; монотонно уменьшается концентрация витамина Е от 21 мг% до 14 мг%; монотонно уменьшается концентрация витамина С от 10 мг% до 2 мг%; электрофореграммы ДНК имеют форму лестницы вследствие межнуклеосомной деградации ДНК; электрофореграммы белков содержат аналитический сигнал регуляторного белка р53.

3.На базе полученных тенденций и маркеров (п. 2) подтвержден метод искусственной индукции апоптоза в листьях гороха действием вытяжки колеоптилей пшеницы, созданный в рамках представляемой работы.

4. На базе полученных тенденций и маркеров (п. 2) разработан и подтвержден метод искусственного частичного ингибирования апоптоза в колеоптилях пшеницы действием вытяжки листьев гороха.

5.Усовершенствованы методы анализа активности антиоксидантной системы: модифицированы методики определения активности пероксидазы, каталазы, супероксиддисмутазы. Получено положительное решение от 16.10.06 о выдаче патента на изобретение "Способ определения активности фермента" по заявке № 2005127999/28 (Гринблат, 2005-2006). Кроме того, модифицирована методика определения концентрации витамина Е.

6. Предложен программный комплекс, рассчитанный на администрирование и анализ биологических данных, состоящий из программ для химико-кинетических расчетов активностей ферментов и для построения линейных профилей электрофореграмм и оцифровки планарных хроматограмм.

7. Создана биоинформационная модель апоптоза и некроза на базе дифференциального и корреляционного анализов, четко описывающая биохимические различия этих типов клеточной гибели средствами информатики и математики.

Предложения производству

1. С помощью выявленных в ходе работы естественных индукторов апоптоза или их аналогов можно: управлять длительностью вегетационного периода; ускорять или увеличивать синхронность созревания урожая; повышать продуктивность зеленой массы растений; повышать безопасность процесса дефолиации растений; создавать экологически безопасные биогербициды направленного действия; бороться с засорением культурных растений; повышать устойчивость растений к патогенам.

2. Усовершенствованные методы анализа активности антиоксидантной системы, а также разработанный программный комплекс можно рекомендовать биохимикам, молекулярным биологам, а также специалистам, работающим в области биоинформатики.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата сельскохозяйственных наук, Гринблат, Антон Иосифович, Орел

1. Акифьев, А. П. Этапность изменений ДНК и ее роль в процессе старения /

2. A. П. Акифьев, А. И. Потапенко // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Общие проблемы биологии. 1986. - Т. 5. - С. 7-35.

3. Анисимов, В. Н. Современные представления о природе старения /

4. B. Н. Анисимов // Успехи соврем, биол. 2000. - Т. 120, № 2. - С. 146-164.

5. Бердышев, Г.Д. Эколого-генетические факторы старения и долголетия. / Г. Д. Бердышев. Л.: Наука, 1977. - 203 с.

6. Биологическая флора Московской области / отв. ред. Т. А. Работнов. М., 1983.-Вып. 7.-262с.

7. Ванюшин, Б. Ф. Молекулярно-генетические механизмы старения / Б. Ф. Ванюшин, Г. Д. Бердышев. М.: Медицина, 1977.-295 с.

8. Ванюшин, Б. Ф. Апоптоз у растений / Б. Ф. Ванюшин // Успехи биологической химии 2001. - Т. 41. - С. 3-38.

9. Воронцова, М.А. Физиологическая регенерация / М. А. Воронцова, Л. Д. Лиознер М:. Советская наука, 1955 - 508 с.

10. ГОСТ 30417-96. Межгосударственный стандарт. Масла растительные. Методы определения массовых долей витаминов А и Е. Введен 1998-01-01. М.: Госстандарт России: Изд-во стандартов, 1999. - 12 с.

11. Методологический сайт о биотехнологии Электронный ресурс. / М., 2006. -Режим доступа: http://www.metodolog.ru/00712/00712.html, свободный.

12. Гунин, А.Г. Клеточный цикл, апоптоз. Электронный ресурс. / Веб-сайт кафедры гистологии чувашского госуниверситета, 2001. Режим доступа: http://www.histol.chuvashia.com, свободный. - Загл. с экрана.

13. Гупало, П. И. Возрастные изменения растений и их значение в растениеводстве / П. И. Гупало. М.: Наука, 1969. - 252с.

14. Общая и молекулярная фитопатология. / Ю. Т. Дьяков и др.. 2001. -М.: Общество фитопатологов. - 301 с.

15. Зилов, В.Г. Элементы информационной биологии и медицины: монография / В.Г. Зилов, К.В. Судаков, О.И. Эпштейн. М.: МГУЛ, 2000. -248 с.

16. Сайт со сравнительными таблицами по апоптозу и некрозу Электронный ресурс. / Киев, 2006. Режим доступа: http://www.pathology.dn.ua/indexrus.shtml, свободный. - Загл. с экрана.

17. Молекулярно-генетические механизмы заболеваний человека: компьютерный анализ и моделирование / Колчанов Н. А. и др. // Материалы Международной конференция «Физико-химическая биология» 30 июля 3 августа 2006, Новосибирск.

18. Конарев, А. В. Белки семян как маркеры / А. В. Конарев // Вестник семеноводства в СНГ. 2000. - № 2. - С. 24-25.

19. Коркушко, О. В. Функции желудка и поджелудочной железы при старении / О. В. Коркушко, Д. М. Якименко, В. П. Терещенко // Физиологические механизмы старения. JI., 1982.-С. 132-143.

20. Лагучев, С. С. О физиологической смерти клеток тела / С. С. Лагучев // Успехи соврем, биол. 1963. - Т. 56. - С. 274-283.

21. Ленинджер А. Основы биохимии: т. 2. / А. Ленинджер. М.: Мир. -1985.-С. 406.

22. Ленинджер, А. Основы биохимии: т.1. / А. Ленинджер. М.: Мир. -1985.-С. 16.

23. Леопольд, А. Рост и развитие растений / А. Леопольд. М.: Мир, 1968. -С. 218.

24. Лихошвай, В. А. Обобщенный химико-кинетический метод моделирования генных сетей / В. А. Лихошвай и др. // Мол. Биология. -2001.-Т. 35.-С. 1072-1079.

25. Лэмб, М. Биология старения / М. Лэмб. М.: Мир, 1980. - 206 с.

26. Мерзляк, М. Н.Активированный кислород и окислительные процессы в мембранах растительной клетки / Мерзляк М. Н. // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Физиология растений. 1989. - Т. 6. - 167 с.

27. Мерзляк, М. Н. Хроматографические и спектральные характеристики липорастворимых флуоресцирующих продуктов, накапливающихся при повреждении и старении тканей растений / М. Н. Мерзляк и др. // Биохимия. 1982. - Т. 47, № 3. - С. 425-433.

28. Методы биохимического исследования растений / под ред. Е. А. Ермакова Л.: Агропромиздат. - 1987. - С. 38-39.

29. Методы биохимического исследования растений / под ред. Е. А. Ермакова. Л.: Агропромиздат. - 1987. - С.42-43.

30. Мохорт, Т.В. Апоптоз роль в развитии сахарного диабета типа 1 / Т. В. Мохорт., С. Б. Мельнов, В. А. Горанов // Проблемы эндокринологии -2000.-Т. 46,№2.-С. 8-13.

31. Наджарян, Т. Л. Проблема определения биологического возраста / Т. Л. Наджарян, В. Б. Мамаев // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Общие проблемы биологии. 1984. - Т. 4. - С. 81-134.

32. Наджарян, Т. Л. Применение дибунола как геропротектора / Т. Л. Наджарян, В. Б. Мамаев // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. 1986. Т. 5. С. 110-162.

33. Никитин, В. Н. Экспериментальные подходы к продлению жизни / В. Н. Никитин // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Общие проблемы биологии. 1984. - Т. 4. - С. 6-43.

34. Обухова, Л. К. Молекулярные механизмы замедления старения антиоксидантами / Л. К. Обухова, Н. М. Эмануэль // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Общие проблемы биологии. 1984. - Т. 4. - С. 44-80.

35. Обухова, Л. К. Свободнорадикальные механизмы старения в биологической эволюции / Л. К. Обухова // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Общие проблемы биологии. 1986. - Т. 5 - С. 36-68.

36. Подколзин, A.A. Новая единая системная сущностная модель старения / A.A. Подколзин, В.Н. Крутько, В.И. Донцов // Клиническая геронтология 2000. - Т. 6, № 7-8. - С. 104-105.

37. Полевой, В. В., Физиология роста и развития растений / В. В. Полевой, Т. С. Саламатова. Л.: Изд.-во ЛГУ, 1991. - 240 с.

38. Полевой, В.В. Живое состояние клетки и биология старения / В. В. Полевой, Т. С. Саламатова. Изд-во СПб. ун-та, 2004. - С. 47.

39. Поликар, А. Элементы патологии клетки / А. Поликар, М. Бесси. -М.: Мир, 1970. -348 с.

40. Практикум по физиологии растений / Под редакцией проф. Н. Н. Третьякова. -М.: Агропромиздат, 1990. С. 130-133.

41. Самсонова, М. Г. Средства для визуализации структуры генных сетей и их динамики Электронный ресурс. / М. Г. Самсонова, В. Н. Серов,

42. A. С. Трушкина. М., 2006. Режим доступа: http://www.ibmh.msk.sU/bioinformatics/a/a08-poster-rus.htm, свободный. -Загл. с экрана.

43. Сафонов, С. И. Фитоиндикация тяжелых металлов на примере нитрата кадмия Электронный ресурс. / С. И. Сафонов, И. Анциферова, А. Хорина. М., 2001 - Режим доступа: http://2001.vernadsky.info/e6/w01091.htm, свободный. - Загл. с экрана.

44. Серебрякова, Т. И. Морфогенез побегов и эволюция жизненных форм злаков / Т. И. Серебрякова. М.: Наука, 1971. - 358 с.

45. Сайт запатентованных методов биохимического анализа Электронный ресурс. / Режим доступа: www.sibpatent.ru, свободный. Загл. с экрана.

46. Скулачев, В. П. Кислород и явления запрограммированной смерти /

47. B. П. Скулачев // Биохимия. 1999. - Т. 64. - С. 1418-1426.

48. Сайт о модульном омоложении на основе теории В.В. Скулачева Электронный ресурс. / В. В. Скулачев [и др.]. М., 2006. - Режим доступа: http://www.starenie.ru/texnologii/modulnoe.php, свободный. - Загл. с экрана.

49. Веб-страница о бионанотехнологиях Электронный ресурс. / В. В. Скулачёв [и др.] М., 2006. - Режим доступа: http://www.starenie.ru/texnologii/nanotex.php, свободный. - Загл. с экрана.

50. Стикс, Г. В поисках молекулярных сокровищ / Г . Стикс // В мире науки №8. - 2005. - С. 76-79.

51. Сайт о принципиально новых направлениях биотехнологии Электронный ресурс. / СПб., 2006. Режим доступа: http://www.biotech.spb.ru/print.php?menu=books&list=find&id=40, свободный. - Загл. с экрана.

52. Фролысис, В. В. Старение и биологические возможности организма / В. В. Фролысис. М.: Наука. - 1975. - 272 с.

53. Фролысис, В. В. Экспериментальные пути продления жизни. /

54. B. В. Фролысис, X. К. Мурадян -М., 1988. 248 с.

55. Чайлахян, М. X. Регуляция цветения высших растений. / М. X. Чайлахян М:. Наука. -1988. - 558 с.

56. Ченцов, Ю. С. Общая цитология / Ю. С. Ченцов. М.: Изд-во МГУ, 1984.-С. 330-340.

57. Сельскохозяйственная биотехнология: учебник / В. С. Шевелуха, и др.; под ред. В. С. Шевелухи 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Высшая школа.-2003.-С. 3-201.

58. Шевченко, Н. В. Перекисное окисление ли-пидов при действии на растения галоидфеноксикислот / Н. В. Шевченко, С. И. Погосян, М. Н. Мерзляк // Физиол. растений. 1980. - Т. 27, № 2. - С. 363-367.

59. Шорнинг, Б. Ю. Необходимость образования супероксида для развития проростков пшеницы / Б. Ю. Шорнинг и др. // Биохимия. 2000. Т. 65.1. C. 1612-1617.

60. Шорнинг, Б. Ю. Действие антиоксидантов на рост и развитие растений / Б. Ю. Шорнинг и др. // Известия РАН, Серия биол. 1999. - № 1. - С. 30-38.

61. Юсуфов, А. Г. Биология старения цветковых растений. / А. Г. Юсуфов. Махачкала: Изд-во ДГУ, 1992. - 204 с.

62. Alexander, P. Is there a relationship between aging, the shortening of lifespan by radiation and the induction of somatic mutations? / P. Alexander // Perspectives in experimental gerontology. Ed. N.W. Shock. Illinois, 1966. -P. 266-279.

63. Almog,N. An insight into the life of p53: a protein coping with many functions. Review of the 9th p53. / N. Almog, V. Rottar // Biophys. Biochem. Acta.-1998.-P. 1378.

64. Alvarez, M. E. Reactive oxygen intermediates mediate a systemic signal network in the establishment of plant immunity / M. E. Alvarez et al. // Cell. -1998.-Vol. 92.-P. 773-784.

65. Bakeeva, L. E. Apoptosis in the Initial Leaf of Etiolated Wheat Seedlings: Influence of the Antioxidant Ionol (BHT) and Peroxides / L. E. Bakeeva et al. // Biochemistry. Vol. 66, No. 8. - 2001. P. 850-859.

66. Beckman, К. B. The free radical theory of aging matures / К. B. Beckman, B. N. Ames // Physiol. Rev. 1998. - Vol. 78. - P. 547-581.

67. Bjorksten, J. Crosslinkage and the aging process / J. Bjorksten // Theoretical aspects of aging. Ed. M. Rockstein. New York, 1974. P. 43-59.

68. Carimi, F. Cytokinins: new apoptotic inducers in plants / F. Carimi et al. // Planta. 2003 - Vol. 216. - P. 413-421.

69. Chamnongpol, P. Defense activation and enhanced pathogen tolerance induced by H202 in transgenic tobacco / P. Chamnongpol et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95. - P. 5818-5823.

70. Серегин И. В. Фитохелатины и их роль в детоксикации кадмия у высших растений / И. В. Серегин // Успехи биологической химии. Т. 41. -2001.-С. 283-300.

71. Dangl, J. L. Death don't have no mercy: cell death programs in plant-microbe interactions / J. L. Dangl, R. A. Dietrich, M. H. Richberg // Plant Cell. 1996. - Vol. 8. - P. 1793-1807.

72. Del Rio, L. A. The Activated Oxygen Role of Peroxisomes in Senescence / L. A. Del Rio et al. // Plant Physiol. 1998. - Vol. 116. - P. 1195-1200.

73. Delledone, M. Nitric oxide functions as a signal in plant disease resistance / M. Delledone et al. // Nature. 1998. - Vol. 394. - P. 585-588.

74. Desikan, R. Harpin and hydrogen peroxide both initiate programmed cell death but have differential effects on gene expression in Arabidopsis suspension cultures / R. Desikan et al. // Biochem. J. 1998. - Vol. 330. - P. 115-120.

75. Dhindsa, R. S. Rapid reduction by IAA of malondialdehyde levels in Avena coleoptiles, a possible effect on lipid peroxidation / R. S. Dhindsa, A. C. Amoral, RE. Cleland // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1984. -Vol. 125.-P. 76-81.

76. Drew, M.C. Senecence: what is it? / M. C. Drew, C.-J. He, P. W. Morgan // Trends Plant Sci. 2000. - Vol. 5. - P. 122-127.

77. Droillard, M. J. Free radical production, catalase and superoxide dismutase activities and membrane integrity during senescence of petals of cut carnations / M. J. Droillard, A. Paulin, J. C. Massot // Physiol. Plant. 1987. - Vol. 71. - P. 197-202.

78. Drori, D. Environmental effects on longevity in the male rat: exercise, mating, castration and restricted feeding / D. Drori, Y. Folman // Exp. Gerontol. -1976.-Vol. 11.-P. 25-32.

79. Durner, J. Nitric oxide as a signal in plants / J. Durner, D. F. Klessig // Current Opin. Plant Biol. 1999. - Vol. 2. - P. 369-374.

80. Durner, J. Defense gene induction in tobacco by nitric oxide, cyclic GMP, and cyclic ADP-ribose / J. Durner, D. Wendehenne, D. F. Klessig // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1998. Vol. 95. - P. 10328-10333.

81. Evan, G. I. Proliferation, cell cycle and apoptosis in cancer / G. I. Evan, K. H. Vousden // Nature. 2001. - Vol. 411. -P. 342-348.

82. Fadel, B. Apoptosis in human disease: a new skin for the old ceremony? /

83. B. Fadel, S. Orrenius, B. Zhivotovsky // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1999. Vol. 266. -P. 699-717.

84. Fath, A. Barley aleurone cell death is not apoptotic characterization of nuclease activities and DNA degradation / A. Fath, P. C. Bethke, R. L. Jones // Plant J. 1999. - Vol. 20. - P. 305-315.

85. Foyer, C. H. Ascorbate and glutathione: keeping active oxygen under control / C. H. Foyer // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998. - Vol. 49. -P. 249-279.

86. Fukuda, H. Xylogenesis: initiation, progression, and cell death / H. Fukuda // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1996. - Vol. 47. - P. 299-325.

87. Fukuda, H. Tracheary element differentiation / H. Fukuda // Plant Cell. -1997.-Vol. 9.-P. 1147-1156.

88. Giannopolities, C. N. Superoxid dismutase. I. Occurrence in higher plants /

89. C.N.Giannopolities, S.K.Ries // Plant Physiology. 1977. - Vol.59. -P. 309-314.

90. Gilchrist D. G. Mycotoxins reveal connections between plants and animals in apoptosis and ceramide signaling / D. G. Gilchrist // Cell Death and Differentiation. 1997. - Vol. 4. - P. 689-698.

91. Gilchrist, D. G. Programmed cell death in plant disease: The purpose and promise of cellular suicide / D. G. Gilchrist // Annu. Rev. Phytopathol. 1998. -Vol. 36.-P. 393-414.

92. Gliicksmann, A. Cell deaths in normal vertebrate ontogeny / A. GlOcksmann // Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 1951. - Vol. 26. - P. 59-86.

93. Godiard, L. Perception and response in plant disease resistance / L- Godiard et al. // Curr. Opin. Genet. Dev. -1994. Vol. 4. - P. 662-671.

94. Greenberg, J. T. Programmed cell death: a way of life fo*" plants / J. T. Greenberg // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996 - Vol. 93. - P 1209412097.

95. Greenberg, J. T. Programmed cell death in plant:pathogen. interactions / J. T. Greenberg // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1997. — Vol. 48. -P. 525-545.

96. Groover, A. Tracheary element differentiation uses a novel ncmechanism coordinating programmed cell death and secondary cell wall synthesis / A. Groover, A.M. Jones // Plant Physiol. -1999. Vol. 8. - P. 267-2*71.

97. Groover, A. Programmed cell death of plant, tracheary elements differentiating in vitro / A. Groover et al. // Protoplasma. 1997. - NAol. 196. -P. 197-211.

98. Guerritore, A. La natura vívente / A. Guerritore // Studium. 1987— — Vol. 4. -P. 597.

99. Guidotti, G.G. Patología generale / G.G. Guidotti. Milano: Casa Ambrosiana, 1990. -133 p.

100. Hayflick, L. The serial cultivation of human diploid cell strains / L. Hayflick, P. S. Moorhead // Exp. Cell Res. 1961. - Vol. 25. - P. 5^5-621.

101. Hayflick, L. How and why we age / L. Hayflick // Exp. Gerontol— 1998. -Vol. 33.-P. 639-653.

102. He, C.-J. Transduction of an ethylene signal is required for cell death and lysis in the root cortex of maize during aerenchyma formation induced by hypoxia / C.-J. He, P. W. Morgan, M. C. Drew // Plant Physiol. — 1996. -Vol. 112.-P. 463-472.

103. Heath, M. C. Apoptosis, programmed cell death and the hype*~sensitive response / M. C. Heath // Eur. J. Plant Pathol. 1998. - Vol. 104. - P. n 17-124.

104. Heidrick, M. L. Effect of diethary 2-mercaptoethanol on the Mife-span, immune system, tumor incidence and lipid peroxidation damage fcn spleenlymphocytes of aging BC3F1 mice / M. L. Heidrick, L. C. Hendricks,

105. D. E. Cook // Mech. Ageing Dev. 1984. - Vol. 27. - P. 341-358.

106. Jabs, T. Reactive oxygen intermediates as mediators of programmed cell death, in plants and animals / T. Jabs // Biochem. Pharmacol. 1999. - Vol. 57. -P. 231-245.

107. Jabs, T Initiation of runaway cell, death in an Arabidopsis mutant by extracellular superoxide / T. Jabs, R. A. Dietrich, J. L. Dangl //Science. 1996. -Vol. 273.-P. 1853-1856.

108. Janicke, R. U. A novel Arabidopsis thaliana protein protects tumor cells from tumor necrosis factor-induced apoptosis / R. U. Janicke, A. G. Porter, A. Kush // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - Vol. 1402. - P. 70-78.

109. Jones, J. D. G. A novel signalling motif shared by plant resistance gene products and regulators of cell death in animals / J. D. G. Jones,

110. E. A. van der Biezen // Curr. Biol. 1998. - Vol. 8. - P. 226-227.

111. Keller, T. A plant homolog of the neutrophil NADPH oxidase gp91phox2+ !subunit gene encodes a plasma membrane protein with Ca -binding domains / T. Keller et al. // Plant Cell. 1998. - Vol.10. - P. 255-266.

112. Kerr, J.F.R. Apoptosis: a basic phenomenon with wide-ranging implication in tissue kinetics / J.F.R. Kerr, A.H. Wyllie, A.R. Currie // Brit. J. Cancer. -1972.-Vol. 26.-P. 239-257.

113. Koudrine, A.V. Trace elements and apoptosis / A.V. Koudrine // Trace. Elem. Biol. Med. 1998. - Vol. 3. - P. 17-27.

114. La Bella, F. S. Effect of beta-aminopropannitryl of prednisolone on survival of male LAF/J mice / F. S. La Bella, S. Vivian // Exp. Gerontol. 1975. -Vol. 10.-P. 185-188.

115. Leist, M. Intracellular adenosine triphosphate (ATP) concentration: a switch in the decision between apoptosis and necrosis / M. Leist et al. // J. Exp. Med. 1997. Vol. 185.-P. 1481-1486.

116. Levine, A. Calcium-mediated apoptosis in a plant hypersensitive disease resistance response / A. Levine et al. // Curr. Biol. 1996. - Vol. 6. - P. 427437.

117. Lokshin, R.A. Senescence processes / R. A. Lokshin, J. Beaulaton// J. Life Sei.-1975.-Vol. 15.- 1549-1565.

118. Lorget, F.High extracellular calcium concentrations directly stimulate osteoclast apoptosis / F. Lorget et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -2000.-Vol. 268.-P. 899-903.

119. Lotem, J. Control of apoptosis in hematopoiesiand leukemia by cytokines, tumor suppressor anoncogenes / J. Lotem, L. Sachs // Leukemia. 1996. -Vol. 13.-P. 925-931.

120. Machida, Y. Progress in studies of plant homologs of mitogen-activated protein (MAP) kinase and potential upstream components in kinase cascades / Y. Machida, R.Nishihama, S.Kitakura // Crit. Rev. Plant Sei. 1997. -Vol. 16.-P. 481-496.

121. Male, D.Cytokines and chemokines / D.Male et al. // Advanced Immunology. London: Mosby, 1996. - 323 p.

122. Marin, M. C. Evidence that p53 and bcl2 regulators of a common cell death pathway important for in vivo lymphogenesis. / M.C.Marin et al. // Oncogene. 1994. - Vol. 9. - P. 3107-3112.

123. Mittler, R. Post-transcriptional suppression of cytosolic ascorbate peroxidase expression during pathogen-induced programmed cell death in tobacco / R. Mittler, X. Feng, M. Cohen // Plant Cell 1998. - Vol. 10. - P. 461-473.

124. Mittler, R. Characterization of nuclease activities and DNA fragmentation induced upon hypersensitive response cell death and mechanical stress / R. Mittler, E. Lam // Plant Mol. Biol. -1997. Vol. 34. - P. 209-221.

125. Mittler, R. Transgenic tobacco plants with reduced capability to detoxify reactive oxygen intermediates are hyperresponsive to pathogen infection / R. Mittler et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1999. Vol. 96. P. 14165-14170.

126. Mittler, R. Inhibition of programmed cell death in tobacco plants during pathogen-induced hypersensitive response at low oxygen pressure / R. Mittler etal.//Plant Cell.-1996.-Vol. 8.-P. 1991-2001.

127. Moll, U.M. Nuclear and mitochondrial apoptotic pathways of p53. / U. M. Moll, A. Zaika // FEBS letter. 2001 - Vol. 493. - P. 65-69.

128. Morel, J.B. The hypersensitive response and the induction of cell death in plants / J. B. Morel, J.L.Dangl // Cell Death and Differentiation. 1997. -Vol. 4.-P. 671-683.

129. Nicotera, P. Energy supply and the shape of death in neurons and lymphoid cells / P. Nicotera, M. Leist // Cell Death Differ. 1997. - Vol. 4. - P. 435-442.

130. Nicotera, P. The role of calcium in apoptosis / P. Nicotera, S. Orrenius // Cell Calcium. 1998. - Vol. 23. - P. 173-180.

131. Noctor, G. Ascorbate and glutathione: keeping active oxygen under control / G. Noctor, C. H. Foyer // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998. -Vol. 49.-P. 249-279.

132. Nooden, L. D. Senescence mechanisms / L. D. Nooden, J. J. Guiamet, I. John // Physiologia Plantarum. 1997. - Vol. 101. - P. 746-753.

133. Oliver, F. J. Essential role for poly (ADP-ribosyl)ation in mouse preimplantation development / F. J. Oliver et al. // J. Hum. Genet. 1999. -Vol. 64.-P. 1282-1288.

134. Oren, M. Regulation of the p53 tumor suppressor protein. / M. Oren // J. Biol. Chem. -1999. Vol. 274. - P. 36031-36034.

135. Orgel, L. E. The maintenance of the accuracy of protein synthesis and its relevance to ageing / L. E. Orgel // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1963. -Vol. 49.-P. 517-521.

136. Pennell, R. I. Programmed cell death in plants / R. I. Pennell, C. Lamb // Plant Cell. -1997. Vol. 9. - P. 1157-1168.

137. Pontier, D. Activation of hsr203, a plant gene expressed during incompatible plant-pathogen interactions is correlated with programmed celldeath / D. Pontier et al. I I Mol. Plant Microbe Interact. 1998. - Vol. 11. - P. 544-554.

138. Pontier, D. Markers for hypersensitive response and senescence show distinct patterns of expression / D. Pontier et al.// Plant Mol. Biol. 1999. -Vol. 39.-P. 1243-1255.

139. Pontier, D. The hypersensitive response. A programmed cell death associated with plant resistance / D. Pontier, C. Balague, D. Roby // Compt. Rend. Acad. Sci. Serie III. 1998. - Vol. 321. - P. 721-734.

140. Reichheld, J. P. Indomethacin-induced Gl/S phase arrest of the plant cell cycle / J. P. Reichheld et al. // Plant J. -1999. Vol. 17. - P. 647-656.

141. Van Rhee, F. P190 BCR-ABmRNA is expressed at low levels in p210-positive chronimyeloid and acute lymphoblastic leukemias / F. van Rhee et al. //Blood. 1996.-Vol. 87.-P. 5213-5217.

142. Robertson, O.H. Histological changes in the organs and tissues of senile castrated kokanee salmon (Oncorhynchus nerka kennerlyi) / O. H. Robertson, B. C. Wexler // Gen. Comp. Endocrinol. -1962. Vol. 2 - P. 458-472.

143. Sanders, E.J. Programmed cell death in development / E.J. Sanders, M. A. Wride // Int. Rev. Cytol. 1995. - Vol. 163. - P. 105-160.

144. Saunders, J. W. Death in Embryonic Systems / J. W. Saunders // Science. -1966.-Vol. 154.-P. 604-612.

145. Scandalios, J.G. Oxygen stress and superoxide dismutases / J. G. Scandalios // Plant Physiol. 1993. - Vol. 101. - P. 7-12.

146. Schwartz, L. M. Do All Programmed Cell Deaths Occur Via Apoptosis? / L. M. Schwartz et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol. 90. -P. 980-984.

147. Sionov, R. V. C-ABL regulates p5-levels under export and ubiquitination / R. V. Sionov et al. // Mol. Cell. Biol. 2001. - Vol. 21. - P. 5869-5878.

148. Skulachev, V.P. Mitochondrial physiology and pathology; concepts of programmed death of organelles, cells and organisms / V. P. Skulachev // Mol. Aspects Med. 1999. - Vol. 20. - P. 139-184.

149. Tiedemann, A. V. Evidence for a primary role of active oxygen species in induction of host cell death during infection of bean leaves with Botrytis cinerea / A.V. Tiedemann // Physiol. Mol. Plant Pathol. 1997. - Vol. 50. - P. 151-166.

150. Torres, M. A. Six Arabidopsis thaliana homologues of the human respiratory burst oxidase (gp91(phox)) / M. A. Torres et al.// Plant J. 1998. -Vol. 14.-P. 365-370.

151. Tsujimoto, Y. Apoptosis and necrosis: Intracellular ATP level as a determinant for cell death modes / Y. Tsujimoto // Cell Death Differ. 1997. -Vol. 4.-P. 429-434.

152. Wojtaszek, P. Oxidative burst: an early plant response to pathogen infection / P. Wojtaszek // Biochem. J. 1997. Vol. 322. - P. 681-692.

153. Wright, W. E. Nuclear control of cellular aging demonstrated by hybridization of nucleate and whole cultured normal human fibroblasts / W. E. Wright, L. Hayflidk // Exp Cell Res. 1975. - Vol. 96. - P. 113-121.

154. Wyshak, G. Fertility and longevity in twins, sibs and parents of twins / G. Wyshak // Soc. Biol. 1978. - Vol. 25. - P. 315-330.

155. Xie, Z. Harpin-induced hypersensitive cell death is associated with altered mitochondrial functions in tobacco cells / Z. Xie, Z. Chen // Mol. Plant Microbe Interact.-2000.-Vol. 13.-P. 183-190.

156. Yonish, S. Wild-type p53 induces apoptosis of myeloid leukaemic cells that is inhibited by interleukin-6 / S. Yonish et al. // Nature. 1991. - Vol. 352. -P. 345-347.

157. Zamyatnina, V. A. Subcellular reorganization of mitochondria producing heavy DNA in aging wheat coleoptiles / V. A. Zamyatnina, et al. // Biochemistry. 2002. - Vol. 67, No. 2. - P. 212-221.

158. Гринблат, А.И. Патент на изобретение №2293969: Способ определения активности фермента / А.И. Гринблат // Бюллетень № 5 от 20.02.2007.

159. ФГОУ ВПО Орловский государственный аграрный университет1. На правах рукописи1. Гринблат Антон Иосифович