Иммунохимическая характеристика антигенов Dirofilaria immitis и Setaria labiato-papillosa, их эффективность в диагностике дирофиляриоза

Хайдаров, Камил Абдурахманович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммунохимическая характеристика антигенов Dirofilaria immitis и Setaria labiato-papillosa, их эффективность в диагностике дирофиляриоза
ВАК РФ 03.02.11, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Иммунохимическая характеристика антигенов Dirofilaria immitis и Setaria labiato-papillosa, их эффективность в диагностике дирофиляриоза"

На правах рукописи

Хайдаров Камил Абдурахманович

Иммунохимическая характеристика антигенов Dirofilaria immitis и Setaria labiato-papillosa, их эффективность в диагностике дирофиляриоза

03.02.11 - паразитология

4844239

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 1 «ПР 2011

Москва-2011 г.

4844239

Работа выполнена в ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии имени К.И. Скрябина (ВИГИС)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Бережко Вера Кузьминична

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Бепедиктов Игорь Иванович

доктор биологических наук, доцент Жданова Ольга Борисовна

Ведущая организация: Курский государственный университет

Зашита состоится «27» апреля 2011 г. в 12 — часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.011.01 при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии имени К.И. Скрябина (ВИГИС).

Адрес: 117218, г. Москва, ул. Б.Чсремушкинская, 28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИГИС

Автореферат размещен на официальном сайте ГНУ ВИГИС Россельхозакадемии http://mvw.gnuvigis.nxt.ru

Автореферат разослан 2011

Ученый секретарь Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, доктор биологических наук, профессор Бережко В.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Дирофиляриоз - зоонозное заболевание, переносчиком которого являются комары. Возбудителями инвазии у собак являются виды - ОноШапа ¡ттШэ и Б. герепя, широко распространенные во многих странах мира (К.И. Скрябин, 1930; И.А. Архипов, 2004; В.Б. Ястреб, 2006; А.Ю. Медведев, 2006). Они зарегистрированы и у человека, однако половой зрелости в организме человека дирофилярии не достигают и микрофилярий не выделяют. Широкому распространению дирофиляриоза в последние годы способствует увеличение численности собак, значительная миграция людей вместе с животными, а также адаптация дирофилярии к различным промежуточным хозяевам.

Прижизненная диагностика дирофиляриоза, в основном, базируется на обнаружении микрофилярий в крови и их идентификации. Однако при латентной форме и низкой интенсивности инвазии этот метод фактически не дает нужного эффекта, поэтому необходимо иметь на вооружении иммунодиагностические тесты, основанные на выявлении циркулирующих антигенов или антител, синтезируемых в организме инвазированного животного или человека.

Применение современных иммунологических методов позволяет изучить кинетику основных показателей иммуноаллергических реакций, антигенные и иммуногенные свойства паразитов, пути формирования защитных реакций организма при заражении.

Выяснение механизма действия антигенов гельминтов на организм хозяина является основой проведения целенаправленного поиска иммунодиагностических средств, более доступных источников иммуногенного материала, а также использования для этих целей гетеролопичных антигенов.

Поскольку приобретение дирофилярий для приготовления антигенов и разработки на их основе иммунодиагностических тестов является в некоторой степени проблематичным, то возникает необходимость поиска гетерологичного, более доступного гсльминтного материала, имеющего общие антигенные компоненты диагностического значения с дирофиляриями. Таким биологическим объектом могут быть сетарии, которые, как и дирофилярии, относятся к подотряду РИапаСа и вполне могут в белковом спектре содержать антигенные компоненты, способные диагностировать дирофиляриоз.

Цель и задачи исследований. Целью работы является иммунохимическая и физико-химическая характеристика антигенов-экстрактов из дирофилярий и сетарий, определение и выделение из них диагностически эффективных антигенных компонентов при дирофиляриозе, разработка на их основе иммуноферментной тест-системы.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- приобрести гельминтный материал - половозрелых сетарий и дирофилярий, приготовить белковые соматические экстракты и определить в них содержание белка;

- провести иммунизацию кроликов соматическими экстрактами из сетарий и дирофилярий, получить иммунные сыворотки и определить их активность иммуноферментной реакцией с гомологичным и гетерологичкым антигеном;

- провести иммунохимический анализ соматических экстрактов из сетарий и дирофилярий реакцией кммунодиффузии в агаровом геле;

- провести фракционирование соматических экстрактов из сетарий и дирофилярий гель-хроматографией, исследовать полученные фракции ИФР, определить в них антигеноактивные и диагностически эффективные при дирофиляриозе;

- разработать на основе фракционированного антигена-экстракта из сетарий диагностическую иммуноферментную тест-систему при дирофиляриозе собак;

- сравнить диагностическую эффективность ИФР при дирофиляриозе собак на основе фракционированного антигена из сетарий и дирофилярий.

Научная новкзиа. Впервые проведена сравнительная физико-химическая и иммунохимическая характеристика соматических экстрактов из половозрелых Dirofilaria immitis и Setaria labiato-papillosa. В экстракте из дирофилярий диск-электрофорезом регистрировали 18, а из сетарий - 16 белковых компонентов, располагающихся в диапазоне белков молекулярной массы 6,5-200 кДа. Реакцией иммунодиффузии с гипериммунными сыворотками от кроликов в экстракте из дирофилярий определено не менее 7, а из сетарий не менее 6 потенциальных антигенных компонентов.

В обоих экстрактах выявлен один антигенный компонент диагностического значения при дирофиляриозе.

Фракционированием антигена-экстракта из сетарий и дирофилярий гель-хроматографией на Superóse 12 Prep Grade выделены диагностически эффективные антигенные фракции при дирофиляриозе собак.

Впервые при дирофиляриозе собак разработана иммуноферментная тест-система на основе фракционированного антигена из сетарий, сопоставимая по своей чувствительности и специфичности с аналогичной реакцией на основе фракционированного соматического экстракта из дирофилярий.

Чувствительность ИФР с фракционированным антигеном из дирофилярий и сетарий составила соответственно 82,4%, специфичность -86,7; 83,3%. Установлена возможность использования в качестве источника диагностического антигена при дирофиляриозе собак гегерологичного вида гельминта-Setaria labiato-papillosa.

Практическая значимость. Предложена иммуноферментная тест-система на основе фракционированного соматического экстракта из половозрелых сетарий для диагностики дирофиляриоза собак.

По материалам диссертационной работы разработаны:

1. Лабораторный регламент на выявление сывороточных антител при дирофиляриозе антигеном из сетарий, одобренный секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РЛСХН 25.09.2008.

2. Методика постановки ИФР с фракционированным антигеном из сетарий для диагностики дирофиляриоза, одобренная секцией «Инвазионные болезни животных » Отделения ветеринарной медицины РАСХН 25.09.2009.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены: -на заседаниях Ученого совета ВИГИС (2006-2009гг.)

- на научных конференциях ВОГ «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями человека и животных» (г. Москва 2007,2009).

- секции «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2008,2009 гг.)

Личный вклад. Представленная диссертационная работа является результатом 3-летних научных исследований автора. Исследования по получению соматических экстрактов из дирофилярий и сетарий, их фракционированию, выделению диагностически эффективных фракций и разработке на их основе иммуноферментной диагностической тест-системы при дирофиляриозе собак проведены самостоятельно под руководством доктора биологических наук, профессора Бережко В.К., которая оказывала научно-методическую помощь в проведении исследований, анализе и обобщении полученных результатов. Статьи, написанные в соавторстве, включают более 80% материалов исследований соискателя.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Иммунохимическая и физико-химическая характеристика экстрактов из половозрелых дирофилярий и сетарий;

- Фракционирование белковых экстрактов из дирофилярий и сетарий, анализ полученных фракций, выявление диагностически активных;

- Отработка параметров и режима постановки ИФР с диагностически активными фракциями из дирофилярий и сетарий;

- Сравнительная оценка диагностической эффективности ИФР с выделенными антигеноактивными фракциями из сетарий и дирофилярий при дирофиляриозе собак.

Публикации. По материалам исследований опубликовано 6 статей, в которых изложены основные положения и выводы по работе, 2 из них в рекомендованном ВАК РФ издании.

обсуждение, выводы, практические предложения. Список литературы содержит 203 источника, в том числе 91 отечественных и 112 иностранных. Работа иллюстрирована 14 таблицами, 13 рисунками.

I. Литературный обзор

Представлен анализ работ по распространению дирофидяриоза, влиянию дирофилярий на организм, посмертной и прижизненной диагностике этой инвазии, а также литературных источников по использованию гетерологичных антигенов в диагностике гельминтозов.

II. Собственные исследования.

2.1 Материалы и методы

2.1.1 Объекты исследования, их получение

Объектами исследования служили половозрелые сетарии (Setaria labiato-papillosa), выделенные от инвазированкого крупного рогатого скота на убойных пунктах Украины и Кабардино-Балкарской Республики и половозрелые дирофилярии (Dirofilaria immitis), полученные от зараженных собак б Краснодарском крае и Волгоградской области.

Антигены, соматические экстракты из половозрелых D. immitis и S. labiato-papillosa.

Фракционированные антигены, полученные из соматических экстрактов половозрелых D. immitis и S. labiato-papillosa.

- антитела диагностические против IgG сыворотки крови собак, меченные пероксидазой (конъюгат), производства НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи;

- гипериммунные сыворотки к антигенным компонентам соматических экстрактов половозрелых D. immitis и S. labiato-papillosa;

- сыворотки от собак, естественно инвазированных дирофиляриями (D. immitis);

- сыворотки от клинически здоровых собак;

- сыворотки собак с подтвержденным паразитологкческим статусом.

2.1.2. Методика приготовления соматических экстрактов из половозрелых дирофилярий и сетарий и определение в них белка

Соматические экстракты готовили из свежезамороженных половозрелых сетарий и дирофилярий (S. labiato-papillosa, D. immitis), методом гомогенизации измельченного биоматериала (каждый отдельно) и попеременного замораживания и оттаивания до получения однородной массы. Экстрагирование белков проводили в фосфатно-солевом буфере рН 7,2-7,4 в соотношении 1:10 на магнитной мешалке при 4°С в течение 24-48 часов. Экстракт (надосадочную жидкость) получали центрифугированием при 12 тыс. об/мин. в течение 15-20 мин. В приготовленных экстрактах

определяли содержание белка на спектрофотометре при 280 им по методу 1^упе (1957) с калибровочной кривой на основании 5-й фракции бычьего сывороточного альбумина.

2.1.3. Физико-химическая характеристика белкового спектра соматических экстрактов из дирофилярий и сетарий

Белковый спектр соматических экстрактов из дирофилярий и сетарий изучали методом электрофореза в полиакриламидиом геле (ПЛАГ) по методике ЬаетшН (1970) с некоторыми модификациями применительно к нашим условиям.

Для разделения белков использовали 12,5%-ный гель, электрофорез проводили в аппарате (УЕ-С2С) фирмы «Хеликон» при напряжении 100-120 вольт. Исследуемые биоматериалы стандартизировали по содержанию белка, в каждую лунку вносили по 20 мкг белка - антигена. Электрофоретическое разделение проводили в одинаковых условиях. В качестве маркеров для определения молекулярной массы белковых компонентов в составе исследуемых объектов использовали белки-маркеры молекулярной массы 6,5-200 кДа: атротинин - 6,5; лизоцим - 14,4; ингибитор трипсина - 21,0; альдолаза - 40; углекислая анпщраза - 31,0; овальбумин - 45,0; бычий сывороточный альбумин - 66,0; фосфорилаза - 97,0; р-галактозидаза - 116,0 и миозин - 200 кДа. Окрашивание и фиксацию электрофореграмм проводили амидошварцем в 7%-ной уксусной кислоте в течение 15-20 мин; отмывку -7%-ной уксусной кислотой.

2.1.4. Иммунизация кроликов соматическими экстрактами из дирофилярий и сетарий, получение гипериммунных сывороток,

оценка их активности в иммуноферментной реакции

В опыте использовали 4-х кроликов, массой 2,0-2,5 кг, по два кролика на каждый исследуемый экстракт. Схема иммунизации включала три 3-х дневных периода подкожного и внутримышечного введения соответствующего экстракта с интервалом между ними 3 дня и последующей отдаленной реиммунизации, проводимой на 28-30-й день после окончания цикла иммунизации. На весь цикл иммунизации, включая и реиммунизацию, каждый кролик получил 10,5 мг соответствующего белка-экстракта. Кровь для получения сыворотки у иммунизированных кроликов брали на 7-9-й день после окончания цикла иммунизации и после реиммунизации. Сыворотки отделяли стандартным методом и хранили при — 18°. Активность полученных гипериммунных сывороток к антигенам соматических экстрактов из дирофилярий и сетарий определяли в ИФР методом титрования образцов сывороток кратно двум от разведения 1:100 до 12800.

Каждую гипериммунную сыворотку исследовали с гомологичным и гетерологичным экстрактом.

2.1.5. Иммунохкмичсская характеристика соматических экстрактов из днрофилярий и сетарий реакцией иммунодиффузии (РИД)

Антигенный спектр соматических экстрактов из днрофилярий и сетарий изучали по методике Ouchterlony (1958) в модификации Гусева и Цветкова (1961) в 1,2%-ном агаровом геле (Difco) на 0,9%-ном растворе хлористого натрия с использованием гипериммунных сывороток от кроликов, полученных к антигенным компонентам соматических экстрактов каждого вида паразита.

Для определения количества и идентичности входящих в их состав антигенных компонентов использовали специальные штампы, состоящие из разного количества трубок ("тройка", "пятерка", "семерка","ряды" и т.д.), диаметр которых был в пределах 3-5 мм. Каждую сыворотку исследовали как в гомологичной, так и в гетерологичной системе реакции.

2.1.6. Иммунофермептная диагностика дирофиляриоза собак с соматическим экстрактом из сетарий

ИФР ставили в непрямом варианте для выявления антител к D.immitis в сыворотке крови инвазированных собак. Для определения оптимального титра соматического экстракта из сетарий, используемого для сенсибилизации полистироловых планшетов, испытали следующие разведения: 4, 8, 12, 16, 30,40, 50 и 60 мкг белка-антигена/ мл, г также 4, 8, 16 и 40 мкг белка на лунку.

Экстракт разводили в 0,1 М карбонатно-бикарбонатном буфере рН=9,6.

Режим сенсибилизации планшетов проводили по образцу модели, в качестве которой был взят соматический антиген из днрофилярий в концентрации 10 и 8 мкг/мл в том же буфере.

Испытаны следующие режимы сенсибилизации: при 4°С 18-20 часов; при 37°С - 45 мин с последующей выдержкой при 4°С в течение 18-20 часов.

Определение минимального диагностического титра проводили с сыворотками естественно инвазированных D. immitis собак, различающихся по степени иммунного ответа, сыворотки крови клинически здорового животного и с гетерологичной инвазией (Toxocara cams, Babesia canis). Исследуемые образцы сывороток разводили 0,01 М фосфатно-солевым буфером (ФСБ) pH 7,2-7,4, содержащим 0,05% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,05% твина-20 в разведении 1:100 и вносили в лунки планшета в количестве 100 мкл.

Для определения временного режима инкубации сенсибилизированных антигеном планшетов с исследуемыми сыворотками испытали режимы: 30, 40,45 и 60 мин при 37°С.

Конъюгат (антитела диагностические против IgG сыворотки крови собак) испытали в разведении 1:6000, 1:8000 и 1:12000, время инкубации с конъюгатом 60,45,40,30,20 и 15 мин при 37°С.

2.1.7. Фракционирование соматических экстрактов из дирофилярий и сетарий, антиг енная характеристика полученных белковых фракций

Фракционирование соматических экстрактов из сетарий и дирофилярий проводили гель-хроматографией на колонке (Pharmacia) размером 16><70 мм, заполненной Superóse 12 Prep Grade и уравновешенной 20 мМ раствором натрия фосфата, натрия хлорида pH 7,0; 0,025% бромонитродиоксана. Скорость протока 30 мл/час поддерживали с помощью перистальтического насоса Microperpex (Pharmacia), фракции собирали по 3 мл в пробирку, а содержание белка в них контролировали на детекторе Uvicord S II, ABS-Range-0,5 (Pharmacia). Скорость бумаги на самописце - 0,2 мм/мин. Хроматографию проводили при комнатной температуре. В полученных в процессе гсльфильтрации фракциях определили содержание белка на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 280 нм. Антигенную активность полученных фракций устанавливали в ИФР с использованием референс положительных и отрицательных контрольных сывороток. Выделенные в ходе исследования белковые фракции, содержащие антигеноактивные компоненты, идентичные диагностическим антигенам при дирофиляриозе, объединили и использовали для разработки диагностической тест-системы на основе ИФР при дирофиляриозе собак.

2.1.8. Разработка иммуноферментной реакции для диагностики дирофиляриоза собак на основе фракционированного соматического антигена из сетарий и дирофилярий

Постановку иммуноферментной реакции проводили в непрямом варианте с целью выявления антител в сыворотке крови животных. Параметры и режим постановки ИФР с соматическими фракционированными антигенами отрабатывали в предварительных экспериментах на сыворотках собак с гомологичной инвазией (слабый и умеренный иммунный ответ), гетерологичной инвазией и отрицательного контроля (клинически здоровые). Твердой фазой служили планшеты из лолистирола (Медполимер, Санкт-Петербург). Исследования начали с объединения выявленных антигенных фракций экстракта каждого вида гельминта, имеющих в своем составе диагностические компоненты при дирофиляриозе.

При выборе оптимальной концентрации белка антигена для сенсибилизации полистироловых планшетов нами были испытаны следующие концентрации: 15; 12; 10; 8; 7 мкг/мл. Антиген разводили в 0,01 М карбонатно-бикарбонатном буфере pH 9,6.

Определение режима сенсибилизации планшетов фракционированным антигеном проводили по образцу модели, в качестве которой был взят соматический экстракт из сетарий в концентрации по белку 10 и 8 мкг/мл в карбонатно-бикарбонатном буферном растворе, pH 9,6. Испытаны следующие режимы сенсибилизации: при 4°С - 18-20 часов, при 37°С - 1час, затем при 4°С - 18 часов.

Определение минимального диагностического титра провели на двух пулах сывороток от собак, спонтанно зараженных D. immitis, со слабым и умеренным иммунным ответом. В качестве отрицательного контроля использовали сыворотку крови клинически здорового животного, а также три сыворотки собак с гетерологичной инвазией (Toxocara canis, Babesia canis, Cysioisospomm canis). Испытали разведения сывороток 1:50 и 1:100.

Минимальным диагностическим титром в иммуноферментной реакции считали титр разведенной сыворотки, при котором наблюдали окрашивание субстратной смеси до красновато-буроватого цвета и отсутствие заметного изменения цвета субстрата с гетерологичными и отрицательной сыворотками.

2.1.9. Диагностическая эффективность иммуноферментной реакции (ИФР) при дирофиляриоза собак с фракционированными антигенами из сетарий и дирофилярий

Исследование диагностической эффективности ИФР с фракционированными соматическими антигенами из сетарий и дирофилярий проводили с сыворотками крови собак, больных D. immitis, D. repens, а также свободных от данной инвазии, и собак с другими паразитарными и не паразитарными патологиями. Кровь собак перед исследованием проверили на наличие микрофилярий классическим методом Кнотт. Сыворотку хранили замороженной при минус 20°С. Постановку и учет результатов проводили в соответствии с программой комиссионной проверки. Испытания проводила на 47 пробах сывороток собак, из которых 11 - от естественно инвазированных D. immitis; 6 - D. repens; 3 - естественно инвазированных Babesia canis; 3 -Toxocara canis; 9 проб сывороток собак с непаргзитарными патологиями и 15 - клинически здоровых из г. Москвы, г. Краснодара, Московской и Ростовской области, у которых не обнаружили других гельминтоз.

Эффективность ИФР устанавливали по показаниям оптической плотности на автоматическом ридере при длине волны 492 им.

Статистическую обработку результатов исследований проводили по стандартной методике Стьюдента.

III. Результаты исследований

3.1. Характеристика белкового спектра соматических экстрактов из половозрелых дирофилярий и сетарий

В белковом спектре соматического экстракта из дирофилярий после окрашивания и отмывки электрофореграммы регистрировали не менее 18 белковых компонентов, располагающихся в диапазоне белков молекулярной массы 14,4-200 кДа и отличающихся по степени окрашивания и электрофоретической подвижности (табл. 1).

Степень окрашивания проявившихся белковых компонентов является характерным признаком количественного содержания той или иной фракции в исследуемом экстракте.

Наиболее четко выраженные и интенсивно окрашенные 4 белковых компонента в этом биоматериале располагались в области подвижности белков молекулярной массы 14,4 кДа (лизоцима); 45,0 кДа (овальбумина); 66,0 кДа (бычьего сывороточного альбумина) и 200 кДа (миозина). Несколько слабее окрашенные, но достаточно четко выраженные еще 3 компонента проявились в диапазоне белков молекулярной массы 21,0 кДа (ингибитора трипсина); 31,0 кДа (углекислой ангидразы) и между белками мол. массы - 31,0-45 кДа. Менее выраженные, слабо окрашенные белковые компоненты располагались по всей длине электрофореграммы.

Аналогичный анализ соматического экстракта из половозрелых сетарий позволил определить в нем не менее 16 белковых компонентов, также различающихся как по подвижности, так и по степени проявления (табл. 1). В этом биоматериале регистрировали не менее 6 наиболее интенсивно окрашенных полос, представляющих компоненты молекулярной массы 14,4 кДа - 1; 45,0 кДа - 1; в области белков молекулярной массы 45,0 и 66,0 кДа - 2 и 200 кДа - 2 компонента. Из этих 6 компонентов мажорными были 3, два из которых проявились в диапазоне белков между 45,0 и 66,0 кДа (овальбумина и бычьего сывороточного альбумина), а 1 - в области подвижности миозина - 200,0 кДа.

Таблица 1

Белковый спектр соматических экстрактов из половозрелых дирофилярий и сетарий и выделенных из них диагностически эффективных фракций при дирофиляриозе собак

№ п/ п Исследованный биоматериал Кол-во выявленных белковых компонентов Результаты электрофореза в ПААГ

Молекулярная масса белковых компонентов кДа

6,514,421,5 21,531,045,0 45,066,0 66,097,0 97,0116,0 116,0200,0

1 Соматический экстракт из половозрелых дирофилярий 18 4 6 4 2 Ч 1

2 Соматический экстракт из половозрелых сетарий 16 3 5 2 2 2 2

Наиболее многочисленные, но слабо выраженные компоненты располагались на электрофореграмме в диапазоне белков мол, массы между 14,4 и 45,0 кДа, а также не менее 2 из них - между белками мол. массы 66,0 и 116,0 кДа. Судя по окраске количественное содержание этих белков в общей массе соматического экстракта незначительное.

3.2. Оценка активности гипериммунных сывороток к антигенам соматических экстрактов в ИФР, характеристика их антигенного спектра в РИД

Анализ активности гипериммунных сывороток, полученных от кроликов к антигенам экстрактов из дирофилярий и сетарий, в КФР показал, что каждый иммунизированный кролик проявил индивидуальную реактивность (табл. 2,3).

Так, судя по титру сывороток и оптической плотности (ОП) в ИФР, наиболее активно иммунный ответ проявился у кроликов к антигенам экстракта из дирофилярий, причем в этом случае отметили значимые различия при сравнении ОП иммунных сывороток в ИФР при разведении. В гомологичной системе реакции с разведения 1:100 и до 1:12800 ОП иммунной сыворотки одного кролика была выше на 0,066-0,265. Такая тенденция не была столь ярко выражена в гомологичной системе реакции с иммунными сыворотками к антигенам экстракта из половозрелых сетарий. В этом случае ОП иммунных сывороток в ИФР при разведении от 1:100 до 1:12800 отличалась незначительно.

Что примечательно, достаточную активность, судя по ОП в ИФР, иммунные сыворотки к антигенам обоих видов паразитов, проявили в гетеролоточной системе реакции, хотя и в этом случае антисыворотки к антигенам В. ¡ттШз реагировали сильнее (табл. 2). С разведения 1:400 эти различия были четко зафиксированы: ОП иммунных сывороток к антигенам дирофилярий с экстрактом из сетарий в ИФР была 0,611 и 0,634, тогда как аналогичные показатели иммунных сывороток к антигенам из сетарий в ИФР с экстрактом из дирофилярий не превышали 0,377 и 0,483, что на 0,234 и на 0,151 ниже. Эта тенденция сохранялась и в дальнейшем до конечного разведения сывороток 1:12800 (ОП иммунных сывороток к антигенам из сетарий была 0,08-0,082, а к антигенам из дирофилярий - 0,147-0,153).

В первом случае показатели ОП превышали аналогичные показатели контрольной сыворотки в 1,7, во втором в 3,1 раза.

Отмеченные различия в иммунном ответе кроликов, безусловно, являются следствием их индивидуальной реактивности, поскольку доза введенного белка-антигена была одинаковой и составила 10,5 мг.

Полученные гипериммунные сыворотки были в дальнейшем использованы для характеристики антигенного спектра соматических экстрактов из дирофилярий и сетарий в гомологичной и гетерологичной системе РИД.

Таблица 2

Оценка активности гипериммунных сывороток к антигенам экстракта из половозрелых Dirofilaria immitis в ИФР

Разведения исследуемых сывороток

Исследуемый 1:100 1:200 1:400 | 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800

материал Оптическая плотность в ИФР

Гомологичная система

Сыворотка кроличья 0,909 0,932 0,910 0,829 0,806 0,589 0,480 0,310

гипериямунная к АГ 0,935 0,920 0,982 0,954 0,974 0,904 0,819 0,694

из дирофилярий (а) 1,315 1,105 0,919 0,945 0,902 0,871 0,530 0,415

М±ш 1,053±0,13 0,985±0,06 0,937±0,02 0,909±0,04 0,894±0,05 0,788±0,1 0,610±0,11 0,493±0,11

Сыворотка кроличья 0,937 0,830 0,714 0,763 0,541 0,364 0,286 0,176

гипериммунная к АГ 0,900 0,863 0,887 0,812 0,794 0,610 0,406 0,333

из дирофилярий (б) 1,028 0,902 0,878 0,799 0,685 0,515 0,470 0,360

М±т 0,955±0,04 0,865±0,021 0,826±0,06 0,791±0,02 0,673±0,07 0,496±0,07 0,387±0,05 0,290±0,06

Сыворотки Гетерологичная система (AT - S. labiato-papillosa)

0,730 0,698 0,611 0,536 0,465 0,337 0,244 0,253

(а) 0,941 0,966 0,947 0,851 0,779 0,611 0,446 0,418

0,905 0,830 0,790 0,705 0,648 0,585 0,490 0,315

М±ш 0,859±0,07 0,831±0,08 0,783±0,1 0,б97±0,1 0,631±0,1 0,511±0,09 0,393±0,08 0,329±0,05

0,808 0,729 0,634 0,507 0,359 0,254 0,182 0,147

(б) 0,806 0,848 0,799 0,706 0,523 0,385 0,269 0,198

0,900 0,820 0,789 0,690 0,535 0,480 0,305 0,229

М±т 0,838±0,03 0,799±0,04 0,740±0,05 0,634±0,06 0,472±0,06 0,373±0,07 0,252±0,04 0,191±0,02

0,125 0,118 0,108 0,100 0,098 0,086 0,072 0,060

Контрольная 0,133 0,125 0,109 0,095 0,083 0,076 0,068 0,059

сыворотка 0,121 0,124 0,119 0,099 0,083 0,077 0,059 0,048

М±ш 0,126±0,004 0,122±0,002 0,112±0,04 0,098±0,002 0,088±0,01 0,076±0,003 0,066±0,004 0,056±0,004

*Р< 0,05 при иркшчсск0„ = 2,78

Таблица 3

Оценка активности гипериммунных сывороток к антигенам экстракта из половозрелых S. labiato-papillosa в ИФР

Разведения исследуемых сывороток

Исследуемый 1:100 [ 1:200 1 1:400 | 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800

материал Оптическая плотность в ИФР

Гомологичная система (АГ - S.labiato-papillosa)

Сыворотка кроличья 0,811 0,762 0,613 0,562 0,382 0,271 0,218 0,199

гипериммунная к АГ 0,989 0,900 0.858 0,697 0,527 0,322 0,217 0,147

из сетарий (ai) 1,102 0,998 0,903 0,795 0,630 0,405 0,313 0,212

M±m 0,967±0,08 0,886±0,07 0,791±0,09 0,685±0,07 0,513±0,07 0,335±0,04 0,249±0,031 0,186±0,02

Сыворотка кроличья 0,835 0,809 0,703 0,626 0,471 0,369 0,295 0,147

гипериммунная к АГ 0,956 0,927 0,816 0,707 0,523 0,398 0,265 0,151

из сетарий (60 0,870 0,802 0,759 0,690 0,580 0,405 0,315 0,221

M±m 0,887±0,04 0,846±0,041 0,759±0,03 0,674±0,03 0,525±0,031 0,391±0,011 0,292±0,014 0,173±0,02

Сыворотки Гетерологичная система (АГ - D. immitis)

0,686 0,561 0,377 0,327 0,260 0,191 0,095 0,080

(а.) 0,600 0,586 0,486 0,352 0,228 0,178 0,125 0,083

0,712 0,603 0.512 0,405 0,320 0,232 0,138 0,099

М±ш 0,666±0,03 0,583±0,012 0,458*0,04 0,3 61 ±0,023 0,269±0,03 0,200±0,02 0,119±0,013 0,087±0,01

0,699 0,677 0,483, 0,279 0,191 0,142 0,093 0,082

(6i) 0,629 0,546 0,508 0,326 0,226 0,170 0,123 0,079

0,701 0,680 0,603 0,480 0,348 0,215 0,151 0,098

М±т 0,676±0,02 0,634±0,044 0,531±0,05 0,362±0,06 0,255±0,05 0,17б±0,021 0,122±0,02 0,086±0,01

0,118 0,099 0,082 0,069 0,062 0,068 0,059 0,053

Контрольная 0,104 0,082 0,072 0,063 0,059 0.057 0,047 0,032

сыворотка 0,129 0,111 0,093 0,081 0,072 0,062 0,055 0,047

М±ш 0,117±0,007 0,097±0,008 0,082±0,006 0,071 ±0,005 0,064±0,004 0,062±0,003 0,053±0,004 0,044±0,01

*Р< 0,05 при ^„„„сско,, = 2,78

Результаты изучения антигенного спектра указанных экстрактов с использованием иммунных сывороток, полученных от кроликов на 7-9-й день после окончания цикла иммунизации, были недостаточно информативными, поскольку преципитирующая активность этих сывороток была слабой.

Причем отмечена зависимость преципктирующей активности иммунных сывороток от реактивности кроликов, поскольку при одинаковом способе и количестве введенного антигена-экстракта наблюдали различия в проявлении иммунного ответа и соответственно числа выявленных в реакции комплексов антиген-антитело (АГ-АТ). Эти различия четко обозначились в РИД не только количеством, но и степенью выраженности проявленных полос преципитации. Более активная иммунная сыворотка к антигенам соматического экстракта из дирофилярий проявляла в гомологичной системе реакции не менее 3 комплексов АГ-АТ, менее активная - не более одного-дьух.

В обоих случаях представляющие эти иммунные комплексы полосы преципитации были недостаточно четко выражены, отдельные из них имели несколько диффузный характер. Исследование этих сывороток в гетерологичной системе реакции с антигеном-экстрактом из сетарий показало не более 1-2 комплексов АГ-АТ, проявившихся также в виде диффузных полос преципитации.

Аналогичный анализ, проведенный в РИД с иммунными сыворотками к антигенам соматического экстракта из сетарий, также подтвердил эту закономерность. В гомологичной системе реакции в зависимости от активности иммунной сыворотки регистрировали 2-3 или 1 комплекс АГ-АТ в виде полос преципитации в агаровом геле разной четкости и интенсивности. В гетерологичной системе эти антисыворотки с экстрактом из дирофилярий проявляли 1-2 комплекса АГ-АТ. Проведенная на 28-й день после окончания иммунизирующего цикла реиммунизация повысила преципитирующую активность сывороток, что отразилось на качественном и количественном показателе проявленных в РИД комплексов АГ-АТ.

В белковом спектре соматического экстракта из дирофилярий этими антисыворотками регистрировали не менее 4-5 и 6-7 преципитирующнх комплексов, большинство из которых проявлялось в агаровом геле четкими полосами.

Такую же закономерность отметили при исследовании соматического экстракта из сетарий, а именно увеличение как числа, так и четкости проявления полос преципитации, представляющих эти комплексы в агаровом геле. Обеими антисыворотками в гомологичной системе регистрировали в РИД не менее 4-6 комплексов АГ-АТ, а в гетерологичной - не менее 4-5 (табл. 4).

Таким образом, проведенный иммунохимический анализ соматических экстрактов из дирофилярий и сетарий в РИД с гипериммунными сыворотками позволил определить в них соответственно 7 и 6

потенциальных антигенных компонентов, вызывающих синтез антител у кроликов. Однако, учитывая невысокую разрешающую способность иммунодиффузионного теста, можно предположить, что количество потенциальных антигенов в белковом спектре исследуемых экстрактов значительно больше.

Антигены-экстракты из половозрелых дирофилярий и сетарий были подвергнуты аналогичному анализу с сывороткой зараженных Б. ¡ттШв собак. В обоих случаях как в гомологичной, так и в гетерологичной системе реакции регистрировали одну полосу преципитации диффузного характера. Причиной проявления диффузных полос может быть, с одной стороны, наличие в сыворотке антител различной специфичности, а, с другой, гетерогенностью антигенов.

Тем не менее, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что соматический экстракт из половозрелых сетарий имеет в составе антигенного спектра компонент, идентичный функциональному, диагностически ценному при дирофиляриозе.

3.3. Эффективность иммуноферментной реакции при дирофиляриозе собак с соматическим антигеном-экстрактом из половозрелых сетарий

Проведенные исследования по оценке эффективности соматического экстракта из половозрелых сетарий в качестве диагностического антигена в ИФР при дирофиляриозе собак показали, что в составе гетерологичного экстракта из сетарий содержится такой компонент, позволяющий дифференцировать сыворотки инвазированных дирофиляриями собак.

Тем не менее, результативность любого иммунотеста во многом зависит от правильного подбора параметров и режима постановки реакции, включая определение оптимальной концентрации антигена, разведение сывороток и видоспецифического конъюгата, а также времени инкубации.

Таблица 4

Антигенный спектр соматических экстрактов из половозрелых дирофилярий и сетарий в гомологичной и гстерологичиой системе РИД*

№ п/п Антисыворотки к антигенам экстракта из дирофилярий Число комплексов АГ-АТ в РИД Антисыворотки к антигенам экстракта из сетарий Число комплексов АГ-АТ в РИД

экстракт из дирофилярий экстракт из сетарий экстракт из сетарий экстракт из дирофилярий

1 Кроличья гипериммунная (а) 1-2 1-2 Кроличья гипериммунная (а,) 1 1-2

2 Кроличья гипериммунная (б) 3 2 Кроличья гипериммунная (б,) 2-3 2

3 Кроличья гипериммунная после реиммунизации (а) 4-5 4 Кроличья гипериммунная после реиммунизации (аО 4-5 4

4 Кроличья гипериммунная после реиммунизации (б) 6-7 5 Кроличья гипериммунная после реиммунизации (61) 4-6 5

5 Сыворотка собаки, инвазированной Б. ¡ттШБ 1 1 Сыворотка собаки, инвазированной В. ¡ттШБ 1 1

* РИД - реакция иммунодиффузии ** АГ-АТ - антиген-антитело

Но даже при соблюдении всех этих позиций не всегда достигается нужный результат, поскольку чувствительность и специфичность иммунологических реакций находится в прямой зависимостии от качества используемого антигена. Испытав более 15 различных комбинаций с разными концентрациями экстракта из сетарий, разведения конъюгата и времени инкубации как с исследуемыми сыворотками, так и с конъюгатом, установили наибольшую разницу в оптической плотности (ОП) между положительными и отрицательными контрольными сыворотками собак и сыворотками животных с гетерологичной инвазией при концентрации антигена-экстракта 50 мкг/мл, разведения сывороток 1:100 и конъюгата 1:6000. Режим сенсибилизации планшетов антигеном составлял 18-20 часов при 4°С, время инкубации с сыворотками — 60 мин, с конъюгатом — 25 мин при 37°С. При этих условиях постановки реакции разница в ОП между референс сыворотками составила 0,08, что несколько ниже аналогичных данных, полученных в ИФР с гомологичным антигеном. Оценка эффективности ИФР с этим экстрактом на большем количестве сывороток собак показала его недостаточную специфичность, которая проявилась ложноположительными ответами с сыворотками собак, инвазированных Т. саше, В. саше, а также клинически здоровых животных. Поскольку диагностически активные антигенные компоненты составляют незначительную часть соматических экстрактов, для повышения эффективности иммунореакций необходимо проводить их очистку от неспецифических примесей и выделить компоненты, обладающие наибольшей чувствительностью и специфичностью.

Учитывая, что испытанный нами экстракт из сетарий в диагностике дирофиляриоза является гетерологичным антигенным материалом, то дополнительная его очистка была особенно необходима, поскольку количественное содержание в нем диагностически эффективных антигенных компонентов при дирофиляриозё не могло превышать таковые показатели в гомологичном экстракте, который также без дополнительного освобождения от неспецифических компонентов был недостаточно эффективным в диагностическом плане.

Поэтому наши дальнейшие исследования были направлены на выделение из соматических экстрактов половозрелых сетарий и дирофилярий диагностических антигенных компонентов и оценки их эффективности в ИФР.

3.4. Характеристика спектра антигенов фракционированных соматических экстрактов из половозрелых дирофилярий и сетарий в ИФР

Антигенная активность белковых фракций экстракта из дирофилярий. Концентрация белка в соматическом экстракте из половозрелых Б. ¡ттШэ, использованного для гель-фильтрации, была 12,5 мг/мл. В процессе фракционирования было получено 3 пика, каждый из

которых включал соответственно 12,12 и 11 белковых фракций. Антигенную активность полученных белковых фракций определяли по разнице оптической плотности (ОП) между положительной и отрицательной контрольной сывороткой крови собак. Полученные данные показали, что фракции первого пика в антигенном отношении не представляли интереса, поскольку разница в ОП между референс-сыворотками была в пределах 0,002-0,032. Белковые фракции второго пика показали достаточную антигенную активность и специфичность (разница ОП от 0,034 до 0,093). Тем не менее, из этих 12 белковых фракций были выбраны 6 (17,1%), специфичность которых, судя по разнице ОП между положительной и отрицательной контрольной сывороткой, была выше (0,094-0,100). Из 11 белковых фракций, входящих в состав 3 пика, 6 показали в ИФР недостаточную активность и специфичность (разница ОП от 0,017 до 0,029). Остальные 5 белковых фракций, хотя были активными антигенами, специфичность их была недостаточной (разница ОП от 0,022-0,035).

Таким образом, необходимый интерес в диагностическом плане при дирофиляриозе представляли 6 (17,1%) белковых фракций второго пика, которые были использованы для дальнейших испытаний и разработки на их основе иммуноферментной диагностической тест-системы.

Антигенная активность белковых фракций экстракта из сетарин.

Концентрация белка в цельном экстракте из половозрелых сетарий, использованном для фракционирования, составляла 11,5 мг/мл. В процессе фракционирования было получено 40 белковых фракций с различным содержанием белка (от 0,009 до 1,545 мг/мл). Антигенную активность каждой фракции проверяли в ИФР по разнице оптической плотности (ОП) между положительной и отрицательной контрольной сывороткой.

Полученные данные показали, что из 40 белковых фракций в 11 (27,5%) разница в ОП между контрольными сыворотками в ИФР была минимальной и составила от 0,001 до 0,064. Эти фракции не могли иметь диагностического значения, поскольку при такой разнице в показателях дифференцировать больных животных от здоровых практически невозможно. Что касается остальных белковых фракций, то их аналогичная оценка в ИФР с теми же сыворотками показала, что 22 (55,0%) из них не содержали антигенные компоненты, способные распознавать сывороточные антитела класса у больных дирофиляриозом животных. Такое

заключение было сделано на основании того, что показатели ОП в ИФР с отрицательным контролем были выше, чем с положительной контрольной сывороткой, а разница между ними нулевой и даже отрицательной.

Из общего числа исследованных фракций только 7 (17,5%), судя по разнице ОП (от 0,150 до 0,388) между контрольными сыворотками в ИФР, могли быть выбраны для дальнейших испытаний. Несмотря на то, что в этих белковых фракциях были определены антигенные компоненты, имеющие диагностическое значение при дирофиляриозе, необходимо было охарактеризовать каждый из них в плане специфичности с сыворотками

собак, инвазированных другими гельминтами, что и стало предметом наших дальнейших исследований,

3.5. Параметры и режим иммуиоферментной тест-системы при дирофиляриозе собак на основе фракционировашюго соматического экстракта из сстарий и дирофилярий

В процессе фракционирования соматических экстрактов из половозрелых дирофилярий и сетарий и последующей характеристики антигенной активности полученных фракций в ИФР было определено в каждом из них соответственно 6 и 7 белковых фракций, имеющих диагностическое значение при дирофиляриозе.

Объединив эти фракции (каждый в отдельности) провели отработку режима и параметров ИФР при дирофиляриозе собак на основе указанных антигенов. В результате этого анализа, проведенного с сыворотками от собак с естественной инвазией Б. ¡ттШэ со слабым и умеренным иммунным ответом (положительный контроль), клинически здорового животного (отрицательный контроль) и сыворотками собак с гетерологичной инвазией, установили наилучшие показатели диагностической тест-системы на основе ИФР при следующих параметрах и режиме: концентрация белка-антигена из сетарий - 25, из дирофилярий - 12 мкг/мл; время сенсибилизации полистироловых планшетов в обоих случаях 18-20 часов при 4°С, разведение сывороток - 1:100, время инкубирования с указанными выше сыворотками -40 мин при температуре 37°С, титр антител диагностических против сыворотки крови собак, меченных пероксидазой (конъюгат) - 1:7000, время инкубирования с конъюгатом также 40 мин при 37°С.

При этих параметрах и режиме проведения ИФР показатели ОП с контрольными положительными сыворотками со слабым иммунным ответом отличались от отрицательных контрольных и сывороток собак с гетерологичной инвазией не менее чем на 0,1.

3.6. Сравнительная диагностическая эффективность иммуиоферментной реакции с фракционированными антигенами из сетарий и дирофилярий

Результаты сравнительной комиссионной оценки диагностической эффективности иммуиоферментной тест-системы на основе фракционированных антигенов из сетарий и дирофилярий представлены в таблице 5. Чувствительность разработанных тест-систем на основе ИФР с фракционированными антигенами из обоих видов гельминтов, которую оценивали с 17 пробами сывороток собак, в том числе с естественной инвазией Э. ¡гпгпШб (11 проб) и Б. герепэ (6 проб), составила соответственно 82,4%.

Таблица № 5

Диагностическая эффективность ИФР при дирофнлярнозе собак с фракционированным антигеном из сетарий (Setaria labiato-papillosa) и из дирофилярин (Dirofilaria immitis)

Setaria labiato-papillosa Dirofilaria immitis

Результаты ИФР - £ Результаты ИФР -S

Сыворотки крови собак Количестве животных Положительные j Ложно-положительные 1 1 Отрицательные Ложно-1 отрицательные Чувствительност % Специфичность,1 Положительные Ложно-положительные Отрицательные о) x 6 3 а 1 1 1 е- е о X § и сг i о я я' •е-§ а) с и

Зараженных: а) Dirofilaria immitis б) Dirofilaria repens 11 6 10 4 1 2 10 4 i 2

Зараженных другими

паразитами: в) Babesia canis 3 1 2 82,4 83,3 1 2 82,4 86,7

г) Toxocara canis 3 1 2 1 2

С непаразитарными 9 1 8 i 8

патологиями

Клинически здоровых 15 1 2 13 i 14

Итого j 47 14 5 25 3 14 4 26 3

Независимо от вида антигена в обеих тест-системах было получено 3 ложноотрицательных результата, а именно один в группе собак, инвазированных D. immitis, два - в группе собак, инвазированных - D. repens.

Специфичность диагностических иммуноферментных тест-систем оценивали с сыворотками трех групп животных: инвазированных другими паразитами Babesia canis (3 пробы) и Toxocara canis (3 пробы); с паразитарной патологией (9 проб) и клинически здоровых (15 проб).

В результате в тест-системе ИФР с фракционированным антигеном из сетарий установили ложноположительную реакцию с 1 сывороткой собаки, зараженной В. canis и 1 - Т. canis, с 1 сывороткой из группы животных с непаразитарными патологиями и 2 - из группы клинически здоровых животных. Таким образом, специфичность ИФР в этом случае составила 83,3%.

Что касается тест-системы на основе ИФР с фракционированным гомологичным антигеном, то ложноположительных результатов было 4, отличие в том, что из 15 сывороток клинически здоровых собак, только в 1 регистрировали ложноположительный ответ. Таким образом, специфичность ИФР составила 86,7%.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования гетерологичного вида гельминта - S. labiato-papillosa в качестве источника антигенного материала для диагностики дирофиляриоза.

Выводы

1. Физико-химической характеристикой соматических экстрактов из половозрелых Dirofilaria immitis и Setaria labiato-papillosa диск-электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) выявлено соответственно 18 и 16 белковых компонентов, располагающихся на электрофореграммах в диапазоне белков молекулярной массы 6,5-200 кДа.

2. Реакцией иммунодиффузии в агаровом геле с гипериммунными сыворотками к антигенам соматических экстрактов из половозрелых D. immitis и S. labiato-papillosa определено в гомологичной системе реакции соответственно 7 и 6, а в гетерологичной - 4-5 и 4 потенциальных антигенных компонентов.

3. В соматическом экстракте из половозрелых дирофилярий и сетарий реакцией иммунодиффузии с сывороткой инвазированных D. ¡mmitis собаки определен один антигенный компонент, имеющий диагностическое значение при дирофиляриозе.

4. Установлена недостаточная чувствительность и специфичность ИФР при дирофиляриозе собак с соматическим антигеном-экстрактом из половозрелых S. labiato-papillosa.

5. Фракционированием соматического экстракта из половозрелых D. immitis гель-фильтрацией на Superóse 12 Prep Grade получено 35 белковых фракций, из которых 6 (17,1%) имели в своем составе диагностически активные антигенные компоненты.

6. Гель-хроматографией соматического экстракта из половозрелых Setaria labiato-papillosa на Superóse 12 Prep Grade получено 40 белковых фракций, 7 (17,5%) из которых показали диагностическое значение при дирофиляриозе собак.

7. Диск-электрофорезом в ПААГ установлено, что выделенные диагностически эффективные белковые компоненты из соматического экстракта половозрелых D. immitis располагаются в зоне белков молекулярной массы 21,5; 31,0; 45,0; 66,0, а из S. labiato-papillosa - 14,4; 21,5 45,0; 66,0; 97,0-116,0 кДа.

8. Иммуноферментная реакция при дирофиляриозе собак с выделенными белковыми фракциями из соматического экстракта D. immitis и S. labiato-papillosa показала сопоставимость результатов реакции по чувствительности и специфичности, соответственно 82,4 ,82,4 и 86,7; 83,3%.

9. Разработана диагностическая иммуноферментная тест-система при дирофиляриозе собак с фракционированным антигеном S. labiato-papillosa.

Практические предложения

Предлагается в качестве источника диагностического антигена при дирофиляриозе использовать гетерологичный вид гельминта Setaria labiato-papillosa, который более доступен в получении, относится как и D. immitis к семейству Filariidae и в антигенном спектре имеет с ним перекрестно-реагирующие компоненты.

Выделение диагностически эффективных при дирофиляриозе перекрестно-реагирующих антигенных компонентов в соматическом экстракте из половозрелых сетарий проводить методом гель-хроматографии на Superóse 12 Prep Grade с последующей серологической оценкой полученных белковых фракций иммуноферментной реакцией с сывороткой инвазированной D. immitis собаки (положительный контроль), сывороткой клинически здоровой собаки (отрицательный контроль) и сывороткой собак с гетерологичной инвазией.

Белковые фракции, с которыми в иммуноферментной реакции разница в оптической плотности между положительной и отрицательной контрольной сывороткой составляет не менее 0,100, объединяют и используют в разработке иммуноферментной тест-системы при дирофиляриозе.

Предложена иммуноферментная тест-система на основе фракционированного соматического экстракта из половозрелых Setaria labiato-papillosa для диагностики дирофиляриоза собак.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Хайдаров К А. Антигенная характеристика белковых фракций экстракта половозрелых Diroíllaria immitis. / Написанова Л.А., Бережко В.К., Хайдаров К.А., Медведев А.ЮУ/ Материалы докладов научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» - М. - 2008 - вып. №9.-с. 320-322.

2. Хайдаров К.А. Иммунохимический анализ соматического экстракта из половозрелых Dirofilaria immitis. / Бережко В.К., Хайдаров К.А., Дахно И.С., Шкурка Е.Ш/ Материалы докладов научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» - М - 2008- вып. № 9. - с. 69-73.

3. Хайдаров К.А. Соматический экстракт из сетарий (Setaria labiato-papillosa) в диагностике дирофиляриоза собак / Хайдаров К.А., Написанова Л.А., Бережко В.К. // Материалы докладов научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» - М - 2009 - вып. № 10. - с. 403.-406.

4. Хайдаров К.А. Антигенный спектр соматических экстрактов из половозрелых сетарий и дирофилярий. /Хайдаров К.А., Бережко В.К. // Российский параигголоппсский журнал. -2009 -№1.-с. 68-74.

5. Хандаров К.А. Лабораторный регламент на выявление сывороточных антител при дирофнляриозе антигеном из сетарий. /Хандаров К.А., Написанова Л.А., Бережко В .К.// Российский шразигодопмеский иодмвал. -2009. - №4. - с. 126-128.

6. Хайдаров К.А. Антигенная активность белковых фракций соматического экстракта из сетарий (Setaria labiato-papillosa) / Хайдаров К.А., Бережко В.К., Написанова Л.А., Дахно И.С., Шкурка Е.П. /У Материалы докладов научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» - М - 201.0 - вып. № 11.-е. 492-495.

Подписано в печать:

24.03.2011

Заказ № 5197 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хайдаров, Камил Абдурахманович

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Распространение дирофиляриоза, влияние дирофилярий на организм.

1.2. Диагностика дирофиляриоза.

1.3. Гетерологичные антигены в иммунодиагностике гельминтозов.

II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и методы.

2.1.1. Объекты исследования, их получение.

2.1.2. Методика приготовления соматических экстрактов из половозрелых Dirofilaria immitis и Setaria labiato-papillosa, определение в них содержания белка.

2.1.3. Физико-химическая характеристика белкового спектра соматических экстрактов из дирофилярий и сетарий.

2.1.4. Иммунизация кроликов соматическими экстрактами из дирофилярий и сетарий, получение гипериммунных сывороток, оценка их активности в иммуноферментной реакции.

2.1.5. Иммунохимическая характеристика соматических экстрактов из дирофилярий и сетарий реакцией иммуно диффузии.

2.1.6. Соматический экстракт из половозрелых сетарий в диагностике дирофиляриоза собак.

2.1.7. Фракционирование соматических экстрактов из половозрелых дирофилярий и сетарий, антигенная характеристика полученных белковых фракций.

2.1.8. Разработка иммуноферментной реакции для диагностики дирофиляриоза собак на основе фракционированного соматического антигена из дирофилярий и сетарий.

2.1.9. Диагностическая эффективность иммуноферментной реакции при дирофиляриозе собак с фракционированным антигеном из сетарий и дирофилярий.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Характеристика белкового спектра соматических экстрактов из половозрелых дирофилярий и сетарий.

3.2. Оценка активности гипериммунных сывороток к антигенам соматических экстрактов из дирофилярий и сетарий в иммуноферментной реакции, характеристика их антигенного спектра реакцией иммунодиффузии.

3.3. Эффективность иммуноферментной реакции при дирофиляриозе собак с соматическим антигеном — экстрактом из половозрелых сетарий.

3.4. Характеристика спектра антигенов фракционированных соматических экстрактов из половозрелых дирофилярий и сетарий в иммуноферментной реакции.

3.5. Параметры и режим иммуноферментной тест-системы при дирофиляриозе собак на основе фракционированного соматического экстракта из сетарий и дирофилярий.

3.6. Сравнительная диагностическая эффективность иммуноферментной реакции с фракционированными антигенами из сетарий и дирофилярий.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммунохимическая характеристика антигенов Dirofilaria immitis и Setaria labiato-papillosa, их эффективность в диагностике дирофиляриоза"

Актуальность проблемы. Дирофиляриоз — зоонозное заболевание, переносчиком которого являются комары. Возбудителями инвазии у собак являются виды - Dirofilaria immitis и D. repens, широко распространенные во многих странах мира (К.И. Скрябин, 1930; И.А. Архипов, 2004; В.Б. Ястреб, 2006; А.Ю. Медведев, 2006; D.R. Webster, 1969 и др.). Они зарегистрированы и у человека, однако половой зрелости в организме человека дирофилярии не достигают и микрофилярий не выделяют. Широкому распространению дирофиляриоза в последние годы способствует увеличение численности собак, значительная миграция людей вместе с животными, а также адаптация дирофилярий к различным промежуточным хозяевам.

Применение современных иммунологических методов позволяет изучать кинетику основных показателей иммуноаллергических реакций, антигенные и иммуногенные свойства паразитов, пути формирования защитных реакций организма при заражении.

Многочисленными экспериментальными исследованиями установлено серологическое родство между различными паразитами, причем перекрестно-реагирующие компоненты обнаружены у таксономически отдаленных видов, относящихся не только к разным семейством, отрядам, но и классам.

Как правило, серологическое родство определяется числом общих антигенных компонентов.

Исследованиями А. Саргоп (1972) установлена определенная закономерность в проявлении антигенного родства у гельминтов, которая значительно уменьшается в соответствии с таксономической удаленностью.

Так, у представителей подсемейства Тохосаппае и АзсапсНпае обнаруживают 8-12 общих антигенных компонентов, у представителей подотрядов Азсапёа1а и ¥ИшаЬа. около 10, подклассов РИазгшсНа и АрЬазгшсНа лишь 3, а классов Сез1:ос1а и Тгета1:ос1а менее 3-х антигенных компонентов.

Наличие прекрасно-реагирующих компонентов между данными видами паразитов может служить основанием для использования гетерологичных видов в качестве источника антигенного материала при разработке иммунодиагностических тестов. Такой подход особенно необходим в тех случаях, когда по тем или иным причинам использование гомологичного антигена ограничено или невозможно.

Таким биологическим объектом могут быть сетарии, которые, как и дирофилярии, относятся к подотряду ¥11апа1а и вполне могут в белковом спектре содержать антигенные компоненты, способные диагностировать дирофиляриоз.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: приобрести гельминтный материал — половозрелых сетарий и дирофилярий, приготовить белковые соматические экстракты и определить в них содержание белка; провести иммунизацию кроликов соматическими экстрактами из сетарий и дирофилярий, получить иммунные сыворотки и определить их активность иммуноферментной реакцией с гомологичным и гетерологичным антигеном;

- провести иммунохимический анализ соматических экстрактов из сетарий и дирофилярий реакцией иммунодиффузии в агаровом геле;

- провести фракционирование соматических экстрактов из сетарий и дирофилярий гель-хроматографией, исследовать полученные фракции иммуноферментной реакцией (ИФР), определить в них антигеноактивные и диагностически эффективные при дирофиляриозе; разработать на основе фракционированного антигена-экстракта из сетарий и дирофилярий диагностическую иммуноферментную тест-систему при дирофиляриозе собак; сравнить диагностическую эффективность иммуноферментной реакции при дирофиляриозе собак на основе фракционированного антигена из сетарий и дирофилярий. Научная новизна. Впервые проведена сравнительная физикохимическая и иммунохимическая характеристика соматических экстрактов из половозрелых Dirofilaria immitis и Setaria labiato-papillosa. В экстракте из дирофилярий диск-электрофорезом регистрировали 18, а из сетарий — 16 белковых компонентов, располагающихся в диапазоне белков молекулярной массы 6,5-200 кДа. Реакцией иммунодиффузии с гипериммунными сыворотками от кроликов в экстракте из дирофилярий определено не менее 7, а из сетарий не менее 6 потенциальных антигенных компонентов.

В обоих экстрактах выявлен один антигенный компонент диагностического значения при дирофиляриозе.

Чувствительность ИФР с фракционированным антигеном из дирофилярий и сетарий составила соответственно 82,4%; 82,4%, специфичность - 86,7; 83,3%. Установлена возможность использования в качестве источника диагностического антигена при дирофиляриозе собак гетерологичный вид гельминта — Setaria labiato-papillosa.

2. Методика постановки ИФР с фракционированным антигеном из сетарий для диагностики дирофиляриоза, одобренная секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, 25.09.2009.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены:

- на заседаниях Ученого совета ВИГИС (2006-2009гг.)

- секции «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (2008, 2009 гг.)

Основные положения, выносимые на защиту:

- Иммунохимический и физико-химический анализ экстрактов из половозрелых дирофилярий и сетарий;

- Сравнительная оценка диагностической эффективности ИФР с выделенными антигеноактивными фракциями из ' сетарий и дирофилярий при дирофиляриозе собак.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах компьютерного текста. Состоит из введения, обзора литературы и собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, практические предложения. Список литературы содержит 203 источника, в том числе 91 отечественных и 112 иностранных. Работа иллюстрирована 14 таблицами, 13 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Паразитология", Хайдаров, Камил Абдурахманович

выводы

3. В соматическом экстракте из половозрелых дирофилярий и сетарий реакцией иммунодиффузии с сывороткой инвазированных D. immitis собаки определен один антигенный компонент, имеющий диагностическое значение при дирофиляриозе.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хайдаров, Камил Абдурахманович, Москва

1. Авдюхина Т.И., Супряга В.Г., Постнова В.Ф. Дирофиляриоз в странных СНГ: анализ случаев за 1915 1996 годы. // Мед. паразитология и паразитар. болезни. - 1997. — №4. - С. 3 - 7.

2. Аксёнова И.Н. Опыт прижизненной иммунодиагностики бовисного цистицеркоза крупного рогатого скота. Бюл. Всес. ин-та. гельминтол., 1974, вып. 12, с. 5-10.

3. Андреева Г.Н., Ермолин Г.А., Тараканов В.И. Перекрестно-реагирующие антигены в экстрактах Aphelenchus avenae, Neoaplectana glaseri и Dictyocaulus filarial// Тр. Всес. ин-та гельминтол. 1975. - т. 22. - с 3-7.

4. Андреева Г.Н. Об эффективности применения гетерологических антигенов для выявления антител в сыворотках у животных при гельминтозах // Бюл. Всес. ин-та гельминтол. — 1979. — вып.24. -с.81-85.

5. Андреева Г.Н., Бережко В.К. Сравнительная иммунохимический анализ некоторых видов нематод паразитов растений, насекомых и сельскохозяйственных животных// Тр. Всес. ин-та гельминтол. -1980.-t.25.-c. 15-21.

6. Аракельян P.C. Эпидемиолого-эпизоотологические особенности дирофиляриоза на территории Астраханской области: автореф. дис. канд. мед. наук / Аракельян P.C. М., 2007. - 25 с.

7. Аракельян P.C. Случай дирофиляриоза человека в Астраханской области // Мед. паразитол. и паразитарн. болезни. 2007. - №3. - с. 55.

8. Астафьев Б.А. Петров O.E. эволюционно-генетическая теория паразитизма // Успехи соврем, биол.1992. -112. №2. С. 163-175.

9. Астафьев Б.А., Петров O.E. Эволюционно-генетическая теория паразитизма. // Успехи современ. биол. — 1992. 112, № 2. - с. 163-175.

10. Архипов И.А., Березина C.B., Демидов Н.В. Дирофиляриоз собак Сурхандарьинской области // Матер, науч. кон. Всес. о-ва гельминтол. 1983.-е. 104-105.

11. Архипов И.А. Использование собак, инвазированных Dirofïlaria immitis (Leidy, 1856), в качестве модели для поиска филярицидных препаратов //Бюл. Всес. ин-та гельминтол. 1986. -Вып. 42.-е. 5-8.

12. Архипова Д.Р. Тенденции к созданию очагов дирофиляриоза и меры борьбы с ним //Матер, конф. Веер, о-ва гельминтол. М., 1994.-С. 6-9.

13. Архипова Д.Р., Архипов И.А. Периодичность микрофилярий в крови собак при дирофиляриозе Ветеринария М., 2004. - №1. -С. 38-39.

14. Архипов И.А. ,Архипова Д.Р. Дирофиляриоз. Москва - 2004 -с.194.

15. Баллад Н.Е., Соколовская О.М. Выявление общих и специфичных антигенных компонентов у Cysticercus bovis, Cysticercus cellulosae и Taeniarhynchus saginatus// Мед. паразитол. и паразитарные болезни.- 1968 -№ 2 -с. 193-198.

16. Баллад Н.Е. Изучение антигенных компонентов цистицерков Cysticercus bovis// Труды Всес. ин-та гельминтол. 1971.-т. 17-с.269-270

17. Баллад Н.Е. Иммунохимическая характеристика антигенов, выделенных из личиночных стадий Taeniarhynchus saginatus// Мед. Паразитол. и паразитарные болезни. 1973 - № 2 - с. 131-136.

18. Бережко В.К. Анализ антигенной структуры половозрелых Dyctiocaulus filariata и D. viviparous// Дис. кан. биол. наук., —М. — 1970.-С.138.

19. Бережко В.К. Иммуноэлектрофоретический анализ антигенной структуры половозрелых Dyctiocaulus filariata и D. viviparus. // Тр. Всес. ин-та гельминтол. —1972. —т. 19. -с. 14-22.

20. Бережко В.К. Изучение антигенности свободноживущей нематоды Rhabditis axei // Бюл. Всес. ин-та гельминтол. 1973. - вып. 10. -с.16-18.

21. Бережко В. К., Курочкина К. Г. Гуморальный иммунный ответ у овец при экспериментальном гемонхозе в зависимости от срока суперинвазирования // Труды Всес. ин-та гельминтол—1985—т.28 — С.21-27

22. Бескровная Ю.Г., Нагорный С.А. Идентификация микрофилярий Dirofilaria spp. с помощью ПЦР // Матер, докл. неуч. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» -М 2008. - С. 73 -75.

23. Бескровная Ю.Г. Дирофиляриоз на юге России (распространение и диагностика) Дис. канд. биол. наук. Ростов-на-Дону—2009. - с. 139.

24. Бессонов А.С. Тез. докл. конф., посвящ. 100-летию со дня рождения акад. К.И. Скрябина Ташкент - 1970 - с.31-32.

25. Бессонов А.С. Дирофиляриозы собак и человека // Ветеринария. -2003. -№3. С. 57-61.

26. Блажин А.Н. Гельминтофауна собак в Абхазии и ее роль в развитии продуктивного собаководства //Тр. Тропич. ин-та НКЗ Абхазская АССР. 1937. - Вып.З. - с. 135-143.

27. Бурджанадзе П.Л. К вопросу о важнейших гельминтозах сельскохозяйственных животных Грузии //Тр. Грузинск. н.-и. вет. опытн. станции. 1943. - т. 8. - с. 36-62.

28. Винницкий В.М. Механизм антигельминтного иммунитета в свете взаимообусловленной филогении паразита и хозяина // Доклады АН СССР. -1950, -т.75.-№3.-с. 477-480.

29. Гаркави Б.Л., Михно Ф.С. Распространение дирофиляриоза домашних собак в Краснодаре //Матер, докл. науч. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями», 22-23 мая 2002. -М.-2002. с. 91.

30. Гаркави Б.Л., Медведев. А.Ю. Распространение дирофиляриоза собак и человека в Краснодарском крае // Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями: Материалы докладов научной конференции М.: ВИГИС. - 2004. -с. 111-112.

31. Гламаздин И.Г. Диагностика цистицеркоза крупного рогатого скота иммуноферментной реакцией Дис. канд. ветерин. наук. — Москва-1990.-с. 144.

32. Гогель JI.C. Filaría immitis в сердце собаки в Закавказье //Журнал науч. и практ. вет. мед. — 1910. т. 3, в.2. - с. 6-16.

33. Горохов В.В. Забытые паразитозы // Мед. паразитол. 2003. - № 1. -с. 33-36.

34. Гурвич Б.М. К распространению микрофиляриоза собак в Донском округе/ //Сев.-кавк. вет. вестник. 1929. -№3-с. 13-14.

35. Гусев А.И. Цветков B.C., 1961. К технике постановки реакции микропреципитации в агаре. Лаб. дело, №2,43-45.

36. Дарченко H.H., Супряга В.Г., Гузеева М.В., Морозов E.H., Жукова Л.А., Сергиев В. П. // Мед. паразитол. и паразитар. болезни. 2009. -№ 2. с. 3 - 7.

37. Державина Т.Ю., Мертешева М.А., Чернышева A.A., Черникова Е.А. . // Мед. паразитол. и паразитар. болезни. 2010.- №1- с. 46 -47.

38. Ермолин Г.А., Ефремов Е.Е. Препаративное выделение функциональных антигенов личинок трихинелл //Веб.: «Достижение мед. паразитологии и троп, мед.», Тбилиси. 1975. — с. 316-321.

39. Есаулова Н.В., Храпай В.А., Акбаев М.Ш. Гельминтофауна домашних и диких плотоядных животных Краснодарского края // Тр. Всес. ин-та гельминтол. 2007. - т. 45. - с. 102-105.

40. Ефремов Е.Е., Ермолин Г.А.// Морфофункциональные закономерности неспецифических защитных реакций организма — М.- 1980.-е. 112-116

41. Желева Р.Ц. Сравнительное исследование антигенной структуры Toxocara canis (Werner, 1782) и Ascaris suum (Geese, 1782) в реакции иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза. // Мед. паразитол. и паразитарн. болезни. 1975. т. 43, № 3 - с. 293-298.

42. Зильбер JT.A. Основы иммунологии. 3-е изд., перераб. - М.: Медгиз -1959.-е. 599.

43. Каденации А.Н. Гельминтофауна млекопитающих Крыма и опыт оздоровления домашних животных от основных гельминтозов: Автореф. дис. док. вет. наук., М. 1958 - с. 18.

44. Клименко В.В. Разделение и характеристика функциональных антигенов Fasciola hepatica и F. gigantica. // Тр. Всес. ин-та гельминт. 1971. - т. 18-е. 129-132.

45. Комаров Ю.Б. Прижизненная диагностика цистицеркоза. -Ветеринария 1977 - № 2 - с. 62-63.

46. Левченко Н.В., Ермаков A.M., Дерезина Т.Н., Нагорный С.А. Эпизоотология, диагностика и лечение дирофиляриоза собак // Тез. 7-й Международн. кон. по пробл. вет. мед. мелких дом. животных. М. - 1999 а. - с. 148-150.

47. Левченко Н.В., Нагорный С.А., Ермаков A.M. и др. Дирофиляриоз у собак // Тез. 2-й риг. Кон. Актуальность пробл. вет. мед. мелких дом. животных на Северном Кавказе. — 19996. с. 23 - 24.

48. Лейкина Е.С. Значение иммунологии в борьбе с гельминтозами //Мед. парзитол. и паразитарн. болезни. 1973 -т. 42,№ 5 - с. 529536.

49. Майр Э. Популяции, виды и эволюция. М.: Мир- 1974. -с. 460.

50. Медведев А.Ю. Гаркави Б.Л. Распространение дирофиляриоза в Краснодарском крае.// Матер, докл. науч. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». — М. — 2005. с. 230-232.

51. Медведев А.Ю. Распространение дирофиляриоз собак в Краснодарском крае и серологическая диагностика инвазии // Тр. Всерос. ин-та гельминтол. 2006. - т. 43. - с. 196-202.

52. Медведев А.Ю. Распространение дирофиляриоз собак в Краснодарском крае и разработка его диагностики иммуноферментной реакцией // Дис. кан. биол. наук. — Москва — 2007 с.137.

53. Мунтян Н.А. Иммунохимиическое изучение антигенной структуры ларвоцисты Echinoccocus granulosus. // Дис. кан. биол. наук. — Кишинев 1971 - с. 140.

54. Насилова В.В. К распространению дирофиляриоза собак в Армянской ССР //Тр. Ереван, зовет, ин-та. 1948. - в. 10. -с. 121-126.

55. Насилова В.В. К изучению клинической картины дирофиляриоза собак //Тр. Ереван, зовет, ин-та. 1952. -В.14. - с. 171-180.

56. Наумычева М.И. Антигены гельминтов //Матер, докл. науч. конф. -Москва-1975 -в. 27-с. 67 85.

57. Петров A.M. Глистные инвазии собак и их санитарное и экономическое значение //Сельхозгиз- М.-Л.-1931. с. 160.

58. Петропавловский НИ. К вопросу о Filaría immitis в крови у собак //Архив вет. науки. -1904. кн. 6. - с. 484-492.

59. Пинчук В.А. Иммунохимический анализ антигенного спектра некоторых патогенных гельминтов // Автореф. дис. кан. биол. наук -Белая церковь 1970. - с. 19.

60. Полетаева О.Г. Сравнительное изучение антигенного строения Ascaris sum и Ascaris lumbricoides // Тр. ВИГИС. -M. -1971. т.17. - с.277-279.

61. Пульняшенко П.Р., Чаркин В.А. Некоторые аспекты диагностики и лечения дирофиляриоза // Матер. 1-й Международн. науч.-практ. веет. конф. по проблемам мелких животных, Одеса, Украина. -2002.-с. 101-105.

62. Раззаков Ш.А. Выявление видоспецифических и перекрестно реагирующих антигенных компонентов эхинококка и альвеококка // Мед. паразитол. и паразитарн. болезни. —1975. —т. 44, № 4- с. 448455.

63. Раззаков Ш.А. Получение сывороток узкой специфичности и их использование для идентификации антигенных компонентов эхинококка и альвеококка. // Мед. паразитол. и паразитарн. болезни. -1976. -т. 45, № 2- с. 148-150.

64. Роберман C.JI. Материалы по гельминтофауне собак Киргизской ССР //Ветеринария. -1941.- №4. с. 18.

65. Рощина Р.В. Дирофиляриоз собак //Восьмой международный конгресс по проблеме ветеринарной медицины мелких домашних животных. 2000. - с. 186-188.

66. Сапунов А .Я., Звержановский М.И. Распространения дирофиляриоза собак в Краснодарском крае // Тез. докл. науч. конф. -Краснодар- 1980. с. 23 - 25.

67. Сафронов Е.Ю., Воробьев A.A., Латышевская Н.И. и др. Дирофиляриоз в Волгоградской области новое заболевание региона // Мед. паразитол. - 2004. - №2. - с. 51-54.

68. Скрябин К.И. Характеристика гельминтофауны домашних животных Туркестана: Дис. Юрьев. - 1916- с. 37-45.

69. Скрябин К.И., Альтгаузен А.З., Шульман Е.С. Первый случай обнаружения Dirofilaria repens у человека //Троп. мед. и ветерин. -1930. т.VIII, № 2. - С. 9-11.

70. Скрябин К.И. Филяриидозные заболевания человека в СССР //Мед. и паразит, болезни. 1940. - т. IX, Вып. 1-2. - С. 119-127.

71. Скрябин К.И., Шихобалова Н.П. Филярии животных и человека. -М.: Сельхозгиз—1948. -с. 608.

72. Смирнов Н.Ф. Антигенный анализ Moniezia expansa и M. benedi методом иммуноэлектрофореза. // Бюл. Всес. ин-та гельминтол.; 1971.-вып. 5.-с. 107-111.

73. Супряга В.Г., Андреенков А.И. Диагностика филяриатозов у лиц с низкой плотностью микрофилярий в крови // Мед. парзитол. и паразитарн. болезни -1978. -№6. с. 100-102.

74. Трунова С.А., Журавлев А.С., Атаев A.M. Гельминты домашних и диких псовых (Canidae) равнинной зоны Северного Кавказа // Тр. Всес. ин-та гельминтол. -2007. т. 45. - с. 228-232.

75. Федотова Г.И., Громова Б.Б. Паразитизм фитогенных организмов. -МСХ СССР ВНИИТЭИСХ, М.- 1974. -с. 58.

76. Фисько A.M., Фисько Е.В. Особенности эпизоотологии дирофиляриоза в ростовской области // Ветеринарная медицина домашних животных // сборник статей. Казань - 2005 -Вып. 2.-е. 81-85.

77. Фисько A.M. Распространения дирофиляриоза собак в Ростовской области // Матер, докл. науч. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарн. болезнями». М. - 2008. — С. 497-499.

78. Худавердиев Т.П, Джафаров Ш.М. К изучению распространения дирофиляриоза кровососущими насекомыми в условиях Нахичеванской АССР//Уч. зап. Азерб. юс. унив-та. -1979. -Вып. 1.-е. 16-21.

79. Чунтонова М.И. Изучение антигенной структуры экстрактов из гемонхов и остертагий // Тезисы докл. к годичн. конф. Всес. ин-та гельминтол. — 1969. с. 59-60.

80. ШинкаренкоАЛ., ПетровЮ.Ф. Эпизоотология основных гельминтозов собак в Волгоградской области // Тр. Всес. ин-та гельминтол. -2005. т. 41. -с. 434-438.

81. Шинкаренко А.Н., Колесников П.В., Караулов В.В. Кардиопульмональная патология при дирофиляриозе собак. // Российский паразитологический журнал. -2009- № 4.—с. 79 82.

82. Шуйкина Э.Е., Сергиев В.П, Супряга В.Г., Аракельян P.C., Дарченкова H.H., Архипов И.А. Особенности формирования синантропных очагов дирофиляриоза в России // Мед. парзитол. и паразитарн. болезни -2009.-№4. с. 9-11.

83. Якимов B.JT. Микрофилярии животных в Туркестанском крае //АВН. — 1916. -Кн. 1.-с. 9-22.

84. Ястреб В.Б. Некоторые аспекты дирофиляриоза собак в Московском регионе // Матер, докл. науч. конф. Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями.- Москва- 2004-В. 5-с. 440 442.

85. Ястреб В.Б. Сравнительное изучение методов обнаружения микрофилярий в крови собак. // Матер, докл. науч. конф. Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями. -Москва —2004, —В. 5.^443-445.

86. Ястреб В.Б. Дирофиляриоз собак в центральном регионе России //Тр. Всерос. ин-та гельминтологии им. К.И. Скрябина. 2006. — т. 42.-с. 457-467.

87. Ястреб В.Б. Влияние породы и хозяйственного назначения собак на зараженность их дирофиляриями // Матер, докл. науч. конф. Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями-Москва -2007 -вып. 8.-е. 396 -398.

88. Ястреб В.Б. Эпизоотологическая ситуация по дирофиляриозу собак в Московском регионе // Российский паразитологический журнал. 2008-№ 3. — с. 63-68.

89. Ястреб В.Б Клинические признаки дирофиляриоза собак, вызванного Di rofilaria immitis и D. repens// Российский паразитологический журнал. -2009—№2.-с. 86-91.

90. Adcock J.L. Pulmonary arterial lesions in canine dirofilariasis // Am. J. Vet. Res. 1961.-V. 22.-P. 655-622.

91. Aranda C., Panyella O., Eritja R., Castella J. Canine filariasis importance and transmission in the Baix Llobregat area, Barcelona (Spain) //Vet. Parasitol. 1998. - V. 77, N 4. - P. 267-275.

92. Araujo A. M. Canine and human Dirofilaria immitis infections in Portugal. A review / A. M. Araujo // Parassitologia. 1996. - N 38. - P. 366.

93. Atwell R.B., Rezakhani A. Inoculation of dogs with artifical larvae similar to those of Dirofilaria immitis: distribution within the pulmonary arteries // Am. J. Vet. Res. 1986. - V. 47. P. 1044 -1045

94. Benex J. Communautés antigenigues entre Taenia saginata et Echinococcus granulosus // Bull. Sjc. pathol. exot. 1972. - 65. - №4. -p. 563-569.

95. Bhaffacharya Alok, Bhaffacharya Sudha, Sehgal Devinder Molecular basis of immune response against parasites // Curr. Sci (India). -1991. -V. 60. -№ 9 10. - P. 569-580.

96. Biguet J. , Tran Van Ky P., Moschetto V., Gnamey Koffy D. Contribution a letude de la structure antigenique des Larves de Trichinella spiralis et des precipitins experiementales du lapin. // Wiad. Parazytol.- 1965- v. 11, vol. 4-p. 299-315.

97. Boros G., Janisch M., Sebestyen G. Dirofilaria immitis fertozttseg kulyaban.// Magyar a Mattory lapja Vengria, 1982. V. 37, №5. P. 313 -316.

98. Boroskova Z., Bencova M. The efficiency of antigens from different stage of Ascaris suum development in the proof of the migration phase of experimental ascaris in pigs. Vet. Med. 1978, r. 23, c. 5, s. 283-287.

99. Burch G., Blair H.E. Dirofilariasis and its diagnosis // Vet.med. 1951. -V.46.-p. 128.

100. Calamel M., Soule C. Choix et preparation dun antigene pour le diagnostic de la cysticercose bovine par immunofluorescence. — Rev. Med. Vet-1972— v. 123, № 8-9-p. 1105-1114.

101. Calvert C.A., Rawlings C.A. Therapy of canine heartworm disease. In: Current Vet. Therapy IX, Small Anim. Pract. 1986 - P. 406-419.

102. Campos M.W. , Gomez V., Gonzalez J. Lozano J.S. Immunological cross — reaction between Helmintian extracts and seroproteins. 3 — rd Int. Congr. Parasitol., Munich, 25-31. August- 1974- v. 2. -P. 1174.

103. Cancrini G., Allende E., Favia G. et al. Canine dirofilariosis in two cities of southeastern Spain //Vet. Parasitol. 2000. - V. 92, N 1. - P. 81-86.

104. Capron A., Brygoo E.R., Afchain D. Apport de letude de la structure antigenique a la phylogenie des Helminthes. // Bull. Mus. Nat. hist, natur. Zoo.- 1972—v. 55-p. 877-885.

105. Capron A., Biguet A., Vernes A., Afchain E. Structural antigenigue des helminthes. Aspects immunologiques. Des relations hote parasite // Pathol. Boil. - 1968.-V. 16.-P.121-138.

106. Carlisle C.H. The incidence of Dirofilaria immitis (Heartworm) in dogs in Queensland //Austral. Vet. J. 1969. - V. 45, N 11. - P. 535-538.

107. Despommier D.D., Muller M. The stichosome of Trichinella spiralis: its structure and function // J. Parasitol. 1970. - v.56, №4/11. - p. 76-77.

108. Diakou A The prevalence of caninediio filariosis in the region of Attiki //Bull, of the Hellenic Vet Med Soc. -2001. -V. 52, N2. -P. 152-156.

109. Dineen J.K. Immunological aspects of parasitism // Nature Lond. -1963. V. 197. -P. 268-269.

110. Elek G., Minik K., Pajor L. New human dirofilarioses in Hungary //Pathol. Oncol. Res. 2000. -V. 6, N 2. - P. 141-145.

111. Espinoza E. Anti-Dirofilaria immitis IgE: Seroepidemiology and seasonal variation in an exposed human population / E. Espinoza, M. Cordero, A. Muro, F. Lorente, F. Simon / Tropical Medicine and Parasitology. 1993a. - Vol. 44, N 3-P. 172.

112. Favia G., Lanfrancotti A., Torre A. et al. Polymerase chain reaction — identification of Dirofilaria repens and Dirofilaria immitis // Parasitology. 1996.-V. 113, N6.-P. 567-571.

113. Fernandes C.G.N., Ihalamulla R.I., Silva W.A.S. Mala and female filarial worms dirofilaria (Nochtiella) repens recovered from the scrotum//Ceylon Med. J.-2000. V. 45. P. 131-132.

114. Flores J.M. Antigenis analysis of tenia solium and T. hydatigera and their larvae stages. 111. Parasite-parasites interrelationships. Arch, med. Ved - 1978— v. 10, № 1-p. 94.

115. Ganestri Trotti G., Pampiglione S., Rivasi F. The species of the genus Dirofilaria Railliet and Henry, 1911 //Parassitologia. 1986. - V.39. - P. 369-374.

116. Georgieva D., Kirkova Z., Ivanov A. A study on the incidence and diagnostics of dirofilariosis (heartworm disease) in carnivores //Bulgarian J. of Vet. Med. 2001. - V. 4, N 4. - P. 231-236.

117. Giannetto S., Pampiglione S., Santoro V., Virga A. Research of canine filariasis in Trapani province (Western Sicily). Morphology on SEM of male Dirofilaria repens //Parassitologia. 1997. - V. 39, N4. - P. 403405.

118. Glickman L.T., Grieve R.b., Breitschwerdt E.B. Serologis patter of canint heartworm (Dirofilariaimmitis) infection // Amer. J. vet. Res. -1984. -V.45, 6,-p, 1178- 1183.

119. Grassi B., Noe G. Propagazione della filariae del sangue esclusivomehte per mezzo della puncture di pealiaia zanzare. Note preliminare // R. C. Accad. Lincoi. 1900. -V.9. - P. 157-162.

120. Grieve R.B., Glickman L.T., Batter A.C. Canine DirofiJaria immitis infection in a huperenzootic area; examination bu parasitologis findings at necropsu and bu two serodyagnosticmedhods//Amer. J. vet Rest 1986 -v. 47. -P. 329-332.

121. Grossi T.L., Ihrke P.J., Walder EJ., Affolter V.K Cutaneous microfilariasis //Skin disease of the dog and cat -2005. -P. 225-228.

122. Guerrero J. Distribution of Dirofilaria immitis in selected areas of Europe and South America //Proc. Heartworm Symp. -1989. -P. 13-18.

123. Harrus S., Harmelin A., Rodrig S., Favia G. Dirofilaria repens infection in a dog in Israel //Amer. J. Trop. Med. Hyg. 1999. - V. 61, N 4. - P. 639-641.

124. Himonas C. Canine filariasis caused by Dirofilaria repens in Greece //Parassitologia -1996.-V. 38, N1-2.-P. 357.

125. Hiroshima K., Iyoda A., Toyozaki T. Human Pulmonary Dirofilariasis:Report of Six Cases//Tohoku J. -1999. -V. 189, N4. -P. 307-314.

126. Hiroshi Schinoda S. Study on rhabditis elongate. I. antigenisiti. // Jap. J. Parasitol- 1969- v. 18, l.-p. 87-92.

127. Hoskins J. D., Hadstad H.V., Hribernic T.N., Breitschwerdt E.B., Hearworm disease in dogs from Louisiana; Pretreatment clinical and laboratory evaluschion // J. Amer. Ani hosp. assoc. 1984 V 20, 2. - p. 205-210.

128. Kanev I., Kamenov I., Ganchev G. et al. Dirofilaria immitis in animals and humans in Bulgaria//Parasitolotologia. -1996. -V. 38, N1-2. -P. 358.

129. Kato K.H. U.S.A. Patent. Immunoassay. 1982. - N 4,322,495.

130. Kelly J.D. Detection and differentiation off microfilariae in canine blood // Avstral. Vet. J. -1973-v.49, 1- p. 23-27.

131. Kitagawa H. Clinical studies on canine dirofilarial hemoglobinuria: relationship between the tricuspid valve orifice and plasma hemoglobin concentración / H. Kitagawa, Y. Sasaki, K. Ishihara / Jap. J. Vet. Sci. -1986. -V. 48, N 1. -P. 99-103.

132. Knott J.I. Metod for making micofilaria surveus on dai blood // trans. R. Trop. Med. Hyg—1939. -v 33. p. 191-196.

133. Kume S. Epizootology of canine heartworm diseasein the Tokyo area: diagnosis and treatment//Proc. 1 -st Inter. Symp. on Can. Heartworm Dis., 1970.-P. 18-33.

134. Laemmli U.K Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. -1970. -V. 227. -P. 680-685.

135. Lahitte J.D., Davoust B., Dorchies P. Etude comparative de sing methods de detection des Microfilares sanguicoles // Rev. Med. Vet. -1986.-V. 137, N 10.

136. Layne E. Spectrophotometric and turbidometric methods for measuring proteins //Methods Enzymol. 1957. - V.3. - P.447-454.

137. Lindsey J.R Identification of canine microfilariae //J. Amer. Vet Assoc. -1965. -V. 146.-P. 1106-1114.

138. Levine JJF., Fox D.S., Snowden K.F.et al. Validity of Filarochek test for detection of Dirofilaria immitis infections in dogs //J. Amer. Anim. Hosp. Assoc. -1988. V. 24, N3.-P. 327-331.

139. Liu S.K., Das K.M., Tashjian R. J. Andult Dirofilaria immitis in the arterial system of a dog //J.Amer. Vet. Med. Assoc. 1966. V. 148. - P. 1501 - 1507.

140. Logar J., Novsak V., Rakovec S., Stanisa O. Subcutaneous infection caused by Dirofilariarepens imported to Slovenia//! Infect -2001. -V. 42, N1. -P. 72-74.

141. Lucientes J., Castillo J.A. Present status of Dirofilaria repens in Spain //Parassitologia. 1996.—V. 38, N1-2. -P. 358.

142. Magat W.J., Jeibka E.L. A sérodiagnostic antigen for trichinellosis //Acta parasitol polon. 1976. - V. 24, N 11-19.-P. 191-198.

143. Madron E. Dirofilariasis in southeastern France: 16 case reports //Point Vet.-1991.-V. 23, N 136.-P. 155-159.

144. Martin T.E., Collins G.H. Testing for heartworm disease in dogs //Canadian Vet. J. 1985. - V. 26, N 1. - P. 58.

145. Masseron T., Sailliol A., Niel L., Floch J.J. Conjunctival dirofilariasis caused by Dirofilaria repens: report of a French case //Med. Trop. -1995. V. 55, N 4. - P. 457-458.

146. Matsumura K., Kazuta Y., Endo R. et al. Detection of circulating immune complexes in the sera of dogs infected with Dirofilaria immitis, by Clg-binding enzyme-linked immunosorbent assay //J. Helminthol. -1986.-V. 60, N3.-P. 239-243.

147. Mines J.J. Medhod of counting of canine microfilariae // Austral. Vet. J. 1967.-Vol. 43.-P. 599.

148. Mizino F., Higashio T., Matsumura T. A survey of canine Dirofilaria invasion in a suburb of Tokyo (Nerima ward) // Kobe J. Med. Sci. -1981. V. 27.-P. 113-120.

149. Murdoch D.B. Heart worm in the United Kingdom //J. Small Anim. Pract. 1984. - V. 25. - P. 299-305.

150. Nadgir S., Tallur S.S., Mangoli V., Halesh L.H. Subconjunctival dirofilariasis in India //Southeast Asia J. Trop. Med. Public Health. -2001. V. 32, N 2. - P. 244-246.

151. Newton W.L., Wright W.N. The occurrence of a dog filarid other than Dirofllaria immitis in the United States. // J/ of Parasitol. 1956- v/42. -p. 246-258.

152. Oelerich J., Umalu R.C., Lederer J. Immunodiagnostiche Untersuchungen bei der bilharziose. I. Antigenanalycen unt antygenbeziehungen // Trop. and med. und parasitol 1974- v.25., 3, -s. 318-326.

153. Otto F.G. Geographical distribution vectors and life cycle of Dirofllaria immitis //J. Amer. Vet. Med. Assoc. 1969. - V. 154. - P. 370.

154. Ouchterlony O., Diffusion in gel methods for immunological analysis. Progress Allergy., 5,1-78

155. Pampiglione S., Elek G., Palfi P. Human Dirofllaria repens infection in Hungary: a case in the spermatic cord and a review of the literature //Acta Vet. Acad. Sci. Hung. 1999. - V. 47. - P. 77-83.

156. Petruschke G., Rossi L., Genchi C., Pollono F. Canine dirofilariosis in the canton of Ticino and in neighbouring areas in northern Italy //Schweizer Archiv fur Tierheikunde. 2001. - V. 143, N 3. - P. 141147.

157. Petithory J., Brumpt L., Bahno M. Study on the serological possibilities of diagnosis in onchocerciasis by double diffusion with heterologous antigens. Ann. Parasitol. Hum. Et comp - 1973- v. №2-p.343 -350.

158. Rawlings C.A., Prestwood A.K., Beck B.B. Eosinophilia and basophilia in Dirofilaria immitis and Dipetalonema reconditum infections //J. Amer. Anim. Hosp. Assoc. 1980. - V. 16. - P. 699-704.

159. Raynaud J.P. La melarsamine (R.M. 340) unnouveau macro filaricide dans le traitement des infestations du chien par Dirofilaria immitis //Prat. Med. Chirurg, de l'Anim. Comp. 1990. -V. 25. - P. 369-374.

160. Renaud F. Biodiversite, genetiqueet evolution dans les systèmes hotes-parasites.//Bull. Soc. Zool. Ff. 1992. - V. 117.-N1-P. 109-115.

161. Retnasabapathy A., San K.T. Incidence of canine heartworm (Dirofilaria immitis) in Malazia // Vet. Ree. 1976. V.98, 4. p. 68-69.

162. Rifaat M.A., Abdel-Aal T. M. Protein and polysaccharidecontent oft y*

163. Fasciola gigantica skin test antigens and their reactivity of the diagnosis of bilharziasis. J. Trop. Med. And Hyg.- 1968- v. 71 № 12- p. 302304.

164. Rifaat M.A., Khalil H.M., Salem S.A., Mohamed H.H. The use of antigen extracted from camel filarial (Acanthocheilonema aevansi) inserological dignosis of human filariasis in Egypt // 3-rd Int. Congr. Parasitol. Munich. 1974. -v.3. - p. 1209.

165. Rifaat M.A., Khalil H.M. The diagnosisof Schistosomiasis by Fasciola gigantica antigents isolated by salting and by DEAE cellulose column chromatography // 2-nd Europ. multicol. parasitol. Yugoslavia. 1975. -p.63.

166. Rilatt D.B., Atwell R.B., Watson A.R.A. et al. A second generation heartworm test //Austral. Vet. Pract. 1984. - V. 14, N 4. - P. 174-175.

167. Rojo-Vazquez F.A., Valcarcel F., Guerrero J., Gomez-Bautista M. Prevalence of canine dirofilariasis in four geographical areas of Spain //Med. Vet. 1990. -V. 7, N 5. - P. 297-305.

168. Rossi L., Pollono F., Meneguz P.G. An epidemiological study of canine filarioses in north-west Italy: what has changed in 25 years //Vet. Res. Commun. 1996. - V. 20, N 4. - P. 308-315.

169. Ruiz-Moreno J.M., Bornay-Llinares F.J., Prieto M.G. et al. Subconjunctival infection with Dirofilaria repens: serogical confirmation of cure following surgery //Arch. Ophthalmol. 1998. - V. 116, N 10. -P. 1370-1372.

170. Schalm O.W., Jain N.C. Detection of microfilaria a using the capillary hematocrid tube // California Vet. 1966- v. 20.- P. 14.

171. Scholtens R.G., Patton S. Evalution of an enzyme linked immunosorbent assay for occult dirofilariasis in apopulation of naturally exposed dogs // Amer J. vet. Res. - 1983. - v. 44, n 5. - p. 861-864.

172. Schrey C.F., Trautvetter E. Heartworm disease in cats and dogs -diagnosis and therapy //Waltham Focus. 1998. - V. 8, N 3. - P. 23-30.

173. Selby L.A., Corwin R.N., Hayes H.M. Risk factors associased with canine heartworm infection // J/ Amer. Vet. Med. Assoc. -1 980. v. 176, 1-n. 33-35.

174. Sharma M.C., Pachauri S.P. Prevalence of canine dirofilariasis in Tarai with particular reference to environment and length of hair // Ind. J. of Microbiol.- 1979.-V. 19.№ 3.-P. 114 117.

175. Sharma M.C., Pachauri S.P. Blood cellular and biochemical studies in canine dirofilariasis//Vet Res. Comm. -1982. -V. 5,N3. P. 295-300.

176. Sharma M.C., S.P. Pachauri Blood cellular and biochemical studies in canine dirofilariasis / Vet. Res. Com.- 1982. Vol. 5, N 3. - P. 295-300.

177. Simon F. Heartworm infection in humans and animals. / F. Simon, C. Genchi / Ediciones universidad de Salamanca 2001. — p.210.

178. Slonka .G.F., Castleman W., Krum S. Adult heartworms in arteries and viens of a dog // J. amer. Med. Assoc. 1977. - V. 170. P.717 - 719.

179. Smith W.D. Serum and mucusantibodies in sheep immunited with larval antigens of Haemonchus contortus // Res. Vet. Sci. 1977 a. - v.22, № l.-p. 128-129.

180. Somorin A.O., Meiner D.C. A new immunodiagnostic test in onchocerciasis // Clin. Allergy. — 1976. v.6, №6. - p. 573-576.

181. Suenaga O., Nishioka T., Itoh T. On the transition of canine heartworm prevalence among dogs in Nagasaki citu, Western Japan// Trop. Med. -1980. Vol. 22, N 1. - P. 35 - 45.

182. Tarello W. Subcutaneous canine dirofilariasis dueto Dirofilaria (Nochtiella) repens of American origin in Italy: case report /Rev.de Med Vet -2000. V. 151, N11.-P. 1053-1058.

183. Tarello W. Importance in the dog of concentration tests for the diagnosis of heardworm dsease in non endemic areas // Vet. On — Line. -2001. -P. 234-238.

184. Thomas RE. A case of canine heartworm disease (Dirofilaria immitis) in the UK //Vet Rec. -1985. — V. 117,N1.-P. 14-15.

185. Twaiko G.L., Mkufya A. Demonstration of antibodies in people with Onchocerca volvulus using adult Onchocerca gutturosa antigen // E. Air. Mod. J. 1977. - v.54, №12. - p. 680-683.

186. Vakalis N.C., Himonas C.A. Human and canine dirofilariasis in Greece //Parasitollogia. -1997. -V. 39, N4. -P. 389-391.

187. Yriev, R.B., et al. Epidemiology of canine heartworm infection // Epidemiology Rev. 1983. - P. 220-246.

188. Wang L.C. Canine filarial infection in north Taiwan // Acta. trop. -1997-v. 68. l.-P. 115-120.

189. Wang J.S., Tung K.C., Huang C.C., Lai C.H. Alteration of extracellular collagen matrix in the myocardium of canines infected with Dirofilaria immitis //Vet Parasitol. 2005.- V. 131. - P. 261 - 265.

190. Webster D.R. Heart worm Dirofilaria immitis infection in dogs// Austral. Vet. J. 1969. -V. 45, № 6. - P. 247-250.

191. Weil G.J., Malane M.S., Powers K. G. Detection of parasite antigens in canine dirofilariasis by counter Immunoelectrophoresis // Am. J. Trap. Med Hyg. — 1984.-V. 33.-P. 425 430.

192. Weil G.J. U.S. Patent Circulating antigens of Dirofilaria immitis, monoclonal antibodies specific therefore and methods of preparing such antibodies and detecting antigens. -1985. -N.4,839,275.

193. Wendrychowicz H., Bezubic B. Studies on the antigens of Ostertagia circumcincta. I. Somatic antigens of infective larvae // Acta parasitol. pol. 1983. - v. 28, №24. - p. 233-244.

194. Wylie J.P. Detection of microfilaria bu a filter technique // J. Amer. Vet. Med. assoc. 1970-v. 156, 10- p. 1403-1405.

195. IJncel T. Seroprevalence of Dirofilaria immitis in Stray Dogs in Istambul and Izmir / IJncel T., Vural G. / Turk J. Vet. Anim Sci. 2005. -N 29. -P. 785-789.

Информация о работе

Хайдаров, Камил Абдурахманович
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.02.11

Диссертация

Иммунохимическая характеристика антигенов Dirofilaria immitis и Setaria labiato-papillosa, их эффективность в диагностике дирофиляриоза - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы