Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Расщепление различных структурных элементов РНК под действием химических рибонуклеаз

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Расщепление различных структурных элементов РНК под действием химических рибонуклеаз"

На правах рукописи

КУЗНЕЦОВА ИРИНА ЛЬВОВНА

РАСЩЕПЛЕНИЕ РАЗЛИЧНЫХ СТРУКТУРНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ РНК ПОД ДЕЙСТВИЕМ ХИМИЧЕСКИХ РИБОНУКЛЕАЗ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Новосибирск, 2005 г.

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (бывший Новосибирский институт биоорганической

химии СО РАН)

Научный руководитель:

д.б.н. Зенкова Марина Аркадьевна

официальные оппоненты:

д.б.н. Меркулова Татьяна Ивановна к.х.н. Веньяминова Алия Гусейновна

Ведущая организаций: Ийститут_Физико-химической_биологии

им.А.Н.Белозерского (МГУ)

Защита состоится «» 2005 г. в "часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, пр. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан « Л » 2005 г.

Учёный секретарь диссертационного совета д.х.н. Фёдорова О.С.

я/33?

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Молекулы РНК выполняют в организме множество разноплановых функций от переноса генетической информации до катализа биохимических реакций. Геномы вироидов и многих вирусов представляют собой молекулы РНК. В связи с важной биологической ролью РНК, крайне актуальной является задача разработки методов направленного воздействия на РНК с целью регуляции биологических процессов в клетке в терапевтических целях и с целью инактивации геномов вирусов. Интерес также представляет создание низкомолекулярных химических соединений, способных расщеплять РНК по определенным нуклеотидным последовательностям или в пределах определенных элементов структур РНК. Изучение свойств таких соединений, получивших название искусственных или химических рибонуклеаз, может помочь выявить роль факторов, обеспечивающих высокую эффективность катализа, осуществляемого природными ферментами. Кроме того, соединения, способные расщеплять РНК, представляют интерес в качестве реагентов для исследования структуры РНК.

В последние годы было создано большое число низкомолекулярных соединений, способных расщеплять РНК в физиологических условиях, однако, до настоящего времени не удалось получить эффективных конструкций для расщепления РНК, обладающих активностью, близкой к активности природных катализаторов. Сегодня еще не установлены факторы, обуславливающие различия в чувствительности к расщеплению фосфодиэфирных связей в различных нуклеотидных последовательностях. Исследование факторов, определяющих специфичность и эффективность расщепления РНК химическими рибонуклеазами, является актуальным для создания высокоэффективных искусственных рибонуклеаз.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы являлось изучение расщепления структурных элементов РНК искусственными рибонуклеазами различной природы. В ходе исследования решались следующие задачи:

- определение рибонуклеазной активности химических рибонуклеаз, представляющих собой короткие катионные пептиды и соединения на основе 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана

- изучение влияния последовательности и пространственной структуры РНК на эффективность реакции трансэтерификации под действием этих химических рибонуклеаз

- изучение расщепления фосфодиэфирных связей в боковых петлях РНК под действием химических рибонуклеаз.

ЮС. национальная]

библиотека I 1

С!

о»

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе выполнения работы проведено систематическое исследование новых химических рибонуклеаз, представляющих собой короткие катионные пептиды, имитирующие активные центры природных рибонуклеаз, и соединения на основе соединенных жестким линкером двух остатков 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана, несущих липофильные фрагменты на четвертизованных атомах азота. Впервые показано, что специфичность расщепления РНК этими соединениями зависит как от структуры РНК-субстрата, так и от структуры самих соединений. Впервые проведено систематическое исследование чувствительности связей боковых петель РНК к расщеплению искусственными рибонукпеазами различной природы. Показано, что в оптимальных условиях достигается селективное расщепление РНК по связям в 4- и 7-звенных петлях.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 8 статей. Результаты работы были представлены на конференциях "Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Applications" (Франция, 1998), "Meeting of the Federation of European Biochemical Societies" (Франция, 1999), "Горизонты физико-химической биологии" (Россия, 2000), "Targeting RNA: Artificial Ribonucleases, Conformational Traps and RNA interference" (Россия, 2003), "Entering unexplored world: RNA targeting" (Германия, 2003), "Chemical & Biological Problems of Proteomics" (Россия, 2004), "1st International Symposium on Biomolecules And Related Compounds" (Франция, 2005).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения результатов и их обсуждения и списка цитированной литературы. Работа изложена на 142 страницах, содержит 53 рисунка и 12 таблиц. Библиография включает 180 литературных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Рибонуклеазная активность коротких синтетических катионных пептидов, состоящих из остатков лизина и гистамина

Новые химические рибонуклеазы представляют собой пептидоподобные молекулы (Рис.1), состоящие из каталитического домена, содержащего остаток гистамина, гистидина или метилового эфира гистидина, и РНК-связывающего домена, представляющего собой короткий пептид, состоящий из остатков лизина1. Соединения, построенные по

Все искусственные рибонуклеазы, использованные данной работе, были синтезированы в ЛОРС ИХДФДО СО РАН.

R1-N Н

?2 -NH

рл

hC-C-NfR

Н и нГ

(1)R= —СН,-СН2у=^

(2) R -

—СН-СН2у=^

- - V

(3) R= —с

о—сн,

iH'CHj7=\

fi-o N.

Рис. 1. Химические рибонуклеазы nLm обозначения и структурные формулы

1L2,1L3,1L4, 2L2,2L3,3L4: п = 1,2,3; R1 = Н, R2 = Н

1L0: п = 1; R1= -ВОС, R2 = -CBZ

данному принципу, были обозначены как химические рибонуклеазы nLm, где m - суммарный положительный заряд соединения при pH 7.0; п - код каталитической группы (1 - гистамин, 2 - метиловый эфир гистидина, 3 -гистидин). L указывает, что РНК связывающий домен состоит из остатков L-лизина. РНК-расщепляющую активность соединений nLm исследовали в экспериментах с [3'-32Р]-меченым in vitro транскриптом тРНК-подобного фрагмента TYMV РНК длиной 42 нуклеотида («мини-тРНК»), дрожжевой [3'-Р]-тРНКРИе и синтетическим декарибонуклеотидом [5'-32P]-UUCAUGUAAA.

Стандартными условиями реакции были 50 мМ имидазольный буфер pH 7.0, содержащий 0.2 М KCl, 0.1 мМ EDTA и 100 мкг/мкл суммарной тРНК из Е. coli. Соединения nLm в концентрации 1 мМ способны достаточно эффективно расщеплять все использованные РНК в стандартных условиях за 24 часа. Не выявлено общих корреляций между длиной РНК и скоростью ее расщепления соединениями nLm (Табл. 1). Для соединений 1L0, 2L2, 2L3 и 3L4 скорость расщепления заметно возрастала с увеличением длины субстрата, а для соединений 1L3 и 1L4 - наоборот, падала. Эффективность расщепления мини-тРНК соединениями серии nLm убывает в ряду 2L2 >1L4 > 1L0.1L3 > 1L2, 2L3, 3L4; для тРНК™9 это ряд: 2L2 > 1L4, 1L0 > 3L4 >

Таблица 1. Эффективность расщепления РНК соединениями nLm

РНК, длина (нт) 1L0* 1L2 1L3 1L4 2L2 2L3 3L4

мини-тРНК, 42 65 15 31 69 82 11 28

TPHKPhe, 76 59 0 7 54 96 25 46

ON10, 10 12 0 46 76 0 13 14

"Приведена суммарная степень (%) расщепления РНК за 24 ч. Расщепление РНК проводили в стандартных условиях в присутствии одного из соединений п1_т в концентрации 10'3 М при 37° С.

21.3 > 11.3, 11-2; тогда как для декарибонуклеотида это ряд: 11.4 > 11.3 > 21.4 > 21_3 « а соединения 11_2, 21.2 не расщепляют декарибонуклеотид. Для тРНК^ и мини-тРНК не обнаружено корреляции между суммарным положительным зарядом химической РНКазы и эффективностью расщепления РНК, тогда как линейный декарибонуклеотид с большей скоростью расщепляется химическими рибонуклеазами, несущими положительный заряд +4 и +3. Интересно, что соединение 21_2 проявляет наибольшую активность в случае тРНК^8 и мини-тРНК, но не расщепляет линейный олигорибонуклеотид. Все соединения пЬт эффективно расщепляют несколько определенных фосфодиэфирных связей в РНК. В мини-тРНК расщеплению подвергаются 4 связи, 3 из которых находятся в СА последовательностях в одноцепочечных участках РНК, а четвертая находится в Св последовательности на стыке одноцепочечного и двуцепочечного участков (Рис. 2). Доля расщепления по СА связям составляет 0.81 - 0.87 от общей степени расщепления мини-тРНК. Анализ специфичности расщепления тРНКРИе и декарибонуклеотида показал, что во всех случаях синтетические конструкции проявляют сходную специфичность расщепления: с наибольшей скоростью происходит расщепление связей в Ру-Ри мотивах (СА > 11А > СС»11С, СС, С11).

Рис. 2. Специфичность расщепления мини-тРНК соединениями п1.т. Стрелками обозначены фосфодиэфирные связи, подвергающиеся расщеплению под действием химических рибонуклеаз серии пил. Размер стрелки соответствует эффективности расщепления РНК по данной связи.

Таким образом, было показано, что рибонуклеазная активность соединений п1.т зависит от вторичной структуры РНК-субстрата. Возможно, что расщепление структурированных РНК определяется эффективностью «подгонки» структуры РНК и РНК-связывающего фрагмента химической рибонуклеазы.

2. Рибонуклеазная активность трипептидов, состоящих из аминокислот, входящих в состав активных центров природных рибонуклеаз А и Т1

Были синтезированы трипептиды КНР, НКК ЯКНа, ЫКНа, КМНа, КТНа, в которых расстояния между функциональными группами, расположенными в боковых радикалах аминокислот, близки значениям расстояний между 4

функциональными группами в активных центрах природных ферментов. Рибонуклеазную активность трипептидов исследовали в экспериментах с [5'-32Р]-меченым 21-звенным олигорибонуклеотидом 5'-

UCGAAUUUCCACAGAAUUCGU-3' (далее ON21) и [3'- Р]-меченой тРНК^з, полученной реакцией транскрипции in vitro. Реакцию проводили в 50 мМ Трис-HCI рН 7.0 или 50 мМ имидазольном буфере рН 7.0, в присутствии 0.2 М KCI и 0.5 мМ EDTA. Реакционную смесь (10 мкл), содержащую один из буферов, 10~7 М ON21, 10 мкг/мкл суммарной тРНК из E.coli и одну из химических рибонуклеаз в концентрации 1 мМ, инкубировали при 37°С 24 часа.

Эффективность расщепления ON21 трипептидами зависит как от строения соединений, так и от природы буфера, в котором проводится реакция. В имидазольном буфере расщепление РНК протекает более эффективно, чем в Трис-HCI буфере (Табл. 2). Поскольку все синтезированные трипептиды содержали гистидин или гистамин, можно предположить, что в комбинации с имидазолом буфера с некоторой вероятностью могли образоваться пары имидазолов вблизи расщепляемых связей, аналогично тому, как это происходит в каталитическом центре РНКазы А. Как видно из таблицы 2, независимо от типа буфера наибольшей эффективностью в реакции расщепления РНК обладают трипептиды, содержащие в своем составе остатки аргинина (остаток гистидина или гис-

Таблица 2. Эффективность расщепления 21-звенного олигорибонуклеотида (ON21) синтезированными трипептидами и соединением 2L2*

Соединение Эффективность расщепления, % Суммарный заряд при рН 7.0

50 мМ имидазольный буфер 50 мМ Трис-HCI буфер

KHR 31 17 +4

HKR 55 8 +4

RKHa 31 6 +4

NKHa 1 0 +3

KNHa 2 0 +3

КТНа 10 4 +3

КНа (2L2) 13 9 +2

'Приведена суммарная степень (%) расщепления ОЫ21 за 24 ч. Ошибка эксперимента составляла не более 10%.

тамина присутствует во всех трипептидах): HKR > KHR = RKHa » КТНа. Значительно более высокая рибонуклеазная активность аргинин-содержащих трипептидов по сравнению с другими трипептидами и описанным ранее дипептидом КНаОМе (2L2) может быть объяснена повышенным сродством таких трипептидов к РНК. Однако, как аргинин-содержащие, так и аргинин-несодержащие трипептиды расщепляют TPHKLys примерно с одинаковой эффективностью - 25±5% за 24 часа. Специфичность расщепления РНК трипептидами совпадает со специфичностью расщепления соединениями nLm.

3. Рибонуклеазные свойства соединений на основе двух остатков 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана, соединенных жестким линкером, несущих липофильные фрагменты на четвертизованных атомах азота

Соединения Dxn состоят из двух одинаковых фрагментов, присоединенных к бензольному кольцу (Рис. 3). Каждый фрагмент состоит из остатка DABCO, несущего алифатические заместители разной длины у четвертичного атома азота Обозначение Dxn показывает, что РНК-связывающим фрагментом является DABCO (D), х - положение доменов в бензольном кольце (х = о - орто, т - мета, р - пара), а п указывает на количество метиленовых звеньев в алифатическом заместителе (п = 1, 4, 6 или 12). Соединения Dxn принципиально отличаются от трипептидов и соединений nLm тем, что в их структуру не входит ни имидазол, ни другие РНК-расщепляющие группы.

Рибонуклеазную активность соединений Dxn исследовали в экспериментах с 21-звенным олигорибонуклеотидом (ON21), tPHK*3"8 из дрожжей, 96-звенным фрагментом HIV1 РНК и 190-звенным фрагментом MDR1 мРНК, полученным реакцией транскрипции in vitro, несущими [32Р] метку на 5'-конце. Стандартными условиями реакции были 50 мМ Трис-HCI буфер pH 7.0, содержащий 0.2 М KCl, 0.1 мМ EDTA и 10 мкг/мкл суммарной тРНК из Е. coli.

Рибонуклеазная активность соединений Dxn зависит от их структуры. Степень расщепления ON21 соединениями Dxn строго зависит от длины алифатического заместителя (Рис. 4). Очевидно, что алифатический остаток играет основную роль в рибонуклеазной активности соединений Dxn. Соединения Dx1, содержащие два остатка DABCO, способных связываться с РНК, но не содержащие гидрофобный остаток, практически не способны расщеплять РНК, a Dp4 слабо (2 5%)

"'У /!— (сн,).н

4W

I—(СН,)„Н

Рис. 3. Структура соединений Dxn

0о12 Ош12 ОрИ

Рис. 4. Влияние длины алифатического заместителя (А) и положения замещенных остатков йАВСО в бензольном кольце (Б) на эффективность расщепления олигорибонуклеотида 0Ы21. Расщепление 0Ы21 проводили в присутствии соединений Охп в концентрации 10 мкМ в течении 4 часов.

расщепляет 0N21. При концентрации 10 мкМ Dp6 в 2 раза активнее Dp4, а при увеличении длины алифатического заместителя до 12 метиленовых звеньев (соединение Dpi2) степень расщепления возрастает в 8 раз (Рис. 4А). Соединения, в которых остатки DABCO располагались наиболее удаленно друг от друга (пара-изомеры (Dpn)), расщепляли РНК активнее мета- (Dmn) и орто-изомеров (Don) (Рис. 4Б).

В tPHK™18 наиболее чувствительными к расщеплению соединениями Dxn являются три СА связи: С13-А14, С61-А62, С63-А64, которые также чувствительны к расщеплению и другими природными и химическими расщепляющими агентами (Рис. 5). Однако, в отличие от соединений nLm и трипептидов, в этом случае одновременно происходит расщепление и по другим связям в тРНКРИе, хотя и с меньшей эффективностью. Расщеплению подвергаются фосфодиэфирные связи как в одноцепочечных фрагментах, так и в составе несовершенных стеблей шпилек. Аналогичные результаты были получены и для других РНК-субстратов, различающихся последовательностью и структурой. Все фосфодиэфирные связи в составе СА и UA последовательностей во всех исследованных РНК расщепляются

^и А

G' t "

А

cue G,AU

вуз с'

4 1

G

А »G А

-к С U

Л«

3 А С С А* С G с, С и

А

А г г с

®АСАС С UGUG

А „си

G G <3 G

и*—

С" U А

G

АА\

Рис. 5. Расщепление [5'-32Р]-тРНК™" под действием соединения Охп. Длина стрелки соответствует степени расщепления по данной связи.

тис

под действием соединений Dxn. Примерно половина СС, CG и CU связей и одна из трех UC связей были чувствительны к этому соединению. Из 9 встречавшихся UG связей и 14 GG связей расщепление наблюдалось только в антикодоновой и D-петлях тРНКРИе, соответственно. Четыре AG связи из 21: две в tPHK™8 и две в MDR1 мРНК расщеплялись соединением Dxn, все они находились в петлях РНК, две из них находились в составе идентичных последовательностей AGAG, а две другие - в составе мотивов AGAU и AGCU.

Расщепление РНК другими исследованными соединениями (nLm и трипептидами) происходит преимущественно по одноцепочечным участкам и участкам с нестабильной структурой, поскольку фосфодиэфирные связи в этих участках могут легко принимать конформацию близкую к линейной при физио-логических условиях. Соединения Dxn способны расщеплять, хотя и с меньшей эффективностью, связи и в двуцепочечных участках РНК. Возможно, связывание положительно заряженных остатков DABCO с меж-нуклеотидными фосфатами и гидрофобные взаимодействия, олиго-метиленовых заместителей обуславливают разрыхление (плавление) двуцепочечных участков РНК.

На основании полученных данных можно заключить, что соединения Dxn способны эффективно расщеплять РНК; их рибонуклеазная активность зависит от строения и падает в ряду Dx12 > Dx6 > Dx4 > Dx1 и Dpn > Dmn s Don. Соединения Dxn расщепляют РНК как в одноцепочечных, так и в двуцепочечных участках преимущественно по С-Х и U-X последовательностям, однако причина эффективного расщепления РНК по двуцепочечным участкам пока не выяснена.

4. Направленное расщепление РНК химическими рибонуклеазами по фосфодиэфирным связям в боковых петлях

Известно, что боковые петли в РНК имеют уникальную вторичную и третичную структуру, а выпетленные связи в РНК расщепляются многими химическими рибонуклеазами с высокой эффективностью. Данная часть работы посвящена поиску боковых петель РНК, в которых расщепление химическими рибонуклеазами проходит более эффективно по сравнению с расщеплением в других структурных элементах РНК.

Чувствительность фосфодиэфирных связей в составе различных элементов вторичной структуры к расщеплению под действием химических рибонуклеаз исследовали в экспериментах с 96-звенным фрагментом РНК белка М2 вируса гриппа (далее М2-96 РНК) (Рис. 6А). Известно, что две рядом расположенные Ру-А связи в составе одноцепочечной РНК чрезвычайно чувствительны к действию различных расщепляющих конструкций. Мы предположили, что боковая петля, которая будет

А

Б

\

М2-96 РНК

М2-96 РНК:ОМ22(7/+)

Рис. 6. Вторичная структура М2-96 РНК (А) и ее комплекса с олигодезоксирибонукпеотидом, образующим боковую петлю (Б). Стрелки указывают сайты расщепления М2-96 РНК соединением АВ1.4СЗ в отсутствие (серые) и присутствии (черные) 10 мМ Мд2*.

образовываться в М2-96 РНК вследствие гибридизации с олигонуклеотидом, содержащая последовательность С55А6СА59 (соответствующая последовательности С25бАССА2бо в М2 РНК), будет гиперчувствительна к расщеплению. Для создания боковых петель проводили гибридизацию М2-96 РНК с олигодезоксирибонукпеотидами (длиной 15-18 нт), частично комплементарными данной РНК (Рис. 6). Олигонуклеотиды были обозначены ОЫт(п/±), где т - порядковый номер олигонуклеотида, п - длина искусственной петли, которую олигонуклеотид образует в М2-96 РНК; + или - показывает наличие или отсутствие некомплементарного аденозина в олигонуклеотиде напротив искусственной петли в РНК (Рис. 7). При гибридизации с этими олигонукпеотидами в РНК должны образовываться боковые петли длиной от 1 до 7 нуклеотидов. Для каждой петли определенной длины было исследовано 2 или 3 варианта последовательности: петли длиной до 4 нуклеотидов содержали либо связь С55-А56, либо связь С58-А59; более длинные петли содержали обе эти связи (за исключением петли, образуемой ОЫ17(5/-)) и различались между собой положением последовательности С55АССА59 в петле. В качестве контроля использовался олигонуклеотид (>N1(0), полностью комплементарный последовательности 50-65 М2-96 РНК.

«*= «*= ¡¡*= ¡¡£=- ¡¡*=

и и и и и и и МАи МАИ и«

_ С»- С —— С^ 44 ОС«. _ 4« ОС^- . С*-- ОС в С С^

47 С О*--47 с О ^--в*- С С О* в* СО С в О

А ТА ТА А ТА ТА А ТА ТА 41т*

д ТА ТА А ТА ТА 41 ТА ТА ТА т*

вот» ТА ТА А ТА ТА ТА ТА ТА ТА

с« со со в1со со со со со со ев

с - СО СО СО со СО СО со СО с<3

т. ТА ТА ТА ТА ТА ТА 69 Т А А М Т А А ТА

Т? ТА ТА ТА 84 Т А- НТ*. ТА I й А £ Т*

Од й* «Ои в£ I * ГД--57СЙ&А. «7 С 2 АЛ о£

т* .'а »7 с а* етсал 0£ Х4 ««Т&2

с| в7с2 ^еа са о 0£ 67 од^ Т & Т 4 4 I £

Ос в£ т& ТД I дв- со со И с

ТГ Тй ТА | & со со во с ой ТА ТА т а 1Л

с; со СО 60 С О ТА ТА ТА со со ед V

т 4 ТА ТА ТА СО СО СО А и А и А и

Са со СО СО Аи А и Аи «4 СО М С О Св

Аи Аи А и Аи и со МСО СО С С д С

сХ МСО «со со с с ос и и М д и

и о с С с ос и и Аи о о о

<>N1(0) ОМ2(1/.) О N3(1/+) О N4(1/-) О N5(2/-) ОЫ6(2/+) ОЫ7(2/-) ОМ8(3/-) О N9(3/+) ОН 10(3/-)

Й= ¡*= ¡¡»=

и . II

о ¿2

с о*- -

СО СО

СО со ,

ТА ТА

" У/

ИТАА,, ы ™ Н «I* ТА*

ТА !*'■ 11 Т А д ев I

с О

А и

с о

о с

МАИ

0№1(4/.) 0№2(4/+) ОН13(4/-) ОЫ14(4/-) ОМ16(5/-) ОИ16(5/+) ОМ17{5/-)

»= й= р »= х*= х*= ¡¡¡-г ........ и ..... -¡г

са— г^г-

4вАЦ-

ОС« -

гг У, /

Т А Т А Т А

И Сб.

' - 4 А 64 Т А£ в I в » 64 Т АС йО И СОА О

I-'**-. н I яп-^ _ . -г а " ; •• — м I чя — а

5 А 1 [ з 1 л® « а I -

сел.» «си 9 I а "тао^ ни»,} I

Д"1 СО СО1

со с о 1 с а

ос ос вс

«и 4и ли

с а со со

I«и ««и А"

о о пса

ОН1«(в/-) ОН19(6/+) ан20(6/-) ОЫ21(7/-) ОН22(7/+) <Ж21(7/-) ОМ24(7/-)

Рис. 7. Структуры и последовательности искусственных боковых петель, формирующихся в комплексах М2-96 РНКюлигонуклеотид ОЩт/±). Стрелки указывают на связи, расщепляемые соединением АВ1.4СЗ в отсутствие (серые) и в присутствии (черные) Мд2*. Толщина стрелок соответствует степени расщепления по данной связи.

4.1. Образование искусственных петель

Была изучена способность олигонуклеотидов образовывать комплекс с М2-96 РНК и формировать в ней боковую петлю заданной длины. Образование комплекса проводили в условиях, аналогичных условиям, в которых изучали расщепление РНК химическими рибонуклеазами: [5'-32Р]-М2-96 РНК (10"7 М) инкубировали с олигонуклеотидами (10"6 М) в 50 мМ Трис-HCI буфере pH 7.0, содержащем 0.2 М KCl, 0.1 мМ EDTA при 37° С.

Рис. 8. Связывание олигонуклеотидов с М2-96 РНК. М2-96 РНК (Iff7 М) инкубировали с соответствующим олигонукпеотидом (Iff6 М) в течение 1 ч при 37°С, затем анализировали с помощью электрофореза в нативном 10% ПААГ. Дорожка К - контроль, инкубация М2-96 РНК в отсутствие олиго-нуклеотида. Положение нативной и связанной с олигонукпеотидом М2-96 РНК показано справа.

Образование искусственных петель в комплексах М2-96 РНК с олигонуклеотидами изучали с помощью метода задержки в геле и пробинга структуры комплексов РНКазой Н, РНказой А и 2 М имидазольным буфером рН 7.0. Анализ гибридизации олигонуклеотидов с М2-96 РНК с помощью метода задержки в геле показал, что образуется 1 комплекс в случае олигонуклеотидов, формирующих боковые 1 - 4-звенные петли в РНК и 2 комплекса, отличающихся электрофоретичесвой подвижностью, в случае формирования более длинных петель (Рис. 8).

Расщепление комплексов М2-96 РНК:олигонукпеотид РНКазой Н проходит точно по связям М2-96 РНК, комплементарным олигонуклеотидам (Рис. 9). Однако, в случае формирования боковых петель длиной более 4

Рис. 9. Пробинг структуры комплексов М2-96 РНК:олигонук-леотид РНКазой Н. Дорожка К -расщепление М2-96 РНКазой Н. Дорожки I. и Т1 - расщепление РНК 2 М имидазольным буфером и РНКазой Т1 в денатурирующих условиях, соответственно. Линии справа от каждой дорожки обозначают теоретическую область РНК:ДНК дуплекса.

звеньев, более слабое расщепление наблюдается и по связям, соответствующим связыванию 5'-«плеча» олигонуклеотида. Эти данные свидетельствуют о слабой гибридизации 5'-части этих олигонуклеотидов с комплементарной последовательностью М2-96 РНК. Эти данные согласуются с результатами, полученными методом задержки в геле. По-видимому, комплекс 2 соответствует состоянию, когда только 3'-«плечо» олигонуклеотида связано с РНК, а наблюдаемое слабое расщепление РНК РНКазой Н в З'-области дуплексов соответствует состоянию полного связывания обоих «плеч» олигонуклеотида, т.е. комплексу 1. Расщепление комплексов М2-96 РНК:олигонуклеотид РНКазой А и 2 М имидазольным буфером подтвердило это предположение. Было сделано заключение, что петли длиной до четырех звеньев формируются строго в соответствии с законами комплементарности, а олигонуклеотиды, которые должны формировать более длинные петли в РНК, образуют «дышащие» комплексы, в которых 5'-часть олигонуклеотида слабо связана с РНК.

4.2. Расщепление фосфодиэфирных связей в искусственных петлях соединениями KHR, 2L2, Dpi2 и ABL4C3

Для изучения чувствительности боковых петель к расщеплению были использованы наиболее активные соединения из серий искусственных рибонуклеаз Dxn и коротких катионных пептидов: Dpi2, 2L2 и KHR, а также ранее изученная в нашей лаборатории химическая рибонуклеаза ABL4C3 (Рис. 10). Анализ чувствительности фосфодиэфирных связей в искусственных петлях к РНК-расщепляющим соединениям проводили по общей схеме: 10"7 М [5'-32Р]-М2-96 РНК инкубировали с соответствующим олигонуклеотидом (10"6 М) в 50 мМ Трис-HCI буфере pH 7.0, содержащем 0.2 М KCl, 0.5 мМ EDTA и 0.1 мкг/мкл РНК-носителя. Через 1 час к реакционной смеси добавляли одну из химических рибонуклеаз до оптимальной концентрации (10 мкМ Dp12, 0.5 мМ ABL4C3, 1 мМ 2L2 и 1 мМ KHR) и инкубировали комплекс в присутствии соединения в течение 8 - 24 ч при 37°С.

♦/ а i

ауау^сц—N. ^с^(сн,йт>-да-сн-скг-т=\ Рис. 10. Структура химической лс=7 мЛн рибонуклеазы АВЫСЗ.

° он

Как видно из рисунка 11, во всех случаях в отсутствие олигонуклеотидов М2-96 РНК расщепляется по трем основным сайтам: 1120-А21, 1130-А31 и 1МЗ-А44 (дорожка К1 на рис. 11). Менее интенсивное расщепление проходит по фосфодиэфирным связям после А21, С22, и24, 1)28, С29, и32, вЗЗ и С46. Чувствительность к расщеплению связей С55-А56 и С58-А59, расположенных в нативной М2-96 РНК в стебле шпильки, зависит от типа

T1 L 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 1 K1 K2

(1/-) (1/*) (1/-)(2/-)(2/«-)<2/-)(3/-)(3/t)(34 (4/.) (5/+) (5/-) (8/-) (в/*) (9/-) (7/-) (7/+) (7Л) (7« (0)

Pt/c. fi. Расщепление комплексов M2-96 PHK-.ON соединением KHR. Радиоавтограф 18% денатурирующего ПААГ после разделения продуктов расщепления [5'-32Р]-М2-96 РНК. Дорожки К1 - контроль, расщепление М2-96 РНК в отсутствие олигонуклеотида; К2 - инкубация М2-96 РНК в отсутствие соединения KHR. Дорожки L и Т1 - расщепление РНК 2 М имидазолом и РНКазой Т1 в денатурирующих условиях, соответственно. Номера олигонуклеотидов обозначены сверху над дорожками. Связи, расщепляемые РНКазой Т1 и KHR, обозначены слева и справа от геля, соответственно.

РНК-расщепляющего агента: в случае соединений ABL4C3 и KHR степень расщепления РНК по этим связям в 2 - 5 раз меньше, чем в среднем по основным сайтам, а в случае соединения Dpi2 степень расщепления по этим связям была примерно равной расщеплению по связям U20-A21 и U30-A31. Очевидно, это объясняется повышенной способностью

соединения Dpi 2 расщеплять РНК по связям в двуцепочечных участках. В присутствии контрольного олигонуклеотида ONI(O), полностью комплементарного последовательности 50-65 М2-96 РНК, происходит полное ингибирование расщепления по связям С55-А56 и С58-А59. Боковые петли, образованные в присутствии всех остальных олигонуклеотидов, расщепляются исследованными соединениями, причем расщепление РНК происходит строго по связям С55-А56 и/или С58-А59 в петле. Соединение 2L2 не проявляет повышенной чувствительности к фосфодиэфирным связям в боковых петлях в комплексах М2-96 РНК с олигонуклеотидами. Степень расщепления по связям С55-А56 и С58-А59 во всех комплексах РНКюлигонуклеотид была одинаковая и не отличалась от контроля (М2-96 РНК в свободном состоянии).

Для того чтобы оценить, насколько чувствительность фосфоди-эфирных связей в искусственных боковых петлях отличается от остальных связей, расщепляемых в М2-96 РНК, мы ввели понятие «селективность» -отношение степени расщепления РНК по связям в искусственной боковой петле к суммарной степени расщепления РНК в данном комплексе. Значения селективности расщепления РНК соединением KHR для всех исследованных комплексов представлены на рис. 12. Как видно из гистограммы, чувствительность связей к расщеплению увеличивается с увеличением длины петли. В комплексах, где олигонуклеотид содержит некомплементарный аденозин напротив петли (ONm(n/+)), селективность расщепления всегда выше, чем в комплексах ONn(m/-). Надо отметить, что связывание олигонуклеотидов, содержащих дополнительный аденозин, не отличается от связывания олигонуклеотида без некомплементарного аденозина. Следовательно, разница в селективности расщепления в петле может быть обусловлена более гибкой структурой петли, образующейся напротив дополнительного аденозин, которая является более предпочтительной для реакции трансэтерификации. Петли длиной до 3

Рис. 12. Селективность расщепления комплексов М2-96 PHK.-ON соединением KHR.

нуклеотидов содержали только один СА мотив, часть 4- и 5-звенных петель также содержала одну СА связь (ON11(4/-), ON12(4/+) и ON17(5/-)), а остальные 4- и 5-звенные петли - обе СА связи (ON13(4/-), ON14(4/-), ON15(5/-) и ON16(5/+)), причем одно из оснований последовательности CAGCA (С или А) находилось в составе РНК:ДНК дуплекса 6 и 7-Звенные петли содержали обе С55-А56 и С58-А59 связи в петле. Максимальная селективность расщепления (0.15) одной СА связи наблюдалась в случае четырехзвенной петли, содержащей С55-А56 связь в апикальном положении (комплекс М2-96 PHK:ON12(4/+)). Присутствие в петле второго СА мотива увеличивает селективность расщепления в петле до 0.21 (комплекс РНК с ON19(6/+)). Такие же закономерности были получены и для соединений Dpi2 и ABL4C3. Чувствительность фосфодиэфирных связей, расположенных в боковой петле, к расщеплению химическими рибонуклеазами возрастает в ряду 2L2 < KHR < Dpi 2 < ABL4C3. В случае соединения ABL4C3 селективность расщепления в 7-звенной петле достигает значения 0.5. Эти данные отражают зависимость чувствительности различных типов соединений к вторичной структуре РНК. Трипептиды и соединения nLm, обладающие слабым сродством к РНК, не способны селективно расщеплять выпетленные фосфодиэфирные связи, в то время как соединения, содержащие остаток DABCO, лучше расщепляют связи в петлях, чем остальные связи в РНК. Наибольшая степень расщепления наблюдается в случае фосфодизфирной связи, расположенной в 4-звенной петле, а в случае комплексов с 7-звенной петлей половина суммарной степени расщепления РНК приходится на две СА связи, расположенные в петле.

4.3. Расщепление комплексов М2-96 РНК:олигонуклеотид соединениями ABL4C3, Dpi 2 и KHR в присутствии 10 мМ MgCI2

На рис. 13 показан анализ продуктов расщепления комплексов М2-96 PHK:ON, формирующих 1-, 4- и 7-звенные петли, соединениями ABL4C3, в присутствии и в отсутствие 10 мМ MgCI2. Добавление ионов магния снижает суммарную степень расщепления РНК: в этих условиях расщепление по связям U43-G44 и C46-G47 происходит значительно слабее, чем в отсутствие ионов магния, а по остальным связям (U20-A21 и U30-A31) расщепления в этих условиях почти не наблюдается (в слчае искусственных РНКаз) или становится значительно слабее (в случае РНКазы А), что, видимо, отражает стабилизацию структуры М2-96 РНК Фосфодиэфирная связь в искусственной петле длиной 1 нуклеотид (комплекс M2-96:ON3(1/+)) не расщепляется ни в присутствии, ни в отсутствие MgCI2 ни искусственными РНКазами, ни РНКазой А. В случае 4-и 7-звенных петель, в присутствии 10 мМ MgCI2, наблюдается эффективное расщепление РНК по выпетленным С55-А56 и/или С58-59 связям.

Т1 I. 3(1/+) 13(4/+) 22(7/+)

Рис. 13. Сравнение расщепления комплексов М2-96 РНК:ОЫ соединением АВ1АСЗ в присутствии (+) и в отсутствие (-) 10 мМ МдС12. Радиоавтограф 18% денатурирующего ПААГ после разделения продуктов расщепления [5'-32Р] М2-96 РНК. Дорожка С1 - инкубация М2-96 РНК в отсутствие олигонуклеотидов, дорожка С2 - инкубация М2-96 РНК в отсутствие соединения АВЫСЗ. Дорожки I. и Т1 -расщепление РНК 2 М имидазолом и РНКазой Т1 в денатурирующих условиях, соответственно. Номера олигонуклеотидов обозначены сверху над дорожками. Связи, расщепляемые РНКазой Т1 и соединениями, обозначены слева и справа от радиоавтографа, соответственно.

Значения селективности расщепления М2-96 РНК для 4- и 7-звенных петель в отсутствие и в присутствии МдС12 приведены на рис. 12. Как видно из представленных данных, селективность расщепления, наблюдаемая в присутствии МдС12, превышает соответствующие значения в отсутствие МдС12 для искусственных РНКаз и не отличается для РНКазы А Для соединения КНР в присутствии ионов магния наблюдается падение эффективности расщепления РНК в 2 раза в комплексе с ОМ2(4/+), однако селективность расщепления при этом немного увеличивается. В комплексе с семизвенной петлей суммарная степень расщепления М2-96 РНК соединением КНР немного возрастает, и также несколько увеличивается селективность расщепления по связям в петле. Таким образом, РНКаза А и соединение КНК имитирующее активный центр РНКазы А, проявляют низкую эффективность расщепления по связям в боковых петлях. Для соединений Ьр12 и АВ1.4СЗ суммарная степень расщепления РНК в присутствии ионов магния также снижается в 2 - 3 раза в сравнении с расщеплением в отсутствие ионов магния. Расщепление М2-96 РНК в присутствии ионов магния происходит только по связям 1)43-044 и С46-С47 и выпетленным С55-А56 и/или С58-59 связям. В комплексах М2-96 РНК с олигонуклеотидами ОМ2(4/+) и 0№2(7/+) выпетленные связи расщепляются соединением Ор12 с такой же эффективностью, что и связи 1/43-044 и С46-047. В случае соединения

1 о.»

е 0,7

Я | 0.6

1 в с 0.5

е 1 0.4

§ 1 0.3

1 „ 0,2 0 1

1Ь- Шк-

КНР АВ1.4СЗ Эр12 РНКаза А

АВ1.4СЗ Ор12 РНКаза А

Рис. 14. Селективность расщепления РНК по связям искусственных 4 звенных (комплекс М2-9в РНК:ОЫ12(4/+)) (А) и 7 звенных (комплекс М2-96 РНК:ОЫ22(7/+)) (Б) боковых петлях в присутствии (черные столбцы) и в отсутствие (штрихованные столбцы) 10 мМ МдСЬ- Селективность расщепления определяли как отношение степени расщепления М2-96 РНК в искусственной боковой петле к суммарной степени расщепления М2-96 РНК.

АВ1.4СЗ степень расщепления по каждой СА связи в петле в присутствии МдС12 примерно в 2 раза выше, чем степень расщепления связи 1143-044 или С46-в47, и, следовательно, селективность расщепления возрастает до значений 0.68 и 0.75 в 4- и 7-звенных петлях, соответственно (Рис. 14). Таким образом, образование 4- и 7-звенных искусственных петель в М2-96 РНК полностью изменяет направленность расщепления РНК соединением АВ1-4СЗ.

На сегодняшний день существует два основных подхода к направленному расщеплению РНК химическими РНКазами: (1) конъюгаты РНК-расщепляющей конструкции с антисмысловым олигонуклеотидом и (2) бинарные системы, состоящие из низкомолекулярной РНК-расщепляющей конструкции и комплементарного олигонуклеотида, несущего группировку, повышающую чувствительность определенного участка или связей РНК к расщеплению. Направленное расщепление РНК в такой системе было продемонстрировано для короткой модельной РНК (36 нт), в которой все связи, за исключением целевой, были защищены комплементарным комплексом с олигонуклеотидом.

Подход к направленному расщеплению, предложенный в данной работе, основан на том, чтобы искусственно повысить чувствительность фосфодиэфирных связей РНК за счет их выпетливания. Наши исследования показали, что в 4 - 7-звенных петлях происходит расщепление РНК со скоростью в несколько раз превышающей расщепление фосфодиэфирных связей в остальной части молекулы. Таким образом, с помощью бинарной системы, состоящей из частично комплементарного олигонуклеотида и химической рибонуклеазы АВ1.4СЗ было достигнуто селективное расщепление РНК в петлях длиной 4-7

оснований. Направленное расщепление РНК происходит, видимо, вследствие создания напряжения в петле, необходимого для эффективного протекания реакции трасэтерификации, и стабилизации остальной структуры РНК, что делает ее малочувствительной к расщеплению по остальным связям, кроме боковой петли.

ВЫВОДЫ

1. Исследовано расщепление различных РНК, отличающихся размером и характером пространственной структуры, новыми соединениями, представляющими собой короткие катионные пептиды, имитирующие активный центр РНКазы А, и химические конструкции на основе двух остатков 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана, несущих липофильные фрагменты на четвертизованных атомах азота (соединения Dxn). Показано, что

-короткие катионные пептиды расщепляют РНК в физиологических условиях преимущественно по фосфодиэфирным связям в СА и UA мотивах, расположенных в одноцепочечных участках и участках с напряженной структурой;

-в случае коротких синтетических РНК мишеней наблюдается корреляция между рибонуклеазной активностью катионных пептидов и их суммарным положительным зарядом. В случае природных РНК дипептид КНа (соединение 2L2) и трипептид HKR проявляют наиболее высокую рибонуклеазную активность, а корреляции между суммарным положительным зарядом соединений и их рибонуклеазной активностью не обнаружена;

- соединения Dxn с наибольшей эффективностью расщепляют фосфодиэфирные связи в СА и UA мотивах как в одноцепочечных, так и в двуцепочечных участках РНК, и с несколько меньшей эффективностью связи в СС, CU, CG, UG, UC, AG и GG мотивах;

- рибонуклеазная активность соединений Dxn возрастает с увеличением длины олигометиленового фрагмента и зависит от положения замещенных остатков диазабициклооктана в бензольном кольце: рибонуклеазная активность падает в ряду пара > мета > орто изомеров.

2. Впервые систематически изучена чувствительность к расщеплению фосфодиэфирных связей в 1 - 7-звенных боковых петлях, формируемых в РНК путем гибридизации с олигонуклеотидами, под действием различных соединений: трипептидов (KHR), соединений на основе 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана (Dpi 2) и его конъюгатов с имидазолом (ABL4C3). Показано, что

- эффеетивность расщепления РНК зависит от длины боковой петли, положения в ней расщепляемой фосфодиэфирной связи и от природы РНК-связывающего фрагмента химической рибонуклеазы (1,4-диазабицикло[2.2.2]октан или катионный пептид) Однозвенные боковые петли не расщепляются искусственными рибонуклеазами. В отсутствие ионов Мд2+ наиболее эффективному расщеплению всеми соединениями, подвергается фосфодиэфирная связь в СА мотиве, расположенном в апикальном положении в петлях длиной 4, 6 и 7 оснований, причем для соединения ABL4C3 (конъюгата 1,4-диазабицикпо[2.2 2]октана и имидазола) скорость расщепления в этих боковых петлях была в 2 - 3 раза выше, чем скорость расщепления в остальных участках молекулы РНК.

- в присутствии ионов Мд2+, под действием соединений на основе 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана (Dpi 2) и имидазола (ABL4C3) наблюдается преимущественное расщепление РНК по связям в 4- и 7-звенных петлях, которое достигает 55% и 75% от общей степени расщепления РНК, соответственно На основании полученных данных предложена бинарная система для селективного расщепления РНК, состоящая из олигонуклеотида, формирующего боковую петлю в РНК, и соединения ABL4C3.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Kuznetsova I.L., Zenkova М.А., Gross H.J. and Vlassov V.V. Enhanced RNA cleavage within bulge-loops by an artificial ribonuclease // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. P. 1201-1212.

2. Koval'ov N., Kuznetsova l.4 Burakova E., Silnikov V., Zenkova M. and Vlassov V. Ribonuclease activity of cationic structures conjugated to lipophilic groups// Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 2004. V. 23. P. 977-982.

3. Kuznetsova I., Tuzikov F., Tuzikova N., Tamkovich N., Zenkova M. and Vlassov V. The role of hydrophobic interactions in catalysis of RNA cleavage by 1,4-diazabicyclo[2.2.2]-octane based artificial ribonucleases // Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 2004. V. 23. P. 907-914.

4. Кузнецова И.Л... Ждан H.C, Зенкова М.А., Власов В.В., Сильников В.Н. Искусственные рибонуклеазы. 5. Синтез и рибонуклеазная активность трипептидов, состоящих из аминокислот, формирующих каталитические центры природных рибонуклеаз // Известия Академии Наук. Серия Химическая. 2004 Т. 53. С. 435-442.

5. Kuznetsova I.L. and Sil'nikov V.N. Small ribonuclease mimics. "Artificial Ribonucleases", Ed. Marina A. Zenkova in Nucleic Acids and Molecular Biology, 2004. V. 13. P. 111-128. Springer Verlag.

6. Кузнецова И.Л.. Зенкова M.A., Власов В. В. Направленное расщепление по фосфодиэфирным связям в искусственных боковых петлях // Материалы конференции молодых ученых СО РАН. 2004. С. 53-56.

7. Zhdan N.S., Kuznetsova I.L.. Zenkova М.А., Vlassov A.V., Silnikov V.N., Giege R., Vlassov V.V. Synthesis and characterization of artificial ribonucleases II Nucleosides and Nucleotides. 1999. V. 18. P. 1491-1492.

8. Ждан H.C., Кузнецова И.Л., Власов A.B., Сильников В.Н., Зенкова М.А., Власов В.В. Синтетические рибонуклеазы 1. Синтез и свойства искусственных рибонуклеаз, содержащих РНК-связывающий фрагмент на основе остатков лизина // Биоорган, химия. 1999. Т. 25, С. 723-732.

Подписано к печати "28" апреля 2005г.

Тираж 100 экз. Заказ № 1441. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 356-600

» -894t

РНБ Русский фонд

2006-4 4368

I

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кузнецова, Ирина Львовна

Список сокращений

Введение

Глава 1. Структура боковых петель РНК и их чувствительность к расщеплению

Обзор литературы)

1.1. Основные элементы вторичной структуры РНК

1.2. Методы исследования структуры боковых петель в ДНК- и РНК-дуплексах

1.3. Структура боковых петель в составе РНК

1.3.1. Боковая петля, состоящая из одного основания 12 1.3.1.1 Структура однозвенных А петель, полученная с помощью ЯМР и РСА

1.3.1.2. Структура однозвенной А петли в составе ДНК.РНК дуплекса

1.3.1.3. Расчетная конформация однозвенной А петли в составе дуплекса

1.3.2. Однозвенные G-содержащие петли

1.3.3. Однозвенные U-содержащие петли

1.3.4. Однозвенные С-содержащие петли

1.3.5. Структура петель, содержащих более одного нуклеотида

1.3.6. Влияние ионов Мд2+ на структуру боковой петли

1.4. Изучение структуры РНК, содержащих петли, с помощью электрофореза в нативных условиях и метода индуцированного электрическим полем временного двулучепреломления (transient electric birefringence)

1.5. Термодинамические характеристики дуплексов, содержащих боковые петли

1.6. Чувствительность фосфодиэфирных связей в боковых петлях РНК к расщеплению

1.6.1. Зависимость стабильности РНК от геометрических параметров межнулеотидной связи

1.6.2. Расщепление РНК в боковых петлях

1.6.2.1. Расщепление боковых петель РНК ионами металлов

1.6.2.2. Расщепление искусственных боковых петель РНК конъюгатами олигонуклеотидов и комплексов металлов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Расщепление различных структурных элементов РНК под действием химических рибонуклеаз"

Молекулы РНК выполняют в организме множество разноплановых функций от переноса генетической информации до катализа биохимических реакций [1-4]. Геномы вироидов и многих вирусов представляют собой молекулы РНК [5,6]. В связи с важной биологической ролью РНК, крайне актуальной является задача разработки методов направленного воздействия на РНК с целью регуляции биологических процессов в клетке в терапевтических целях и с целью инактивации геномов вирусов. Интерес также представляет создание низкомолекулярных химических соединений, способных расщеплять РНК по определенным нуклеотидным последовательностям или в пределах определенных элементов чувствительных структур РНК. Изучение свойств таких соединений, получивших название искусственных или химических рибонуклеаз, может помочь выявить роль факторов, обеспечивающих высокую эффективность катализа, осуществляемого природными ферментами. Соединения, способные расщеплять РНК, представляют интерес в качестве реагентов для исследования структуры РНК, для целей биотехнологии.

Химические рибонуклеазы могут быть использованы в качестве каталитических доменов в конъюгатах олигонуклеотидов для сайт-направленного расщепления РНК. Химические соединения, катализирующие расщепление определенных РНК и способные проникать в клетки, служить в качестве регуляторов экспрессии генов, а также противовирусными агентами, инактивирующими РНК-содержаще вирусы (вирус HIV 1, вирус клещевого энцефалита, вирус гриппа и т. д.).

В последние годы было создано большое число низкомолекулярных соединений, способных расщеплять РНК в физиологических условиях [7]. В их число входят комплексы некоторых металлов [8,9], органические соединения, содержащие низкоосновные аминосоединения [10,11] и остатки имидазола [12,13], а также конструкции на основе олиго- и полипептидов [14-16]. Несмотря на интенсивные исследования, ведущиеся с целью создания химических рибонуклеаз, до настоящего времени не удалось получить эффективных конструкций для расщепления РНК, обладающих активностью, близкой к активности природных катализаторов. Сегодня еще не установлены механизмы, обуславливающие различия в реакционной способности фосфодиэфирных связей в различных нуклеотидных последовательностях: по невыясненным причинам различные катализаторы преимущественно расщепляют РНК по фосфодиэфирным связям, находящимся в Pyr-А последовательностях [17,18]. Исследование факторов, определяющих специфичность и эффективность расщепления РНК химическими рибонуклеазами, является актуальным для создания высокоэффективных искусственных рибонуклеаз, способных расщеплять молекулы РНК со скоростью, близкой к расщеплению природными ферментами.

Целью настоящей работы являлось изучение расщепления структурных элементов РНК искусственными рибонуклеазами различной природы. В ходе исследования решались следующие задачи: определение рибонуклеазной активности химических рибонуклеаз, представляющих собой короткие катионные пептиды и соединения на основе 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана;

- изучение влияния последовательности и пространственной структуры РНК на эффективность реакции трансэтерификации под действием этих химических рибонуклеаз;

- изучение расщепления фосфодиэфирных связей в боковых петлях РНК под действием химических рибонуклеаз.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кузнецова, Ирина Львовна

выводы

1. Исследовано расщепление различных РНК, отличающихся размером и характером пространственной структуры, новыми соединениями, представляющими собой короткие катионные пептиды, имитирующие активный центр РНКазы А, и химические конструкции на основе двух остатков 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана, несущих липофильные фрагменты на четвертизованных атомах азота (соединения Dxn). Показано, что

- короткие катионные пептиды расщепляют РНК в физиологических условиях преимущественно по фосфодиэфирным связям в СА и UA мотивах, расположенных в одноцепочечных участках и участках с напряженной структурой;

- в случае коротких синтетических РНК мишеней наблюдается корреляция между рибонуклеазной активностью катионных пептидов и их суммарным положительным зарядом. В случае природных РНК дипептид КНа (соединение 2L2) и трипептид HKR проявляют наиболее высокую рибонуклеазную активность, а корреляции между суммарным положительным зарядом соединений и их рибонуклеазной активностью не обнаружено;

- соединения Dxn с наибольшей эффективностью расщепляют фосфодиэфирные связи в СА и UA мотивах как в одноцепочечных, так и в двуцепочечных участках РНК, и с несколько меньшей эффективностью связи в СС, CU, CG, UG, UC, AG и GG мотивах;

- рибонуклеазная активность соединений Dxn возрастает с увеличением длины олигометиленового фрагмента и зависит от положения замещенных остатков диазабициклоокгана в бензольном кольце: рибонуклеазная активность падает в ряду пара > мета >орто изомеров.

2. Впервые систематически изучена чувствительность к расщеплению фосфодиэфирных связей в 1 - 7-звенных боковых петлях, формируемых в РНК путем гибридизации с олигонуклеотидами, под действием различных соединений: трипептидов (KHR), соединений на основе 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана (Dpi2) и его конъюгатов с имидазолом (ABL4C3). Показано, что

- эффективность расщепления РНК зависит от длины боковой петли, положения в ней расщепляемой фосфодиэфирной связи и от природы РНК-связывающего фрагмента химической рибонуклеазы (1,4-диазабицикло[2.2.2]окган или катионный пептид). Однозвенные боковые петли не расщепляются искусственными рибонуклеазами. В отсутствие ионов Мд2+ наиболее эффективному расщеплению всеми соединениями, подвергается фосфодиэфирная связь в СА мотиве, расположенном в апикальном положении в петлях длиной 4, 6 и 7 оснований, причем для соединения ABL4C3 (конъюгата 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана и имидазола) скорость расщепления в этих боковых петлях была в 2 -3 раза выше, чем скорость расщепления в остальных участках молекулы РНК.

- в присутствии ионов Мд2+, под действием соединений на основе 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана (Dpi 2) и имидазола (ABL4C3) наблюдается преимущественное расщепление РНК по связям в 4 и 7-звенных петлях, которое достигает 55% и 75% от общей степени расщепления РНК, соответственно. На основании полученных данных предложена бинарная система для селективного расщепления РНК, состоящая из олигонуклеотида, формирующего боковую петлю в РНК, и соединения ABL4C3.

Заключение

В данном обзоре рассмотрены структуры боковых петель РНК, полученные с помощью РСА, ЯМР спектроскопии и расчета минимальной энергии. Нуклеотиды в боковой петле РНК могут принимать две основные конформации: основание может принимать выпетленную наружу конформацию или находиться в стэкинге внутри спирали. Возможно, что нуклеотиды в боковой петле способны находится и в том, и в другом состоянии из-за их физической подвижности. Выпетленная конформация стабилизируется межмолекулярными и внутримолекулярными связями, и наблюдается для большинства однозвенных G, U и С петель. Смещение равновесия в сторону конформации с выпетливанием или стэкинг-взаимодействий зависит от типа выпяченного основания и фланкирующих его нуклеотидов, а также от температуры и состава буфера. В случае U-петель большой вклад в структуру вносят Хугстиновские взаимодействия. Однозвенные А-петли наиболее конформационно подвижны и могут принимать как вывернутую, так и спрятанную в спираль конформации, однако стэкинг-взаимодействия внутри спирали являются наиболее энергетически выгодными для этих петель. В петлях, состоящих из более чем одного нуклеотида, наблюдается большее структурное разнообразие, которое возникает вследствие формирования сети водородных связей и стэкинг-взаимодействий между нуклеотидами внутри летли, а также нуклеотидами в петле и фланкирующими их парами оснований.

При анализе РНК-дуплексов, несущих боковую петлю с помощью метода задержки в геле и метода индуцированного электрическим полем временного двулучепреломления было показано, что пиримидин-содержащие боковые петли вносят больший изгиб в структуру спирали, чем пурин-содержащие петли. Во всех случаях угол изгиба возрастает при увеличении размера петли. Стабильность петли зависит от комбинации нуклеотидного состава петли и фланкирующих ее пар оснований. Боковые петли, содержащие более одного нуклеотида, ввиду их бесконечного множества, могут образовывать всевозможные третичные структуры РНК. На сегодняшний день известна только одна конценсусная последовательность, названная "изгиб с поворотом", для которой можно предсказать общий вид третичной структуры РНК. Для других многозвенных боковых петель необходимо детальное изучение образуемой ими структуры.

Согласно представленным данным, боковые петли РНК более чувствительны к расщеплению под действием широкого спектра РНК-расщепляющих соединений, чем апикальные петли шпилек и одноцепочечные участки, и являются привлекательной мишенью для конструирования конъюгатов олигонуклеотидов для сайт-направленного расщепления РНК. Однако систематическое исследование расщепления различных боковых петель РНК было проведено только для ионов металлов.

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Материалы

2.1.1. Реактивы и препараты

В работе использовали дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, дидезоксирибонуклеозидтрифосфаты, рибонуклеозидтрифосфаты, акриламид, N-N'-метиленбисакриламид, агарозу, бактериальную среду LB, бакто-агар, трипсин, культуральную среду DMEM, LiCI04, DTT, MgCI2, EDTA, HEPES, Трис, TEMED, BSA, бромфеноловый синий, ксиленцианол, краситель "Stains-All" производства фирмы "Sigma" (США); гпицерин фирмы "Serva" (Германия); SDS, формамид, персульфат аммония фирмы "Fluka" (Швейцария); мочевину фирмы "ICN" (США). Прочие реактивы были отечественного производства марки "о.с.ч" или "х.ч".

Ферменты Т4 РНК-лигаза, Т4 полинуклеотид-киназа, РНКаза Т1, РНКаза ONE, РНКаза U2, ДНКаза I (без РНКаз) фирмы "Promega" (США); бактериальная щелочная фосфатаза, РНКаза Т2 и V1 производства "Boehringer Mannheim" (Германия); эндонуклеазы рестрикции SsfNI и Bst2U\ производства "Сибэнзим" (Россия), РНК-полимераза фага Т7 и Taq ДНК-полимераза, производства Лаборатории биоорганической химии ферментов ИХБФМ СО РАН.

Клетки Escherichia coli штамм XL-Blue, любезно предоставленные к.б.н. Филиппенко М. Л. (ИХБФМ СО РАН). у32Р]АТР и [5-32Р]рСр с удельной активностью ~ 4000 Кю/ммоль производства "Биосан" (Россия).

В работе использовали амппификатор OMN-E фирмы "Hybaid" (США), спектрофотометр "Милихром" (НПО "Научприбор", г. Орел, Россия), вакуумную сушку для акриламидных гелей "LABCONCO" (США), рН-метр "Orion 41 OA" (США), счетчик радиоактивности "Canberra Packard" (США), фосфоримиджер "Molecular Imager" фирмы "Bio-Rad" (США), центрифуги "Contron Т-42К" (Франция) и "Eppendorf 5415" (Германия), "J21-Beckman" (США). Гели радиоавтографировали с использованием рентгеновской пленки "РЕНЕКС" (Россия).

Искусственные рибонуклеазы, использованные в работе, синтезированы в Лаборатории органического синтеза ИХБФМ СО РАН к. х. н. Д. А. Коневцом, аспирантами Н. А. Ждан и Е. А. Бураковой под руководством д.х.н. В. Н.Сильникова.

Для приготовления всех буферных растворов и реакционных проб использовали воду, очищенную на установке MilliQ фирмы Millipore (США). Все буферы подвергали стерилизации фильтрованием через нитроцеллюлозный фильтр (0,22 мкм) фирмы Millipore (США).

2.1.2. Плазмиды

Для получения М2 РНК вируса гриппа, "minihelix" тРНК, тРНК™1® реакцией транскрипции in vitro использовали плазмиды pSVK3M2 из коллекции ЛБНК ИХБФМ СО РАН, TYA-22, любезно предоставленную профессором Р. Жьеже (IBMC du CNRS, Страсбург, Франция) и pYC90, любезно предоставленную к.х.н. Н.А. Моор.

2.1.3. Олигорибонуклеотиды и РНК

Олигорибонуклеотиды ONIO r(UUCAUGUAAA) и ON21 r(UCGAAUUUCCACAGAAUUCGU) были синтезированы в фуппе химии олигорибонуклеотидов ИХБФМ СО РАН фосфитамидным методом на синтезаторе ASM-102U (ТОО "БИОССЕТ", Новосибирск) и очищены ионообменной и обращеннофазовой хроматографией или препаративным электрофорезом в денатурирующих условиях. Чистоту олигонуклеотидов проверяли с помощью электрофореза в 15% ПААГ в денатурирующих условиях, визуализацию олигонуклеотидов в геле проводили с помощью окраски Stains-All. 96-звенный фрагмент РНК HIV1 и 190-звенный фрагмент MDR1 РНК были любезно предоставлены к.б.н. Мироновой Н.Л. и к.б.н. Костенко Е. В. (ИХБФМ СО РАН).

2.1.4. Олигодезоксирибонуклеотиды

Олигодезоксирибонуклеотиды были синтезированы в технологической лаборатории ИХБФМ СОРАН с помощью стандартного фосфитамидного метода и выделены с помощью ионообменной и обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Для амплификации 96-звенного фрагмента М2 РНК вируса гриппа в качестве праймеров использовали олигонуклеотиды M2-96-dir

ACAAGCTTTAATACGACTCACTATAGGGCCTTCTACGGAAGGAGTACC и M2-96-rev

- CGAGACAAAATGACTGTCGTCAGC.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кузнецова, Ирина Львовна, Новосибирск

1. Yarns М. Boundaries for an RNA world // Curr. Opin. Chem. Biol. 1999. V. 3. P. 260-267.

2. Doudna J.A. and Rath V.L. Structure and function of the eukaryotic ribosome: the next frontier// Cell. 2002. V. 109. P. 153-156.

3. Doherty E.A., BateyR.T., Masquida B. and Doudna J.A. A universal mode of helix packing in RNA// Nat. Struct. Biol. 2001. V. 8. P. 339-343.

4. Sanger H. L., Klotz G., Riesner D., Gross H.J. and Kleinschmidt A.K. Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. V. 73. P. 3852-3856.

5. Jewell N.A. and Mansky L.M. In the beginning: genome recognition, RNA encapsidation and the initiation of complex retrovirus assembly // J. Gen. Virol. 2000. V. 81. P. 1889-1899.

6. Zenkova M.A. Artificial Nucleases. In Nucleic Acids and Molecular Biology, Heidelberg, Springer Verlag. 2004. V. 13.

7. Trawick B.N., Daniher A.T. and Bashkin J.K. Inorganic mimics of ribonucleases and ribozymes: from random cleavage to sequence-specific chemistry to catalytic antisense drugs // Chem. Rev. 1998. V. 98. P. 939-960.

8. Morrow J.R. Artificial ribonucleases //Adv. Inorg. Biochem. 1994. V. 9. P. 41-74.

9. Shinozuka K., Nakashima Y., Shimizu K. and Sawai H. Synthesis and characterization of polyamine-based biomimetic catalysts as artificial ribonuclease // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2001. V. 20. P. 117-130.

10. Yoshinari K. and Komiyama M. Facile cleavage of RNAs by oligoamines. Correlation between amine structure and catalytic activity // Nucleic Acids Symp. Ser. 1991. N. 25. P. 2324.

11. Podyminogin M.A., Vlassov V.V. andGiege R. Synthetic RNA-cleaving molecules mimicking ribonuclease A active center. Design and cleavage of tRNA transcripts // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 5950-5956.

12. Zenkova M., Beloglazova N., Sil'nikov V., Vlassov V. and Giege R. RNA cleavage by 1,4-diazabicyclo2.2.2.octane-imidazole conjugates // Methods Enzymol. 2001. V. 341. P. 468-490.

13. Perello M., BarbierB. and Brack A. Hydrolysis of oligoribonucleotides by alpha-helical basic peptides//Int. J. Pept. Protein Res. 1991. V. 38. P. 154-160.

14. Tung C.H., Wei Z, Leibowitz M.J. and Stein S. Design of peptide-acridine mimics of ribonuclease activity// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 7114-7118.

15. Kierzek R. Hydrolysis of oligoribonucleotides: influence of sequence and length // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 5073-5077.

16. Kaukinen U., Lyytikainen S., Mikkola S. and Lonnberg H. The reactivity of phosphodiester bonds within linear single-stranded oligoribonucleotides is strongly dependent on the base sequence // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. P. 468-474.

17. Smith J.S. and Nikonowicz E.P. NMR structure and dynamics of an RNA motif common to the spliceosome branch-point helix and the RNA-binding site for phage GA coat protein // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 13486-13498.

18. Borer P.N., Lin Y., Wang S., Roggenbuck M.W., Gott J.M., Uhienbeck O.C. and Peiczer I. Proton NMR and structural features of a 24-nucleotide RNA hairpin // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 6488-6503.

19. De Guzman R.N., Wu Z.R., Stalling C.C., Pappalardo L., Borer P.N. and Summers M.F. Structure of the HIV-1 nucleocapsid protein bound to the SL3 psi-RNA recognition element // Science. 1998. V. 279. P. 384-388.

20. Hansen J.L., Ippolito J.A., Ban N., Nissen P., Moore P.B. and Steitz T.A. The structures of four macrolide antibiotics bound to the large ribosomal subunit // Mol. Cell. 2002. V. 10. P. 117128.

21. Hansen J.L., Moore P.B. and Steitz T.A. Structures of five antibiotics bound at the peptidyl transferase center of the large ribosomal subunit // J. Mol. Biol. 2003. V. 330. P. 1061-1075.

22. Ippolito J.A. and Steitz T.A. The structure of the HIV-1 RRE high affinity rev binding site at 1.6 A resolution // J. Mol. Biol. 2000. V. 295. P. 711-717.

23. Fourmy D., Yoshizawa S. and Puglisi J.D. Paromomycin binding induces a local conformational change in the A-site of 16 S rRNA // J. Mol. Biol. 1998. V. 277. P. 333-345.

24. Ogle J.M., Brodersen D.E., demons W.M., Tarry M.J., Carter A.P. and Ramakrishnan V. Recognition of cognate transfer RNA by the 30S ribosomal subunit // Science. 2001. V. 292. P. 897-902.

25. Carter A.P., demons W.M., Brodersen D.E., Morgan-Warren R.J., Hartsch Т., Wimberly В. T. and Ramakrishnan V. Crystal structure of an initiation factor bound to the 30S ribosomal subunit II Science. 2001. V. 291. P. 498-501.

26. Hansen J.L., Schmeing T.M., Moore P.B. and Steitz T.A. Structural insights into peptide bond formation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 11670-11675.

27. Kim C.H., Kao C.C. and Tinoco /.Jr. RNA motifs that determine specificity between a viral replicase and its promoter// Nat. Struct. Biol. 2000. V. 7. P. 415-423.

28. Wimberly B.T., Brodersen D.E., demons W.M.Jr., Morgan-Warren R.J., Carter A.P., Vonrhein C., Hartsch T. and Ramakrishnan V. Structure of the 30S ribosomal subunit // Nature. 2000. V. 407. P. 327-339.

29. Robertus J.D., Ladner J.E., Finch J.T., Rhodes D., Brown R.S., Clark B.F. and Klug A. Structure of yeast phenylalanine tRNA at 3 A resolution // Nature. 1974. V. 250. P. 546-551.

30. Kim S.H., Suddath F.L., Quigley G.J., McPherson A., Sussman J.L., Wang A.H., Seeman N.C. and Rich A. Three-dimensional tertiary structure of yeast phenylalanine transfer RNA // Science. 1974. V. 185. P. 435-440.

31. Wyatt J.R. and Tinoco I.Jr. RNA structural elements and RNA function. In The RNA World, eds. R. Gesteland and J. Atkins, NY, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor. 1993. P. 465-496.

32. Woese C.R. and Gutell R.R. Evidence for several higher order structural elements in ribosomal RNA// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 3119-3122.

33. Nikulin A., Serganov A., Ennifar E., Tishchenko S., Nevskaya N. Shepard W., Portier C., Garber M., Ehresmann В., Ehresmann C., Nikonov S. and Dumas P. Crystal structure of the S15-rRNA complex II Nat. Struct. Biol. 2000. V. 7. P. 273-277.

34. Klein D.J., Schmeing T.M., Moore P.B., and Steitz T.A. The kink-turn: a new RNA secondary structure motif// EMBO J. 2001. V. 20. P. 4214-4221.

35. Cech T.R. Self-splicing of group I introns // Annu. Rev. Biochem. 1990. V. 59. P. 543-568.

36. Moore M.J., Query C.C. and Sharp P.A. Splicing of precursors to mRNA by the splicosome. In The RNA World, eds. R. Gesteland and J. Atkins, NY, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor. 1993. P. 303-357.

37. Wittop Koning Т.Н. and Schumperli D. RNAs and ribonucleoproteins in recognition and catalysis // Eur. J. Biochem. 1994. V. 219. P. 25-42.

38. Wimberty В., Varani G. and Tinoco I.Jr. The conformation of loop E of eukaryotic 5S ribosomal RNA// Biochemistry. 1993. V. 32. P. 1078-1087.

39. Frank D.N., Ellington A.E. and Pace N.R. In vitro selection of RNase P RNA reveals optimized catalytic activity in a highly conserved structural domain // RNA. 1996. V. 2. P. 11791188.

40. Schmitz M. and Tinoco I.Jr. Solution structure and metal-ion binding of the P4 element from bacterial RNAse P RNA// RNA. 2000. V. 6. P. 1212-1225.

41. Iwai S., Pritchard C., Mann D.A., Karn J. and Gait M.J. Recognition of the high affinity binding site in rev-response element RNA by the human immunodeficiency virus type-1 rev protein // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 6465-6472.

42. PuglisiJ.D., Tan R., Calnan B.J., FrankelA.D. and Williamson J.R. Conformation of the TAR RNA-arginine complex by NMR spectroscopy // Science. 1992. V. 257. P. 76-80.

43. Correll C.C., Munishkin A., Chan Y.L., Ren Z., Wool I.G. and Steitz T. A. Crystal structure of the ribosomal RNA domain essential for binding elongation factors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 13436-13441.

44. Xiong Y. and Sundaralingam M. Two crystal forms of helix II of Xenopus laevis 5S rRNA with a cytosine bulge II RNA. 2000. V. 6. P. 1316-1324.

45. Jiang L, Suri A.K., Fiala R. and Patel D.J. Saccharide-RNA recognition in an aminoglycoside antibiotic-RNA aptamer complex II Chem. Biol. 1997. V. 4. P. 35-50.

46. Carter A.P., Clemons W.M., Brodersen D.E., Morgan-Warren R.J., Wimberty B.T. and Ramakrishnan V. Functional insights from the structure of the 30S ribosomal subunit and its interactions with antibiotics // Nature. 2000. V. 407. P. 340-348.

47. Batey R.T., Rambo R.P. and Doudna J.A. Tertiary Motifs in RNA Structure and Folding // Angew Chem Int Ed Engl. 1999. V. 38. P. 2326-2343.

48. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. Москва, "Мир". 1987. С. 261

49. Dock-Bregeon А.С., Chewier В., Podjarny A., Johnson J., de Bear J.S., Gough G.R., Gilham P.T. and Moras D. Crystallographic structure of an RNA helix: UfUAJeAfe // J. Mol. Biol. 1989. V. 209. P. 459-474.

50. Pyle A.M. Metal ions in the structure and function of RNA // J. Biol. Inorg. Chem. 2002. V. 7. P. 679-690.

51. AuffingerP. and Westhof E. RNA solvation: a molecular dynamics simulation perspective // Biopolymers. 2000. V. 56. P. 266-274.

52. Auffinger P. and Westhof E. Hydrophobic groups stabilize the hydration shell of. 2-0-methylated RNA duplexes //Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2001. V. 40. P. 4648-4650.

53. AuffingerP. and WesthofE. Water and ion binding around r(UpA)12 and d(TpA)i2 oligomers--comparison with RNA and DNA (CpG)12 duplexes // J. Mol. Biol. 2001. V. 305. P. 1057-1072.

54. Hermann T. and Patel D.J. Stitching together RNA tertiary architectures // J. Mol. Biol. 1999. V. 294. P. 829-849.

55. Weeks K.M. and Crothers D.M. Major groove accessibility of RNA // Science. 1993. V. 261. P. 1574-1577.

56. Gralla J. and Crothers D.M. Free energy of imperfect nucleic acid helices. II. Small hairpin loops // J. Mol. Biol. 1973. V. 73. P. 497-511.

57. Dale Т., Smith R. and Serra M.J. A test of the model to predict unusually stable RNA hairpin loop stability // RNA. 2000. V. 6. P. 608-615.

58. Antao V.P. and Tinoco I. Jr. Thermodynamic parameters for loop formation in RNA and DNA hairpin tetraloops II Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 819-824.

59. Antao V.P., Lai S.Y. and Tinoco I.Jr. A thermodynamic study of unusually stable RNA and DNA hairpins // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 5901-5905.

60. Butcher S.E., Allain F.H. and Feigon J. Solution structure of the loop В domain from the hairpin ribozyme // Nat. Struct. Biol. 1999. V. 6. P. 212-216.

61. Correll C.C., Freeborn В., Moore P.B. and Steitz T.A. Metals, motifs, and recognition in the crystal structure of a 5S rRNA domain // Cell. 1997. V. 91. P. 705-712.

62. Cate J.H., Gooding A.R., Podell E., Zhou K., Golden B.L., Szewczak A.A., Kundrot C.E., Cech T.R. and Doudna J.A. RNA tertiary structure mediation by adenosine platforms // Science.1996. V. 273. P. 1696-1699.

63. Tamura M. and Holbrook S.R. Sequence and structural conservation in RNA ribose zippers // J. Mol. Biol. 2002. V. 320. P. 455-474.

64. Schroeder R., Barta A. and Semrad K. Strategies for RNA folding and assembly // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2004. V. 5. P. 908-919.

65. Seggerson K. and Moore P.B. Structure and stability of variants of the sarcin-ricin loop of 28S rRNA: NMR studies of the prokaryotic SRL and a functional mutant // RNA. 1998. V. 4. P. ;1203-1215.

66. Moine H., Cachia С., WesthofE., Ehresmann B. and Ehresmann C. The RNA binding site of S8 ribosomal protein of Escherichia coli: Selex and hydroxyl radical probing studies // RNA.1997. V. 3. P. 255-268.

67. Luebke K.J. and Tinoco I.Jr. Sequence effects on RNA bulge-induced helix bending and a conserved five-nucleotide bulge from the group I introns // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 1167711684.

68. Cate J.H., Gooding A.R., Podell E., Zhou K„ Golden B.L, Kundrot C.E., Cech T.R. and Doudna J.A. Crystal structure of a group I ribozyme domain: principles of RNA packing II Science. 1996. V. 273. P. 1678-1685.

69. Portmann S., Grimm S., Workman C., Usman N. and Egli M. Crystal structures of an A-form duplex with single-adenosine bulges and a conformational basis for site-specific RNA self-cleavage//Chem. Biol. 1996. V. 3. P. 173-184.

70. Joshua-Tor L., Frolow F., Appella E., Hope H., Rabinovich D. and Sussman J.L Three-dimensional structures of bulge-containing DNA fragments II J. Mol. Biol. 1992. V. 225. P. 397431.

71. Joshua-Tor L, Rabinovich D., Hope H., Frolow F., Appella E., and Sussman J.L The three-dimensional structure of a DNA duplex containing looped-out bases // Nature. 1988. V. 334. P. 82-84.

72. Nikonowicz E.P., Meadows R.P. and Gorenstein D.G. NMR structural refinement of an extrahelical adenosine tridecamer d(CGCAGAATTCGCG)2 via a hybrid relaxation matrix procedure II Biochemistry. 1990. V. 29. P. 4193-4204.

73. Tereshko V., Wallace S.T., Usman N., Wincott F.E. and Egli M. X-ray crystallographic observation of "in-line" and "adjacent" conformations in a bulged self-cleaving RNA/DNA hybrid // RNA. 2001. V. 7. P. 405-420.

74. Sudarsanakumar С., Xiong Y. and Sundaralingam M. Crystal structure of an adenine bulge in the RNA chain of a DNA.RNA hybrid, d(CTCCTCTTC)-r(gaagagagag) // J. Mol. Biol. 2000. V. 299. P. 103-112.

75. Xiong Y. and Sundaralingam M. Crystal structure of a DNA.RNA hybrid duplex with a polypurine RNA r(gaagaagag) and a complementary polypyrimidine DNA d(CTCTTCTTC) // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 2171-2176.

76. Zacharias M. and Sk/enar H. Conformational analysis of single-base bulges in A-form DNA and RNA using a hierarchical approach and energetic evaluation with a continuum solvent model //J. Mol. Biol. 1999. V. 289. P. 261-275.

77. Szewczak A.A. and Moore P.B. The sarcin/ricin loop, a modular RNA//J. Mol. Biol. 1995. V. 247. P. 81-98.

78. Szewczak A.A., Moore P.B., Chang Y.L. and Wool I.G. The conformation of the sarcin/ricin loop from 28S ribosomal RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 9581-9585.

79. Xiong Y., Deng J., Sudarsanakumar C. and Sundaralingam M. Crystal structure of an RNA duplex r(gugucgcac)(2) with uridine bulges //J. Mol. Biol. 2001. V. 313. P. 573-582.

80. Wedekind J. E. and McKay D. B. Crystal structure of a lead-dependent ribozyme revealing metal binding sites relevant to catalysis // Nat. Struct. Biol. 1999. V. 6. P. 261-268.

81. Diener J.L. and Moore P.B. Solution structure of a substrate for the archaeal pre-tRNA splicing endonucleases: the bulge-helix-bulge motif// Mol. Cell. 1998. V. 1. P. 883-894.

82. Ippolito J.A. and Steitz T.A. A 1.3-A resolution crystal structure of the HIV-1 trans-activation response region RNA stem reveals a metal ion-dependent bulge conformation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 9819-9824.

83. Deng J., Xiong Y., Sudarsanakumar C., Shi K. and Sundaralingam M. Crystal structures of two forms of a 14-mer RNA/DNA chimer duplex with double UU bulges: a novel intramolecular U*(A x U) base triple // RNA. 2001. V. 7. P. 1425-1431.

84. Chen Y.W., Bycroft M. and Wong K.B. Crystal structure of ribosomal protein L30e from the extreme thermophile Thermococcus celer: thermal stability and RNA binding // Biochemistry. 2003. V. 42. P. 2857-2865.

85. Pitt S.W., MajumdarA., Serganov A., Patel D.J. and Al-Hashimi H.M. Argininamide binding arrests global motions in HIV-1 TAR RNA: comparison with Mg2+-induced conformational stabilization // J. Mol. Biol. 2004. V. 338. P. 7-16.

86. Bhattacharyya A., Murchie A.I. and Lilley D.M. RNA bulges and the helical periodicity of double-stranded RNA//Nature. 1990. V. 343. P. 484-487.

87. Bhattacharyya A. and Lilley D.M. The contrasting structures of mismatched DNA sequences containing looped-out bases (bulges) and multiple mismatches (bubbles) // Nucleic Acids Res. 1989. V. 17. P. 6821-6840.

88. Lilley D.M. Kinking of DNA and RNA by base bulges // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 7140-7142.

89. Zacharias M. and Hagerman P.J. Bulge-induced bends in RNA: quantification by transient electric birefringence // J. Mol. Biol. 1995. V. 247. P. 486-500.

90. Groebe D.R. and Uhlenbeck O.C. Thermal stability of RNA hairpins containing a four-membered loop and a bulge nucleotide // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 742-747.

91. Znosko B.M., Silvestri S.B., Volkman H., Boswell B. and Serra M.J. Thermodynamic parameters for an expanded nearest-neighbor model for the formation of RNA duplexes with single nucleotide bulges// Biochemistry. 2002. V. 41. P. 10406-10417.

92. Longfellow C.E., Kierzek R. and Turner D.H. Thermodynamic and spectroscopic study of bulge loops in oligoribonucleotides // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 278-285.

93. Papanicolaou C., Gouy M. and Ninio J. An energy model that predicts the correct folding of both the tRNA and the 5S RNA molecules // Nucleic Acids Res. 1984. V. 12. P. 31-44.

94. Zhu J. and Wartell R.M. The effect of base sequence on the stability of RNA and DNA single base bulges // Biochemistry. 1999. V. 38. P. 15986-15993.

95. Li Y. and Breaker R.R. Kinetics of RNA degradation by specific base catalysis of transesterification involving the 2'-hydroxyl group // J. Am. Chem. Soc. 1999. V. 121. P. 53645372.

96. Soukup G.A. and Breaker R.R. Relationship between internucleotide linkage geometry and the stability of RNA// RNA. 1999. V. 5. P. 1308-1325.

97. Oivanen M., Kuusela S. and Lonnberg H. Kinetics and mechanisms for the cleavage and isomerization of the phosphodiester bonds of RNA by bronsted acids and bases // Chem. Rev. 1998. V. 98. P. 961-990.

98. Thompson J.E., Kutateladze T.G., Schuster M.C., Venegas F.D., Messmore J.M. and Rains R.T. Limits to catalysis by ribonuclease A11 Bioorg. Chem. 1995. V. 23. P. 471-481.

99. Usher D.A. and McHale A.H. Hydrolytic stability of helical RNA: a selective advantage for the natural 3',5'-bond // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. V. 73. P. 1149-1153.

100. Sassanfar M. and Szostak J.W. An RNA motif that binds ATP // Nature. 1993. V. 364. P. 550-553.

101. Ferrin Т.Е., Huang C.C., Jarvis L.E. and Langridge R. The MIDAS display system // J. Mol. Graphics. 1988. V. 6. P. 13-27.

102. Hosaka H., Sakabe I., Sakamoto K., Yokoyama S. and Takaku H. Sequence-specific cleavage of oligoribonucleotide capable of forming a stem and loop structure // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 20090-20094.

103. Bibillo A., Figlerowicz M., Ziomek K. and Kierzek R. The nonenzymatic hydrolysis of oligoribonucleotides. VII. Structural elements affecting hydrolysis // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2000. V. 19. P. 977-994.

104. Zagorowska I., Kuusela S. and Lonnberg H. Metal ion-dependent hydrolysis of RNA phosphodiester bonds within hairpin loops. A comparative kinetic study on chimeric ribo/2'-0-methylribo oligonucleotides // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 3392-3396.

105. Ciesiolka J., Michalowski D., Wrzesinski J., Krajewski J. and Krzyzosiak W.J. Patterns of cleavages induced by lead ions in defined RNA secondary structure motifs // J. Mol. Biol. 1998. V. 275. P. 211-220.

106. Husken D., Goodall G., Blommers M.J., Jahnke W., Hall J., Haner R., and Moser H.E Creating RNA bulges: cleavage of RNA in RNA/DNA duplexes by metal ion catalysis // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 16591-16600.

107. Kaukinen U., Bieleki, L, Mikola, S., Adamiak, R.W. and, Lonnberg, H. The cleavage of phosphodiester bonds within small RNA bulges in the presence and absence of metal ion catalysts//J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2. 2001. V. 2. P. 1024-1031.

108. Vlassov V., Abramova Т., Godovikova Т., Giege R. and Silnikov V. Sequence-specific cleavage of yeast tRNA(Phe) with oligonucleotides conjugated to a diimidazole construct // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997. V. 7. P. 39-42.

109. Hall J., Husken D., Pieles U., Moser H. E. and Haner R. Efficient sequence-specific cleavage of RNA using novel europium complexes conjugated to oligonucleotides // Chem. Biol. 1994. V. 1.P. 185-190.

110. Kolasa K., Morrow J. and Sharma A. Trivalent lanthanide ions do not cleave RNA in DNA-RNA hybrids // Inorg. Chem. 1993. V. 32. P. 3983 3984.

111. Hall J., Husken D. and Haner R. Towards artificial ribonucleases: the sequence-specific cleavage of RNA in a duplex // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 3522-3526.

112. De Mesmaeker A., Haener R., Martin P. and Moser H. Nucleic Acids and Molecular Biology // Acc. Chem. Res. 1995. V. 28. P. 366 374.

113. HanerR., Hall J., Pfutzer A. and Husken D. Development of artificial ribonucleases // Pure and Appl. Chem. 1998. V. 70. P. 111-116.

114. Putnam W.C., Daniher A.T., TrawickB.N. andBashkin J.K. Efficient new ribozyme mimics: direct mapping of molecular design principles from small molecules to macromolecular, biomimetic catalysts// Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 2199-2204.

115. Astrom H. and Stromberg R. Synthesis of new OBAN's and further studies on positioning of the catalytic group//Org. Biomol. Chem. 2004. V. 2. P. 1901-1907.

116. Astrom H., Williams N.H. and Stromberg R. Oligonucleotide based artificial nuclease (OBAN) systems. Bulge size dependence and positioning of catalytic group in cleavage of RNA-bulges // Org. Biomol. Chem. 2003. V. 1. P. 1461-1465.

117. Niittymaki T. and Lonnberg H. Sequence-selective cleavage of oligoribonucleotides by 3d transition metal complexes of 1,5,9-triazacyclododecane-functionalized 2-O-methyl oligoribonucleotides// Bioconjug. Chem. 2004. V. 15. P. 1275-1280.

118. Madder A., Ehrl R. and Stromberg R. Stabilization of RNA bulges by oligonucleotides containing 2'-naphthylmethyl-2'-deoxytubercidine II Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2003. V. 22. P. 1289-1291.

119. Nakano S., Uotani Y., Uenishi K., Fujii M. and Sugimoto N. Site-selective RNA cleavage by DNA bearing a base pair-mimic nucleoside // J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127. P. 518-519.

120. ГловерД. Клонирование ДНК. Методы. Мир. 1988.

121. Maniatis Т., Fritsch Е., and Sambrook J. (1989) Molecular cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. P. 1.21 -1.74

122. England Т.Е., Bruce A.G. and Uhlenbeck O.C. Specific labeling of 3' termini of RNA with T4 RNA ligase // Methods Enzymol. 1980. V. 65. P. 65-74.

123. Silberklang M., Prochiantz A., Haenni A. L. and Rajbhandary U. L. Studies on the sequence of the З'-terminal region of turnip-yellow-mosaic-virus RNA // Eur. J. Biochem. 1977. V. 72. P. 465-478.

124. Ehresmann C., Baudin F., Mougel M., Romby P., Ebel J. P., and Ehresmann B. Probing the structure of RNAs in solution // Nucleic Acids Res. 1987. V. 15. P. 9109-9128.

125. Meador J.Z*. and Kennell D. Cloning and sequencing the gene encoding Escherichia coli ribonuclease I: exact physical mapping using the genome library // Gene. 1990. V. 95. P. 1-7.

126. Vlassov A., Vlassov V. and Uhlenbeck O. RNA hydrolysis catalyzed by imidazole as a reaction for studying the secondary structure of RNA and complexes of RNA with oligonucleotides II Dokl. Akad. Nauk. 1996. V. 349. P. 411-413.

127. Donis-Keller H. Site specific enzymatic cleavage of RNA // Nucleic Acids Res. 1979. V. 7. P. 179-192.

128. Petyuk V.A., Zenkova M.A., Giege R. and Vlassov V.V. Hybridization of antisense oligonucleotides with the 3'part of tRNA(Phe) // FEBS Lett. 1999. V. 444. P. 217-221.

129. Mathews D.H., Sabina J., Zuker M. and Turner D.H. Expanded sequence dependence of thermodynamic parameters improves prediction of RNA secondary structure // J. Mol. Biol. 1999. V. 288. P. 911-940.

130. Lane D., Prentki P. and Chandler M. Use of gel retardation to analyze protein-nucleic acid interactions// Microbiol. Rev. 1992. V. 56. P. 509-528.

131. Morrow J.R. Hydrolytic cleavage of RNA catalyzed by metal ion complexes // Met. Ions Biol. Syst. 1996. V. 33. P. 561-592.

132. Morrow J.R. and Iranzo O. Synthetic metallonucleases for RNA cleavage // Curr. Opin. Chem. Biol. 2004. V. 8. P. 192-200.

133. Vlassov V.V., Zuber G., Felden В., Behr J.P. and Giege R. Cleavage of tRNA with imidazole and spermine imidazole constructs: a new approach for probing RNA structure // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 3161-3167.

134. RiepeA., BeierH. and Gross H.J. Enhancement of RNA self-cleavage by micellar catalysis II FEBS Lett. 1999. V. 457. P. 193-199.

135. Silnikov V. and Vlassov V. Design of site-specific RNA-cleaving reagents H Russian Chemical Reviews. 2001. V. 70. P. 491-508.

136. Breslow K. and Labelle M. Sequential general base-acid catalysis in the hydrolysis of RNA by imidazole II J. Am. Chem. Soc. 1986. V. 108. P. 2655-2659.

137. Sprinzl M. On the structure of phenylalanine tRNA from yeast. Spin-label studies // Eur. J. Biochem. 1974. V. 49. P. 595-605.

138. Giege R., Felden В., Zenkova M.A., Sil'nikov V.N. and Vlassov V.V. Cleavage of RNA with synthetic ribonuclease mimics II Methods Enzymol. 2000. V. 318. P. 147-165.

139. Zhong M. and Kailenbach N.R. Mapping tRNA and 5S RNA tertiary structures by charge dependent Fe(ll)-catalyzed cleavage//J. Biomol. Struct. Dyn. 1994. V. 11. P. 901-911.

140. Endo M., Hirata К., Inokawa Т., Matsumura К., Komiyama M., Ihara Т., Sueda S. and Takagi M. Site-specific hydrolysis of yeast tRNAPhe by anthraquinone-glycine and anthraquinone-iminodiacetate conjugates//Nucleic Acids Symp. Ser. 1995. 109-110.

141. Komiyama M. and Inokawa T. Selective hydrolysis of tRNA by ethylenediamine bound to a DNA oligomer// J. Biochem. (Tokyo). 1994. V. 116. P. 719-720.

142. Komiyama M., Inokawa Т., Shiiba Т., Takeda N. Yoshinari K. and Yashiro M. Molecular design of artificial hydrolytic nucleases and ribonucleases // Nucleic Acids Symp. Ser. 1993. N. 29. P. 197-198.

143. Guan L.L., Totsuka R., Kuwahara J., Otsuka M. and Sugiura Y. Cleavage of yeast tRNA(phe) with Ni(lll) and Co(lll) complexes of bleomycin // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. V. 191. P. 1338-1346.

144. Huttenhofer A., Hudson S., Noller H. F. and Mascharak P. K. Cleavage of tRNA by Fe(ll)-bleomycin // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 24471-24475.

145. Vlassov V. and Vlassov A. Cleavage of RNA by imidazole. In Artificial Ribonucleases ("Nucleic Acids and Molecular Biology"), Heidelberg, Springer Verlag, V. 13. 2004. P. 49-88.

146. Зенкова M., Чумакова H., Власов А., Комарова H., Вениаминова А., Власов В., Сильников В. Синтетические конструкции, функционально имитирующие рибонуклеазу А // Молекул. Биология. 2000. Т. 34. С. 456-460.

147. Strater N., Lipscomb N., Klabunde Т. and Krebs В. Two-metal ion catalysis in enzymatic acyl- and phosphoryl-transfer reactions // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996. V. 35. P. .20242055.

148. Wilcox D.E. Binuclear Metallohydrolases // Chem. Rev. 1996. V. 96. P. 2435-2458.

149. Kovall R.A. and Matthews B.W. Type II restriction endonucleases: structural, functional and evolutionary relationships // Curr. Opin. Chem. Biol. 1999. V. 3. P. 578-583.

150. Isel С., Ehresmann С., Keith G., Ehresmann B. and Marquet R. Initiation of reverse transcription of HIV-1: secondary structure of the HIV-1 RNA/tRNA(3Lys) (template/primer) // J. Mol. Biol. 1995. V. 247. P. 236-250.

151. Helm M., Brule H., Degoul F., Cepanec C., Leroux J.P., Giege R. and Florentz C. The presence of modified nucleotides is required for cloverleaf folding of a human mitochondrial tRNA//Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 1636-1643.

152. Calnan B.J., Tidor В., Biancalana S., Hudson D. and Frankel A.D. Arginine-mediated RNA recognition: the arginine fork//Science. 1991. V. 252. P. 1167-1171.

153. Kierzek R. Nonenzymatic hydrolysis of oligoribonucleotides // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 5079-5084.

154. Martin K. and Helenius A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: the viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import//Cell. 1991. V. 67. P. 117-130.

155. Fischer W.B. and Sansom M.S. Viral ion channels: structure and function // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1561. P. 27-45.

156. Ito Т., Gorman O.T., Kawaoka Y., Bean W.J. and Webster R.G. Evolutionary analysis of the influenza A virus M gene with comparison of the M1 and M2 proteins // J. Virol. 1991. V. 65. P. 5491-5498.

157. Dimitrov R.A. and Zuker M. Prediction of hybridization and melting for double-stranded nucleic acids // Biophys. J. 2004. V. 87. P. 215-226.

158. Misra V.K. and Draper D.E. On the role of magnesium ions in RNA stability// Biopolymers. 1998. V. 48. P. 113-135.

159. Zenkova M. and Beloglazova N. Site-specific artificial ribonucleases: conjugates of oligonucleotides with catalytic groups. In Artificial Nucleases ("Nucleic Acids and Molecular Biology"), Heidelberg, Springer Verlag, V. 13. 2004. P. 189-222.

160. Kuzuya A., Mizoguchi R., Morisawa F., Machida К and Komiyama M. Metal ion-induced site-selective RNA hydrolysis by use of acridine-bearing oligonucleotide as cofactor // J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. P. 6887-6894.