Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разнообразие магнитотактических бактерий пресных водоемов европейской части России

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разнообразие магнитотактических бактерий пресных водоемов европейской части России"

На правах рукописи

Дзюба Марина Владимировна

РАЗНООБРАЗИЕ МАГНИТОТАКТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ ПРЕСНЫХ ВОДОЕМОВ ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ.

03.02.03- микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 1 ЯШ 2Г,3

Москва-2013

005048937

005048937

Работа выполнена в Федеральном Государственном Бюджетном Учреждении Науки Центре «Биоинженерия» РАН и Федеральном Государственном Бюджетном Учреждении Науки Институте микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН

Научный руководитель:

Научный консультант

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук

Кузнецов Борис Борисович

доктор биологических наук

Горленко Владимир Михайлович

Ивановский Руслан Николаевич

доктор биологических наук, ведущий

научный сотрудник кафедры микробиологии

биологического факультета МГУ им.

М.В.Ломоносова

Ушакова Нина Александровна

заведующая лабораторией инновационных

технологий Федерального государственного

бюджетного учреждения науки Институт

проблем экологии и эволюции им. А.Н.

Северцова РАН

Ведущая организация:

Федеральное государственное унитарное предприятие Государственный научно-исследовательский институт Генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Защита состоится 19.02.2013 г. в 15:30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу 119991, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, корп. 12, биологический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, аудитория М-1 . С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. Автореферат разослан «_»_20_

Ученый секрет:

Диссертационного совета к.б.н. Пискункова Нина Федоровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Способность ориентироваться в геомагнитном поле была выявлена у различных организмов, в том числе, насекомых, птиц и млекопитающих (Киршвинк, 1989). Одним из самых ярких примеров магниторецепции являются магнитотактические бактерии (Blakemore, 1975). Магнитотактические бактерии (магнитобактерии, МТБ) представляют собой гетерогенную группу водных микроорганизмов, объединенных способностью ориентироваться во внешнем магнитном поле благодаря наличию в их клетках магнетосом — частиц магнетита (FejO/i) или грейгита (Fe3S<i), окруженных липопротеиновой мембраной. Эти микроорганизмы широко распространены в природе и играют значительную роль в круговороте железа, а также накоплении магнетита в придонных осадках (Bazylinski and Frankel, 2004). Кроме того, изучение магнитобактерии является актуальным сегодня благодаря уникальности свойств бактериальных магнитных наноразмерных частиц и их высокому биотехнологическому потенциалу.

Несмотря на значительный прогресс в изучении разнообразия МТБ (Blakemore, Maratea and Wolfe, 1979; Flies, Peplies and Schüler, 2005), механизма образования магнетосом (Komeili, 2007), а также генетических основ биоминерализации внутриклеточного магнетита (Jogier et al., 2009), многие вопросы остаются малоизученными. К их числу можно отнести вопросы происхождения и эволюции магнитотаксиса, а также тесно связанные с ними проблемы филогении МТБ. Кроме того, необходимо дальнейшее изучение таксономического разнообразия МТБ из различных природных источников. В частности, следует отметить недостаточное освещение вопросов видового разнообразия МТБ в водоемах Российской Федерации, которое сводится, в основном, к описанию встречающихся морфологических типов или описанию нового штамма уже известного вида (Чертов, 2000; Филина, 1998). Из-за трудностей культивирования на сегодняшний день в чистых культурах доступно не более 10 видов. Тем не менее, филогенетическое разнообразие некультивируемых МТБ может быть изучено с использованием молекулярно-экологических методов, основанных на определении и анализе последовательности генов 16S рРНК, так как эти бактерии, благодаря их способности к магнитотаксису, могут быть сконцентрированы из природных источников с помощью магнита. Применение комплексного подхода, включающего как классические микробиологические методы, предполагающие получение чистых культур и культивирование, так и молекулярно-экологические методы идентификации, для изучения видового разнообразия МТБ позволит не только более глубоко изучить представленность

различных МТБ в природных водоемах, но и расширить спектр штаммов, перспективных для биотехнологического применения.

Цель н задачи исследований. Целью настоящей работы являлись поиск и изучение видового разнообразия магнитотактических бактерий из различных пресных водоемов европейской части России с использованием микробиологических и молекулярно-биологических методов. Для достижения заданной цели были поставлены следующие задачи:

1) описать морфологическое разнообразие магнитотактических бактерий, выделенных из донных осадков, на примере следующих водоемов: озеро Селигер (Тверская обл.), река Ольховка (г. Кисловодск), река Аксай Курмоярский (Волгоградская обл.), река Пшада (Краснодарский край) с помощью методов световой и просвечивающей электронной микроскопии;

2) описать филогенетическое разнообразие выявленных МТБ на основе данных анализа последовательностей генов, кодирующих 16S рРНК;

3) выделить в чистые культуры, изучить физиологические особенности и определить таксономическое положение новых штаммов МТБ;

5) определить последовательность ДНК полноразмерного генома одного из выделенных штаммов и провести на основе полученных данных анализ генов, ответственных за метаболизм железа и биоминерализацию магнетита.

Научная новизна н практическая значимость работы. На основании комплексного исследования впервые описано морфологическое и филогенетическое разнообразие МТБ ряда пресных водоемов Российской Федерации. Полученные результаты научно-исследовательской работы дополняют имеющиеся данные о видовом разнообразии МТБ.

Выделены в чистую культуру и охарактеризованы ранее не описанные МТБ, относящиеся к роду Magnetospirillum и предположительно представляющие собой новые виды. Выделенные штаммы могут быть использованы для промышленного получения высококачественных магнитных наночастиц. Также в результате работы был описан новый вид бактерий Magnetospirillum aberrantis sp. nov. str. SpK, синтезирующий немногочисленные внутриклеточные кристаллы магнетита, но не обладающий способностью к магнитотаксису.

Секвенирован и аннотирован геном Magnetospirillum aberrantis. На основе последовательности генома М. aberrantis проведен анализ генов, предположительно ответственных за обмен железа и биоминерализацию внутриклеточного магнетита. Предложена гипотетическая схема этих процессов.

Реализация результатов исследований. Полученный в результате данной работы штамм Magnetospirillum 80-1 был использован в качестве продуцента бактериальных магнетосом при выполнении работ по государственному контракту Минобрнауки России №16.512.11.2128. На основе препарата магнетосом штамма Ма^паовртИит 80-1 был создан прототип набора реактивов для выделения ДНК. Также полученный препарат магнетосом был использован для получения модифицированных бактериальных наночастиц с иммобилизованными на поверхности антителами с целью создания прототипа набора для проведения высокочувствительного иммуноферментного анализа.

Апробация работы и публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано 2 научные статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных Министерством Образования и ВАК РФ. Опубликовано 7 тезисов докладов на российских и международных конференциях. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 48-й научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2010), 14-ой Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), XVIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011» (Москва, 2011), Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2011; Москва, 2012), международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 2012), молодежной научной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2012).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов. Работа изложена на 126 страницах, содержит 7 таблиц и 19 рисунков. Список литературы содержит 174 источника, из которых 6 опубликовано в России и 168 зарубежных.

Сотрудничество и благодарности. Основная работа по анализу разнообразия МТБ с помощью молекулярно-экологических методов проводилась на базе центра коллективного пользования уникальным научным оборудованием, в группе молекулярной диагностики Центра «Биоинженерия» РАН (руководитель - к.б.н. Кузнецов Б.Б.). Выделение и исследование морфологии и физиологии новых штаммов было проведено на приборной базе лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН (руководитель - д.б.н. Горленко В.М.). Химический состав включений М. аЬеггапИя был определен на приборной базе РНЦ «Курчатовский институт» (руководитель - к.ф.-м.н. А.Л. Васильев). Секвенирование последовательностей нуклеиновых кислот фрагментов генов 168 рРНК было проведено на

приборной базе ЦКП, в группе мегасеквенирования Центра «Биоинженерия» РАН (руководитель - к.т.н. Т. В. Колгановой). Определение последовательности генома М. aberrantis было проведено совместно с сотрудниками лаборатории систем молекулярного клонирования Центра «Биоинженерия» РАН (руководитель д.б.н. Равин Н.В.). Автор выражает глубокую благодарность всем упомянутым участникам данной работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Экспериментальные исследования выполнялись в период 2009-2012 гг.

Объектом исследования являлись магнитотактические бактерии донных осадков пресных водоемов - р. Ольховки, оз. Селигер, р. Аксай Курмоярский и р. Пшада. Бактерии были сконцентрированы с помощью магнита (1.1 Тл) из микрокосмов, сформированных из ила и воды исследуемых водоемов в соотношении 1:4, объем микрокосмов составил 3 л. Пробы воды и ила были отобраны из прибрежной зоны, с глубины около 0.5 м. На озере Селигер исследования проводили в течение двух лет, проводя отбор проб в разных точках таким образом, что было сформировано два микрокосма - «Селигер-1» и «Селигер-2». Микрокосмы (аквариумы) на протяжении всего времени проведения экспериментов содержали в темноте, при комнатной температуре. Магнит устанавливали у стенки аквариума с внешней стороны, на границе раздела фаз ил/вода. Через 1-3 часа у северного полюса магнита, с внутренней стороны стенки аквариума, формировалось видимое невооруженным глазом пятно, представляющее собой концентрированную фракцию МТБ. Отбор биомассы бактерий из пятна проводили с помощью стеклянной пипетки Пастера и полученный материал использовали для последующих экспериментов.

Морфологию бактерий изучали под световым микроскопом Olympus ВХ-41 и под просвечивающим электронным A JEM-100CXII с ускоряющим напряжением 80 кВ. Способность к магнитотаксису оценивали визуально, наблюдая под световым микроскопом за изменением направления движения клеток МТБ в зависимости от изменения направления оси магнита, расположенного на предметном столике микроскопа.

Библиотеки клонов последовательностей 16S рРНК исследуемых бактерий получали следующим образом. Суммарную ДНК из сконцентрированных клеток МТБ выделяли с помощью модифицированного метода Бирнбойма-Доли и Wizard-технологии ("Promega", США). Полученный препарат ДНК использовали для амплификации гена 16S рРНК с помощью ПЦР (с использованием универсальных праймеров 1 IF и 1492R). Затем полученный продукт клонировали при помощи набора реактивов pGEM-T Easy System ("Promega", США) в штамм DH10B Е. coli, согласно рекомендациям производителя.

Клонированные фрагменты секвенировапи на автоматическом секвенаторе ABI 3730 ("Applied Biosystems", США) с использованием универсальных праймеров M13F, M13R и 530F.

Первичный анализ сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изучаемых бактерий с имеющимися в базе данных GenBank был проведен с помощью программного пакета BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast. Филогенетический анализ исследуемых МТБ проводили с использованием пакета программ MEGA 5, методом neighbor-joining.

Стратегия выделения чистых культур МТБ была основана на использовании метода капиллярной магнитной сепарации "race track" для эффективного отделения перед посевом клеток, способных к магнитотаксису, от других бактерий. Очищенными таким образом клетками МТБ засевали питательные среды. Для получения отдельных колоний культуры магнитотактических спирилл пересевали в столбики агаризованной (1.5%) гетеротрофной среды, содержащей сукцинат в качестве единственного источника углерода.

Филогенетический анализ выделенных магнитотактических спирилл проводили, как описано выше.

С целью определения полиморфизмов на штаммовом/видовом уровне, использовали такие разновидности ПЦР-фингерпринтинга, как ВОХ-ПЦР (BOX repetitive elements), ERIC-ПЦР (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus sequence) и AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) с использованием рестриктаз Bse211 и Xbal.

Для выделения культуры бактерий М. aberrantis была использована модифицированная среда Пфеннига (Pfennig and Lippert, 1966), в которые засевали материал донных осадков р. Ольховки. Чистая культура М. aberrantis была получена с использованием модифицированного метода магнитной сепарации на основе накопительной культуры.

Для выделения и очистки магнитных включений М. aberrantis использовали метод ультразвукового разрушения клеток (Virsonic 600, США) с последующей сепарацией самих частиц на магнитных колонках (MACS Separation Columns, Германия). Изображения и картина дифракции магнитных включений штамма SpK были получены с помощью просвечивающего электронного микроскопа модели TECNAI G2 30 с ускоряющим напряжением 300 кВ. Элементный состав был определен с помощью метода энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии.

Секвенирование генома М. aberrantis было проведено совместно с сотрудниками лаборатории систем молекулярного клонирования Центра «Биоинженерия» РАН на

секвенаторе 454 FLX (Roche). Сборку контигов проводили с помощью пакета программ Phred/Phrap/Consed. Определение открытых рамок считывания и их аннотацию проводили с помощью программного пакета Glimmer и сравнением с аналогичными последовательностями из международных баз данных KEGG, Uniprot, NR-NCBI. Идентификация и анализ предполагаемых генов обмена железа и биоминерализации магнетита проведен с помощью пакета программ Molquest v. 2.3.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Из литературных данных известно, что МТБ были обнаружены в олиго- и мезотрофных природных водоемах с выраженной стратификацией донных осадков (Flies С., Peplies J. and Schuler D., 2004). Выбранные для исследования водоемы удовлетворяли всем перечисленным условиям. Исследования МТБ вели в микрокосмах, сформированных из воды и ила выбранных водоемов, поскольку это позволяло вести длительные наблюдения в лабораторных условиях.

1. Морфологическое разнообразие МТБ исследуемых водоемов.

Изучение морфологии сконцентрированных клеток МТБ методами световой и просвечивающей электронной микроскопии выявило присутствие различных морфотипов, преобладающим из которых почти во всех микрокосмах (за исключением микрокосма «Пшада») являлись магнитные кокки (рис. 1).

В микрокосме «Ольховка» на протяжении всего времени исследования преобладали подвижные магнитные кокки, размером 1-2 мкм. На микрофотографии кокков из микрокосма «Ольховка» видны расположенные по периферии клетки магнетосомы, диаметром 45-55 нм. Кроме того, в клетках выявляются крупные электрон-плотные включения, занимающие большую часть объема клетки (Рис. 1А).

В микрокосмах «Селигер-1» и «Селигер-2» также преобладали магнитные кокки, а в микрокосме «Селигер-2» было выявлено присутствие магнитных спирилл в качестве минорного компонента. Магнитные кокки, выявленные в микрокосмах «Селигер-1» и «Селигер-2» различались по морфологическим особенностям. Магнитотактические кокки (размером 1,5-2 мкм) из микрокосма «Селигер-1» содержали две цепочки магнетосом, расположенные под углом друг к другу. Диаметр магнетосом составлял 45-50 нм. Клетки подвижны с помощью двух пучков жгутиков (рис. 1Б). Магнитные кокки из микрокосма «Селигер-2» (размер 1-1,5 мкм) содержали магнетосомы диаметром 45-50 нм, объединенные в множественные цепочки, а также присутствующие в виде скоплений (рис. 1В).

В микрокосме «Аксай-Курмоярский» преобладали магнитные кокки, в качестве минорного компонента присутствовали магнитотактические спириллы. На микрофотографии магнитотактических кокков, выявленных в данном микрокосме, видны магнетосомы, диаметром 45-55 нм, объединенные в единственную цепочку (рис. 1Г). Особенностью микрокосма «Пшада» являлось преобладание среди МТБ вибрионов, размером 0.5x2.0 мкм. Магнитотактические кокки присутствовали в качестве минорного компонента. В клетках магнитотактических вибрионов микрокосма «Пшада» присутствовала единственная цепочка крупных, диаметром 100-120 нм, магнетосом. Благодаря своим крупным размерам, магнетосомы этих МТБ выявляются даже под световым микроскопом (рис. 1 Д, Е).

и. Д

У»,

Рисунок 1. Морфология магнитотактических бактерий, выявленных в результате исследования. А - МТБ микрокосма «Ольховка»; Б - МТБ микрокосма «Аксай-Курмоярский»; В, Г - МТБ микрокосма «Селигер-1»; Д - МТБ микрокосма «Селигер-2»; Е - МТБ микрокосма «Пшада». Стрелками обозначены магнетосомы. Масштабная линейка 0.5 мкм.

Таким образом, по данным микроскопических исследований, в изученных водоемах наблюдалось значительное морфологическое разнообразие МТБ. В большинстве микрокосмов преобладали магнитотактические кокки. Кроме того, у выявленных МТБ варьировали размеры и внутриклеточная локализация магнетосом.

2. Филогенетическое разнообразие магнитотактических кокков исследуемых водоемов.

Для МТБ, выявленных в донных осадках каждого из исследуемых водоемов, были получены библиотеки клонов, содержащих вставки фрагментов генов 16S рРНК. В результате проведения филогенетического анализа фрагментов было обнаружено, что преобладающие филотипы во всех исследуемых микрокосмах, кроме микрокосма «Пшада», принадлежат магнитотактическим коккам. Всего в настоящей работе было выявлено 8 филотипов магнитотактических кокков (рис. 2). В микрокосме «Ольховка» выявлено 2 филотипа, один из которых является доминирующим (Olkh-1) и включает 62 последовательности. Было показано, что данные последовательности идентичны последовательности 16S рРНК некультивируемого магнитного кокка, обнаруженного ранее в донных осадках озера Чимси, Бавария (Flies, Peplies and Schuler, 2005). Другой обнаруженный нами филотип (Olkh-2) представлен всего одной последовательностью и образует на дереве отдельную кладу. Оба этих филотипа входят в единый кластер с тремя филотипами SELII магнитотактических кокков, выявленными в микрокосме «Селигер-2».

Единственный филотип, выявленный в микрокосме «Селигер-1» - SELI -формирует отдельный кластер. Наибольшее число филотипов магнитотактических кокков, четыре, выявлено в микрокосме «Аксай-Курмоярский». Три из них - Aks-1, Aks-2, Aks-3 объединяются в единый кластер, в то время как Aks-4 входит в состав отдельного кластера, вместе с последовательностями некультивируемых пресноводных магнитных кокков, обнаруженных ранее в других исследованиях (Flies, Peplies and Schuler, 2005). На представленной дендрограмме видно, что все обнаруженные филотипы образуют единый кластер с последовательностями других некультивируемых пресноводных магнитотактических кокков, в то время как морские культивируемые кокки Magnetococcus marinus МС-1 и МО-1 формируют отдельный кластер, представители которого недавно были объединены в семейство Magnetococcaceae, порядок Magnetococcales (Bazylinski et al., 2012). Уровень ветвления кластеров на полученной нами дендрограмме позволяет предположить, что некультивируемые пресноводные и культивируемые морские магнитотактические кокки принадлежат к различным семействам, относящимся к порядку Magnetococcales класса Alphaproteobacteria. Однако отсутствие культивируемых

представителей группы пресноводных магнитотактических кокков оставляет этот вывод на уровне предположения.

OIkli-1 JX502624 (62 клопа) идентичны Magnetic coccus ТВ24 Х81185.1

OlkU-2 JX502623

оо

ISELIM KC252622 (4 клона) SELI1-2 KC252623 (19 клонов)

SELIJ-3 KC252624 (28 клонов)

UnculturedMagnetic coccus (CS103> Х61605Л

ncultured Magnetic coccus iTB121 XS11S3.1 Uncultured Magueiococcus sp. clone 1" EU780677.I

UnculturedMagnetococctnsp. clone 29 EU7806S0.1

Aks-1 KC252625 (19 клонов) Aks-2 KC252626

Aks-3 KC252627 (35 клонов)

Aks-4 КС 2 52628 (2 клона)

Uncultured Magnetic coccus (CS81) XS 1184.1

, UnculturedMagnelococcussp. cloneXSE-42 EF379385.1 L UnculturedMagmiococcussp. clone XSE-4 EF3793861 — UnculturedMagneiococcussp- cloned EU780674.1

SELI KC252621 (55 клонов)

□Uncultured Magnetic bacterium rjJ 17 У13210.1 Uncultured Magnetic bacterium ij5 20 Y13207.1 Magneto-ovoid bacterium MO-1 EF643520.2 Magnetococcus marinus MC-1 TJN896'52.1

Ccittlobacwcrescenliis N A1 ООО T NCO11916.1

-o

ft о S - О CO

о

s=j X cr

\Miigiielococcaceue

О -XS n Z

MagiieioipirilluiiigiyphirwaiMise'SiSR-1' NR027605.1 Alagnetospiriliи litmagneioiacticum DSM 3856" NR0263S1.1 99 IЛ/agneiospirlllwiiiitagnaiicuntXMB-l' D1'514.1 Pseudomonas aeruginosa NBRC2689T AB6S0318.1

Escherichia coll JCM1649'AB24 2910.1 Desul/ovibrlo magmxicin RS- Г NR027575.1

Desuifovibrio desutfuricaw AT CC 2 7 7 74r AF192154.1 Geobacier metallireduceni GS-1JT NC'00751 1 Mjyococcutfuhw HW-11 NCO 15711.1

Nilrospia marina1 X82559.1 Candiclaim MagMtobacier.

ii bavaricum X7183 S. 1

Рисунок 2. Филогенетический анализ клонов фрагментов генов (1300 п.о.) 16S рРНК магнитотактических кокков исследуемых водоемов. Дерево построено с помощью алгоритма neighbor-joining, с анализом 1000 альтернативных деревьев. Цифры указывают достоверность bootstrap-анализа. Типовые штаммы обозначены надстрочным Т. Внизу дан масштаб эволюционных расстояний. Филотипы исследуемых магнитотактических кокков выделены жирным шрифтом. Обозначения Aks - филотипы магнитотактических кокков, выявленные в микрокосме «Аксай-Курмоярский»; SELI - филотип магнитотактических кокков, выявленные в микрокосме «Селигер-1»; SELII - филотипы магнитотактических кокков, выявленные в микрокосме «Селигер-2»; Olkh - филотипы магнитотактических кокков, выявленные в микрокосме «Ольховка»; арабскими цифрами через дефис обозначены номера филотипов; а - Alphaproteobacteria, у - Gammaproteobacteria, 8 -Deltaproteobacteria.

Несмотря на то, что под световым микроскопом среди МТБ, полученных из микрокосмов «Селигер-2» и «Аксай Курмоярский», наблюдали немногочисленные клетки магнитотактических спирилл, в результате анализа библиотек клонов не были обнаружены соответствующие им филотипы. Это указывает на то, что магнитотактические спириллы представлены в качестве минорного компонента.

Следует отметить, что в микрокосме «Пшада» в результате анализа клональных библиотек не было обнаружено последовательностей, сходных с последовательностями МТБ, имеющимися в базе данных Genbank. Этот факт может указывать на принадлежность наблюдаемых бактерий филогенетическим группам, среди которых МТБ ранее не были выявлены. Таким образом, филогенетическое разнообразие МТБ р. Пшада нуждается в дальнейшем изучении.

3. Характеристика новых штаммов магнитотактических спирилл.

В результате последовательного применения магнитной сепарации, метода "race track" (капиллярной магнитной сепарации) МТБ из донных осадков р. Ольховка, оз. Селигер и р. Пшада и последующем посеве содержимого кончика капилляра на питательные среды, в среде, содержащей сукцинат натрия в качестве единственного источника углерода, наблюдали рост микроорганизмов. Отдельные колонии были получены после пересева клеток из жидкой культуры в столбики агаризованной среды следующего состава (г/л): КН2Р04, 0.7; NaN03, 0.15; тиогликолят натрия, 0.2; сукцинат натрия, 0.4; натрий виннокислый, 0.4; ацетат натрия, 0.05; цитрат железа (III) 50 мкМ; ресазурин 0.2 мг/л; агар 1.5%, растворы витаминов и микроэлементов, по 1 мл (Bryantseva

et al., 1999), pH 6.8. Штаммы магнитотактических спирилл, выделенных из донных осадков р. Ольховка, оз. Селигер и р. Пшада были обозначены как SO-1, Sel-I и SP-1 соответственно.

Клетки выделенных штаммов представляли собой спириллы. Размер клеток SO-1 составил 0.3-0.4 х 1.2-3.0 мкм, SP-1 и Sel-1 - 0.3-0.4 х 1.5-5 мкм. На электронных микрофотографиях каждого из штаммов выявляется единственная цепочка магнетосом, расположенная вдоль длинной оси клетки, диаметр частиц составляет 45-55 нм (Рис. 3).

А

J(ÍP

ш ¡айНнь. А/ 4

.....^...Д | ......."

НН ЩИ? — —

Рисунок 3. Морфология выделенных штаммов магнитотактических спирилл. А — БО-1; Б -ЭР-!; В - БеН. Масштабная линейка - 0.4 мкм; стрелками обозначены магнетосомы.

Штаммы Magnetospirillum spp. SO-1, SP-1 и Sel-1 развивались в диапазоне температур 18-42 'С, с оптимальным ростом при 28 'С. Оптимум рН для роста составил 6.5-6.8.

Штаммы росли хемоорганогетеротрофно, на средах с карбоновыми кислотами. Наилучший рост SP-1 и Sel-1 наблюдается на средах с фумаратом, малатом, сукцинатом, SO-1 - с сукцинатом, бутиратом и лактатом в качестве единственных источников углерода и доноров электронов. Добавление дрожжевого экстракта (0.1 г/л) и витаминов приводило к незначительному увеличению роста. На средах без железа бактерии прекращали синтез магнетосом.

Все три штамма - микроаэрофилы. Для SP-1 и Sel-1 оптимальным для роста было содержание кислорода в газовой фазе 1-5%. Для SO-1 характерна способность к аэробному росту, однако оптимальным содержанием для роста культуры и формирования магнетосом является содержание кислорода в газовой фазе 2-3%. Способность к анаэробному росту с использованием нитратов в качестве альтернативных акцепторов электронов не обнаружена.

Анализ последовательностей генов 16S рРНК (1300 п.о.) выделенных штаммов с помощью BLAST показал, что наиболее сходными с ними являются последовательности представителей рода Magnetospirillum. Наибольшее сходство последовательности 16S рРНК проявляют с видами М. magneticum и М. magnetotacticum - 98-99%. Для выделенных

в настоящей работе штаммов также показана высокая степень сходства последовательностей 165 рРНК между собой (табл. 1).

Таблица 1. Уровни подобия последовательностей гена 16S рРНК изучаемых штаммов магнитотактических спирилл между собой и с описанными ранее представителями рода Magnetospirillum. Вычислено с помощью Sequence ID/Similarity (BioEdite 7.0.9.0.)

Представители рола Magnetospirillum SO-1 SP-1 Sel-1 Magnetospirillum aberrantis SpK Magnetospirillum magnetotacticum MS-1 S a .o 1 5 a С §■ о il T 1? Magnetospirillum magneticum MGT-1 Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1 Magnetospirillum bellicus str. VDY

SO-1 100.0% 98.0% 97.5% 95.3% 99.6% 99.6% 99.6% 95.6% 95.5%

SP-1 98.0% 100.0% 98.3% 94.9% 98.1% 97.7% 97.6% 95.1% 95.1%

Sel-1 97.5% 98.3% 100.0% 95.3% 98.0% 97.7% 97.5% 95.4% 94.8%

Magnetospirillum aberrantis SpK 95.3% 94.9% 95.3% 100.0% 95.3% 95.4% 95.1% 95.6% 96.7%

Magnetospirill um magnetotacticum MS-1 99.6% 97.7% 98.0% 95.3% 100.0% 99.5% 99.4% 95.6% 95.5%

Magnetospirillum magneticum AMB-1 99.6% 97.7% 97.7% 95.4% 99.5% 100.0% 99.7% 95.4% 95.5%

Magnetospirillum magneticum MGT-1 99.6% 97.6% 97.5% 95.1% 99.4% 99.7% 100.0% 95.5% 95.3%

Magnetospirill um gryphiswaldense MSR-1 95.6% 95.1% 95.4% 95.6% 95.6% 95.4% 95.5% 100.0% 95.7%

Magnetospirillum bellicus str. VDY 95.5% 95.1% 94.8% 96.7% 95.5% 95.6% 95.3% 95.7% 100.0%

Таким образом, на основании полученных результатов выделенные штаммы были отнесены к роду Ма^еШрИИит. На представленной дендрограмме показано, что 80-1 входит в единый кластер с М. та^еНсит и М. magnetotact¡cum, в то время как 5Р-1 и 5е1-1 вместе образуют отдельный кластер (рис. 4).

9з r Magnetospirillum magneticumMGT-l TD17515.1 60\ ■ MagnetospirillitmmagneticumAMB-1T D17514.1

Magnetospirillum sp. SO-1 JX502622

Magnetospirillummagnetotacticum DSM 38?6 : NR026381 .1 Magnetospirillum sp. Sel l KC252629 1—Magnetospirillum sp. SP 1 KC252630

100 Magnetospirillum J10 FJS60937.1 92 I L Magnetospirillum giyphisnaldenseMSR-l TNR027605.1 AquaspirillumpolymorphumDSM 9160 T F.T562215.1 — Magnetospirillum aberrantisSpK GU724731.1 r Dechiorospirilluni sp. WD AF170352

l00 r Dechiorospirilluni sp. DB AV530551 53l Magnetospirillum bellicus VDYT EF405S24.1 Phaeospirillumchandramohanii JA145T AM779061 Phaeospirillum moIiscAiamimDSM120TFR733695.1 Phaeospirillumfu/vlimNCIMB 11762 TNR_025S36.1 ATCC 11170T D30778.1

С

100

- Rhodospirillum rubr

-Rhodospirillum sulfurexigens JA143 т AM710622

-Magnetococcns marinlts MC-17 JNS9675 2.1

Рисунок 4. Филогенетическое положение выделенных штаммов магнитотактических спирилл и М. aberrantis. Алгоритм — neighbor-joining. Дерево построено с помощью алгоритма neighbor-joining, с анализом 1000 альтернативных деревьев. Цифры указывают достоверность bootstrap-анализа. Надстрочный Т - типовые штаммы. Внизу дан масштаб эволюционных расстояний. Изучаемые штаммы выделены жирным шрифтом.

Рисунок 5. Электрофореграммы фингерпринтинг-ПЦР (А, Б) и AFLP-анализа (В). 1 - SO-1; 2 - SP-1; 3 - Sel-1; 4 - М. magnetotacticum; 5 - М. gryphiswaldense', М - маркер; К -контроль.

На электрофореграмме ПЦР-продуктов, полученных с помощью фингерпринтинг-ПЦР видно, что паттерны у всех анализируемых штаммов значительно отличались числом и размерами ПЦР-фрагментов (рис. 5). Совокупность результатов филогенетического анализа и фингерпринтинга указывают на то, что штаммы ЭР-1 и ЭеЫ могут быть идентифицированы как новые виды рода Ма&еШртИит, в то время как 80-1 благодаря его близости к М. таёпеИсит может быть определен как новый изолят этого вида.

4. МазпеШъртИит аЬеггапйь ¡р. поу. штамм врК - новая пресноводная бактерия с магнитными включениями.

Кроме магнитотактических спирилл, из донных осадков реки Ольховки был выделен ранее не описанный вид бактерий. Чистая культура была получена методом предельных разведений накопительной культуры, полученной после посева материала донных осадков в среду следующего состава (г/л): КН2РО4, 0.4; ЫН4С1, 0.33; КС1, 0.33; МаС12-2Н20, 0.33; №2504> 0.25; №2820у5Н20, 0.25; ЫаЫОз, 0.33; 1МаНС03, 0.25, цитрат железа III 30 мкМ; ацетат натрия, 1; дрожжевой экстракт, 0.1; а также ресазурин, 0.5 мг/л; натрий тиогликолят, 50 мг/л; витамин В12, 15 мкг/л, микроэлементы 1 мл (Вгуап^еуа е1 а1., 1999). Бактерии, размером 0.4 х 1.5 мкм обладали подвижностью с помощью полярно расположенных жгутиков (рис. 6А, Б). Характерной особенностью бактерий штамма врК является образование мелких плотных гранул размером 30-40 нм, располагающихся в клетках гроздями, или в виде коротких цепочек (рис. 6 В, Г). Показано, что включения обладают магнитными свойствами (рис. 6 Д), однако они не объединяются в длинные цепочки, характерные для бактериальных магнетосом. Способностью к магнитотаксису выделенные бактерии не обладают. -

Клетки развивались в диапазоне температур 20 - 45°С, с оптимальным ростом при 31°С. Наилучший рост наблюдался при рН 6.5 - 6.9. Основной тип метаболизма -хемоорганотрофный. Микроаэрофилы, оптимальный рост при 1 - 5% кислорода в газовой фазе. Способность к анаэробному росту с использованием нитратов в качестве альтернативного акцептора электронов не выявлена. Каталазная активность в клетках отсутствует, тогда, как оксидазная обнаружена. Хорошо растут на среде со многими карбоновыми кислотами. Наилучший рост на ацетате и фумарате. Сахара и спирты не поддерживали рост.

С помощью ПЦР было показано, что выделенные бактерии содержат ген ЯиВ1зСо сЬЬМ (форма II). Однако способность к автотрофному росту не была выявлена при использовании таких возможных доноров электронов как тиосульфат, аммоний и закисное железо. Содержание Г-Ц в ДНК 62.6%. Содержат убихинон Ою- Состав основных жирных

кислот: 18:1ш7 - 58.19%; 16:0 - 19.23%; 16:1ш7 - 11.12%; 18:0 - 1.91%. Резервные вещества - полигидроксибутират и полифосфаты.

Анализ последовательностей нуклеотидов гена 16Б рРНК показал принадлежность выделенного штамма к классу А1ркарго1еоЬас1ег1а, к семейству Л/гос/о5рг>///осеае, к роду Ма^пеЮзртИит.

Рисунок 6. Морфология клеток и магнитных включений М. аЬеггапИя. А. Световая микроскопия, фазовый контраст. Б. Жгуты на полюсах клетки. В, Г. Магнитные включения внутри клеток, обозначены М. Д. Элементный состав для минеральных включений штамма М. аЬеггапй5 по данным энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии соответствуют магнетиту. Масштабная линейка А - 5 мкм; Б - 1 мкм; В -0.5 мкм; Г - 100 нм

На филогенетическом дереве, представленном на рисунке 4 штамм ЭрК формировал отдельный кладу, занимающую промежуточное положение между родами ОесЫогояр^Шит и Ма^пе^ртИит. Уровни сходства последовательности гена 168 рРНК штамма врК с известными видами рода Ма§пеЮ5р1гИ1ит составил от 96.1% до 96.4%. Таким образом, таксономическое положение исследованного микроорганизма было

определено как новый вид рода Magnetospirillum, которому предложено название Magnetospirilium aberrantis sp. nov. (abe rrantis, L. neut. adj. отличный, отклоняющийся от других).

5. Реконструкция метаболизма железа и биоминерализации магнетита бактерии Мадпе^ртИит аЬеггаШ'я врК на основе анализа секвенированного генома.

М. аЬеггат'к - первый представитель рода Ма§пе^р'т11ит, синтезирующий немногочисленные нерегулярные внутриклеточные включения магнетита (30-35 нм), но не способный к магнитотаксису. Нами была выдвинута гипотеза, что такой фенотип может обеспечивать некий минимальный набор генов, необходимых для биоминерализации внутриклеточного магнетита, причем эти гены могут представлять собой ортологи генов, вовлеченных в процесс синтеза магнетосом у МТБ. Для проверки данной гипотезы был проведен сравнительный анализ генома М. аЬеггапИз, который позволил выявить гены, предположительно ответственные за обмен железа и синтез магнетита. Последовательности фрагментов генома (контигов) депонированы в вепЬапк под номером РШЫА54001. На основе полученных данных предложена гипотетическая схема, отражающая процессы поглощения, восстановления и запасания железа, а также синтеза внутриклеточных кристаллов магнетита у М. аЪеггапйх (рис. 7)

Определенная в результате работы последовательность генома М. аЬеггап(й включала 63 значимых контига, общей длиной 4158192 пар оснований (п.о.). В них обнаружены 3878 открытых рамок считывания (ОРС) (табл. 2).

Таблица 2. Сравнительная характеристика геномов представителей рода Magnetospirillum

Свойства М. aberrantis SpK М. magneticum АМВ-1* М. gryphiswaldense MSR-1* М. magnetotacticum MS-1*

Размер генома, п.о. 4158192 4967148 4264908 4503280

вС состав (%) 59,9 65,1 62,1 64

Общее число контигов 254 1 373 316

Наличие плазмид Нет Нет 1 Нет

Число аннотированных открытых рамок считывания 3878 4559 4268 4925

Число генов тРНК 54 50 47 44

Число генов 165/238/58 рРНК 1/1/1 2/2/НА 2/2/2 2/2/2

* данные из Richter et al., 2007; НА - не аннотирован

Краткое описание схемы обмена железа и биоминерапизаиии магнетита. В геноме М. aberrantis нами был обнаружен набор из 21 ОРС, проявляющих высокую степень сходства с генами белков, ответственных за сидерофор-зависимый транспорт Fe3+. Две из них кодируют белки, сходные с FecE и FhuA, продукты которых входят в системы транспорта сидерофоров нитратного и гидроксаматного типа. Но в геноме отсутствуют ОРС, проявляющие значимый уровень подобия с генами остальных компонентов систем сидерофорного транспорта Fhu и Fee - FhuBCD и FecABCD. При этом у М. aberrantis выявляются полноценные ОРС, кодирующие ТопВ-бокс и АВС-транспортеры. Высвобождение ионов железа из Ре3+-сидерофорных комплексов сопряжено с восстановлением ионов Fe3+ до Fe2+. Как правило, этот процесс осуществляет фермент железоредуктаза (ЕС 1.16.1.7).

Комплекс Ре1' „.. гндрошшатный сидерофор

Дншпраг Fei-

Рисунок 7. Гипотетическая схема метаболизма железа и биоминерализации магнетита М. аЬеггапИз, предложенная на основе анализа генома. Обозначения: АВС-ТП -комплекс АВС-транпортеров; ПСП — периплазматический связывающий белок. Зачеркнутые компоненты - белки систем транспорта сидерофоров, ОРС которых не были обнаружены в геноме.

В геноме М. аЬеггапИв присутствует одна ОРС, предположительно кодирующая этот фермент. Железоредуктаза М. аЬеггаШ15 наиболее сходна с железоредуктазой М gryphis^waldense (уровень подобия 74%). В результате проведенного анализа было показано, что в геноме М. аЬеггам\$ закодировано два набора белков систем транспорта Ре2+ РеоАВ. Известно, что двойная система транспорта также характерна для

17

магнитотактических спирилл. Функцию запасания железа в клетках M. aberrantis выполняют бактериоферритины. Наиболее высоким уровнем сходства с бактериоферритинами М. aberrantis обладают аналогичные белки M. magnetotacticum (уровень подобия 69%). Сравнительный анализ показал, что в геноме М. aberrantis отсутствуют ОРС, имеющие значимый уровень подобия (> 50%) с генами, относящимися к т.н. «магнетосомному геномному островку» (MAI - magnetosome gene island). Из литературных данных известно, что MAI представляет собой участок генома, содержащий большую часть генов, определяющих магнитотактический фенотип у Magnetospirilium. Тем не менее, нами были найдены 4 ОРС, обладающие высоким уровнем подобия (> 75%) с генами белков, обнаруженных ранее в мембране магнетосом, но не относящихся к MAI: magA, mpsA, ттеК и магнетосомной ГТФ-азы Р16 - mms\6. Мы предположили, что белки, соответствующие этим генам у M. aberrantis, выполняют сходные функции с аналогичными белками у M. magneticum АМВ-1, контролируя процесс инвагинации мембраны и транспорт ионов Fe2+ внутрь везикул. Предложенная гипотетическая схема имеет существенные отличия от таковой, предложенной для магнитотактических спирилл. Ограниченность набора генов, кодирующих белки, предположительно ответственные за минерализацию магнетита, обуславливает нерегулярность магнитных включений, отсутствие их постоянных объединений в виде цепочек или крупных агломератов, и, следовательно, отсутствие у M. aberrantis способности к магнитотаксису. При этом процесс поглощения Fe2+ в общих чертах сходен с таковым у магнитотактических спирилл и имеет ту же характерную особенность - наличие двух систем транспорта FeoAB. Совокупность полученных нами данных позволила предположить, что М. aberrantis представляет собой форму, вторично утратившую способность к магнитотаксису в процессе эволюции, вероятно, в результате крупной делеции. Имеющиеся литературные данные о нестабильности и частых делециях в области MAI у других представителей Magnetospirilium также свидетельствуют в пользу данной гипотезы.

выводы.

1. В исследованных водоемах были определены преобладающие морфотипы МТБ. В донных осадках озера Селигер, рек Ольховка и Аксай Курмоярский преобладающим морфотипом МТБ являлись кокки. В донных осадках реки Пшада преобладающим морфотипом являлись вибрионы.

2. В результате филогенетического анализа среди выявленных в донных осадках исследуемых водоемов МТБ было показано наличие 10 различных филотипов магнитотактических кокков, формирующих на дендрограмме единый кластер с описанными ранее последовательностями пресноводных магнитотактических кокков, предположительно соответствующий отдельному семейству внутри порядка Magne tococcales.

3. Выделено в чистые культуры три новых штамма магнитотактических спирилл, SO-1, SP-1 и Sel-1, относящихся к роду Magnetospirillum, по крайней мере, два из них относятся к новым видам.

4. Описан новый вид бактерий - Magnetospirillum aberrantis штамм SpK, способный к синтезу немногочисленных внутриклеточных включений магнетита, но не обладающий способностью к магнитотаксису.

5. На основе результатов секвенирования генома Magnetospirillum aberrantis проведен анализ генов, предположительно ответственных за метаболизм железа и биоминерализацию магнетита. На основе полученных результатов построена гипотетическая схема этих процессов. Показано, что у M. aberrantis отсутствуют гены магнетосомного геномного островка (MAI), но имеются гены mmslô, magA, mpsA и mmeA, участвующие в процессах биоминерализации у Magnetospirillum.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Горленко В.М., Дзюба М.В., Малеева А.Н., Пантелеева А.Н., Колганова Т.В., Кузнецов Б.Б. Magnetospirillum aberrantis sp.nov. - новая пресноводная бактерия с магнитными включениями // Микробиология. 2011. Т. 80 №5. С. 679-690.

2. Дзюба М.В., Марданов A.B., Белецкий А. В., Колганова Т.В., Сухачева М.В., Шеленков A.A., Горленко В.М., Кузнецов Б.Б., Скрябин К.Г. Реконструкция путей метаболизма железа у бактерии Magnetospirillum aberrantis SpK по результатам анализа секвенированного генома // Доклады академии наук, 2012. т. 444, № З.С 335-338.

Тезисы конференций.

1. Дзюба М.В., Сухачева М.В. Молекулярная идентификация новых штаммов магнитотактических спирилл // «Актуальные проблемы современной микробиологии»: 8-я молодежная школа-конференция с международным участием. - ИНМИ им. C.B. Виноградского РАН. Москва, 2012. - С. 65-67.

2. Дзюба М.В. Новые штаммы бактерий, синтезирующие внутриклеточные магнитные наночастицы // Сборник материалов международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии». Москва, 20 - 22 марта 2012 г. - С. 268.

3. Дзюба М.В., Горленко В.М. Кузнецов Б.Б. Magnetospirillum sp. SO-1 - новый штамм бактерий-продуцентов магнитных наночастиц // Тезисы докладов и стендовых сообщений, XXIV Зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии Москва, 7-9 февраля 2012. ИБХ РАН. С. 24.

4. Дзюба М.В. Изучение механизма образования магнетосом у Magnetospirillum aberrantis на основе анализа генома II Тезисы докладов и стендовых сообщений, XXIII Международная зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии, ИБХ РАН. Москва, 2011. С. 138.

5. Малеева А.Н., Дзюба М.В. Изучение видового разнообразия магнитотактических бактерий озера Селигер и реки Пшада // Ломоносов-2011: XVIII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых; секция «Биология»: Тезисы докладов. Москва, 2011. С. 165-166.

6. Дзюба М.В.. Сорокина А.Ю., Курек Д.В., Малеева А.Н., Груздев Д.С. Исследование морфологии магнетосом, выделенных из ранее неописанного рода

магнитотактических спирилл, с помощью методов электронной просвечивающей (ПЭМ) и атомно-силовой микроскопии (АСМ) - 14-ая международная пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» 19-23 апреля 2010 г.: Сборник тезисов, Т.1. Пущино, 2010. С. 242-243.

7. Малеева А.Н., Груздев., Д.С., Дзюба М.В. Применение методов молекулярной экологии для поиска и идентификации магнитотактических бактерий. - тезисы 48-й Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс». Новосиб. Гос. Ун-т. Новосибирск, 2010. С. 265

Заказ № 33-А/01/2013 Подписано в печать 14.01.2013 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

¿Р^ ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

1(www.cfr.ru; e-maihzak@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дзюба, Марина Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. РАЗНООБРАЗИЕ МАГНИТОТАКТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МАГНИТОТАКСИСА.

1.1. Магниторецепция у бактерий. Магнитотаксис.

1.2. Видовое разнообразие магнитотактических бактерий.

1.3. Разнообразие и филогения представителей рода Magnetospirillum.

1.4. Гипотезы происхождения и эволюции магнитотактических бактерий.

ГЛАВА 2. ФИЗИОЛОГИЯ МАГНИТОТАКТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ.

2.1. Особенности физиологии представителей рода Magnetospirillum.

2.2. Особенности физиологии магнитотактических бактерий других таксономических групп.

2.3. Стратегии выделения чистых культур и культивирования магнитотактических бактерий.

ГЛАВА 3. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БИОМИНЕРАЛИЗАЦИИ МАГНЕТИТА И СИНТЕЗА МАГНЕТОСОМ.

3.1. Организация геномов магнитотактических бактерий.

3.2. Идентификация магнетосомных генов.

3.3. Молекулярная организация генов магнетосомных белков.

3.3.1. Характеристика МА1.

3.3.2. Организация магнетосомных генов внутри МА1.

3.4. Функции отдельных магнетосомных белков.

ГЛАВА 4. ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ МАГНИТОТАКТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ И МАГНЕТОСОМ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

5.1. Объекты исследования.

5.2. Получение обогащенных суспензий МТБ.

5.3. Методы исследования морфологии и строения клеток.

5.5. Молекулярно-биологические методы и филогенетический анализ.

5.5.1. Выделение ДНК.

5.5.2. Выделение высокомолекулярной ДНК.

5.5.3. ПЦР-амплификация.

5.5.4. Очистка фрагментов ПЦР в агарозе.

5.5.5. Клонирование ПЦР-фрагмента.

5.5.6. Выделение плазмидной ДНК.

5.5.7. Секвенирование библиотек клонов.

5.5.8. Филогенетический анализ.

5.5.9. Фингерпринтинг.

5.6. Выделение и культивирование штаммов МТБ.

5.6.1. Магнитное обогащение МТБ в капилляре ("race track").

5.6.2. Среды и условия культивирования.

5.6.3. Получение чистых культур.

5.6.4. Физиолого-биохимическая характеристика.

5.7. Секвенирование и аннотация генома Magnetospirillum aberrantis SpK. Анализ целевых генов.

5.7.1. Секвенирование и аннотация генома.

5.7.2. Идентификация и анализ генов, ответственных за обмен железа и биоминерализацию магнетита М. aberrantis.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА 6. АНАЛИЗ ВИДОВОГО РАЗНООБРАЗИЯ МАГНИТОТАКТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ.

6.1. Морфология клеток МТБ из изучаемых водоемов.

6.2. Филогенетическое разнообразие магнитотактических кокков исследуемых водоемовбб

6.2.1. Получение библиотек клонов фрагментов генов 16S рРНК.

6.2.2. Филогенетический анализ.

ГЛАВА 7. ИССЛЕДОВАНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ИЗУЧАЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ.

7.1. Характеристика новых штаммов магнитотактических спирилл SO-1, SP-1 и Sel-1.

7.1.1. Выделение чистых культур и культуральные признаки.

7.1.2. Морфологические особенности.

7.1.3. Физиолого-биохимическая характеристика.

7.1.4. Выявление генов RubisCO и NifH с помощью ПЦР-анализа.

7.1.5. Филогенетический анализ.

7.1.6. Фингерпринтинг-ПЦР выделенных штаммов.

7.2. Magnetospirillum aberrantis sp. str. SpK - пресноводная хемоорганотрофная бактерия, способная к синтезу нерегулярных включений магнетита.

7.2.1. Выделение чистой культуры и культуральные признаки.

7.2.2. Морфологические особенности.

7.2.4. Физиолого-биохимическая характеристика.

7.2.5. Филогенетический анализ и таксономическое положение.

7.2.6. Таксономическое описание.

ГЛАВА 8. СЕКВЕНИРОВАНИЕ И АННОТИРОВАНИЕ ПОЛНОРАЗМЕРНОГО ГЕНОМА МАGNETOSPIRILL UM ABERRANTIS SPK SP.

8.1. Общая информация о геноме.

8.2. Анализ ОРС, предположительно соответствующих генам метаболизма железа Magnetospirillum aberrantis SpK sp.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разнообразие магнитотактических бактерий пресных водоемов европейской части России"

Начиная с 70-х годов XX века было проведено множество исследований, посвященных восприятию магнитного поля живыми организмами. Наличие способности ориентироваться в геомагнитном поле было показано у многих организмов, в том числе у насекомых, птиц и млекопитающих [1]. Одним из самых значимых открытий в этой области были магнитотактические бактерии [32]. Магнитотактические бактерии (магнитобактерии, МТБ) представляют собой гетерогенную группу водных микроорганизмов, объединенных способностью ориентироваться во внешнем магнитном поле благодаря наличию в их клетках магнитных частиц - магнетосом. МТБ широко распространены и играют значительную роль в круговороте железа в природе, а также накоплении магнетита в придонных осадках [24].

МТБ были открыты сравнительно недавно, однако за последние годы достигнуты значительные успехи в изучении разнообразия представителей этой группы микроорганизмов, форм кристаллов магнитных частиц, механизма образования магнетосом, а также генетических основ биоминерализации внутриклеточного магнетита. Тем не менее, многие вопросы еще остаются открытыми: по-прежнему неизвестна роль большинства белков мембраны магнетосом, не определены до конца механизмы регуляции синтеза бактериальных магнитных частиц, а также остается открытым вопрос о возникновении, эволюции и экологической роли магнитотаксиса. Во многом это определяется тем, что, из-за трудностей культивирования, в чистые культуры выделено сравнительно небольшое число видов магнитобактерий. Изучение видового разнообразия и географической распространенности МТБ также является актуальной задачей.

Исследование магнитобактерий актуально, в том числе, благодаря уникальности свойств бактериальных магнитных наноразмерных частиц и их высокому биотехнологическому потенциалу. В ряде исследований была продемонстрирована возможность применения магнетосом для детекции и выделения биологических молекул, повышения чувствительности иммуноферментного анализа, в качестве контрастирующих агентов в магнитно-резонансной томографии, для направленной доставки лекарств, а также терапии опухолей методом гипертермии [8, 50, 86]. Увеличение числа штаммов МТБ, доступных в чистых культурах, может внести значительный вклад в развитие биотехнологии МТБ.

Цель настоящей работы - поиск и изучение видового разнообразия магнитотактических бактерий из пресных водоемов европейской части России с использованием микробиологических и молекулярно-биологических методов. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

• описать морфологическое разнообразие магнитотактических бактерий, выделенных из донных осадков, на примере следующих водоемов: озеро Селигер (Тверская обл.), река Ольховка (г. Кисловодск), река Аксай-Курмоярский (Волгоградская обл.), река Пшада (Краснодарский край) с помощью методов световой и просвесивающей электронной микроскопии;

• описать филогенетическое разнообразие выявленных МТБ на основе данных анализа последовательностей генов, кодирующих 16Б рРНК;

• выделить в чистые культуры, изучить физиологические особенности и определить таксономическое положение новых штаммов МТБ;

• определить последовательность ДНК полноразмерного генома одного из выделенных штаммов и провести на основе полученных данных анализ генов, ответственных за метаболизм железа и биоминерализацию магнетита.

Проведенные исследования дополнят сведения о морфологическом и видовом разнообразии МТБ. Описание новых штаммов позволит расширить представления о физиологических особенностях бактерий этой группы. На основании данных аннотации полноразмерного генома одного из выделенных штаммов будут выявлены и проанализированы гены, предположительно ответственные за обмен железа и биоминерализацию внутриклеточного магнетита. Прикладная направленность исследования заключается в выделении и подборе условий культивирования новых штаммов магнитотактических бактерий, пригодных для биотехнологического применения.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Дзюба, Марина Владимировна

выводы

1. В исследованных водоемах были определены преобладающие морфотипы МТБ. В донных осадках озера Селигер, рек Ольховка и Аксай Курмоярский преобладающим морфотипом МТБ являлись кокки. В донных осадках реки Пшада преобладающим морфотипом являлись вибрионы, кокки и спириллы не были выявлены.

2. В результате филогенетического анализа среди выявленных в донных осадках исследуемых водоемов МТБ было показано наличие 10 различных филотипов магнитотактических кокков, формирующих на дендрограмме единый кластер с описанными ранее последовательностями пресноводных магнитотактических кокков, предположительно соответствующий отдельному семейству внутри порядка Magnetococcales.

3. Выделено в чистые культуры три новых штамма магнитотактических спирилл, SO-1, SP-1 и Sel-1, относящихся к роду Magnetospirillum. Совокупность результатов филогенетического анализа и фингерпринтинг-анализа указывают на то, что, по крайней мере, два из них относятся к новым видам. Штаммы являются хемоорганогетеротрофами, в качестве основного источника углерода потребляют карбоновые кислоты.

4. Описан новый вид бактерий - Magnetospirillum aberrantis штамм SpK, способный к синтезу немногочисленных внутриклеточных включений магнетита, но не обладающий способностью к магнитотаксису.

5. На основе результатов секвенирования генома Magnetospirillum aberrantis проведен анализ генов, предположительно ответственных за метаболизм железа и биоминерализацию магнетита. На основе полученных результатов построена гипотетическая схема этих процессов. Показано, что у М. aberrantis отсутствуют гены магнетосомного геномного островка (MAI), но имеются гены mmsló, magA, mpsA и ттеА, участвующие в процессах биоминерализации у Magnetospirillum.

БЛАГОДАРНОСТИ

Основная работа по анализу разнообразия МТБ с помощью молекулярно-экологических методов проводилась на базе центра коллективного пользования уникальным научным оборудованием, в группе молекулярной диагностики Центра «Биоинженерия» РАН (руководитель - к.б.н. Кузнецов Б.Б.). Выделение и исследование морфологии и физиологии новых штаммов было проведено на приборной базе лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН (руководитель - д.б.н. Горленко В.М.). Химический состав включений М аЬеггапШ был определен на приборной базе РНЦ «Курчатовский институт» (руководитель - к.ф.-м.н. А.Л. Васильев). Секвенирование последовательностей нуклеиновых кислот фрагментов генов 168 рРНК было проведено на приборной базе ЦКП, в группе мегасеквенирования Центра «Биоинженерия» РАН (руководитель - к.т.н. Т. В. Колгановой). Определение последовательности генома М аЬеггапйБ было проведено совместно с сотрудниками лаборатории систем молекулярного клонирования Центра «Биоинженерия» РАН (руководитель д.б.н. Равин Н.В.). Автор выражает глубокую благодарность всем упомянутым участникам данной работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С помощью комплексного подхода, реализованного в настоящем исследовании, было описано морфологическое и филогенетическое разнообразие МТБ ряда пресных водоемов России. Полученные результаты существенно дополняют имеющиеся данные о разнообразии МТБ. Также в результате проведенной работы были выделены в чистые культуры и охарактеризованы ранее не описанные магнитобактерии - 80-1, 8Р-1 и 8е1-1, относящиеся к роду Ма£пе1о8р1гШит и предположительно представляющие собой новые виды. Культуральные признаки, основной тип метаболизма хемоорганогетеротрофный), предпочитаемые субстраты (карбоновые кислоты) и другие черты физиологии выделенных магнитотактических спирилл были близки к таковым, описанным для представителей рода Magnetospirillum. В результате филогенетического анализа показана значительная филогенетическая близость изученных штаммов видам М. та§пейсит и М magnetotacticum. В числе прочих методов для описания выделенных штаммов впервые для данной группы бактерий был использован метод фингерпринтинг-ПЦР. Полученные паттерны наглядно демонстрировали отличия между штаммами на видовом уровне.

С помощью ПЦР-анализа у 80-1, 8Р-1 и 8е1-1 было выявлено наличие гена ключевого фермента, ответственного за автотрофию - ЯиЫзСО и одного из ключевых ферментов, ответственных за фиксацию молекулярного азота - №Ш, что свидетельствует о потенциальной способности этих бактерий к автотрофии и азотфиксации. Однако в рамках настоящей работы исследование этих процессов не проводилось.

Помимо новых штаммов МТБ был выделен в чистую культуру и описан новый вид бактерий Magnetospirillum аЪеггапйз $р. поу. з^г. 8рК, синтезирующий немногочисленные внутриклеточные кристаллы магнетита, но не обладающий способностью к магнитотаксису. Для М. аЬеггаШгя был секвенирован и аннотирован полноразмерный геном, на основании последовательности которого проведен анализ генов, ответственных за обмен железа и биоминерализацию внутриклеточного магнетита. В результате были обнаружены некоторые сходные черты в организации геномов М. aberrantis и магнитотактических представителей рода Magnetospirillum: 1) наличие четырех генов, предположительно ответственых за биоминерализацию магнетосом - mpsA, mag A, mms\6 и ттеА\ 2) наличие двойной системы транспорта железа FeoAB. На основании совокупности данных о морфологии, физиологии и геноме М. aberrantis, полученных в настоящем исследовании, было выдвинуто предположение о том, что данная бактерия представляет собой форму, в процессе эволюции утратившую способность к магнитотаксису. Дальнейшее изучение немагнитотактических представителей рода Magnetospirillum может значительно расширить представления об эволюции этой группы бактерий.

Штаммы магнитотактических спирилл SO-1, SP-1 и Sel-1, описанные в данной работе, способны продуцировать магнетосомы и таким образом потенциально могут быть использованы для промышленного получения высококачественных магнитных наночастиц. Однако на основании проведенных экспериментов в качестве штамма-продуцента магнитных наночастиц для биотехнологического применения может быть рекомендован штамм Magnetospirillum SO-1. Преимущества данного штамма заключаются в его аэротолерантности, а также устойчивой продукции магнетосом в более широком диапазоне условий по сравнению с другими культивируемыми МТБ. Magnetospirillum SO-1 был использован в качестве продуцента магнетосом при выполнении работ по государственному контракту Минобрнауки России №16.512.11.2128. В результате выполнения этих работ получены модифицированные магнетосомы двух типов - обладающие иммуноглобулинсвязывающей и ДНК-связывающей активностью, на основе которых были созданы прототипы наборов для проведения высокочувствительного ИФА и выделения ДНК соответственно.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дзюба, Марина Владимировна, Москва

1. Биогенный магнетит и магниторецепция. Новое о биомагнетизме / под ред. Дж. Киршвинк. Перевод с англ. В 2-х т. М.: Мир, 1989 - 353 с. т.1.

2. Марусина А.И., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Турова Т.П., Кравченко И.К., Гальченко В.Ф. Система олигонуклеотидных праймеров для амплификации генов nif.Н различных таксономических групп прокариот // Микробиология. 2001. - Т.70. - № 1 .-С. 86-91.

3. Пиневич А.В. Микробиология железа и марганца / А.В. Пиневич. СПб.: Изд-во С.-Петерб. Ун-та, 2005. - 374 с.

4. Резников, А.А. Методы анализа природных вод / А.А. Резников, Е.П. Муликовская, И.Ю. Соколов. М.: Недра, 1970. - С. 118.

5. Филина, Н.Ю. Биология и экология бактерий, образующих магнитоупорядоченные соединения железа: дис. . канд. биол. наук: 03.00.07 / Филина Наталия Юрьевна. М., 1998. - 155 с.

6. Чертов, Н.В. Магнитотактические бактерии водоемов Нижней Волги: автореф. дис. . канд. биол. наук: 03.00.18 / Чертов Николай Владимирович. -М., 2000.-24 с.

7. Amann, R., Ludwig, W., Schleifer, K.H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation // Microbiol. Rev. -1995.-№.59.-P. 143-169.

8. Arakaki, A., Webb, J., Matsunaga, T. A novel protein tightly bound to bacterial magnetic particles in Magnetospirillum magneticum strain AMB-1 // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278, - P. 8745-8750.

9. Bahaj, A., Croudace, I., James, P., Moeschler, F., Warwick, P. Continuous radionuclide recovery from wastewater using magnetotactic bacteria // J. Magn. Magn. Mater. 1998. -V. 184. - P. 241-244.

10. Bahaj, A., James, P., Ellwood D., Watson J. Characterization and growth of magnetotactic bacteria—implications of clean up of environmental pollution // J. Appl. Physiol. 1993. - V. 73. - P. 5394-5396.

11. Bahaj, A., James, P., Moeschler, F. Low magnetic-field separation system for metal-loaded magnetotactic bacteria // J. Magn. Magn. Mater. 1998. - V. 177 — P. 1453-1454.

12. Bahaj, A., James, P., Moeschler F. Wastewater treatment by biomagnetic separation: A comparison of iron oxide and iron sulphide biomass recovery // Water Sci. Technol. 1998. - V. 38. - P. 311-317.

13. Balkwill, D., Maratea, D., Blakemore, R.P. Ultrastructure of a magnetotactic spirillum//J. Bacterid.- 1997.-Vol. 141.-P. 1399-1408.

14. Bastide, M. McCombie, W. Assembling genomic DNA sequences with PHRAP // Curr. Protoc. Bioinformatics. 2007. - V. 11. - P. 13-18.

15. Bazylinski, D., Williams, T. Ecophysiology of magnetotactic bacteria / Microbiol. Monogr D. Schueler: Magnetoreception and magnetosomes in bacteria // Berlin: Springer-Verlag Heidelberg, 2006. P. 37-75.

16. Bazylinski, D. Anaerobic production of single-domain magnetite by the marine, magnetotactic bacterium, strain MV-1 / In: Frankel R.B., Blakemore R.P. Iron biominerals // New York: Plenum, 1990. P. 69-77.

17. Bazylinski, D., Blakemore R. Denitrification and assimilatory nitrate reduction in Aquaspirillum magnetotacticum // Appl. Environ. Microbiol. 1983. - V. 46. -P. 1118-1124.

18. Bazylinski, D., Dean, A., Schueler, D., Phillips E., Loveley D. N2-dependent growth and nitrogenase activity in the metal-metabolizing bacteria, Geobacter and Magnetospirillum species // Environ. Microbiol. 2000. - V.2. - P. 266-273.

19. Bazylinski, D., Dean A., Williams T., Kimble-Long L., Middleton S., Dubbels B. Chemolithoautotrophy in the marine magnetotactic bacterial strains MV-1 and MV-2 // Arch. Microbiol. 2004.-V. 182. - P.373-387.

20. Bazylinski, D., Frankel, R. Biologically controlled mineralization of magnetic iron minerals by magnetotactic bacteria / In: Lovley D.R. (ed.) Environmental microbe-metal interactions // Washington DC: ASM, 2000. P. 109-144.

21. Bazylinski, D., Frankel, R. Magnetosome formation in prokaryotes // Nature Rev. Microbiol. 2004. - V. 2. - P. 217-230.

22. Bazylinski, D., Frankel, R., Jannasch, H. Anaerobic magnetite production by a marine magnetotactic bacterium // Nature. 1988. - V. 334. - P. 518-519.

23. Bertani, E. L., Weko, J., Phillips, K.V., Gray, R.F., Kirschvink, J.L. Physical and genetic characterization of the genome of Magnetospirillum magnetotacticum, strain MS-1 // Gene. 2001 - Y. 264. - P. 257-263.

24. Birnboim, H., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA// Nucleic Acids Res. 1979. - V. 7. - № 6. -P.1513-1523.

25. Blakemore, R., Frankel, R., Kalmijn, A. Southseeking magnetotactic bacteria in the southern hemisphere // Nature. 1980. - №.236. - P. 384-385.

26. Blakemore, R., Maratea, D., Wolfe, R. Isolation and pure culture of a freshwater magnetic spirillum in chemically defined medium // J. Bacteriol. 1979. - V. 140 -No. 2.-P. 720-729.

27. Blakemore, R. Magnetotactic bacteria // Annu. Rev. Microbiol. 1982. - V. 36. -P. 217-238.

28. Blakemore, R. Magnetotactic bacteria // Science. 1975. - №190 - P. 377-379.

29. Blakemore, R., Short, K., Bazylinski, D., Rosenblatt, C., Frankel, R. Microaerobic conditions are required for magnetite formation within Aquaspirillum magnetotacticum // Geomicrobiol. J. 1985. - V. 4. - P. 53-71.

30. Blakemore, R.P., Frankel, R.B. Magnetic navigation in bacteria // Scientific American. 1981. - No. 245. - P. 42-49.

31. Bose, M., Barber, R. Prophage Finder: a prophage loci prediction tool for prokaryotic genome sequences // In Silico Biol. 2006. - V.6. - P. 223-227.

32. Burgess, J., Kawaguchi, R., Sakaguchi, T., Thornhill, R., Matsunaga, T. Evolutionary relationship among Magnetospirillum strains inferred from phylogenetic analysis of 16S rRNA sequences // J. Bacteriol. 1993. - V. 174. -No. 20.-P. 6689-6694.

33. Calugay, R., Miyashita, H., Okamura, Y., Matsunaga, T. Siderophore production by the magnetic bacterium Magnetospirillum magneticum AMB-1 // FEMS Microbiol. Lett. 2003. - V. 218. - P. 371-375.

34. Chang, S., Kirschvink, J. Magnetofossils, the magnetization of sediments, and the evolution of magnetite biomineralization // Annu. Rev. Earth Planet. Sci. 1989. V. 17. P. 169-195.

35. Chang, S., Stolz, J., Kirschvink, J. L., Awramik, S. M. Biogenic magnetite in stromatolites and occurrence in ancient sedimentary environments // Precamb. Res. 1989,-V. 43.-P. 305-315.

36. Coates, J., Michaelidou, U., Bruce, R., O'Connor, S., Crespi, J., Achenbach L. Ubiquity and diversity of dissimilatory (per)chloratereducing bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 1999. -V. 65. - P. 5234-5241.

37. Delcher, A., Harmon, S., Kasif, O., White S., Salzberg L. Improved microbial gene identification with GLIMMER // Nucleic Acids Res. 1999. - V. 27. -№23. -P. 4636-4641.

38. DeLong, E., Frankel, R., Bazylinski, D. Multiple evolutionary origins of magnetotaxis in bacteria // Science 1993. V. 259. - №5096. - P. 803-806.

39. Dubbels, B., DiSpirito, A., Morton, J., Semrau, J., Neto, J., Bazylinski, D. Evidence for a copper-dependent iron transport system in the marine, magnetotactic bacterium strain MV-1 // Microbiol. 2004. V. 150. - P. 29312945.

40. Eden, P., Schmidt, T., Blakemore, R., Pace, N. Phylogenetic analysis of Aquaspirillum magnetotacticum using polymerase chain reaction-amplified 16S rRNA-specific DNA // Int. J. Syst. Bact. 1991. - V. 41. - No. 2. P. 324-325.

41. Evans, M., Heller, F. Environmental Magnetism: Principles and Applications of Enviromagnetics. San Diego: Academic Press, 2003. - P. 507.

42. Faivre, D., Schueler, D. Magnetotactic bacteria and magnetosomes // Chem. Rev. -2008. V. 108.-No. 11.-P. 4875-4898.

43. Faivre, D., Beottger, L., Matzanke, B., Schueler, D. Intracellular magnetite biomineralization in bacteria, proceeds via a distinct pathway involvingmembrane-bound ferritin and ferrous iron species // Angew. Chem. Int. Ed. -2007. V. 46. - P. 8647-8652

44. Felfoul, O., Mohammadi, M., Martel, S. Magnetic resonance imaging of Fe304 nanoparticles embedded in living magnetotactic bacteria for potential use as4carriers for in vivo applications // Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 2007. -P. 1463-1466.

45. Flies, C., Peplies, J., Schueler, D. A combined approach foe the characterization of uncultivated magnetotactic bacteria from various aquatic environments // Appl. Environ. Microbiol. -2005. -V. 71 No. 5. - P. 2723-2731.

46. Frankel, B., Bazylinski, D. How magnetotactic bacteria make magnetosomes queue up // Trends Microbiol. 2006. - V. 14. - P. 329-331.

47. Frankel, R., Bazylinski, D., Johnson, M., Taylor, B. Magneto-aerotaxis in marine, coccoid bacteria // Biophys. J. 1997. - V. 73. - P. 994-1000.

48. Frankel, R., Papaefthimiou G., Blakemore R., O'Brien W. Fe304 precipitation in magnetotactic bacteria // Biochem. Biophys. Acta. 1983. - V. 763. - P. 147159.

49. Fukuda, Y., Okamura, Y., Takeyama, H., Matsunaga, T. Dynamic analysis of a genomic island in Magnetosprillum sp. strain AMB-1 reveals how magnetosome synthesis developed // FEBS Lett. 2006. - V. 580. - P. 801- 812.

50. Funaki, M., Sakai H., Matsunaga T. Identification of the magnetic poles on strong magnetic grains from meteorites using magnetotactic bacteria // J. Geomagn. Geoelectr. 1989. - V. 41. - P. 77-87.

51. Funaki, M., Sakai, H., Matsunaga, T., Hirose, S. The S-pole distribution on magnetic grains in pyroxenite determined by magnetotactic bacteria // Phys. Earth Planet. Inter. 1992. -V. 70. - P. 253-260.

52. Gordon, D., Abajian, C., Green, P. Consed: a graphical tool for sequence finishing // Genome Res. -1998. V.8. - №3. - P. 195-202.

53. Grass, G., Otto, M., Fricke, B., Haney, C., Rensing, C., Nies, D., Munkelt, D. FieF (YiiP) from Escherichia coli mediates decreased cellular accumulation of iron and relieves iron stress // Arch. Microbiol. 2005. - V. 183. - P. 9-18.

54. Gruenberg, K., Mueller, E., Otto, A., Reszka, R., Linder, D. Biochemical and proteomic analysis of the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense // Appl. Eviron. Microbiol. 2004. - V. 70. - P. 1040-1050.

55. Gruenberg, K., Wawer, C., Tebo, B., Schueler, D. A large gene cluster encoding several magnetosome proteins is conserved in different species of magnetotactic bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - V. 67. - P. 4573^1582.

56. Guerin W., Blakemore R. Redox cycling of iron supports growth and magnetite synthesis by Aquaspirillum magnetotacticum // Appl. Environ. Microbiol. 1992. -V. 58.-P. 743-772.

57. Guo, F., Yang, W., Jiang, J., Geng, S., Peng, T., Li J. Magnetosomes eliminate intracellular reactive oxygen species in Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1 // Environ. Microbiol. 2012. - V. 2. - P. 1462-1470.

58. Harasko, G., Pfutzner, H., Futschik, K. Domain analysis by means of magnetotactic bacteria // IEEE T. Magn. 1995. - V. 31. - P. 938-949.

59. Harasko, G., Pfutzner, H., Rapp, E., Futschik, K., Schueler, D. Determination of the concentration of magnetotactic bacteria by means of susceptibility measurements // Jpn. J. Appl. Phys. -1993. V. 32. - P. 252-260.

60. Heyen, U., Schueler, D. Growth and magnetosome formation by microaerophilic Magnetospirillum strains in an oxygen-controlled fermentor // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. - V.61. - P. 536-544.

61. Iron uptake and homeostasis in microorganisms / ed. Cornelis P., Andrews S. -UK.: Caister Academic Press. 2010. - 291 p.

62. Jogler, C., Schueler, D. Genomics, genetics, and cell biology of magnetosome formation // Annu Rev. Microbiol. 2009. - № 63. - P. 501-521.

63. Jogler, C., Schueler, D. Genetic analysis of magnetosome biomineralization // Microbiol. Monogr D. Schueler: Magnetoreception and magnetosomes in bacteria / Berlin: Springer-Verlag Heidelberg, 2006. P. 133-161.

64. Kainth, P., Gupta, R. Signature proteins that are distinctive of alpha proteobacteria // BMC Genomics. 2005. - V. 6. - P. 94.

65. Kawaguchi, R. Phylogenetic analysis of a novel sulfate-reducing magnetic bacterium, RS-1, demonstrates its membership of the deltaproteobacteria // FEMS Microbiol. Lett.-2001.-V. 126.-No. 3.-P. 277-282.

66. Kim, B., Kodama, K., Moeller, R. Bacterial magnetite produced in water column dominates lake sediment mineral magnetism: Lake Ely, USA // Geophys. J. Int. -2005.-V. 163.-P. 26-37.

67. Komeili, A. Molecular Mechanisms of Magnetosome Formation // Annu. Rev. Biochem. 2007. - V.76. - P.51-66.

68. Komeili, A., Li, Z., Newman, D., Jensen, G. Magnetosomes are invaginations organized by actin-like protein MamK // Science. 2005. -V. 311. - P.242-245.

69. Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T., Newman, D. Magnetosome vesicles are present prior to magnetite formation and MamA are required for their activation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - V. 101. - P.3839-3844.

70. Krichevsky, A., Smith, M., Whitman, L., Johnson, M., Clinton, T., Perry L., Applegate B., O'Connor K., Csonka L. Trapping motile magnetotactic bacteria with a magnetic recording head // J. Appl. Physiol. 2007. - V. 101. - P. 14701— 14706.

71. Lane, D. 16S/23S rRNA sequencing // In: Stackebrandt E., Goodfellow M., editors. Nucleic acid techniques in bacterial systematics / Chichester, United Kingdom: John Wiley & Sons, 1991. P. 115-175.

72. Lang, C., Schueler, D. Expression of green fluorescent protein fused to magnetosome proteins in microaerophilic magnetotactic bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 2008. - V. 74. - P. 4944-4953

73. Lang, C., Pollithy, A., Schueler, D. Identification of promoters for efficient gene expression in Magnetospirillum gryphiswaldense // Appl. Environ. Microbiol.2009. V. 75. - P. 4206-4210.

74. Leavis, H., Willems, R., Top, J., Spalburg, E. Mascini, E., Fluit, A., Hoepelman, A., Neeling, A., Bonten, M. Epidemic and nonepidemic multidrug-resistant Enterococcus faecium II Emerg. Infect. Diseas. 2003. -V. 9. -№9. - P. 11081110.

75. Lefevre, C., Frankel, R., Abreu, F., Lins, U., Bazylinski, D. Culture-independent characterization of a novel, uncultivated magnetotactic member of the Nitrospirae phylum // Environ. Microbiol. 2011. -V. 13. - №2. - P. 538-549.

76. Lin, W., Pan, Y. Temporal variation of magnetotactic bacterial communities in two freshwater sediment microcosms // FEMS Microbiol. Lett. 2009. - V. 302.- №1. P. 85-92.

77. Lin, W., Li, J., Schueler, D., Jogler, C., Pan, Y. Diversity analysis of magnetotactic bacteria in Lake Miyun, northern China, by restriction fragment length polymorphism // Syst. Appl. Microbiol. 2009. - V. 32. - № 5. - P. 342350.

78. Mandernack, K., Bazylinski, D., Shanks, W., Bullen, T. Oxygen and isotope studies of magnetite produced by magnetotactic bacteria // Science. 1999. - V. 285.-P. 1892-1896.

79. Matsunaga T. Applications of bacterial magnets // Trends Biotechnol. 1991. -V. 9.-P. 91-95.

80. Matsunaga, T., Hashimoto, K., Nakamura, N., Nakamura, K., Hashimoto, S. Phagocytosis of bacterial magnetite by leucocytes // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1989,-V. 31.-P. 401-405.

81. Matsunaga, T., Higashi, Y., Tsujimura, N. Drug delivery by magnetoliposomes containing bacterial magnetic particles // Cell Eng. 1997. - V. 2. - P. 7-11.

82. Matsunaga, T., Nakamura, C., Burgess, J., Sode, S. Gene transfer in magnetic bacteria: transposon mutagenesis and cloning of genomic DNA fragments required for magnetosome synthesis // J. Bacteriol. 1992. - V. 174. - P. 27482753.

83. Matsunaga, T., Okamura, Y. Genes and proteins involved in bacterial magnetic particle formation // Trends Microbiol. 2003. - V. 11. - P. 536-541.

84. Matsunaga, T., Okamura, Y., Fukuda, Y., Wahyudi, A., Murase, Y., Takeyama, H. Complete genome sequence of the facultative anaerobic magnetotacticbacterium Magnetospirillum sp. strain AMB-1 // DNA Res. 2005. - V.12. - P. 157-166.

85. Matsunaga, T., Sato, R., Kamiya, S., Tanaka, T., Takeyama, H. Chemiluminescence enzyme immunoassay using Protein A-bacterial magnetite complex//J. Magn. Magn. Mater. 1999. - V. 194.-P. 126-131.

86. Matsunaga, T., Tadokoro, F., Nakamura, N. Mass culture of magnetic bacteria and their application to flow type immunoassays // IEEE T. Magn. 1990. - V. 26.-P. 1557-1559.

87. Matsunaga, T., Takeyama, H. Biomagnetic nanoparticle formation and application // Supramol. Sci. 1998. - V. 5. - P. 391-394.

88. Matsunaga, T., Togo, H., Kikuchi, T., Tanaka, T. Production of luciferase magnetic particle complex by recombinant Magnetospirillum sp. AMB-1 // Biotechnol. Bioeng. 2000. - V. 70. - P. 704-709.

89. Matsunaga, T., Tsujimura, N., Kamiya, S. Enhancement of magnetic particle production by nitrate and succinate fed-batch culture of Magnetospirillum sp. AMB-1 // Biotechnol. Tech. 1996. -V. 10. - P. 495-500.

90. Matsunaga, T., Kamiya, S. Use of magnetic particles isolated from magnetotactic bacteria for enzyme immobilization // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1987. - V. 26.-P. 328-332.

91. McKay, D., Gibson, E., Thomas-Keprta, K., Vali, H., Romanek, C., Clemett, S., Chillier, X., Maechling, C., Zare, R. Search for past life on Mars: possible relic biogenic activity in martian meteorite ALH84001 // Science. 1996. - V. 273. -P. 924-930.

92. Meldrum, F., Heywood, B., Mann, S., Frankel, R., Bazylinski, D. Electron microscopy study of magnetosomes in two cultured vibrioid magnetotactic bacteria//Proc. R. Soc. London B. 1993. - V. 251. - P. 237-242.

93. Nakamura, C., Burgess, J., Sode, K., Matsunaga, T. An iron-regulated gene, magA, encoding an iron transport protein of Magnetospirillum sp. strain AMB-1 // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 28392-28396.

94. Nakamura, C., Kikuchi, T., Burgess, J., Matsunaga, T. Iron-regulated expression and membrane localization of the MagA protein in Magnetospirillum sp. AMB-1 // J. Biochem. (Tokyo). 1995. - V. 118. - P. 23-27.

95. Nakamura, N., Matsunaga, T. Highly sensitive detection of allergen using bacterial magnetic particles // Anal. Chim. Acta. 1993. - V. 281. - P. 585-589.

96. Nash, C. Mechanisms and evolution of magnetotactic bacteria: PhD thesis / Cody Nash. Pasadena: Calif Inst. Technol, 2008. - P. 75

97. Neilands, J. A brief history of iron metabolism // Biol. Metals. 1984. - V. 4. -P.l-6.

98. Neilands, J. Siderophores: structure and function of microbial iron transport compounds // J. Biol. Chem. 1995. - V. 279. - P. 26723-26726.

99. Noguchi, Y., Fujiwara, T., Yoshimatsu, K., Fukumori, Y. Iron reductase for magnetite synthesis in the magnetotactic bacterium Magnetospirillum magnetotacticum // J. Bacteriol. 1999.-V. 181. - P. 2142-2147.

100. Oldfield, F., Wu, R. J. The magnetic properties of the recent sediments of Brothers Water, NW England // J. Paleolimnol. 2000. - V. 23. - P. 165-174.

101. Ota, H., Takeyama, H., Nakayama, H., Katoh, T., Matsunaga, T. SNP detection in transforming growth factor-beta 1 gene using bacterial magnetic particles // Biosens. Bioelectron. -2003. -V. 18. P. 683-687.

102. Paoletti, L., Blakemore, R. Hydroxamate production by Aquaspirillum magnetotacticum II J. Bacteriol. 1986. - V. 167. - P. 73-76.

103. Paoletti L., Blakemore R. Iron reduction by Aquaspirillum magnetotacticum II Curr. Microbiol. -1988. V. 17. - P. 339-342.

104. Pradel, N., Santini, C., Bernadac, A., Fukumori, Y., Wu, L. Biogenesis of actin-like bacterial cytoskeletal filaments destined for positioning prokaryotic magnetic organelles. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. - V. 103. - P. 17485-1789

105. Prozorov, T., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B., Wang, L., Palo, P. Proteinmediated synthesis of uniform superparamagnetic magnetite nanocrystals // Adv. Funct. Mater. 2007. - V. 17. - P. 951-957.

106. Sakaguchi, H., Hagiwara, H., Fukumori, Y., Tamaura, Y., Funaki, M., Hirose, S. Oxygen concentration-dependent induction of a 140-kDa protein in magnetic bacterium Magnetospirillum magnetotacticum MS-1 // FEMS Microbiol. Lett. -1993,-V. 107. P.169-174.

107. Sakaguchi, T., Arakaki, A., Matsunaga, T. Desulfovibrio magneticus sp. nov., a novel sulfate-reducing bacterium that produces intracellular single-domain-sized magnetite particles // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. - V. 52. - P. 215-221.

108. Sakaguchi, T., Burgess, J., Matsunaga, T. Magnetite formation by a sulfate-reducing bacterium // Nature. 1993. - V. 365. - P. 47-49.

109. Sakaguchi, T., Tsujimura, N., Matsunaga, T. A novel method for isolation of magnetic bacteria without magnetic collection using magnetotaxis // J. Microbiol. Methods. 1996. V. 26. - P. 139-145.

110. Sakane, T. Chemotaxonomic investigation of heterotrophic, aerobic and microaerophilic spirilla, the genera Aquaspirilium, Magnetospirillum and Oceanospirillum II Syst. Appl. Microbiol. 1994. - V.17. -P. 128-134.

111. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual / Sambrook J. 2 ed. - New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

112. Scheffel, A., Gruska, M., Faivre, D., Linaroudis, A., Graumann, P. L. An acidic protein aligns magnetosomes along a filamentous structure in magnetotactic bacteria // Nature. 2006. - V. 440. - P. 110-114.

113. Scheffel, A., Schueler, D. The acidic repetitive domain of the Magnetospirillum gryphiswaldense MamJ protein displays hypervariability but is not required for magnetosome chain assembly // J. Bacteriol. 2007. - V. 189. - P. 6437-6446.

114. Schueler, D. Formation of magnetosomes in magnetotactic bacteria // J. Molec. Microbiol. Biotechnol. JMMB Symposium. 1999. - V.l. - No.l. - P. 79-86.

115. Schueler, D. Molecular analysis of a subcellular compartment: the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense II Arch. Microbiol. 2004. - V. 181.-P. 1-7.

116. Schueler, D., Baeuerlein, E. Dynamics of iron uptake and Fe304 mineralization during aerobic and microaerobic growth of Magnetospirillum gryphiswaldense II J. Bacteriol. 1998,-V. 180.-P. 159-162.

117. Schueler, D., Baeuerlein, E. Iron-limited growth and kinetics of iron uptake in Magnetospirillum gryphiswaldense II Arch. Microbiol. -1996. V. 166. - P. 301307.

118. Schueler, D., Schleifer, K.H. The genus Magnetospirillum / Brenner D.J., Krieg N.R., Starley J.T. Bergey's manual of determinative bacteriology // New York: Berlin Springer Heidelberg. 2005. - P. 28-31.

119. Schueler, D., Spring, S., Bazylinski, D. Improved technique for the isolation of magnetotactic spirilla from a freshwater sediment and their phylogenetic characterization // Syst. Appl. Microbiol. 1999. -V. 22. - No. 3. - P. 466-471.

120. Shinoda, Y., Sakai, Y., Ue, M., Hiraishi, A., Kato, N. Isolation and characterization of a new denitrifying spirillum capable of anaerobic degradation of phenol // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66. - No. 4 - P. 1286-1291.

121. Simmons S., Bazylinski D., Edwards K. South-seeking magnetotactic bacteria in the Northern Hemisphere // Science. 2006. - V. 311. -No.5759. - P. 371-374.

122. Smith, M. J., Sheehan, P. E., Perry, L. L., O'Connor, K., Csonka, L. N., Applegate, B. M., Whitman, L. J. Quantifying the magnetic advantage in magnetotaxis // Biophysical Journal. 2006. - V. 91. - P. 1098-1107

123. Snowball, I. Bacterial magnetite and the magnetic properties of sediments in a swedish lake // Earth Planet. Sci. Lett. 1994. - V. 126. - P. 129-142.

124. Sode, K., Kudo, S., Sakaguchi, T., Nakamura, N., Matsunaga, T. Application of bacterial magnetic particles for highly selective messenger-RNA recovery system // Biotechnol. Tech. 1993. - V. 7. - P. 688-694.

125. Spring, S., Amann, R., Ludwig, W., Schleifer, K., Gemerden, H., Petersen, N. Dominating role of an unusual magnetotactic bacterium in the microaerobic zone of a freshwater sediment // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V. 59. - N. 8. - P. 2397-2403.

126. Spring, S., Amann, R., Ludwig, W., Schleifer, K.H., Schueler, D., Poralla, K., Petersen, N. Phylogenetic analysis of magnetotactic bacteria from the alpha-subclass of proteobacteria // Syst. Appl. Microbiol. 1995. - V. 17. - P. 501-508.

127. Spring, S., Schleifer, K. Diversity of magnetotactic bacteria // Syst. Appl. Microbiol. 1995.-V. 2.-N. 18.-P. 147-153.

128. Stephens, C. Bacterial cell biology: managing magnetosomes // Curr. Biol. -2006,-V. 16.-P. 363-365.

129. Tanaka, M., Okamura, Y., Arakaki, A., Tanaka, T., Takeyama, H., Matsunaga, T. Origin of magnetosome membrane: proteomic analysis of magnetosome membrane and comparison with cytoplasmic membrane // Proteomics. 2006. -V. 6.-P. 5234-5247.

130. Taoka, A., Asada, R., Wu, L. F., Fukumori, Y. Polymerization of the actin-like protein MamK, which is associated with magnetosomes // J. Bacteriol. 2007. -V. 189.-P. 8737-8740

131. Taylor, B., Zhulin, I., Johnson M. Aerotaxis and other energy-sensing behavior in bacteria//Annu. Rev. Microbiol. 1999. - No. 53.-P. 103-128.

132. Versalovic, J., Schneider, de Brulin, F., Lupski. J. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction // Methods Mol. Cell. Biol. 1994. - V. 5. - P. 25-40

133. Wahyudi, A.,Takeyama, H., Matsunaga, T. Isolation of Magnetospirillum magneticum AMB-1 mutants defective in bacterial magnetic particle synthesis by transposon mutagenesis // Appl. Biochem. Biotechnol. 2001. - V. P. - 147-154.

134. Wang, Q., Garrity, M., Tiedje, J., Cole J. Naive Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy // Appl Environ Microbiol. -2007. V.73. - P. 5261-5267.

135. Williams, T., Zhang, C., Scott J., Bazylinski D. Evidence for autotrophy via the reverse tricarboxylic acid cycle in the marine magnetotactic coccus strain MC-1 // Appl. Environ. Microbiol. 2006. - V. 72. - P. 1322-1329.

136. Wolfe, R., Thauer, R., Pfennig, N. A Capillary racetrack method for isolation of magnetotactic bacteria // FEMS Microbiology Ecology. 1987. -V. 45. - P. 3135.

137. Yang, C., Takeyama, H., Tanaka, T., Hasegawa, A., Matsunaga, T. Synthesis of bacterial magnetic particles during cell cycle of Magnetospirillum magneticum AMB-1 //Appl. Biochem. Biotechnol. 2001. - V. 91. -№ 9. - P. 155-160.

138. Yang, C., Takeyama, H., Tanaka, T., Matsunaga, T. Effects of growth mediumcomposition, iron sources and atmospheric oxygen concentrations on productionof luciferase-bacterial magnetic particle complex by a recombinant126

139. Magnetospirillum magneticum AMB-1 // Enzyme Microb. Technol. -2001. V. 29.-P. 13-19.

140. Yoshino, T., Matsunaga, T. Development of efficient expression system for protein display on bacterial magnetic particles // Biochem. Biophys. Res. Commun.-2005.-V. 338.-P. 1678-1681.

141. Yoshino, T., Matsunaga, T. Efficient and stable display of functional proteins on bacterial magnetic particles using Mmsl3 as a novel anchor molecule // Appl. Environ. Microbiol. 2006. - V.72. - P. 465-471.

142. Yoshino, T., Tanaka, T., Takeyama, H., Matsunaga, T. Single nucleotide polymorphism genotyping of aldehyde dehydrogenase 2 gene using a single bacterial magnetic particle // Biosens. Bioelectron. 2003. -V. 18. - P. 661-666.

143. Yoza, B., Arakaki, A., Maruyama, K., Takeyama, H., Matsunaga, T. Fully automated DNA extraction from blood using magnetic particles modified with a hyperbranched polyamidoamine dendrimer // J. Biosci. Bioeng. 2003. - V. 95. -P. 21-26.

144. Yoza, B., Matsumoto, M., Matsunaga, T. DNA extraction using modified bacterial magnetic particles in the presence of amino silane compound // J. Biotechnol. 2002. - V. 94. - P. 217-224.