Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Распространенность вирусов гриппа птиц в Республике Таджикистан: иммунологический мониторинг

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Распространенность вирусов гриппа птиц в Республике Таджикистан: иммунологический мониторинг"



На правах рукописи

СЛЙДАРОВА МУХАЙЁ МАХМАДРАХИМОВНА

А

РАСПРОСТРАНЁННОСТЬ ВИРУСОВ ГРИППА ПТИЦ В РЕСПУБЛИКЕ ТАДЖИКИСТАН: ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата ветеринарных наук

1 2 МАЙ 2011

ДУШАНБЕ-2011

4846489

Работа выполнена на Научно - производственном предприятии «Биологические препараты» Таджикской академии сельскохозяйственных наук (НПП БП ТАСХН)

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук

Амирбеков Муллоджон

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Соловьёв Борис Васильевич

доктор ветеринарных наук, профессор Масимов Нусрат Абулфатович

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности.

Защита диссертации состоится «17» мая 2011 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 006.033.01 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно - исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я. Р. Коваленко Российской Академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии) по адресу: 109428, Москва, Рязанский проспект, д.24 корп. 1, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ПТУ ВИЭВ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан « апреля 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Грипп птиц (кур) - острая высококонтагиозная вирусная болезнь птиц, характеризующаяся общим угнетением, отёками, поражением органов дыхания, пищеварения и ЦНС. Болезнь впервые описал Перрончито (1880) в Италии под названием «экссудативный тиф кур». Впоследствии она неоднократно возникала во многих странах мира, где её диагностировали под разными названиями, в том числе как европейскую или классическую чуму птиц. Вирусную природу возбудителя (классической, европейской) чумы птиц установил Чентани в 1901 г., а в 1955 г. возбудитель был идентифицирован как influenza virus А, и после этого с 1971 г. болезнь стали называть гриппом птиц (Конопаткин А.А., Бакулов И.А. и др., 1983, Кельмик Д.У., 2003).

В течение XX века вспышки болезни, вызванные разными штаммами, происходили во многих регионах мира, в том числе в Северной и Южной Америке, на севере Африки, в странах Среднего и Дальнего Востока, Европе и бывшем Советском Союзе. Из числа выделенных возбудителей высокой вирулентностью для птиц обладают вирусы подтипов H5N1 и H7N7.

В природе у диких птиц встречаются практически все известные подтипы вирусов гриппа типа А. При этом существует механизм рекомбинации поверхностных антигенов гемагглютинина и нейраминидазы. Вирусы, которые авирулентны для своих носителей, имеют широкий круг хозяев, включая другие виды птиц и млекопитающих. Важным фактором эффективной передачи таких вирусов другим видам, в частности водоплавающим птицам, может быть репликация вирусов в кишечном тракте птиц; этот резервуар в живой природе играет важную роль в экологии вирусов гриппа (Джавадов Э.Д., Придыбайло Н.Д., Амдий Э.М., Мирзоев Д.М., Салимов, Т.М., 2008). Весьма важным фактом, определяющим актуальность наших исследований, является определенная связь между заболеванием людей и вспышками гриппа птиц. В последние годы некоторые подтипы вирусов птичьего гриппа зачислены в число опасных для человека. В Соединенных Штатах Америки каждый год более 200 000 пациентов

3

обращаются в больницы из - за гриппа и регистрируется приблизительно 36 G00 смертельных случаев. В 328 случаях вирус подтипа H5N1 вызвал заболевание и в 200 случаях со смертельным исходом (Lipman D. Journal of Virology, January 2008).

В Таджикистане проблема гриппа птиц изучена не достаточно. В республике до настоящего времени не зарегистрирован высокопатогенный подтип вируса H5N1, но в различные годы были обнаружены штаммы других подтипов ВГП: 6-й (1972 г.), 7-й (1976-1978 гг.) и 4-й (1978-1979, 1983-1984 гг.) (Салимов Т.М., Фатхудинова М.Ф., 2008). Вопрос нельзя считать закрытым, принимая во внимание постоянную циркуляцию вируса H5N1 в соседних странах, возможность переноса возбудителей с дикими птицами, маршруты перелёта которых пролегают через территорию Таджикистана.

В Таджикистане наряду с птицеводческими хозяйствами промышленного типа значительное поголовье кур содержится в мелких фермерских и частных подворных хозяйствах. Эта птица обычно имеет свободный выгул, и по этой причине возможны множественные контакты с дикими и синантропными птицами - потенциальными носителями штаммов вируса гриппа. Следовательно, наблюдение за распространением гриппа птиц весьма важно для прогнозирования возможных эпизоотических вспышек болезни и организации противоэпизоотических мероприятий.

Кроме того, согласно «Санитарного кодекса наземных животных'') -официального издания Международного эпизоотического бюро, членом которого является Республика Таджикистан, все страны обязаны предоставлять другим странам - членам МЭБ любую информацию по предупреждению распространения опасных болезней животных (ст. кодекса 1.1.2.).

Цель и задачи исследования. В связи с вышеизложенным была поставлена цель - провести мониторинг гриппа птиц с использованием иммунологических (серологических) тестов для определения возможной циркуляции вирусов в популяции домашней птицы в различных регионах Республики Таджикистан и разработать рекомендации по предупреждению эпизоотических вспышек болезни.

Для достижения указанной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Отработать методики иммунологического (серологического) мониторинга вируса гриппа птиц различных подтипов.

2. Разработать тсст - систему для выявления антител к высокопатогенному вирусу гриппа птиц Н5ШвИФА.

3. Изучить возможность выявления потенциальных очагов возбудителя гриппа с гемагглютинином Н7 и НЗ с использованием вирусов гриппа лошадей «А/лошадь1/Прага56» (Н7Ы7) и «А/лошадь2/Майами 63» (ГОШ).

4. Провести серологическое обследование домашних птиц (в РТГА) для выявления специфических антител к различным подтипам вируса гриппа птиц.

5. На основании полученных данных разработать практические предложения по профилактике инфекции.

Научная новизна исследования. Впервые в Республике Таджикистан установлена циркуляция ранее не регистрировавшихся вирусов гриппа птиц, нескольких подтипов. Проведенным исследованием на 12 подтипов вируса гриппа, положительные результаты в РТГА получены с вирусами: НЗ, Н6, Н8, Н11, Н12, Н13.

Установлено, что непрямой вариант твердофазного ИФА (иммуноферментный анализ) вследствие высокой чувствительности позволяет выявлять скрытые очаги инфекции, в которых не наблюдают манифестные формы гриппа птиц Н5Ы1.

При отрицательных результатах па вирус Н5Ш в РТГА, получены

совпадающие положительные результаты в ИФА и иммуноблотинге с

использованием моноклональных антител.

Установлено, что гетерологичные вирусы «А/лошадь1/Прага 56» (Н7Ы7) и

«А/лошадь 2/Майами 63» (НЗШ), использованные в тест-системе ИФА выявляют

антитела к общим поверхностным антигенам возбудителей гриппа птиц.

Указанное позволяет использовать гетсротипичные вирусы

«А/лошадь1/Прага 56» (Н7Ы7) и «АУлошадь 2/Маями 63» (НЗШ) для

иммунологического мониторинга и выявления скрытых очагов вирусов гриппа

птиц содержащих геммаглютинины Н7 и НЗ.

5

Практическое значение работы. Установлено, что в птицеводческих хозяйствах разного типа ряда районов Республики Таджикистан., несмотря на отсутствие в последние годы зарегистрированных вспышек гриппа птиц, циркулируют штаммы возбудителя, отнесенные к низкопатогенным подтипам вируса гриппа птиц. Выявлены очаги на территории, которых у домашней птицы обнаруживаются антитела к высокопатогенным подтипам вируса Н51Ч1 и Н7М7, что очевидно связано с циркуляцией низковирулентных штаммов, представляющих потенциальную опасность для домашней птицы.

Проведена апробация нескольких тестов, для целей лабораторной диагностики и мониторинговых исследований, а именно: ИФА-выявление антител к группоспецифическому белку вируса гриппа А; ИФА и иммуноблотинга-определение антител к поверхностным гликопротеинам вируса. Разработаны наборы ИФА для ретроспективной диагностики высокопатогенных вирусов гриппа птиц (Н5Ы1 и Н7ОТ). В качестве компонентов тест - систем методом ИФА, предназначенных для ретроспективной диагностики гриппа птиц Н7 и НЗ, могут использоваться гетеротипичные вирусы «А/лошадь1/Прага56» (Н7М7) и А/лошадь2/Майами63 (НЗМ8).

Применение апатогенного для птиц штамма А/лошадь1/Прага56» в диаг ностическом наборе взамен высоковирулентного вируса Н7Ы7 гриппа птиц, обеспечивает биологическую безвредность диагносткума и снижаег опасность для окружающей среды.

Полученные данные использованы при разработке системы профилактических мероприятий против гриппа птиц в Республике Таджикистан.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на 10-м Международном конгрессе Всемирной Конской Ветеринарной Ассоциации (г. Москва, 2008), Ученом Совете Научно - производственного предприятие «Биологические препараты» Республики Таджикистан (Душанбе, 2010), Ученом Совете ГНУ «Всероссийский научно - исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Ковалено» (Москва, 2011). Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены на межлабораторном научно - производственном

6

совещании научных сотрудников Научно - производственного предприятия «Биологические препараты» Республики Таджикистан (Душанбе, 2010).

Основные полоз/сепия, выносимые на защиту. - данные исследований, характеризующие циркуляцию вирусов ептиц различных подтипов, которые ранее не регистрировались в Республике Таджикистан.

результаты экспериментальных исследований, обосновывающие использование метода непрямого твердофазного ИФА для мониторинговых исследований на грипп птиц H5N1, позволяющие вследствие высокой чувствительности метода, выявлять скрытие очаги инфекции при отсутствии манифестных форм гриппа.

результаты разработки твердофазного ИФА для выявления антител к поверхностным гликопротсинам вируса гриппа птиц H5N1.

материалы исследований, обосновывающих перспективность использования гетеротипичных вирусов «А/лошадь 1/Прага5б» (H7N7) и «А/лошадь 2/Маями 63» (H3N8), в составе тест-систем ИФА для выявления антител к вирусам гриппа птиц Н7 и НЗ.

Личный вклад соискателя. Экспериментальные исследования, анализ и обобщение результатов выполнены автором самостоятельно при участии научного руководителеля д.в.н., М. Амирбекова. Исследования по разработке ИФА с гомологичными и гетерологичными антигенами вируса гриппа птиц выполнены совместно с к.б.н. Г.К. Юровым, к.б.н. C.B. Алексеенковой, В.В. Ивановым в период прохождения стажировки в отделе вирусологии ВИЭВ. Часть исследований по серодиагностике гриппа птиц выполнены совместно с сотрудниками Национального центра ветеринарной диагностики и Службы государственного ветеринарного надзора МСХ РТ - Тиллоевым Т., Зухурбековой О. «Пособие для ветеринарных специалистов по борьбе с птичьим гриппом» разработано совместно с Мамадшоевым М.М. и Тошматовым Н. Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методической помощи сотрудникам

ГНУ ВИЭВ имени Я.Р. Коваленко д.в.н., профессору К.П. Юрову, к.б.н., Г.К. Юрову и к.б.н., C.B. Алексеенковой.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, 3 в изданиях рекомендованных ВАК РФ (Журналы «Иммунология», «Ветеринарная патология» и «Кишоварз (Земледелие)»).

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 111 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, результаты исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Список литературы содержит 159 источника, из них - 140 иностранные. Диссертация иллюстрирована 2 таблицами, 12 рисунками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена в лаборатории вирусных болезней животных Научно -производственного предприятия «Биологические препараты» Таджикской академии сельскохозяйственных наук (НПП БП ТАСХН) в период 2007 - 2011 гг.

Материалы.

Сыворотки кур. Сыворотки были получены от кур из птицефабрик и мелких подворных хозяйств различных регионов республики Таджикистан: ГБАО -Рушон, Чилликул, Кабодиян, Файзабад, Варзоб, Вахдат, Рашт, Шахринав.

Вирусы. В работе использовали штамм «A/ck/Skot/59» (H5N1) вируса гриппа птиц из музея вирусных штаммов Научно - производственного предприятия «Биологические препараты», предоставленный Центром ВОЗ в порядке научно-технической помощи Республике Таджикистан по программе «Проект по контролю за птичьим гриппом», штаммы «А/лошадь1/Прага/56» (H7N7), «А/лошадь2/Маями63» (H3N8) вируса гриппа лошадей получены из музея отдела вирусологии ВИЭВ.

Куриные эмбрионы. Для размножения вируса гриппа птиц и гриппа лошадей использовали SPF куриные эмбрионы в возрасте 9-10 суток.

Лабораторные животные. Гипериммунные сыворотки получали на кроликах на экспериментальной базе Научно - производственного предприятия «Биологические препараты» Республики Таджикистан. Коммерческие диагностические наборы:

- «FLOCKSREEN Avian Influenza virus ELISA KIT (AI)», произ. «x-OvO», Великобритания;

- «Набор антигенов и сывороток для диагностики гриппа птиц в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)», произ. ОАО «Покровский завод биопрепаратов», Россия.

- «Диагностические антигены и сыворотки для РТГА»; «Инактивированный антиген вируса гриппа птиц подтипа H5N1», произ. ФГУ «ВНИИЗЖ», Россия.

- «AniGen Н5 AIV Ag ELISA», произ. «Animal Genetics, Inc», Южная Корея.

Реактивы. Необходимые для проведения работы растворы готовили из реактивов фирм «Химмед», «Биолаб», «Литех», «Хеликон» (Россия); «Anigen Animal Genetics, Inc» (Южная Корея); «Биорад» (США) и др. Методы.

Культивирование вирусов в куриных эмбрионах. Для заражения вирусом гриппа птиц «A/ck/Skot/59» (H5N1) использовали 9-10 дневные СПФ куриные эмбрионы. Для предотвращения бактериального заражения использовали антибиотики широкого спектра действия (стрептомицин и пенициллин 1000 ед/мл). Эмбрионы заражали в аллантоисную полость по 0,2 мл вируссодержащей эмбриональной жидкостью в разведении 1:100 - 1:1000 и инкубировали при температуре 37°С в течение 48 часов. Зараженные эмбрионы просматривали через 6, 8, 12, 24, 48 часов после заражения под овоскопом. Погибшие эмбрионы охлаждали, помещая в холодильник при 4 - 6°С, вскрывали в асептических условиях и собирали эмбриональную жидкость для последующей работы._Пробы крови у кур получали из подкрыльцовой вены.

РТГА проводили на иммунологических планшетах с V- образными лунками с 1% суспензией куриных эритроцитов согласно рекомендациям изложенным в издании МЭБ «Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals», Издание 6,2008.

Иммуноферментный анализ. Для проведения экспериментальных исследований был использован непрямой вариант твердофазного ИФА для выявления антител к вирусу гриппа птиц. При постановке ИФА антиген (вирионы, очищенные ультрацентрифугированием в градиенте сахарозы) адсорбировали на иммунологические планшеты (производства фирмы «Greiner -bio», Германия) по 100 мкл в лунку в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,4. После адсорбции лунки планшет промывали 4-5 раз промывочным раствором. Для промывочного раствора использовали ФСБ с добавлением Твина -20 (0,02М фосфатного буфера рН 7,4; 0,05% Твина - 20). Готовили ряд последовательных двукратных разведений сывороток в ФСБ с добавлением Твика - 20 (0,02 М фосфатном буфере рН 7,4, 170 мМ NaCl; 0,05% Твина - 20). Реакцию проводили в объёме 100 мкл. Инкубировали с исследуемыми сыворотками 1,5 часа при t +37°С. Лунки планшет 3-4 раза промывали промывочным раствором и добавляли иммунопероксидазный коньюгат. В качестве конъюгата использовали антитела против иммуноглобулинов кур, полученные на кролике, конъюгированные с пероксидазой хрена. Инкубацию с конъюгатом проводили в условиях аналогичных инхубации с сыворотками. По окончании инкубации лунки планшет промывали 4-5 раз промывочном раствором и проявляли реакцию внесением в каждую лунку субстратной смеси. В качестве субстратной смеси использовали коммерческий препарат «ТМБ» на основе хромогена 3, 3',5,5'-тетраметилбекзидина (производства фирмы «Биолаб», Россия). Окраску субстратной смесью проводили по протоколу фирмы - изготовителя. Результаты ИФА оценивали на фотометре «Multiscan®MCC/340» с вертикальным лучом при длине волны 450 нм по коэффициенту оптического поглощения (ОП, 450). Положительными считали пробы, коэффициент оптического поглощения которых, начиная с разведения 1: 200 в 2 и более, раз превосходил коэффициент оптического поглощения отрицательного контроля, но при этом был не ниже 0,200 оптических единиц (о.е.). Уровень оптической плотности ниже 0,150 о.е. принимали за отрицательный результат.

Иммуноблоттинг. Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) проводили в буферной системе Лемли в 12% ПААГ толщиной 0,75 мм.

10

Электроперенос белков после их разделения в ПААГ - ДСН проводили по методу Бюрнет с небольшими модификациями на нитроцеллюлозу. Иммуноблотинг проводили с сыворотками кур по общепринятой методике. Для проявления реакции использовали субстратную смесь на основе хромогена - ортодианизина.

Статистическая обработка. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием компьютерной программы Microsoft Office Excel 2003, используя рекомендации Д.А. Новикова, В.В. Новочадова. Для результатов измерения в шкале отношений применяли показатель описательной статистики — «гистограмму», т.е. графическое изображение зависимости частоты попадания элементов выборки от соответствующего интервала группировки (Новикова Д.А., Новочадова В.В. «Статистические методы в медико -биологическом эксперименте (типовые случаи)» 2005).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В Таджикистане проблема гриппа птиц изучена не достаточно. В различные годы были обнаружены штаммы нескольких подтипов ВГП: 6-й (1972 г.), 7-й (1976-1978 гг.) и 4-й (1978-1979, 1983-1984 гг.) (Салимов Т.М., Фатхудинова М. Ф. 2008г.).

Исследования, проведенные совместно с сотрудниками Национального центра ветеринарной диагностики и Таджикского научно-исследовательского института профилактической медицины (3945 проб сыворотки крови, 51 трупа птиц - оседлых и перелётно-гнездящиеся видов; 226 трахеальных и клоачных мазков от домашних, диких и синантропных птиц), свидетельствовали об отсутствии в Таджикистане вируса с антигенной формулой H5N1. Однако, полученные результаты нельзя считать окончательными, учитывая неблагополучие по гриппу птиц сопредельных государств, и маршруты перелетных птиц, пролегающих через территорию Республики. Указанное послужило основанием для продолжения наших исследований.

Обнаружение типоспецифических антител к вирусу гриппа А птиц.

Использовали коммерческий набор для ИФА на основе «FLOCKSREEN Avian Influenza virus ELISA KIT (AI)», производитель «x-OvO» Великобритания.

Сыворотки для исследования были получены из районов Вахдат, Рашт, Файзобад, Шахринав. Результаты представлены на рис.1 и 2.

Как видно из данных на рис. 1 антитела к типоспецифическому белку гриппа А в достоверно- диагностических титрах выявляли в пробах, полученных в 4-х административных районах (Вахдат, Рашт, Файзабад, Шахринав). Наиболее высокие титры антител обнаруживали в сыворотках, полученных из района: Шахринав и в более низких титрах - в пробах из других 3-х районов.

Рис. 1. Выявление антител к типоспецифическому антигену вируса гриппа А птиц в ИФА (разведение сыворотки 1 : 400)

ОП, усл. ед.

0,6 1 FIBffl

0,6 - |f Т"'

■III ■

Вахдат Рашт Файзобод Шахринав К- К+

районы Республики Таджикистан

Наличие иммунного ответа у кур на типоспецифический белок вируса j гриппа А свидетельствует о циркуляции возбудителя гриппа в популяции птиц на ! территории Республики Таджикистан. Полученные результаты послужили основанием для продолжения исследований с целью выяснения в плане ретроспективной диагностики подтиповой принадлежности вирусов гриппа птиц.

Первостепенное значение придавали изучению возможной циркуляции высокопатогенного вируса гриппа птиц H5N1. В связи с этим нами была разработана тест система ИФА для выявления антител к поверхностным антигенам этого вируса.

Разработка тест-системы для определения антител к поверхностным антигенам Н5 вируса гриппа птиц методом ИФА.

Получение антигена. В качестве исходного вируссодержащего материала использовали штамм вируса гриппа птиц «А/ск/8ко1/59» (Н5Ы1), предоставленный Центром ВОЗ в порядке научно-технической помощи Республике Таджикистан по программе «Проект по контролю за птичьим гриппом» из музея вирусных штаммов Научно - производственного предприятия «Биологические препараты» Республики Таджикистан.

Для заражения вирусом гриппа птиц использовали 9-10 дневные СПФ

куриные эмбрионы. Собранную вируссодержащую жидкость использовали для

приготовления антисыворотки (антител) для иммуноферментного анализа (ИФА).

Для этого вирус очищали следующим методом: для избавления от дебриса

вируссодержащ уюэмбриональную жидкость осветляли низкоскоростным

центрифугированием в роторе 12-2 Ш/Е (центрифуга ВЕСКМАЫ) в течение 20

минут при 6 ООО об/мин. Из декантированного супернатанта готовили

концентрированный вируссодержащий осадок, который был получен после

центрифугирования в роторе 12-2 Ш/Е (центрифуга ВЕСКМАЫ) в течение 2-х

часов при 20 ООО об/мин. Частично очищенную находящуюся в осадке вирусную

массу ресуспендировали в физиологическом растворе и наслаивали на градиент

30% - 65% сахарозы. Ультрацентрифугирование проводили в роторе 41

(центрифуга ВЕСКМАЫ) при 35 ООО об/мин, в течение 2-х часов.

Опалесцирующую зону отбирали и анализировали в иммуноферментном анализе

методом шахматного титрования. По результатом шахматного титрования были

определены оптимальные разведения антигена для его дальнейшего

использования в иммуноферментном диагностикуме.

Получение моноспецифических гипериммунных антисывороток против иммуноглобулинов кур класса С и приготовление иммуноспецифического

конъюгата.

Моноспецифические антисыворотки к иммуноглобулинам кур класса в для постановки ИФА получали иммунизацией кроликов. Иммунизацию проводили путем подкожной инъекции суспензии иммуноглобулина и адъюванта Фрейнда. Очищенные иммуноглобулины кур класса в, были получены методом

13

анионообменной хроматографии. В качестве сорбента использовали DEAE-TP. После завершения иммунизации отбирали кровь иммунизированных кроликов путем тотального обескровливания. Отделяли сыворотку и определяли концентрацию иммуноглобулинов спетрофотометрически при длине 280 Нм. Гипериммунные сыворотки, использовали для получения моноспецифических антител конъюгированных с ферментом (пероксидаза хрена).

В результате был получен иммунопераксидазный коньюгат, который использовали в экспериментах для обнаружения специфических антител к вирусу гриппа кур. Активность коньюгата была определена в разведение 1:1000. Указанная тест-система использована нами для мониторинга вирусов гриппа птиц, включающих гемааглютининпятого типа. Сыворотки для исследования получены от кур птицефабрик и мелких подворных хозяйств 8 районов Республики Таджикистан: Рушон - ГБАО, Джилликул, Кабадиян, Файзабад, Варзоб, Вахдат, Рашт, Шахринав (рис.2).

Рис.2. Выявление антител к вирусу гриппа птиц H5N1 в ИФА (разведение сыворотки 1 : 200)

ОП, усл. ед.

Описание к рис. 2 - районы Республики Таджикистан: 1) Рушон - ГБАО; 2) Джилликул; 3) Кабадиян; 4) Файзабад; 5) Варзоб; 6) Вахдат; 7) Рашт; 8) Шахринав. К- - отрицательный контроль; К+ - положительный контроль.

В районах 1-5 проводилась вакцинация кур инактивированной вакциной из IHT.H5N1.

Наиболее высокие титры антител выявлены в пробах из района Шахринав, что коррелирует с результатами, представленными на рис. которые демонстрируют циркуляцию антител у домашней птицы к типоспецифическому белку гриппа А. Данные, полученные по районам 1-5 (Рушон - ГБАО, Джилликул, Кабадиян, Файзабад,' Варзоб) по-видимому, объясняются проведённой вакцинацией кур против гриппа и возможно не отражают истинную картину распространения эпизоотического вируса. Поскольку в этих районах применялось «Инактивированная эмульгированная вакцина против птичьего гриппа из шт. H5N1», ОАО «Покровский завод биопрепаратов». Однако, в связи стем, что отсутствуют сведения об иммуногенный активности вакцины к внутреннему типоспецифическому белку вируса, мы можем с некоторой долей осторожности допустить, что выявленные антитела к РНП гриппа А, на самом деле индуцированы эпизоотическим штаммом вируса гриппа H5N1.

Подтверждение специфичности результатов иммуноферментного анализа методом иммуноблотинга

Для подтверждения специфичности иммуноферментного анализа с полученными очищенными вирионами нами был проведён иммуноблотинг, после проведение вертикального электрофореза в денатурирующих условиях с прогреванием в присутствии восстанавливающего дисульфидные связи реагента DTT (дитиотреитол), с пробами, давшими положительную реакцию на антитела к типоспецифическому белку гриппа птиц А. Для определения молекулярной массы был поставлен контроль с использованием моноклинальных антител против гемагглютинина Н5 из коммерческого набора «AniGen Н5 AIV Ag ELISA» фирмы «Animal Genetics, Inc»; производитель Корея,

Установлено, что сыворотки положительно реагировавшие с типоспецифическим антигеном гриппа А взаимодействуют с вирусным гликопротеином с молекулярной массой 35 кД, что соответствует молекулярной

массе субъединицы гемагглютинина вируса гриппа. Следовательно, результаты иммуноблотинга подтверждают специфичность выше приведенных данных.

РТГА для выявления антител к гемагглютининам вируса различных

подтипов: Н5Ш, Н7Ш, НЗЩ НШ1, Н13Ш, Н12Ш, H2NЗ, H4N6, Н6№, H8N4, Н9Ш, H11N6

С целью выявления антител к гемагглютининам вируса других подтипов, а именно Н5Ш, Н7ОТ, НЗШ, НШ1, Н13Ы2, Н12Ы5, Н2№, Н4Ы6, Н6Ы2, Н8Ы4, Н9Ы2, Н1 Ш6 исследовали все пробы в РТГА с коммерческими диагностикумами «Диагностические антигены и сыворотки для РТГА»; «Инактивированный антиген вируса гриппа птиц подтипа Н5Ш», серия №3 контроль№3, дата изготовления 03.2008г., производитель ФГУ «ВНИИЗЖ», Россия.

Данные по выявлению антител к вирусу различных подтипов представлены на рис. 3,4,5.

Рис. 3. Выявление антител у кур к вирусу гриппа птиц Н7М7, Н5М, Н13№, Н12№, Н2МЗ, Н4Ы6 в РТГА

Титр антител

административные районы

Рис. 4. Выявление антител у кур к вирусу гриппа птиц H3N8, H1N1, H6N2, H8N4, H9N2, H11N6 в РТГА

Титр антител

административные районы

□ H3N8 SH1N1 ■ H6N2 ПИ H8N4

□ H9N2 EH11N6

Рис. 5. Обнаружение положительной реакции (РТГА) с пробами крови кур из 4 -х районов на вирусы подтипов НЗ, Н6, НИ, Н12,Н8, Н13.

i |>\о

Bail tarn

ЙСЙ1И

•w»

ИНДИЯ-

Обозначения: ¡H3N8, H6N2. ЯИВ H12N5, ИДИ ДЩ

Наиболее высокие титры антител обнаруживали к вирусу 113N8 в пробах из районов Файзабад, Рашт; к вирусу Н6№ - в пробах из районов: Файзабад, Вахдат, Рашт и Шахринав; к вирусу Н1Ш6 - в пробах из районов Вахдат, Шахринав; к вирусу Н8И4, Н12И5- в пробах из района Рашт; к вирусу Н13К2 - в пробах из района Шахринав. В остальных случаях антитела не выявляли или выявляли в низких титрах.

Выявление антител у кур к общим поверхностным антигенам гетеротипичных вирусов гриппа лошадей.

В настоящее время установлено, что пандемические штаммы могут возникать путем прямой передачи целого вируса от одного вида к другому. | Принимая во внимание, что все штаммы вируса гриппа птиц содержат в своей структуре гемагглютинины лошадиного происхождения (4), мы провели I исследования по выявлению антител у кур к гетерологичным вирусам гриппа лошадей в ИФА со штаммами «А/лошадь1/Прага/56» (Н7Ш), «А/лошадь2/Маями63» (ИЗ N8), которые содержат в составе антигенных детерминант однотипные для птиц эпитопы. Полученные результаты представлены на рис. 6. Исследование проводили с пробами из районов ГБАО, Джилликул, Кабадиян, Варзоб, Файзабад, Вахдат, Рашт, Шахринав.

Рис 6. Выявление антител в сыворотки крови кур с гетерологичными вирусами гриппа лошадей Н7М7 и НЗШ в ИФА (разведение сыворотки 1 : 200)

ОП, усл. ед.

1,9 1,7 1,5

1,3 1,1 0,9 0,7 0,5 0,3 0,1

--■

■ Н7№ □ НЗМ8

1

2 3 4 5 !

административные районы

6

7

8

в пробах крови кур из Рушонского района - ГБАО и из района Варзоб выявлены антитела к вирусу гриппа Н7Ы7 лошадей в высоких титрах. В других пробах уровень антител к вирусу лошадей подтипов Н7Ы7 и НЗЫ8 был минимальный.

ОБСУЖДЕНИЕ

В Таджикистане проблема птичьего гриппа изучена не достаточно. В прошлом на территории Таджикистана были обнаружены штаммы нескольких подтиппов вируса гриппа птиц - 6-й (1972 г.), 7-й (1976-1978 гг.) и 4-й (1978-1979, 1983-1984 гг.).

В настоящее время несмотря на то, что в сопредельных странах периодически возникают эпизоотии высокопатогекного вируса гриппа птиц (Н5Ы1), а через территорию республики пролегают основные пути миграции перелетных птиц из Индокитая и Китая, вспышки этой инфекции не регистрируются^). Ранее нами (Сайдарова и др. 2009), методом иммуноферментного анализа установлено наличие антител к вирусу гриппа Н5Ы! у домашних птиц в нескольких областях. Иммунологический мониторинг позволил проследить распространение вируса Н5М1, несмотря на отсутствие видимых признаков заболевания у кур. Данные, полученные по районам Вахдат, Рашт, Шахринав свидетельствуют о циркуляции низкопатогенных или авирулентных штаммов вируса H5N1.

Возможность появления как высокопатогенных, так и низкопатогенных вариантов вируса Н5М1 обусловлена заносом возбудителя дикими птицами в периоды их осенней и весенней миграций. Высокопатогенные штаммы циркулируют среди птиц в странах Индокитая: Вьетнаме, Лаосе, Камбодже и Таиланде. Именно здесь развивались массовые эпизоотии и эпидемические осложнения птичьего гриппа. Слабопатогенные штаммы Н5Ш обнаруживались по периферии этой зоны в Китае, Корее, Казахстане, России, Индонезии, Филиппинах. Кроме того, ранее в птицеводческих хозяйствах республики были выявлены несколько подтипов вируса грипп птиц содержащими гемагглютинины - 6-й (1972 г.), 7-й (1976-1978 гг.) и 4-й (1978-1979, 1983-1984 гг). (Салимов Т.М.,

Фатхудинова М.Ф. 2008). Исследования на вирус H5N1, проведенные нами в 2006-2009 гг. совместно с сотрудниками Национального центра ветеринарной диагностики и Таджикского научно-исследовательского института профилактической медицины (исследованы 3945 проб сыворотка крови, 51 труп птиц оседлые виды- зимородок, чёрный дроздь, малая горлица, перелётно-гнездящиеся-дубонос, сизый голубь, полевой конёк, зелёная пеночка, комышовая овсянка, обыкновенная овсянка, полевой жаворонок, 226 трахеальных и клоачных мазков от домашних, диких и синантропных птиц), завершились отрицательными результатами. Однако, вопрос, очевидно, нельзя считать закрытым. В Таджикистане наряду с птицеводческими хозяйствами промышленного типа значительное поголовье кур содержится в мелких подворных хозяйствах. Эта птица обычно имеет свободный выгул, и по этой причине возможны множественные контакты с дикими и синантропными птицами - потенциальными носителями патогенных штаммов вируса гриппа). С целью выявления антител к общему типоспецифическому антигену вируса гриппа А (нуклеопротеину), мы исследовали пробы сывороток полученных от кур из районов Вахдат, Шахринав, Файзабад, Рашт используя коммерческий набор «FLOCKSREEN Avian Influenza virus ELISA KIT (AI)», производитель «x-OvO» Великобритания в ИФА. Антитела к типоспецифическому белку гриппа А в достоверно - диагностических титрах были выявлены в пробах, полученных из 4-х административных районов. Наиболее высокие титры антител обнаруживали в районе Шахринав и в более низких титрах - в пробах из других 3-х районов.

Принимая во внимание отсутствие острых вспышек гриппа в популяции кур Таджикистана, обнаружение антител к вирусу H5N1 могло бы представлять существенный интерес. В связи с этим нами была разработана тест система ИФА для выявления антител к поверхностным антигенам этого вируса.

Наиболее высокие титры антител были выявлены в пробах из района Шахринав, что коррелирует с результатами по выявлению антител к типоспецифицескому антигену гриппа А. Данные, полученные по районам: ГБАО, Джилликул, Кабадиян, Файзабад, Варзоб - по-видимому, объясняются

проведённой вакцинацией кур против гриппа и не отражают картину распространения эпизоотического вируса.

Для подтверждения специфичности иммуноферментного анализа с данными пробами применили иммуноблотинг. Для иммуноблоттинга использовали сыворотки крови кур, давшие положительную реакцию на антитела к типоспецифическому белку вируса гриппа А. В качестве дополнительного контроля применяли моноклональные антитела против гемагглютинина Н5 из коммерческого набора «AniGen Н5 AIV Ag ELISA», производство Корея. Результаты показали, что исследуемые сыворотки и специфические моноклональные антитела взаимодействуют с вирусным гликопротсииом с молекулярной массой примерно 35 кДт, что соответствует молекулярной массе субъединицы гемагглютинина вируса гриппа.

Следовательно в районе Шахринав в ИФА у кур обнаруживаются антитела к типоспецифическому внутреннему антигену вируса гриппа А и антитела к поверхпостнам гликопротеинам вируса. Это означает, что домашняя птица (куры) в этом регионе имела контакт с вирусом H5N1. Наличие у кур специфических иммуноглобулинов к высокопатогенному вирусу H5N1 при отсутствии манифестной формы инфекции, очевидно, объясняется циркуляцией авирулентных штаммов возбудителя.

Полученные нами данные с вирусом H7N7 гриппа лошадей свидетельствуют об активной циркуляции в популяции кур вируса с гемагглютинином Н7 в горных районах ГБАО и Варзоб, что возможно связано с наличием природных резервуаров вируса в дикой фауне этих районов.

Остаётся невыясненным вопрос, существует ли на территории Республики Таджикистан постоянный резервуар этих вирусов, или же они заносятся перелетными птицами.

Исследования, проведенные в РТГА с 12 антигенными подтипами вируса гриппа птиц, позволили установить циркуляцию антител к гемагглютининам подтипов H3N8, H6N2, H11N6, H8N4, H12N5, H13N2. Можно предположить, что распространение слабовирулентных штаммов обусловлено рядом причин. Считается установленным, что домашние водоплавающие птицы (утки, гуси)

21

весьма восприимчивы к эпизоотическим штаммам вируса гриппа, которые распространяются дикими и синантропными птицами (В. Yuksel, Линкольна AMW 2007; А. Globig, Hannover, 2007). Водоплавающие птицы служат резервуаром всех 16 подтипов вируса гриппа типа А. У диких уток вирус гриппа размножается, главным образом, в клетках желудочно - кишечного тракта, инфекция протекает без видимых признаков заболевания, однако, вирус выделяется в высоких концентрациях с фекалиями. Вирус гриппа птиц выделяется из свежих фекальных масс, а также из неконцентрированной озерной воды.

Заражение «дикими» штаммами вируса домашней водоплавающей птицы является тем пусковым механизмом, который служит началом эпизоотических вспышек гриппа среди домашних птиц. Этот механизм хорошо «срабатывает» в странах Юго-восточной Азии (Китай, Вьетнам и др.), а также в Европейских странах. В Таджикистане поголовье водоплавающей домашней птицы относительно невелико и это звено не имеет большого значения в эпизоотическом процессе в сравнении с другими регионами.

Ещё одна причина, возможно, заключается в географических особенностях Таджикистана, большая часть которого занята горными хребтами, что затрудняет контакт дикой и домашней птицы. Кроме того, нельзя исключить, что домашняя птица в долинах зонах республики является резервуаром слабопатогенных вирусов гриппа птиц.

Наконец следует принимать во внимание эффективность работы ветеринарной службы страны, которая обеспечивает качественное проведение профилактических и противоэпизоотических мероприятий.

ВЫВОДЫ

1. Проведенными ретроспективными серологическими (иммунологическими) исследованиями сывороток крови кур в нескольких районах Республики Таджикистан в период 2008-2009 гг. обнаружены антитела к различным подтипам вируса гриппа птиц.

2. В реакции торможении гемагглютинации со штаммами 12-ти подтипов вирусов гриппа птиц выявлены антитела к низковирулентным вирусам гриппа птиц подтипов: НЗ, Н6, Н8, HI 1, Н12, Н13.

3. Для выявления антител к вирусу гриппа H5N1 разработана чувствительная тест - система, непрямой вариант твердофазного ИФА, позволяющая выявлять скрытые очаги гриппа птиц H5N1, в которых не наблюдается манифестная форма инфекции.

4. Исследованием в ИФА (с использованием разработанной нами тест- системы) сыворотки крови кур в районе Шахринав в 62,7 % обнаружены антитела к вирусу гриппа птиц H5N1. Полученные результаты позволяют заключить, что, несмотря на отсутствие в последние годы зарегистрированных вспышек гриппа птиц на территории Республики Таджикистан, в ряде районов циркулируют слабовирулентные штаммы возбудителя.

5. При отрицательных результатах РТГА на вирус H5N1 получены совпадающие положительные результаты в ИФА и иммуноблогинге с использованием моноклональных антител к Н5, производства фирмы «Animai Genetics, Inc», Южная Корея.

6. Показано, что вирусы «А/лошадь 1ЛТрага56» (H7N7) и «А/лошадь 2/Махми63» (H3N8) могут использоваться как компонент тест-системы ИФА для ретроспективной диагностики гриппа птиц подтипов Н7 и НЗ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработано и издано при поддержке представительства ЮНИСЕФ,

«Пособие для ветеринарных специалистов для борьбы с птичьим гриппом»,

Утвержденное Службой Государственного ветеринарного надзора 8 декабря

2007г. (в соавторстве).

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Diagnostics of equine influenza in elisa / G.K. Yurov, V.V. Ivanov, S.V. Alekseyenkova, M.M. Saidarova, K.P.Yurov // Proc.lO"1 Internat.Congr. of World Equine Vet. - Ass., 2008, Moscow, p. 696.

2. Иммунологический мониторинг гриппа птиц на территории Республики Таджикистан / М.М. Сайдарова, М. Амирбеков, Г.К. Юров, C.B. Алексеенкова, К.П. Юров // Иммунология. - 2009. - 30 (5). - С. 309-311.

3. Выявление антител к вирусу гриппа птиц H5N1 методами ИФА и РТГА у кур в птицеводческих хозяйствах Республики Таджикистан / М.М. Сайдарова, М. Амирбеков, Г.К. Юров, C.B. Алексеенкова, К.П. Юров // Ветеринарная патология. - 2009. - 3. - С. 50-51.

4. Махмадшоев М.М. Пособие для ветеринарных специалистов для борьбы с птичьим гриппом / М.М. Махмадшоев, Н. Тошматов, М.М. Сайдарова // Издание Министерства сельского хозяйства и охраны природы Республики Таджикистан Службы Государственного ветеринарного надзора при поддержке представительства ЮНИСЕФ. - 2007. - С. 1- 89.

5. Аноятбеков М. Зукоми парранда (Грипп птиц) - (на государственном языке) / М. Аноятбеков, М.М. Сайдарова II Ветеринария. - 2010. 7- 9. - Душанбе. - С. 23-27.

6. Ретроспективный анализ циркуляции штаммов вируса гриппа птиц H5N1 на территории Таджикистана методами ИФА и иммуноблотинга / М.М. Сайдарова, М. Амирбеков, Г.К. Юров, C.B. Алексеенкова, К.П. Юров // Кишоварз (Земледелие). - 2011. №1 - С. 14 -16.

Подписано в печать:

05.04.2011

Заказ № 5265 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Объем: 1 усл.п.л. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Сайдарова, Мухайё Махмадрахимовна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Свойства возбудителей.

2.1.1. Морфология.

2.1.2. Классификация.

2.1.2.1. Классификация гемагглютинина и нейраминидазы.

2.1.2.2. Классификация вирусов по патогенным свойствам.

2.1.2.3. Патотипы вируса Н5Ш.

2.1.2.4. Патогенность для других видов животных.

2.2. Эпизоотология и эпидемиология гриппа птиц.

2.2.1. Распространённость вирусов гриппа птиц.

2.2.2. Резервуары инфекции.

2.2.3. Пути передачи вирусов гриппа птиц.

2.2.4. Миграция птиц в Таджикистане.

2.3. Симптомы, течение болезни и патологоанатомические 34 изменения

2.3.1. Симптоматика.

2.3.2. Патологоанатомические изменения.

2.4. Диагностика.

2.4.1. Выделение вируса. Взятие и подготовка материала.

2.4.2. Биопроба на цыплятах.

2.4.3. Идентификация вируса.

2.4.4. Современные методы диагностики и типирования вирусов 45 гриппа.

2.5. Меры борьбы.

2.5.1. Вакцинопрофилактика.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3. Материалы и методы.

3.1. Материалы.

3.1.1. Сыворотки кур.

3.1.2. Вирусы.

3.1.3. Куриные эмбрионы.

3.1.4. Лабораторные животные.

3.1.5. Коммерческие диагностические наборы.

3.1.6. Реактивы.

3.2. Методы.

3.2.1. Отбор крови у кур.

3.2.2. Культивирование вирусов в куриных эмбрионах.

3.2.3. Реакция гемагглютинации.

3.2.4. Реакция торможения гемагглютинации.

3.2.5. Приготовление антигена для постановки ИФА.

3.2.6. Получение моноспецифических гипериммунных антисывороток против иммуноглобулинов кур класса О для постановки ИФА

3.2.7. Получение иммуноспецифического конъюгата.

3.2.8. Иммуноферментный анализ.

3.2.9. Иммуноблотинг после проведения вертикального электрофореза в буферной системе Ьаетш1у.

3.2.10. Статистическая обработка.

3.3. Результаты собственных исследований.

3.3.1. Мониторинг гриппа птиц Н51Ч1.

3.3.2. Обнаружение типоспецифических антител к вирусу гриппа А птиц.

3.3.3. Разработка тест - системы для определения антител к поверхностным антигенам Н5 вируса гриппа птиц методом

3.3.3.1. Получение антигена.

3.3.3.2. Получение моноспецифических гипериммунных антисывороток против иммуноглобулинов кур класса в и приготовление иммуноспецифического конъюгата.

3.3.3.3. Подбор компонентов тест - системы.

3.3.4. Подтверждение специфичности результатов иммуноферментного анализа методом иммуноблотинга.

3.3.5. РТГА для выявления антител к гемагглютининам вируса различных подтипов: Н5М, Н7Ш, НЗШ, НШ1, Н13Ш, H12N5, Н2ГО, Н4К6, ^N2, Н8М, H9N2, H11N6.

3.3.6. Выявление антител у кур к общим поверхностным антигенам вирусов гриппа лошадей.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

5. ВЫВОДЫ.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Распространенность вирусов гриппа птиц в Республике Таджикистан: иммунологический мониторинг"

Грипп птиц (кур) — острая высококонтагиозная вирусная болезнь птиц, характеризующаяся общим угнетением, отёками, поражением органов дыхания, пищеварения и ЦНС. Болезнь впервые описал Перрончито (1880) в Италии под названием «экссудативный тиф кур». Впоследствии она неоднократно возникала во многих странах мира, где её диагностировали под разными названиями, в том числе как европейскую или классическую чуму птиц. Вирусную природу возбудителя (классической, европейской) чумы птиц установил Чентани в 1901 г., а в 1955 г. возбудитель был идентифицирован как influenza virus А, и после этого с 1971 г. болезнь стали называть гриппом птиц (9).

В течение XX века вспышки болезни, вызванные разными штаммами, происходили во многих регионах мира, в том числе в Северной и Южной Америке, на севере Африки, в странах Среднего и Дальнего Востока, Европе и бывшем Советском Союзе. Из числа выделенных возбудителей- высокой вирулентностью для птиц обладают вирусы подтипов H5N1 и H7N7.

В природе у диких птиц встречаются практически все известные подтипы вирусов гриппа типа А. При этом существует механизм рекомбинации поверхностных антигенов гемагглютинина и нейраминидазы. Вирусы, которые авирулентны для своих носителей, имеют широкий круг хозяев, включая другие виды птиц и млекопитающих. Важным фактором эффективной передачи таких вирусов другим видам, в частности водоплавающим птицам, может быть репликация вирусов в кишечном тракте птиц; этот резервуар в живой природе играет важную роль в экологии вирусов гриппа (18). Весьма важным фактом, определяющим актуальность наших исследований, является определенная связь между заболеванием людей и вспышками гриппа птиц. В последние годы некоторые подтипы вирусов птичьего гриппа зачислены в число опасных для человека. В Соединенных Штатах Америки каждый год более 200 ООО пациентов обращаются в больницы из - за гриппа и регистрируется приблизительно 36 ООО смертельных случаев. В 328 случаях вирус подтипа H5N1 вызвал заболевание и в 200 случаях со смертельным исходом (Lipman D. Journal of Virology, January 2008).

В Таджикистане проблема гриппа птиц изучена не достаточно. В республике до настоящего времени не зарегистрирован высокопатогенный подтип вируса H5N1, но в различные годы были-обнаружены штаммы других подтипов ВГП: 6-й (1972 г.), 7-й (19761978 гг.) и 4-й (1978-1979, 1983-1984 гг.) (18). Вопрос нельзя считать закрытым, принимая во внимание постоянную циркуляцию вируса H5N1 в соседних странах, возможность переноса возбудителей с дикими птицами, маршруты перелёта которых пролегают через территорию Таджикистана.

В Таджикистане наряду с птицеводческими, хозяйствами промышленного типа значительное поголовье кур содержится в мелких фермерских и частных подворных хозяйствах. Эта птица обычно имеет свободный выгул, и по этой причине возможны множественные контакты с дикими и синантропными птицами - потенциальными носителями штаммов вируса гриппа. Следовательно, наблюдение за распространением гриппа птиц весьма важно для прогнозирования возможных эпизоотических вспышек болезни и организации противоэпизоотических мероприятий.

Кроме того, согласно «Санитарного кодекса наземных животных» -официального издания Международного эпизоотического бюро, членом которого является Республика Таджикистан, все страны обязаны предоставлять другим странам - членам МЭБ любую информацию по предупреждению распространения опасных болезней животных (ст. кодекса 1.1.2.)

Для достижения указанной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Отработать методики иммунологического (серологического) мониторинга вируса гриппа птиц различных подтипов.

2. Разработать тест - систему для выявления антител к высокопатогенному вирусу гриппа птиц Н5Ш в ИФА.

3. Изучить возможность выявления потенциальных очагов возбудителя гриппа с гемагглютинином Н7 и НЗ с использованием вирусов гриппа лошадей «А/лошадь 1/Прага56» (Н7К7) и «А/лошадь2/Майами 63» (НЗШ).

4. Провести серологическое обследование домашних птиц (в РТГА) для выявления специфических антител к различным подтипам вируса гриппа птиц.

5. На основании полученных данных разработать практические предложения по профилактике инфекции.

Научная новизна исследования.

Впервые в Республике Таджикистан установлена циркуляция ранее не регистрировавшихся вирусов гриппа птиц, нескольких подтипов. Проведенные исследования на 12 подтипов вируса гриппа, положительные результаты в РТГА получены с вирусами: НЗ, Н6, Н8, Н11, Н12, Н13.

Установлено,' что непрямой вариант твердофазного ИФА (иммуноферментный анализ) вследствие высокой чувствительности позволяет выявлять скрытые очаги инфекции, в которых не наблюдают манифестные формы гриппа птиц Н5№.

При отрицательных результатах на вирус Н5Ш в РТГА получены совпадающие положительные результаты в ИФА и иммуноблотинге с использованием моноклональных антител.

Установлено, что гетерологичные вирусы «А/лошадь 1 /Прага 56» (Н7Ы7) и «А/лошадь2/Маями63» (НЗИБ), использованные в тест-системе ИФА выявляют антитела к общим поверхностным антигенам возбудителей гриппа птиц.

Указанное позволяет использовать гетерологичные штаммы вирусы «А/лошадь 1/Прага5 6» (Н7Ш) и «А/лошадь2/Маями63» (НЗШ) для иммунологического мониторинга и выявления скрытых очагов вирусов гриппа птиц, содержащих гемагглютинины Н7 и НЗ.

Практическое значение работы.

Установлено, что в птицеводческих хозяйствах разного типа ряда районов Республики Таджикистан, несмотря на отсутствие в последние годы зарегистрированных вспышек гриппа птиц, циркулируют штаммы возбудителя, отнесенные к низкопатогенным подтипам вируса гриппа птиц. Выявлены очаги на территории, которых у домашней птицы обнаруживаются антитела к высокопатогенным подтипам вируса Н5№ и Н7Ы7, что очевидно связано с циркуляцией низковирулентных штаммов, представляющих потенциальную опасность для домашней птицы.

Проведена апробация нескольких тестов, для целей лабораторной диагностики и мониторинговых исследований, а именно: ИФА -выявление антител к группоспецифическому белку вируса гриппа А; в

ИФА и иммуноблотинге - определение антител к поверхностным гликопротеинам вируса. Разработаны наборы ИФА для ретроспективной диагностики антител к вирусам гриппа птиц (Н5Ш и Н7Ы7). В качестве компонентов тест - систем методом ИФА, предназначенных для ретроспективной диагностики гриппа птиц Н7 и НЗ, могут использоваться гетерологичные вирусы «А/лошадь 1/Прага5 6» (Н7Ы7) и А/лошадь2/Маями63 (НЗЫ8).

Применение апатогенного для птиц штамма А/лошадь 1/Прага5 6» в диагностическом наборе взамен высоковирулентного вируса Н7Ы7 гриппа птиц обеспечивает биологическую безвредность диагностикума и снижает опасность для окружающей среды.

Полученные данные использованы при разработке системы профилактических мероприятий против гриппа птиц в Республике Таджикистан.

Апробация работы.

Материалы работы были представлены на 10-м Международном конгрессе Всемирной Конской Ветеринарной Ассоциации (г. Москва, 2008), Ученом Совете Научно - производственного предприятие «Биологические препараты» Республики Таджикистан (Душанбе, 2010), Ученом Совете ГНУ «Всероссийский научно - исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко» (Москва, 2011). Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены на межлабораторном научно - производственном совещании научных сотрудников Научно - производственного предприятия «Биологические препараты» Республики Таджикистан (Душанбе, 2010).

Основные положения, выносимые на защиту:

- данные исследований, характеризующие циркуляцию вирусов птиц различных подтипов, которые ранее не регистрировались в Республике Таджикистан.

- результаты экспериментальных исследований, обосновывающие использование метода непрямого твердофазного ИФА для мониторинговых исследований на грипп птиц Н5Ш, позволяющие вследствие высокой чувствительности метода, выявлять скрытие очаги инфекции при отсутствии манифестных форм гриппа.

- результаты разработки твердофазного ИФА для выявления антител к поверхностным гликопротеинам вируса гриппа птиц Н5№.

- материалы исследований, обосновывающих перспективность использования гетеротипичных вирусов «А/лошадь1/Прага56» (Н7Ы7) и «А/лошадь2/МаямибЗ» (НЗШ), в составе тест-систем ИФА для выявления антител к вирусам гриппа птиц Н7 и НЗ.

Личный вклад соискателя.

Экспериментальные исследования, анализ и обобщение результатов выполнены автором самостоятельно при участии научного руководителя д.в.н., М. Амирбекова. Исследования по разработке ИФА с гомологичными и гетерологичными антигенами вируса гриппа птиц выполнены совместно с к.б.н. Г.К. Юровым, к.б.н. C.B. Алексеенковой, В.В. Ивановым в период прохождения стажировки в отделе вирусологии ВИЭВ. Часть исследований по серодиагностике гриппа птиц выполнены совместно с сотрудниками Национального центра ветеринарной диагностики и Службы государственного ветеринарного надзора МСХ РТ Тиллоевым Т., Зухурбековой О. «Пособие для ветеринарных специалистов по борьбе с птичьим гриппом» разработано совместно с Мамадшоевым М.М. и Тошматовым Н. Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методической помощи сотрудникам ГНУ ВИЭВ имени Я.Р. Коваленко д.в.н., профессору К.П. Юрову, к.б.н., Г.К. Юрову и к.б.н., C.B. Алексеенковой.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, 3 в изданиях рекомендованных ВАК РФ (Журналы: «Иммунология», «Ветеринарная патология» и «Кишоварз» - (Земледелие)).

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 111 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, результаты исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Список литературы содержит 159 источника, из них - 140 иностранные. Диссертация иллюстрирована 2 таблицами, 12 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Сайдарова, Мухайё Махмадрахимовна

5. ВЫВОДЫ

1. Проведенными ретроспективными серологическими (иммунологическими) исследованиями сывороток крови кур в нескольких районах Республики Таджикистан в период 2008-2009 гг. обнаружены антитела к различным подтипам вируса гриппа птиц.

2. В реакции торможении гемагглютинации со штаммами 12-ти подтипов вирусов гриппа птиц выявлены антитела к низковирулентным штаммов вирусов гриппа птиц подтипов: НЗ, Н6, Н8, Н11, Н12, Н13.

3. Для выявления антител к вирусу гриппа Н5Ш разработана чувствительная тест - система, непрямой вариант твердофазного ИФА, позволяющая выявлять скрытые очаги гриппа птиц Н5Ш, в которых не наблюдают манифестные формы инфекции.

4. Исследованием в ИФА (с использованием разработанной нами тест-системы) сыворотки крови кур в районе Шахринав в 62,7 % обнаружены антитела к вирусу гриппа птиц Н5Ш. Полученные результаты позволяют заключить, что, несмотря на отсутствие в последние годы зарегистрированных вспышек гриппа птиц на территории Республики Таджикистан, в ряде районов циркулируют слабовирулентные штаммы возбудителя.

5. При отрицательных результатах РТГА на вирус Н5Ш получены совпадающие положительные результаты в ИФА и иммуноблотинге с использованием моноклональных антител к Н5, производства фирмы «Animal Genetics, Inc», Южная Корея.

6. Показано, что вирусы «А/лошадь 1/Прага56» (H7N7) и «А/лошадь 2/Маями63» (H3N8) могут использоваться как компонент тест-системы ИФА для ретроспективной диагностики гриппа птиц подтипов Н7 и НЗ.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработано (в соавторстве) «Пособие для ветеринарных специалистов для борьбы с птичьим гриппом».

Пособие утверждено Службой государственного ветеринарного надзора Министерства сельского хозяйства и охраны природы Республики Таджикистан 8 декабря 2007 г. и издано при финансовой поддержке представительства ЮНИСЕФ, 2007 г., стр. 1 - 89.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Сайдарова, Мухайё Махмадрахимовна, Душанбе

1. Абдусалямов И.А. Особенности миграции птиц в Таджикистане ГРИПП человека, животных и птиц в Таджикистане / И.А. Абдусалямов // Душанбе, -2008.- С. 97-99.

2. Бельяев A.J1. Грипп птиц глобальная проблема. / А.Н. Слепушкин // Журн. РЭТ - инфо, 2004. - №3 (51). - С. 39-43.

3. Бессарабов Б.Ф. Грипп птиц: / И.И. Мельникова, Н.К. Сущкова, С.Ю. Садчиков // Методическое пособие М: ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина. УДК 619:578(07). С. 59.

4. Джавадов Э.Д. Контроль над гриппом птиц. Грипп человека, животных и птиц в Таджикистане / Э.М. Амдий, Т.М. Салимов и др. // УДК 619:616.921.5:636.5/6 Душанбе, 2008, - С. 252-256.

5. Завьялов Е.В. Характеристика миграций водоплавающих птиц Саратовской области на основе анализа данных кольцевания и визуальных наблюдений / Г.В. Шляхтин, H.H. Якушев // Бекут: Украинский орнитол. журн. 2002. -Т. 11, выпуск 2. - С. 215-250.

6. Завьялов Е.В. Генезис и основные направления трансформации фауны птиц в условиях динамики естественных антропогенных факторов на севере Нижнего Поволжья: автореф. дис. . д. биол. наук Саратов, - 2005. - 46 с.

7. Каверин Н.В. Межвидовая трансмиссия вирусов гриппа А и проблема пандемии / Ю.А. Смирнов // Вопр. вирусол. 2003. - Т. 48, №3- С. 4 -10.

8. Кельмик Д.У. Грипп (чума) птиц. Болезни домашних ' и сельскохозяйственных животных / Д.У. Кельмик // Москва изд. Аквариум -2003.С.-673 -693.

9. Конопаткин A.A. Эпизоотология и инфекционные болезни сельскохозяйственных животных / И.А. Бакулов, Я.В. Нуйкин и др. // Изд. Колос. Москва 1983. - С. 461-466.

10. Липатов A.C. Эволюция вирусов гриппа птиц H5N1 с 1997 по 2004г. в Южной и Юго-Восточной Азии / Ю.А. Смирнов, Н.В. Каверин, Р.Г. Вебстер // Вопр. вирусол. 2005. - Т. 50, №4.- С. 11-17.

11. Львов Д.К. Новые и вновь возникающие вирусные инфекции / Д.К. Львов // Вопр. вирусол. 2000. Т. 45, № 4 - С. 4-7.

12. Львов Д.К. Межпопуляционные взаимодействия в системе вирусы гриппа А животные - человек / С.С. Ямникова, А.Д. Забережный, Т.В. Гребенникова // Вопр. вирусол. - 2005. - Т. 50, №4. - С. 4-11.

13. Макаров В.В. Высокопатогенный вирус гриппа птиц, вызывающий гриппозную пневмонию у человека / A.A. Воробьёв, В.М. Бондаренко, Б.В. Боев // Журн. Микробиол. №3. - 2005- С. 105-109.

14. Михеев A.B. Состояние и перспективы изучения сезонных миграций птиц в СССР. Трансконтинент связи перелетных птиц и их роль в распространении арбовирусов / A.B. Михеев // Новосибирск: Наука, 1978. -С. 13-17.

15. Митин Н.И. Характеристика моноклональных антител к антигенам вирусов гриппа и парагриппа птиц. / Е.Г. Реутов, A.A. Черных и др. // Ветеринария №10 1991. - С. 23 - 27.

16. Нецкий Г.И. Распространение и региональная экология арбовирусов трансконтинент, связи перелётных птиц и их роль в распространении арбовирусов / Г.И. Нецкий // Новосибирск: Наука, 1978. - С. 193-195.

17. Раушан Аманджанова. Высокопатогенный грипп птиц / Аскар Кожаев // Жур. Ветеринария 2008. - №2. - С. 10-14.

18. Салимов Т.М. Грипп птиц в Таджикистане ГРИПП человека, животных и птиц в Таджикистане / М.Ф. Фатхуддинова, Т. Тиллоев // Душанбе. 2008. -С. 247-251.

19. Тихонов З.В. Развитие учений об инфекционных болезнях животных и птичьем гриппе, (исторический аспект). / З.В. Тихонов. Изд. Юго-восток-сервис. // Москва. 2006. - С. 22-25.

20. Altmuller A. Genetic relatedness of the nucleoprotein (NP) of recent swine, turkey and human influenza A virus (H1N1) isolates / M. Kunerl, K. Muller, V.S. Hinshaw, W.M. FitchI // Virus Res. 22. 1991. - p. 79-87.

21. Aleksandr S. Lipatov. Neurovirulence in Mice of H5N1 Influenza Virus Genotypes Isolated from Hong Kong Poultry in 2001 / Scott Krauss, Malik Peiris, Jerold E. et al. // Journal of Virology. Vol. 77, No. 6. Mar. 2003 - p. 38163823.

22. Ayato Takada. Avirulent Avian Influenza Virus as a Vaccine Strain against a Potential Human Pandemic / Noritaka Kuboki, Katsunori Okazaki, Ai Ninomiya. et al. // Journal of Virology. Vol. 73, No.' 10. Oct. 1999. - p. 8303-8307.

23. Beard C.W. Demonstration of type-specific influenza antibody in mammalian and avian sera by immunodiffusion / C.W. Beard // Bull. WHO. 1970. - p. 779785.

24. Beard C.W. Protection of chickens against highly pathogenic avian influenza virus (H5N2) by recombinant fowipox viruses / W.M. Schnitzlein, D.N. Tripathy // Avian Dis. -1991. p. 350-359.4

25. Becker, W.B. The isolation and classification of tern virus: influenza virus / W.B. Becker // A/Tem/South Africa/ J. Hyg. 64. 1961. - p. 309-320.

26. Butler D. Bird flu: Crossing borders / Butler D. // Nature. 436. 2005. - p. 310-■31Г.

27. Capua I. (Mortality in Muscovy ducks (Cairina moschata) and domestic geese (Anser var. domestica) associated with natural infection with a highly pathogenic avian influenza virus of H7N1 subtypes / F. Mutinelli // Avian Pathol. 30.-2001.-p. 179-183.i

28. Capua I. Human health implications of avian influenza viruses and

29. Paramyxoviruses. Eur. J. Clin. / D. J. Alexxander // Microbiol. Inect. Diis. 23.2003.-p. 1-6.

30. Capua I. H7N1 Avian Influenza in Italy (1999-2000) in intensively reared chickens and turkeys / S. Mutinelli, D.J. Alexcander // Avian Pathol. 29. 2000. -p. 537-543.

31. Capua I. Avian influenza: resent development / D.J. Alexcander // Avian Pathol. 33. 2004. - p. 393-404.

32. Capua I. Strategies for the control of avian influenza in Italy / G. Cattoli, S. Marangon, G.Ortali // Vet. Rec. 2002. - p. 150-223.

33. Capua I. Review article: The avian influenza epidemic in Italy, 1999-2000 / S. Marangon // Avian Pathol. 29. 2002. - p. 289-294.

34. Capua I. Isolation of an avian paramyxovirus type 9 from migratory waterfowl in Italy / R. De Nardi, M.S. Beato, C. Terregino, M. et al. // Vet. Rec.2004.-p. 155-156.

35. Capua I. Increased resistance of vaccinated turkeys to experimental infection with an H7N3 low — pathogenicity avian influenza virus / C. Terrreging, G. Cattoli, A. Toffan // Avian Pathol. 33. 2004. - p. 47-55.

36. Choi Y.K. Studies of H5N1 influenza virus infection of pigs by using viruses isolated in Vietnam and Thailand in 2004 / T.D. Nguyen, H. Ozaki, R.J. Webby, et al. // J. Virol. 79. 2005. - p. 10821-10825.

37. Chua T-H. Performance evaluation of five detections tests for avian influenza antigen with various avian samples / T.M. Ellis, C.W. Wong, Y. Guan, et al. // Avian Dis. 51.- 2007. p. 96-105.

38. Collins R.A. Detection- of highly pathogenic and low pathogenic avian influenza subtype H5 (Eurasian lineage) using NASBA / L.S. Ko, K.L So, T. Ellis, L.T. Lau, et'al.' // J. Virol. Methods. 103. 2002. - p. 213-225.

39. David L. Comparisons of Highly Virulent H5N1 Influenza A Viruses Isolated from Humans and Chickens from Hong Kong / L. Michael, Nancy Cox, Thomas Rowe, et al. // Journal of Virology. Vol. 72, No. 8. Aug. 1998. - p. 6678-6688.

40. David L. Evolution of avian influenza viruses / L. David // Veterinary Microbiology. 74. 2000. - p. 15-27.

41. Daprile P.N. Current situation of avian influenza in Italy and approaches to its control / P.N. Daprile // In: Acute Virus Infections of Poultry, McFerran J.B. & McNulty M.S., eds. Martinus Nijhoff, Dordrecht, The Netherlands. 1986. - p. 29-35.

42. Delogue M. Ecological aspects of influenza A virus circulation > wild birds of the Western Palearctic / M. A. De Marco, I. Donatelli, L. Campitelli // Vet. Res. Commun. 27 (1). 2003. - p. 101-106.

43. Easterday B.C. Influenza. In: B.W. Calnek, H.J. Barnes, L.R. Macdougald, Y.M. Saif, C.W. Beard. (Hrsg.); Diseases of Poultry. 10. Aufl. Iowa State of University Press, Ames, Iowa. 1997. - p. 541-569.

44. Englund L. Avian influenza A virus causing an outbreak of contagious interstitial pneumonia in mink / B. Klingeborn, T. Mejerland // Acta Vet Scand. 27(4).- 1986.-p. 497-504.

45. Erich Hoffmann. Characterization of the Influenza A Virus Gene Pool in Avian Species in Southern China: Was H6N1 a Derivative or a Precursor of

46. H5N1 / Juergen Stech, Irina Leneva, Scott Krauss, et al. // Journal of Virology. Vol. 74, No. 14. July. 2000. - p. 6309-6315.

47. Elphick J. Colling Atlas of bird migration / J. Elphick // Verlag Marshall, New York, S.-1995.-p. 88-132.

48. Eric С.J. Class, Pandemic influenza is a zoonosis, as it requires introduction of avian-like gene segments in the human population / C.J. Eric. // Veterinary Microbiology 74. 2000. p. 133-139.

49. FAO Technical Task Force on Avian Influenza: Potential risk of highly pathogenic avian influenza (HPAI) spreading through wild water bird migration. // FAO AIDE News, Special issue no. 2005. - p. 33.

50. Fouchier, R.A.M. Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of PNAS / P.M. Schneeberg, F.W. Rozendaal, J.M. Broekman, et al. // Animal Health Association. 101 (5). 2004. - p. 1356-1361. .

51. Geraci JR. Mass mortality of harbor seals: pneumonia associated with influenza A virus / DJ. Aubin, IK. Barker, RG. Websterr, et al. // Science. 215. 1982. p. 1129-31.

52. Govorkova E.A. Lethality to ferrets of H5N1 influenza viruses isolated from humans and poultry in 2004 / J.E. Rehg, H.L. Krauss, Y. Yen, et al. // J. Virol. 79.-2005.-p. 2191-2198.

53. Garcia A. Efficacy of inactivated H5N2 influenza vaccines against lethali

54. A/chicken/Queretaro/19/95 infection / H. Johson Kumar, D. Srivastana, D.A. Jayawardene, et al. // Avian Dis. 42. 1998. - p. 248-256.

55. Ge J. Newcastle diseases virus-based live attenuated vaccine completely protects chickens and mice from lethal challenge of homologous and heterologous H5N1 avian influenza viruses / G. Deng, Z. Wen, G. Tian, et al. // J. Virol. 81. -2007.-p. 150-158.

56. Gresikova M: BIsolation of influenza virus from wild ducks (anas platyrhynchos) / A. Tumova, M. Sekeyova: // Acta Virol. 22. 1978. - p. 296301.

57. Guo Y. Characterization of a new avian-like influenza-A virus from horses in China / Wang, Kawaoka Y, Gorman O, Ito T, Saito T, Webster RG, Virology. 188(1).-1992.-p. 245-255.

58. Halvorson D.A. Strengths and weaknesses of vaccines as a control tool. Proceedings of the Fourth International Symposium on Avian Influenza, Athens, Georgia, USA. Swayne D.E. Slemons R.D., eds. U.S. // Animal Health Association. 1998. - p. 223-227.s

59. Halvorson D.A. Outbreaks of low pathogenicity avian influenza in USA.

60. Proceedings of the Fourth international Symposium on Avian influenza, Athens,

61. Georgia, USA. D.E. Swayne, R.D. Slemons, / D.D. Frame, A.J. Friendshuh Ndshuh. // Animal Health Association. 1998. - p. 36-46.

62. Hafez H.M. Investigations on Avian Influenza A in meat turkey flocks in Germany / C. Prusas, S. Cortez De Jackel, O. Werder. // Arch. Geflugelk. 67(1). -2003.-p. 11-15.

63. Hinshaw V.S. The perpetuation of orthomyxoviruses and paramixoviruses in Canadian waterfowl / R.G. Websterb, B. Turner // Can. J. Microbiol. 26. 1980. -p. 622-629.

64. Hinshaw V.S. Characterization of two influenza A viruses from a pilot whale / W.J. Bean, J.R. Geraci, P Fiorelli, et al. // J Virol. 58. 1986. - p. 655-658.

65. Homme P.J. Avian influenza virus infections 11. Experimental epizootiology of influenza A/turkey/Wisconsin/1966 virus in turkeys / P.C. Easterday, D. P. Anderson // Avian Dis. 14. 1970. -p. 240-247.

66. Hoffmann E. Characterization of the influenza A virus gene pool in southern China: was H6N1 a derivative or a precursor of H5N1 / J. Stech, I. Leneva, S. Krauss, et al. // Virol. 74. 2000. p. 6309-6315.

67. Horimoto T. Origin and molecular changes associated5 with emergence of a highly pathogenic H5N2 influenza virus in Mexico / E. Rivera, J. Pearson, D. Senne et al. // Virology. 213. 1995. - p. 223-30.

68. Hoffmann B. Rapid and highly sensitive pathotyping of avian influenza A H5N1 virus by using real-time reverse transcription PCR / T. Harder, E. Starick, K. Depner, et al.. // J. Clin. Microbiol. 45. 2007. - p. 600-603.

69. Imai M. Development of H5-RT-LAMP (loop-mediated isothermal amplification) system for rapid diagnosis of H5 avian influenza virus infection / A. Ninomiya, H. Minekawa, T. Notomi, T. Ishizaki, M. Tashiro et al. // Vaccine. 24. -2006.-p. 6670-6682.

70. Jacqueline M. Katz. Molecular Correlates of Influenza A H5N1 Virus Pathogenesis in Mice / Lu Xiuhua, M. Terrence Tumpey, B. Catherine et al. // Journal of Virology. Nov. Vol. 74, No. 22. 2000: - p. 10807-10810.

71. Janiice M. Protection against a Lethal Avian Influenza A Virus, in a. Mammalian System / Riberdy, Kirsten J. Flynn, Juergen Stech, G. Robert Webster, et al. // Journal of Virology. Vol. 73, No. 2. Feb. 1999. - p. 14531459.

72. Kaleta; E.F. Avian influenza A viruses in birds-an ecological, ornithological and virological view / G. Ilergarten, A. Yilmaz // Dtsch. tierarztl. Wochenschrift. -112 (12).-2005.-p. 441-480.

73. Kennedy F. Interspecies transmission^ of influenza vimses: H5Nl virus and a Hong Kong SAR perspective / Shortridgea, Peng Gaob, Yi Guanc, Toshihiro Itod, et,al. // Veterinary Microbiology. 74. 2000. - p. 141-147.

74. Kida H. Duck influenza lacking evidence of disease signs and immune response /R. Yanagawa, Y. Matsuoka // Infect Immun. 30. 1980: - p. 547-53.

75. Ko L.S. Nucleic acid: sequence-based amplification methods to detect avian influenza virus / L.T. LaUj J. Banks, R. Aherne, I.H: Brown, et al. // Biochem Biophys. Res. Commun. 313. 2004. - p. 336-342.

76. Kuiken, T. Avian H5N1 influenza in cats / G. Rimmelzwaan, D. Van Riel, G. Van Amerongen, et al. // Science. 2004. - p. 306-241.

77. Lee C.W. Effect of vaccine use in the evolution of Mexican Lineage H5N2 avian influenza virus / D.A. Senne, D.L. Surez // J. Virol. 78(15). 2004. - p. 8372-8381.

78. Liu H.Q. Genetic mutations of the hemagglutinin genes of H9N2 subtype avian influenza virus / D.X. Penge, J. Cheng' et al. // J. Yangzhou University, Agriculture and Life Sciences Edition. 23. 2002. - p. 6-9.

79. Lois A. Pathogenesis of Avian Influenza A (H5N1) Viruses in Ferrets / Zitzow, Thomas Rowe, Timothy Morken, Wun-Ju Shieh, et al. // Journal of Virology. Vol. 76, No. 9. May. 2002. - p. 4420-4429.

80. Londt B.Z. Highly pathogenic avian influenza viruses with low virulence for chicken's in vivo tests / J. Banks, D.J. Alexcaander // Avian Pathol. 36. 2007. - p. 347-350.

81. Maines T.R. Avian influenza (H5N1) viruses isolated from humans in Asia in 2004 exhibit increased virulence in mammals / X.H. Lu, S.M. Erb, L. Edwarders, J. Guarner, P.W. Greer, D.C. Nguyen, et al. // J. Virol. 79. 2005. -p. 11788-11800.

82. Masato Hatta. The continued pandemic threat posed by avian influenza viruses in Hong Kong / Yoshihiro Kawaoka // Trends in Microbiology Vol.10 No.7. July. 2002. - p. 340-345.

83. Michael L. Structural features of the avian influenza virus hemagglutinin that influence virulence / Perdue, David L. Suarez // Veterinary Microbiology. 74. -2000. p. 77-86.

84. Ministry of Agriculyure, P.R. China Poultry avian influenza vaccination in China. 2006. электронные ресурсы. - 2006.http://www.agri.Gov.cn/ztzl/gdztzl/P020061023368529330005.pdf.

85. Munch M. Detection and subtyping (H5 andH7) of avian type A influenza virus by reverse transcription PCR and PCR- ELISA / L. Nielsen, K. Handberg, P. Jorgensen // Arch. Virol. 146. - 2001. - p. 87-97.

86. Naeem K. The avian influenza H7N3 outbreak in Sound Central Asia. // Proceedings of the Fourth International Symposium, on Avian Influenza, Athens, Georgia, USA. Swayne D.E. & Slemons R.D., eds. U.S. Animal Health Association. 1998. - p. 31-35.

87. Naeem K. Avian influenza A subtype H9N2 in poultry in Pakistan / A. Ullan, R.J. Manvell, D.J. Alexander // Vet. Rec. 1999. - p. 145-560.

88. Nakaya T. Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector / J. Cros, M.S. Park, Y. Nakava, A. Sagrera, et al. // J. Virol. 4. 2001. - p. 11868-11873.

89. Nikolai V. Influenza H5 virus escape mutants: immune protection and antibody production in mice / A. Yuri, Smirnov, K. Asya, Gitalman, et al. // Virus Research. 99. 2004. - p. 205-208.

90. Paul Sockeett. Avian influenza / Sockeett Paul. // Can Med Assoc J FEB. 10. 158 (3).- 1998.-p. 369.

91. Perkins L.E. Comparative susceptibility of selected avian and mammalian species to a Hong Kong-origin H5N1 high-pathogenicity avian influenza virus / D.E. Swayne // Avian Dis. 47. 2003. - p. 956-967.

92. Price R.J. Commercial avian influenza vaccines / R.J. Price // In: Proceedings of the First Avian Influenza Symposium, 1981. Cater Comp., Richmond, USA. 1982.-p. 178-179.

93. Rappole J.H. Birds and influenza H5N1 virus movement to and within North America / Z. Hubaler // Emerg. Lnf. Dis. 12 (10). 2006. - p. 1486-1492.

94. Rick A. Impact of glycosylation on the immunogenicity of a DNA-based influenza H5 HA vaccine / Bright, Ted M. Ross, Kanta Subbarrao, L. Harriet, et al. // Virology. 308. 2003. - p. 270-278.

95. RimmelzwaanI G.F. Influenza A Virus (H5N1) infection in cats causes systemic disease with potential novel routes of virus spread within and between hosts. Am / D. Van Riel, M. Baars, T.M. Bestebroer, et al. // J. Patthoi. 168. -2006.-p. 176-183.

96. Richarz K. Siedlungen in: K. Rcharz, E. Bezzel, M. Hormann (Hrsg): Taschenbuch fur Vogelschutz. AULA-Veriag, Wiebelsheim. 2001. - p. 276-302.

97. SinneckerH J. Studies of some biological and molecular characteristics of avian influenza A/H7 (Havl) subtypes / H.J. Egert, J. Eggert, S. Gogolin, GUMPEL, et al. // Acta virol. 30. 1986. - p. 25-34.

98. Sinnecker R. Surveillance of pelagic birds for influenza A viruses / H. Sinnecker E. Zilske, et al. // Acta. Virol. 27. 1983. - p. 75-79.

99. Sominina A.A / et al. Int Symp. lOOYeas of Virol St-Peterburg. M. -1992.-p. 103.

100. Songserm T. Fatal Avian Influenza A H5N1 in a Dog / A. Amonsin, R. JamOn, N. Sae-Heng, et al. // Emerg. Inf. Dis. 12 (11). 2006. - p. 1744-1747.

101. Stallknecht D. E. Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water / M.T. Kearney, S.M. Shane, et al. // Avian Dis. 34.-1990.-p. 412-418.

102. Sturm-Ramirez K.M. Reemerging H5N1 influenza viruses in Hong Kong in 2002 are highly pathogenic to ducks / T. Elliss, B. Bousfield, L.Bissett, et al.7/ J. Virol. 78 (9). 2004. - p. 4892-901.

103. Swayne D.E. Evaluation of the kidney of a potential site of avian influenza virus persistence in chickens / R.D. Slemons // Avian Dis. 36. 1992. - p. 937944.

104. Swayne D.E. Halvorson D.A. Influenza in: Y.M. Saif, H.J. Bernes, J.R. Glisson, (Hrsg.): Diseases of Poultry. 11. Aufl. Iowa State University Press, Ames, Iowa. 2003. - p. 135-160.

105. Swayne D.E. Highly pathogenic avian influenza / D.L. Suarez // Rev. Sei. Tech. 19. 2000. - p. 463-468.

106. Scholtissek C. Genetic relatedness of hemagglutinins of the HI subtype of influenza A viruses isolated from swine and birds / H. Burger, P.A. Bachmann, C. Hannoun // Virology. 129. - 1983. - p. 521-528.

107. Shantha Kodihalli, DNA Vaccine Encoding Hemagglutinin Provides Protective Immunity against H5N1 Influenza Virus Infection in Mice / Hideo Goto, L. Darwyno Kobasa, Scott Krauss, et al. // Journal of Virology. Vol. 73, No. 3. Mar. 1999. - p. 2094-2098.

108. Stallknech ED. Ecology and epidemiology of avian influenza viruses in wild bird populations: waterfowl, shorebirds, pelicans, cormorants, etc., Proc. 4th International Symp. on Avian Influenza, May 29-31, 1997, Athens, USA, p. 6167.

109. Shafer A.L. Development and validation of a competitive enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Type A influenza antibodies in avian sera / J.B. Katz, K.A. Eernisse // Avian Dis. 42. 1998. - p. 28-34.

110. Sims L.D. Avian influenza in Hong Kong. Proceeding of the Fifth International Symposium on Avian Influenza, Athens, Georgia, USA, 14-17 April 2002 / L.D. Sims // Avian Dis. 47. 2003. - p. 832-837.

111. Slomka M.J. Identification of sensitive and specific avian influenza PCR methods through blind ring trials in the European Union / V.J. Coward, J. Banks, B.Z. Londt, et al. // Avian Dis. 51. 2007. - p. 227-234.

112. Slomka M.J. Validated H5 Eurasian real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction and its application in H5N1 outbreaks in 2005 2006 / T. Pavidis, J. Banks, W. Shell, et al. // Avian Dis. 51. - 2007. - p. 373-377.

113. Spackman E. Development of a real-time reverse transcriptase PSR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes / D.A. Senne, T.J. Myers, L.L. Bulaga, et al. // J. Clin. Microbiol. 40. 2002. - p. 32563260.

114. Starick E. Type-and subtype-specific RT PCR assays for avian influenza viruses / Romer - Oberdorfed, O. Werner // J. Vet. Med. В. 47- 2000. - p. 295 -301.

115. Swayne DE. Efficacy of recombinant fowl poxvirus vaccine in protecting chickens against a highly pathogenic Mexican-origin H5N2 avian influenza virus / JR. Beck, TR. Mickle // Avian Dis. 41(4). 1997. - p. 910-22.

116. Swayne DE. Pathogenicity and diagnosis of H5N2 Mexican avian influenza viruses in chickens / ML. Perdue, M. Garcia, E. Rivera-Cruz, et al. // Avian Dis. 41(2).- 1997.-p. 335-346.

117. Swayne D.E. Avian influenza vaccine use during 2001. In: Proceedings of the 104th annual meeting of the US Animal Health Association US AHA, Richmond, Virginia, USA. 2001. - p. 469-471.

118. Swayne D.E. Vaccines for list A poultry diseases; emphasis on avianinfluenza / D.E. Swayne // Dev. Boil. (Basel). 2003. - p. 201-212.

119. Swayne D.E. & Suarez D.L. Avian influenza in Europe, Asia and Central America during 2001. In Proceedings of the 104th annual meeting of the US Animal Health Association USAHA, Richmond, Virginia, USA. 2001. - p. 465-470.

120. Taisuke Horimoto. Direct Reverse Transcriptase PCR To Determine Virulence Potential of Influenza A Viruses in Birds / Yoshihiro Kawaoka // Journal of Clinical Microbiology, Vol. 33, No. 3. Mar. 1995. - p. 748-751.

121. Terrence M. Characterization of a Highly Pathogenic H5N1 Avian Influenza A Virus Isolated from Duck Meat / Tumpey, L. David, Suarez; E.L. Laura, et al. // Journal of Virology. Vol. 76, No. 12. June. 2002. - p. 6344-6355.

122. Teifke J. Pathology of highly pathogenic avian influenza virus A/swan/Germany/R65/06 infection in mute (Cygnus olor) and whooper swans (Cygnus cygnus) / R. Klopfleisch, A. Globig, E. Starick, et al. // Vet. Pathol. -44 (2). 2007. - p. 137-143.

123. Toshihiro Ito. Generation of a Highly Pathogenic Avian Influenza A Virus from an Avirulent Field Isolate by Passaging in Chickens / Goto Hideo, Yamamoto Eiji, Tanaka Hiroko, et al. // Journal of Virology. Vol. 75. No. 9. May. 2001. - p. 4439-4443.

124. Thanawongnuwech R. Probenle tiger-to-tiger transmission of avian influenza H5N1 / A. Amonsin, R Tantilertcharoen, E. Tunak // Emerg. Inf. Dis. 11. -2005. p. 699-701.

125. Thomas Rowe. Detection of Antibody to Avian Influenza of Clinical Microbiology / A. Robert, Abernatly, Jean Hu-Primmer, W. William, et all. // Journal of Virology. Vol. 37, No. 4. Apr. 1999. - p. 937-943.

126. Vahlenkamp T.W. Influenza virus infections in mammals / T. C. HARDER. // Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr. 119 (3/4). 2006. - p. 123-131.

127. World Health Organization Expert Committee. A revision of the system of nomenclature for influenza viruses: a WHO Memorandum. Bull. WHO. 58. -1980.-p. 585-591.

128. World Organization For Animal Health (OIE). Chapter 1.1.2. Avian influenza. In: Terrestrial Animal Health Code, 12 Edition, rue de Prony, 75017 Paris, France pp 2010.i r

129. Yuri A. Influenza H5 virus escape mutants: immune protection and antibodyproduction in mice / Smirnov, K. Asya, Gitelman, A. Elena, et al. // Virus Research. 99. 2004. - p. 205-208.

130. Webster R.G. H5N1 outbreaks and enzootic influenza / M. Peiris, H. Chen, Y. Guan // Emerg. Inf. Dis. 12(1).- 2008. p. 3-8.

131. Webster R.G. Intestian ihfluenza: Replication' and characterization of influenza viruses in ducks / M. Yakhno, V.S. Hinsh'aw, W.J. Bean, et al. // Virol. 84. 1978. - p. 268-278.

132. Webster R.G. Evolution and ecology of influenza A viruses / W.J. Bean, O.T. Gorman, T.M. Chambers, et al. //Microbiol. Rev. 56. 1992. - p. 152-178.

133. Werner O. Bekampfungsstrategouen bei Klassischer Geflugelpest in Deutschland und der Europaischen Union / Т. Harder // Bern. Munch. Tierarztl. Wochenscher. 119 (3/4). 2006. - p. 151-159:

134. Werner О. Aviare Influenza-Reichen dies Uberwachugsmabnanmen aus. In: DVG-Taguang Fachgruppe "Geflugelkranheiten", Referatesammlung, 63. / O. Werner//Fachgesprach, hannover. 2002. - p. 81-67.

135. Werner O. Klassische Geflugelpest-Eine Ubersicht. Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr. 119 (3/4). 2006. - p. 140-150.

136. Werner O. Orthomyxoviridae in: Siegmann, О., o. U. Neumann (Hrsg.): / E.F. Kaleta // Kompendium der Geflugelkrankheiten. Schlutersche Verlagsbuchhandiung, Hannover. 2005.

137. Werner O. Avian Influenza / T. Harder // http:/www. Influenzareport.com. Zugriff. Электронные ресурсы. 28.08.2006.

138. Wolf P.U. Erstbeschreibung diagnostischer Leibefunde. Letal verlaufende influenza bei Hauskatzen nach naturlicher Infektion mit H5N1/Asia in Deutschland.Deutsch / W. Uhl, S. Gerst, C. Wolf, K. Gerst, M. Klopries // Tierarztebl. 4. 2006. - p. 426-431.

139. Webster RG. Intestinal influenza: replication and characterization of influenza viruses in ducks / MA. Yakhno, VS. Hinshaw, WJ. Bean, et al. // Virology. 84. 1978. - p. 268-78.

140. Xiuhua LU. A Mouse Model for the Evaluation of Pathogenesis and Immunity to Influenza A (H5N1) Viruses Isolated from Humans / M. Terrence, Tumpey, Timotly Morkeen, et al. // Journal of Virology. Vol. 73, No. 7. July -1999.-p. 5903-5911.