Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Распространение дирофиляриоза собак в Краснодарском крае и разработка его диагностики иммуноферментной реакцией

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Распространение дирофиляриоза собак в Краснодарском крае и разработка его диагностики иммуноферментной реакцией"

На правах рукописи

МЕДВЕДЕВ Андрей Юрьевич

РАСПРОСТРАНЕНИЕ ДИРОФИЛЯРИОЗА СОБАК В КРАСНОДАРСКОМ КРАЕ И РАЗРАБОТКА ЕГО ДИАГНОСТИКИ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ РЕАКЦИЕЙ

Специальность 03.00 19 - паразитология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва-2007

Работа выполнена в ГНУ Всероссийском научно - исследовательском институте гельминтологии им К И Скрябина

Научный руководитель доктор ветеринарных наук,

профессор Гаркави Борис Львович

Официальные оппоненты доктор ветеринарных наук, профессор

Малахова Екатерина Ивановна ВНИИ гельминтологии им К И Скрябина (ВИГИС)

Кандидат ветеринарных наук Шемяков Дмитрий Николаевич Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им К И Скрябина (МГАВМиБ)

Ведущая организация Кубанский государственный аграрный

университет

Защита состоится «¿¿ъ октября 2007 в часов на заседании диссертационного совета Д 006 011 01 при Всероссийском научно - исследовательском институте гельминтологии имени К И Скрябина (ВИГИС)

Адрес 117218, Москва, ул Большая Черемушкинская, д 28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИГИС Автореферат разослан «И^» сентября 2007 г

Ученный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Бережко В К

Введение

Актуальность проблемы. Дирофиляриоз широко распространенное заболевание собак и кошек Возбудителями дирофиляриоза домашних животных служат круглые паразитические черви DirofQaria immitis, локализующиеся в правом желудочке и легочных артериях и Drrofilana repens, паразитирующие в подкожной клетчатке Паразитируя в сердце собак и кошек, дирофилярии вызывают расстройства кровообращения в результате механической закупорки и эндокардита, клинически проявляющегося расстройством сердечной деятельности D repens у животных проявляется поражением кожи

Дирофиляриоз является трансмиссивным заболеванием Развитие возбудителей дирофиляриоза происходит с участием промежуточного хозяина комаров родов Aedes, Culex, Anophelus

Дирофиляриоз является зоонозным заболеванием Дирофилярии в организме человека не достигают половой зрелости Неполовозрелые дирофилярии обнаруживаются в глазу и других жизненно важных органах человека, для их удаления требуется хирургическое вмешательство

Изучением дирофиляриоза собак в России занималось много исследователе, но тем не менее остаются недостаточно изученными вопросы эпизоотологии дирофиляриоза собак в южных районах России, в Нижнем Поволжье, Северном Кавказе, в том числе в Краснодарском крае, где он особенно широко распространен и иммунодиагностика этой инвазии, что явилось предметом наших исследований и определило цель работы.

Цель и задачи исследований. Целью нашей работы явилось изучение распространения дирофиляриоза в различных климатических зонах Краснодарского края и разработка серологической диагностики дирофиляриоза

Для выполнения поставленной дели необходимо было решить следующие задачи-

• Изучить распространение дирофиляриоза собак в городской и сельской местности Краснодарского края

• Определить сезонную периодичность появления микрофилярий в крови собак

• Установить влияние возраста, пола, породы, типа содержания на зараженность собак D immitis

• Изучить влияние D immitis на организм собак, гематологические и биохимические показатели крови животных

• Приготовить соматический экстракт из половозрелых дирофилярий, провести его фракционирование и выделить наиболее эффективную диагностическую фракцию

• Провести электрофоретический анализ соматического фракционированного экстракта дирофилярий в ПААГ

• Отработать параметры постановки иммуноферментной реакции (ИФР) и оценить диагностические качества фракционированного соматического антигена в ИФР

• Провести производственные испытания ИФР при дирофиляриозе собак

Научная новизна Впервые установлено распространение дирофиляриоза у собак городской и сельской местности в условиях Краснодарского края. Максимальная инвазированность собак В шш^ установлена в возрасте 5-7 лет. Выяснено влияние пола, породы, условий содержания на зараженность собак дирофиляриями Установлена сезонная динамика дирофиляриоза. Проведено фракционирование экстракта О. ишшйз и определена наиболее активная и специфичная фракция Определена молекулярная масса двух белковых компонентов диагностически эффективной фракции соматического антигена из половозрелых Б шшийв, которая составила 19,3 и 20,5 кДа соответственно Впервые в России разработан серологический метод прижизненной диагностики дирофиляриоза собак на основе иммуноферментной реакции с использованием фракционированного соматического экстракта половозрелых дирофилярий Установлена чувствительность и специфичность ИФР при дирофиляриозе собак — 84,0 и 86,46% соответственно Оценена эффективность мнкрофилярицидного действия ивермектина в дозе 0,2 мг/кг массы (100%) Проведена оценка профилактического действия моксидектина в дозе 3 мкг/кг при дирофиляриозе собак в условиях Краснодарского края

Практическая значимость. Результаты изучения эпизоотологии дирофиляриоза и усовершенствование методов диагностики этого заболевания в условиях Краснодарского края используются при разработке мер борьбы с этой болезйыЬ

По материалам диссертации разработан лабораторный регламент на выявление антител к дирофиляриям (О шишШ) у собак, одобренный секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (сентябрь 2006г )

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на

1 Заседаниях ученного совета ВИГИС (203-2006гг)

2 Научной конференции ВОГ «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (г Москва, 2004,2005)

3. Секции «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2006г.)

Основное содержание диссертации опубликовано в 3 печатных работах

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 137 страницах основного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов собственных исследований, их обсуждения, выводов и списка использованной литературы из 197 источников, в том числе 67 авторов СНГ и 130 иностранных

Диссертация иллюстрирована 16 таблицами, 7 рисунками и 3 фотографиями

Основные положения, выносимые на защиту;

1. Распространение, эпизоотология дирофиляриоза собак в разных ландшафтно-климатических районах Краснодарского края,

2. Получение соматического фракционированного антигена из половозрелых Б шишйз и его физико - химическая характеристика,

3. Разработка диагностической тест-системы на основе ИФР при дирофиляриозе собак с использованием соматического фракционированного антигена,

4. Оценка лечебного и профилактического действия ивермектина и моксидектина при дирофиляриозе собак в условиях Краснодарского края

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 2.1 Обзор литературы

В литературном обзоре проанализированы различные аспекты рассматриваемой проблемы по систематике, морфологии и биологии дирофилярий, эпизоотологии, распространению дирофиляриоза у человека, влиянию дирофилярий на организм собак, методов посмертной и прижизненной диагностики, терапии и профилактики дирофиляриоза

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1 Материалы и методы исследования

Распространение дирофиляриоза собак в городской и сельской местности в разных ландпгафтно-климатических условиях края изучали на основании исследований проб крови методом концентрации Всего обследовали 1192 собаки г Краснодара и 234 собаки из разных районов Краснодарского края

Работу по распространению дирофиляриоза среди собак проводили в период 2003 -2006 гг в Краснодарском крае во все сезоны года.

Диагностические исследования по обнаружению микрофшшрий в крови собак проводили согласно модифицированному методу Knott (1939), а также по методу неполных гельминтологических вскрытий в разных районах Краснодарского края В объект исследования вошли Приморско-Ахтарский, Павловский, Лабинский, Славянский, Красноармейский, Тимашевский районы, г. Краснодар и г Москва

Интенсивность инвазии D ímnutis среди собак изучали на основании гельминтологических вскрытий сердца, легочной артерии и подкожной клетчатки 26 трупов собак г Краснодара и других районов края При гельминтологическом вскрьггии у каждого животного подсчитывали количество дирофилярий, определяли экстенсивность (ЭИ, %) и интенсивность инвазии (ИИ, экз./гол ). Полученные результаты обработали статически с расчетом средних величин, их ошибки и уровня достоверности с использованием компьютерной программы Microsoft Excel

Возрастную и сезонную динамику инвазированности собак дироФиляриями изучали в условиях Краснодарского края в 2003-2005 гг по результатам исследований проб венозной крови 31 щенка в возрасте до года, а также 44, 47,28,24 собак в возрасте соответственно 13, 4-6, 7-9, 10 лет и старше У собак различных возрастных групп брали кровь в разные сезоны года и исследовали методом концентрации

Влияние породы, пола и типа содержат™ ня инвазированность дироФиляриями изучали на 770 собаках разного возраста После изученйя распространения и сезонно-возрастной динамики инвазированности собак дирофиляриями проводили анализ зараженности их с учетом пола, породы и назначения домашнего содержания (мелкие и служебные породы), дворовые, бродячие

Сезонную периодичность появления микрофилярий D ímmitis в крови изучали на 508 спонтанно инвазированных собаках У собак брали пробы крови из подкожной вены предплечья в разное время года и устанавливали наличие микрофилярий методом концентрации по Knott (1939)

Дифференциальное окрашивание личинок и видовой состав микрофилярий собак

Краснодарского края изучали путем окрашивания личинок кислой фосфатазой (Chalifoux L, Hunt RD, 1971). Всего исследовано 50 проб крови с мшсрофиляриями Сначала микрофилярии отмывали от эритроцитов Затем личинки инкубировали в субстрате, состоящем из мединалового буфера, парарозапинилинового красителя и AS-TR нафтола, 1 час при 37 °С Далее промывали в дистиллированной воде и помещали в 1% метиленовый зеленый Через 2-3 минуты отмывали снова дистиллированной водой Дегидротировали сначала в 95%, затем в 100%-ном этиловом спирте и промывали в ксилоле Личинки после такой обработки можно увидеть как осадок красного цвета

Влияние D immitis на клинические показатели изучали у 73 собак общепринятыми методами: клинический осмотр, термометрия, аускультация Рентгенографию проводили на аппарате 12П5, электрокардиографию - на полиспектр нейрософт V 4 690

Влияние D. immitis на гематологические и биохимические показатели крови у собак изучали на базе ветеринарных клиник г Краснодара «Доверие» и г Москвы «Белый клык-М» В опыте использовали 10 собак, спонтанно инвазированных D immitis, и 10 собак, свободных от дирофилярий и другой инвазии После постановки диагноза у собак брали пробы крови для гематологических и биохимических исследований Пробы крови брали в специальные пробирки для данных исследований. Гематологические показатели определяли общепринятыми методами* эритроциты и лейкоциты подсчитывали при помощи счетной камеры Горяева, гемоглобин при помощи гемоглобинметра «МИНИГЕМ 540», гематокрит определяли, используя гемагокритные капилляры и центрифугу при 2000 об /мин в течение 5-7 минут, СОЭ - микрометодом в капилляре Панченкова Для подсчета лейкограммы мазки крови красили по Романовскому-Гимза и подсчитывали по 100 клеток, а затем выводили процентное соотношение отдельных видов лейкоцитов

Биохимические показатели крови собак исследовали на анализаторе «Clima MC 15» с определением уровня аспартат-трансаминазы (ед /л), апанин-трансаминазы (ед /л), щелочной фосфатазы (ед./л), креатинина (ед /л), билирубина (мкмоль/л), прямого билирубина (мкмоль/л), мочевины (моль/л), глюкозы (моль/л), общего белка (г/л) и альбумина (г/л), а-амилазы (ед./л.), натрия (ммоль/л), калия (ммоль/л), кальция (ммоль/л)

Кроме того, у этих собак учитывали общие клинические показатели по общепринятым методам

Микрофилярищидное действие ивермектина изучали на 20 собаках, спонтанно инвазированных D immitis, распределенных на 2 равноценные группы Животным первой группы препарат давали в дозе 0,2 мг/кг, второй - 0,006 мг/кг

Учет эффективности ивомека проводили путем исследования проб крови до и через 14, 30 и 120 дней после введения препарата. Кровь брали по 1- 2 мл из вены предплечья и

исследовали концентрирующим методом (Knott, 1939)

Испытание оптимальной схемы профилактики дирофиляриоза собак с применением моксидектина проводили на 50 собаках разного возраста. Животные до опыта были свободны от микрофилярий по результатам предварительных исследований проб крови Моксидектин вводили в дозе 3 мкг/кг с интервалом 30 дней в период с марта по ноябрь Контролем служили 50 собак, которые не получали препарат. Эффективность применения этой схемы профилактики оценивали на основании исследований проб крови собак в начале опыта и через 7,14 и 30 дней

В последующем моксидектин применяли в той же дозе в течение всего периода активности комаров с интервалом 30 дней и последний раз препарат вводили через месяц после окончания лета комаров - в ноябре 2004

Контрольная группа состояла из 50 собак и не получала моксидектин. Пробы крови собак обеих групп исследовали на наличие микрофилярий спустя 7 месяцев после окончания лета комаров.

Приготовление соматического экстракта. Гельминты собирали из свежих трупов собак, инвазированных дирофиляриями, и помещали в физиологический раствор 0,9% в соотношении 110 (вес и объем) и измельчали в ступке на холоде до получения однородной массы Экстрагирование белков проводили в течение 24 часов в этом же растворе при 4°С на магнитной мешалке По окончании экстрагирования гомогенат центрифугировали при 15000 об/мин в течение 30 мин на холоде, осадок удаляли, а супернатант использовали в качестве экстракта.

Получение соматического фракционированного антигена дирофилярий Фракционирование цельного экстракта из дирофилярий проводили гель-хроматографией на колонке (Pharmacia) размером 16x70 см Колонку заполняли Superóse 12 Prep Grade и уравновешивали 20 мМ растворами натрия-фосфата, натрия хлорида pH 7,0, 0,025% бромонитродиоксапа Перед хроматографией экстракт имеет выраженную опалесценцию, исчезающую после фильтрации через фильтр 0,45 мкм Скорость протока 30 мл/час под держивали перистальтическим насосом Micropeipex (Pharmacia) Фракции собирали по 3 мл в пробирку, а содержание белка в них контролировали на детекторе Uvicord Sil, ABSRange — 0,5 (Pharmacia) Скорость бумаги на самописце - 0,2 мм/мин Хроматография проводилась при комнатной температуре В процессе гель-фильтрации получили 35 белковых фракций Содержание белка во фракциях определяли на спектрофотометре Ultrospec II при 280 нм в 1 см кювете Антигенную активность полученных белковых фракций определяли в ИФР с использованием референс-положительных и отрицательных сывороток.

Физико-химическая характеристика соматического фракционированного антигена дирофилярий.

Изучение белкового спектра соматического фракционированного антигена дирофилярий методом электрофореза в ПААГ согласно Laemmli (1970) с некоторыми модификациями Разделение проводили в денатурирующих условиях с использованием 12,5% геля в присутствии додецилсульфата натрия при напряжении 300 вольт

Постановка и учет результатов иммуноферментной реакции при дирофиляриозе собак с соматическим фракционированным антигеном

Постановку иммуноферментной реакции проводили в непрямом варианте с целью выявления антител в сыворотке крови животных Параметры и режим постановки ИФР с соматическим фракционированным антигеном отрабатывали в предварительных экспериментах на сыворотках собак с гомологичной инвазией (слабый и умеренный иммунный ответ), гетерологичной инвазией и отрицательного контроля (клинически здоровые) Твердой фазой служили планшеты из полистирола (Медполимер, Санкт-Петербург)

Определение оптимальной концентрации антигена. При выборе оптимальной концентрации антигена для сенсибилизации полистироловых планшетов нами были испытаны следующие разведения. 15, 12; 10, 8, 7 мкг/мл Антиген разводили в 0,01 М карбонатно-бикарбонашом буфере pH 9,6

Определение режима сенсибилизации планшетов антигеном. Эта работа проводилась по образу модели В качестве таковой взят дирофиляриозный соматический фракционированный антиген в концентрации 10 и 8 мкг/мл в карбонатно-бикарбонатном буферном растворе Испытаны следующие режимы сенсибилизации при 4 °С 18-20 часов, 1 час при 37°С с последующей выдержкой в течение 18-20 часов при 4° С

Определение минимального диагностического титра сывороток крови собак Определение минимального диагностического титра провели на двух пулах сывороток от собак, спонтанно зараженных D unmitis, со слабым и умеренным иммунным ответом В качестве отрицательного контроля использовали сыворотку крови клинически здорового животного, а также три гетерологичные сыворотки (Toxocara canis, Babesia cams, Cystoisosporum cams) Испытали разведения сывороток 1 50 и 1:100.

Минимальным диагностическим титром иммуноферментной реакции считали титр разведенной сыворотки, при котором наблюдали окрашивание субстратной смеси до красновато-буроватого цвета и отсутствие изменения цвета субстрата с гетерологичными и отрицательной сыворотками

Оценку диагностической эффективности ИФР с соматическим фракционированным антигеном провели в ходе комиссионно с использованием 128 проб сывороток крови собак, в том числе 25 — от спонтанно инвазированных О пшшйв, 96 - от условно здоровых животных и 7 проб с гетерологичной инвазией У условно здоровых животных не обнаружено других гельминтов.

Постановку и учет результатов проводили в соответствии с программой комиссионной проверки

Статистическую обработку полученных данных проводили по стандартной методике Стъюдента

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1 Анализ данных по эпизоотологии дирофиляриоза собак в Краснодарском крае

В процессе длительного изучения эпизоотологии гельминтозов и организации противогельминтозных мероприятий известный отечественный гельминтолог, д в н, проф ЕЕ Шумакович (1963) пришел к заключению. «Эпизоотология одного и того же гельминтоза в разных зонах имеет существенное отличие и разработка мер борьбы с гельминтозами в настоящее время невозможна без предварительного изучения их эпизоотологии»

Знание закономерностей течения эпизоотического процесса, как известно, помогает разрабатывать систему противоэпизоотических мероприятий, позволяющую изменять естественный ход, предупреждать его активацию и прерывать этот процесс на отдельных территориях

Эти позиции были взяты нами за основу при изучении эпизоотологии дирофиляриоза собак в Краснодарском крае

По результатам исследований проб крови собак на дирофиляриоз мы установили, что он регистрируется во всех обследуемых районах края, причем как в сельской местности, так и в городских условиях (г. Краснодар).

По нашим данным экстенсивность инвазии достигает у сельских собак 19,04-69,6% (в среднем 34,35%), у городских - 28,02% (табл 1).

Впервые на основе анализа результатов наших исследований была установлена высокая зараженность собак I) шшпйз в плавневой зоне Краснодарского края (Западная дельтовая зона, г Приморско-Ахтарск)

При гельминтологическом вскрытии сердец и крупных сосудов сердца у собак установлена 42,85%-ная экстенсивность дирофиляриозной инвазии в сельской местности Краснодарского края и 53,3%-ная - в городской

Таким образом, заражение дирофиляриями домашних собак выявлено во всех районах края с различными природно-климатическими условиями

В районах, расположенных в плавневой зоне Приморско-Ахтарском, Красноармейском и Славянском (Анапо-Таманская зона), исследовали 77 проб крови собак, из них микродирофилярии найдены в 32 пробах (41,5%) В районах, расположенных в степной зоне. Тимашевском (Центральная зона) и Павловском (Северная зона) и в г Краснодаре, при исследовании 1304 проб крови микродирофилярии найдены в 367, что составляет 28,14% В предгорной зоне в Лабннском районе (Южно-Предгорная зона) из 45 исследованных проб микрофилярии были обнаружены в 16 пробах (35,5%).

Наибольшую экстенсивность инвазии собак регистрировали в плавневой зоне края -41,5% - местности, отличающейся значительным количеством открытых водоемов (Западная дельтовая и Анапо-Таманская зоны) Несколько ниже, но также достаточно высокий процент зараженных собак оказался в степной и предгорной природно-климатических зонах края - 28,14 и 35,5% соответственно

4.2. Сезонная периодичность микрофиляриемии н видовой состав микрофилярии у собак Краснодарского края Результаты исследований проб крови собак в разные сезоны года, проведенные в условиях Краснодарского края, свидетельствуют о существенной разнице в экстенсивности микрофиляриозной инвазии в разное время года Максимальную экстенсивность инвазии отмечали у собак летом в июне-52,08% и осенью в октябре-53,12%, в среднем за лето ЭИ достигала 42,02%, осенью-42,56% В зимний период ЭИ снижалась в среднем до 17,52%

Результаты гельминтологических вскрытий сердца собак значительно отличаются от результатов исследований крови в разные сезоны года По результатам вофьгшя трупов собак нами не отмечена значительная разница в экстенсивности и интенсивности дирофиляриозной инвазии Экстенсивность инвазии составила зимой - 66,6%, весной -38,46%, летом - 66,6% и осенью — 50% при интенсивности инвазии, равной соответственно 23,75, 31, 37,36,6 экз/гол, а в среднем, ЭИ была равной 55,41% и ИИ - 32,08 экз /гол

Зараженность собак микрофитриями в разных районах Краснодарского края

Населенный пункт Исследовано животных Из них зараженных ЭИ, %

Сельская местность

Приморско - Ахтарский 33 23 69,6

Тимашевский 54 26 48,14

Лабинский 45 16 35,5

Павловский 58 7 12,06

Красноармейский 23 5 21,73

Славянский 21 4 19,04

Городская местность

г Краснодар 1192 334 28,02

Пик микрофиляриемии отмечается летом-осенью в период активности большей численности комаров — промежуточных хозяев, что позволяет в природе осуществить передачу и дальнейшее распространение инвазии Таким образом, при дирофиляриозе пробы крови для плановых исследований целесообразно брать в летнее - осенний период для обнаружения микрофилярий в крови

С помощью метода дифференциального окрашивания личинок микрофилярий Chalifoux and Hunt (1971) мы изучили видовую популяцию дирофилярий. Для определения видового состава мы исследовали 51 пробу крови, взятые от собак г Краснодара. Личинки окрашивали сразу после взятия Таким образом, в 49 пробах крови обнаружили личинки, относящиеся к D immitis (96,07%), с характерными окрашенными зонами экскреторной и анальной пор, и 2 образца крови, относящиеся к D repens (3,93%), с характерной окрашенной анальной порой

Этот вид исследования необходим практикующим ветеринарным врачам для прогнозирования течения заболевания и его лечения. Преимущество этого метода — очень специфичный вид анализа Недостатки - его дороговизна, занимает много времени и требуются высоко квалифицированные лаборанты.

4.3. Возрастая динамика инвазированности собак дирофиляриями По результатам исследований проб крови 164 собак разных возрастных групп из разных населенных пунктов, в том числе из г Краснодара, на дирофиляриоз мы пришли к заключению, что все они были инвазированы независимо от возраста. Экстенсивность инвазии собак составила до года 3,2%, 1-3 года - 22,72%, 4-6 лет - 48,93%, 7-9 лет -42,85%, 10 лет и старше - 54,16% (табл 2)

В то же время по результатам гельминтологических вскрытий сердца 26 трупов собак разных возрастных групп установили, что 13 из них были инвазированы D immitis Причем экстенсивность дирофиляриозной инвазии у разновозрастных собак различалась и составила в возрасте до года 0%, 1-3 года - 20%, 4-6 лет - 51,14%, 7-9 лет - 71,42%, старше 10 лет - 100%

Таким образом, результаты гельминтологических вскрытий подтверждают данные исследований крови о более высокой степени инвазированности собак в возрасте 10 лет и старше Зараженность дирофиляриями собак всех возрастных групп, за исключением животных до года, свидетельствует об отсутствии у них возрастного иммунитета к заражению дирофиляриями

Возрастная динамика инвазированности собак микрофиляриями D. immitis

Возраст собак Исследовано собак Из них инвазировано ЭИ,%

До года 31 1 за

1-3 лет 44 10 22,7

4-6 лет 47 23 48,93

7-9 лег 28 12 42,85

10 лег и старше 24 13 54,16

В среднем 174 59 33,9

4.4. Влияние породы и пола собак на зараженность дирофиляриями

При анализе полученных результатов исследований проб крови 202 сук и 178 кобелей разного возраста не установлено существенной разницы в показателях их экстенсинвазированности D immitis Самки собак оказались инвазированы на 31,68%, а самцы на 29,77%

Таким образом, по нашим данным пол собак не оказывает влияния на степень инвазированности их дирофиляриями.

Результаты анализа данных по исследованию проб крови собак разных пород свидетельствуют о незначительных колебаниях в инвазированности Так, зараженность собак породы немецкая и восточно-европейская овчарка составила 32,35%, среднеазиатская и кавказская овчарка - 30%, мастино неаполетано, боксер - 25%, доберман - 28,12%, дог - 28,57%, ротвейлер - 29,03% Лабрадор -18,18%, сенбернар - 20%, пудель - 16,66%, курцхаар - 22,2%, такса - 26,6%, американский стаффордширский терьер - 31,03%, той терьер - 12,5% Судя по этим показателям, наиболее восприимчивы к заражению дирофиляриям немецкая и восточноевропейская овчарки, а устойчивость к этой инвазии проявляют собаки породы той терьер В меньшей степени были инвазированы микрофиляриями также беспбродные и собаки маленьких пород Независимо от этого наши исследования показали, что в основной массе порода не оказывает существенного влияния на инвазированность собак дирофиляриями По-видимому, в большей степени на их зараженность влияют такие факторы, как условия содержания и характер использования (дворовые, служебные, охотничьи, комнатные и т.д)

4.5. Влияние типа содержания и характера использования собак на зараженность

днрофиляриями

При исследовании проб крови 150 собак, в том числе 52 квартирных (содержащихся, в основном, в квартирах с выгулом иа улице), 27 служебных (содержащихся на ограниченной территории), 16 охотничьих, 25 бродячих и 30 дворовых, установлена незначительная разница в инБазированное™ их D immitis

В максимальной степени были инвазированы микрофиляриями бродячие и дворовые собаки - 40%, в меньшей степени - квартирные (26,92%). Слабая зараженность {вартирных собак, вероятно, обусловлена хорошими условиями содержания и, в первую очередь, меньшей возможностью контакта с промежуточным хозяином

Высокая степень инвазирования охотничьих собак микрофиляриями, в пределах 37,5%, обусловлена характером их использования Чаще всего охотятся в лиманах, заболоченных местах, лесах, где повышенная влажность, что способствует большей плотности популяции промежуточных хозяев — комаров

Таким образом, собаки, содержащиеся в разных условиях, оказались зараженными D rmmitis в разной степени Максимально инвазированы микрофиляриями дворовые, бродячие, охотничьи и служебные собаки, которые в большей степени подвергнуты контакту промежуточных хозяев - комаров

В большей степени на зараженность собак кардиодирофиляриями оказывают такие факторы, как условия содержания и характер их использования В наименьшей степени, по нашим данным, были инвазированы квартирные собаки, что связано с тем, что они имеют меньшую возможность контакта с промежуточным хозяином И А Архипов, ДР Архипова (2004) и Т Oda et al (1996) также отмечали слабую зараженность комнатных собак дирофиляриями

На основании результатов изучения отдельных вопросов эпизоотологии дирофиляриоза с учетом региональных особенностей, мы разработали картограмму сформировавшихся на территории региона очагов дирофиляриоза собак и людей, которая позволит, на наш взгляд, осуществить попытку прогнозирования заболевания людей и собак дирофиляриозом, разработать в перспективе более правильную, гибкую тактику и стратегию борьбы с данным гельминтозом, целенаправленнее проводить комплекс противодирофиляриозных профилактических мероприятий

4.6. Влияние дирофилярий на организм собак Патологические изменения в организме хозяина обусловлены повреждениями, вызванными половозрелыми гельминтами, микрофиляриями и ювенильными формами паразита.

В зависимости от степени клинических проявлений заболевания, вызванного Б ишшьз, исследованные нами 73 собаки были распределены на три группы

1 Бессимптомная форма-30 собак (41,1%)

2 Средняя степень тяжести (кардиопульмонарная болезнь)—28 собак (38,4%)

3 Тяжелая форма болезни (кардиопульмонарная болезнь с тромбоэмболическими осложнениями, почечной и печеночной недостаточностью) — 15 собак (20,5%)

Чаще всего мы наблюдали бессимптомное течение заболевания, что в нашем случае составило 41%

У животных со средней степенью тяжести болезни проводили клинический осмотр, аускультацию, рентгенографию, электрокардиограмму У собак с такой формой болезни (28 животных) были выражены следующие симптомы периодическая слабость, неустойчивость к физическим нагрузкам, спорадический кашель, одышка. На рентгеновском снимке сердца наблюдали гипертрофию правых отделов сердца (53,57%), при электрокардиографии - гипертрофию правого желудочка (14,28%)

У собак с тяжелой степенью заболевания были выражены следующие симптомы острая слабость, анорексия, потеря веса, хронический резкий кашель, тахипноэ, диспноэ, цианоз При аускультации легких слышны аномальные шумы на вдохе, при аускультации сердца - систолический сердечный шум и расщепленный второй тон сердца. На рентгеновских снимках видны изменения в сосудах сердца, очаги инфильтрации легких, кардиомегалия, гепатомегалия. На электрокардиограмме признаки расширения правого предсердия, нарушения проводимости.

В первую очередь при дирофиляриозе поражаются сердечно-сосудистая (нарушение кровообращения и проводимости сердца) и дыхательная (расстройства дыхания, аллергическая пневмония) системы, реже печень, почки и другие органы с нарушением их функции

4.7. Анализ результатов гематологических и биохимических исследований крови

собак при дирофиляриозе Клинические наблюдения за инвазированными собаками показали, что дирофиляриоз у большинства животных протекал без видимых симптомов болезни, но с тяжелыми осложнениями. В связи с этим нами проведены гематологические исследования При этом оценивали количество эритроцитов, гемоглобина, гематокрит, лейкоцитов, СОЭ, лейкограмму Полученные результаты свидетельствуют о некоторых изменениях в показателях крови Нами отмечено существенное снижение содержания гемоглобина, гематокрита, эритроцитов Количество эритроцитов снижалось до 3,0 х 1012/" Содержание лейкоцитов повысилось до 13,4-18,7 х 109/л Изменения произошли

также в лейкограмме Повысилось содержание лимфоцитов и палочкоядерных нейтрофилов, а количество сегментоядерных нейтрофилов незначительно снизилось Количество эозинофилов увеличилось в 1,5 и более раз

Значительные изменения происходили в биохимических показателях крови инвазированных дирофиляриями собак. Мы обнаружили повышение содержания билирубина, снижение общего белка, альбумина, незначительное повышение активности печеночных ферментов (щелочная фосфатаза АЛТ, ACT), почечных показателей (креатинин, мочевина) Содержание глюкозы, а-амилазы, глобулинов, натрия, кальция и калия отличалось от здоровых животных несущественно

4.8. Оценка эффективности ивомека и моксидектина прн дирофиляриозе Исследования проводили на базе ветеринарной клиники «Доверие» г Краснодара. В опытных и контрольной группах использовали собак разного возраста и пород, зараженных микрофиляриями Каждая группа собак состояла из 10 животных Подбор животных в первой и второй группах проводили по наличию личинок дирофилярий в поле зрения микроскопа, число которых от 1 и более В третью группа (контрольная) животных подбирали по положительным результатам анализов на микрофилярии

Ивомек испытывали в форме 1%-ного раствора подкожно в область коленной складки или область холки с соблюдением правил асептики и антисептики Собакам первой и второй подопытных групп вводили ивомек однократно в дозе 0,2 и 0,006 мг/кг соответственно с интервалом 7 дней Собаки третьей группы препарат не получали и служили инвазированным контролем

Учет эффективности ивомека против микрофилярий проводили через 14 и 30 дней после первого применения по результатам исследований проб крови перед очередной инъекцией ивермектина. Пробы крови по1 мл брали из подкожной вены предплечья и исследовали методом Knott (1939)

Полученные результаты свидетельствуют о 100%-ной эффективности препарата уже после однократного применения в дозе 0,2 мг/кг Ивомек в дозе 0,006 мг/кг оказался недостаточно эффективным (70%) против микрофилярий после первого и второго применения

Ивомек обладает пролонгированным действием на микрофилярии Эффективность препарата в дозе 0,2 мг/кг проявлялась в течение опыта, продолжающегося 6 месяцев

4.9. Эффективность моксидектина для профилактики днрофиляриоза собак Учитывая то, что источники инвазии особую опасность представляют летом в период активности промежуточного хозяина — комаров, нами поставлена цель разорвать цикл развития путем предотвращения микрофиляриемии в крови зараженных собак в

летний период и недопущения заражения комаров, а также предотвращения возможности заражения собак и развития дирофилярий в их организме путем применения микрофилярицидного препарата в весенне-летне-осенний период, те в период лета кровососущих комаров

С этой целью мы использовали моксидектин и провели исследования по его действию на микрофилярии на 50 собаках Собак в эту группу подбирали из щенков, рожденных в ноябре-декабре месяце, для того, чтобы полностью исключить заражение микрофиляриями Перед опытом до начала лета комаров у этих животных исследовали кровь на наличие микрофилярий и животным, свободным от этой инвазии, задавали моксидектин в дозе 3 мкг/кг перорально Кровь исследовали через 7,14 и 30 дней

Собак контрольной группы также подбирали по этому принципу Учитывая, что персистентное действие моксидектина около месяца, нами для профилактики дирофиляриоза была испытана схема применения этого препарата в весенне-летне-осенний период с интервалом в 1 месяц

Результаты опыта свидетельствуют о том, что собаки, которые получали моксидектин с марта по ноябрь месяц перорально в дозе 3 мкг/кг с интервалом 30 дней, оказались свободными от инвазии В то же время в контрольной группе из 50 собак 5 оказались зараженными, в их крови обнаружили микрофилярии, что свидетельствует о заражении в летний период

Таким образом, моксидектин оказался эффективным средством для профилактики дирофиляриоза собак Препарат целесообразно применять перед началом периода активности комаров, затем с интервалом 30 дней до окончания периода лета комаров и последний раз спустя 1 месяц

4.10. Характеристика соматического фракционированного антигена D. immitis В процессе фракционирования экстракта дирофилярий на Superóse 12 мы получили 35 белковых фракций. Концентрация белка в них колебалась от 117 до 740 мкг/мл Согласно показателям оптической плотности полученных белковых фракций был построен график, на котором видны три пика При постановке иммуноферментной реакции установили, что наиболее активными были белки второго пика, в которых содержались диагностически активные антигенные компоненты

Эффективность фракций второго пика (32 - 38 фракции), включающих диагностически активные компоненты, проверяли более детально, испытав их в иммуноферментной реакции на одних и тех же сыворотках собак с подтвержденным диагнозом дирофиляриоза и клинически здоровых животных Для предварительной оценки специфичности этих фракций использовали также гетерологичные сыворотки

(бабезиоз, токсокароз) В результате установили, что антигенные компоненты фракции 32, 33, 34, 36 показали хорошую чувствительность, но низкую специфичность В то же время белки фракции 35 как по чувствительности, так и по специфичности превосходили все остальные

Оценка специфичности диагностически активных белковых фракций, проведенная в ИФР с 96 сыворотками крови клинически здоровых собак без гельминтов и кровепаразитов, подтвердила наибольшую специфичность белков 35й фракции при сохранении высокой чувствительности Исходя из полученных данных, дальнейшие иммунодиагностические исследования при дирофиляриозе проводили с использованием в качестве антигена белковой фракции 35 соматического экстракта О цщшйв

Для изучения физико-химических свойств соматического фракционированного антигена дирофилярий использовали метод электрофореза в полиакриламидном геле (ЗББ-РААО), который выполняли согласно Ьаеттк (1970) с некоторыми модификациями. Для разделения белков в денатурирующих условиях использовали 12,5%-ный гель в присутствии додецшгсульфата натрия

На электрофореграмме соматического фракционированного антигена выявлено 2 компонента, причем наиболее интенсивно о!фашен только один с молекулярной массой 19,3 кДа. Она же и является мажорной белковой полосой Вторая полоса, судя по степени проявления, характеризуется незначительным количеством белка Ее молекулярная масса составила 21,5 кДа

4.11. Анализ результатов по постановке и учету иммуноферментной реакции при дирофиляриозе собак с использованием фракционированного соматического

антигена.

Определение оптимальной концентрации антигена. Из испытанных разведений антигена для сенсибилизации полистироловых планшетов при выборе оптимальной концентрации установили, что наибольшая чувствительность и специфичность в иммуноферментной реакции при дирофиляриозе была достигнута при 8-12 мкг/мл

Определение режима сенсибилизации плашттето» антигеном При выборе режима сенсибилизации планшетов испытали несколько вариантов 4°С в течение 18-20 часов; 1 час при 37°С и затем 18-20 часов при 4°С, 1 час при 37°С. Наиболее оптимальными по нашим результатам оказались два режима 18-20 часов при 4°С и комбинированный - 1 час при 37°С плюс 18-20 часов при 4°С. Но поскольку при первом способе реакция проявлялась медленнее, мы остановили свой выбор на втором При экстренной

необходимости можно использовать также режим 1 час при 37°С, но при этом несколько снижается чувствительность

Определение мидимяш.ного диагностического титра сывороток крови собак Минимальный диагностический титр (минимальный специфический титр) важный показатель ИФР, который в значительной степени определяет чувствительность и специфичность теста. Этот показатель зависит от вида и качества антигена, качества конъюгата, режима постановки реакции

Оптимальное разведение сыворотки для исследований в ИФР в скрининге определяли на основе выявления максимальной разницы цветового сигнала мевду сыворотками собак с гомологичной инвазией (слабый и умеренный иммунный ответ), отрицательным контролем и гетерологичными сыворотками Работу проводили на тех же сыворотках собак, которые использовали при определении оптимальной концентрации и режима сенсибилизации полистироловых планшетов Сыворотки исследовали в разведении 1 50, 1-100. Исследования показали, что в разведениях 1 50 сыворотки собак с гетерологичными инвазиями (В cams, I cams, Т earns) давали сомнительную и положительную реакции Кроме того, в титре 1.50 сомнительную реакцию регистрировали также с отрицательной контрольной сывороткой Таким образом, в результате проведенных исследований установили минимальный диагностический титр, равный 1 100, который позволяет выявить низкий уровень антител у зараженных D immitis собак при сохранении высокого уровня специфичности реакции.

Режим постановки реакции При отработке режима постановки ИФР с соматическим фракционированным антигеном дирофилярий установили, что оптимальным является вариант инкубации с сыворотками и с конъюгатом по 1 часу при 37°С Увеличение или уменьшение времени инкубации на каком-либо из этих двух этапов заметно снижает специфичность Инкубацию при комнатной температуре 18-26°С не испытывали, так как в ходе отработки режима сенсибилизации планшетов антигеном мы установили, что небольшие экспозиции по времени без термостата снижают чувствительность метода.

Ход постановки реакции 1 При сенсибилизации планшетов для разведения антигена использовали 0,01 М комплексирующий карбонатный-бикарбонатный буфер рН-9,6 Антиген и все остальные ингредиенты, используемые в реакции (исследуемую сыворотку, конъюгат, субстрат), вносили в объеме 100 мкл на лунку После сенсибилизации планшет отмывали дистиллированной водой с 0,05% содержанием твина-20 3 раза по 5 минут Отмывку этим раствором проводили после каждого этапа реакции

2. Исследуемые и контрольные сыворотки разводили 0,01 М фосфатно-солевым буфером рН 7,2-7,4 с 0,05% содержанием твина-20 и 0,05% - бычьего сывороточного альбумина в диагностическом титре 1 100 Инкубировали в течение 1 часа при температуре 37°С Отрицательным контролем служила сыворотка крови здоровой собаки, а положительным - сыворотка спонтанно зараженного животного Б. юшийв

3 На следующем этапе постановки ИФР вносили конъюгат в рабочем разведении 1 3000 Рабочее разведение определяли в предварительных испытаниях для каждой новой серии Для разведения конъюгата использовали раствор, состоящий из 0,01 М фосфатно-солевого буфера рН 7,2-7,4 с 0,05% содержанием твина-20 и 0,5% бычьего сывороточного альбумина. Инкубировали 1 час при температуре 37°С

4 Проявление реакции проводили субстратной смесью из 10 мл цитратного буфера рН 4,7-5,0 с добавлением 8 мг ортофенилендиамина и 5 мкл 50% стабилизированной перекиси водорода (пергидроля) После проявления (5-15 минут), реакцию останавливали стоп-реагентом, который состоял из водного раствора концентрированной серной кислоты в соотношении 1 1 Стоп-реагент вносили в объеме 30 мкл на лунку.

Визуальную оценку реакции проводили по интенсивности окрашивания субстрата в лунках Положительная реакция характеризуется потемнением субстратной смеси до жёлтого с оттенком буроватого, а затем после остановки стоп-реагентом - до красновато-буроватого оггенка смеси в лунке, где инкубировалась сыворотка животного, инвазированного Б ишшЬб При отсутствии изменения цвета реакцию оценивали как отрицательную, что свидетельствовало об отсутствии в исследуемой сыворотке антител к антигену Б шишйв Интенсивность окраски при положительной реакции должна заметно превосходить таковую с отрицательной контрольной сывороткой и быть сопоставимой с положительной Сыворотки, незначительно превосходящие по интенсивности окраски в ИФР отрицательный контроль, считали сомнительными и относили в разряд положительных Сомнительную сыворотку исследовали повторно Дважды сомнительную реакцию относили в разряд положительной При автоматическом учете на многоканальном ридере использовали волну длиной 492 нм Положительной считали сыворотку, превосходящую по оптической плотности отрицательный контроль в 1,5 раза

4.12. Диагностическая эффективность ИФР при дирофиляриозе собак с соматическим фракционированным антигеном.

В опытах, выполненных комиссионно, по оценке диагностической эффективности ИФР с антигеном Б. шшгШв использовали 128 сывороток крови собак естественно зараженных О

21

immitis (25); естественно ннвазированных Babesia cams (3), Toxocara cams (3); Isospora cams (3), 96 сывороток относительно здоровых собак из г. Москвы и г Краснодара.

Чувствительность ИФР оценили по результатам реакции с 25 сыворотками крови собак, естественно зараженных D. immitis (для подтверждения диагноза применяли метод концентрирования Knott (1939)

Таким образом, в результате исследований получили 4 ложноотрицательных ответа, что составило 16% Все неспецифические ложноноложительные и сомнительные результаты относили к ложноположительным Ложноноложительные ответы регистрировали в 13 пробах сывороток из группы относительно здоровых животных, что составило 13,54% Таким образом, специфичность соматического фракционированного антигена составила 86,46%, а чувствительность составила — 84%

Результаты наших опытов (табл 3) подтвердили данные других исследователей о том, что специфичность серологических тестов при дирофиляриозе собак повышается при использовании соматического фракционированного антигена.

Таблица 3

Диагностическая эффективность ИФА с соматическим фракционированным антигеном D. immitis

Группа обследованных Количество проб Результаты ИФА

Соматический фракционированный антиген

+ - Чувствител ьностъ специфичн ость

Дирофиляриоз 25 21 4 84% 86,46%

Бабезиоз 3 - 3

Токсокароз 3 - 3

Цистоизоспороз 1 - 1

Неустановленный диагноз и клинически здоровые 96 13 83

Итого 128

выводы

1. Изучено распространение дирофиляриоза собак, вызываемого D lmmitis, в различных природою - климатических зонах Краснодарского края Установлено, что в плавневых ( Приморско-Ахтарский район) и предгорных (Лабинский район) зонах, где больше популяция промежуточных хозяев-комаров, экстенсивность инвазии достигает 70%, в более засушливых (степных) - 30%

2. Дирофиляриоз в Краснодарском крае зарегистрирован как у сельских, так и у городских собак (г Краснодар) Экстенсивность инвазии по результатам исследований крови у первых составила в среднем 34,34%, у вторых - 28,02%, при гельминтологическом вскрытии экстенсинвазированность была соответственно 42,85 и 53,3%

3. Установлена зависимость инвазированности дирофиляриями от возраста собак По результатам гельминтологических вскрытий экстенсивность инвазии D lmmitis у собак в возрасте до 1 года, 1-3, 4-6, 7-9, 10 и старше лет составила соответственно 0, 20; 51,14, 71,4, 100%, а по результатам исследования крови на наличие микрофилярий соответственно 3,2; 22,7,48,93,42,85,54,16%.

4 Установлена экстенсивность и интенсивность инвазии дирофиляриями в зависимости от сезона года ЭИ составила зимой-66,6%, весной-38,46%, летом-66,6% и осенью-50,0%, а ИИ в среднем 30,75, 16,0, 52,5 и 35,5 экз/собаку соответственно

5. Пол собак не оказывает существенного влияния на их инвазированность их D lmmitis. На зараженность собак дирофиляриями оказывают влияние -порода, условия содержания и характер их использования. В наибольшей степени были инвазированы собаки крупных пород, дворовые, бродячие и охотничьи собаки, экстенсивность инвазии у которых составила в среднем 26,72, 40,0,40,02 и 37,5% соответственно В меньшей степени были инвазированы квартирные собаки (ЭИ -26,92%).

6. Наиболее патогенными для организма собак являются дирофилярии D. unmitis, вызывающие тяжелые осложнения, а именно общую слабость в 80% случаев, неустойчивость к физической нагрузке - 26%, кашель 46,6%, изменения цвета слизистых оболочек - 6%, аускультативно расщепление второго тона - 6,6%, на рентгенологическом снимке изменения правых отделов сердца, кардиомегалию -60%, при электрокардиографическом исследовании признаки расширения правого предсердия и желудочка - 33,3% Установлено также влияние дирофилярий на гематологические и биохимические показатели, проявляющиеся

снижением количества эритроцитов до 3,0х1012/л, гемоглобина до 68х10г/л, гематокрита до 18%, повышением СОЭ до 76 мм/час, количества лейкоцитов и эозинофилов в 2 раза, билирубина, мочевины, креатинина, АсАТ, АлАТ, щелочной фосфотазы

7 Установлена 100%-ная эффективность ивермектина против микрофилярий в дозе 0,2 мг/кг по ДВ после однократного применения. Для профилактики дирофиляриоза собак испытан моксидектин за месяц до начала лета комаров, затем через каждые 30 дней в течение активности промежуточного хозяина, предотвращающий микрофиляриемию и развитие дирофилярий в организме восприимчивых животных

8 Разработана тест - система на основе ИФР и проведена отработка параметров и режимов ее постановки при дирофиляриозе собак с соматическим фракционированным антигеном Определена диагностическая эффективность ИФР при дирофиляриозе собак Чувствительность реакции с фракционированным антигеном составила 84,0%, специфичность 86,46%

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Изучение особенностей эпизоотологии и точной своевременной диагностики дирофиляриоза собак с учетом местных природно-климатических условий является основой для организации и своевременного проведения мер борьбы с этим заболеванием

Разработана и предложена оптимальная схема применения отечественного препарата ивермектина при дирофиляриозе собак с учетом микрофилярицидного действия и особенностей эпизоотологии заболевания, а также схема профилактики дирофиляриоза моксидектином с учетом климатических особенностей Краснодарского края.

Разработана серологическая тест — система на основе иммуноферментной реакции на выявление антител к И шишйв у собак, рекомендованная для внедрения в ветеринарную лабораторную практику

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Гаркави Б Л, Медведев А.Ю Распространение дирофиляриоза собак и человека в Краснодарском крае //Матер докл науч конф «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями», М, 2004 - Вып 5 - С 111112.

2. Медведев А Ю, Гаркави Б Л. Распространение дирофиляриоза в Краснодарском крае //Матер докл науч. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» -М, 2005.-С 230-232

3 Медведев АЮ Распространение дирофиляриоза собак в Краснодарском крае и серологическая диагностика инвазии. //Тр Всерос ин-та гельминтол -2006.-Т 43 -С 196-202

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25 09 2000 г Подписано в печать 20 09 07 Тираж 100 экз Усл. п.л 1,56 Печать авторефератов (495) 730-47-74,778-45-60

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Медведев, Андрей Юрьевич

Введение

1 Обзор литературы

1.1 Систематика, морфология и биология дирофилярий

1.2 Эпизоотология дирофиляриоза собак

1.3 Распространение дирофиляриоза человека

1.4 Влияние дирофилярий на организм собак

1.5 Посмертная и прижизненная диагностика дирофиляриоза

1.6 Терапия и профилактика дирофиляриоза собак

2 Собственные исследования

2.1 Материалы и методы

2.1.1 Характеристика региона исследования

2.1.2 Объекты исследования

2.1.3 Эпизоотология дирофиляриоза собак в Краснодарском крае

2.1.3.1 Распространение дирофиляриоза собак в городской и сельской местности

2.1.3.2 Интенсивность инвазии, возрастная и сезонная динамика инвазированности собак дирофиляриями

2.1.3.3 Инвазированность собак дирофиляриями в зависимости от породы, пола, типа содержания и характера использования

2.1.4 Сезонная периодичность микрофиляриемии и видовой состав микрофилярий у собак Краснодарского края и Московской области

2.1.5 Клинические проявления дирофиляриоза собак, влияние степени инвазии на гематологические и биохимические показатели крови

2.1.6 Разработка иммунологической диагностики дирофиляриоза собак

2.1.6.1 Получение соматического фракционированного антигена из D. immitis и его физико-химическая характеристика

2.1.6.2 Разработка иммуноферментной реакции для диагностики дирофиляриоза собак на основе фракционированного соматического антигена

2.1.6.3 Диагностическая эффективность ИФР при дирофиляриозе собак

2.1.7 Испытание антигельминтных препаратов при дирофиляриозе собак

2.1.8 Статистическая обработка данных 60 2.2 Результаты исследований

2.2.1 Анализ данных по эпизоотологии дирофиляриоза собак в Краснодарском крае

2.2.2 Влияние дирофилярий на организм собак

2.2.3 Анализ результатов гематологических и биохимических исследований крови собак при дирофиляриозе

2.2.4 Характеристика соматического фракционированного антигена

D. immitis

2.2.5 Анализ результатов по постановке и учету иммуноферментной реакции при дирофиляриозе собак с использованием соматического фракционированного антигена

2.2.6 Диагностическая эффективность иммуноферментной реакции при дирофиляриозе собак с соматическим фракционированным антигеном

2.2.7 Оценка эффективности ивомека и моксидектина при дирофиляриозе

Введение Диссертация по биологии, на тему "Распространение дирофиляриоза собак в Краснодарском крае и разработка его диагностики иммуноферментной реакцией"

Актуальность проблемы. Дирофиляриоз широко распространенное заболевание собак и кошек. Возбудителями дирофиляриоза домашних животных служат круглые паразитические черви Dirofilaria immitis, локализующиеся в правом желудочке и легочных артериях и Dirofilaria repens, паразитирующие в подкожной клетчатке. Паразитируя в сердце собак и кошек, дирофилярии вызывают расстройства кровообращения в результате механической закупорки желудочков сердца и сосудов, клинически проявляющегося расстройством сердечной деятельности. D. repens у животных проявляется поражением кожи.

Дирофиляриоз является трансмиссивным заболеванием. Развитие возбудителей дирофиляриоза происходит с участием промежуточного хозяина комаров родов Aedes, Culex, Anopheles.

Определенную опасность дирофилярии представляют для человека, у которого они не достигают половой зрелости. Неполовозрелые дирофилярии обнаруживаются в глазу и других жизненно важных органах человека. Для их удаления требуется хирургическое вмешательство.

Изучением дирофиляриоза плотоядных в нашей стране занимались И.А. Архипов и Д.Р. Архипова (2004).

Остаются недостаточно изученными вопросы эпизоотологии дирофиляриоза собак в южных районах России, Северном Кавказе, в том числе в Краснодарском крае, где он особенно широко распространен и иммунодиагностика этой инвазии, что явилось предметом наших исследований и определило цель работы.

Цель и задачи исследований. Целью нашей работы явилось изучение распространения дирофиляриоза в различных ландшафтно-климатических зонах Краснодарского края и разработка серологической диагностики дирофиляриоза.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Изучить распространение дирофиляриоза собак в городской и сельской местности Краснодарского края

• Определить сезонную периодичность появления микрофилярий в крови собак

• Установить влияние возраста, пола, породы, типа содержания собак на зараженность D. immitis

• Изучить влияние D. immitis на организм собаки, гематологические и биохимические показатели крови животных

• Приготовить соматический экстракт из половозрелых дирофилярий, провести его фракционирование и выделить наиболее эффективную диагностическую фракцию

• Провести электрофоретический анализ соматического фракционированного экстракта дирофилярий в ПААГ (полиакриламидный гель)

• Отработать параметры постановки иммуноферментной реакции и оценить диагностические качества фракционированного соматического антигена в ИФР (иммуноферментная реакция)

• Провести производственные испытания ИФР при дирофиляриозе собак

Научная новизна. Впервые в Краснодарском крае установлено распространение дирофиляриоза у собак городской и сельской местности. Максимальная инвазированность собак D. immitis установлена в возрасте 5-7 лет. Выяснено влияние пола, породы, условий содержания на зараженность собак дирофиляриями. Установлена сезонная динамика дирофиляриоза. Проведено фракционирование экстракта D. immitis и определена наиболее активная и специфичная фракция. Определена молекулярная масса белковых компонентов диагностически эффективной фракции соматического антигена из половозрелых D. immitis, которая составила 19,3 и 21,5 кДа соответственно. Впервые в России разработан серологический метод прижизненной диагностики дирофиляриоза собак на основе иммуноферментной реакции с использованием фракционированного соматического экстракта половозрелых дирофилярий. Установлена чувствительность и специфичность ИФР при дирофиляриозе собак - 84,0 и 86,46% соответственно. Оценена эффективность микрофилярицидного действия ивермектина в дозе 0,2 мг/кг массы (100%). Проведена оценка профилактического действия моксидектина в дозе 3 мкг/кг при дирофиляриозе собак в условиях Краснодарского края.

Практическая значимость. Результаты изучения эпизоотологии дирофиляриоза и усовершенствование методов диагностики в условиях Краснодарского края используются при разработке мер борьбы с этой болезнью.

По материалам диссертации разработан лабораторный регламент на выявление антител к дирофиляриям (D. immitis) у собак, одобренный секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (сентябрь 2006г.)

Апробация работы. 1. Заседания ученого совета ВИГИС (20032006гг.)

2. Материалы диссертационной работы доложены на научной конференции ВОГ «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (г. Москва, 2004, 2005)

3. Секция «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2006г.)

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Эпизоотология, распространение дирофиляриоза собак в разных ландшафтно-климатических районах Краснодарского края;

2. Получение соматического фракционированного антигена из половозрелых D. immitis и его физико-химическая характеристика;

3. Разработка диагностической тест-системы на основе ИФА при дирофиляриозе собак с использованием соматического фракционированного антигена;

4. Оценка лечебного и профилактического действия ивермектина и моксидектина при дирофиляриозе собак в условиях Краснодарского края.

Публикации. По материалам исследований опубликовано 3 статьи:

1. Гаркави Б.Л., Медведев А.Ю. Распространение дирофиляриоза собак и человека в Краснодарском крае //Матер, докл. науч. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями», М., 2004. - Вып. 5. - С. 111-112.

2. Медведев А.Ю., Гаркави Б.Л. Распространение дирофиляриоза в Краснодарском крае. //Матер, докл. науч. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». - М., 2005. - С. 230-232.

3. Медведев А.Ю. Распространение дирофиляриоза собак в Краснодарском крае и серологическая диагностика инвазии. //Тр. Всерос. ин-та гельминтол. - 2006. - Т. 43. - С. 196-202.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 137 страницах компьютерного текста. Состоит из введения, обзора литературы и собственных исследований, включающих материалы и методы, 7 глав, обсуждения, выводы, практические предложения. Список литературы содержит 197 источника, в том числе 67 отечественных и 130 иностранных. Работа иллюстрирована 16 таблицами, 7 рисунками и 3 фотографиями.

Заключение Диссертация по теме "Паразитология", Медведев, Андрей Юрьевич

выводы

1. Изучено распространение дирофиляриоза собак, вызываемого D. immitis, в различных природно-климатических зонах Краснодарского края. Установлено, что в плавневых (Приморско-Ахтарский район) и предгорных (Лабинский район) зонах, где больше популяция промежуточных хозяев-комаров, экстенсивность инвазии достигает 70%, в более засушливых (степных) - 30%.

2. Дирофиляриоз в Краснодарском крае зарегистрирован как у сельских, так и у городских собак (г. Краснодар). Экстенсивность инвазии у первых составила в среднем 34,34%, у вторых - 28,02%, при гельминтологическом вскрытии экстенсинвазированность была соответственно 42,85 и 53,3%.

3. Установлена зависимость инвазированности дирофиляриями от возраста собак. По результатам гельминтологических вскрытий экстенсивность инвазии D. immitis у собак в возрасте до 1 года, 1-3, 46, 7-9, 10 и старше лет составила соответственно 0; 20; 51,14; 71,4; 100%, а по результатам исследования крови на наличие микрофилярий соответственно 3,2; 22,7; 48,93; 42,85; 54,16%.

4. Установлена экстенсивность и интенсивность инвазии дирофиляриями в зависимости от сезона года: ЭИ составила зимой-66,6%; весной-38,46%; летом-66,6% и осенью-50,0%, а ИИ в среднем 30,75; 16,0; 52,5 и 35,5 экз./собаку соответственно.

5. Пол не оказывает существенного влияния на инвазированность их D. immitis. На зараженность собак дирофиляриями оказывают влияние -порода; условия содержания и характер их использования. В наибольшей степени были инвазированы собаки крупных пород; дворовые, бродячие и охотничьи собаки, экстенсивность инвазии у которых составила в среднем по породам 26,72; 40,0; 40,02 и 37,5% соответственно. В меньшей степени были инвазированы квартирные собаки (ЭИ-26,92%).

6. Наиболее патогенными для организма собак являются дирофилярии D. immitis, вызывающие тяжелые осложнения, а именно общую слабость в 80% случаев, неустойчивость к физической нагрузке -26%, кашель 46,6%, изменения цвета слизистых оболочек - 6%, аускультативно: расщепление второго тона - 6,6%; на рентгенологическом снимке изменения правых отделов сердца, кардиомегалию - 60%; при электрокардиографическом исследовании признаки расширения правого предсердия и желудочка - 33,3%. Установлено также влияние дирофилярий на гематологические и биохимические показатели, проявляющиеся снижением количества

19 эритроцитов до 4,38±1,1*10 /л, гемоглобина до 101±39,68х10г/л, гематокрита до 27,2±8,54%, повышением СОЭ до 32,4±4,56 мм/час, количества лейкоцитов до 15,51±2,94x109/л и эозинофилов до 8,4±2,4%, билирубина - 17,2±6,1 мкмоль/л; мочевины - 16,32±4,2 ммоль/л; креатинина - 184,4±33,23 мкмоль/л; АсАТ - 73,27±18,56 МЕ/л; АлАТ - 60,44±16,36 МЕ/л; щелочной фосфатазы - 134,3±25,1 МЕ/л.

7. Установлена 100%-ная эффективность ивермектина против микрофилярий в дозе 0,2 мг/кг по ДВ после однократного применения. Для профилактики дирофиляриоза собак испытан моксидектин в дозе 3 мкг/кг за месяц до начала лета комаров, затем через каждые 30 дней в течение активности промежуточного хозяина, предотвращая микрофиляриемию и развитие дирофилярий в организме восприимчивых животных.

8. Разработана тест - система ИФА и проведена отработка параметров и режимов ее постановки при дирофиляриозе собак с соматическим фракционированным антигеном. Определена диагностическая эффективность ИФР при дирофиляриозе собак. Чувствительность реакции с соматическим фракционированным антигеном составила 84,0%, специфичность 86,46%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Изучение особенностей эпизоотологии и точной своевременной диагностики дирофиляриоза собак с учетом местных природно-климатических условий является основой для организации и своевременного проведения мер борьбы с этим заболеванием.

Разработана серологическая тест - система на основе иммуноферментной реакции на выявление антител к D. immitis у собак, рекомендованная для внедрения в ветеринарную лабораторную практику.

Разработана и предложена оптимальная схема применения отечественного препарата ивермектина при дирофиляриозе собак с учетом микрофилярицидного действия и особенностей эпизоотологии заболевания, а также схема профилактики дирофиляриоза моксидектином с учетом климатических особенностей Краснодарского края.

Результаты изучения эффективности ивермектина и моксидектина при дирофиляриозе собак могут быть применимы в условиях Краснодарского края.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата ветеринарных наук, Медведев, Андрей Юрьевич, Москва

1. Авдюхина Т.И., Супряга В.Г., Постнова В.Ф. Дирофиляриоз в Российской Федерации //Тез. докл. Веер. симп. «Роль российской гельминтологической школы в развитии паразитологии», М., 8-10 дек. 1997.- М., 1997.-С. 1.

2. Авдюхина Т.И., Констатинова Т.Н., Горбунова Ю.П. Учебное пособие к практическим занятиям по медицинской паразитологии. Лабораторная диагностика гельминтозов // Нематоды. Министерство здравоохранения. 2001. - Раздел I. - С. 37.

3. Артамонова А.А., Нагорный С.А. Проблемы дирофиляриоза на Северном Кавказе // Роль русских гельминтов в развитии паразитологии: тез. докл., Ростов-на-Дону. 1997. - С. 4-5.

4. Архипов И.А. Использование собак, инвазированных Dirofilaria immitis (Leidy, 1856), в качестве модели для поиска филярицидных препаратов //Бюл. Всес. ин-та гельминтол. 1986. - Вып. 42. - С. 5-8.

5. Архипов И.А., Башанкаев В.А., Архипова Д.Р. Распространение дирофиляриоза и патогенная роль его возбудителей для собак, кошек и человека //Матер, докл. научн. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями (зоонозы)». М., 2002. - С. 22-24.

6. Архипов И.А., Архипова Д.Р. Дирофиляриоз М., 2004. - 194с.

7. Архипова Д.Р. тенденции к созданию очагов дирофиляриоза и меры борьбы с ним //Матер, конф. Веер, о-ва гельминтол. М., 1994. - С. 69.

8. Архипова Д.Р. Биология дирофилярий и эпизоотология дирофиляриоза собак в степной зоне юга России: Автореф. дис. канд. биол. наук. 2003. - 25с.

9. Архипова Д.Р., Архипов И.А. Количественный метод диагностики дирофиляриоза собак //Тр. Всерос. ин-та гельминтолог. 2004. - Т.40. -С. 18-22.

10. Бессонов А.С. Дирофиляриозы собак и человека // Ветеринария. 2003. - №3. - С. 57-61.

11. Блажин А.Н. Гельминтофауна собак в Абхазии и ее роль в развитии продуктивного собаководства //Тр. Тропич. ин-та НКЗ Абхазская АССР. 1937. - Вып.З. - С. 135-143.

12. Бронштейн A.M., Супряга В.Г. и др. Дирофиляриоз человека в Московском регионе //Мед. паразитол. 2003. - №4.

13. Буракова О.В. Иммуноферментный анализ//Практикум по иммунологии, М., 2001. С.69-81.

14. Бурджанадзе П.Л. К вопросу о важнейших гельминтозах сельскохозяйственных животных Грузии //Тр. Грузинск. н.-и. вет. опытн. станции. 1943. - Т. 8. - С. 36-62.

15. Василик Н.С. Деяки аспекта епизоотологии та клиничного прояву инвазии Dirofilaria repens у собак Киивського региону //Вет. мед. Укр. -Киев, 2001.-С. 25-27.

16. Величко С.В., Василик Н.С., Абраменко И.В., Белоус Н.И. Визначення видовош надежности гельминту та клинико-патогенетични особливости перебигу инвазии D. repens у собак в пивничных регионах Украини //Наук, вестник НАУ. 2000. - С. 167-172.

17. Власенко Ю.И. Ассоциации гельминтов плотоядных и их лечение в равнинной зоне Краснодарского края //Труды КубГАУ. 2007. - № 1(5). -С. 147-150.

18. Гаркави Б.Л., Кравченко В.М. Дирофиляриоз сердца собак в г. Краснодаре //Тез. регионал. конф. по актуал. пробл. ветеринар, мелких домашних животных. Краснодар, 2001. - С. 30-31.

19. Гаркави Б.Л., Медведев А.Ю. Распространение дирофиляриоза собак и человека в Краснодарском крае //Матер, докл. науч. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». 2004. - С. 111-112

20. Гаркави Б.Л., Михно Ф.С. Распространение дирофиляриоза домашних собак в Краснодаре //Матер, докл. науч. конф. «Теория ипрактика борьбы с паразитарными болезнями», 22-23 мая 2002. М., 2002.-С. 91.

21. Гогель JI.C. Filaria immitis в сердце собаки в Закавказье //Журнал науч. и практ. вет. мед. 1910.-Т. 3, В.2.-С. 6-16.

22. Григорьева М.В., Дворовенко Е.В. Дирофиляриоз оболочек яичка под маской синдрома отечной и гиперемированной мошонки //Детская хирургия. 2003. - №2.

23. Гурвич Б.М. К распространению микрофиляриоза собак в Донском округе //Сев.-кавк. вет. вестник. 1929. - №3.

24. Гуськов В.В., Горшкова Е.В., Постнова В.Ф., Агарунов А.В. Дирофиляриоз в Астраханской области //Лечащий врач. 2001. - №1. -С.13-16.

25. Дахно И.С., Немешкало Ю.П., Дахно Г.Ф. и др. Дирофиляриоз собак у Пивнично-Схидний части Украини //36. матер. III Мижнар. наук.-практ. конф., Киев, 1998. С. 97-99.

26. Демидова А .Я. Гельминтофауна собак Азербайджана //Сб. раб. по гельминтол. 1937. - С. 123-125.

27. Каденации А.Н. Гельминтофауна млекопитающих Крыма и опыт оздоровления домашних животных от основных гельминтозов: Автореф. дис. . док. вет. наук., М., 1958.

28. Карвовский О., Макаревич О., Тростянецька Ю. Макаревич Е. Дирофиляриоз собак у Криму //Вет. мед. Укр. 1997. - №5. - С. 26.

29. Кетти Д. Антитела //Методы. М., 1991. - Т. 2.

30. Кудинов А.В., Анникова Л.В. Дирофиляриоз теперь и в Саратове //Ветеринария Поволжья. 2002. - №3. - С. 19-21.

31. Левченко И.В., Нагорный С.А., Ермаков A.M. и др. Дирофиляриоз у собак //Тез.2-й per. конф. «Актуальные проблемы вет. мед. мелких домашних животных на Северном Кавказе». 1999. - С. 23-24.

32. Любченко Е.Н., Вавилова О.И. Дирофиляриоз собак// Актуальные проб. биол. и вет. мед. мелких домашних животных.

33. Мат. междунар. практич. конф. Троицк, 2000. - №3. - С. 43-44.

34. Мазуркевич А.И., Величко С.В., Василик Н. и др. Дирофиляриоз собак у Киевському региони //Ветеринарна мед. Укр. Киев, 2001. - С. 18-19.

35. Матчанов Н.М. Роль собак Келесского массива Ташкентской области в эпизоотологии и эпидемиологии гельминтозов //Природная очаговость болезней и вопросы паразитологии. Алма-Ата, 1961. - С. 291-297.

36. Нагорный С.А., Артамонова А.А. Дирофиляриоз в г. Ростове-на-Дону //Тез. 1-й per. конф. «Актуальные проблемы вет. мед. мелких дом. животных на Северном Кавказе». 1997. - С.35-36.

37. Нагорный С.А., Бескровная Ю.Г., Ермакова JI.A. // Особенности эпизоотологии дирофиляриоза в Ростове-на-Дону.: Мат. докладов научной конференции: Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями. М., 2007. - №8. - С. 239241.

38. Насилова В.В. К распространению дирофиляриоза собак в Армянской ССР //Тр. Ереван, зовет, ин-та. 1948. - В. 10. - С. 121-126.

39. Насилова В.В. К изучению клинической картины дирофиляриоза собак //Тр. Ереван, зовет, ин-та. 1952. - В.14. -С. 171-180.

40. Нго Т.Т., Ленхофф Г. Иммуноферментный анализ. М., 1988. С. 941399.

41. Петров A.M. К фауне паразитических червей домашних плотоядных Туркестана //Тр. Гос. ин-та эксперимен. вет. 1926. -T.II, Вып.2. - С. 89-101.

42. Петров A.M. Глистные инвазии собак и их санитарное и экономическое значение //Сельхозгиз, М.-Л., 1931. 160с.

43. Петров A.M. Глистные болезни пушных зверей. Изд-во «Международная книга», 1941. 219с.

44. Петропавловский НИ. К вопросу о Filaria immitis в крови у собак //Архив вет. науки. -1904. кн. 6. - С. 484-492.

45. Поживил А.И., Мищишин В.Т., Галат В.Ф. Випадки захворювання собак на дирофиляриоз в Украини //36. матер. III Мижн. наук.-практ. конф. Киев, 1998.-С. 114-116.

46. Поживил А.И., Петренко О.Ф., Чомко В.Н. и др. Диагностика и лечение дирофиляриоза собак //36. матер. IV Мижн. наук.-практ. конф. 14-15 жовтня 1999.-К., 1999.-С.78-81

47. Постнова В.Ф., Ковтунов А.И., Абросимова JI.M. и др. Новые случаи дирофиляриоза человека //Мед. паразитол. и параразитарн. бол. 1997. -№1.-С. 6-9.

48. Прохоров AM. и др. Краснодарский край //Большая Советская Энциклопедия. -М, 1973.-С. 334-336.

49. Роберман CJI Материалы по гельминтофауне собак Киргизской ССР //Ветеринария. -1941.- №4. С. 18.

50. Рощина Р.В. Дирофиляриоз //litlpyAvvvw.akcorLkiev.ua 1999.

51. Рощина Р.В. Дирофиляриоз собак //Восьмой международный конгресс по проблеме ветеринарной медицины мелких домашних животных. 2000. - С. 186-188.

52. Сапунов А.Я. Совершенствование мер борьбы с трихинеллезом в северо-западном регионе Кавказа //Дис. . док. вет. наук. Краснодар, 2001.-С. 20-25.

53. Сапунов А.Я., Звержановский М.И. Распространение дирофиляриоза собак в Краснодарском крае //Тез. докл. науч. конф. Краснодар, 1980. - С. 23-25.

54. Скрябин К.И. К характеристики гельминтофауны домашних животных Туркестана: Дис. Юрьев, 1916.

55. Скрябин К.И. Филяриидозные заболевания человека в СССР //Мед. и паразит, болезни. 1940. - т. IX, Вып. 1-2. - С. 119-127.

56. Скрябин К.И., Альтгаузен А.З., Шульман Е.С. Первый случай обнаружения Dirofilaria repens у человека //Троп. мед. и ветерин. 1930. - т.VIII, №2. - С. 9-11.

57. Скрябин К.И., Шихобалова Н.П. Филярии животных и человека. М.: Сельхозгиз, 1948.-608с.

58. Сонин МД Филяриаты животных и человека и вызываемые ими заболевания. 43. Филярииды, онхоцерцины. М., 1975.-С. 237-292

59. Супряга В.Г., Старкова Т.В., Сабгайда Т.П. и др. Изучение дирофиляриоза человека в России //Матер. Междунар. конф., посвящ. 125-летию К.И. Скрябина «Основные достижения и перспективы развития паразитологии». М., 2004. - С. 304-306.

60. Сухова М.В. Эпизоотологический надзор при дирофиляриозе плотоядных в условиях Среднего и Нижнего Поволжья: Автореф. дис. . канд. вет. наук. 2002. - С. 22.

61. Ушаков А.В., Степанова Т.Ф., Струкова А.С. Случай дирофиляриоза человека в городе Тюмени //Мед. паразитол. и паразитарн. бол. 2002. -№4.-С. 52-53

62. Фисько МА Дирофиляриоз собак в Новочеркасске. //Ветеринария. 2006. - №5. -С. 36.

63. Хижа С.И. К вопросу о клинической картине при дирофиляриозе подкожной клетчатки у собак //Сб. науч-пракг. раб. вет. состава погран. войск. -1958. В. 1. - С. 65-68.

64. Худавердиев ТЛ К биологии Dirofilaria repens Railliet et Henry, 1911, возбудителя дирофиляриоза собак в Нахичеванской АССР //Матер, науч. конф. Всес. о-ва гельминшл. -1976. -Вып. 28. -С. 163-169.

65. Худавердиев ТЛ, Джафаров IILM К изучению распространения дирофиляриоза кровососущими насекомыми в условиях Нахичеванской АССР //Уч. зап. Азерб. гос. унив-та-1979. -Вып. 1.-С. 16-21.

66. Якимов ВЛМикрофилярии животных в Туркестанском крае //АВН 1916.-Кн. 1.-С. 9-22.

67. Ястреб В.Б. Некоторые аспекты дирофиляриоза собак в Московском регионе //Матер, докл. научн. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». 2004.- С. 440442.

68. Ястреб В.Б. Дирофиляриоз собак в центральном регионе России //Тр. Всерос. ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. 2006. - Т. 42. - С. 457-467.

69. Addario С. Su un nematode dell' occio umano. //Ann. Ottalmolog. 1885. -XIV, N2-3.-P. 134.

70. Aranda C., Panyella O., Eritja R., Castella J. Canine filariasis importance and transmission in the Baix Llobregat area, Barcelona (Spain) //Vet. Parasitol. 1998. - V. 77, N 4. - P. 267-275.

71. Atwell R.B., Buoro I.B.J. Clinical presentations of canine dirofilariasis with relation to their haemotological and microfilarial status //Res. Vet. Sci. -1983.-V. 35,N3.-P. 364-366.

72. Bancroft T.L. On some further observations on the life history of Filaria immitis Leidy //Brit. Vet. J. 1904. - V.l. - P. 822-823.

73. Bernard P.N., Bauche J. Conditions le propagation de la fflariose sub-cutanee du chien Stegomyafesciatahotemtermediairede Dirofilaria repens/ZIbid.- 1913.-N6.-P. 89.

74. Bidgood AJ., Collins G.H. Hie prevalence of Dirofilaria immitis in dogs in Sydney //Austral.Vet J.-1996.-V. 73, N3.-P. 103-104.

75. Bokaie S., Mobedi I., Mobebuli M et al. The prevalence of dirofilariasis in dogs in Meshkinshahr area, northwest Iran //J. of the Fac. of Vet Med. -1998. V. 53, N1/2. -P. 23-26.

76. Boros G., Janisch M., Sebestyen G. Dirofilaria immitis fertozttseg kulyaban.// Magyar a Mattory lapja Vengria, 1982. V. 37, №5. P. 313 -316.

77. Calvert C.A., Rawlings C.A. Therapy of canine heartworm disease. In: Current Vet. Therapy IX, Small Anim. Pract. 1986. P. 406-419.

78. Cancrini G., Allende E., Favia G. et al. Canine dirofilariosis in two cities of southeastern Spain //Vet. Parasitol. 2000. - V. 92, N 1. - P. 81-86.

79. Carlisle C.H. The incidence of Dirofilaria immitis (Heartworm) in dogs in Queensland //Austral. Vet. J. 1969. - V. 45, N 11. - P. 535-538.

80. Chalifoux L., Hunt R.D. Histochemical differentiation of Dirofilaria immitis and Dipetalonema reconditum //J. Amer. Vet. Med. Assoc. 1971. - V. 158. -P. 601-605.

81. Corwin R.M., Nahm J. Heartworm. www.missouri.edu/~vmicrrorc/Nematodes/Spirurids/Dimmitis.htm.

82. Cringoli G., Rinaldi L., VenezianoV., Capelli G. A prevalence survey and risk analysis of filariosis in dogs from the Mt. Vesuvius area of southern Italy //Vet. Parasitol. 2001. - V.102. - P. 243-252.

83. Dashiell G.F. A case of dirofilariasis involving the lung //Amer. J. Top. Med. Hyg. 1961. - V. 10. - P. 37-38.

84. Desportes G. Nouvelle description de Г extremite' cephaligue de Г adalte de Dirofilaria immitis (Leidy, 1856) // Ann. de parasit. 1939. -V.17, N 5. - P. 405-414.

85. Diakou A. The prevalence of canine dirofilariosis in the region of Attiki //Bull, of the Hellenic Vet. Med. Soc.-2001.-V. 52, N2.-P. 152-156.

86. Doby, J.M., Guiguen, C, Lefeuvre, R. Presence de Dirofilaria immitis (Leidy, 1856) chez le chien en Bretagne // Bulletin Societe Francaise de Parasitologie. 1986. -N 4. - P. 51-54.

87. Dunsmore J.D., Shaw S.F. Clinical parasitology of dogs //Vet Rev. -1990. V. 31. - P. 115-130.

88. Elek G., Minik K., Pajor L. et al. New human dirofilarioses in Hungary //Pathol. Oncol. Res. 2000. - V. 6, N 2. - P. 141-145.

89. Eyles D.E., Gibson C.L., Jones F.E., Cuningham M.E.G. Prevalence of Dirofilaria immitis in Memphis, Tennessee //J. of Parasitol. 1954. - V.40, N 2.-P. 216-221.

90. Favia G., Lanfrancotti A., Torre A. della et al. Polymerase chain reaction-identification of Dirofilaria repens and Dirofilaria immitis //Parasitology. -1996.-113, N6.-P. 567-571.

91. Fernando S.D., Ihalamulla R.I., Silva WAS. Male and female filarial worms Dirofilaria (Nochtiella) repens recovered from the scrotum //Ceylon Med J. -2000. V. 45.-P. 131132.

92. Fortin J.F. Development of Dirofilaria immitis in Aedes triseriatus and Aedes vexans . Master f Science Thesis, University of Guelnh, 1979. 33. Kennedy, C.R. Ecological animal parasitology // Oxford: Black wall Sci. PubL. 1975.-P. 163.

93. Fullebom F. Beitrage zur Biologie der Filarian//Centr. Bakt I AbL Qrig. -1912. -V. 66. -P. 255-267.

94. Ganestri Trotti G., Pampiglione S., Rivasi F. The species of the genus Dirofilaria Railliet and Henry, 1911 //Parassitologia. 1986. - V.39. - P. 369374.

95. Georgieva D., Kirkova Z., Ivanov A. A study on the incidence and diagnostics of dirofilariosis (heartworm disease) in carnivores //Bulgarian J. of Vet. Med. 2001. - V. 4, N 4. - P. 231-236.

96. Giannetto S., Pampiglione S., Santoro V., Virga A. Research of canine filariasis in Trapani province (Western Sicily). Morphology on SEM of male Dirofilaria repens //Parassitologia. 1997. - V. 39, N4. - P. 403-405.

97. Gilis JM, Smith RD., Todd K.S. Diagnostic criteria for an enzyme-linked immunosorbent assay for occult heartworm disease: Standardization of the test system in naturally exposed dogs//Am. J. Vet Res.-1984.-V. 45,N11.-P. 2289-2292.

98. Giassi В., Noe G. Propagazione della filariae del sangue esclusivomehte per mezzo dellapuncture di pealiaria zanzare. Note preliminary //R. C. Accad Lincoi. -1900. V. 9. - P. 157-162.

99. Grossi TL., Ihrke PJ., Walder EJ., Afifolter V.K. Cutaneous microfilariasis //Skin disease ofthe dog and cat -2005. -P. 225-228.

100. Guerrero J. et al. Distribution of Dirofilaria immitis in selected areas of Europe and South America/ZProc. Heaitwoim Symp.- 1989.-P. 13-18.

101. Harrus S., Harmelin A., Rodrig S., Favia G. Dirofilaria repens infection in a dog in Israel //Amer. J. Trop. Med. Hyg. 1999. - V. 61, N 4. - P. 639-641.

102. Hawking A.G., Hsiu J.G., Smith R.M. et al. Pulmonary dirofilariasis diagnosed by fine needle aspiration biopsy: a case report //Acta Cytologica.1985.-V. 29.-P. 19-22.

103. Hendrix CM, Schlotthauer J.C., Bemrick WJ., Averbeck GA Temperature effects on the development ofDirofilaria immitis in Aedes vexans //Proc. of the Heartworm Symp. -1981.-P.9-12.

104. Himonas C. Canine filariasis caused by Dirofilaria repens in Greece //Parassitologia. -1996.-V. 38, N1-2.-P. 357.

105. Hirano H, Kizaki Т., Sashikata Т., Matsumura T. Pulmonary dirofilariasis. Clinicopathological study//Kobe J. Med Sci.-2002.-V. 48,N3.-P. 79-86.

106. Hiroshima KL, Iyoda A., Toyozaki T. et al. Human Pulmonary Dirofilariasis: Report of Six Cases //Tohoku J. -1999. -V. 189,N4.-P. 307-314.

107. Ilievski V. Dirofilarijaza pasa u sjedinjenim americkim drzavama //Vet glasnik. -1983. -V.37,N9.-S. 687-693.

108. Ishihara K., Kitagawa R, Ojma M et al. Clinico-pathological studies on canine dirofflarial haemogbbinuria/Дф. J. Vet Sci.- 1978.-V.40.-P. 525-537.

109. Ishihara K., Sasaki Y., Kitagawa H Development of a flexible alligator forceps: a new instrument for removal of heartworms in the pulmonary arteries of dogs //Jap. J. Vet Sci.1986. -V. 48, N 5. -P. 989-991.

110. Kanev I., Kamenov I., Ganchev G. et al. Dirofilaria immitis in animals and humans in Bulgaria/ZParasitolotologia- 1996.-V. 38,N 1-2.-P. 358.

111. Kartman L. Effect of feeding mosquitoes upon dogs with differential microfilaraemias // J. Parasitol. -1953. -V. 39, N 4. -P 572-573.

112. KatoKH. Patent Immunoassay.-1982.-N4,322,495.

113. Kelly Ш Detection and differentiation of microfilariae in canine blood //Austral. Vet J. -1973.-V. 49,N l.-P. 23-27.

114. Knight DH Heartworm heart disease //Adv. in Vet Sci. and Сотр. Med-1977.—V. 21. -P. 107-149.

115. Knight DH., Campbell W.C., Weiner D J. et al. Microfilaricidal efficacy of ivermectin in adulticide treated and untreated heartworm infected dogs / In Otto G.F. Proc. Heartworm Symp.-1986.-P. 19-27.

116. Knight DH How current knowledge has affected the diagnosis, prevention and treatment ofheartworm infection. In Soli MD. ed Proc. Amer. Heartworm Symp. -1992. -P. 253.

117. Knott J.I. Method for making microfilarial surveys on day blood //Trans. К Soc. Trap. Med Hyg.- 1939.-V.33.-P. 191-196.

118. Kobayashi S., Kakinuma K., Qhtake К. et al. Effects of fenthion against microfilaria of Dirofilaria immitis //Jap. J. Vet Sci.-1972.-V. 34.-P. 177.

119. Kume S. Epizootology of canine heartworm disease in the Tokyo area; diagnosis and treatment//Proc. 1-st Inter. Symp. on Can. Heartworm Dis., 1970.-P. 18-33.

120. LaemmliUK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the assembly of the head of bacteriophage T4//Natur.-1970.-V. 16(1).-P. 7-13.

121. Lahitte J. D., Davoust В., Dorchies P. Etude comparative de cinq methods de detection des Microfilaires sanguicoles //Rev. Med Vet -1986. -V. 137, N10. -P. 639 -644.

122. Leidy J. Worms in heart of a dog //Proc. Acad Nat Sci., Philadelphia. -1856. V. 10,N l.-P. 110-112.

123. Levine JP., Fox D.S., Snowden K.F. et al. Validity of Filarochek test for detection of Dirofilaria immitis infections in dogs //. Amer. Anim Hosp. Assoc. -1988. -V. 24, N 3. -P. 327-331.

124. Lindsey J.R. Diagnosis of filarial infections in dogs. I. Microfilarial surveys //J. of Parasitol. -1961.-V. 47, N5.-P. 695-702.

125. Lindsey J.R. Identification of canine microfilariae //J. Amer. Vet Assoc. -1965. -V. 146. -P.l 106-1114.

126. Logar J., Novsak V., Rakovec S., Stanisa 0. Subcutaneous infection caused by Dirofilaria repens imported to Slovenia//! Infect-2001.-V. 42,N l.-P. 72-74.

127. LokJB. Dirofilaria sp.: Taxonomy and distribution In: Dirofilariasis. Ed. Boreham PPL., AtwellRB.-1988.-P. 1-28.

128. Lucientes J., Castillo JA Present status of Dirofilaria repens in Spain //Parassitologia. -1996.-V. 38, N1-2.-P. 358.

129. Madron E. Dirofilariasis in southeastern France: 16 case reports //Point Vet.- 1991.-V. 23, N136.-P. 155-159.

130. Magat W.J., Jeska E.L. A serodiagnostic antigen for trichinellosis //Acta parasitol polon. 1976. - V. 24, N 11-19. - P. 191-198.

131. Martin Т.Е., Collins G.H. Testing for heartworm disease in dogs //Canadian Vet. J. 1985. - V. 26, N 1. - P. 58.

132. Masseron Т., Sailliol A., Niel L., Floch J.J. Conjunctival dirofilariasis caused by Dirofilaria repens: report of a French case //Med. Trop. 1995. -V. 55, N4.-P. 457-458.

133. Matsumura K., Kazuta Y., Endo R. et al. Detection of circulating immune complexes in the sera of dogs infected with Dirofilaria immitis, by Clg-binding enzyme-linked immunosorbent assay //J. Helminthol. 1986. - V. 60, N3.-P. 239-243.

134. McCarthy J. Canine heartworm disease, a discussion of the current knowledge. In Bradeley R.E. ed. 1970.

135. Milanez de Campos J.R., Barbas C.S., Filomeno L.T. et al. Human pulmonary dirofilariasis: analysis of 24 cases from Sao Paulo, Brazil //Chest.- 1997. V. 112, N 3. - P. 729-733.

136. Mizuno F., Higashio Т., Marsumura T. A survey of canine Dirofilaria invasion in a suburb of Tokyo (Nerima ward) //Kobe J. Med. Sci. 1981. - V. 27.-P. 113-120.

137. Montoya J.A., Morales M., Ferrer O. et al. The prevalence of Dirofilaria immitis in Gran Canaria, Canary Islands, Spain (1994-1996) //Vet. Parasitol. 1998. -V. 75, N 2/3. - P. 221-226.

138. Murdoch D.B. Heart worm in the United Kingdom //J. Small Anim. Pract. -1984.-V. 25.-P. 299-305.

139. Nadgir S., Tallur S.S., Mangoli V., Halesh L.H. et al. Subconjunctival dirofilariasis in India //Southeast Asia J. Trop. Med. Public Health. 2001. -V. 32, N2. - P. 244-246.

140. Nelson G.S. The identification of infective filarial larvae in mosquitoes: with a note on the species found in Wild mosquitoes on the Kenya Cost //J. of Helminthol. 1959. - V. 33, N 2/3. - P. 233-256.

141. Newton W.L., Wright W.H. The occurrence of a dog filarid other than Dirofilaria immitis in the United States //J. of Parasitol. 1956. - V. 42. - P. 246-258.

142. Newton W.L. Experimental transmission of the dog heartworm, Dirofilaria immitis, by Anopheles quadrimaculatus //J. of Parasitol. 1957. - V. 43. - P. 589.

143. Newton W.L. Longevity of an experimental infection with Dirofilaria immitis in a dog //J. of Parasitol. 1968. - V. 54. - P. 187-188.

144. Otto F.G. Geographical distribution vectors and life cycle of Dirofilaria immitis //J. Amer. Vet. Med. Assoc. 1969. - V. 154. - P. 370.

145. Pampiglione S., Trotti C.G., Rivasi F. Human dirofilariasis due to Dirofilaria (Nochtiella) repens: A review of world literature //Parasitollogia. 1995. - V. 37, N2-3.-P. 149-193.

146. Pampiglione S., Elek G., Palfi P. et al. Human Dirofilaria repens infection in Hungary: a case in the spermatic cord and a review of the literature //Acta Vet. Acad. Sci. Hung. 1999. - V. 47. - P. 77-83.

147. Pampiglione S., Rivasi F., Angeli G. et al. Dirofilariasis due to Dirofilaria repens in Italy, an emergent zoonosis: report of 60 new cases //Histopathology. 2001. -V. 38, N 4. - P. 344-354.

148. Petruschke G., Rossi L., Genchi C., Pollono F. Canine dirofilariosis in the canton of Ticino and in neighbouring areas in northern Italy //Schweizer ArchivfurTierheikunde.-2001.-V. 143,N3.- P. 141-147.

149. Railliet A., Henry A. Sur une Filaire peritoneale des Porcins //Bull. Soc. Path. exot. 1911. -V. 4. -P. 386-389.

150. Rawlings C.A., Prestwood A.K., Beck B.B. Eosinophilia and basophilia in Dirofilaria immitis and Dipetalonema reconditum infections //J. Amer. Anim. Hosp. Assoc. 1980. - V. 16. - P. 699-704.

151. Rawlings C.A., Dawe D.L., McCall J.W. et al. Four types of occult Dirofilaria immitis infection in dogs //J. Amer. Vet. Med. Assoc. 1982. - V. 180,N11.-P. 1323-1326.

152. Raynaud J.P. La melarsamine (R.M. 340) un nouveau macrofilaricide dans le traitement des infestations du chien par Dirofilaria immitis //Prat. Med. Chirurg. de l'Anim. Сотр. 1990. - V. 25. - P. 369-374.

153. Raynaud J.P. Thiacertarsamide (adulticide) versus melarsomine (RM 340) developed as macrofilaricide (adulticide and larvicide) to cure canine heartworm infection in dogs //Ann. Rech. Vet. 1992. - V. 23, N 1. - P. 125.

154. Rilatt D.B., Atwell R.B., Watson A.R.A. et al. A second generation heartworm test //Austral. Vet. Pract. 1984. - V. 14, N 4. - P. 174-175.

155. Ro J.Y., Takalakis P.J., White V.A. et al. Pulmonary dirofilariasis: The great imitator of primary or metastatic lung tumor //Hum. Pathol. 1989. - V. 20. P. 69-76.

156. Robinson N.B., Chaves C.M., Conn J.H. Pulmonary dirofilariasis in man: a case report and review of the literature //J. Thorac. Cardiovac. Surg. 1977. -V. 74.-P. 403-410.

157. Rojo-Vazquez F.A., Valcarcel F., Guerrero J., Gomez-Bautista M. Prevalence of canine dirofilariasis in four geographical areas of Spain //Med. Vet. 1990. - V. 7, N 5. - P. 297-305.

158. Rossi L., Pollono F., Meneguz P.G. et al. An epidemiological study of canine filarioses in north-west Italy: what has changed in 25 years //Vet. Res. Commun. 1996. - V. 20, N 4. - P. 308-315.

159. Ruiz-Moreno J.M., Bornay-Llinares F.J., Prieto M.G. et al. Subconjunctival infection with Dirofilaria repens: serogical confirmation of cure following surgery //Arch. Ophthalmol. 1998. - V. 116, N 10. - P. 1370-1372.

160. Sahal M, Ozlem M, Tanyel B. et al. Biochemical changes in the blood, urine and abdominal fluid of dogs infected with Dirofilaria immitis //Vet Fak Deigisi. -1997. V.44, N 2/3, -P. 267-276.

161. Sakamoto Т., Togoe Т., Yamamoto Y., Kitano Y. Microfilaricidal effect of fention applied on the skin of the dog infected with Dirofilaria immitis //Mem Fac. Agr. Kagoshima Univ. -1980.-V.16.-P. 75-87.

162. Scholtens R.G., Patton S. Evaluation of an enzyme-linked imunosorbent assay for occult dirofilariasis in a population of naturally exposed dogs //Amer. J. Vet Res. -1983. V. 44, N5.-P. 861-864.

163. Schrey C.F., Trautvetter E. Heartworm disease in cats and dogs diagnosis and therapy //Waltham Focus. - 1998. - V. 8, N 3. - P. 23-30.

164. Sharma MC., Pachauri SP. Blood cellular and biochemical studies in canine dirofilariasis //Vet Res. Comm.-1982.-V. 5,N3.-P. 295-300.

165. Stueben ED. Larval development of Dirofilaria immitis (Leidy) in fleas //J. of Parasitol. -1954. V. 40, N 5. -P. 580-589.

166. Sudermann M.T., Craig T.M. Efficacy of ivermectin against Dirofilaria immitis microfilariae in naturally infected dogs //Amer. J. Vet. Res. 1984. -V. 45, N5.-P. 1031-1032.

167. Tarello W. Subcutaneous canine dirofilariasis due to Dirofilaria (Nochtiella) repens of American origin in Italy: case report / Rev. de Med Vet 2000. V. 151, N11. - P. 10531058.

168. Tarello W. Impotance in the dog of concentration test for the diagnosis of heartworm disease in non endemic areas INet On-line. -2001.

169. Taylor AE.R The development of Dirofilaria immitis in the mosquito Aedes aegypti //J. Helminthol.-1960,-V. 34,N 1/2.-P. 27-38/

170. Thilsted JP., Whorton J., Hibbs CM, Jilson GP., Steece R, Stromei M Comparison of for serotest for the detection of Dirofilaria immitis infection in dogs //Am J. Vet Res. -1987.-V. 48,N5.-P. 837-841.

171. Thomas RE. A case of canine heartworm disease (Dirofilaria immitis) in the UK //Vet Rec.-1985.-V. 117,N1.-P. 14-15.

172. Thrasher JP., Ash LR, Littlie MD. Filarial infections of dog? in New Orleans //J. of the

173. Am. Vet Med Assoc.-1963.-V. 143, N6.-P. 605-608.

174. Traldi G. La filariosi cardio-polmonare//Ed. Scivac.-1987. -V. 1.- P. 1-3.

175. Underwood P.C., Harwood PD. Survial and location of the microfilariae of Dirofilaria immitis in the dog//J. ofParasitol.-1939.-V. 25.-P. 23-33.

176. Vakalis N.C., Hmonas С A Human and canine dirofilariasis in Greece //Parasitollogia. -1997.-V. 39,N4.-P. 389-391.

177. Vezzoni A, Genchi C., Raynaud J.-P. Adulticide efficacy of RM 340 in dogs with mild and severe natural infections. In Soli MD. ed Proc. Amer. Heartworm Symp. -1992. P. 231.

178. Wallace СЛ. Canine heartworm disease, a discussion of the current knowledge. In Bradeley R£. ed -1970.

179. Wang L.C. Canine filarial infection in north Taiwan //Acta Trop. -1997. -V. 68, N1. -P. 115-120.

180. Ward J.W., Franklin MA Further studies on the occurrence of the dog heart worm, Dirofilaria immitis in dogs in Mississippi //X of Parasitol. -1953. -V. 39, N 5. -P. 570-571.

181. Watson ADJ., Testoni FJ., Pages W.L. A comparison of microfilariae isolated from canine blood by the modified Knott test and a filter method //Austral. Vet J. -1973. V. 49, Nl.-P. 28-30.

182. Watts KJ., Reddy G.R., Holmes RA et al. Seasonal prevalence of third-stage larvae of Dirofilaria immitis in mosquitoes from Florida and Louisiana II1 ofParasitol. 2001. - V. 87,N2.-P.322-329.

183. Webber Ai7., Hawking F. Experimental maintenance of Dirofilaria repens and D. immitis indogs//Exper. Parasitol.-1955.-V. 4, N2.-P. 143-164.

184. Webster D.R. Heart worm Dirofilaria immitis infection in dogs //Austral. Vet J. -1969. -V. 45, N 6. -P. 247-250.

185. Wee S.H, Lee C.G., Kim J.T. Prevalence of Dirofilaria immitis infection in dogs of Chuncheon area//Korean J. of Vet Public Health. -2001. -V. 25, N4. -P. 229-232.

186. Weil GJ., Malane MS., Powers KG. Detection of parasite antigens in canine dirofilariasis by wunterimmunoeelectrophoresis //Am. J. Trop. Med Hyg. -1984. -V. 33. -P. 425430.

187. Weil GJ. U.S. Patent Circulating antigens of Dirofilaria immitis, monoclonal antibodies specific therefore and methods of preparing such antibodies and detecting antigens. -1985. -N.4,839,275.

188. Wright SA, Boyce K.W. Epizootology of canine cardiovascular dirofilariasis in six northern California counties //Proc. Ann. Conf. California Mosq. and Vector Control Assoc. -1989.-V.57.-P. 37-43.

189. Wylie JP. Detection of microfilariae by a filter technique //J. Amer. Vet Med Assoc. -1970.-V. 156,N 10.-P. 1403-1405.

190. Yoon H.Y., Yoon C.S., Jeong S.W. et al. Prevalence and relatine risk of canine dirofilariasis among dogs in Seoul, South Korea //Vet Parasitol. -2002. V. 115, N 19.-P. 576-577.

191. Yriev, R.B., and al. Epidemiology of canine heartworm infection // Epidemiology Rev. 1983. - P. 220-246.