Разработка амплификационной тест-системы для идентификации возбудителей кокцидиоидомикоза

Гришина, Марина Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка амплификационной тест-системы для идентификации возбудителей кокцидиоидомикоза
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка амплификационной тест-системы для идентификации возбудителей кокцидиоидомикоза"

На правах рукописи

Гришина Марина Анатольевна

РАЗРАБОТКА АМПЛИФИКАЦИОННОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КОКЦИДИОИДОМИКОЗА

03.00.07 - микробиология

Автореферат

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Волгоград - 2006

003068038

Работа выполнена в ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научный руководитель: кандидат медицинских наук,

доцент Антонов Валерий Алексеевич.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Попов Юрий Алексеевич;

кандидат медицинских наук Пронина Елена Александровна.

Ведущая организация: Ростовский-на-Дону НИПЧИ.

Защита состоится « в '/Ц часов на заседании дис-

сертационного совета Д 208.078.01 по присуждению учёной степени доктора (кандидата) наук при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РосНИПЧИ «Микроб».

Автореферат разослан <

« ^ » 200

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук,

старший научный сотрудник АЛ.Слудский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Кокцидиоидомикоз - инфекционное заболевание, вызываемое особо опасными диморфными грибами Coccidioides immilis и Coccidioides posadasii. С immilis эндемичен для Калифорнии (США), а C.posadasii имеет значительно более широкое географическое распространение, включая юго-западную часть США, Центральную и Южную Америку [М.С. Fisher et al., 2001; 2002].

Отдельные эпидемические вспышки кокцидиоидомикоза описаны и вне эндемичных регионов. Опасности заражения подвергаются люди, посещающие эндемичные территории, и пациенты при пересадке органов от больных кокцидиоидомикозом [J.E. Blair et al., 2001; S.Verghese et al., 2002; V.Chaturvedi et al., 2000; S.A. Desai et al., 2001; P.W. Wright et al., 2003; M.B.Miller et al., 2004]. Иммунодефицитное состояние макроорганизма увеличивает риск возникновения заболевания [J.N.Galgiani, 1999; J.A. Leake et al., 2000].

Спорадические вспышки в неэндемичных районах могут быть вызваны артроспорами грибов, находящимися в импортируемом инфицированном сырье (преимущественно сельскохозяйственная продукция) [A.Ogiso et al., 1997].

В России до сих пор не было зарегистрировано ни одного случая этого микоза. В то же время имеется вероятность выявления данных возбудителей у туристов и лиц, прибывающих из эндемичных стран Западного полушария, а также в продуктах растениеводства, импортируемых из этих стран.

Ввиду существования угрозы возникновения чрезвычайных биологических ситуаций в результате террористических актов, интерес к возбудителям кокцидиоидомикоза проявляется и как к потенциальным агентам биотерроризма [D.M. Dixon, 2001]. Степень угрозы обусловлена не только легкостью создания микроспорового аэрозоля, неэффективностью вакцин, сложностью терапии и диагностики, но и отсутствием иммунной прослойки и потому практически полной незащищенностью нашего населения от этого патогена.

В естественных условиях возбудители кокцидиоидомикоза обитают в почве в мицелиальной форме, а инфицирование людей и многих видов млекопитающих происходит при случайной встрече человека и животных с этими патогенами во время обильной вегетации грибов. При ингаляции артроспор в макроорганизме происходит совершенно иной, чем в почве, морфологический цикл развития грибов, именуемый паразитическим или тканевым. Артроспоры увеличиваются в размерах, что сопровождается быстрым и синхронным делением ядра, и гриб образует сферические клетки, так называемые сферулы, содержащие эндоспоры. По мере созревания стенка зрелых сферул разрывается и эндоспоры, попадая в кровь и ткани, образуют новые сферулы [J.N.Galgiani, 1993].

Трудности диагностики кокцидиоидомикоза обусловлены диморфным характером этих микроскопических грибов - способностью существования в виде мицелиальной (сапробиотической) форме во внешней среде и тканевой (паразитической) в организме человека и животных. Выделение и идентификация культуры по традиционной схеме лабораторного анализа, включая использование биопробных животных, занимает около 30 суток. Общим для всех иммуно-серологических методов, направленных на выявление грибов, является их недостаточная чувствительность и специфичность [А.В.Липницкий и др., 1995;

B.С.Лесовой и др. 1995].

В качестве альтернативных способов выявления данных патогенов в последнее время все более активно используются молекулярно-генетические методы идентификации. Одним из них является полимеразная цепная реакция, которую отличает универсальность, высокая чувствительность и относительная простота исполнения. Первое сообщение о разработке праймеров для идентификации возбудителя кокцидиоидомикоза опубликовано S. Pan и G. Cole в 1995 году [S. Pan, G.T. Cole., 1995]. Выбранные праймеры на основе последовательности гена, кодирующего 19 kDa специфичный антиген, авторы рекомендовали для создания амплификационной тест-системы с целью выявления С immitis В последующих работах для конструирования специфических праймеров использовалась спейсерная область рибосомальных генов [D.R. Greene et al., 2000]. Однако, учитывая высокую консервативность рибосомальных генов различных видов грибов, существует вероятность получения ложноположительных результатов, в первую очередь при исследовании материала из объектов внешней среды [B.C. Millar et al., 2003]. Тест-система на основе праймеров, фланкирующих ген, кодирующий АГ богатый пролином [R.Bialek et al., 2004], была апробирована только при исследовании биопсийных образцов тканей, пораженных C.posadasii. В этой работе отсутствовали данные о какой либо возможности идентифицировать предложенной тест-системой С. immitis. До сих пор нет публикаций, в которых бы приводились результаты использования ПЦР не только для выявления, но и дифференциации возбудителей кокцидиоидомикоза между собой.

На основании вышеизложенного, очевидна актуальность исследований, направленных на совершенствование схем лабораторной диагностики кокцидиоидомикоза и создания амплификационных тест-систем для идентификации

C. immitis и С posadasii

Цель работы заключалась в выборе специфичных праймеров и конструировании тест-системы для выявления и дифференциации С. immitis и С posadasii методом полимеразной цепной реакции.

Задачи исследования

1. Провести анализ нуклеотидных последовательностей, представленных в различных генетических базах данных, с целью подбора праймеров для идентификации СЛттШв и С posadasii методом ПЦР.

2. Оценить специфичность и чувствительность выбранных олигонуклеотид-ных затравок на широком наборе гомологичных и гетерологичных штаммов микроорганизмов и сконструировать амплификационную тест-систему для идентификации и дифференциации С ттШБ и Срвзас/аяН.

3. Определить видовую принадлежность штаммов возбудителей кокцидио-идомикоза, предоставленных Коллекционным центром Волгоградского научно-исследовательского противочумного института, с помощью методов генетического типирования.

4. Установить оптимальные способы обеззараживания материала и подготовки проб при исследовании объектов внешней среды и биологического материала, контаминированных возбудителями кокцидиоидомикоза.

5. Оценить эффективность сконструированной тест-системы для детекции С 1ттШь и С в объектах внешней среды и диагностики экспериментального кокцидиоидомикоза.

Научная новизна

Впервые разработана отечественная амплификационная тест-система для идентификации и дифференциации возбудителей кокцидиоидомикоза на основе фрагмента гена макрофагсвязанного протеина САттШз и на основе фрагмента гена гликопротеина внешней стенки сферул С ро$ас1а$И. Показана ее эффективность при обнаружении ДНК грибов в объектах, искусственно контаминированных штаммами СосШтдез $рр., и биологическом материале от экспериментально зараженных животных. Олигонуклеотидные праймеры СтМВРХз -С'ипМВРЪся обеспечивают специфическую амплификацию обоих возбудителей кокцидиоидомикоза, а праймеры Ср5О№82$ - СрБОЦЫаБ - только Сро.часЬязи.

Схема лабораторной диагностики кокцидиоидомикоза дополнена этапами ПЦР как при идентификации чистых культур С.роза(1ази и С. ¡ттМм, так и исследовании экспериментального клинического материала и проб из объектов внешней среды.

На основе результатов внутривидового генетического типирования и анализа культур Сосс'1сНо1с1ез .чрр методом ПЦР с использованием двух пар праймеров, определена видовая принадлежность коллекционных штаммов возбудителей кокцидиоидомикоза.

Предложен способ выделения ДНК возбудителей особо опасных микозов из контаминированных проб почвы и клинических образцов, обеспечивающий высокоэффективный лизис клеток патогенных грибов с последующей очисткой ДНК. Приоритетность исследований подтверждена положительным решением о выдаче патента на изобретение «Способ выделения ДНК Сосс1с1Ыс1е$ ттШя для проведения полимеразной цепной реакции» №2005122043/14(024850) от 12. 07.2005г.

Практическая значимость

Сконструированная амплификационная тест-система может быть использована в специализированных лабораториях для идентификации и дифференциации возбудителей кокцидиоидомикоза. На сегодняшний день предложенные праймеры используют в лабораториях Волгоградского научно-исследовательского противочумного института для анализа музейных штаммов Сосс1с1Ыс1ез арр при изучении их фенотипических и генетических особенностей

Материалы диссертации включены в лекционный материал, предназначенный для врачей, биологов и лаборантов учреждений санитарно-эпидемиологического профиля и клинических диагностических лабораторий при проведении первичной специализации и курсов усовершенствования по вопросам специфической индикации, лабораторной диагностики особо опасных заболеваний и противодействию биотерроризму.

По результатам диссертационной работы составлены методические рекомендации: «Способ обеззараживания материала, зараженного возбудителями кокцидиоидомикоза, для проведения полимеразной цепной реакции» и «Использование олигонуклеотидных праймеров СтМВР\а - СлтМВР2аь и СрБОШ%2з - Ср80\У%2а$ для идентификации и дифференциации возбудителей кокцидиоидомикоза», одобренные Ученым советом Волгоградского научно-исследовательского противочумного института (протокол №5 от 07.06.2006 г.) и утвержденных директором института.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Олигонуклеотидные праймеры С'тМВР 15 - СтМВР2аз, подобранные на основе гена, детерминирующего макрофагсвязанный белок МВР-1, обеспечивают амплификацию специфичных фрагментов ДНК обоих видов возбудителей кокцидиоидомикоза, а праймеры С/л^О^И?!? - Ср801Щ2а$, выбранные на основе SOWgp82 гена, кодирующего иммунодоминантный гликопротеин внешней стенки сферул, позволяют детектировать С розайаьй

2. Амплификационная тест-система для идентификации и дифференциации возбудителей кокцидиоидомикоза, сконструированная на основе родос-пецифических праймеров СгтМВРЪ - СтМВР2а$ и видоспецифических олигонуклеотидных затравок СрБ01¥82х - СрБОИЫаз для выявления С.рохасккп, обладает чувствительностью 1х104 артроспор/мл при анализе чистых культур микромицетов.

3. Обработка проб раствором мертиолятом натрия до конечной концентрации 1:10ОО позволяет проводить обеззараживание материала, содержащего возбудителей кокцидиоидомикоза, для его исследования методом ПЦР без снижения чувствительности реакции амплификации.

4. Экстракция ДНК грибов с помощью гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформного метода с последующей нуклеосорбцией является эффективным способом подготовки проб при исследовании объектов внешней среды и биологического материала методом ПЦР.

5. Разработанная амплификационная тест-система с праймерами CimMBP\s - CimMBP2as и CpSOW82s - CpSOW82as обеспечивает выявление возбудителей кокцидиоидомикоза при исследовании биологического материала от экспериментально зараженных животных.

6. Сконструированная тест-система позволяет специфически детектировать С immilis и C.posadasii с чувствительностью 1х104 артроспор/мл при исследовании объектов внешней среды (почвы), искусственно контамини-рованных возбудителями кокцидиоидомикоза.

Апробация работы

Основные материалы диссертации доложены: на научно-практической конференции по медицинской микологии «VII Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 2004); V Всероссийской научно - практической конференции, - «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004); Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология - XXI век» (Саратов, 2004); III Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2005); Научно-практической конференции по медицинской микологии «VIII Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 2005); VI Межгосударственной научно-практической конференции государств участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников Содружества Независимых Государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005); IV Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2006); Научно-практической конференции по медицинской микологии «IX Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 2006), а также на научных конференциях Волгоградского НИПЧИ.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 124 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 5-ти глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 177 источников, в том числе 35 отечественных и 142 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 21 рисунком.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы В качестве исследуемого материала использовали взвеси чистых культур микромицетов, биологический материал от лабораторных животных, экспериментально заражённых C.posadasii (образцы лёгких, печени, селезёнки и кровь), пробы почвы, искусственно контаминированной С immitis и C.posadasii.

Обьектами исследования служили 26 штаммов Coccidioides immitis, 2 штамма Blastomyces dermatitidis, 3 штамма Histoplasma capsulatum, 1 штамм Histoplasma duboisii, 1 штамм Histoplasma farciminosum и 2 штамма Paracoccidioides brasiliensis В работе использовали по 1 штамму возбудителей оппортунистических микозов: Candida albicans, Nocardia asteroides, Mucor racemosus, Aspergillus fumigatus, Emmonsia parva, Emmonsia crescens и по 1 штамму гетерологичных бактериальных микроорганизмов - Burkholderia pseu-domallei, Burkholderia mallei, Yersinia pestis и Escherichia coli. Исследуемые штаммы микроорганизмов были предоставлены Коллекционным центром Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.

Штаммы возбудителей особо опасных микозов в мицелиальной фазе роста культивировали на агаре Сабуро с 3 % дрожжевым экстрактом (Difco, США) при 28°С в течение 30 суток. Дрожжевые формы Н.capsulatum, В dermatitidis и Р brasiliensis выращивали на агаре Френсиса при 37°С в течение 10 суток. Для других микроорганизмов использовали общепринятые для соответствующих видов питательные среды и сроки инкубирования

Моделирование кокцидиоидомикозной инфекции осуществляли путём внутрибрюшинного введения белым мышам 1,0 мл суспензии артроспор 30-ти суточной культуры штамма C.posadasii 36 Silveira в 0,15 М NaCl (рН 1,2-1,А). Заражающая доза составляла 1x103 КОЕ/мл. Экспериментальных животных вскрывали на 3, 7, 14 и 21 сут после заражения, Части внутренних органов (лёгких, печени, селезёнки) и кровь исследовали в ПЦР. Одновременно делали высев на питательные среды. Идентификацию выделенной культуры возбудителя кокцидиоидомикоза проводили по общепринятым схемам.

Выделение ДНК из чистых культур микромицетов осуществляли с помощью метода гуанидинтиоцианат-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом [G. S.Sandhu et al., 1995].

При конструировании праймеров ориентировались на результаты секве-нирования нуклеотидных последовательностей, представленных в GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information). Анализ молекулярной структуры праймеров проводили с использованием компьютерных программ Gene Runner 3.0 и Oligo 4.0 (проверяли на образование димеров, шпилек и других вторичных структур). Определение степени гомологии нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы BLASTn на сервере (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/').

Олигонуклеотидные праймеры синтезировали фосфоамидитным методом на автоматическом синтезаторе ДНК «АСМ-102 У» (АОЗТ «Биосан», г. Новосибирск) на базе НПФ «ДНК-технология» (г. Москва).

Реакционная смесь с обеими парами праймеров включала 2 мМ MgCl2 и 1 ед. Taq-полимеразы производства НПФ «ДНК-Технология», 200 мкМ каждого из четырёх дезоксинуклеозидтрифосфатов, специфические олигонуклеотидные праймеры по 12 пМ. Для проведения реакции амплификации с праймерами CpSOWS2s - Cp.SOlV82as использовали десятикратный буфер для ПЦР ((NH4)2S04 - 170 мМ, BSA - 2мг/мл, DTT- 10 мМ, Трис - 670 мМ, pH 8,8), а с праймерами CimMBPls - CimMBP2as ПЦР-буфер производства НПФ «ДНК-Технология». Реакцию амплификации проводили на программируемом термо-циклере «Терцик» (НПФ «ДНК-технология», Москва) с применением «горячего старта».

Все манипуляции при постановке реакции амплификации проводили в соответствии с МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-I1 групп патоген-ности» (2003 г).

Наличие специфических ампликонов определяли электрофоретическим разделением амплификационной смеси в 1,5 % агарозном геле. Гель-электрофорез проводили согласно рекомендациям, изложенным в руководствах [Л.А.Остерман, 1981; Т. Маниатис и др., 1984].

Реакцию рестрикции ампликонов проводили по общепринятым методикам [Т. Маниатис и др., 1984]. В работе использовали эндонуклеазы рестрикции Hinf I (MBI «Fermentas», Литва).

Секвенирование продуктов амплификации проводили на базе ЗАО «ПИННИ» г.Москва с использованием набора BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США).

Для проведения статистической обработки результатов использовали пакет прикладных программ STAT1ST1CA 6.0 (StatSoft Inc ,США)

Результаты исследований

Для идентификации С ¡ттШя и С. розаскки в качестве ДНК - матрицы были выбраны участки гена МВР-1, детерминирующего макрофагсвязанный белок, и гена, кодирующего иммунодоминантный гликопротеин

внешней стенки сферул. Олигонуклеотидные затравки СЫМВРХя атМВР2а.ч, выбранные на основе последовательности гена МВР-1, были общими (родоспецифическими) для идентификации С ттМь и С.ро$ас1а$И (рис.1). Праймеры СрБОН'82«- СрЗОИ/82ая, подобранные на основе последовательности фрагмента гена SOWgp82, сконструированы для обнаружения С.рояасЬзИ (рис.2).

AF326276 С. immilis ААЕС02000000 C.immitis RC ID 222929 C.posadasii C735

219 |.....CimMBPÍs........|

gcaggttaatgaatagcgttggtg gaccactggcaggttaatgaatagcgttggtgtattacgt gaccactggcaggttaatgaatagcgttggtgtattacgt gaccactggcaggttaatgaatagcgttggtgtattacgt

AF326276 C.immitis AAEC02000000 C.immitis RC ID 222929 Сposadasii C735

|.........CimMBPlas . | 815

caaacatcagtccgtaatcgtgtg ctccacatacaaacatcagtccgtaatcgtgtggcgctaa ctccacatacaaacatcagtccgtaatcgtgtggcgctaa ctccacatacaaacatcagtccgtaatcgtgtggcgctaa

Рис.1. Нуклеотидные последовательности фрагментов гена МВР-1 C.immitis и C.posadasii на участках посадок праймеров

3268 I . . CpSOmis I

cacttcttaagtcttatttcc

AF308873 С posadasii caatgatagcacttcttaagtcttatttccttagcactt

ААЕС02000000 C.posadasii С735 caatgatagcacttcttaagtcttatttccttagcactt ID 222929 С. immitis RC caatgatagcacttcttaagtcttatttccttagcactt

|.....CpSOW$2as........| 3567

ggcattgatcgtcacctccat AF308873 C.posadasii acggagggcattgatcgtcacctccatggttgtcta

ААЕС02000000 С posadasii C735 acggagggcattgatcgtcacctccatggttgtcta ID 222929 С immitis RC acggagcgcattgatcgtcaccatggttgtctatat

Рис.2. Нуклеотидные последовательности фрагментов гена SOИ/gp82 С ¡ттШ5 и Сposadasii и локализация праймеров.

Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт обладает уникальной в России коллекцией грибных культур II группы патогенно-сти. Однако все исследуемые штаммы возбудителя кокцидиоидомикоза числились в Коллекционном центре Волгоградского научно-исследовательского противочумного института как САшпиШ. Фенотипических признаков с помощью которых можно было бы дифференцировать С.'иптН'и и C.posadasii до настоящего времени не установлено. Поэтому специфичность выбранных праймеров была определена после установления видовой принадлежности исследуемых культур Coccid¡oides зрр. с помощью генотипических методов.

Генотипирование культур СоссШюЖз $рр. проведено на основе анализа единичных нуклеотидных замен (БКР) в вариабельных участках ДНК этих

микромицетов. Для выявления SNP использовали метод ПЦР-ПДРФ, который заключался в амплификации хромосомных локусов Ы и VL возбудителей кок-цидиоидомикоза и гидролизе ампликонов эндонуклеазой рестрикции Hinf I. В работе Fisher М.С. et al. [М.С. Fisher et al., 1999; 2000] показано, что у штаммов C.immitis в локусе Ы отсутствует полиморфный сайт рестрикции для эндонук-леазы Hinf 1, но имеется сайт рестрикции для данной эндонуклеазы в локусе VL. У штаммов C.posadasii локус Ы гидролизовался эндонуклеазой Hinf I по полиморфному сайту, но рестрикция локуса VL у этой группы штаммов отсутствовала.

В результате работы было выяснено, что штаммы микромицетов из коллекции музея культур Волгоградского научно-исследовательского противочумного института гетерогенны по рестрикционному профилю и образуют две группы. По картине рестрикции локусов Ы и VL 15 штаммов Coccidioides spp. были отнесены нами к виду C.posadasii и 11 штаммов - С immitis. Наличие нук-леотидных замен в полиморфных сайтах рестрикции подтверждено секвениро-ванием последовательностей ампликонов локусов Ы и VL и сравнительным анализом с генетической базой данных GenBank NCBI.

После определения видовой принадлежности штаммов возбудителей кок-цидиоидомикоза определены оптимальные параметры постановки ПЦР для обеих изучаемых пар праймеров. При соблюдении всех условий проведения анализа размеры амплифицированных фрагментов ДНК составили для праймеров CimMBPls - CimMBP2as 597 п.н., а для CpSOW82s - CpSOW82as - 300 п.н., что соответствовало расчетным данным.

При тестировании коллекции культур Coccidioides spp. с использованием олигонуклеотидных затравок CimMBPls - CimMBPlas продукт амплификации синтезировался с ДНК всех штаммов возбудителей кокцидиоидомикоза с чувствительностью 1х102 - 1х104артроспор/мл. С помощью праймеров CpSOWSls -CpSOWS2as специфический фрагмент амплификации был обнаружен при анализе 15 штаммов C.posadasii. Чувствительность реакции колебалась в пределах 1x10' - 1х103 артроспор/мл. С другими видами близкородственных грибов и ге-терологичных микроорганизмов с обеими парами праймеров в 100 % случаев получен отрицательный результат.

Для проверки специфичности продуктов ПЦР проведено их секвенирова-ние. С помощью программы BLASTn выявлено, что секвенированные нуклео-тидные последовательности ампликонов, синтезируемых с помощью праймеров CpSOm2s - CpSO№2as, были гомологичны (99 %) гену SOWgp82 C.posadasii (GenBank NCBI, accession AF308873). При сравнительном анализе секвениро-ванных фрагментов амплификации, полученных с праймерами CimMBPls -CimMBP2as, их нуклеотидная последовательность имела 99 % гомологии с опубликованной последовательностью гена МВР-1 С immitis (GenBank NCBI, accession AF326276).

Выявленные генетические различия исследуемых изолятов возбудителей кокцидиоидомикоза подтвердили специфичность праймеров CpSOW%2s-CpSOW 82ял и CimMBPls - CimMBPlas (таб.1).

Таблица 1. Результаты ПЦР-ПДРФ вариабельных локусов ДНК коллекционных штаммов возбудителей кокцидиоидомикоза и специфичности сконструированных праймеров.

Штаммы Рестрикция локуса Праймеры

VI, Ы атмври-СипМВР1а$ СрБОт 2*-сряотгаБ

СлттШа 333, 46-Р, 46-Н, 158, 4, С-5,34,46, 441,5960, 30881 + - + -

С.роиа(1ат 22,7/86, А-1, М-11, В-13, 24, 36 ЭПуен-а, 51,442, В-475, 27567, 30883, 36794, 37686, 95271 - + + +

Поскольку возбудители кокцидиоидомикоза относятся к группе особо опасных инфекций, работа с которыми строго регламентирована, то и проведение полимеразной цепной реакции должно быть обеспечено соответствующими методами подготовки проб, предусматривающими обеззараживание исследуемого материала. Но, рекомендуемые способы обеззараживания и табельные средства стерилизации проб, содержащих возбудителей особо опасных микозов (растворы формалина, автоклавирование и др.), не могут быть использованы при подготовке материала для его анализа методом ПЦР, поскольку приводят к деградации генетического материала или ингибированию реакции амплификации.

На основании проведённых нами экспериментов показано, что для проведения ПЦР наиболее эффективным способом обеззараживания проб, содержащих возбудителей кокцидиоидомикоза, являлось использование раствора мер-тиолята натрия в конечной концентрации 1:1000 с последующим их прогреванием в течение 40 мин при температуре (56+1 )°С.

Еще одним важным условием адекватного проведения реакции амплификации является получение ДНК в достаточно чистом виде, не содержащей примесей, ингибирующих реакцию. Учитывая, что возбудители кокцидиоидомикоза относятся к потенциальным агентам биотерроризма, большое значение приобретает экспрессность их идентификации в объектах внешней среды, где могут присутствовать различные органические соединения, ингибирующие реакцию амплификации. Существующие методы пробоподготовки, описанные в литературе, обеспечивали хороший лизис, но не давали достаточной очистки ДНК от примесей компонентов почвы, что приводило к появлению ложноотрица-тельных результатов ПЦР.

дитслей кок ци д но ид о ми к оза ш почвы предлагаемым способом чувствительность реакции амплификации составила 1 х i О4 клеток с обеими парами п рай мерой,

С помощью предлагаемой нами тест-системы были проанализированы биоптаты и кроаь от лабораторных животных, экспериментально заражённых возбудителем кокцидиоидоми коза. При эиутрибрюшинном заражении белых мышей С. immitis или C.posadasii развивается, как правило, диссемшифрованный кокцидшидомишз. Началом острого кокцидиоидошикт следует считать 3 суд, когда артроспоры начинают превращаться в сферулы, На 7 день уже обнаруживают абсцессы и гранулёмы печени и селезенки, начинается развитие сливной пневмонии. Поэтому для реакции амплификации отбор секционного Материала от инфицированных белых мышей осуществляли на 3, 7, !4 и 21 сут после заражения. Исследование биологических проб проводили параллельно культуральным микологическим методом и ПЦР.

Возможность обнаружения возбудителя к о к ци ди о я до м и ко за методом ПЦР показана при анализе нроб крови экспериментально заражённых животных, начиная с третьих суток после заражения, С прайм ерами CpSOW%2s -CpSOW82as ДНК С. posadasii 36 Silveira в этот период была выявлена в 50 % образцов крови, fia 7, 14 и 21 сут после заражения выявление ДНК возбудителя кокцидиоидомикоза возросло и составило 75 %. При использовании праймеров CimMBPls - CimMBFlas на 7 и 14 дни заражения положительные результаты ПЦР были получены в 50 % проб. На 3 и 21 сут наблюдения ДНК гриба обнаруживали в 25 % случаев. При исследовании образцов крови с помощью микологического метода возбудитель кокцидиоидомикоза удалось выявить только с 7 сут заражения в 50 % проб крови. На 14 день при посеве рост фиба наблюдался во всех пробах крови (100 %). А на 21 день-только в 25 % (рис. 3).

3 сут 7 сут 14 сут 21 сут

Н Ср80УУ825 - Ср5СМ82а5 В С1тМВР1з-С1тМВР2а5 Е Микологический метод

Рис. 3. Выявление С розасШэИ 36 ЗЛус^га в крови экспериментально

зараженных животных с использованием микологического метода и ПЦР,

Примечание: по оси ординат - % положительных результатов

Для обнаружении возбудителя коккидиоидомикоза методом ПЦР оценена возможность использования сконструированных праймеров С1тМВР\.% -СтМВР2ай и Ср$ОШЫз - (,р.^ОИ'82а\ для анализа биологическою материала (печень, селезенка, легкие) при экспериментальной инфекции. Показано, что и реакции амплификации возбудитель детектировался в суспензиях органов от всех белых мышей, зараженных культурой гриба, на всех сроках наблюдения.

Возбудитель кок цидио идо микоза с помощью реакции амплификации обнаружен а крови, селезенке и легких уже на 3 сут после заражения, что свидетельствовало о диссемииации возбудителя. С помощью культурам, но го метода на 3 сут после заражения С. рошсЬ.чп 36 5П\;е1га выявлен лишь в 25 % проб селезенки (рис.4). При вскрытии зараженных животных в этот срок наблюдения макроскопических изменений внутренних органов выявлено не было.

[Апологический метод CpSO№2s- CpSCMB2as GniffiPls - QnrWBP2as

печень селезенка легкие кровь

□ CimMSPIs - CimMBP2as 0CpSCM62s^ CpSCW/B2as Ш Мйюпогический метод

Рис. 4.Результаты выявления С, posadasii 36 Siiveira в органах при экспериментальной инфекции на 3 сут заболевания. Примечание: по оси ординат - % положительных результатов.

Начиная с 7 сут, наблюдалось увеличение количества положительных проб как методом ПЦР, так и микологическим метолом. На 14 сут иатоморфологическая картина была характерна для диссеминир ова и но го ко кии ли оило микоза [A.B. Лишшцкий и др., 1998: B.C. Лесовой и др. 1995: M..I. Fiese, 1958]. При анализе биологического материала ДНК С. posadasii 36 Siiveira методом ПЦР на 21 день наблюдения с использованием праймеров CpSOÜ'%2s -Cp$0lV&2as обнаруживали в образцах печени (75 %), селезёнке (100 %) и лёгких (100 %). С помошыо праймеров CimMBP\s - CimMBPlas ДНК выявлена в образцах печени и селезёнки в 50 % случаев и 75 % проб лёгких.

Микологическим методом на 21 день наблюдения возбудитель обнаруживали в образцах печени (75 %) и селезёнке (100 %), а и посевах легких всех животных возбудитель к о к п и д но ндо м и коза выделить не удалось, ввиду роста посторонней микрофлоры (рис.5).

печень селезенка легкие кровь

О атМВР15 -С)тМВР2аз 13 СрЭСМ825 - СрЗОУШаэ и Микологический метод

Рис. 5. Результаты выявления С. posacJa.HH 36 5[!\ена у животных при экспериментальном кокцидиоидомикозе на 21 сут заболевания. Примечание: по оси ординат - % положительных результатов.

Синтезируемые в ПЦР ампликоны, полученные при анализе проб крови и внутренних органов экспериментально зараженных животных, были выборочно секвенироваиы. При сравнительном анализе нуклеотидных последовательностей секвенированных фрагментов ДНК с помощью программы ВЬА5Тп был сделан вывод о гомологии секвенированных продуктов только с геномом возбудителя ко к и иди о идо ми ко за, что свидетельствовало о специфичности выбранных праймеров.

С материалом контрольный группы (интактных) белых мышей в ПЦР с разработанными праймерами получен отрицательный ответ.

При исследовании методом ПЦР проб секционного материала, полученного от зараженных белых мышей, более высокий процент положительных результатов. так же как и при исследовании крови, наблюдался с праймерами

СрВотъ - Срзотгск.

Эффективность ПЦР для обнаружения ДНК С.рохаЛмН 36 5]|ус1га при анализе биоптатов от живот пых зараженных этим патогеном превышала микологический метод на 9,36 %. При сравнительной статистической опенке эффективности микологического метода и ПЦР ие установлено статистически досто-

100 80 60

40 20 о

МР^ Микологический метод Г СрЗО№2з - СрЗСЧШаБ С1ггйМВР1э - С1тМВР2ав

верных различий в диагностической эффективности этих двух методов (р=0,08). В то же время, необходимо помнить о преимуществе ПЦР, которое выражается в возможности получения результатов в более ранние сроки.

При параллельном использовании микологического метода и ПЦР, совпадение данных отмечено в 64,73 % случае (таб.2). Из 22 (35,27 %) несовпадающих результатов в 14 (21,87 %) случаях положительные данные получены только в реакции амплификации. Отрицательные результаты ПЦР, полученные в 8 (12,5 %) микологически подтверждённых пробах, мо1уг объясняться низкой концентрацией клеток в данных пробах, а также тем, что части органов, используемые для микологического посева, намного превышали объем проб, необходимых для анализа методом ПЦР.

Таблица 2. Сопоставление результатов ПЦР и микологического метода при исследовании биологического материала от экспериментально зараженных животных С. ро.$ас1сиИ 36 БПуета

Результаты микологического метода Результаты ПЦР

положительные отрицательные

Положительные (35) 27 8

Отрицательные (29) 14 15

Всего 64 41 23

На основании проведенных исследований можно сделать заключение о принципиальной возможности использования праймеров СтМВР\8 -С\тМВР2а$ для ускоренной идентификации двух возбудителей кокцидиоидо-микоза - СЛттШя и Срозаскляи. Олигонуклеотидные затравки СрБОШ!.? -СрБОМЫси являются видоспецифическими и позволяют детектировать только Сро$ас1азп. На сегодняшний день культурально-морфологические и иммуноди-агностические тесты для дифференциации этих возбудителей не разработаны. Известные генотипические методы предполагают наличие чистой культуры, являются более трудоемкими и дорогостоящими. Предложенная нами ампли-фикационная тест-система с двумя парами праймеров позволяет не только выявлять возбудителей кокцидиоидомикоза при исследовании чистых культур грибов, объектов окружающей среды и биологического материала, контамини-рованных возбудителями кокцидиоидомикоза, но и проводить дифференциацию С ¡ттМи и С.розас!а$Н

В результате проделанной работы показано, что одним из преимуществ ПЦР по сравнению с микологическим методом для идентификации микромице-тов рода СосШШс1е5 является скорость получения результатов. Продолжительность ПЦР-анализа составляет 3-4 часа (чистые культуры) и 6 часов для проб биологического материала и объектов окружающей среды. Это значительно быстрее 15-30 суточного выращивания грибов на питательной среде с обяза-

тельным последующим доказательством их двуфазности и проверки вирулентности культур при помощи биологического метода (еще 7-10 сут).

Таким образом, разработанная амплификационная тест-система с двумя парами праймеров САтМВРХп - СтМВР2аз и Ср50\У825 - Ср$ОМ'82а,ч может быть использована для идентификации и дифференциации возбудителей кок-цидиоидомикоза и позволяет в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать возбудителей кокцидиоидомикоза в биологическом материале и объектах окружающей среды.

ВЫВОДЫ

1. На основе нуклеотидных последовательностей, представленных в базе СепВапк МСВ1, были подобраны родоспецифические праймеры СгтМВР 1« - С'апМВР2а$, комплементарные фрагменту гена макрофагсвя-занного белка МВР-1, для идентификации С хттНм и С рохайази. Для обнаружения С ровас}а8и сконструированы видоспецифические праймеры СрБОШ25 - СрБОШ2а$, фланкирующие участок гена, кодирующего иммунодоминантный гликопротеин внешней стенки сферул ХО\¥£р82.

2. Для идентификации и дифференциации С иптгт и С po.4ada.sii разработана амплификационная тест-система с двумя парами праймеров СтМВРХз - атМВР2аз и СрБОМ82$ - СрБОШ2а5 Подобраны оптимальные условия проведения ПЦР, при соблюдении которых можно обнаруживать возбудителей кокцидиоидомикоза с чувствительностью 1x104 артроспор/мл при анализе чистых культур микроорганизмов.

3. Установлена видовая принадлежность исследуемых штаммов возбудителей кокцидиоидомикоза на основании данных рестрикционного анализа хромосомных локусов Ы и УЬ, а также секвенирования фрагментов ДНК, синтезируемых в реакции амплификации с помощью праймеров СтМВРЪ - СтМВР2аз и СрЗОМПз - СрБО№2аз. Показано, что штаммы гриба из коллекции музея культур Волгоградского научно-исследовательского противочумного института принадлежат двум видам микроорганизмов - Сposadasii и С ¡ттШз.

4. Показано, что для обеззараживания материала, содержащего возбудителей кокцидиоидомикоза, при исследовании методом ПЦР, может быть использован раствор мертиолята натрия до конечной концентрации 1:1000 с последующим прогреванием проб в течение 40 мин при температуре (56±1)°С. Данный способ обеззараживания обеспечивает эффективную инактивацию гриба и позволяет проводить реакцию амплификации без снижения чувствительности метода ПЦР.

5. Подобран эффективный способ выделения ДНК Coccidioides ,чрр из объектов внешней среды (почвы) и биологического материала, контаминиро-ванных артроспорами возбудителя, основанный на гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформной депротеинизации с последующей очисткой ДНК методом нуклеосорбции.

6. Продемонстрирована возможность использования сконструированной амплификационной тест-системы для специфической детекции C.immitis и С posadasii с чувствительностью 1х104 артроспор/мл при исследовании объектов внешней среды, искусственно контаминированных возбудителями кокцидиоидомикоза.

7. Выявлена диагностическая эффективность разработанной амплификационной тест-системы на основе двух пар праймеров CimMBPXs -CimMBPlas и CpSOWS2s - CpSOlV$2as при анализе биологического материала от животных с экспериментальным кокцидиоидомикозом. Показана возможность использования метода ПЦР для детекции возбудителей кокцидиоидомикоза на ранних сроках инфекционного процесса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Антонов В.А., Алексеев В.В., Липницкий A.B., Лесовой B.C., Ткаченко Г.А., Гришина М.А., Савченко С.С. Идентификация возбудителей особо опасных микозов с помощью полимеразной цепной реакции // Проблемы мед. микологии,- 2004,- Т.6, №2,- С.57.

2. Антонов В.А., Алексеев В.В., Липницкий A.B., Лесовой B.C., Ткаченко Г.А., Гришина М.А., Савченко С.С. Использование ПЦР для экспресс - идентификации возбудителей особо опасных микозов И Медицинская микробиология - XXI век: Материалы Всероссийской научно-практической конференции. -Саратов, - 2004,- С. 25-26.

3. Антонов В.А., Алексеев В.В., Липницкий A.B., Замараев B.C., Лесовой B.C., Ткаченко Г.А., Гришина М.А., Савченко С.С. Генодиагностика глубоких микозов // Генодиагностика инфекционных болезней: Сб. трудов V Всероссийской научно - практической конференции. - М., - 2004. - Т.2.- С.157-158.

4. Антонов В.А., Алексеев В.В., Липницкий A.B., Замараев B.C., Ткаченко Г.А., Алтухова В.В., Савченко С.С., Лесовой B.C., Гришина М.А. Стратегия и тактика конструирования амплификационных тест-систем для идентификации патогенных буркхольдерий и возбудителей особо опасных микозов // Генодиагностика инфекционных болезней: Сб. трудов V Всероссийской научно-практической конференции,- М., - 2004,- Т.2. - С.160-161.

5. Лесовой B.C., Гришина М.А., Липницкий A.B., Становая О.В., Кулаков М.Я. Оценка иммунологических методов выявления in vivo антигенов возбудителя кокцидиоидомикоза // Успехи мед. микологии: Материалы III Всероссийского конгресса по мед. микологии.- М.,- 2005.- Т.5.- С.24-25.

6. Гришина М.А., Ткаченко Г.А., Савченко С.С., Становая О.В., Антонов В.А., Лесовой B.C., Замараев B.C., Липницкий A.B. Сравнительный анализ ПЦР и традиционных методов диагностики кокцидиоидомикоза на ранней стадии заражения // Успехи мед. микологии: Материалы III Всероссийского конгресса по мед. микологии.- М.,- 2005,- Т.5.- С. 17-19.

7. Гришина М.А., Ткаченко Г.А., Антонов В.А., Савченко С.С., Лесовой B.C., Замараев B.C., Липницкий A.B. Использование ПЦР для идентификации

возбудителя кокцидиоидомикоза // Проблемы мед. микологии - 2005,- Т.7, №2.- С.100-101

8. Становая О.В., Лесовой B.C., Кулаков М.Я., Гришина М.А., Липницкий A.B. Антигенные различия между штаммами Coccidioides spp // Проблемы мед. микологии,- 2005. - Т.7, №2. - С.109-110

9. Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Гришина М.А., Савченко С.С., Лесовой B.C., Замараев B.C., Липницкий A.B., Алексеев В.В. Использование ПЦР для ускоренной идентификации возбудителей особо опасных микозов // Проблемы мед. микологии.- 2005. - Т.7, №2. - С.30-37.

Ю.Гришина М.А., Ткаченко Г.А., Антонов В.А., Савченко С.С., Лесовой B.C., Замараев B.C., Липницкий A.B. Разработка амплификационной тест-системы для идентификации возбудителя кокцидиоидомикоза // Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях: Материалы VI Межгосударственной научно-практической конференции государств участников СНГ. - Волгоград, 2005,-С.226-227.

П.Ткаченко Г.А., Гришина М.А., Савченко С.С., Антонов В.А., Лесовой B.C., Замараев B.C., Липницкий A.B. Использование различных вариантов ПЦР для внутривидового типирования штаммов возбудителей кокцидиоидомикоза // Успехи мед. микологии: Материалы IV Всероссийского конгресса по мед. микологии. - М., 2006. - Т.8. - С. 103-104.

12.Гришина М.А., Ткаченко Г.А., Антонов В.А., Савченко С.С., Замараев B.C., Лесовой B.C., Липницкий A.B. Обнаружение диморфных грибов Coccidioides immitis и Coccidioides posadasii методом полимеразной цепной реакции П Успехи мед. микологии: Материалы IV Всероссийского конгресса по мед. микологии,- М., 2006. - Т.8. - С.98-100.

13.Лесовой В.С Гришина М.А., Липницкий A.B. О полиморфизме культур грибов рода Coccidioides // Успехи мед. микологии: Материалы IV Всероссийского конгресса по мед. микологии. - М., 2006.- Т.7. С.11-13.

Гришина Марина Анатольевна

РАЗРАБОТКА АМПЛИФИКАЦИОННОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КОКЦИДИОИДОМИКОЗА

03.00.07 - микробиология

Автореферат на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная №1-65гр. Печать офсетная . Тираж 100 экз. Заказ № 2098

Отпечатано ООО «Бланк» Лиц. №3550 г. Волгоград ул. Скосырева 2а

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гришина, Марина Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биологические свойства возбудителей кокцидиоидомикоза, эпидемиология и патогенез заболевания

1.2. Таксономическое положение Сосс/сЛо/с/ау ттШБ и СоссгйШйез розайази

1.3. Лабораторная диагностика кокцидиоидомикоза

1.4. ДНК диагностика особо опасных микозов 32 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы микроорганизмов, использованные в работе

2.2. Питательные среды и условия культивирования микроорганизмов

2.3. Обеззараживание материала, содержащего возбудителей ООИ

2.4. Подготовка проб для постановки реакции амплификации

2.5. Методы выделения ДНК

2.6. Выбор и синтез олигонуклеотидных праймеров

2.7. Постановка полимеразной цепной реакции

2.8. Секвенирование продуктов амплификации

2.9. Проведение электрофореза и детекция продуктов амплификации

2.10. Заражение лабораторных животных 49 2.11 .Статистическая обработка данных

ГЛАВА 3. ПОДБОР ПРАЙМЕРОВ И ОПТИМИЗАЦИЯ ПАРАМЕТРОВ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ

3.1. Анализ нуклеотидных последовательностей и конструирование ви- 51 доспецифических праймеров

3.2. Выбор оптимальных условий для постановки полимеразной цепной 58 реакции

ГЛАВА 4. ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДА ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КОКЦИДИОИДОМИКОЗА

4.1. Разработка способа обеззараживания материала содержащего воз- 62 будителей кокцидиоидомикоза

4.2 Оптимизация метода выделения ДНК из чистых культур возбуди- 64 телей кокцидиоидомикоза для проведения ПЦР

4.3. Выделение ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза из искусственно 67 контаминированных проб

ГЛАВА 5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ ВЫБРАННЫХ ОЛИГО-НУКЛЕОТИДНЫХ ЗАТРАВОК

5.1. Генотипическая дифференциация штаммов возбудителей кокци- 71 диоидомикоза, находящихся в Коллекционном центре Волгоградского научно-исследовательского противочумного института

5.2. Определение аналитической специфичности и чувствительности 74 выбранных олигонуклеотидных затравок

ГЛАВА 6. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕ- 83 АКЦИИ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КОКЦИДИОИДОМИКОЗА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка амплификационной тест-системы для идентификации возбудителей кокцидиоидомикоза"

Кокцидиоидомикоз - инфекционное заболевание, вызываемое диморфными грибами Coccidioides immitis и Coccidioidesposadasii. C.immitis эндемичен для Калифорнии (США), a C.posadasii имеет значительно более широкое географическое распространение, включая юго-западную часть США, Центральную и Южную Америку [44, 124, 166].

Заболевание принадлежит к категории «респираторных», т.е. основной путь инфицирования - аэрогенный (ингаляция артроспор с частицами пыли приводит к заражению млекопитающих и человека) [58, 72, 96, 161, 163]. Восприимчивость человека к заражению грибами рода Coccidioides считается всеобщей, так как организм человека не обладает естественным иммунитетом [72].

В эндемичных регионах распространённость этой инфекции довольно высока. По данным внутрикожной аллергической пробы и результатам серологических реакций, в США инфицировано кокцидиоидомикозом около 10 млн. человек и ежегодно заболевает от 25 ООО до 100 ООО человек [92, 93, 132, 138]. В 0,5 % - 1 % случаев встречается вторичный кокцидиоидомикоз, характеризующийся диссеминацией, часто со смертельным исходом [70, 72, 80, 81, 87, 92].

Отдельные эпидемические вспышки кокцидиоидомикоза описаны и вне эндемичных регионов. Опасности заражения подвергаются люди, посещающие эндемичные территории, и пациенты при пересадке органов от больных кокцидиоидомикозом [45, 53, 59, 61, 63, 64, 65, 82, 123, 132, 158]. Иммунодефицитное состояние макроорганизма увеличивает риск возникновения заболевания [45, 52,63,93,116,152].

Ввиду существования угрозы возникновения чрезвычайных биологических ситуаций в результате террористических актов, интерес к возбудителям кокцидиоидомикоза проявляется и как к потенциальным агентам биотерроризма [2, 26, 81]. Степень угрозы обусловлена не только легкостью создания микроспорового аэрозоля, неэффективностью вакцин, сложностью терапии и диагностики, а также отсутствием иммунной прослойки и потому практически полной незащищенностью нашего населения от этого патогена.

Диморфный характер - способность существовать в мицелиальной (са-пробиотической) форме во внешней среде и тканевой (паразитической) в организме человека и животных и определяет сложности диагностики кокцидиоидомикоза. Традиционная схема лабораторного анализа с выделением культуры и использованием биопробных животных занимает до 30 и более суток [6]. Общим для всех иммуносерологических методов, направленных на выявление антигенов грибов, является их недостаточная чувствительность составляющая 1x104 -1 х 107 артроспор/мл [27,31, 32].

Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт обладает уникальной в России коллекцией грибных культур II группы патогенно-сти. В институте на протяжении многих лет проводились исследования, направленные на изучение биологии возбудителей особо опасных микозов, разработку и оценку средств лечения и специфической профилактики.

Логическим продолжением таких исследований является разработка высоко чувствительных и специфичных методов выявления этих грибов. Среди новых средств диагностики кокцидиоидомикоза следует выделить методы, основанные на обнаружении ДНК микробов. В первую очередь, это полимераз-ная цепная реакция (ПЦР), которая позволяет выявлять патогены при отсутствии этапа культивирования микроорганизмов.

В доступной литературе крайне мало публикаций, касающихся разработки амплификационных тест-систем для идентификации этих грибов. Описаны праймеры, предназначенные для выявления интерспейсерных областей рибо-сомальных генов C.immitis, участков последовательностей генов 19 kDa специфичного антигена и пролинобогащенного антигена А2 [112, 135, 140]. Тест-система на основе ITS последовательности была изучена на чистых культурах, на пробах биологического материала и пробах с объектов окружающей среды [112]. Однако, учитывая высокую консервативность рибосомальных генов грибов, в этой работе рекомендовано дополнительно использовать секвенирование для подтверждения специфичности синтезируемых в реакции ампликонов. Важно отметить, что на метод секвенирования при идентификации продуктов ПНР при анализе клинических проб и объектов внешней среды можно будет положиться только в том случае, если ITS регионы всех грибов будут секве-нированы и внесены в GenBank [77, 78, 86, 106]. В противном случае возможно получение ложноположительных результатов.

На основе последовательности гена, кодирующего 19 kDa специфичный антиген, S. Pan и G. Cole [135] сконструировали праймеры для идентификации C.immitis, рекомендованные для разработки амплификационной тест-системы. Эти праймеры отличались высокой специфичностью и чувствительностью. Нижний предел чувствительности реакции составлял lpg ДНК С. immitis. Однако данные олигонуклеотидные затравки не были протестированы для выявления возбудителя кокцидиоидомикоза при исследовании проб биологического материала и объектов окружающей среды. Кроме того, не ясна специфичность этих праймеров - являются ли они видовыми для С. immitis или групповыми для Coccidioides spp.

R. Bialek и др. [140] использовали праймеры на ген, кодирующий АГ/2 богатый пролином, показавшие высокую чувствительность «гнездной» ПЦР, которая позволяла детектировать единичные клетки гриба, при этом специфичность реакции составила 100 %. Данная тест-система была апробирована только при исследовании биопсийных образцов тканей, пораженных C.posadasii. В работе отсутствуют сведения о какой-либо возможности идентификации этими праймерами С. immitis.

Анализ литературных источников позволяет сделать заключение, что на сегодняшний день явно недостаточно информации о преимуществе тех или иных праймеров для идентификации этих возбудителей, а также использования ПЦР для диагностики кокцидиоидомикоза на различных стадиях инфекционного процесса.

Цель работы заключалась в выборе специфичных праймеров и конструировании тест-системы для выявления и дифференциации САттШз и С.розаскяИ методом полимеразной цепной реакции.

Задачи исследования:

1. Провести анализ нуклеотидных последовательностей, представленных в различных генетических базах данных, с целью подбора праймеров для идентификации С. ттШБ и С.ро8ас1а8и методом ПЦР.

3. Определить видовую принадлежность штаммов возбудителей кокцидиоидомикоза, предоставленных Коллекционным центром Волгоградского научно-исследовательского противочумного института, с помощью методов генетического типирования.

5. Оценить эффективность сконструированной тест-системы для детекции возбудителей в объектах внешней среды и диагностики экспериментального кокцидиоидомикоза.

Научная новизна

Впервые разработана отечественная амплификационная тест-система для идентификации и дифференциации возбудителей кокцидиоидомикоза на основе фрагмента гена макрофагсвязанного протеина СлттШБ и на основе фрагмента гена гликопротеина внешней стенки сферул С.ро5ас1а5Н. Показана ее эффективность при обнаружении ДНК грибов в объектах, искусственно контаминиро-ванных штаммами Соссгс1ю1с1ез ярр., и биологическом материале от экспериментально зараженных животных. Олигонуклеотидные праймеры СшМВРХб -СшМВР1а8 обеспечивают специфическую амплификацию обоих возбудителей кокцидиоидомикоза, а праймеры СрБОТУЫБ - СрБОШЫая - только С./гоадг/ош.

Схема лабораторной диагностики кокцидиоидомикоза дополнена этапами ПЦР как при идентификации чистых культур С.розсккяИ и С. шгпШб, так и исследовании экспериментального клинического материала и проб из объектов внешней среды.

На основе результатов внутривидового генетического типирования и анализа культур СосЫсИо1с1е5 зрр. методом ПЦР с использованием двух пар прай-меров, определена видовая принадлежность коллекционных штаммов возбудителей кокцидиоидомикоза.

Предложен способ выделения ДНК возбудителей особо опасных микозов из контаминированных проб почвы и клинических образцов, обеспечивающий высокоэффективный лизис клеток патогенных грибов с последующей очисткой ДНК. Приоритетность исследований подтверждена положительным решением о выдаче патента на изобретение «Способ выделения ДНК СосЫсИо1с1ез ттЫв для проведения полимеразной цепной реакции» №2005122043/14(024850) от 12. 07. 2005г.

Практическая значимость

Сконструированная амгогафикационная тест-система может быть использована в специализированных лабораториях для идентификации и дифференциации возбудителей кокцидиоидомикоза. На сегодняшний день предложенные праймеры используют в лабораториях Волгоградского научно-исследовательского противочумного института для анализа музейных штаммов СосЫсИо1с1е5 эрр. при изучении их фенотипических и генетических особенностей.

По результатам диссертационной работы составлены методические рекомендации: «Способ обеззараживания материала, зараженного возбудителями кокцидиоидомикоза, для проведения полимеразной цепной реакции» и «Использование олигонуклеотидных праймеров СгтМВР 1$ - СшМВР2а8 и СрБ01У&2з - СрЗОИЫай для идентификации и дифференциации возбудителей кокцидиоидомикоза», одобренных Ученым советом Волгоградского научно-исследовательского противочумного института (протокол №5 от 07.06.2006 г.) и утвержденных директором института.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Олигонуклеотидные праймеры СтМВРЪ - атМВР2а$, подобранные на основе гена, детерминирующего макрофагсвязанный белок МВР-1, обеспечивают амплификацию специфичных фрагментов ДНК обоих видов возбудителей кокцидиоидомикоза, а праймеры Ср80Ц^2з - Ср801¥82гк, выбранные на основе гена, кодирующего иммунодоминантный гликопротеин внешней стенки сферул, позволяют детектировать С.ротйаьи.

2. Амплификационная тест-система для идентификации и дифференциации возбудителей кокцидиоидомикоза, сконструированная на основе родос-пецифических праймеров СшМВРЪ - СшМВР2а8 и видоспецифических олигонуклеотидных затравок Ср$01Р82з - Ср80УР%2ш для выявления С.розайаьи, обладает чувствительностью 1x104 артроспор/мл при анализе чистых культур микромицетов.

3. Обработка проб раствором мертиолятом натрия до конечной концентрации 1:1000 позволяет проводить обеззараживание материала, содержащего возбудителей кокцидиоидомикоза, для его исследования методом ПЦР без снижения чувствительности реакции амплификации.

5. Разработанная амплификационная тест-система с праймерами СшМВРХя - С1тМВР2а$ и СрБОТУЫя - Ср80ИУЪ2ай обеспечивает выявление возбудителей кокцидиоидомикоза при исследовании биологического материала от экспериментально зараженных животных.

6. Сконструированная тест-система позволяет специфически детектировать СЛттШй и С.роБайази с чувствительностью 1x104 артроспор/мл при исследовании объектов внешней среды (почвы), искусственно контамини-рованных возбудителями кокцидиоидомикоза.

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ.

Структура и объём диссертации

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Гришина, Марина Анатольевна

ВЫВОДЫ

1. На основе нуклеотидных последовательностей, представленных в базе вепВапк МСВ1, были подобраны родоспецифические праймеры СшМВРЪ - СшМВР1а8, комплементарные фрагменту гена макрофаг-связанного белка МВР-1, для идентификации СлгпгпШб и С.роБсикяи. Для обнаружения С.роБасЫН сконструированы видоспецифические праймеры СрБОУУЫя - СрЗОЦЫся, фланкирующие участок гена, кодирующего иммунодоминантный гликопротеин внешней стенки сфе-рул SOWgp 82.

2. Для идентификации и дифференциации СлттШэ и С.розайаьИ разработана амплификационная тест-система с двумя парами праймеров СШМВРЪ - СтМВР2ш и СрБОШгБ - СрЗО№2ш. Подобраны оптимальные условия проведения ПЦР, при соблюдении которых можно обнаруживать возбудителей кокцидиоидомикоза с чувствительностью 1x104 артроспор/мл при анализе чистых культур микроорганизмов.

3. Установлена видовая принадлежность исследуемых штаммов возбудителей кокцидиоидомикоза на основании данных рестрикционного анализа хромосомных локусов Ы и УЬ, а также секвенирования фрагментов ДНК, синтезируемых в реакции амплификации с помощью праймеров СшМВРЪ - СшМВР1а8 и СрЗОШ2Б - СрЗОШ2а8. Показано, что штаммы гриба из коллекции музея культур Волгоградского научно-исследовательского противочумного института принадлежат двум видам микроорганизмов - С.роБс^азп и САгпгпШб.

5. Подобран эффективный способ выделения ДНК Coccidioides spp. из объектов внешней среды (почвы) и биологического материала, конта-минированных артроспорами возбудителя, основанный на гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформной депротеинизации с последующей очисткой ДНК методом нуклеосорбции.

6. Продемонстрирована возможность использования сконструированной амплификационной тест-системы для специфической детекции C.immitis и C.posadasii с чувствительностью 1x104 артроспор/мл при исследовании объектов внешней среды, искусственно контаминиро-ванных возбудителями кокцидиоидомикоза.

7. Выявлена диагностическая эффективность разработанной амплификационной тест-системы на основе двух пар праймеров CimMBPls -CimMBPlas и CpSOW&ls - CpSOW&2as при анализе биологического материала от животных с экспериментальным кокцидиоидомикозом. Показана возможность использования метода ПЦР для детекции возбудителей кокцидиоидомикоза на ранних сроках инфекционного процесса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Кокцидиоидомикоз - болезнь, относящаяся к группе глубоких системных микозов, клинически характеризуется преимущественным поражением органов дыхания, кожи, подкожной клетчатки с образованием свищей и инфильтратов, вызываемое диморфными грибами Coccidioid.es штШй и Сос-\oides розси1азИ.

Микоз регистрируется прежде всего в юго-западных штатах США и странах Латинской Америки. В естественных условиях возбудители кокци-диоидомикоза обитают в почве, а инфицирование людей и многих видов млекопитающих происходит при случайной встрече человека и животных во время обильной вегетации гриба в почве при определенных климатических условиях [44, 58, 72, 96, 136, 161, 163, 89]. Интерес к этим патогенам обусловлен возможностью их использования в качестве потенциальных агентов биотерроризма [81].

Трудности диагностики кокцидиоидомикоза обусловлены диморфным характером этих микроскопических грибов - способностью существования в виде мицелиальной (сапробиотической) форме во внешней среде и тканевой (паразитической) в организме человека и животных. Существующие методы идентификации данных возбудителей оказываются недостаточно эффективными для их индикации и ускоренной диагностики. Культуральный метод длителен и трудоёмок при исполнении. Иммунологические методы дают более быстрые результаты, но обладают относительно низкой чувствительностью и невысокой специфичностью из-за возможных перекрёстных реакций с гетерологичными видами грибов [32, 72, 84, 138, 157].

Первое сообщение о разработке праймеров для идентификации возбудителя кокцидиоидомикоза опубликованно S. Pan и G. Cole в 1995 году [135]. Выбранные праймеры на основе последовательности гена, кодирующего 19 kDa специфичный антиген, авторы рекомендовали для создания амплифика-ционной тест-системы с целью выявления C.immitis. В последующих работах для конструирования специфических праймеров использовалась спейсерная область рибосомальных генов [159]. Однако, учитывая высокую консервативность рибосомальных генов различных видов грибов, существует вероятность получения ложноположительных результатов, в первую очередь при исследовании материала из объектов внешней среды [86]. Тест-система на основе праймеров, фланкирующих ген, кодирующий АГ богатый пролином [140], была апробирована только при исследовании биопсийных образцов тканей, пораженных C.posadasii. В этой работе отсутствовали данные о какой либо возможности идентифицировать предложенной тест-системой C.immitis.

Учитывая вышесказанное, для идентификации С. immitis и С. posadasii в качестве ДНК - матрицы нами были выбраны участки гена МВР-1, детерминирующего макрофагсвязанный белок, и SOWgp82 гена, кодирующего иммунодоминантный гликопротеин внешней стенки сферул. При поиске специфичных нуклеотидных последовательностей нами были исключены ри-босомальные гены ввиду их высокой степени гомологии с близкородственными грибами.

Олигонуклеотидные затравки CimMBPls - CimMBP2as, выбранные на основе последовательности гена МВР-1, были общими (родоспецифически-ми) для идентификации C.immitis и C.posadasii. Праймеры CpSOW82s -CpSOW82ast подобранные на основе последовательности фрагмента гена SOWgp82, сконструированы для обнаружения C.posadasii.

После проведения серии экспериментов были определены оптимальные параметры постановки реакции амплификации для обеих изучаемых пар праймеров. При соблюдении всех условий проведения анализа размеры амплифицированных фрагментов ДНК для праймеров CimMBPls - CimMBP2as составили 597 п.н., а для CpSOW82s - CpSOW82as -300 п.н.

Поскольку фенотипических признаков, с помощью которых можно было бы дифференцировать 2 близкородственных вида C.immitis и C.posadasiU пока не выявлено, для установления видовой принадлежности исследуемых коллекционных штаммов возбудителей кокцидиоидомикоза использовали генотипические методы.

Генотипирование культур Coccidioides spp. проведено на основе анализа единичных нуклеотидных замен (SNP) в вариабельных участках ДНК этих микромицетов. Для выявления SNP использовали метод ПЦР-ПДРФ, который заключался в амплификации хромосомных локусов Ы и VL возбудителей кокцидиоидомикоза и гидролизе ампликонов эндонуклеазой рестрикции Hinf I. В работе Fisher М.С. et al. [38, 145] показано, что у штаммов C.immitis в локусе Ы отсутствует полиморфный сайт рестрикции для эндонуклеазы Hinf I, у штаммов C.posadasii локус Ы гидролизовался эндонуклеазой Hinf I по полиморфному сайту, но рестрикция локуса VL у этой группы штаммов отсутствовала.

В результате работы было выяснено, что штаммы микромицетов из коллекции музея культур Волгоградского научно-исследовательского противочумного института гетерогенны по рестрикционному профилю и образуют две группы. По результатам исследований 15 штаммов Coccidioides spp. соответствовали генотипу некалифорнийской группы [89, 145] и были отнесены нами к виду C.posadasii. Остальные 11 штаммов по картине рестрикции локусов Ы и VL были сходны с генотипом калифорнийской группы, что позволило идентифицировать их как вид C.immitis. Наличие нуклеотидных замен в сайтах рестрикции было подтверждено секвенированием фрагментов последовательностей.

Выявленные генетические различия исследуемых изолятов возбудителя кокцидиоидомикоза подтвердили специфичность праймеров CpSOW82s-CpSOW 82as и CimMBPls - CimMBPlas. При тестировании коллекции культур Coccidioides spp. с использованием олигонуклеотидных затравок CimMBPls - CimMBPlas продукт амплификации синтезировался только при исследовании ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза с чувствительностью fj л

1x10 - 1x10 артроспор/мл. С помощью праймеров CpSOWS2s - CpSOW&las специфический фрагмент амплификации был обнаружен при анализе 15 штаммов C.posadasii. Чувствительность реакции колебалась в пределах 1x101 1

-1x10 артроспор/мл. С другими видами близкородственных грибов и гете-рологичных микроорганизмов с обоими праймерами в 100 % случаев получен отрицательный результат.

Для проверки специфичности продуктов ПЦР проведено их секвениро-вание. С помощью программы BLASTn выявлено, что секвенированные нук-леотидные последовательности ампликонов, синтезируемых с помощью праймеров CpSOW82s - CpSOWWlas, были гомологичны (99 %) гену SOWgp82 C.posadasii (GenBank NCBI, accession AF308873). При сравнительном анализе секвенированных фрагментов амплификации, полученных с праймерами CimMBPls - CimMBP2as, их нуклеотидная последовательность имела 99 % гомологии с опубликованной последовательностью гена МВР-1 C.immitis (GenBankNCBI, accession AF326276).

Поскольку возбудители кокцидиоидомикоза относятся к группе особо опасных инфекций, работа с которыми строго регламентирована [29], то и проведение полимеразной цепной реакции должно быть обеспечено соответствующими методами подготовки проб, предусматривающими обеззараживание исследуемого материала. Но рекомендуемые способы обеззараживания и табельные средства стерилизации проб [29], содержащих возбудителей особо опасных микозов (растворы формалина, автоклавирование и др.), не могут быть использованы при подготовке материала для его анализа методом ПЦР, поскольку приводят к деградации генетического материала или ингибирова-нию реакции амплификации. На основании проведённых нами экспериментов показано, что для проведения ПЦР наиболее эффективным способом обеззараживания проб, содержащих возбудителей кокцидиоидомикоза, являлось использование раствора мертиолята натрия в конечной концентрации 1:1000 с последующим их прогреванием в течение 40 мин при температуре (56±1)°С.

Еще одним важным условием адекватного проведения реакции амплификации является получение ДНК в достаточно чистом виде, не содержащей примесей, ингибирующих реакцию. Учитывая, что возбудители кокцидиои-домикоза относятся к потенциальным агентам биотерроризма, большое значение приобретает экспрессность их идентификации в объектах внешней среды, где могут присутствовать различные органические соединения, инги-бирующие реакцию амплификации. Существующие методы пробоподготов-ки, описанные в литературе, обеспечивали хороший лизис, но не давали достаточной очистки ДНК от примесей компонентов почвы, что приводило к появлению ложноотрицательных результатов ПЦР.

Нами дополнительно был введён этап сорбции ДНК на силикагеле после гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформной депротеинизации клеток, что позволило получить препараты ДНК высокой чистоты. При выделении ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза из почвы предлагаемым способом чувствительность реакции амплификации составила 1x104 клеток с обеими парами праймеров.

На сегодняшний день имеется небольшое количество работ по использованию амплификационных тест-систем для идентификации возбудителей кокцидиоидомикоза. Причем, известны лишь единичные публикации, в которых ПЦР рекомендована для исследования клинического материала [112, 140]. Представляет интерес работа S. М. Johnson [112], в которой для диагностики кокцидиоидомикоза использовали праймеры, сконструированные на основе ITS-области рибосомальной ДНК С. immitis. Тестированию подвергли 9 образцов сыворотки экспериментально зараженных мышей. В данном исследовании показано, что ДНК С. immitis выявляли только на 3 сут, а в более поздние сроки получены отрицательные результаты. Авторы объясняют такой результат содержанием небольшого количества возбудителя кокцицио-идомикоза в сыворотке крови.

С помощью предлагаемой нами тест-системы были проанализированы биоптаты и кровь от лабораторных животных, экспериментально заражённых возбудителем кокцидиоидомикоза. При внутрибрюшинном заражении белых мышей С. ШтШБ или С^робосЬбИ развивается, как правило, диссеминирован-ный кокцидиоидомикоз. Началом острого кокцидиоидомикоза следует считать 3 сут, когда артроспоры начинают превращаться в сферулы. На 7 день уже обнаруживают абсцессы и гранулёмы печени и селезенки, начинается развитие сливной пневмонии [6, 31]. Поэтому для реакции амплификации отбор секционного материала от инфицированных белых мышей осуществляли на 3, 7, 14 и 21 сут после заражения. Исследование биологических проб проводили параллельно культуральным микологическим методом и ПЦР.

В результате проведенных исследований показано преимущество использования реакции амплификации для генодиагностики исследуемой инфекции, особенно в ранние сроки заболевания.

Возможность обнаружения возбудителя кокцидиоидомикоза методом ПЦР показана при анализе проб крови экспериментально заражённых животных, начиная с третьих суток после заражения. С праймерами СрЗОИЫя -СрЗОТУЫаз ДНК С. розас1а8И 36 8Пуеп*а в этот период была выявлена в 50 % образцов крови. На 7, 14 и 21 сут после заражения выявление ДНК возбудителя кокцидиоидомикоза возросло и составило 75 %. При использовании праймеров СшМВРХб - СипМВР2ав на 7 и 14 дни заражения положительные результаты ПЦР были получены в 50 % проб. На 3 и 21 сут наблюдения ДНК гриба обнаруживали в 25 % случаев. При исследовании образцов крови с помощью микологического метода возбудитель кокцидиоидомикоза удалось выявить только с 7 сут заражения в 50 % проб крови. На 14 день при посеве рост гриба наблюдался во всех пробах крови (100 %). А на 21 день - только в 25 %.

Следует отметить, что в отличие от данных S. М. Johnson [112], при исследовании сыворотки и плазмы крови нами получены отрицательные результаты с обеими парами праймеров. Положительные результаты ПЦР наблюдали при выделении ДНК возбудителя кокцидиоидомикоза только из цельной крови зараженных животных.

Для обнаружения возбудителя кокцидиоидомикоза методом ПЦР оценена возможность использования сконструированных праймеров CimMBPls -CimMBPlas и CpSOW&ls - CpSOW&2as для анализа биологического материала (печень, селезенка, легкие) при экспериментальной инфекции. Показано, что в реакции амплификации возбудитель детектировался в суспензиях органов от всех белых мышей, зараженных культурой гриба, на всех сроках наблюдения.

Возбудитель кокцидиоидомикоза с помощью реакции амплификации обнаружен в крови, селезенке и легких уже на 3 сут после заражения, что свидетельствовало о диссеминации возбудителя. С помощью культураль-ного метода на 3 сут после заражения С. posadasii 36 Silveira выявлен лишь в 25 % проб селезенки. При вскрытии зараженных животных в этот срок наблюдения макроскопических изменений внутренних органов выявлено не было.

Начиная с 7 сут, наблюдалось увеличение количества положительных проб как методом ПЦР, так и микологическим методом. При визуальном наблюдении брюшной полости мышей в эти сроки отмечалось полнокровие и увеличение печени и селезенки, в сальнике - появление мелких множественных узелков. На 10 - 14 сутки эти узелки становились крупнее, сливались между собой и спаивались с окружающими тканями. Также узелки имелись на брюшине, брыжейках кишок, иногда на печени и селезенке. В некоторых случаях наблюдали выпот в брюшной полости. Поражения легких носили характер уплотнения пораженных долей. На 21 сут отмечались более выраженные изменения во внутренних органах. Увеличилось количество узелков в печени и селезенке, в легких узлы приобретали консистенцию хряща. Патоморфологическая картина была характерна для диссеминированного кокци-диоидомикоза [6,31, 88].

При анализе биологического материала ДНК С. розайаьи 36 8Пуе1га методом ПНР на 21 день наблюдения с использованием праймеров СрЗОТФЪЪ - СрЗОИЫая обнаруживали в образцах печени (75 %), селезёнке (100 %) и лёгких (100 %). С помощью праймеров СШМВРХз - СтМВР2а5 ДНК выявлена в образцах печени и селезёнки в 50 % случаев и 75 % проб лёгких. Микологическим методом на 21 день наблюдения возбудитель обнаруживали в образцах печени (75 %) и селезёнке (100 %). При культуральном методе исследования в посевах легких всех животных возбудитель кокци-диоидомикоза выделить не удалось, ввиду роста посторонней микрофлоры.

При исследовании методом ПЦР проб секционного материала, полученного от зараженных белых мышей, оказалось, что более высокий процент положительных результатов, так же как и при исследовании крови, наблюдался при анализе проб с помощью праймеров СрБОИЫя - СрЗОИЫая.

Эффективность ПЦР для обнаружения С.розас^аБп 36 8Пуе1га при анализе биоптатов от животных зараженных этим патогеном превышала микологический метод на 9,36 %. При параллельном использовании микологического метода и ПЦР, совпадение данных отмечено в 64,73 % случае. Из 22 (35,27 %) несовпадающих результатов в 14 (21,87 %) случаях положительные данные получены только в реакции амплификации. Отрицательные результаты ПЦР, полученные в 8 (12,5 %) микологически подтверждённых пробах, могут объясняться низкой концентрацией клеток в данных пробах, а также тем, что части органов, используемые для микологического посева, намного превышали объем проб, необходимых для анализа методом ПЦР.

Синтезируемые в ПЦР ампликоны, полученные при анализе проб крови и внутренних органов экспериментально зараженных животных, были выборочно секвенированы. При сравнительном анализе нуклеотидных последовательностей секвенированных фрагментов ДНК с помощью программы ВЬАБТп был сделан вывод о гомологии секвенированных продуктов только с геномом возбудителя кокцидиоидомикоза, что свидетельствовало о специфичности выбранных праймеров.

На основании проведенных исследований можно сделать заключение о принципиальной возможности использования праймеров СтМВРЪ -СтМВР2ш для ускоренной идентификации двух возбудителей кокцидиоидомикоза - СЛттШй и С-рояснЗаяи. Олигонуклеотидные затравки СрЗО}¥%2з -СрЗОМЫсн являются видоспецифическими и позволяют детектировать только С.розадазИ. На сегодняшний день культурально-морфологические и иммунодиагностические тесты для дифференциации этих возбудителей не разработаны. Известные генотипические методы предполагают наличие чистой культуры, являются более трудоемкими и дорогостоящими. Предложенная нами амплификационная тест-система с двумя парами праймеров позволяет не только выявлять возбудителей кокцидиоидомикоза при исследовании чистых культур грибов, объектов окружающей среды и биологического материала, контаминированных возбудителями кокцидиоидомикоза, но и проводить дифференциацию С. штШя и С.розас1азИ.

В результате проделанной работы показано, что одним из преимуществ ПЦР по сравнению с микологическим методом для идентификации микро-мицетов рода СосЫсИогс1е5 является скорость получения результатов. Продолжительность ПЦР-анализа составляет 3-4 часа (чистые культуры) и 6 часов для проб биологического материала и объектов окружающей среды. Это значительно быстрее 15-30 суточного выращивания грибов на питательной среде с обязательным последующим доказательством их двуфазности и проверки вирулентности культур при помощи биологического метода (еще 710 сут).

Одним из ограничений использования культурального метода в практической медицине является необходимость соблюдения специальных условий безопасности работы при обнаружении гриба, а именно все манипуляции с культурами в мицелиальной фазе должны проводиться в боксах биологической безопасности Ш-го класса специально подготовленным персоналом.

При культуральном методе исследования важное значение имеет степень микробного загрязнения исследуемого материала посторонней микрофлорой, что значительно затрудняет выделение чистой культуры микромице-тов. Эффективность метода зависит также от качества питательных сред и наличия количества жизнеспособных элементов гриба в патологическом материале. На результаты ПЦР не влияет ни контаминация проб гетерологич-ными микроорганизмами, ни жизнеспособность клеток гриба.

Таким образом, разработанная амплификационная тест-система с двумя парами праймеров СтМВРЪ - атМВР2ш и СрЗОИЫя - Ср$ОШ2аБ может быть использована для идентификации и дифференциации возбудителей кокцидиоидомикоза и позволяет в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать возбудителей кокцидиоидомикоза в биологическом материале и объектах окружающей среды.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гришина, Марина Анатольевна, Саратов

1. Ашмарин И.П., Воробьёв A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях JL: Гос. изд-во мед. лит., 1962. - 181с.

2. Аэрогенные инфекции в аспекте проблемы биотерроризма / Алексеев

3. B.В., Тихонов Н.Г, Липницкий A.B. и др. // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 2003. - Вып.85. - С.20-27.

4. Блохина И.Н., Леванова Г.Ф., Антонов A.C. Систематика бактерий (с основами геносистематики) Н. Новгород: Изд-во Нижегородского унта, 1992. - 171с.

5. Валькова Е.Р., Липницкий A.B. Серологические показатели при экспериментальных глубоких микозах // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 1970. - №12. - С.55-59.

6. Глубокие микозы / Липницкий A.B., Лесовой B.C., Храпова Н.П., Тихонов Н.Г. // Лабораторная диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней. Сб. науч. тр. под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырё-ва. Саратов, 1998. -Т.2. С.80-100.

7. Жаркова С.Ф. Усовершенствование серологических методов идентификации и индикации: Автореф. дис. канд. мед. наук. / Л., 1985. -21с.

8. Изучение антител к возбудителям глубоких микозов / Липницкий A.B., Высочинская H.H., Храпова Н.П. и др. // Вопросы противоэпидемической защиты: Сб. статей НИИЭМ Н.Ф. Гамалея. М. - 1976. -Вып.- 25. - С.158-164.

9. Использование ХЛИА для диагностики кокцидиоидомикоза / Лип-ницкий A.B., Коваленко A.A., Лесовой B.C., Жаркова С.Ф. // Материалы 3 междунар. миколог, симпозиума. СПб., 1995. - С.40.

10. Иммунохимический анализ антигенов кокцидиоидного гриба / Хра-пова Н.П., Рогожкина Н.М., Жаркова С.Ф., Новицкая И.В. // Микология и фитопатология. 1988. - Т.22,№5. - С.441-446.

11. Кашкин П.Н. Шекласов Н.Д. Руководство по медицинской микологии М.: Медицина, 1978. - 325с.

12. Лабораторная диагностика, лечение и профилактика глубоких микозов: Методические рекомендации. Элиста, 1995. - 47с.

13. Лесовой B.C., Липницкий A.B. Морфологическая оценка мутантов кокцидиоидного гриба различной вирулентности // Генетика и биохимия вирулентных возбудителей ООИ: Сб. науч. тр. Волгоград, 1992.-С.84.

14. Лесовой B.C. Протективные свойства кокцидиоидного гриба и основные принципы создания противококцидиоидных вакцин // Автореф. дис. .д-ра. мед. наук. Л., 1987. - 32с.

15. Лесовой B.C., Прокофьева Е.И. Иммуногенность кокцидиоидного гриба. Влияние способа инактивации на иммунный ответ // Актуальные вопросы мед. микологии. — Л., 1987. С.55.

16. Лесовой B.C., Прокофьева Е.И. К вопросу об оценке безопасности живых кокцидиоидных вакцин // Диагност, проф. чумы, холеры, сапа и мелиоидоза: Сб. науч. тр. Волгоград, 1983. - С.61-62.

17. Липницкий A.B. Иммунологические методы диагностики некоторых глубоких микозов // Журн. микробиол. эпидем. и иммунобиол. 1970.-№1.- С. 126-129.

18. Лихолетова C.B. К вопросу о химическом составе липидов кокцидио-идного гриба // Пробл. особо опасн. инф. 1975. - №1. - С.145-147.

19. Лихолетова C.B., Черепанов Н.М., Бородько С.Л. Изучение химического состава мицелиальной фазы C.immitis в зависимости от возраста // Матер. Всесоюз. совещания по вопр. глубоких микозов. Волгоград, 1970.-С. 160-165.

20. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. - 479с.

21. Молекулярная клиническая диагностика. Методы // под ред. С. Хер-рингтона, Дж. Макги. -М.: Мир, 1999. С.302-383.

22. МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами 1-Й групп пато-генности»- М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2003.-39 с.

23. МУ 3.5.5.1034 01 «Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп, при работе методом ПЦР». -М., 2001.-6с.

24. Получение чистых люминесцирующих противококцидиоидных антител / Храпова Н.П., Высочинская Н.Н., Лесовой B.C. и др. // Вопросы противоэпидемич. защиты населения. М., 1979. - Вып.29. - С. 165-170.

25. Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму. Волгоград, 2004. - 256 с.

26. Проблемы лабораторной диагностики глубоких микозов / Липницкий А.В., Лесовой B.C., Храпова Н.П. и др. // Мед. паразитология и паразитарные болезни. 1995. - №4. - С.53-56.

27. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. М.: Медиа Сфера, 2003. - 305 с.

28. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1285 03. Безопасность работы с микроорганизмами I - П групп патогенности (опасности) // Госсанэпиднадзор России. - М., 2003. - 103с.

29. Сергеев А.Ю. Сергеев Ю.В. Грибковые инфекции. М.: Издательство Бином, 2003.-439с.

30. СПИД-ассоциированные микозы / Лесовой B.C., Липницкий А.В., Тихонов Н.Г., Яшкулов К.Б. Элиста, 1995.- 173с.

31. Усовершенствование тест-системы для ТИФА антигенов кокцидио-идного гриба. Отчет о НИР (заключительный) / Волгоградский н.-и. противочумн. ин-т. Руководитель: Храпова Н.П. Волгоград, 1994. — ГР 01.9.10. 013839.-34с.

32. Храпова Н.П., Липницкий А.В. Получение иммуноглобулинового эритроцитарного диагностикума кокцидиоидоза // Вопросы противоэпидемической защиты: Сб. статей НИИЭМ Н.Ф. Гамалея. — М., -1976.- Вып.- 25. С.165-172.

33. Храпова Н.П., Рогожкина Н.М., Жаркова С.Ф. Твёрдофазный имму-ноферментный анализ антигенов Coccidioides immitis II Журнал микро-биол. эпидемиол. и иммунобиол. 1988. - №8. - С.90-94.

34. Экспериментальный кокцидиоидоз у мышей после введения возбудителя перорально / Прокофьева Е.И., Липницкий А.В., Лесовой B.C., Храпова Н.П. и др. // Микология и фитопатология. 1985. - Т. 19, №19. -С.238-240.

35. A major cell surface antigen of Coccidioides immitis which elicits both humoral and cellular immune responses / Hung, C. Y., Ampel N. M., Christian L. et al. // Infect. Immun. 2000. - Vol. 68,№2.- P.584-593.

36. A parasitic phase-specific adhesin of Coccidioides immitis contributes to the virulence of this respiratory fungal pathogen / Hung C. Y., Yu J. J., Seshan K. R. et al. // Infect. Immun. 2002. - Vol. 70,№7. -P.3443—3456.

37. A test for concordance between the multilocus genealogies of genes and microsatellites in the pathogenic fungus Coccidioides immitis / Fisher M.C., Koenig G.L., White T.J., Taylor J.W. // Mol. Biol. Evol.- 2000. Vol.17. -P.l 164-1174.

38. Antigen identification in Coccidioides immitis / Cole G.T., Starr M.E., Sun S.H., Kirkland T.N. II J. Microbiol. 1986. - Vol.34. - P.159-164.

39. Arsura E.L., Bobba R.K., Reddy C.M. Coccidioidal pericarditis: a case presentation and review of the literature // Int. J. Infect. Dis. 2005. -Vol.9,№2. - P. 104-109.

40. Arsura E.L., Kilgore W.B. Miliary coccidioidomycosis in the immunocompetent patients // J. Chest 2000. - Vol. 117,№2. - P.404-409.

41. Avise J.C., Ball R.M. Principles of genealogical concordance in species concepts and biological taxonomy // Oxford Surv. Evol. Biol. 1990. - №7.-P.45-67.

42. Baddley J.W., Cobbs C.S., Pappas P.G. Surgical treatment of multiple skull abscesses associated with coccidioidomycosis // J. Mycoses. 2004. -Vol.47,№l-2. - P.69-71.

43. Biogeographic range expansion into South America by Coccidioides immitis mirrors New World patterns of human migration / Fisher M.C., Koenig G.L., White TJ. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.- 2001.- Vol.98, №8.-P.4558-4562.

44. Blair J.E., Logan J.L. Coccidioidomycosis in solid organ transplantation // Clin. Infect. Dis. 2001. - Vol.33,№1. - P.1536-1544.

45. Brass C., Levine H.B., Stevens D.A. Stimulation and suppression of cellmediated immunity by endosporulation antigens of Coccidioides immitis II Infect. Immun. 1982. - Vol.35,№2. - P.431-436.

46. Burt A., Carter D.A., Koenig G.L. et al. Molecular markers reveal cryptic sex in the human pathogen Coccidioides immitis II Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1996. Vol.93,№2.- P.770-773.

47. Burt A., Dechairo B.M., Koenig G.L. et al. Molecular markers reveal differentiation among isolates of Coccidioides immitis from California, Arizona and Texas // Mol. Ecol.- 1997. Vol.6,№8. - P.781-786.

48. Catanzaro A., Flataner F. Detection of serum antibodies in coccidioidomycosis by solid-phase radioimmunoassay // J. Infect. Dis. -1983. -V.47. -P.32-39.

49. Centers for Disease Control and Prevention. Coccidioidomycosis among persons attending the world championship of model airplane flying // Morb. Mortal. Wkly. Rep 2001. -Vol.50. - P. 1106-1107.

50. Centers for Disease Control and Prevention. Increase in cocidioidomyco-sis—Arizona, 1998-2001 // Morb. Mortal. Wkly. Rep. 2003; -Vol.52.-P. 109-112.

51. Cerebrospinal fluid antibodies detected by ELISA against a 33-kDa antigen from spherules of Cocddioides immitis in patients with cocddioidal meningitis / Galgiani J.N., Peng T., Lewis M.L. et al. // J. Infect. Dis. -1996. -Vol.l73,№ 2. P.499-502.

52. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem.-1987. Vol.162, №1. - P. 156-159.

53. Chowfin A., Tight R. Female genital coccidioidomycosis (FGC), Addison's disease and sigmoid loop abscess due to Coccidioides immites; case report and review of literature on FGC // Mycopathologia 1999.- Vol.145, №3. - P.121-126.

54. Chuang A., Thomas R., Hoffman R.S. Disseminated coccidioidomycosis in an immunocompetent person living in New York City // J. Urban. Health. 2005. - Vol.82,№2. - P.339-345.

55. Coccidioides immitis in the gallbladder and biliary tree / Sydorak R.M., Albanese C.T., Chen Y. et al. // J. Pediatr. Surg. 2001. - Vol.36,№7.-P. 1054-1056.

56. Coccidioides immitis isolated from armadillos (Dasypus novemcinctus) in the state of Piaui, northeast Brazil / Eulalio K.D., de Macedo R.L., Caval-canti M.A. et al. // Mycopathologia 2001. - Vol. 149,№2. - P.57-61.

57. Coccidioidomycosis among visitors to a Coccidioides immitis-Qndemic area: an outbreak in a military reserve unit / Standaert S.M, Schaffner W., Galgiani J.N. et al. // J. Infect. Dis. 1995. - Vol.171. - P.1672-1675.

58. Coccidioidomycosis among Workers at an Archeological Site, Northeastern Utah / Petersen L.R., Marshall S.L., Barton-Dickson C. et al. // Emerg. Infect. Dis. 2004. - Vol. 10,№ 4. - P.637-642.

59. Coccidioidomycosis in India: report of a second imported case / Verghese S., Aijundas D., Krishnakumar K. et al. // Med. Mycol. 2002. - Vol.40,№3. - P. 307-309.

60. Coccidioidomycosis in liver transplant patients // Clin. Infect. Dis. 1997. -Vol.24.-P.216-221.

61. Coccidioidomycosis in New York State / Chaturvedi V., Ramani R., Gro-madzke S., et al. // Emerg. Infect. Dis. 2000. -Vol.6,№ 1.- P.25-29.

62. Coccidioidomycosis in non-endemic areas: a case series / Desai S.A., Minai O.A., Gordon S.M. et al. // Respir. Med. 2001. - Vol.95,№4.- P.305-309.

63. Coccidioidomycosis in travelers returning from Mexico Pennsylvania, 2000 // MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. - 2000. - Vol.49,№44. - P. 10041006.

64. Coccidioidomycosis osteomyelitis masquerading as a bone tumor. A report of 2 cases / Caraway N.P., Fanning C.V., Stewart J. et al. // Acta Cytol.-2003. Vol.44,№5. - P.777-782.

65. Cole G.T., Zhu S., Kruse D. Isolation of antigen with proteolytic activity from C. immitis II Infect. Immun. 1989. - Vol.57. - P. 1524-1534.

66. Cole G.T.; Hung C.Y. The parasitic cell wall of Coccidioides immitis II Med. Mycol. 2001. - Vol.39,№1.- P.31-40.

67. Common antigens among systemic disease fungi analyzed by two-dimensional immunoelectrophoresis / Huppert M., Adler J. P., Rice E. H., Sun S. H. II Infect. Immun. 1979. - Vol.23. - P.479-485.

68. Concerted Evolution in the Repeats of an Immunomodulating Cell Surface Protein, SOWgp, of the Human Pathogenic Fungi Coccidioides immitis and C. posadasii / Johannesson H., Townsend J.P., Hung C. et al. // Genetics 2005. - Vol.171,№1. - P.109-117.

69. Cox R.A., Magee M. Coccidioidomycosis: Host Response and Vaccine Development II J. Clin. Microbiol. Rev. 2004. - Vol. 17,№4. - P.804-839.

70. Davis L.E., Porter B.S. Central Nervous System Coccidioides immitis Infections // Curr. Treat. Options. Neurol.- 2005. Vol.7,№2. - P.157-165.

71. Davis L.E., Cook G., Costerton J.W. Biofilm on ventriculo-peritoneal shunt tubing as a cause of treatment failure in coccidioidal meningitis // Emerg. Infect. Dis. 2002. - Vol.8,№4.- P.376-379.

72. Detection of Coccidioides immitis infection in Coahuila, Mexico / Mondragon-Gonzalez R., Mendez-Tovar L.J., Bernal-Vazquez E. et al. // Rev. Argent. Microbiol. 2005. - Vol.37,№3. - P.135-138.

73. Detection of Paracoccidioides brasiliensis in Tissue Samples by a Nested PCR Assay / Bialek R., Ibricevic A., Aepinus C., Najvar L. et al. // Clin. Microdiol. 2000. - Vol.38. - P.2940-2942.

74. Diagnosis and monitoring of murine histoplasmosis by a nested PCR assay / Bialek R., Fischer J., Feucht A. et al. // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol.39. -P. 1506-1509.

75. Disruption of the Gene Which Encodes a Sérodiagnostic Antigen and Chitinase of the Human Fungal Pathogen Coccidioides immitis / U. Reichard, C. Hung, P. Thomas and G. Cole // Infect. and Immun. 2000. - Vol.68,№ 10. - P.5830-5838.

76. Disseminated Coccidioidomycosis / Wang C., Jerng J., Ko J. et al. // Emerg. Infect. Dis. 2005. - Vol.11,№1. - P.177-179.

77. Dixon D.M. Coccidioides immitis as a Select Agent of bioterrorism // J. Appl. Microbiol. 2001. - Vol.91 ,№ 4. - P.602-605.

78. Donor-related coccidioidomycosis in organ transplant recipients / Wright P.W., Pappagianis D., Wilson M. et al. // Clin. Infect. Dis. 2003. -Vol.37,№ 9.-P.1265-1269.

79. Emmons C.W. Fungi which resemble Coccidioides immitis II Coccidioidomycosis. Proceedings of second Coccidioidomycosis symposium Phoenix, Arizona 1967. - P.333-339.

80. Evaluation of Two Nested PCR Assays for Detection of Histoplasma capsulatum DNA in Human Tissue / Bialek R., Feucht A., Aepinus C.et al. // J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol.40,№ 5. - P.1644-1647.

81. False Identification of Coccidioides immitis: Do Molecular Methods Always Get It Right? / Millar B.C., Jiru X., Walker M.J. et al. // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol.41,№12. - P.5778-5780.

82. Feldman B.S., Snyder L.S. Primary pulmonary coccidioidomycosis // Semin. Respir. Infect. 2001. - Vol.16,№4. - P.231-237.

83. Fiese M.J. Coccidioidomycosys. Springfield, Illinois, USA, 1958. -P.227.

84. Fisher M.C., Koenig G.L., White T.J. Pathogenic clones versus environmentally driven population increase: analysis of an epidemic of the human fungal pathogen Coccidioides immitis II J. Clin. Microbiol. 2000. -Vol.38,№2. - P.807-813.

85. Foureman P., Longshore R., Plummer S.B. Spinal cord granuloma due to Coccidioides immitis in a cat I I J. Vet. Intern. Med. 2005. - Vol.l9r№3.-P.373-376.

86. Fungemia due to Coccidioides immitis. An analysis of 16 episodes in 15 patients and a review of the literature. Ampel N.M., Ryan K.J., Carry P J. et al. // J. Medicine 1986. - Vol.65,№5. - P.312-321.

87. Galgiani J.N. Coccidioidomycosis // West J. Med. 1993. - Vol. 159,№2. -P.153-171.

88. Galgiani J.N. Coccidioidomycosis: a regional disease of national importance. Rethinking approaches for control // Ann. Intern. Med.- 1999.-Vol.l30,№4,Ptl. P.293-300.

89. Goldani L. Z., Maia A. L., Sugar A. M. Cloning and nucleotide sequence of a specific DNA fragment from Paracoccidioides brasiliensis II J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol 33. - P.1652-1654.

90. Goldani L. Z., Sugar A. M. Short report: use of the polymerase chain reaction to detect Paracoccidioides brasiliensis in murine paracoccidioidomycosis // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1998. - Vol 58. - P.152-153.

91. Greene R.T., Troy G.C. Coccidioidomycosis in 48 cats: a retrospective study (1984-1993) // J. Vet. Intern. Med. 1995. - Vol.9,№2. - P.86-91.

92. Gromadzki S.G., Chaturvedi V. Limitation of the AccuProbe Coccidioides immitis culture identification test: false-negative results with formaldehyde-killed cultures // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol.38,№6. - P.2427-2428.

93. Hamilton A.J., Gomez B.L. The application of monoclonal antibodies to the diagnosis of disseminated mycoses // Rev. Iberoam. Micol. 1998. -Vol.15. -P.118-124.

94. Head and neck manifestations of disseminated coccidioidomycosis / Arnold M.G., Arnold J.C., Bloom D.C. et al. // J. Laryngoscope 2004. -Vol.114, №4.-P.747-752.

95. Hobbs E.R. Coccidioidomycosis // Dermatol.Clin. 1989. - Vol.7,№2. -P.227-239

96. Huppert M. Antigen used for measuring immunological reactivity. Fungi pathogenic for humans and animals Part B: Pathogenicity and Detection -New York, 1983. P. 219-302.

97. Huppert M. Recent developments in coccidioidomycosis. // Rev. Med. Vet. My col. 1968. -Vol.6. - P.279-294.

98. Huppert M., Sun S.H., Bailey J.W. Natural variability in Coccidioides im-mitis II Proc. 2nd Cocci. Simp., Arizona State Dept. Hlth, 1967. P.323-328.

99. Huppert, M., Sun S. H., Harrison J. L. Morphogenesis throughout saprobic and parasitic cycles of Coccidioides immitis // Mycopathologia-1982.-Vol.78.-P.107-122.

100. Hyphal forms in the central nervous system of patients with coccidioidomycosis / Hagman H.M., Madnick E.G., D'Agostino A.N. et al. // Clin. Infect. Dis. 2000. - Vol.30,№2. - P.349-353.

101. Identification and isolation by DDRT-PCR of genes differentially expressed by Histoplasma capsulatum during macrophages infection / Co-lonna-Romano S., Porta A., Franco A. et al. // Microb. Pathog. 1998. -Vol.25.-P.55-66.

102. Immunomycology: rapid and specific immunocytochemical identification of fungi in formalin-fixed, paraffin-embedded material / Reed J. A., Hemann B.A., Alexander J.L., Brigati D.J. // J. Histochem. Cytochem. 1993. -Vol. 41.- P. 1217—1221.

103. In search of the natural habitat of Paracoccidioides brasiliensis / McEwen J. G., Garcia A. M., Ortiz B. L. et al. // Arch. Med. Res. 1995. - Vol.26. -P.305-306.

104. In situ hybridization for the identification of yeastlike organisms in tissue section / Hayden R. T., Qian X., Roberts G. D., Lloyd R. V. // Diagn. Mol. Pathol. 2001. - Vol.10. - P. 15-23.

105. Increase in coccidioidomycosis--Arizona, 1998-2001 // MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 2003. - Vol.52,№ 6. - P.109-112.

106. Johnson S. M.( Simmons K. A. and Pappagianis D. Amplification of Coccidioidal DNA in Clinical Specimens by PCR // J. Clin. Microbiol. -2004. Vol.42,№5. - P.1982-1985.

107. Johnson S. M. and D. Pappagianis. The coccidioidal complement fixation and immunodiffusion-complement fixation antigen is a chitinase // Infect. Immun.- 1992.-Vol 60,-P.2588-2592.

108. Johnson S.M, Zimmermann C.R, Pappagaanis D. Use of a recombinant Coccidioides immitis complement fixation antigen-chitinase in conventional serological assays // J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol.34,№12. - P.3160-3164.

109. Kaufman L., Clark M. J. Value of the concomitant use of complement fixation and immunodiffusion tests in the diagnosis of coccidioidomycosis // Appl. Microbiol. 1974. - Vol.28. - P.641-643.

110. Kirkland T.M, Fierer J. Coccidioidomycosis: a reemerging infectious disease // Emerg. Infect. Dis. 1996. - Vol.2. - P. 192-199.

111. In search of the natural habitat of Paracoccidioides brasiliensis / McEwen J. G., Garcia A. M., Ortiz B. L. et al. // Arch. Med. Res. 1995. - Vol.26. -P.305-306.

112. In situ hybridization for the identification of yeastlike organisms in tissue section / Hayden R. T., Qian X., Roberts G. D., Lloyd R. V. // Diagn. Mol. Pathol. 2001. - Vol.10. - P.15-23.

113. Increase in coccidioidomycosis—Arizona, 1998-2001 // MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 2003. - Vol.52,№ 6. - P.109-112.

114. Johnson S. M., Simmons K. A. and Pappagianis D. Amplification of Coccidioidal DNA in Clinical Specimens by PCR // J. Clin. Microbiol. -2004. Vol.42,№5. - P.1982-1985.

115. Johnson S. M. and D. Pappagianis. The coccidioidal complement fixation and immunodiffusion-complement fixation antigen is a chitinase // Infect. Imrnun.- 1992. Vol 60,- P.2588-2592.

116. Johnson S.M, Zimmermann C.R, Pappagaanis D. Use of a recombinant Coccidioides immitis complement fixation antigen-chitinase in conventional serological assays // J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol.34,№12. - P.3160-3164.

117. Kaufman L., Clark M. J. Value of the concomitant use of complement fixation and immunodiffusion tests in the diagnosis of coccidioidomycosis // Appl. Microbiol. 1974. - Vol.28. - P.641-643.

118. Kirkland T.M, Fierer J. Coccidioidomycosis: a reemerging infectious disease // Emerg. Infect. Dis. 1996. - Vol.2. - P.192-199.

119. Kolivras K.N., Comrie A.C. Modeling valley fever (coccidioidomycosis) incidence on the basis of climate conditions // Int. J. Biometeorol, 2003. -Vol.47,№2. - P.87-101.

120. Koufopanou V., Burt A., Taylor J.W. Concordance of gene genealogies reveals reproductive isolation in the pathogenic fungus Coccidioides immitis 1/ Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1997. Vol.94,№10. - P.5478-5482.

121. Krane J.F., Renshaw A. A. Relative value and cost-effectiveness of culture and special stains in fine needle aspirates of the lung // Acta Cytol. 1998. -Vol.42,№2. - P.305-311.

122. Levine H.B., Cobb I.M., Scalarone G.M. Spherule coccidioidin in delayed dermal sensitivity reactions of experimental animals // Sabouraudia 1969. -Vol.7,№l. - P.20-32.

123. Levine H.B., Jonzalez-Ochoa A., Ten Iyck D.R. Dermal sensitivity to C. immitis. A comparison of responses elicited in man by spherulin and coccidioidin //Amer. Rev. Respirate. Dis. 1973. - Vol.107, №3. -P.379-386.

124. Lupan D.M., Nziramasanga P. Elastase activity of fungi with anamorphs similar to Coccidioides immitis 11 Mycopathol. 1985. - Vol.92,№3. - P. 169171.

125. Miller M.B., Hendren R., Gilligan P.H. Posttransplantation disseminated coccidioidomycosis acquired from donor lungs // J. Clin. Microbiol. 2004. -Vol.42, №5. - P.2347-2349.

126. Molecular markers reveal cryptic sex in the human pathogen Coccidioides immitis / Burt A., Carter D.A., Koenig G.L. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1996. Vol.93,№2. - P.770-773.

127. Kolivras K.N., Comrie A.C. Modeling valley fever (coccidioidomycosis) incidence on the basis of climate conditions // Int. J. Biometeorol. 2003. -Vol.47,№2. - P.87-101.

128. Koufopanou V., Burt A., Taylor J.W. Concordance of gene genealogies reveals reproductive isolation in the pathogenic fungus Coccidioides immitis II Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1997. Vol.94,№10. - P.5478-5482.

129. Krane J.F., Renshaw A.A. Relative value and cost-effectiveness of culture and special stains in fine needle aspirates of the lung // Acta Cytol. 1998. -Vol.42,№2. - P.305-311.

130. Levine H.B., Cobb I.M., Scalarone G.M. Spherule coccidioidal in delayed dermal sensitivity reactions of experimental animals // Sabouraudia 1969. -Vol.7,№1. - P.20-32.

131. Levine H.B., Jonzalez-Ochoa A., Ten Iyck D.R. Dermal sensitivity to C. immitis. A comparison of responses elicited in man by spherulin and coc-cidioidin II Amer. Rev. Respirate. Dis. 1973. - Vol.107, №3. -P.379-386.

132. Lupan D.M., Nziramasanga P. Elastase activity of fungi with anamorphs similar to Coccidioides immitis II Mycopathol. 1985. - Vol.92,№3. - P. 169171.

133. Miller M.B., Hendren R., Gilligan P.H. Posttransplantation disseminated coccidioidomycosis acquired from donor lungs // J. Clin. Microbiol. 2004. - Vol.42,№5. - P.2347-2349.

134. Molecular markers reveal cryptic sex in the human pathogen Coccidioides immitis / Burt A., Carter D.A., Koenig G.L. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1996. Vol.93,№2. - P.770-773.

135. Molecular markers reveal differentiation among isolates of Coccidioides immitis from California, Arizona and Texas / Burt A., Dechairo B.M., Koenig G.L. et al. II Mol. Ecol. 1997. - Vol.6,№8. - P.781-786.

136. Molecular probes for diagnosis of fungal infections / Sandhu, G. S., Kline B. C., Stockman L., Roberts G. D. // J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol.33. -P.2913-2919.

137. Multi-organ failure caused by reactivated coccidioidomycosis without dissemination in a patient with renal transplantation / Cha J.M., Jung S., Bahng H.S.et al. //J. Respirology 2000. - Vol.5, №1.- P.87-90.

138. Ophuls W. Coccidioidal granuloma // J. Amer, Med. Assoc. 1905. -Vol.45. -P.120M296.

139. Ophuls W. Further observations on a pathogenic mould formerly described as a protozoan (Coccidioides immitis, Coccidioides pyogenes) // Exp. Med. — 1905. -Vol.6.- P.443-486.

140. Ophuls W., Moffitt H.C. A new pathogenic mould (formerly described as a protozoan: Coccidioides immitis pyogenes): preliminary report // Phila Med. J. 1900. - №5. - P.1471-1472.

141. Outbreak of coccidioidomycosis in Washington state residents returning from Mexico. / Cairns L., Blythe D., Kao A., Pappagianis D. et al. // Clin. Infect Dis. 2000. - Vol.30. - P.61-64.

142. Pan S., Cole G. T. Electrophoretic karyotypes of clinical isolates of Coccidioides immitis // Infect. Immun. 1992. - Vol.60. - P.4872-4880.

143. Pan S., Sigler L., Cole G.T. Evidence for a phylogenetic connection between Coccidioides immitis and Uncinocarpus reesii (Onygenaceae) II Microbiology 1994. - № 140. - P. 1481 -1494.

144. Pan. S., Cole G.T. Molecular and biochemical characterization of a Coccidioides immitis-specific antigen // Infect, and Immun. 1995. - Vol.63, № 10. — P.3994-4002.

145. Pappagianis D. Epidemiology of coccidioidomycosis // Curr. Top. Med. Mycol. 1988. - №2. - P. 199-238.

146. Molecular markers reveal differentiation among isolates of Coccidioides immitis from California, Arizona and Texas / Burt A., Dechairo B.M., Koenig G.L. et al. // Mol. Ecol. 1997. - Vol.6,№8. - P.781-786.

147. Molecular probes for diagnosis of fungal infections / Sandhu, G. S., Kline B. C., Stockman L., Roberts G. D. // J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol.33. -P.2913-2919.

148. Multi-organ failure caused by reactivated coccidioidomycosis without dissemination in a patient with renal transplantation / Cha J.M., Jung S., Bahng H.S.et al. // J. Respirology 2000. - Vol.5,№1.- P.87-90.

149. Ophuls W. Coccidioidal granuloma // J. Amer. Med. Assoc. 1905. -Vol.45.-P.1201-1296.

150. Ophuls W. Further observations on a pathogenic mould formerly described as a protozoan (Coccidioides immitis, Coccidioides pyogenes) // Exp. Med. — 1905.-Vol.6.- P.443-486.

151. Ophuls W., Moffitt H.C. A new pathogenic mould (formerly described as a protozoan: Coccidioides immitis pyogenes): preliminary report // Phila Med. J. 1900. - №5. - P. 1471-1472.

152. Outbreak of coccidioidomycosis in Washington state residents returning from Mexico. / Cairns L., Blythe D., Kao A., Pappagianis D. et al. // Clin. Infect. Dis. 2000. - Vol.30. - P.61-64.

153. Pan S., Cole G. T. Electrophoretic karyotypes of clinical isolates of Coccidioides immitis// Infect. Immun. 1992. - Vol.60. - P.4872-4880.

154. Pan S., Sigler L., Cole G.T. Evidence for a phylogenetic connection between Coccidioides immitis and Uncinocarpus reesii (Onygenaceae) // Microbiology 1994. - №140. - P.1481-1494.

155. Pan. S., Cole G.T. Molecular and biochemical characterization of a Coccidioides immitis-specific antigen // Infect, and Immun. 1995. - Vol.63, №10. — P.3994-4002.

156. Pappagianis D. Epidemiology of coccidioidomycosis // Curr. Top. Med. Mycol. 1988. - №2. - P.199-238.

157. Pappagianis D. Serologic studies in coccidioidomycosis // Semin. Respir. Infect 2001. - Vol. 16,№4. - P.242-250.

158. Pappagiannis D., Zimmer B.L. Serology of coccidioidomycosis // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol.3. - P.247-268.

159. Parasitic mycelial forms of Coccidioides species in Mexican Patients / Munoz B., Castanon L.R. Calderon M.E, et al. // J. Clin. Microbiol. 2004.- Vol.42,№3.-P.1247-1249.

160. PCR Assays for Identification of Coccidioides posadasii Based on the Nucleotide Sequence of the Antigen 2/Proline-Rich Antigen / Bialek R., Kern J., Herrmannetall T. et al. // J. Clinical.Microdiol. 2004.- Vol.42 ,№2. P.778-783.

161. Pfaller M.A., Diekema D.J. Unusual fungal and pseudofungal infections of humans //J. Clin. Microbiol. 2005.-Vol.43,№4. - P. 1495-1504.

162. Posadas A. Un nuevo caso de mycosis fungoidea con psorospermis // Ann. Circ. Med. Argent- 1892, №15. - P.585-597.

163. Primary cutaneous coccidiodomycosis: case report and review of the literature / Gildardo J.M., Leobardo V.A., Nora M.O., Jorge O.C. // Int. J. Dermatol. 2006. - Vol.45,№2. - P.121-123.

164. Primers for genotyping single nucleotide polymorphisms and microsatellites in the pathogenic fungus Coccidioides immitis / Fisher M.C., Koenig G.L., White T.J., Taylor J.W. // Mol. Ecol. 1999. - Vol.8. - P. 1082-1084.

165. Proline-rich vaccine candidate antigen of Coccidioides immitis: conservation among isolates and differential expression with spherule maturation / Peng T„ Orsborn K.I, Orbach M.J., Galgiani J.N. // J. Infect Dis. 1999. -Vol. 179,№2. - P.518-521.

166. Pappagianis D. Serologic studies in coccidioidomycosis // Semin. Respir. Infect. 2001. - Vol.16,№4. - P.242-250.

167. Pappagiannis D., Zimmer B.L. Serology of coccidioidomycosis // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol.3. - P.247-268.

168. Parasitic mycelial forms of Coccidioides species in Mexican Patients / Munoz B., Castanon L.R. Calderon M.E. et al. // J. Clin. Microbiol. 2004. - Vol.42,№3. - P. 1247-1249.

169. PCR Assays for Identification of Coccidioides posadasii Based on the Nucleotide Sequence of the Antigen 2/Proline-Rich Antigen / Bialek R., Kern J., Herrmannetall T. et al. // J. Clinical.Microdiol. 2004. -Vol.42,№2.-P.778-783.

170. Pfaller M.A., Diekema D.J. Unusual fungal and pseudofungal infections of humans // J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol.43,№4. - P.1495-1504.

171. Posadas A. Un nuevo caso de mycosis fungoidea con psorospermis // Ann. Circ. Med. Argent.- 1892. №15. - P.585-597.

172. Primary cutaneous coccidiodomycosis: case report and review of the literature / Gildardo J.M., Leobardo V.A., Nora M.O., Jorge O.C. // Int. J. Dermatol. 2006. - Vol.45,№2. - P.121-123.

173. Primers for genotyping single nucleotide polymorphisms and microsatellites in the pathogenic fungus Coccidioides immitis / Fisher M.C., Koenig G.L., White T.J., Taylor J.W. // Mol. Ecol. 1999. - Vol.8. - P.1082-1084.

174. Proline-rich vaccine candidate antigen of Coccidioides immitis: conservation among isolates and differential expression with spherule maturation / Peng T., Orsborn K.I, Orbach M.J., Galgiani J.N. // J. Infect Dis. 1999. -Vol.179,№2.-P.518-521.

175. Pulmonary coccidioidomycosis in Japan: case report and review / Ogiso A., Ito M., Koyama M. et al. // Clin. Infect. Dis. 1997. - Vol.25. - P. 12601261.

176. Rapid identification of dimorphic and yeast-like fungal pathogens with specific DNA probes / Lindsley M. D., Hurst S. F., Iqbal N. J., Morrison C. J. II i. Clin. Microbiol. 2001. - Vol.39. - P.3505-3511.

177. Reid, T. M., Schafer M. P. Direct detection of Histoplasma capsulatum in soil suspensions by two-stage PCR // Mol. Cell. Probes 1999. -Vol.13. -P.269-273.

178. Rippon J.W. Medical mycology: the pathogenic fungi and pathogenic ac-tinomycetes. Philadelphia: Karcourt Brace, 1988. - 797P.

179. Risk factors for acute symptomatic coccidioidomycosis among elderly persons in Arizona, 1996-1997 / Leake J.A.D., Mosley D.G., England B. et al. //J. Infect. Dis. -2000. Vol.181. -P.1435-1440.

180. Rixford E.f Gilchrist T.C. Two cases of protozoan (coccidioidal) infection of the skin and other organs // Johns Hopkins Hosp. Rep. 1896. - №1. -P.209-268.

181. Saubolle M. A. Life cycle and epidemiology of Coccidioides immitis. II In H. E. Einstein and A. Catanzaro Coccidioidomycosis. National Foundation for Infectious Diseases, Washington, D.C. 1996.

182. Seronegative disseminated coccidioidomycosis in patients with HIV infection / Antoniskis D., Larsen R. A., Akil B. et al. // AIDS. 1990. - Vol.4., №7. - P.691-693.

183. Sigler L., Carmichal J.W. Taxonomy of Malbranchea and some other hy-phomycetes with arthroconidia // Mycotaxon 1976. - №4. - P.349-388.

184. Pulmonary coccidioidomycosis in Japan: case report and review / Ogiso A., Ito M., Koyama M. et al. // Clin. Infect. Dis. 1997. - Vol.25. - P.1260-1261.

185. Rapid identification of dimorphic and yeast-like fungal pathogens with specific DNA probes / Lindsley M. D., Hurst S. F., Iqbal N. J., Morrison C. J. //J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol.39. -P.3 505-3511.

186. Reid, T. M., Schafer M. P. Direct detection of Histoplasma capsulatum in soil suspensions by two-stage PCR // Mol. Cell. Probes 1999. -Vol.13. -P.269-273.

187. Rippon J.W. Medical mycology: the pathogenic fungi and pathogenic ac-tinomycetes. Philadelphia: Karcourt Brace, 1988. - 797P.

188. Risk factors for acute symptomatic coccidioidomycosis among elderly persons in Arizona, 1996-1997 / Leake J.A.D., Mosley D.G., England B. et al. //J. Infect. Dis. -2000. Vol.181. -P. 1435-1440.

189. Rixford E., Gilchrist T.C. Two cases of protozoan (coccidioidal) infection of the skin and other organs // Johns Hopkins Hosp. Rep. 1896. - №1. -P.209-268.

190. Saubolle M. A. Life cycle and epidemiology of Coccidioides immitis. II In H. E. Einstein and A. Catanzaro Coccidioidomycosis. National Foundation for Infectious Diseases, Washington, D.C. 1996.

191. Seronegative disseminated coccidioidomycosis in patients with HIV infection / Antoniskis D., Larsen R. A., Akil B. et al. // AIDS. 1990. - Vol.4., №7. - P.691-693.

192. Sigler L., Carmichal J.W. Taxonomy of Malbranchea and some other hy-phomycetes with arthroconidia // Mycotaxon 1976. - №4. - P.349-388.

193. Small-subunit ribosomal DNA sequence shows Paracoccidioides brasil-iensis closely related to Blastomyces dermatitidis / Bialek R., Ibricevic A., Fothergill A., Begerow D. // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol.38. - P.3190-3193.

194. Smith M.A, Anderson A.E, Kostroff K. An unusual case of coccidioidomycosis //J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol.32. - P. 1063-1064.

195. Soil isolation and molecular identification of Coccidioides immitis / Greene D.R., Koenig G., Fisher M.C., Taylor J.W. // Mycologia 2000. -Vol.92. - P.406-410.

196. Spherulin skin testing and histoplasmal and coccidioidal serology: lack of effect / Deresinski S.C., Levine H.B., Kelly P.C. et al. // Am. Rev. Respir. Dis.- 1977. Vol 4.,№ 7. - P.691-693.

197. Stevens D.A. Coccidioidomycosis//N. Engl. J. Med. 1995. - Vol.332. -P. 1077-1082.

198. Stevens D.A. Diagnosis of fungal infections: current status // J. Antimicr. Chemoth. 2002. - Vol.49. - P. 11-19.

199. Taxy J.B., Kodros S. Musculoskeletal coccidioidomycosis: unusual sites of disease in a nonendemic area // Am. J. Clin. Pathol. 2005. — Vol. 124,№5. - P.696-696.

200. Taylor J.W., Fisher M.C. Fungal multilocus sequence typing — it's not just for bacteria // Current Opinion in Microbiology 2003. - Vol.6. — P.351-356.

201. Small-subunit ribosomal DNA sequence shows Paracoccidioides brasil-iensis closely related to Blastomyces dermatitidis / Bialek R., Ibricevic A., Fothergill A., Begerow D. // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol.38. - P.3190-3193.

202. Smith M.A, Anderson A.E, Kostroff K. An unusual case of coccidioidomycosis //J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol.32. - P. 1063-1064.

203. Soil isolation and molecular identification of Coccidioides immitis / Greene D.R., Koenig G., Fisher M.C., Taylor J.W. // Mycologia 2000. -Vol.92. - P.406-410.

204. Spherulin skin testing and histoplasmal and coccidioidal serology: lack of effect / Deresinski S.C., Levine H.B., Kelly P.C. et al. // Am. Rev. Respir. Dis.- 1977. Vol 4.,№ 7. - P.691-693.

205. Stevens D.A. Coccidioidomycosis //N. Engl. J. Med. 1995. - Vol.332. -P. 1077-1082.

206. Stevens D.A. Diagnosis of fungal infections: current status // J. Antimicr. Chemoth. 2002. - Vol.49. - P. 11-19.

207. Taxy J.B., Kodros S. Musculoskeletal coccidioidomycosis: unusual sites of disease in a nonendemic area // Am. J. Clin. Pathol. 2005. - Vol. 124,№5. - P.696-696.

208. Taylor J.W., Fisher M.C. Fungal multilocus sequence typing — it's not just for bacteria // Current Opinion in Microbiology 2003. - Vol.6. -P.351-356.

209. Tirabosei I. N., Marticorena B., Negroni R. ELISA in coccidioidomycosis humana // Rev. Inst. med. trop. Sao Paulo. 1991. - Vol.33,№4. - P.281-285.

210. Unusual forms of immature sporulating Coccidioides immitis diagnosed by fine-needle aspiration biopsy / Ke Y., Smith C.W., Salaru G. et al. // Arch. Pathol. Lab. Med. 2006. - Vol. 130,№ . p.97-100.

211. Wack E.E., DuggerK.O., Galgiani J.N. Enzyme-linked immunosorbent assay for antigens of Coccidioides immitis : human sera interference corrected by acidification-heat extraction // J. Lab. Clin. Med. 1988. - Vol.111. -P.560-565.

212. Wayne J., Sedman D.W., Wethilnglon R. Serological responses to various Coccidioides antigen preparations in a new enzyme immunoassay // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol.30,№8. - P.1907-1912.

213. Weiner M.H. Antigenemia detected in human coccidioidomycosis // J. Clin. Microbiol 1983. - Vol.18. - P.136-142.

214. Yang M. C., Magee D. M., Cox R. A. Mapping of a Coccidioides immitis-specific epitope that reacts with complement-fixating antibody // Infect. Immun. 1997. - Vol. 65. - P.4068-4074.

215. Yeo S. F., Wong B. Current Status of Nonculture Methods for Diagnosisof Invasive Fungal Infections // J. Clin. Microbiol. 2002.- Vol.l5,№3. -P.465-484.

216. Zartarian M , Peterson E.M., de la Maza L.M. Detection of antibodies to Coccidioides immitis by enzyme immunoassay // Amer. J. Clin. Pathol. -1997. Vol. 107,№2. - P. 148-153.

217. Tirabosei I. N., Marticorena B., Negroni R. ELISA in coccidioidomycosis humana // Rev. Inst. med. trop. Sao Paulo. 1991. - Vol.33,№4. - P.281-285.

218. Unusual forms of immature sporulating Coccidioides immitis diagnosed by fine-needle aspiration biopsy / Ke Y., Smith C.W., Salaru G. et al. // Arch. Pathol. Lab. Med. 2006. - Vol.130,№1. - P.97-100.

219. Wack E.E., Dugger K.O., Galgiani J.N. Enzyme-linked immunosorbent assay for antigens of Coccidioides immitis : human sera interference corrected by acidification-heat extraction // J. Lab. Clin. Med. 1988. - Vol.111. -P.560-565.

220. Wayne J., Sedman D.W., Wethilnglon R. Serological responses to various Coccidioides antigen preparations in a new enzyme immunoassay // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol.30,№8. - P.1907-1912.

221. Weiner M.H. Antigenemia detected in human coccidioidomycosis // J. Clin. Microbiol 1983. - Vol.18. - P.136-142.

222. Yang M. C., Magee D. M., Cox R. A. Mapping of a Coccidioides immitis-specific epitope that reacts with complement-fixating antibody // Infect. Immun. 1997. - Vol. 65. - P.4068^074.

223. Yeo S. F., Wong B. Current Status of Nonculture Methods for Diagnosisof Invasive Fungal Infections // J. Clin. Microbiol. 2002.- Vol.l5,№3. -P.465-484.

224. Zartarian M , Peterson E.M., de la Maza L.M. Detection of antibodies to Coccidioides immitis by enzyme immunoassay // Amer. J. Clin. Pathol. -1997.-Vol.107,№2. -P.148-153.

225. Zimmer B.L., Pappagianis D. Comparison of immunoblot analyses of spherule-endospore-phase extracellular protein and mycelial-phase antigen of Coccidioides immitis // Infec.and Immun. 1986. - Vol.53 ,№1. - P.64-70.

226. Zimmerman C.R., Snedker C.J., Pappagianis D. Characterization of Coccidioides immitis isolates by restriction fragment length polymorphisms // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol.32,№12. - P.3040-3042.

227. Zimmer B.L., Pappagianis D. Comparison of immunoblot analyses of spherule-endospore-phase extracellular protein and mycelial-phase antigen of Coccidioides immitis // Infec.and Immun. 1986. - Vol.53,№1. - P.64-70.

228. Zimmerman C.R., Snedker C.J., Pappagianis D. Characterization of Coccidioides immitis isolates by restriction fragment length polymorphisms // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol.32,№12. - P.3040-3042.

Информация о работе

Гришина, Марина Анатольевна
кандидата биологических наук
Саратов, 2007
ВАК 03.00.07

Диссертация

Разработка амплификационной тест-системы для идентификации возбудителей кокцидиоидомикоза - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы