Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Различия в морфологии и функциональной активности дермальных фибробластов в зависимости от их происхождения и условий культивирования

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Различия в морфологии и функциональной активности дермальных фибробластов в зависимости от их происхождения и условий культивирования"

На правах рукописи

ЮДИНЦЕВА Наталия Михайловна

РАЗЛИЧИЯ В МОРФОЛОГИИ II ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ДЕРМАЛЫ1ЫХ ФИБРОБЛАСТОВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ИХ ПРОИСХОЖДЕНИЯ II УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

03.03.04-клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 1 0 к: 2010

Санкт-Петербург 2010

004611272

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Пинасв Георгий Петрович Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Михсльсоп Виктор Михайлович Институт цитологии РАН

доктор медицинских наук, профессор Галибин Олег Всеволодович Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика И. П. Павлова

Ведущая организация:

Институт биологии развития им.Н.К.Кольцова РАН, Москва

Защита диссертации состоится «22» октября 2010 года в 12 часов на заседании

Диссертационного совета Д. 002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу:

194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

Адрес элекгрошюй почты Института: сеШч'о@та|1. cvtspb.rssi.ru

Сайт: КЦр/Ауд\^-cytspb.rssi.ru

Факс: 8 (812) 297-35-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан «22» сентября 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.В.Каминская

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность проблемы

В настоящее время одной из актуальных проблем современной регенеративной медицины является разработка клеточных технологий, используемых для восстановления структурной и функциональной целостности поврежденных органов и тканей. Применение традиционных методов лечения не всегда приводит к заживлению или полному восстановлению исходной структуры ткани. Заживление обширных и глубоких повреждений дермы заканчивается образованием рубца, который нарушает структуру и функции ткани. Исключение составляет заживление повреждений эмбриональной ткани, при котором рубцы не образуются (Dang et al., 2003; Mackool et al., 1998; Matthew et al., 2003). Причина образования рубцов до настоящего времени не выяснена.

Основными клетками, создающими структурную основу для формирования кожи в процессах морфогенеза и регенерации после повреждения, являются фибробласты. Интенсивно синтезируя белки внеклеточного матрикса (ВКМ), ростовые факторы и матриксные металлопротеиназы (ММП), они восстанавливают поврежденную дерму, на которой затем формируется эпидермис. Однако до настоящего времени точно неизвестно какие именно фибробласты участвуют в процессе заживления раны и каковы их свойства.

Имеются данные, что фибробласты, находящиеся в ране, могут происходить из монопуклеаров крови, которые превращаются в месте повреждения в фиброциты (Abe et al., 2001; Bucala et al., 1994; Chesney et al., 1998). При этом неизвестно, остаются ли они в сформированном рубце после заживления ткани. Кроме того, фибробласты из окружающей рапу кожи также могут принимать участие в заживлении, но остаются ли они в сформированном рубце и сохраняют ли при этом свои свойства неизвестно.

В настоящее время в ряде клиник для заживления повреждений кожи применяются клеточные продукты, разработанные также и в Отделе клеточных культур Института цитологии РАН. Один из них - дермальный эквивалент (ДЭ), который представляет собой коллагеновый гель с внесенными в него дермальными фибробластами. Следует учитывать, что, несмотря на положительное воздействие ДЭ на заживление ран, коллаген может оказывать влияние на состав синтезируемых клетками белков ВКМ (Clark et al., 1995; Grinnell, 1994) и снижать скорость их продуцирования (Mauch et al., 1988). При культивировании фибробластов в дермальном эквиваленте, приготовленном на основе фибрина, синтез клетками белков ВКМ может отличаться от условий культивирования их в коллагеновом геле. В связи с тем, что на ранней стадии раневого заживления в организме

образуется фибриновый сгусток, который активно перерабатывают и реорганизуют фибробласты, представляет интерес изучение функциональной активности клеток, культивируемых в фибриновом геле.

Для понимания процесса организации ткани и формирования рубцов необходимо изучить морфологию дермальных фибробластов различного происхождения и синтез ими белков ВКМ в условиях двухмерного (монослой) и трехмерного (фибриновый или коллагеновый гель) культивирования. Для того чтобы приблизиться к пониманию процесса образования рубцов, необходимо, прежде всего, установить, различаются ли фибробласты, выделенные из нормальной, рубцовой и эмбриональной кожи между собой по свойствам и по способности формировать микроокружение.

1.2 Цели и задачи работы

Целью данной работы являлось сравнительное исследование морфологии фибробластов, выделенных из нормальной, рубцовой и эмбриональной кожи человека, а также интенсивности синтеза ими мажорных белков ВКМ и степени активности матриксных металлопротеиназ в условиях двухмерного и трехмерного культивирования (в фибриновом или коллагеновом геле).

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи.

1. Определить характер организации актинового цитоскелета у дермальных фибробластов разного происхождения, распластанных на одних и тех же иммобилизованных белках ВКМ.

2. Проанализировать синтез мажорных белков ВКМ и степень активности матриксных металлопротеиназ у дермальных фибробластов различного происхождения в двухмерных и трехмерных условиях культивирования.

3. Сопоставить функциональные свойства дермальных фибробластов различного происхождения в зависимости от их микроокружения.

4. Выполнить сравнительный анализ влияния нормальных фибробластов, культивируемых в коллагеновом или фибриновом геле, на заживление экспериментальных ран у лабораторных животных.

1.3 Основные положения, выносимые на защиту

1. Характер организации актинового цитоскелета при распластывании дермальных фибробластов различного происхождения на одних и тех же иммобилизованных белках ВКМ

зависит от типа ткани и свидетельствует о наличии специфичности лиганд-рецепторных взаимодействий у клеток каждого типа ткани.

2. Дермальные фибробласты разного происхождения отличаются друг от друга по количеству синтезируемых мажорных белков ВКМ, соотношению между ними и молекулярной массе их фрагментов. Степень этих различий зависит от условий культивирования.

3. Выявленные различия в степени активности ММП могут являться причиной различного состава и размеров фрагментов белков ВКМ, синтезируемых фибробластами.

4. Внесение в экспериментальные рапы животных фибрипового геля с нормальными фибробластами, интенсивно синтезирующими белки ВКМ, способствует эффективному формированию соединительной ткани.

1.4 Научная новизна полученных результатов

В данной работе впервые был проведен сравнительный анализ морфологии и функциональной активности фибробластов, выделенных из нормальной, рубцовой и эмбриональной кожи человека. Выявлены существенные различия в организации цитоскелета, а также в количестве и соотношении мажорных белков ВКМ, синтезируемых фибробластами Установлено, что степень установленных различий определяется условиями культивирования фибробластов и их микроокружением.

1.5 Теоретическое н практическое значение работы

Результаты проведенных исследований имеют фундаментальное значение для расширения представлений о механизмах формирования соединительной ткани в процессе регенерации. Полученные данные будут использованы при разработке новых клеточных продуктов, предназначенных для заживления ран различной этиологии, связанных с повреждениями кожного покрова человека. Обнаруженные закономерности и выводы из работы могут быть использованы в лекционных курсах высших учебных заведений медицинского и биологического профилей.

1.6 Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, из них 6 статей в рецензируемых журналах, 12 тезисов и 1 патент.

Материалы диссертации были представлены на Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2004, 2006, 2007, 2009); на Всероссийской

научно-практической конференции с международным участием «Современные проблемы сердечно-сосудистой, легочной и абдоминальной хирургии», посвященной 100-лстию со дня рождения академика РАМН Ф.Г.Углова (Санкт-Петербург, 2004); на конференции «Клиническая трансплантация органов» (Москва, 2005); на IX Ежегодной сессии НЦССХ и Всероссийской конференции молодых ученых (Москва, 2005); на III Всемирном Конгрессе по регенеративной медицине (Лейпциг, 2007); на Британско-Российском совещании в сотрудничестве с Европейской комиссией (Москва, 2007).

1.7 Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего ^^источников. Диссертация изложена на /У^страницах машинописного текста. Иллюстративный материал содержит 35 рисунков и 3 таблицы. Работа выполнялась в рамках Гос кошракга № 02.522.11.2006/03 и при поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Клеточные культуры

Фибробласты выделяли методом миграции из фрагментов нормальной и рубцовой кожи взрослых доноров, а также из эмбриональной кожи. В качестве нормальной и рубцовой кожи взрослых доноров была использована кожа лица, полученная в результате косметологических операций. Эмбриональные фибробласты кожи были выделены из кожи эмбриона позднего срока развития, изъятого в результате кесарева сечения. Клетки культивировали в среде ВМЕМ (1СЫ) с добавлением 10 % эмбриональной бычьей сыворотки (бйсо) в атмосфере 5 % СО2 при температуре 37 °С. В работе были использованы клетки на третьем-восьмом пассажах.

2.2 Трехмерное культивироваиие фибробластов

Трехмерное культивирование фибробластов разного происхождения осуществляли путем введения клеток в формируемые коллагеновый или фибриновый гели.

Для приготовления коллагенового геля смешивали коллаген I типа, полученный по стандартной методике (СЬапс1гакаяап е! а1., 1967), стерильный 0.34 М раствор ЫаОН (для подведения рН 7.0) и концентрированную (10х) питательную среду 199 (для выравнивания

ионной силы). В полученную смесь добавляли суспензию фибробластов в питательной среде ДМЕМ (ICN), содержащей 10 % эмбриональной бычьей сыворотки (Gibco).

Для приготовления фибринового геля в раствор фибриногена (Calbiochem) с концентрацией 2 мг/мл добавляли суспензию фибробластов в среде ДМЕМ, содержащей 10 % эмбриональной бычьей сыворотки. Затем для образования фибрина вводили 1 ед тромбина (Sigma) на 0.1 мл геля.

Конечная концентрация фибробластов в обоих вариантах гелей составляла 1 х 106 кл/мл, конечная концентрация коллагена - 2 мг/мл, фибрина - 1 мг/мл. Аликвоты приготовленной смеси по 0.1 мл вносили в лунки 96-луночной платы и инкубировали в атмосфере 5 % СО2 при температуре 37 °С до полной полимеризации геля. Затем в каждую лунку добавляли по 0.1 мл питательной среды ДМЕМ, содержащей 10 % эмбриональной бычьей сыворотки. Гели, с заключенными в них фибробластами, культивировали в течение 10 су т.

2.3 Иммунофлуоресцентиый анализ организации цитоскелета

В качестве субстратов для распластывания клеток были использованы белки ВКМ: коллаген I и IV типов, ламшшн 2/4 и фибронекгин. Коллаген I типа получен из сухожилий крысиных хвостов (Chandrakasan et al., 1967), коллаген IV типа и ламинии 2/4 выделены из плаценты человека (Черепанова и др., 2002; Kleinman, 1994; Palm, Furcht, 1983;), фибронекгин получен из плазмы крови человека (Ruoslanti et al., 1982).

Покровные стекла покрывали вышеперечисленными белками с концентрацией 10 мкг/мл и инкубировали в течение ночи при +4 СС. Затем отмывали PBS и для исключения неспецифического связывания с субстратом обрабатывали 2 %-ным раствором бычьего сывороточного альбумина (BSA) в течение 1 ч при 37 °С. Суспензию фибробластов, выделенных из нормальной, рубцовой и эмбриональной кожи, наносили в концентрации 1 х 105 кл/мл в 0.1 мл среды без сыворотки на покровные стекла, покрытые лигаидами. После инкубации в течение 60 мин в атмосфере 5 % С02 при температуре 37 °С среду удаляли и промывали раствором PBS. Прикрепившиеся клетки фиксировали 4 %-ным формалином, отмывали PBS и обрабатывали 0.1 %-ным Тритоном Х100 в течение 15 мин при комнатной температуре.

Для выявления фокальных контактов клетки инкубировали с моноклональными антителами мыши против винкулина (Sigma, США) в течение 60 мин при комнатной температуре, в разведении 1:250. После трехкратной отмывки клеток раствором PBS наносили вторые поликлональные козьи антитела против IgG мыши, копьюгировапные с

FITC (Fluorescein Isothiocynate) (Sigma, США) в разведении 1:500 и инкубировали 30 мин при комнатной температуре в темноте с последующим 3-кратным отмыванием PBS.

Для выявления актиновых структур родамин-фаллоидин (Molecular probes, США) с концентрацией 10 ед/мл наносили на покровное стекло в 100 мкл и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте, после этого трижды отмывали раствором PBS. В качестве заключающей среды использовали Mounting medium (Pharmacia Biotech., Швеция).

Идентификацию окрашенных клеток проводили с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SL (Zeiss, Германия). Для возбуждения флуоресценции использовали аргоновый лазер с длиной волны 488 нм и HeNe -лазер с длиной волны 543 им. Применяли раздельное сканирование для каждого сигнала.

2.4 Иммунофлуоресцептный анализ белков ВКМ, синтезируемых фнбробластамн

Присутствие синтезируемых фибробластами мажорных белков ВКМ оценивали с помощью метода непрямой иммупофлуоресценции. Дермальные фибробласты различного происхождения культивировали в течение 10 сут в двухмерных условиях и в гелях на покровных стеклах. Препараты трижды промывали PBS для удаления сыворотки, затем фиксировали 4 %-ным раствором формальдегида (Sigma, США) в течение 15 мин при комнатной температуре с последующей трехкратной отмывкой раствором PBS.

В качестве первых антител использовали моноклональные мышиные антитела против коллагена IV типа (Chemicon, Великобритания) и фибронектина (Sigma, США), а также поликлональные кроличьи антитела против коллагена I типа и ламинина (Chemicon, Великобритания). Антитела разводили в соотношении 1:250.

В качестве вторых антител были использованы поликлональные козьи антитела против IgG мыши, конъюгированные с FITC (Fluorescein Isothiocynate) (Sigma) и поликлональные антитела свиньи против IgG кролика, коныогированные с FITC (Dako, Дания), Антитела разводили в соотношении 1:500.

Сначала наносили первые антитела на 60 мин при комнатной температуре, трижды промывали PBS. Затем наносили вторые антитела на 45 мин в темноте и 3 раза промывали PBS. В качестве заключающей среды использовали Mounting medium (Pharmacia Biotech., Швеция). Препараты анализировали с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SL (Zeiss, Германия). Для возбуждения флуоресценции использовали HeNe -лазер с длиной волны 543 нм.

Измерение таких параметров, как площадь проекции клетки на подложку, а также значения усредненных интенсивностей флуоресценции клеток выполняли с помощью программы «WCIF ImageJ 1.37i» (National Institute of Health, Maryland, USA). Поскольку все изображения клеток получены при равных условиях, и используемые величины были относительными, значения, выраженные в пикселях, не переводили в традиционные единицы измерения.

Математическую обработку полученных данных проводили с помощью «Microsoft Excel 2007». В каждом эксперименте оценивали изображения 300-500 клеток, полученные с помощью конфокального микроскопа. В работе представлены данные трех и более независимых экспериментов. Обработку полученных данных проводили методами вариационной статистики при помощи программы «Microsoft Excel 2007», определяя следующие показатели: среднее значение, ошибку среднего, достоверность различий между группами, с вычислением доверительного интервала (р); различия считали достоверными при р< 0.05.

2.5 Получение белков ВКМ, синтезируемых фиброблаетами в двухмерных условиях культивирования

Фибробласты снимали с поверхности чашек 2 мМ раствором ЭДТА на PBS в течение 3-5 мин при 37 °С. Снятые клетки удаляли, а наработанные ими на чашках белки ВКМ промывали 3 раза тем же раствором. После удаления клеток, белки покрывали 5 %-иой уксусной кислотой, и оставляли на ночь при +4 °С. Затем кислоту удаляли и вносили 1 мл раствора в составе: 125 мМ Трис-HCl, pH 6.8, 0.1 %-ный SDS, 10 %-ный глицерин, 1 %-ный ДТТ, 0.05 мМ PMSF, коктейль ингибиторов протеаз (Roche, Германия) и инкубировали при 37 °С в течение 60 мин. Белки снимали скрепером, процедуру снятия повторяли 3 раза. Белковые экстракты объединяли, добавляли 5 объемов подкисленного ацетона и оставляли для формирования осадка при - 20 °С на ночь. Затем белки ВКМ осаждали центрифугированием (5000 g, 15 мин) (Туроверова и др., 2009). Полученный осадок для выполнения электрофореза растворяли в буфере Лэммли (Laemmli, 1970).

2.6 SDS-электрофорез и иммуноблотинг

Белки разделяли в 7.5 %-ном полиакриламидном геле в присутствии SDS и переносили на мембрану PVDF (Millipore) по стандартной методике (Towbin et al., 1979).

Моноклональные антитела против коллагена IV типа (Chemicon, Великобритания) и фибронектина (Sigma, США), а также поликлональные антитела против коллагена I типа и

ламинина (Chemicon, Великобритания) разводили в соотношении 1:500; вторые антитела против IgG мыши и кролика (Sigma, США) разводили в соотношении 1:10000. Концентрация тотального белка в препаратах ВКМ фибробластов была различной и дальнейшее выравнивание концентраций между различными пробами выполняли их разведением буфером Лэммли. Сравнительный анализ концентраций белков в геле проводили измерением оптической плотности электрофореграмм при помощи прибора ChemiDock XRS и программы Quantity One (BioRad). Хемилюминесценцию регистрировали на установке ChemiDok XRS (BioRad).

Фотографии гелей были получены на приборе ChemiDoc XRS с помощью программы QuantityOne. Вычисление средних значений и 95 %-ных доверительных интервалов проводили при помощи программ Origin и Excel. В работе представлены данные трех и более независимых экспериментов.

2.7 Выявление активности матрнксных металлопротеиназ методом зимографии

Были проанализированы образцы кондиционированной среды и образцы гелей на сроках культивирования: 1-10 сут. Буфер для проб (0.625 М Трис рН = 6.8; 2 %-ный SDS; 10 %-ный глицерин; 0.01 %-ный бромфенол синий) добавляли в образцы и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Белки разделяли в 4.5 %-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях в присутствии 10 %-ного SDS в трис-глициновом буфере Лэммли при значении тока 25 мА. Вместо воды при приготовлении геля использовали раствор желатина. Для выявления положения зон, соответствующих металлопротеиназам ММП-2 и ММП-9, использовали среду, кондиционированную фибробластами линии НТ-1080, которая содержит проформы и активные формы ММП-2 и ММП-9 (Oliver et al., 1999).

После проведения электрофореза гель двукратно отмывали 0.5 %-ным раствором Тритона Х100 и выдерживали в течение ночи в растворе (50 мМ Трис-HCl рН 7.4; 5 мМ СаСЬ) для выявления активности ферментов. Гель окрашивали раствором Кумасси и отмывали в 7 %-ном растворе уксусной кислоты. Изображения, полученные в электронном виде, сканировали, степень активности ММП для выявленных полос выражали в условных единицах (произведение площади окрашенной полосы в пикселях на интенсивность окраски в единицах оптического поглощения).

2.8 Гистологический анализ биоптатов кожи в процессе заживления

ран

Фибриновый и коллагеновый гели с заключенными в них нормальными фиброблаетами вносили в экспериментальные раны животных (крыс). На 7-е сутки после этого был выполнен забор биоптатов. В качестве контроля был использован вариант без внесения клеточных продуктов. Морфологическое исследование гистологических препаратов с помощью иммуногистохимических методов проводили при помощи светооптического микроскопа Leica DM LS (Германия). Микроморфометрические измерения выполняли с помощью окуляр-микрометра. Количественно оценивали площадь коллагена при помощи программы «Видеотест Морфология 4.0», оценивая 5 полей зрения под микроскопом при увеличении объектива 20*. Коллагеновые волокна выявляли окрашиванием по Ван-Гизону (Автандилов, 1998).

Следующие параметры в поле зрения оценивали условно в баллах: состав и степень выраженности воспалительной инфильтрации раны лимфоцитами, гистиоцитами, лейкоцитами, гигантскими многоядерными клетками (выраженная - 3, умеренно выраженная - 2, слабо выраженная -1). Определяли число микрососудов капиллярного типа в срезе (прекапилляры, капилляры, посткапилляры) и площадь коллагеновых волокон (мкм2). Микрофотографирование проводили при помощи цифровой фотокамеры Leica DC320.

Математическую обработку полученных клшшко-морфологических данных проводили методами вариационной статистики при помощи программы Microsoft Exel, определяя следующие показатели: среднее значение, ошибку среднего, достоверность различий между группами, доверительный интервал (р); различия опытных групп с контролем считали достоверными при р < 0.05.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Организация актннового цитоскелета у дермальных фибробластов различного происхождения при взаимодействии с иммобилизованными белками ВКМ

Известно, что цитоскелет быстро реагирует на изменения в микроокружении клеток, и по характеру его пространственной организации можно судить о степени сходства или различия клеток разного происхождения, находящихся в одинаковых условиях. Белки внеклеточного матрикса оказывают специфическое влияние на формирование структуры актинового цитоскелета (Арэ и др., 1999), поэтому, одним из подходов, позволяющих выявить различия между фиброблаетами разного происхождения, является анализ организации цитоскелета у исследуемых клеток, распластанных па одних и тех же белках ВКМ. Через 60 мин после их распластывания на субстрате были выявлены различия в

организации цитоскелета и степени формирования фокальных контактов у фибробластов различного происхождения (рис. 1). Клетки, имеющие сходную организацию цитоскелета,

Рис. 1. Организация цитоскелета и фокальных контактов у дермальных фибробластов различного происхождения на белках ВКМ, 100 х. Здесь и далее: Нф - нормальные, Рф -рубцовые, Эф -эмбриональные фибробласты. Красный -актиновые структуры, зеленый - винкулин.

Фибробласты,

распластанные на одном и том же белке ВКМ, имели сходный характер пространственной организации актинового цитоскелета. Однако при этом наблюдались существенные различия в распределении актиновых структур и степени формирования фокальных контактов. Из этих данных следует, что во взаимодействие с одним и тем же белком, по-видимому, были вовлечены разные сочетания интегриновых рецепторов, определяющих степень сродства к данному субстрату. В пользу такого заключения свидетельствовали полученные данные о различной степени сродства с тем или иным субстратом одного типа фибробластов.

Например, нормальные фибробласты в наибольшей степени взаимодействовали с субстратом при распластывании на коллагене I типа и фибронектине, достаточно хорошо взаимодействовали с коллагеном IV типа, но менее плотно, чем с коллагеном I типа, и слабо взаимодействовали с ламинином 2/4. Для рубцовых фибробластов наиболее адгезивными субстратами являлись фибронектин и ламинин 2/4, а на коллагене I и IV типов клетки имели слабо развитый актиновый цитоскелет и плохой контакт с данными субстратами. В отличие от нормальных и рубцовых эмбриональные фибробласты имели сильную степень сродства к коллагену I и IV типов и ламинину 2/4. В меньшей степени они взаимодействовали с фибронектином.

составляли от 50 до 70 % каждой клеточной популяции.

3.2 Оценка наличия синтезируемых фибробластами белков ВКМ с помощью метода непрямой иммунофлуорссценции

В условиях двухмерного и трехмерного культивирования был выявлен синтез мажорных белков ВКМ у фибробластов различного происхождения Интенсивность флуоресценции клеток была выражена в разной степени. По полученным данным были построены диаграммы (рис 2).

Двухмерные условия

Коллагеновый гель

Фибриновый гель

6- 60

О

а 40

20

а

¿* 0

I; I к IV ф-н лам бглкпВКМ_

к1 «IV ф-н лам белки ВКМ_

Рис. 2. Содержание клеток с высокой интенсивностью флуоресценции в популяциях дермальных фибробластов различного происхождения при двухмерном и трехмерном культивировании: к I, к IV - коллаген I и IV типов; ф-н - фибронектин; лам -ламинин.

На диаграмме видно, что получены количественные различия по синтезу белков ВКМ разными по происхождению фибробластами, находящимися в одинаковых условиях культивирования Например, в двухмерных условиях культивирования коллаген IV типа наиболее интенсивно синтезировали рубцовые фибробласты, в меньшей степени — эмбриональные и совсем незначительно - нормальные фибробласты.

В фибриновом геле высокий уровень синтеза белков ВКМ был выявлен для всех типов фибробластов В коллагеновом геле доля клеток популяций фибробластов разного происхождения, имеющих высокую интенсивность флуоресценции, была значительно меньше, чем в фибриновом геле и при двухмерных условиях культивирования

Таким образом, независимо от происхождения клеток, микроокружение оказывает существенное влияние на синтез ими белков ВКМ

3.3 Синтез мажорных белков ВКМ дермальпыми фибробластами различного происхождения в условиях двухмерного и трехмерного культивирования

Данные электрофореза свидетельствовали о сходном составе белков ВКМ, синтезируемых фибробластами разного происхождения в двухмерных условиях культивирования (рис. 3, а).

Рис. 3. Состав белков ВКМ, синтезируемых фибробластами различного происхождения в условиях двухмерного культивирования.

Здесь и далее: а - электрофорез белков ВКМ, синтезируемых нормальными (нф), Рубцовыми (рф) и эмбриональными фибробластами (эф) (окраска Кумасси); б, в, г, д — иммуноблотинг белков ВКМ, окраска антителами против коллагена I типа, коллагена IV типа, фибронектина и ламинина, соответственно

Результаты иммуноблотинга с использованием антител против мажорных белков ВКМ выявили фрагменты синтезируемых белков. Антителами против коллагена I типа были выявлены две белковые полосы примерно 65 кДа и 55 кДа (рис. 3, б). Коллаген IV типа был представлен в виде белковой полосы около 55 кДа (рис. 3, в). С помощью антител против фибронектина выявляли белковую полосу около 140 кДа (рис. 3, г). Антителами против ламинина была обнаружена белковая полоса с молекулярной массой около 40 кДа (рис. 3, д).

Кроме того, получили количественные различия в синтезе белков ВКМ фибробластами разного происхождения, находящихся в одинаковых условиях культивирования Например, рубцовые фибробласты синтезировали в 2 раза больше фибронектина, по сравнению с эмбриональными и в 4 раза больше по сравнению с нормальными фибробластами.

Далее был проведен электрофорез белков ВКМ, синтезируемых фибробластами различного происхождения при культивировании в фибриновом геле в течение 10 сут, с последующим выполнением иммуноблотинга (рис. 4).

кДа Нф 2Ф Эф

0.1Г

кДа нф Рф Эф 72-

55-

кДа Нф Рф Эф 170130-

кДа Нф Рф Эф

кДа Нф Рф Эф

43- ^

Д

шН

Рис. 4. Состав белков ВКМ

синтезируемых фибробластами различного происхождения в фибриновом геле.

Так же, как и в предыдущих экспериментах был показан сходный белковый состав ВКМ, синтезируемый фибробластами различного происхождения при культивировании их в фибриновом геле (рис. 4, а). В результате проведения иммуноблотинга были выявлены фрагменты белков, но с большей молекулярной массой по сравнению с условиями двумерного культивирования клеток

Так антителами против коллагена I типа была выявлена белковая полоса с молекулярной массой около 200 кДа (рис. 4, б). Коллагену IV типа соответствовала белковая полоса около 55 кДа (рис. 4, в). Фибронектин был представлен белковой полосой с молекулярной массой около 170 кДа (рис. 4, г), Ламинин выявлялся в виде белковой полосы с молекулярной массой около 190 кДа (рис. 4, д).

Как и в предыдущем случае, различные по происхождению фибробласты, находясь в одинаковых условиях культивирования, имели только количественные отличия в синтезе белков ВКМ Например, рубцовые фибробласты синтезировали в 1 5 раза больше коллагена I типа, чем синтезировали нормальные, и в 2 раза больше, чем синтезировали эмбриональные фибробласты.

Для того чтобы выявить влияние микроокружения на синтез белков ВКМ, был проведен электрофорез белков, синтезируемых фибробластами разного происхождения при культивировании их в коллагеновом геле, с последующим иммуноблотингом (рис. 5).

кДа Нф Рф Эф <*>

кДа Нф Рф Эф

б

кДа Нф Рф Эф

170- тт

г

кДа Нф Рф Эф в

кДа Нф Рф Эф

Д

Рис. 5. Состав белков ВКМ, синтезируемых фибробластами различного происхождения в коллагеновом геле.

Результаты

электрофореза также показали сходный состав белков ВКМ, синтезируемых фибробластами различного происхождения при культивировании их в коллагеновом геле в течение 10 сут (рис. 5, а). Данные иммуноблотинга выявили такие же размеры фрагментов белков ВКМ, как и при культивировании клеток в фибриновом геле, за исключением коллагена IV типа.

Антителами против коллагена I типа была выявлена белковая полоса, с молекулярной массой около 200 кДа (рис 5, б) Коллаген IV типа был представлен только у рубцовых фибробластов в виде белковой полосы с молекулярной массой около 110 кДа (рис. 5, в) Фибронектин выявлялся в виде белковой полосы с молекулярной массой около 170 кДа (рис 5, г). Ламинину соответствовала белковая полоса с молекулярной массой около 190 кДа (рис. 5,Д).

Результаты иммуноблотинга также выявили различия в количестве белков ВКМ, синтезируемых фибробластами различного происхождения. Например, нормальные фибробласты синтезировали в 1.5 раза больше ламинина, чем синтезировали рубцовые и почти в 2 раза больше, чем синтезировали эмбриональные фибробласты.

Таким образом, при культивировании фибробластов разного происхождения в одинаковых условиях были показаны количественные различия в синтезе ими одних и тех же белков ВКМ Кроме того, проведенное сравнение синтеза белков ВКМ фибробластами в двухмерных условиях культивирования и в гелях выявило различия в размерах полученных фрагментов белков.

Проведенный количественный анализ синтеза белков ВКМ фибробластами в фибриновом и коллагеновом геле не показал различий в размерах выявленных фрагментов белков (за исключением коллагена IV типа), но фибробласты в фибриновом геле, независимо от их происхождения, более интенсивно синтезировали мажорные белки ВКМ. Например, количество коллагена I типа, синтезируемое нормальными фибробластами в фибриновом

геле, было в 5 раз больше, Рубцовыми - почти в 20 раз больше, эмбриональными - в 7 раз больше, чем при культивировании клеток в коллагеновом геле (рис. 6).

Рис. 6. Количественное сравнение синтеза мажорных белков ВКМ дермальными фибробластами различного происхождения в фибриновом или коллагеновом геле.

Снижение интенсивности синтеза белков фибробластами в коллагеновом геле по сравнению с фибриновым гелем можно объяснить подавляющим влиянием окружающего клетки коллагена, что соответствует литературным данным (Clark et al., 1995; Grinnell, 1994; Mauch et al., 1988).

При культивировании фибробластов разного происхождения в одинаковых условиях, были обнаружены различия в соотношении синтезируемых клетками белков ВКМ. Например, в двухмерных условиях культивирования соотношение фибронектина и ламинина, синтезируемое нормальными фибробластами было 2:1, Рубцовыми - 4:1, эмбриональными -1:1 (рис. 7).

Рис. 7. Соотношение мажорных белков ВКМ, синтезируемых фибробластами различного происхожден ия в двухмерных условиях культивирования.

Проведенный анализ состава белков ВКМ, синтезируемых фибробластами разного происхождения в двухмерных и трехмерных условиях культивирования, выявил различия не только в интенсивности синтеза белков, но и в размерах выявленных фрагментов. Кроме того, полученные результаты свидетельствовали, прежде всего, о том, что синтезируемые белки ВКМ во всех случаях представляли собой не исходные полноразмерные молекулы, а их фрагменты, образовавшиеся, по-видимому, в результате действия матриксных метаплопротеиназ.

Синтез в двухмерных условиях

...

1 rfl

±

_нф рф эф

| ОКОЛЛ1 ИКР.VIIV Оф.II Оли

3.4 Выявление активности матриксных металлопротеиназ у фибробластов различного происхождения в условиях двухмерного и трехмерного культивирования

Для того чтобы выявить наличие и степень активности ММП у разных типов фибробластов в двухмерных условиях культивирования и в гелях, была выполнена зимография Так как нас интересовали протеиназы, расщепляющие основные белки ВКМ, то в качестве субстрата был выбран желатин Однако при этом следует отметить, что данные протеиназы обладают желатинолигической активностью и расщепляют не нативные белки, а уже подвергшиеся гидролизу другими протеиназами.

С помощью данного метода были выявлены ММП с желатинолигической активностью: желатиназа В (ММП-9) с молекулярной массой 92 кДа, функция которой -очищение раны от некротических тканей, а также желатиназа А (ММП-2), с молекулярной массой 72 кДа, которая принимает участие в ремоделированли синтезируемого матрикса.

Были проанализированы образцы кондиционированной клетками среды и образцы гелей. В качестве контроля была использована среда дня культивирования клеток, содержащая 10 % сыворотки и образцы гелей без клеток, в которых степень активности ММП была выявлена на незначительном уровне (рис. 7).

Культивирование в двухмерных условиях

нф

рф

эф

1с 5е I с 1с 5с 7с 1с Зс 5с 7с

9272-

Культивирование в фибриновом геле

нф рф эф

кДа 1с Зс 7с 10с 1с Зс 7с Юс |с Зс 7с 10с_

92- Г" 1 " ......................

72"

нф рф эф |

921....................................................................

72-1

Культивирование в коллагеновом геле

рф эф I нф рф эф

...7_£.—!!!1. ..'Д—Ь.-----■"£. -----[ кДа __1с_____7е__10с_ Jc_lc_._l.05. _As.__.7c_ _.10с_

Рис. 7. Активность ММП у фибробластов различного происхождения при культивировании их в двухмерных условиях и в гелях: а - анализ кондиционированной клетками среды; б - анализ образцов геля с клетками.

выявленных полос выражали в условньгх единицах полосы в пикселях на интенсивность окраски в на основании полученных данных были построены

Рис. 8.

Количественное сравнение активности ММП у фибробластов в двухмерных и трехмерных условиях культивирования.

в г Полученные данные

свидетельствовали о том, что у дермальных фибробластов разного происхождения при культивировании в одинаковых условиях были выявлены различия в степени активности ММП. Например, при анализе кондиционированной среды при культивировании клеток в коллагеновом геле, степень активности ММП-2 у нормальных была в 1.6 раза ниже, а у эмбриональных фибробластов в 2.3 раза ниже по сравнению с Рубцовыми фибробластами (рис. 8, б).

Кроме того, степень активности ММП у фибробластов также зависела от условий их культивирования. В фибриновом геле фибробласты различного происхождения проявляли более высокую степень активности ММП по сравнению с культивированием их в двухмерных условиях или в коллагеновом геле, за исключением активности ММП-9 у нормальных фибробластов (рис. 8, в). Так как ММП-9 участвует в очищении раны от некротических тканей, можно предполагать, что такая повышенная активность свидетельствует о реакции клеток на избыточное количество окружающего их коллагена. При этом у нормальных фибробластов степень активности ММП-9 была больше по сравнению с другими клетками, что свидетельствовало о том, что данные фибробласты, возможно, наиболее интенсивно удаляли коллаген Высокий уровень активности ММП-2 у эмбриональных фибробластов в коллагеновом геле по сравнению с другими клетками может

Степень активности ММП для (произведение площади окрашенной единицах оптического поглощения) и диаграммы (рис. 8).

Активность ММП 9 ¿онлтшоннроипшш'! с/

Лк-тнвн остъ ММП-2

колп.гепь

Капп.гель

]ву*ыермое

Активность ММП-2 а гелях

фибр.ГвЛЬ

колп.гепь

быть связан с большей активностью ремоделирования синтезируемого матрикса клетками на ранних стадиях формирования соединительной ткани (рис. 8, г).

Таким образом, фибробласты разного происхождения различались в степени активности ММП, которая зависела от условий культивирования клеток.

3.5. Гистологический анализ бноптатов новообразованной дермы после внесения в рану фнбринового или коллагепового гелей с нормальными фибробластами

Для того чтобы сравнить, в какой мере обнаруженные различия влияния микроокружения на синтез белков ВКМ могут воздействовать на процесс восстановления соединительной ткани нормальными фибробластами, находящимися в составе обоих вариантов гелей, гели были внесены в модельную рану экспериментальных животных (крыс). Контролем являлось заживление раны без внесения клеточных продуктов.

Проведенный анализ показал, что при внесении фибринового геля в рану в грануляционной ткани не наблюдали инфильтрацию гигантскими многоядерными клетками, что являлось свидетельством отсутствия воспалительной реакции на инородный материал. В то же время при внесении коллагепового геля была обнаружена инфильтрация гигантскими миогоядерными клетками, что показало наличие незначительной воспалительной реакции.

При подсчете числа сосудов микроциркуляторного русла у крыс с внесением в рану гелей в обеих модификациях существенных различий не обнаружено, однако по сравнению с группой контроля темпы ангиогепеза были увеличены.

Следует обратить внимание на то, что площадь выявленного новообразованного коллагена при внесении в рану фибринового или коллагенового гелей с клетками была в 2 раза больше по сравнению с контрольной группой. При этом необходимо учитывать, что во внесенном в рану коллагеновом геле этот белок уже присутствовал, в то время как фибробласты, внесенные в фибриновом геле, должны были активно его синтезировать, чтобы наработать выявленное количество (табл.).

Таблица

Количественные характеристики восстановления соединительной ткани у крыс различных групп.

Число сосудов Площадь КВ в Выраженность Выраженность

Группа капиллярного поле зрения, ЛГИ, баллы ГИ, баллы

типа(п= 10) мкм2, (п = 5)

Контроль 14.8 ± 1.1 7663.4 ±293.8 2 нет

Коллагеновый 21.6 ±1.8 16160.5 ±481.5 3 1

гель р < 0.05 р < 0.05

Фибриновый 25.4 ±2.1 16617.6 ±219.9 1 нет

гель р < 0.05 р < 0.05

Примечание: представлены средние значения и погрешности. КВ - коллагеновые волокна; ЛГИ - лимфо-гистиоцитарный инфильтрат; ГИ - гигантоклеточный инфильтрат; п - число обсчитанных полей зрения. Отличия опытных групп с контролем считали достоверными при р < 0.05.

Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о возможности применения фибринового геля с заключенными в него нормальными фибробластами с целью лечения дермальных ран различной этиологии.

4. ВЫВОДЫ

1. Фибробласты, выделенные из нормальной, рубцовой и эмбриональной кожи человека, различаются по характеру организации актинового цитоскелета и степени взаимодействия с одними и теми же иммобилизованными белками внеклеточного матрикса.

2. Дермальные фибробласты разного происхождения различаются по количеству и соотношению синтезируемых мажорных белков ВКМ при всех условиях культивирования.

3. Выявляемые белки ВКМ представлены фрагментами полипептидных цепей, что может быть связано с различной степенью активности матриксных металлопротеиназ.

4. Условия культивирования и микроокружение специфически влияют на активность матриксных металлопротеиназ, синтезируемых фибробластами разного происхождения.

5. Наибольшую функциональную активность дермальные фибробласты, независимо от их происхождения, проявляют при культивировании их в фибриновом геле.

6. Трансплантация в экспериментальные раны крыс нормальных фибробластов в фибриновом геле способствует нормальному заживлению раны, о чем свидетельствуют отсутствие воспалительной реакции, интенсивный рост кровеносных капилляров и продуцирование клетками коллагена как структурной основы восстанавливаемой соединительной ткани.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мельцова А.Ж., Сабельников В В., Гриценко В В., Шулепова Е.К., Прокопец А.И , Пинаев Г.П., Блинова М.И., Юдинцева Н.М. 2005. Применение аплогенных дермальных фибробластов в комплексном лечении трофических язв венозной этиологии // Стационарозамещающие технологии. Амбулаторная хирургия. 3 (19): 34-36.

2. Мельцова А.Ж., Гриценко В В., Орловский П.И., Томсон В В., Сабельников В В., Шулепова Е.К., Прокопец А.И., Пинаев Г.П., Блинова М.И., Юдинцева Н.М. 2007.

Применение дермальных фибробластов в комплексном лечении больных трофическими язвами венозной этиологии. Вестник хирургии имени Грекова. 166 (1): 72-77.

3. Юдинцева Н.М., Блинова М.И., Пинаев Г.П. 2008. Особенности организации цитоскелета у фибробластов нормальной, рубцовой и эмбриональной кожи человека, распластанных на белках внеклеточного матрикса. Цитология. 50 (10): 861-867.

4. Протасов М.В., Смагина Л.В., Юдинцева Н.М., Галибин О.В., Пинаев Г.П., Воронкина ИВ. 2009. Возможность прогнозирования эпителизации ран у крыс по изменению активности матриксных металлопротеиназ в раневом экссудате. Цитология. 51(4): 311-313.

5. Туроверова Л.В., Хотин М.Г., Юдинцева Н.М., Магнуссон К.-Э., Блинова МИ, Пинаев Г.П., Тентлер Д.Г. 2009. Метод анализа белков внеклеточного матрикса, синтезируемого клетками в культуре. Цитология. 51 (8): 691-696.

6. Юдинцева Н.М., Плескач Н.М., Смагина Л.В., Блинова М.И., Самусенко И.А., Пинаев Г.П. 2010. Восстановление соединительной ткани в результате трансплантации па раны экспериментальных животных дермалыюго эквивалента на основе фибрина. Цитология. 52 (9): 724-728.

7. Калмыкова Н.В., Блинова М.И., Юдинцева Н.М., Кухарева Л.В., Спичкина О.Г., Пинаев Г.П., Венгилевский В В. Эквивалент кожи и способ его получения. Патент № 2006110711/15(011655) от 3.04.2006.

8. Блинова М.И., Калмыкова Н.В., Юдинцева Н.М., Пинаев Г.П., Серговская Т.В., Синицина В.Ф., Козулин ДА., Григорьева Н.А. 2004. Клеточные продукты на основе культивируемых клеток кожи для лечения ожогов. Нижегородский медицинский журнал, приложение. С. 137-138.

9. Блинова М.И., Калмыкова Н.В., Юдинцева Н.М., Абрамова Н.В., Кухарева Л.В., Шатиль М.А., Бубнова Н.А., Добрыдин О Н., Лапин Ю.А., Поздняков В.Б., Серговская ТВ., Синицина В.Ф., Власов А.С., Пинаев Г.П. 2004. Заместительная клеточная терапия кожи для заживления ран. Цитология. 46 (10)'. 898.

10. Юдинцева Н.М., Мельцова А.Ж., Гриценко В В., Сабельников В В., Шулепова Е.К., Серговская Т.В., Синицина В.Ф., Власов А.С., Блинова М.И., Пинаев Г.П. 2005. Заместительная клеточная терапия для лечения трофических язв венозной этиологии. Материалы конференции «Клиническая трансплантация органов». 14-15 апреля, Москва.

С. 175-176.

11. Мельцова А.Ж., Гриценко В В., Мочапов О.Ю., Сабельников В.В., Шулепова Е.К., Пинаев Г.П., Блинова М.И., Юдинцева Н.М., Калмыкова Н.В., Абрамова Н.В. Опыт лечения

венозных трофических язв с применением дермальных фибробластов. Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Современные проблемы сердечно-сосудистой, легочной и абдоминальной хирургии», посвященная 100-летию со дня рождения академика РАМН Ф.Г.Углова, 2004 г. Санкт-Петербург. С.150-152.

12. Гриценко В В., Мельцова А.Ж., Сабельников В В., Шулепова Е.К., Прокопец А.И., Пинаев Г.П., Блииова М.И., Юдиицева Н.М. 2005. Применение аллогенных дермальных фибробластов в комплексном лечении венозных трофических язв // Сердечно-сосудистые заболевания. IX Ежегодная сессия НЦССХ и Всероссийская конференция молодых ученых. Бюллетень НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН. 6 (5): 295.

13. Воронкина И.В., Протасов М.В., Соловьева М.А., Смагина Л.В., Юдиицева Н.М., Галибин О.В., Пинаев Г.П. 2006. Изучение динамики активности матриксных металлопротеипаз (ММП) после пересадки дермалыюго эквивалента на модели незаживающей раны у крыс. Цитология. 48 (9): 750-751.

14. Юдиицева II.M., Канов Е.М., Смагина Л.В., Воронкина И.В., Блинова М.И., Пинаев Г.П. 2006. Миграция фибробластов кожи человека и синтез ими белков внеклеточного матрикса в трехмерных конструкциях. Всероссийская конференция "Биология клетки в культуре". Цитология. 48 (9): 816.

15. Юдинцева Н.М., Блинова М.И., Пинаев Г.П. 2007. Особенности формирования цитоскелета и фокальных контактов фибробластами нормальной, рубцовой и эмбриональной кожи человека на белках внеклеточного матрикса. Всероссийская конференция «Биология клетки в культуре». Цитология. 49 (9): 808.

16. Yudintseva N., Smagina L., Voronkina I., Vlasov A., Blinova M., Pinaev G. 2007. Fibrin equivalent can be used for treatment different etiology skin wounds. World Conference on Regenerative Medicine. Germany, Leipzig. Regeneration Medicine. 2 (5): 715.

17. Pinaev G., Blinova M., Yudintseva N., Kukhareva L., Voronkina I., Nikolaenko N., Tsupkina N., Shved Y., Spichkina O., Deev R. The provision of adequate microenviroment for stem should determine efficiency of substitute therapy technologies. Материалы Британско-Российского совещания в сотрудничестве с Европейской комиссией. 15-16 марта 2007 г. Москва. С. 5.

18. Blinova M., Pinaev G., Yudintseva N., Kukhareva L., Voronkina I., Spichkina O., Shved Y., Pleskach N., Nikolaenko N., Zupkina N., Shubin N., Deev R., Bochek A., Nudga L., Mikhailov N., Lebedeva M., Bilibin A. Cell Technologies for recovering of structural and functional activity of

damaged tissues. Материалы Британско-Российского совещания в сотрудничестве с Европейской комиссией. 15-16 марта 2007 г. Москва. С. 11.

19. Юдннцева Н.М., Блинова М.И., Минаев Г.П. 2009. Влияние микроокружения на морфологическую и синтетическую активность в культуре дермапьных фибробластов разного происхождения. Всероссийский симпозиум «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий». 12-14 октября, Санкт-Петербург. Цитология. 51 (9): 795.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Арэ А.Ф., Поспелова Т.В., Пинасе Г.П. 1999. Особенности структурной организации актинового цитоскелета нормальных, иммортализованных и трансформированных фибробластов крысы и ее изменения под влиянием белков внеклеточного матрикса. Цитология. 41(8): 707-715.

Черепанова О.А., Калмыкова Н.В., Воронкина ИВ., Аре А.Ф., Горелик Ю.В., Пинаев Г.П. 2002. Различия в характере взаимодействия нормальных и трансформированных кератиноцитов человека с изоформами ламишша. Цитология. 44 (2): 151-158.

Туроверова JI.B., Хотин М.Г., Юдиицева Н.М., К.-Э. Магнуссон, Блинова М.И., Пинаев Г.П., Тентлер Д.Г. 2009. Метод анализа белков внеклеточного матрикса, синтезируемого клетками в культуре. Цитология. 51 (8): 691-696.

Abe R, Donnelly S.C., Peng Т., Bucala 11, Met: C.N. 2001. Peripheral blood fibrocytes: differentiation pathway and migrationto wound sites. J. Immunol. 166: 7556-7562.

Bucala 11, Spiegel L.A., Chesney J., Hogan M., Cerami A. 1994. Circulating fibrocytes define a new leukocyte subpopulation that mediates tissue repair. Mol. Med. 1: 71-81.

Chandrakasan G., Torchia D.A., Pie: K.A. 1967. Preparation of intact monomeric collagen from rat tail tendon and skin and the structure of the nonhelical ends in solution. J. Biol. Chem. 251: 6062-6067.

Chesney J., Met: C., Stavitsky А.В., Bacher M., Bucala R. 1998. Regulated production of type I collagen and inflammatory cytokines by peripheral blood fibrocytes. J. Immunol. 160. 419-425.

Clark R.A., Nielsen L.D., Welch M.P., McPherson J.M. 1995. Collagen matrices attenuate the collagen-synthetic response of cultured fibroblasts to TGF-beta. J. Cell Sci. 108 (3): 1251-61.

Dang C., Ting K., Soo C., Longaker M.T., Loren: H.P. 2003. Fetal wound healing current perspectives. Clin. Plast. Surg. 30 (1): 13-23.

Grinnell F. 1994. Fibroblasts, myofibroblasts, and wound contraction. J. Cell Biol. 124: 401-404.

Kleinman H.K. 1994. Isolation of laminin-1 and type IV collagen from the EHS sarcoma. J.Tissue Culture Metods. 16: 231-233.

Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227: 680-685.

Mackool R.J., Gittes G.K., Longaker M.T. 1998. Scarless healing. The fetal wound. Clin. Plast. Surg. 25(3): 357-65.

Matthew M., Kita H.M., Anthony A., Lonergan M.D., Koch R. 2003. Autocrine Growth Factor Production by Fetal., keloid, and normal dermal fibroblasts. Arch. Facial. Plast. Surg. 5: 26-30.

Mauch C., Hatamochi A., Scharffetter K., Krieg T. 1988. Regulation of collagen synthesis within a three-dimensional collagen gel. Exp. Cell Res. 493-503.

Oliver G.W., Steller-Stevenson W.G., Kleiner D.E. 1999. Zymography, casein zymography, and reverse zymography: activity assays for proteases and their inhibitors. In: Handbook of proteolyc enzymes (Barret A.J., Rawling N.D., Woessner J.F., Eds ), San-Diego, Academic Press. 61-76.

Pulm S.L., Furcht L.T. 1983. Production of laminin and fibronectin by Schwannoma cells: cell- protein interactions in vitro and protein localization in peripheral nerve in vivo. J. Cell. Biol. 96: 1218-1226.

Ruoslanti E., Hayman E.G., Pirschbacher M., Engvall E. 1982. Fibronectin: purification, immunochemical properties and biological activities. Methods in Enzimology. 82: 803-830.

Towbin //., Staehelin T., Gordon J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76: 4350-4.

Автор выражает глубокую признательность сотрудникам Отдела клеточных культур Института цитологии РАН за помощь в работе. Особенно автор благодарен своему научному руководителю проф. Г.П.Пинаеву, М.И.Блиновой, И.В.Воронкиной, Л.В.Смагиной, Л.В.Туроверовой, Д.Г.Тентлеру, И.А.Самусенко.

Подписано в печать 17.09.2010. Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,75 Тираж 100 экз. Заказ 389

Отпечатано в типографии ООО «Адмирал»

199048, Санкт-Петербург, В. О., 6-я линия, д. 59 корп. 1, оф. 40Н

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Юдинцева, Наталия Михайловна

ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Строение кожи человека.

2.2. Основные компоненты внеклеточного матрикса дермы.

2.3. Внеклеточный матрикс рубцовой соединительной ткани.

2.4. Функции фибробластов в процессе заживления раны.

2.5. Особенности дермальных фибробластов различного происхождения.

Цель и задачи исследования.

Положения, выносимые на защиту.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Выделение и культивирование фибробластов.

3.2. Трехмерное культивирование фибробластов.

3.3.Иммунофлуоресцентный анализ организации цитоскелета.

3.4.Иммунофлуоресцентный анализ белков ВКМ, синтезируемых фибробластами.

3.5. Получение белков ВКМ, синтезируемых фибробластами в двухмерных условиях культивирования.

3.6. 808-электрофорез и иммуноблотинг.

3.7. Выявление активности матриксных металлопротеиназ методом зимографии.

3.8. Гистологический анализ биоптатов кожи в процессе заживления ран.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Взаимодействие дермальных фибробластов различного происхождения с иммобилизованными белками ВКМ.

4.2. Морфология фибробластов различного происхождения в гелях. Синтез белков ВКМ в условиях двухмерного и трехмерного культивирования.

4.3.Электрофоретический анализ состава белков ВКМ, синтезируемых фибробластами различного происхождения в условиях двухмерного и трехмерного культивирования. Иммуноблотинг.

4.4. Выявление активности матриксных металлопротеиназ у фибробластов различного происхождения в условиях двухмерного и трехмерного культивтрования.

4.5. Гистологическое исследование биоптатов новообразованной дермы после внесения в рану фибринового и коллагенового гелей с нормальными фибробластами.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Различия в морфологии и функциональной активности дермальных фибробластов в зависимости от их происхождения и условий культивирования"

В настоящее время одной из актуальных проблем современной регенеративной медицины является разработка клеточных технологий, используемых для1 восстановления структурной и функциональной целостности поврежденных органов и тканей. Применение традиционных методов^ лечения, не всегда приводит к заживлению или полному восстановлению исходной структуры ткани. Заживление обширных и глубоких повреждений дермы заканчивается образованием рубца, который нарушает структуру и функции ткани. Исключение составляет заживление повреждений' эмбриональной ткани, при котором не образуются рубцы (Dang et al., 2003; Mackool1 et'al., 1998; Matthew et al., 2003). Причина образования рубцов, до ¡настоящего времени не выяснена.

Основными клетками, создающими структурную основу для формирования кожи в процессе морфогенеза и при регенерации после повреждения, являются-фибробласты. Интенсивно синтезируя белки' внеклеточного матрикса (ВКМ), ростовые факторы и матриксные метгалопротеиназы (ММП), они восстанавливают поврежденную дерму, на которой затем формируется эпидермис. Однако до настоящего времени точно неизвестно, какие именно фибробласты участвуют в процессе заживления раны, и каковы их свойства. Имеются данные, что фибробласты, находящиеся в ране, могут происходить из мононуклеаров крови, которые превращаются в месте повреждения в, так называемые, фиброциты (Abe et al., 2001; Bucala et al., 1994; Chesney et al., 1998). Кроме того, фибробласты из окружающей рану кожи также могут принимать участие в заживлении раны. При этом неизвестно, какие фибробласты остаются > в сформированном рубце после заживления ткани.

В настоящее время в ряде клиник для заживления повреждений кожи применяются клеточные продукты, разработанные также и в Отделе клеточных культур Института цитологии РАН. Один из них - дермальный эквивалент (ДЭ), который представляет собой коллагеновый гель с внесенными в него дермальными фибробластами. Следует учитывать, что, несмотря на положительное воздействие ДЭ на заживление ран, коллаген может оказывать влияние на состав синтезируемых клетками белков ВКМ (Clark et al., 1995; Grinnell, 1994) и снижать скорость их продуцирования (МаисЬ а1., 1988; ТЫе е1 а1., 1991). При культивировании фибробластов в дермальном эквиваленте, приготовленном на основе фибрина, синтез клетками белков ВКМ может отличаться от условий культивирования их,в коллагеновом геле. В связи с тем, что на ранней стадии раневого заживления в организме образуется фибриновый сгусток, который активно перерабатывают и реорганизуют фибробласты, представляет интерес изучение функциональной активности клеток, культивируемых в фибриновом геле.

Так как основными клетками, участвующими в формировании рубца являются фибробласты, то для понимания процесса организации ткани необходимо изучить морфологию фибробластов различного происхождения и синтез ими белков ВКМ в условиях двухмерного (монослой) и трехмерного (фибриновый или коллагеновый гель) культивирования: В настоящее время нет данных, характеризующих полный состав и организацию белков ВКМ, синтезируемых дермальными- фибробластами. Для того чтобы приблизиться к пониманию процесса образования рубцов, необходимо, прежде всего, установить, различаются ли фибробласты, выделенные из нормальной, рубцовой и эмбриональной кожи, между собой по свойствам и по способности формировать микроокружение.

Данное исследование посвящено выявлению особенностей морфологии и функциональной активности дермальных фибробластов разного происхождения, в частности, синтеза ими белков ВКМ и матриксных металлопротеиназ в условиях двухмерного и трехмерного культивирования. Возможно, что полученные знания позволят оптимизировать технологии создания клеточных продуктов, предназначенных для лечения кожных ран различной этиологии.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Юдинцева, Наталия Михайловна

6. выводы

1. Фибробласты, выделенные из нормальной, рубцовой и эмбриональной кожи человека, различаются по характеру организации актинового цитоскелета и степени взаимодействия с одними и теми же иммобилизованными белками внеклеточного матрикса.

2. Дермальные фибробласты разного происхождения различаются по количеству и соотношению синтезируемых мажорных белков ВКМ при всех условиях культивирования.

3. Выявляемые белки ВКМ представлены фрагментами полипептидных цепей, что может быть связано с различной степенью активности матриксных металл опротеиназ.

4. Условия культивирования и микроокружение специфически влияют на активность матриксных металл опротеиназ, синтезируемых фибробластами разного происхождения.

5. Наибольшую функциональную активность дермальные фибробласты, независимо от их происхождения, проявляют при культивировании их в фибриновом геле.

6. Трансплантация в экспериментальные раны крыс нормальных фибробластов в фибриновом геле способствует нормальному заживлению раны, о чем свидетельствуют отсутствие воспалительной реакции, интенсивный рост кровеносных капилляров и продуцирование клетками коллагена как структурной основы восстанавливаемой соединительной ткани.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Юдинцева, Наталия Михайловна, Санкт-Петербург

1. Автандилов Г.Г. 1998. Основы патологоанатомической практики. Руководство М.: РМАПО. 505 с.

2. Албертс Б., Брей Д., Льюис Д., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Д. 1994. Молекулярная биология клетки / под ред. Г.П:Георгиева и Ю.С.Ченцова. М. Мир. 2: 539с.

3. Арэ А.Ф. 2000. Взаимодействие поверхностных рецепторов клетки с различными иммобилизованными и свободными лигандами определяет структура актинового цитоскелета. Диссертация. СПб.

4. Калмыкова Н.В., Черепанова O.A., Горелик Ю.В., Воронкина И.В., Блинова М.И., Пинаев Г.П. 2002. Различное влияние ламинина-1 и ламинина-2/4 на адгезию и миграцию культивируемых кератиноцитов человека. Цитология. 44(8): 792-797.

5. Калмыкова Н.В., Черепанова O.A., Блинова М.И., Пинаев Г.П. 2003. Стабилизирующая роль интегрина a6ß4 в процессе миграции эпидермальных клеток на ламинине-2/4. Трансплантология, Киев. 4(1): 30-32.

6. Туроверова Л.В., Хотин М.Г., Юдинцева Н.М., К.-Э. Магнуссон, Блинова М.И., Пинаев Г.П., Тентлер Д.Г. 2009. Метод анализа белков внеклеточного матрикса, синтезируемого клетками в культуре. Цитология. 51 (8): 691-696.

7. Хэм А., Кормак Д. 1983. Гистология. Перевод с англ. под ред. Афанасьева Ю.И., Ченцова Ю.С. М. Мир. 4: 244.

8. Черепанова O.A., Калмыкова Н.В., Воронкина И.В., Аре А.Ф., Горелик Ю.В., Пинаев Г.П. 2002. Различия в характере взаимодействия нормальных итрансформированных кератиноцитов человека с изоформами ламинина. Цитология. 44 (2): 151-158.

9. Abe R., Donnelly S.C., Peng Т., Bucala R., Metz C.N. 200J. Peripheral blood fibrocytes: differentiation pathway and migrationto wound sites. J. Immunol. 166: 75567562.

10. Abraham D.J., Eckes В., Rajkumar V., Krieg T. 2007. New developments in fibroblast and myofibroblast biology: Implications for fibrosis and scleroderma. Current Rheumatology Reports. 9(2): 136-143.

11. Agren M.S. 1994. Gelatinase activity during wound healing. Br. J. Dermatol. 131: 634-640.

12. Agren M.S. 1999. MMP are required for re-epithelisation of cutaneous wounds. Arch. Derm. Res. 291: 583-590.

13. Agrez M., Chen A., Cone R.I., Pytela R., Sheppard D. 1994. The alpha-v beta 6 integrin promotes proliferation of colon carcinoma cells through a unique region of the beta 6 cytoplasmic domain. J. Cell Biol. 127: 547-556.

14. Are A., Pinaev G., Lindberg U. 1995. The rapid actin cytoskeleton reorganization induced by EGF is different for A431 cells spread on various substrates . Abstr. of 10 European Cytoskeletal Forum, Stockholm, Sweden. 15.

15. Aumailley M., Ronsselle P. 1999. Laminins of the dermo-epidermal junction. Matrix Biol. 18: 19-28.

16. Aumailley M., A. Khal El., Knoss N., Tunggal L. 2003. Laminin 5 processing and its integration into the ECM. Matrix Biol. 22: 49-54.

17. Azzarone В., Macieira-Coelho A. 1982. Heterogeneity of the kinetics of proliferation within human skin fibroblastic cell populations. J. Cell Sci. 57: 177-187.

18. Babu M., Diegelmann Rl, Oliver N. 1989. Fibronectin is overproduced by keloid fibroblasts during abnormal wound healing. Mol. Cell Biol. 9: 1642-1650.

19. Beck K., Hunter I., Engel J. 1990. Structure and functions of laminin: anatomy of a multidomains glycoprotein' FASEB J. 4: 148-160.

20. Bell E., Ivarsson В., Merill C. 1979. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76: 1274-1278.

21. Betz P., Nerlich A., Wilske J., Tubel J., Penning R., Eisenmenger W. 1993. Immunohistochemical localization of collagen types I and VI in human skin wounds. Int. J. Leg. Med: 106(1): 31-34.

22. Birk D.E., Zycband E.I., Winkleman D.A. 1990. Collgen fibrillogenesis in situ. Acad Sci. NY. 580: 176-194.

23. Blitstein-Willinger E. 1991. The role of growth factors in wound healing. Skin Pharmacol. 4: 175-182.

24. Bressler R.S., Bressler C.H. 1989. Functional anatomy of the skin. Clin Podiatr. Med. Surg. 6: 229-246.

25. Bucala R., Spiegel L.A., Chesney J., Hogan M., Cerami A. 1994. Circulating fibrocytes define a new leukocyte subpopulation that mediates tissue repair. Mol. Med. 1:71-81.

26. Chandrakasan G., Torchia D.A., Piez K.A. 1967. Preparation of intact monomeric collagen from rat tail tendon and skin and the structure of the nonhelical ends in solution. J. Biol. Chem. 251: 6062-6067.

27. Chang H.Y., Chi J.T., Dudoit S., Bondre C., van de Rijn M., Botstein D:, Brown P.O. 2002. Diversity, topographic differentiation, and positional' memory in human fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99(20): 12877-82.

28. Chanoki M., Ishii M., Fukai K., Kobayashi H., Hamada T., Muragaki Y., Ooshima A. 1988. Immunohistochemical localization of type V collagen in normal human skin. Arch. Dermatol. Res. 280(3): 145-151.

29. Chesney J., Metz C., Stavitsky A.B., Backer M., Bucala R. 1998. Regulated production of type I collagen and inflammatory cytokines by peripheral blood fibrocytes. J. Immunol. 160: 419-425.

30. Clark R.A.F. 1996. The molecular and cellular biology of wound repair. British J. Plastic. Surgery. 49: 502-522.

31. Clark R.A.F., Lanigan J.M., DellaPelle P., Manseau E., Dvorak H.F., Colvin R.B. 1981. Fibronectin and fibrin provide a provisional matrix for epidermal cell migration during wound repair. J. Invest. Dermatol. 79: 264-269.

32. Clark R.A.F., Nielsen L.D., Welch M.P., McPherson J.M. 1995. Collagen matrices attenuate the collagen-synthetic response of cultured fibroblasts to TGF-beta. J. Cell Sci. 108(3): 1251-61.

33. Couchman J.R., Hook M., Rees D.A., Timpl R. 1983. Adhesion, growth and matrix production by fibroblasts on laminin substrates. Cell Biol. 96: 177-183.

34. Dale P.D., Sherratt J.A., Maini P.K. 1996. The role of fibroblast migration in collagen fibre formation during foetal and adalt dermal wound healing. Proc. R. Soc. London. 263:653-660.

35. Damsky C., Sutherland A., Fisher S. 1993. Extracellular matrix. 5: adhesive interaction in early mammalian embryogenesis, implantation, and placentation. FABES. 7: 1320-1329.

36. Dang C., Ting K., Soo C., Longaker M. T., Lorenz H.P. 2003. Fetal wound healing current perspectives. Clin. Plast .Surg. 30(1): 13-23.

37. Diegelmann R.F., Evans M.C. 2004. Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing. Frontiers in Bioscience. 9: 283-289.

38. Doolittle R.F. 1984. Fibrinogen and fibrin. Annu. Rev. Biochem. 53: 195-229:

39. Ehri K., Leivo I., Argraves W. S., Ruoslahti E., Engvall E. 1990. Merosin, a tissue-specific basement membrane protein, is a laminin-like protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 3264-3268.

40. Elices M.J., Urry L.A., Hemler M.E. 1991. Receptor functions for the integrin VLA-3: fibronectin, collagen, and laminin binding are differentially influenced by arg-gly-asp peptide and by divalent cations. J. Cell Biol. 112: 169-181.

41. Elsdale T., Bard J. 1972. Collagen substrata for studies on cell behavior. J. Cell Biol. 54(3): 626-637.

42. Fleischmajer R., PerlishJ.S., Duncan M. 1983. Scleroderma. A modeltfor fibrosis. Arch. Dermatol. 119: 957-962.

43. Folbnan J., Klagsbrun M. 1987. Angiogenic factors. Science. 235(4787): 442447.

44. Friedman D. W., Boyd C.D., Mackenzie J. W. 1993. Regulation of collagen gene expression in keloids and hypertrophic scars. J. Surg. Res. 55: 214-22.

45. Gailit J., Clark R. A. F. 1996. Studies in vitro on the role of av and plintegrins in the adhesion of human dermal fibroblasts to provisional matrix proteins fibronectin, vitronectin, and fibrinogen. J. Invest. Dermatol. 106: 102-108.

46. Gailit J., Clarke C., Newman D., Tonnesen M.G., Mosesson M.W., Clark R.A.F. 1997. Human fibroblasts bind directly to fibrinogen at RGD sites through integrin aVa3. Exp. Cell Res. 232: 118-126.

47. Gailit J., Pierschbacher M. and Clark R. A. F. 1993. Expression of functional a4pl by human dermal fibroblasts. J. Invest. Dermatol. 100: 323-328.

48. Garner W.L., Karmiol S., Rodriguez J.L., Smith DJ. Jr, Phan S.H. 1993. Phenotypic differences in cytokine responsiveness of hypertrophic scar versus normal dermal fibroblasts. J. Invest. Dermatol. 101(6): 875-879.

49. Gioia M., Monaco S., Van Den Steen P.E., Sbardella D., Grasso G., Marini S., Overall C.M., Opdenakker G., Coletta M. 2009. The Collagen binding domain of gelatinase a modulates degradation of collagen IV by gelatinase B. J. Mol. Biol. 386(2): 419-434.

50. Gorelik J. V., Cherepanova O.A., Voronkina I. V., Diakonov L.A., Blinova M.I., Pinaev G.P. 2001. Laminin-2/4 from human placenta is a better adhesion agent for primary keratinocytes than laminin-1 from EHS sarcoma. Cell Bioli Intern. 25: 395-402.

51. Graf J., Iwamoto Y., Sasaki M., Martin G.R., Kleinman H.K., Robey F.A., Yamada Y. 1987. Identification of an amino acid sequence in laminin mediating cell attachment, chemotaxis, and receptor binding. Cell. 48: 989-996.

52. Grassl E.D., Oegema T.R., Tranquillo R.T. 2002. Fibrin as an alternative biopolymer to type I collagen for fabrication of a media equivalent. J. Biomed. Mater. Res. 60: 607-612.

53. Greiling D., Clark R.A.F. 1997. Fibronectin provides a conduit for fibroblast transmigration from a collagen gel into a fibrin gel. J. Cell Sci. 110: 861-870.

54. Grinnell F. 1978. Cellular adhesiveness and extracellular, substrata. Int. Rev. Cytol. 53: 65-144.

55. Grinnell F. 1994. Fibroblasts, myofibroblasts, and wound contraction. J. Cell Biol. 124:401-404.

56. Grinnell F. Ho C., Tamariz E., Lee D.J., Skuta G. 2003. Denritic fibroblasts in three-dimentional collagen matrix. Mol. Biol. Cell. 14: 384-395.

57. Grunert M., Dombrowski C., Sadasivam M., Manton K., Cool S. M., Nurcombe V. 2007. Isolation of a native osteoblast matrix with aspecific affinity for BMP2. J. Mol. Histol. 38: 393-404.

58. Gunsilius E., Petzer A.L., Stockhammer G., Christian M.K., Gastl G. 2001. Serial measurement of vascular endothelial growth factor and transforming growth factor-B 1 in serum of patients with acute ischemic. Stroke. 32: 275-278.

59. Halfter W., Schurer B., Yip J., Yip L., Tsen G., Lee J.A., Cole G.J. 1997. Distribution and substrate properties of agrin, a heparan sulfate proteoglycan' of developing axonal pathways. J. Comp. Neurol. 383: 1-17.

60. Harper R.A., Grove G. 1979. Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular, dermis: differences in growth potential in vitro. Science. 204: 526-527.

61. Hedman K., Kurkinen M., Alitalo K., Vaheri A., Johansson S., Hook M. 1979. Isolation of the pericellular matrix of human fibroblast cultures. J. Cell Biol. 81: 83-91.

62. Huo Y., Ley K. 2004. Role of platelets in atherosclerosis (review). Trends in Cardiovascular Medicine. 14: 18-22.

63. Hynes R.O., Yamada KM. 1982. Fibronectins: Multifunctional modular glycoproteins. J. Cell Biol. 95: 369-377.

64. Jesior J.C., Miller A., Berthet-Colominas C. 1980. Crystalline three-dimensional packing is general characteristic of type I collagen fibrils. FEBS. Lett. 113(2): 238-40.

65. Kaizuka M, Yamabe H., Osawa H., Okumura K. Fujimoto N. 1999. Thrombin stimulates synthesis of type IV collagen and tissue inhibitor of metalloproteinases-1 by cultured human mesangial cells. J. Am. Soc. Nephrol. 10: 1516-1523.

66. Kirsner R.S, Eaglstein W.H. 1993. The wound healing process. Dermatol. Clinics. 11(4): 629-640.

67. Kleinman H.K. 1994. Isolation of laminin-1 and type IV collagen from the EHS sarcoma. J.Tissue Culture Metods. 16: 231-233.

68. Knapp T.R., Daniels J.R., Kaplan E.N. 1977. Patologic scar formation. Morphologic and biochemical correlated. Am. J. Pathology. 86(1): 47-63.

69. Krane S.M. 1995. Is collagenase (matrix metalloproteinase-1) necessary for bone and other connective tissue remodeling? Clin. Orthop. Relat. Res. 313: 47-53.

70. Krotzsch-Gomez F.E., Furuzawa-Carballeda J., Reyes-Marques R., Quiroz-Hernandez E., Dias de Lion L. 1998. Cytokine expression is downregulated by collagen-polyvinylpyrrolidone in hypertrophic scars. J. Invest. Dermatol. 111(5): 828-836.

71. Kuhn K., Eble J. 1994. .The structural bases of integrin-ligand interactions. Trends in Cell Biology. 4: 256-261.

72. Mackay A.R., Hartzler J.L., Pelina M.D., Thorgeirsson U.P. 1990. The amino-terminal 29- and 72 kDa tumor cell gelatinases to degrade type IV collagen. J. Biol. Chem. 265:21929-34.

73. Mackool R.J., Gittes G.K., Longaker M.T. 1998. Scarless healing. The fetal wound. Clin. Plast. Surg. 25(3): 357-365.

74. Marchant J.K., Zhang G., Birk D.E. 2002. Association of type XII collagen with regions of increased stability and keratocyte density in the cornea. Exp. Eye. Res. 75(6): 683-694.

75. Martin P. 1996. Mechanisms of Wound healing in the embryo and fetus. Current Topics in Developmental Biol. 32: 175-203.

76. Matthew M., Kita H.M., Anthony A., Lonergan M.D., Koch R. 2003. Autocrine growth factor production by fetal, keloid, and normal dermal fibroblasts. Arch. Facial. Plast. Surg. 5: 26-30.

77. Mauch C., Hatamochi A., Scharffetter K., Krieg T. 1988. Regulation of collagen synthesis within a three-dimensional collagen gel. Exp. Cell Res. 493-503.

78. McKeown S.T., Barnes J.J., Hyland P.L., Lundy F.T., Fray M.J., Irwin C.R. 2007. Matrix metalloproteinase-3 differences in oral and» skin fibroblasts. J. Dent. Res. 86(5): 457-62.

79. McNicol A., Israels S.J. 2003. Platelets and anti-platelet therapy. J. Pharmacol. Sci. 93(4): 381-96.

80. Mercandetti M., Cohen A.J. 2005. Wound Healing: Healing and Repair. Emedicine.com.

81. Monical P.L., Kefalides N.A. 1994. Coculture modulates laminin synthesis and mRNA levels in epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts. Exp. Cell Res. 210(2): 154-159.

82. Nagase H., Woessner J.F. 1999. Matrix Metalloproteinases. J. Biol. Chem. 274: 21491-21494.

83. Neidert M.R., Lee E.S., Oegema T.R., Tranquillo R.T. 2002. Enhanced fibrin remodeling in vitro with TGF-P 1, insulin and plasmin for improved tissue-equivalents. Biomaterials. 23(17): 3717-3731.

84. Niesler C. U., Ferguson M. W.J. 2001. TGF-beta superfamily cytokines in wound healing" in TGF-beta and related cytokines in inflammation (Breit S.N., Wahl S.M., ed., Birkhauser), Basel. 173-198.

85. Nishida T., Yasumoto, K., Otori T., Desaki J. 1988. The network structure of corneal fibroblasts in the rat as revealed by scanning electron microscopy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 29: 1887-1890.

86. Nishizawa Y., Fukai F., Natori Y., Kato R., Tanuma S., Katayama T. 1998. Mesangial cell apoptosis induced by a fibronectin fragment. Apoptosis. 3: 407-412.

87. Nnsgens B., Merrill C., Lapiere C., Bell E. 1984. Collagen biosynthesis by cells in a tissue equivalent matrix in vitro. Coll. Relat. Res. 4: 351-363.

88. Odermatt B.F., Lang A.B., Ruttner JR., Winterhalter K.H., Trueb B. 1984. Monoclonal antibodies to human type IV collagen: useful reagents to demonstrate the heterotrimeric nature of the molecule. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7343-7347.

89. Oliver N., Babu M., Diegelmann R. 1992. Fibronectin gene transcription is enhanced in abnormal wound healing. J. Invest. Dermatol. 99: 579-86.

90. O'Toole E. A., Marinkovich M.P., Peavey C.L., Amieva M.R., Furthmayr H., Mustoe T.A. and Woodley D.T. 1997. Hypoxia increases human keratinocyte motility on connective tissue. J. Clin. Invest. 100(11): 2881-2891.

91. O'Toole E.A. 2001. Extracellular matrix and keratinocyte migration. Clin. Exp. Dermatol. 26(6): 525-30.

92. Parks W.C. 1999. Matrix metalloproteinases in repair. Wound Rep. Reg 7: 423432.

93. Pepper M. 2001. Role of the matrix metalloproteinase and plasminogen activatorplasmin systems in angiogenesis. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 21: 1104-1117.

94. PfaffM., Gohring W., Brown J.C., Timpl R. 1994. Binding of purified collagenreceptors (aipi, a2pi) and rgd-dependent integrins to laminins and laminin fragments.

95. Eur. J. Biochem. 225(3): 975-984.

96. Pinnell S.R. 1982. Regulation of collagen synthesis. J. Invest. Dermatol. 79(1): 7376.

97. Postlethwaite A.E, Shigemitsu H., Kanangat S. 2004. Cellular origins of fibroblasts: possible implications for organ fibrosis in systemic sclerosis. Current Opinion in Rheumatol. 16: 733-738.

98. Pulm S.L., Furcht L.T. 1983. Production of laminin and fibronectin by Schwannoma cells: cell- protein interactions in vitro and protein localization in peripheral nerve in vivo. J. Cell. Biol. 96: 1218-1226.

99. Rappolee D.A., MarkD., Bansa M.J., Werb Z. 1988. Wound macrophages express TGF-a and other growth factors in vivo: analysis by mRNA phenotyping. Science. 241: 708-712.

100. Rawlins J.M., Lam W.L., Karoo R.O., Naylor I.L., Sharpe D.T. 2006. Quantifying collagen type in mature burn scars: a novel approach using histology and digital image analysis. J. Burn Care Res. 27(1): 60-65.

101. Rinn J.L., Bondre C., Gladstone H.B., Brown P.O., Chang H.Y. 2006. Anatomic demarcation by positional variation in fibroblast gene expression programs. PLoS Genetics. 2(7): 1084-1096.

102. Ross R., Raines E.W., Bowen-Pope D.F. 1986. The biology of platelet-derived growth factor. Cell. 46: 155-169.

103. Ruoslanti E., Hayman E.G., Pirschbacher M., Engvall E. 1982. Fibronectin: purification, immunochemical properties and biological activities. Methods in Enzimol. 82: 803-830.

104. Russell S.B., Trupin K.M., Rodriguez-Eaton S., Russell J.D., Trupin J.S. 1988. Reduced growth-factor requirement of keloid-derived fibroblasts may account for tumor growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.: 85(2): 587-591.

105. Ryan J. W., Dorer F.E., Stewart J.M. 1974. Hydrolysis of Bradykinin and its higher homologues by angiotensin-converting enzyme. Biochem. J. 141: 915-17.

106. Ryan M.C., Tizard R., VanDevanter D.R., Carter W.G. 1994. Cloning of the LamA3 gene encoding the a3 chain of the adhesive ligand epiligrin. Expression in wound repair. J. Biol. Chem. 269: 22779-22787.

107. Savage K., Swann D.A. 1985. A comparison of glycosaminoglycan synthesis by human fibroblasts from normal skin, normal scar, and hypertrophic scar. J. Invest. Dermatol. 84: 521-526.

108. Schafer I.A., Pandy M., Ferguson R. 1985. Comparative observation of fibroblasts derived from the papillary and reticular dermis of infants and adults: growth kinetics, packing density at confluence and surface morphology. Mech. Ageing Dev. 31: 275-293.

109. Scott P.G. Dodd C.M., Tredget E.E. 1996. Chemical characterization and quantification of proteoglycans in human post-burn hypertrophic and mature scars. Clin. Sci. 90: 417-425.

110. Scott P.G., Ghahary A., Wang J.F. 2007. Molecular and Cellular Hypertrophic Scarring. Saunders Elsevier Inc., Philadelphia. 596-607.

111. Sechler J.L., Takada Y., Schwarzbauer J.E. 1996. Altered rate of fibronectin matrix assembly by deletion of the first type III repeats. J. Cell Biol. 134: 2573-583.

112. Senior R.M., Griffin G.L., Huang J.S., Walz D.A., Deuel T. 1983. Chemotactic activity of platelet a-granule proteins for fibroblasts. J. Cell Biol. 96: 382-385.

113. Seppa H., Grotendorst G., Seppa S., Schiffmann E. and Martin G.R. Platelet-derived growth factor in chemotactic for fibroblasts. J. Cell Biol. 92: 2584-588.

114. Sewry C.A., Dalessandro M., Wilson L.A., Sorokin L.M., Naom I., Bruno S. 1996. Expression of laminin chains in skin in merosin deficient congenital muscular dystrophy. Neuropediatrics. 28: 217- 222.

115. Shapiro S.D. 1998. Matrix metalloproteinase degradation of extracellular matrix: biological consequences. Curr. Opin. Cell Biol. 10: 602-608.

116. Shimokado K., Raines E.W., Madtes D.K., Barrett T.B., Benditt E.P., Ross R. 1985. A significant part of macrophage-derived growth factor consists of two forms of PGDF. Cell1. 43: 277-286.

117. Soder S., Posch E. 2004.The NCI domain of human collagen IV is necessary to initiate triple helix formation. Bioch. Bioph. Res. Communic. 325(1): 276-280.

118. Siler U., Seiffert M., Puch S., Richards A., Torok-Storb B., Muller C.A., Sorokin L., Klein G. 2000. Characterization and functional analysis of laminin isoforms in human bone marrow. Blood. 96: 4194-203.

119. Smith L T., Holbrook K A., MadriJ.A. 1986. Collagen types I, III, and V in human embryonic and fetal skin. Am. J. Anat. 175(4): 507-21.

120. Smith J.W., Ruggeri Z.M., Kunicki T.J., Cheresh D.A. 1990. Interaction of integrins avp3 and glycoprotein Ilb-IIIa with fibrinogen: differential peptide recognition accounts for distinct binding sites. J. Biol. Chem. 265: 12267-12271.

121. Smola H., Stark H.J., Thiekotter G., Mirancea N., Krieg T., Fusenig N.E. 1998. Dynamics of basement membrane formation by keratinocyte-fibroblast interactions in organotypic skin culture. Exp. Cell Res. 239: 399-410.

122. Sorrell J.M., Caplan A.I. 2004. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. J. Cell Science. 117: 667-675.

123. Stricklin G.P., Nanney L.B. 1994. Immunolocalization of collagenase and TIMP in healing human burn wounds. J. Invest. Dermatol. 103(4): 488-492.

124. Stupack D. G. 2005. Integrins as a distinct subtype of dependence receptors. Cell Death Differ. 12: 1021-1030.

125. StupackD.G., Cheresh D.A. 2002. Get a ligand, get a life: integrins, signaling and, cell survival. J. Cell Sci. 115: 3729-3738.

126. Tani T., Lehto V.-P., Virtanen I. 1999. Expression of laminins 1 and 10 in carcinoma cells, and comparison of their role in cell adhesion. Exp. Cell Res. 248: 11'5-121.

127. Thie M., Schlumberger W., Semich R., Rautrerberg J., Robenek H. 1991. Aortic smooth muscle cells in collagen lattice culture: effects on ultrasructure, proliferation and collagen synthesis. Eur. J. Cell Biol. 55:295-304.

128. Timpl R., Tisi D., Talts J.F., Andac Z., Sasaki T., Hohenester E. 2000. Structure and function of laminin LG modules. Matrix Biol. 19: 309-317.

129. Timpl R., Wiedemann H., Van Delden V., Furthmayr H., Kiihn K. 1981. A network model for, the organization of Type IV collagen molecules in basement membrane. Eur. J. Biochem. 120:203-211.

130. Tonnesen M.G., Feng X., Clark R.A. 2000. Angiogenesis in wound healing. .T. Invest. Dermatol. Symp. Proc. 5(1): 40-6.

131. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins-from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.76: 4350-4.

132. Tuan T.L., Song A., Chang S., Younai S., Nimni M.E. 1996. In vitro fibroplasia: matrix contraction, gel growth, and collagen production of fibroblast cultured in fibrin gels. Exp. Cell Res. 223: 127-134.

133. Tuan T.L., Zhu J.Y., Sunl B., Nichter L.S., Nimni Marcel E., Laug WE. 1996. Elevated levels of plasminogen activator inhibitor-1 may account for the altered fibrinolysis by keloid fibroblasts. J. Invest. Dermatol. 106: 1007-101.

134. Unemori E.N., Werb Z. 1986. Reorganization of polymerized actin: a possible trigger for induction of procollagenase in fibroblasts cultured in and on collagen gels. J. Cell Biol. 103: 1021-1031.

135. Vartio T. 1989. Regular fragmentation of hidrogen peroxide-treated fibronectin. J. Biol. Chem. 264(8): 4471-4475.

136. Version K.A., Reichardt L.F. 1993. Extracellular matrix. 2: Role of extracellular matrix molecules and'their receptors in the nervous system. FABES. 7: 996-1003.

137. Wahl S.M. 1999. Transforming growth factor beta. In Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates, Third Edition, Gallin J., Snyderinan R., eds., Lippincott-Raven Publishcrs, Philadelphia. 883-892.

138. Wang J.F., Dodd C., Shankowsky H.A., Scott P.G., Tredget E.E. 2008. Deep dermal fibroblasts contribute to hypertrophic scarring. Laboratory Invest. 88 1278-1290.

139. Weber L., Meigel W.N., Spier W. 1978. Collagen polymorphism in pathologic human scars. Arch. Dermatol. Res. 261: 63-71.

140. Welch M.P., Odland, G.F., Clark R.A.F. 1990. Temporal relationships of F-actin bundle formation, collagen and fibronectin matrix assembly, and fibronectin receptor expression to wound contraction. J. Cell Biol. 110: 133-145.

141. Wenstrup R.J., Florer J.B, Brunskill E. W., Bell S.M., Chervoneva I, Birk D.E. 2004. Type V collagen controls the initiation of collagen fibril assembly. J. Biol. Chem. 279(51): 53331-7.

142. Werb Z. 1997. ECM and cell surface proteolysis: regulating cellular ecology. Cell. 91: 431-442.

143. Whitby D.J., Ferguson M. W.J. 1991. The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neofetal and adult mice. Development. 112: 651-668.

144. Woodley D.T., Bachmann P.B., O'Keefe E.J. 1988. Laminin inhibits human keratinocyte migration. J. Cell Physiol. 136:140-146.

145. Wu C., Bauer J., Juliano R., McDonald J. 1993. The alpha 5 beta 1 integrin fibronectin receptor, but not the alpha 5 cytoplasmic domain, functions in an early and essential step in fibronectin matrix assembly. J. Biol. Chem. 268: 21883-21888.

146. Xu J., Clark R.A.F. 1997. A Three-dimensional collagen lattice induces protein kinase C-C, activity: role in a2 integrin and collagenase mRNA expression. J. Cell Biol. 136: 2473-483.

147. Yang J.F., Olson M.E., Ball D.K., Brigstock D.R., Hart D.A. 2003. Recombinant connective tissue growth factor modulates porcine skin fibroblast geneexpression. Wound Rep. Reg. 11: 411-418.

148. Yamada K.M., Clark R.A.F. 1996. Cellular biology of wound. Plenum Press NY. 611.

149. Yurchenco P.D., Cheng Y.S., Colognato H. 1992. Laminin forms an independent network in basement membranes. J. Cell Biol. 117(5): 1119-1133.

150. Yurchenko R., Furthmayr H. 1984. Self-assembly of basement membrane collagen. Biochem. 23: 1839-1850.

151. Zhang K, Kramer R.H. 1996. Laminin 5 deposition promotes keratinocyte motility. Exp. Cell. Res. 227: 309-322.

152. Zhang D., Pier T., McNeel D.G., Wilding G., Friedl A. 2007. Effects of a monoclonal anti-avp3 integrin antibody on blood vessels — A pharmacodynamic study Investigational New Drugs. 25(1): 49-55.

153. Zillikens D. 1999. Acquired skin desease of hemidesmosomes. J. Dermatol. Sci. 20: 134-154.