Радиоиммуноанализ в оценке гормонального гомеостаза

Пивень, Надежда Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Радиоиммуноанализ в оценке гормонального гомеостаза
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Радиоиммуноанализ в оценке гормонального гомеостаза"

Г I V"

и I И1Г»»> -

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ ИМЕНИ .И.И. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

ПИВЕНЬ Надежда Викторовна

РАДИОИКМУНО АНАЛИЗ В ОЦЕНКЕ ГОРМОНАЛЬНОГО Г0ИЕ0СТАЗА

03.00.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицински* наук (в форме научного доклада)

МОСКВА - 1993

Работа выполнена в Институте биоорганической химии Академии наук Беларуси, г.Минск

Научный консультант: академик Академии наук Беларуси, профессор A.A. Ахрем

Оффициальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Е.Г. Зезеров

доктор биологических наук, профессор A.M. Егоров

доктор медицинских наук, профессор Л.И. Винницкий

Ведущая организация: Институт клинической кардиологии

им.А.Л. Мясникова Кардиологического научного центра Российской академии медицинских наук

Защита состоится " 7Э • ..кГ.У...... 1993г. в час. на

заседании- специализированного совета Д 074.05.10 по защите диссертации на сойскание ученой степени доктора медицинских наук при Московской Медицинской Академии им. М.М. Сеченом по адресу: 119881 Москва, ул. Вольная Пироговская, 2/6

С диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова

Диссертация-разослана " " ........... 1993г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

А.Ю. Миронов

СОДЕРЖАНИЕ стр.

1. Общая характеристика работы............................. 1

2. Материал и методы исследования ........................^ 9

3. Результаты исследования и их обсуждение................ 13

3.1. Получение антисывороток для радиоиммуноанализа.... 13

3.2. Радиоиммуноанализ в оценке функционального состояния гонад и коры надпочечников ............. 34

3.3. Радиоиммуноанализ в оценке функционального состояния системы "гипофиз-щитовидная железа"..... 46

3.4. Радиоиммуноанализ в оценке эффективности

лечения .......................................... 53

4. Заключение ............................................ 56

Выводы ................................................ 63

Список опубликованных по теме диссертации работ ....... 66

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕННЫХ ТЕРМИНОВ РИА - радиоиммуноанализ АГ - антиген

АКДС - адсорбированная коклюш-дифтерия-столбняк (вакцина)

АКТГ - адренокортикотропный гормон

Б-2-МГ - бета-2-микроглобулин

ВСА - бычий сывороточный альбумин

Е2 - эстриол

ЕЗ - эстрадиол

К - кортизол

П - прогестерон

ПАФ - полный адьювант Фрейнда

ПДО - прогрессирующий деформирующий остеоартроз

ПЛ н плацентарный лактоген

РА - ревматоидный артрит

РЭА - раково-эмбриональный антиген-

Т - тестостерон

ТЗ - трийодтиронин

Т4 - тироксин

ТГ - тиреоглобулин

ТСГ - тироксин-связывающий Глобулин

ТТГ - тиреотропный гормон

ФНС - функциональная недостаточность суставов ЧСА - человеческий сывороточный альбумин ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В современной биологии концепция гомеостаза - относительного постоянства среды организма - начиная от классических исследований (Аничков Н.Н.,1930; Баранов В.Г., 1965; Адо ИИ., 1972; Горизонтов П Д., 1986) и вплоть до настояцзго времени занимает прочное место среди фундаментальных понятий теоретической и прикладной медицины. Значение этой концепции велико, так как исследования по гомеостазу смыкаются с анализом медико-биологических и социальных категорий здоровья, с Медицинским понятием "нормы", причем на каждом уровне организации биосистем гомеостаз имеет свои особенности и механизмы, обеспечивающие структурное и функциональное единство организма (Горизонтов П.Д. 1981). Ведущая роль в регуляции гомеостаза принадлежит эндокринной системе. Эндокринный гомэостаз характеризуется сохранением равновесия между концентрацией гормона, находящегося в крови, и напряжением секреторной активности железы, синтезирующей этот гормон (Алешин Б.В. 1981). Важным аспектом этой проблемы является изучение роли эндокринной системы при патологии, учасие ее в патогенезе того ила иного заболевания. Одним кз основных направлений в современном исследовании эндокринного гомеостаза является разработка адэкватных методов количественной оценки функционального состояния систем организма, пригодных и доступных для клинической практики (Шифрин Г.А., 1991). Прогльсе в диагностике и профилактике заболеваний человека в последние -годы стал возможным благодаря созданию универсального, высокочувствительного и доступного для практического здравоохранения

метода радиоиммунологического анализа (РИА), внедрение которого клиническую практику относят к важнейшим достижениям медицины Успех РИА обусловлен его специфичностью, высокой клиническс информативностью и достоверностью исследований, позволяюще количественно определять содержание различных биорегуляторов высоким уровнем чувствительности (10~12 моль/л). Широкое внедрени РИА в практику отечественного здравоохранения сдерживалось д последнего времени не только отсутствием производств

радиодиагностических наборов в стране и научных разработок направленных на создание соответствующих технологий, но отсутсвием научно обоснованной методологии их применения пр различных формах патологии.

Целью настоящей работы было: изучить возможность использования РИА для углубленного исследования гормонального гомеостаза, оценки динамики и особенностей функционирования различных' гормональных систем, их резервных вогмоки и

взаимосвязи с клинической симптоматикой и видом проводимой терапии при патологии на примере ревматоидного артрита (РА); оценить клинико-патогенетическую значимость выявленных с помощью РИА гормональных нарушений.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи: - разработка научных основ получения высокоспецифичных и аффинных антисывороток к регуляторным белкам, белково-пептидным, стероидным и тиреоидным гормонам, пригодных для РИА, с целью использования их в качестве компонентов отечественных, серийно выпускаемых наборов реактивов для количественного определения названных соединений;

- определение в крови больных РА .с-различными клиническими проявлениями сроками заболевания концентраций прогестерона, тестостерона, эстриола, зсградиола, кортизола, тиреотропного гормона, тиреоглобулина, тироксина, трийодтиронина, тироксинсвязывакяцего глобулина до и после противовоспалительной и гормональной терапии;

- изучение особенностей функционирования гонад, корн надпочечников, системы гипофиз-щитовидная эелеза у больных РА с помощью функциональной нагрузки АКТГ в сочетании с РИА;

изучение с помощью РИА влияния проводимого противовоспалительного лечения и гормонотерапии на функционирование различных гормональных систем организма;

- изучение возможностей использования РИА для оценки клинико-патогеиетической значимости выявленных нарушений при РА. Научная новизна. Настоящая работа является углубленным комплексным исследованием

гормонального гомеостаза при аутоиммунной патологии с

использованием РИА-адэкватного высокочувствительного метода современного медицинского микроанализа. Впервые разработаны биотехнология и научные основы получения высокоаффинных и специфичных антисывороток к регуляторным белкам, белково-лептидным, стероидным и тиреоидным гормонам, пригодных для целей РИА. На основе этих антисывороток разработаны аналитические тест-системы и осуществлен серийный выпуск наборов реактивов для радиоиммунологического анализа названых биорегуляторов 25 наименований.

С помощью отечественных РИА-наборов в сочетании с функциональной нагрузкой АКТГ у больных РА изучен гормональный

статус и выявлены особенности функционирования гонад, коры надпочечников и системы "гипофиз-щитовидная железа", что позволило оценить чувствительность рецепторного аппарата и функциональные резервы как отдельных эндокринных желез, так и эндокринной системы в целом. Такой методичесий прием дал возможность выявить малоизученные стороны нарушения функционального состояния перечисленных эндокринных желез. Обнаружены диссоциация и полиморфизм ответа изучаемых гормональных систем на нагрузку АКТГ, которые в противоположность лицам контрольной группы выражаются аномальными ответными реакциями, причем вероятность их возникновения высока у больных, для которых характерны изменения исходного уровня гормона в крови, длительное и тяжелое течение заболевания. Выявленная функциональная резистентность некоторых эндокринных желез в ответ на нагрузку АКТГ подтверждает роль функциональной разобщенности гормональных систем в патогенезе РА.

С помощью РИА у больных РА обнаружены явления относительной эстрогенной и надпочечниковой недостаточности на фоне развития гипотиреоза, коррелирующие с определенной клинической симптоматикой, тяжестью и длительностью заболевания, что дает основание по-новому интерпретировать механизмы развития гормональной недостаточности основных эндокриннных желез, имеющих патогенетическое значение в развитии аутоиммунной патологии и доказывающих существование взаимодействия иммунной и эндокринной систем.

Показана целесообразность применения РИА для контроля эффективности проводимой противовоспалительной и гормональной терапии, необходимость предварительной оценки гормонального статуса с целью избирательного назначения лекарственных, в том числе и гормональных препаратов.

Таким образом,-в данной'работе на основе использования современного высокочувствительного метода РИА решена серьезная научная проблема, имеющая важное значение для практической медицины, поскольку освещена роль дезинтеграции функционального состояния гормональных систем при РА, заложены основы для разработки контролируемого дифференциального подхода к лечению и целенаправленной профилактике при данной патологии. Теоретическая и практическая значимость. Разработаны научные основы, оригинальные

схемы и методы получения специфических антисывороток к белково-пептидным, стероидным и тиреоидным гормонам, которые были использованы как компонент серийно выпускаемых наборов реактивов для радиоим?^унологического определения концентрации этих соединений в биологических жидкостях. Кроме того, полученные антисыворотки были использованы для разработки аналитических тест-систем и создания на их основе наборов реактивов для иммуноферментного анализа инсулина, тироксина, трийодтиронина, тироксин-связываюцего глобулина, кортизола и прогестерона. Научная технология получения антисывороток с улучшенными аналитическими параметрами может быть использована при разработке любых иммунохимических методов исследования.

Отечественные радиодиагностические наборы были внедрены в клиническую практику путем определения с их помощью концентраций регуляторных белков и основных гормонов с целью диагностики, контроля за эффективностью терапии и изучения патогенетических механизмов развития различных заболеваний На основе

использования РИА получены новые данные, которые раскрывают патогенетическую роль нарушений гормонального гом'еостаза при

патологии, связанных с клиническими проявлениями и давностью заболевания. Расширено и углублено представление о роли гонад, коры надпочечников и щитовидной железы в развитии РА - заболевания аутоиммунного генеза, что подтверждает взаимодействие и участие иммунной и эндокринной систем в .патогенезе этого заболевания. Выявление и учет особенностей функционального состояния изучаемых эндокринных желез позволяет более полно охарактеризовать гормональный гомеостаз при патологическом процессе и проводить целенаправленную терапию, воздействуя на определенные механизмы как на органном, так и на клеточном уровнях.

С помощью нагрузки АКТГ определены принципы оценки особенностей нарушения гормонального гомеостаза, созданы предпосылки для более полного представления о характере патологического процесса, что дает возможность с большей долей вероятности решать вопросы целесообразности применения того или иного лечебного препарата.

Работа ориентирует практических врачей на необходимость учитывать развитие различных эндокринных нарушений, особенно со стороны щитовидной железы, коры надпочечников и половых желез, и исследовать эндокринный статус для осуществления целенаправленных лечебных мероприятий. Некоторые показатели функционального состояния эндокринных желез (концентрации кортизола, тироксина, трийодтиронина, тиреотропина) могут быть использованы как дополнительные дифференциально-диагностические и прогностические признаки развития РА. Обнаружение нарушений гормонального гомеостаза, коррелирующих с клинической картиной процесса, в известной мере, определяет прогноз заболевания и позволяет дать научно-обоснованные рекомендации по тактике применения

сомплекскых мероприятий, для-предупреждения и устранения подобных ;арушений методами коррегирующей терапии, в том числе и ормональными препаратами.

В работе обосновано использование РИА для изучения •ормокального гомеостаза при патологии на примере РА с целью (иагностики, контроля за течением заболевания и эффективностью [роводимой терапии, а также для прогнозирования исхода болезни. ) с н о и н ы е положения, выносимые на защиту: • Разработка научных основ и- биотехнологии получения высокоаф-фиьных и специфичных антисывороток, пригодных для целей радио-имуноанализа регуляторных белков, белково-пептидных, стероидных и тиреоидных гормонов с целью использования их в качестве компонентов отечественных серийно выпускаемых радиодиагностических наборов. - Возможность использования РИЛ для:

- оценки особенностей функционального состояния и резервных возможностей гормональных систем при патологии;

- обнаружения изменений гормонального гсмеостаза, обусловленных нарушением секреции и метаболизма гормонов и дезинтеграцией деятельности эндокринных желез;

- выявления важности взаимоотношений между функциональным состоянием эндокринных желез и клиническими проявлениями, тяжестью и сроками заболевания;

- оценки эффективности проводимой терапии, в том числе и гормонотерапии;

- установления патогенетической роли функциональной дезинтеграции гормонального гомеостаза при патологии.

Апробация основных результатов. Материалы исследований

докладывались и обсуждались иа: Международно] симпозиуме стран - членов СЭВ по радиофармпрепаратам и РИА-наборам (Шверин, ГДР, 1983; Обнинск, 1986; София, 1989), Международном симпозиуме "Химия и биохимия пептидно-белковш гормонов" (Суздаль, 1985); YII Всесоюзном симпозиуме по хими! белков и пептидов (Таллинн, 1987); Республиканской конференции эндокринологов (Вильнюс, 1987); Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы в биохимической и иммунологической диагностике" (Москва, 1989); I Всесоюзном съезде иммунологов (Сочи-Дагомыс, 1989); XXYI Международном симпозиуме по ядерной медицине (Лейпциг, 1989); Всесоюзных координацинационных совещаниях по РИА-наборам (Минск, 1982,1984; Каунас, 1986; Обнинск,1989); Республиканском обществе эндокринологов (Минск, 1990); I иммунологическом съезде Белоруссии (Минск, 1990); III Европейском симпозиуме по комплементу (Братислава, 1990); Межинститутском семинаре по технологии РИА-наборов (Прага, 1990); Республиканском съезде акужеров-гинекологов (Минск, 1990); Всесоюзном симпозиуме "Иммунобнотехнология-91" (Сочи-Адлер, 1991); YII Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология* (Москва, 1991); Европейском конгрессе ядерной медицины (Амстердам, 1990; Вена, 1991). Публикации. Основное содержание исследований отражено в

46 опубликованных работах и 10 авторских свидетельствах СССР. За работу "Создание научных основ, разработка технологии, организация опытного- производства и внедрение в практику здравоохранения радиоднагностических наборов" (совместно - Ахрем А.А.,Аметов A.C., Касаткин D.H., Стрельченок O.A., Чащин В.Л. и др.) присуждена Государственная премия Белорусской ССР в области науки и техники 1988 года.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для решения поставленных задач были проведены исследования на экспериментальном и клиническом материале.

Получение иммунных сывороток к белково-пептидным, стероидным и тиреоидным гормонам и другим биорегуляторам проводили путем иммунизации экспериментальных животных - кроликов и. морских свинок, по разработанным нами оригинальным схемам. Создание научно-обоснованной методологии получения антисывороток, пригодных для целей РИА, представляло собой отдельную задачу,реализация которой описана нами в разделе 3.1.

Качественную и количественную сценку получаемых в динамике иммунизации антисывороток проводили путем определения основных аналитических параметров антител таких, как аффинность, специфичность н титр. Специфичность (кросс-реактивность), характеризующую способность антисыворотки различать соединенно, против которого она получена, в присутствии структурных аналогов, определяли как процентное соотношение основного и структурного аналогов, вызывающее сннЕение связывания метки на 50% (АЬгаЬаш Е., 1969). Аффинность антител, отрадающую степень сродства антител к антигену н характеризующую силу связи между активным центром антител и антигенной- детерминантой, оценивали путем определения константы ассоциации (Чард Р., 1981). В данном случае константа характеризует усредненный аффинитет антисыворотки с гетерогенными популяциями антител. Для исследований отбирались аитисыворотки, ямеющие значение константы в пределах 109-10^ л/моль , что позволяло доводить чувствительность анализа до 10Г9-1(Г*12 моль/л. Гитр антисыворотки определяли как наибольшее ее разведение,

которое способно связывать в условиях радиоиммуноакализа 51 фиксированного количества меченного радионуклидом антиген; Антисыворотки, удовлетворяющие требованиям РИА, были использова: как компонент для разработки и серийного выпус: радиодиагностических наборов.

Изучение возможности использования РИА для оценки гормональной гомеостаза при патологии проводили на примере РА - системно! заболевании аутоиммунной природы. Выбор этой формы патологии бы. не случаен. С одной стороны, сообщения о функциональном состояни! эндокринных желез при РА единичны, по существу ье изуче! гормональный гомеостаз при этом заболевании, отсутствуют данные < степени и характере функционирования измененных эндокринные органов в зависимости от клинической симптоматики заболевание (Беневоленская Л.И. и др., 1984), а с другой стороны, изучени< патогенеза ревматических заболеваний, в ток числе и РА, приобрелс особую актуальность и социальное значение в силу высоко! инвалидизации и смертности при них.

Клинические исследования были проведены в кардиоревматологиче-ской клинике Белорусского Государственного Института усовершенствования врачей. Обследовано 60 женщин, больных РА, в возраск 45-65 лет (в постменопаузе), 40 женщин (45-65 лет), больных прогрессирующим деформирующим остеоартрозом - ПДО (группа сравнения] и 15 здоровых женщин того же возраста (контрольная группа), з которых не выявлены отклонения в состоянии здоровья. Выбор тако» возрастной категории был обусловлен тем, что несмотря на то, чтс пик заболеваемости РА приходится на возраст 20-45 лет, нередкс впервые эта тяжелая инвалидизирующая болезнь возникает у ли! пожилого возраста. Однако, особенности гормонального гомеостаза 1

этой возрастной_______группы—~ больных, особенно у женщин в

постнекопаузе, практически не изучены (Довганский Л.А., 1986). хотя это принципиально новое состояние гормонального гомеостаэа без циклических изменений в функционировании эндокринных желез. В то же время изменение демографического состава населения определяет актуальность геронтологических аспектов ревматически* заболеваний (Еров и др. 1983; Мазнева Л.К. и др., 1987).

Достоверность диагноза и активность патологического процесса определяли с ломояью критериев, разработанных в Институте ревматизма АМН СССР. Обследуемые больные РА имели различные сроки заболевания (до 2-х лет - 11, от 2 до 5 лет - 14, более 5 лет - 20 человек), I и II степень ( 26 и 19 больных соответственно) функциональной недостаточности суставов (ФНС), а также I-III степени активности процесса (I степень - 15, II - 10, IIJ -20 человек). Большая часть обследуемых (45 больных) била подвергнута традиционной противовоспалительной терапии (индо-метацин по 100-150 мг/сутки), а остальные 15 человек - гормонотерапии (предниэолон по 30-35 мг/сутки) в течение двух недель. При этом были отобраны лица, которые до поступления в клинику, как минимум, месяц не получали гормональных препаратов.

Изучение особенностей функционирования гонад, корк надпочечников и системы " гипофиз-дитовидная железа" у всех обследуемых лиц проводили с помощью острой Фармакологической пробы адре-иокортикотропным гормоном - АКТГ как до, так и после лечения. Выбор данного препарата был обусловлен тем, что он обладает специфическим действием на эндокринные системы, "что позволяет при остром применении оценить чувствительность рецепторного аппарата и Функциональные резервы как отдельных эндокринных желез, так и

гормональных систем в целом (Dickatrein G. et al., 1991). Во время проведения нагрузки за сутки до исследования больные не принимали других лекарственных препаратов. АКТГ (суспензия цинк-кортикотропина Каунасского завода эндокринных препаратов) вводили по 40 ед. внутримышечно. Кровь для исследования забирали из вены до и через 1 час после введения препарата. Функциональное состояние эндокринных желез оценивали путем определения в сыворотке крови концентраций следующих соединений: прогестерона, тестостерона, эстрадиола, эстриола, кортизола, тироксина, трийодтиронина, тиреоглобулина, тироксинсвязывающего глобулина, с помощью радиодиагностических наборов производства Института биоорганической химии АН Беларуси (Минск). Концентрацию тирео-тропного гормона (ТТП контролировали при помощи набора реактивов Фирмы Cis-International (Франция). Гормональные обследования проводили при поступлении в стационар и перед выпиской после проведения курса лечения (до и после пробы с АКТГ). Кровь для этих целей у всех обследуемых лиц забирали утром натощак в охлажденные пробирки. Образцы крови отстаивали в течение 30 мин при +5 - +8°С в холодильнике для образования сгустка. Полученную сыворотку отделяли от сгустка и центрифугировали при 3000 об/мин при 0°С 10-15 мин. Определение ТТГ проводили в плазме крови. Для получения плазмы к образцам крови добавляли ЭДТА (1мг/мл), тщательно перемешивали, центрифугировали в тех же условиях, надосадочную жидкость (плазму) отсасывали. Образцы сыворотки и плазмы хранили при -20°С в пластиковых пробирках с пробками.

Результаты всех исследований были подвергнуты статистическому анлизу на персональном компьютере с помощью программы "Stat-graf.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1.ПОЛУЧЕНИЕ АНТИСЫВОРОТОК ДЛЯ РАДИОИММУНОАНАЛИЗА

Широкое внедрение РИА в практику здравоохранения сдерживалось цо последнего времени не только отсутствием в стране производства радиодиагностических наборов для анализа различных биорегуляторов, но к отсутствием научных разработок, направленных на создание соответствующих технологий. С целью ликвидации зависимости отечественного здравоохранения от импорта РИА-наборов в Институте биоорганической химии АН Беларуси были созданы научные основы, разработана технология и организован опытно-промышленный выпуск радиодиагностических наборов. Для выполнения этой задачи было важно разработать методологию получения антисывороток, пригодных для РИА регуляторных белков, опухолевых маркеров, белково-пептидных, стероидных и тиреоидных гормонов и на их основе создать аналитические тест-системы, а затем организовать промышленный выпуск радиодиагностических наборов.

Специфические антисыворотки являются основным компонентом любой системы иммуноанализа, а характеристики используемых антител, такие как специфичность и аффинность, во многом предопределяют основные параметры разработанных на их основе аналитических тест-систем. Получение антисывороток для целей РИА представляет собой достаточно сложную задачу, успешное решение которой зависит от природы и свойств иммуногена, вида используемого адьюванта, схемы иммунизации, способа введения антигена, его оптимальной дозы и т.д. Многочисленные литературные сообщения, в основном, сводятся к описанию успешных примеров в получении антител против того или иного антигена, а различия при экспериментальном сравнении методик

между собой, как правило, пытаются объяснить различиями в индивидуальном ответе иммунизируемых животных (Lader S., 1979). Задачей наших исследований было:

■ разработать эффективные схемы иммунизации животных для получения антисквороток к некоторым белковым антигенам (инсулину, Ферритину, тироксинсвязыьаюяему глобулину - ТСГ, раково-эмбрк-ональному антигену - РЭА, плацентарному лактогену - ПЛ, бета-2-микроглобулину, тиреоглобулину - ТГ) и гормонам стероидного (кортизол - К, прогестерон - П, тестостерон - Т, эстрисл - Е2, эстрадиол - ЕЗ) и тиреоидного (тироксин - Т4, трийодтиронин -ТЗ) профиля с улучшенными аналитическими параметрами с целью использования их для разработки соответствующих РИА-наборов;

- изучить зависимость параметров антисывороток от природы, свойств, дозы и способа введения иммуногена, вида используемого адьюванта, схемы и продолжительности иммунизации;

- оценить основные параметры антисывороток в динамике иммунизации и пригодность их для целей радиоиммуноан&лиза.

Результаты многолетней экспериментальной работы по получению специфических антисывороток, пригодных для РИА белково-пептидных, тиреоидных н стероидных гормонов, опухолевых маркеров и регу-ляторных белков, позволили нам провести анализ закономерностей и Фактов, влияющих как на процесс образования антител, так и на их аналитические параметры (ПивеньН.В., 1986).

Иммуногек. Основным критерием при использовании антисыворотки в любом имкунохимическом анализе является ее специфичность. Этот параметр связан прежде всего с химической чистотой иммуногена, который до сих пор не получил однозначного толкования. С одной стороны, существование примесей

в препаратах- антигена вызывает появление неспецифических антител, а, с другой стороны, каждая новая стадия очистки может приводить к химическим изменениям в молекуле антигена, следствием чего будет выработка антител новой специфичности, которые на большей или меньшей протяженности перестают узнавать свой антиген (Hum В., Chanter S., 1981). Рис.1 демонстрирует возможность получения противоинсулиновых антител с улучшенными аналитическими параметрами при использовании препаратов высоко-очищенного инсулина, полученного с помощью разработанного нами метода (А.С.СССР N1290585). Как видно, аналитические параметры антисыворотки при использовании иммуногена высокой степени чистоты существенно лучше, несмотря на то, что многие авторы считают, что высокоочищенный инсулин менее иммуногенен

(Schlienhkrull I., 1977).

Титр АС 200 ООО

?0 ООО

50 ООО 30 ООО

10 000

ад ^ШТИП-ЧК Перекрестная рсш^ция АС % ч " асс ^/мшп.

.MjiuHiu: blWMiruii 1.-ие;пт.д

□ И,'J 0,0b l.CxlO11

Щ 9,0 0,3 0,05 ' ,02xI0J1

После I никла Среду.у.у. титр Максимальный титр

inc.I.Основные аналитические параметру аятисывороток (АС), полученных с использованием раагачиых препаратов инсулина | | - шсокоочищешшй ннсулин

ЯИВ - монокомлоиентный тсулин i+иокноовмениая хр.)

Высокая специфичность иммунных сывороток получена нами при использовании максимально очищенных препаратов других белковых антигенов - ПЛ, ТСГ, РЭА и ТГ. Высокая степень чистоты иммуногена, на наш взгляд, позволяет не только исключить перекрестные реакции антисыворотки, но и (даже в тех случаях, когда кроссреактивность не важна) избежать антигенную конкуренцию, которая может препятствовать образованию некоторых специфических антител.

Иммуногенность - способность антигена вызывать продукцию антител или другие иммунные реакции, находится, как правило, в прямой зависимости от их молекулярной массы. Вещества с молекулярной массой менее 800 (к ним, в частности, относятся стероидные и тиреоидные гормоны) вообще не иммуногенны, однако, становятся таковыми после присоединения их в качестве гаптенов к более крупным молекулам, например, высокомолекулярным белкам. Трудность получения антител к ним связана с тем, что эти соединения часто являются обычными для организма метаболитами, не имеющими ни видовой специфичности, ни собственной ииммуно-генности. Кроме того, низкое содержание их в биологических жидкостях, а также наличие большого числа структурно-родственных соединений предъявляет особые требования к аффинности и специфичности получаемых антисывороток. В качестве имиуногенов нами были использованы коныогаты стероидных и тиреоидных гормонов с белками-носителями (человеческим - ЧСА, или бычьим сывороточным альбумином - БСА) с различной плотностью посадки гаптена на молекуле носителя. Иммуногенность коньюгатов "гаптен-носитель" зависит от положения и стереохимии гаптена (именно эти факторы предопределяют специфичность получаемых антител); молярного соотношения гаптен-носитель, типа и длины мостика между носителем

и Лптеном, природы и свойств носителя; ~ способа химического присоединения гаптена к молекуле носителя; способа и продолжительности периода иммунизации.

До сих пор не установлена четкая корреляция между молярным соотношением компонентов коныогата и специфичностью, активностью и аффинностью получаемых антител. Некоторые авторы считают наиболее эффективным молярное соотношение гаптен:носитель 12-30 : 1 (Haegele TL, Grohovsky М.,1980), другие -1:1 (Giovannini Е. et al., 1982). Нами разработан метод получения антисывороток с улучшенными аналитическими параметрами к стероидным и тиреоидным гормонам, при котором при иммунизации были использованы конъюгаты этих гормонов с белками с высокой (30-50 моль на 1 моль белка) эпитопной плотностью посадки ( A.C. N1264428), и тем самым показана возможность использования высоковалентных коньюгатов для получения антисывороток к гормонам.

Второй аспект этого вопроса связан с выбором носителя для коныогирования его с гаптеном, который сам бы вызывал наиболее эффективно иинтенсивный синтез антител у данного вида животных. Нами разработан новый способ получения антисывороток к гормонам стероидного и тиреоидного профиля (А.С.СССР N1264428), отличительной особенностью которого является применение чередующихся введений гормонов, коньюгированных с различными белками-носителями (ВСА, ЧСА) в сочетании с высокой валентностью коныогата, результатом чего явилось получение высокоактивных антисывороток, обладающих высокой аффинностью (константа ассоциации не ниже 1x10 9 л/моль) и специфичностью (табл.1), й наконец, третий аспект - способ химического соединения гаптена с носителем, который существенно влияет на иммуногенность коныогата.

Таблица 1.

Процент перекрестной реакции антисывороток со структурно-родственными соединениями

% перекрестной реакции Стероид собственные литературные

результаты данные

Антисыворотка к прогестерону К^ая М. et а1.,1972

Прегненолон 5,4% не опред.

5-прегнан-З,20 дион 10,3 31%

17-оксипрогестерон 0,9 3

11-дезоксикортикостерон 0,3 2,3

кортикостерон 0,1 0,8

11-дезоксикортизол 0,1 не опред.

кортизол 0,01 0,01

тестостерон 0,01 0,01

зстрадиол 0,01 0,01

эстриол 0,01 0,01

Антисыворотка к тестостерону Нозойа Н. еЬ а1.,1979

Дигидротестостерон 20% 64%

Дигидроэпиандростерон 0,1 0,03

Андростендиол 0,5 3,8

Андростендион 3 2,6

5- андростан-3,17 дион 3,3 4,5

Андростерон 0,16 1,1

11ис1ег Н. et а1.,1972

Антисыворотка к кортизолу ОезИ I* . еЬ а1., 1975

11-дезоксикортизол 15% 100%; 3,8%

кортикостерон 0,01 46 12,5

прегнилолон 31 64,0

прогестерон 1 28 0,001

11-оксикортикостерон 1 46 12,5

тестостерон 0,1 13 0,001

Сравнительный-анализ-результатов по получению антипрогестероновых иммунных сывороток с помощью коныогатов, в которых связь с гаптеном осуществлялась через СЗ- и Cll-положение, показал, что специфичность антител была выше при использовании коньюгатов через положение С11(табл.2). В этом положении молекула стероида удалена на длину четырех углеродных атомов, а по мнению (Snippe Н. et al., 1975) связь гаптена с носителем через короткий химический мостик приводит к получению более специфических антисывороток.

Часть наших экспериментов была связана с изучением влияния дозы иммуногена на динамику продукции и характеристики антисывороток, так как сведения по этому вопросу достаточно противоречивы, несмотря на их многочисленность (Herbest W. 1968, Hurn В. 1974, Lader et al., 1979, Miles L. et al., 1974 и др.). Параллельная иммунизация кроликов разными дозами РЭА (10 и 100 мкг) показала, что доза 10 мкг недостаточна для стимуляции удовлетворительного иммунного ответа: кролики продуцировали антитела с титрами в 4-5 раз меньшими по сравнению с животными, которым антиген вводился в дозе 100 мкг (табл.3). Применение больших доз не приводило к повышению эффективности результата. Получение хороших результатов при еженедельном введении иммуногена в больших дозах следует рассматривать как описание в литературе успешных примеров, но, в целом, такой подход не может быть рекомендован. На наш взгляд, эффективная доза, как правило, ниже общепринятой и для кроликов и морских свинок равна 100 мкг на первое введение, что согласуется с мнением Miles L. (1974). Последующие введения антигена предусматривают использование доз, равных половине первоначальной. Использование слишком высоких и слишком низких

доз нежелательно не только потому, что может вызвать состояние толерантности у животных, но и потому, что может приводить к продукции антител с низкой аффинностью в силу стимуляции -лимфоцитов, несущих низкоаффинные рецепторы (Green I. et. al., 1969).

Таблица 2

Сведения по специфичности антитестостероновых антител, продуцируемых на коньюгаты, полученные путем модификации различных положений стероидной молекулы (коньюгат 1 - Зье положение; 2 - 20ое; 3-4 - бое; 5 - 7ое; 6-7 - lloe, молекула стероида удалена надлину четырех углеродных атомов).

исслЕдтшй СТЕРОИД СПЕЦИФИЧНОСТЬ /ШТИП2Л В %

1 2 3 ^ 5 6 7 -г

ПРОГЕСТЕРОН 100 100 100 100 100 ISO 100

5^-ПШтВДЮН - 3,20 51 57 67 38 II 27 5.4

5ß - ПРЕГНШИОН - 3,20 В,5 12 0.4 15 2 20 -

3«¿-ОКСИПРЕШ2Н - 5-0Н-20 7,3 9 13,6 II 4 0,6 0,2

горжешитн - 4-ОН-З 1.5 I О.И 1,5 I 0,25 3

И-ДЕЭОКСИКОРШОСТЕРОН 4,7 3 0,62 2 2 1.5 -

17 Л -ОКСИПРОГЕСТЕРОН - - 0.16 . 4 5 2,3 0.9

ТЕСТОСТЕРОН 0.2 0,2 0.3 0,2 - 0,3 0.1

КОРТИКОСТЕРОН .0,2 0.2 0.3 - 0.3 0,2 0.1

ЗСТРАЛИОЛ 0.2 0,2 0.3 ОД 0.3 0,2 0.1

ЭСТРОН 0,2 0,2 0.3 0,1 0.3 0,2 0,1

ЭСТРИОЛ 0.2 0,2 0.3 од 0.3 0,2 ОД

А д ъ ю в а Н-Т. Нами -изучено" сравнительное действие адъювантов различной природы - неспецифических стимуляторов иммунных реакций - на аналитические параметры и динамику продукции антител. Особый интерес представляло изучение использования препаратов микробных клеток в качестве

адъювантов. описана эффективность применения коклюшной моновакцины (ЪоЫегеПа рег"1изз!з ) при получении антисывороток к стероидным и гипофизарным гормонам (УаИикаИЛа I. е1:.а1., 1977).

Таблица 3.

Зависимость аналитических параметров АНТИ - РЭА ' от

иммунизируемой дозн антигена

Иббявяувмыв параме тры Доза антигена,гр

*итр антисыворотки, вызывающий ¡0$ связывание 125-1-РЭА I : 45000 I : 10 000 I : 65 000

'абочее разведение аяти-РЭА ; радаоишунологической тест- :истоме I : 150 000 I : 40 000 I : 250 000

[онстанта ассоциации, л/моль 1,02х1010 1,08хЮ10 1,35хЮ10

:росс - реактивность сЫСА, % I I I

1ремя достижения максимального 'итра, мае. б " ! 4

Таблица 4. Процент выхода антисывороток с различными значениями титров, полученных при использовании полного адюванта Фрейнда и коклюшной моновакцины (Bord pertussis).

Анти- Титр сыворотка

ПАФ B.pert.

АНТИ-ПЛЧ

>1:1000 ->1:2000 66,6 >1:4000 33,3

33,3 33,3 33,3

>1:40000 33,3 -

>1:80000 16,8 33,3

АНТИ- >1:120000 8,3 66,6

РЭА >1:160000 8,3 -

>1:180000 25

>1:300000 8,3 -

АНТИ-

Т-3-

БСА

до1:30000 >1:30000 >1:60000 >1:120000

60 20

60 30 10

Изучение аналитических параметров антител к целому ряду белковых антигенов и гаптенов, полученных по предложенной методике, показало, что не всегда очевидны преимущества использования коклюшной

моновакцины (табл. 4, 5). В серии наших экспериментов при получении антисывороток к различным антигенам мы применили введение низких доз иммуногена в сочетании с вакцинами типа АКДС и БЦШ, что оказалось не менее эффективным, чем многократная иммунизация с применением полного адьюванта Фрейнда (табл. 6). Важно и соотношение объемов антигена и адьюванта при проведении иммунизации. Рис.2 на примере получения антител к тестостерону демонстрирует результаты применения 2-х объемов ПАФ на один объем водного раствора антигена, которое оказалось

более эффективным, чем общепринятое соотношение 1:1.

Таблица СПЕЦ И Ф И" Ч НОС Т Ь АНТй - Т - 3 БСА

( процент перекрестной реакции с дигидротестосгероном)

ЦИКЛЫ ИММУНИЗАЦИИ

Вид адьюванта I II III 1У У

ПАФ 31 27 33 29 36

f>&ziu$s/s 31 21 22 34 48

Таблица 6.

Зависимость титра анти-ТГ от вида и объема используемого адьюванта

Вид Число Продолжительность иммунизации, мес.

адьюванта введений -------------------------------------

адьюванта 1,5 5 6,5

ПАФ 1:1 5 1 : 10000 1: : 60000 1 :60000

ПАФ 1:2 3 1: : 15000 1: : 100000 1: : 100000

ПАФ + БЦЖ 1 1: :20000 1; : 100000 1 : 100000

ПАФ+БЦЖ+АКДС 1 1; :40000 1: :150000 1. : 150000

Наш многолетний опыт работы с веществами различной природы доказал преимущества использования сочетаний различных адьювантных систем: полного (неполного) адьюванта Фрейнда и вакцин типа БЦЖ, АКДС, b.pertussis; адьюванта Фрейнда и гидроокиси алюминия;

Pit.3 ixmtmcni ¿»рактврястхжх «и-мотмирои-З-ВСЛ MSuan/Iuan) оря испольэомюш (шпш да» полного мшюята tpalma (tut)

— — — — - *Г » ПЛ» I : S. И- «6

Гпафпнп ипсшнрого»

(xpocc*p*»T»nootb СИГ )

Коютштк асоошап I - 0,5 х 10»

г - 1.6 х 10®

3 - I.X х I09

4 ~ 6,i X I09

5 - 0.« х 10* в - S.J х К?

таят

< s

п.

чередований введений иммуногена, иммобилизованного на сефарозе, активированной бромистым цианом, с введением антигена на гидроокиси алюминия и т.д. ( A.C. СССР N1349046; А.С.СССР N1324134). Однако, немаловажным обстоятельством на пути получения хороших результатов являются и индивидуальные особенности животных. Иммунореактивность животных генетически детерминирована (Петров Р.В. и др., 1983), поэтому животных с неудовлетворительными характеристиками получаемых антител следует выводить из эксперимента. Однако, такое решение в некоторых случаях можно принять лишь через несколько месяцев иммунизации, так как "трудные" иммуногены иногда не сразу вызывают интенсивный иммунный ответ, а хорошие продуценты антител могут быть затем не лучшими.

Режим иммунизации. Процесс получения специфических

иммунных сывороток к веществам различной природы включал следующие этапы: иммунизацию животных,

контроль аналитических параметров антител в динамике иммунизации, анализ и выбор антисывороток, удовлетворяющих требованиям РИА.

Для получения специфвдеских антисывороток к белковым антигенам нами были использованы различные схемы иммунизации, которые различались между собой дозой, способом и местом введения антигена, типом адьюванта, длительностью процесса иммунизации. Перед иммунизацией обязательно проводили иммунохимическую идентификацию каждого антигена методом антигенного анализа с помощью стандартных (контрольных) тест-систем (рис.3).

Рис.-З ', Иммунохимическая идентификация препаратов инсулина (методом преципитации в агаре с использованием тест-системы к инсулину)

1.4 - антиген (инсулин) тест-системы,

2.5 - анализируемый препарат инсулина,

3.6 - физиологический раствор,

7 - антисыворотка к инсулину Чантитело тест-системы)

Для низкомолекулярных соединений в ходе предварительных экспериментов по иммунизации кроликов коныогатами стероидных и тиреоидных гормонов устанавливали оптимальную плотность посадки каждого гаптена на молекуле белка-носителя. Проведен сравнительный анализ свойств антисывороток, получаемых в результате иммунизации животных конъюгатами с различной эпитопной плотностью посадки гаптенов. Показано, что плотность посадки гаптенов на

белках-носителях существенно влияет не только на процесс количественного накопления антител, но и на процент перекрестных реакций со структурно-родственными соединениями. Отличительной особенностью получения антисывороток к низкомолекулярным гормонам явилось чередование в процессе иммунизации двух различных коныо-гатов: гаптен - БСА и гаптен - ЧСА, что позволило эффективно влиять на динамику продукции и аналитические параметры антител. Результатом экспериментов явилась разрабстка оптимальных схем иммунизации для получения высокоспецифичных и высокоаффинных иммунных сывороток. В качестве примеров приведем некоторые из них. Антисыворотка к инсулину. Разработан метод

получения антисыворотки против инсулина, отличительной особенностью которого является использование при иммунизации морских свинок чередования двух депонирующих соединений: инсулин - ПАФ и инсулин-бром-циан-сефароза или инсулин - гидроокись алюминия (А.С.СССР N1349046). Такой методический подход позволил получить антисыворотки с улучшенными аналитическими параметрами: перекрестная реакция с про-инсулином - не более 10%, глюкагоном - 0,3%, С-пептидом - 0,05%; константа связывания - 1,02 - 1,73 х 1012 л/моль. Титр антисыворотки после первого цикла иммунизации был в пределах 1:20000 -1:30000, через 6 месяцев - 1:60000 - 1:80000, а через 10-12 месяцев - 1:100 000 - 1:200000, что позволяло в радиоиммунологической тест-системе доводить разведение антисыворотки до 1:400000 - 1:1000000 (Пивень Н.В. и др., 1986).

Антисыворотка к РЭА. При использовании традиционных методик для получения антител к высокомолекулярным антигенам на полный цикл затрачива-

ется, как правило, несколько-миллиграммов антйг-ена. Разработанный нами метод предусматривает однократное внутрикожное введение кролику 100 мкг антигена, эмульгированного в ПАФ. Одновременно животному вводится подкожно вакцина БЦЖ и коклюшная моновакцина (А.С. СССР N 1361763). В результате была достигнута существенная экономия дефицитного антигенного материала и получены высокоаффинные специфические антитела. Процент перекрестной реакции с неспецифическим кросс-реагирующим антигеном (ПСА) был равен 1%; величина константы связывания - 1х10*0 л/моль; титр антисыворотки через 21 день после начала иммунизации составлял 1:25000,через 3-4 месяца - 1:60000, что -позволяло в радиоиммунологической тест-системе использовать антисыворотку в разведении 1:200000 -1:250000 (Пивень Н.В. и др., 1986).

Антисыворотка к ПЛ. В качестве антигена использовали препараты высокоочищенного гормона, полученного из аммоний-бикарбонатного экстракта плаценты (Пивень Н.В. и др., 1989). Была разработана эффективная схема иммунизации, сущность которой состоит в многократном введении ПЛ в дозе 100 мкг на каждое введение. Полученные антитела были ковалентно иммобилизованы на белке А золотистого стафилококка на основе его способности связываться с Рс-фрагментом антител. Изучена возможность использования иммобилизованных таким образом первых антител в РИА. Такой методический подход позволил сократить время анализа, исключив стадию применения специального сепарирующего агента, увеличить достоверность результатов и упростить процедуру самого анализа (Пивень Н.В. и др., 1988). Специфичность анализа в системах с применением антител в гомогенной среде и антител, иммобилизованных на белке А, была

сопоставима: форма калибровочного графика, положение стандартных точек на нем, а также определенные концентрации ПЛ в контрольных сыворотках свидетельствуют о. том, что иммобилизованные на белке А

антитела могут быть применим^ для радиоиммуноанализа ПЛ (рис.4).

I «до »

аз

■к 60

Ко нт род шд Сврвмд#ммм докцвнтшм. т/л

7.5 в : 0.4

20 19 * 1.1

75 70 * 3.5

Рис. 4.. Калибровочный график в координатах

с использованном иммобилизованных на белке А антител к ПЛ.

Вставка - определение различных концентраций 11Л в контрольных сыворотках

Антисыворотка к феррит ину получена путем

иммунизации кроликов препаратом высокоочищенного ферритина, выделенного из селезенки человека. С целью повышения специфичности полученных антител были проведены хроматография иммунной сыворотки на ферритине, ковалентно связанного с сефарозой, после чего адсорбционная хроматография на гранулированном полиакриламидном носителе для удаления примесных продуктов кислотной деструкции ферритина (А.С.СССР N 1503508). Такой методический прием позволил при создании иммунорадиометрической. аналитической системы уменьшить время анализа, сохранив его чувствительность, точность и достоверность.

А н тисыворотка к гормонам. В качестве иммуно-

генов были использованы конъюгаты стероидных и тиреоидных гормонов с белками-носителями (ЧСА или ВС А) с различной плотностью посадки г-аптена на носителе.

Разработан способ получения антисывороток к стероидным и тиреоидным гормонам, отличительной особенностью которого является применение чередующихся введений гормонов, конъюгированных с различными белками-носителями (ЧСА и БСА) с высокой эпитопной плотностью (А.С.СССР N 1264428). Ниже на примере конъюгата тироксин-белок приведена типичная схема получения антисыворотки к тиреоидным и стероидным гормонам (табл.7). В некоторых случаях, в частности, при получении антисыворотки к кортиэолу был применен новый методический прием, суть которого состоит в том, что одновременно с первым введением конъюгата кортизол-З-карбо-ксиметилоксин-ВСА проводили подкожную инъекцию адсорбированной вакцины КДС в качестве неспецифического стимулятора иммуногенеза, а весь процесс иммунизации состоял из двух введений иммунсгека с интервалом между ними 10 недель (А.С.СССР N1324134). В результате разработанных методов существенно улучшены такие аналитические параметры антисывороток, как специфичность и связывающая активность. Сведения по специфичности антисывороток к стероидным гормонам приведены в таблице 1. Величина константы связывания для антисывороток к гормонам была в пределах 1-2 х 10.9 л/моль. Титр антисывороток для разных видов антисывороток колебался от 1:20 000 до 1:100 000. В частности, титр антител и тироксину в 3 раза, а к трийодтиронину в 2,5 раза, а конечное разведение антисы^вороток к прогестерону в аналитической системе в 17 раз, к тестостерону в 3-4 раза были выше по сравнению с описанным в литературе.

Таблица 7.

Схема иммунизации кроликов коньюгатом тироксин - БСА (ЧСА)

Цикл Способ Антигенный материал Доза

иммунизации Белок- Плотность по- Физио- Адыовант вводи-носи- садки гаптена логичес- Фрейнда, мого тель на белке кий раст- мл конью-

моль/моль вор, мл та, мг

В подушечки лап БСА 30- -50 0,5 0,5 1

Интервал 12-24 дня

В подушечки лап ЧСА 30- -50 0,5 0,5 1

I Интервал 12 дней

Внутрикожно во ЧСА 25- -30 0,5 0,5 1

множество точек

спины и шеи

Интервал 40 дней

II, Подкожно и внут- БСА 25- -30 0,2 0,2 0,5

IY, рикожно во мно-

и жество точек спины

т.д.Интервал 40 дней

III, Подкожно и внут- ЧСА 25- -30 0,2 0,2 0,3

У и римышечно (бедро,

т.д. подколенная область)

Оценка аналитических параметров антисывороток. Антисыворотки, предназначенные для

РИА, тестировались по трем основным

параметрам: специфичность, аффинность и титр. Важность перечисленных параметров антисыворотки очевидна при создании радиоиммунологических тест-систем. Недостаточная специфичность делает антисыворотку совершенно непригодной даже при наличии высокого титра и хорошей аффинности. В свою очередь, низкие значения

константы связывания не позаоля^ог приненять антисыйоротку" для создания радиоиммунологической системы.

Изучение перечисленных параметров позволило сделать еще один важный вывод: значения специфичности, аффинности и 'титров антител меняются в динамике иммунизации (табл.8), что предъявляет особые требования к их контролю при каждом цикле иммунизации и очередном заборе крови. Чередованию высокой и низкой аффинности антител в течение периода иммунизации связывают с различиями в строении активных центров антител разных классов и подклассов иммуноглобулинов (ОивЬ ^Г.Е. е! а1, 1985). Хорошая специфичность антисыворотки, полученная в модельном эксперименте, не всегда может гарантировать высокую специфичность аналитической системы в целом.

Таблица 8.

Аналитические параметры анти-кортизол-З-БСА в динамике иммунизации

Аналитические Продолжительность 'иммунизации , мес .

параметры . 6 8 10 12 14

Специфич- И-дезоксикортизол 37 29 17 22, 25

ность, % 17 -оксипроге стерон 0,1 0,8 0,1 0,5 0,1

кортикостерон 34 6 0,1 2 7

прогестерон 0,02 0,01 1,01 0,02 0,03

Константа ассоциации, л/моль х

108 8,8 2,9 1x109 1-,б 3,6

Титр 1:20000 1:32000 1:40000 1:6000

Таблица 9 демонстрирует аналитические параметры двух антисывороток к кортизолу и результаты теста "на открытие" различных концентраций кортизола, являющегося важным показателем пригодности антисыворотки для РИА.

Как видно из таблицы, несмотря на хорошую специфичность обеих антисывороток одна из них (И 216) завышает значение концентрации кортизола в контрольных сыворотках и поэтому непригодна для создания РИА-системы. Заключение о полной пригодности антисыворотки для каждой конкретной тест-системы можно сделать после оценки формы калибровочного графика и проведения теста "на открытие" различных концентраций анализируемого гормона в контрольных сыворотках в сочетании с изучением ее специфичности н аффинности.

Однако следует иметь в виду, что на результат определения аналитических параметров антител -большое влияние оказывает тип метки, используемый в тест-системе. Радиоактивные трепараты л'иганда будут существенно отличаться в иммунохимическом отношении в зависимости от того, содержат они внешнюю (йод-125) или внутреннюю (ЗН) метку. В качестве примера приводим значения

Таблица 9.

Спвцгфичвоогь, вффанносм л результаты теста ка открытие двух ангнсшзорото»: коргизол-З-БСА

ИЗУЧАВ'ЫЫЕ ПАРАМЕТРЫ 1НТИСИВ0Р0ТК£

* 214 Я 216

Специфичнее ть Ярэдаизмок 114 23

II- Двзокишзргизол 26 2

17 - Окшрогестерои 0,3 0.1

Кортюсостврон 6 12

Прогестерон 0,06 ОД

•Константа,л/иша 1,3 X 108' 1,7 х Ю8

Тест'на от Контрольные сшюротки 279 - 439 тюль/Л к р и г и в 300 583

709 - 1041пмодь/л 600 1172

специфичности актксывороток против кортизола и тестостерона (табл.10), оцененной с помощью ЗН и 1251. Титры антисывороток, определенные с двумя типами меток, также существенно различались: применение 125-йод-меток позволяло использовать антисыворотки в разведениях почти в 10 раз больших, чем для систем с ЗН. Таким образом, в результате выполнения серии экспериментальных

Таблица 10. ОЦЕНКА СПЕЦИФИЧНОСТИ АНТИТЕЛ

О ПОМОЩЬЮ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ МЕЧЕНОГО ЛИГАНДА

Кросс-реагирующее соединение, вид антисыворотки Процент перекрестной реакции

4Н

П-Дезоксккортизод (Анти-кор?изол-3-БСА) 6 8 I 4

51-Дигидротестоствро (Анти-тестостерон-3-БСА) 83 I 8

исследований разработаны новые эффективные методы получения антисывороток к регуляторным белкам, белково-пептидным, стероидным и тиреоидным гормонам с улучшенными аналитическими параметрами, пригодными для целей РИА этих соединений. На основе разработанных методов создана научно обоснованная биотехнология получения высокоспецифичных антисывороток для серийно выпускаемых радиодиагностических наборов 25 наименований.

3.2. РАДИОИММУНОАНАЛИЗ В ОЦЕНКЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ГОНАД И КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ

Участие половых гормонов и кортизола в развитии аутоиммунных заболеваний, в частности РА, представляет особый интерес, т.к. рядом авторов показано, что эти гормоны могут качественно и количественно влиять на уровни иммунорегуляторных реакций в организме (Ahmeds S., 1985) и оказывать иммуномодулирующее действие на аутоиммунные процессы (Talal N., 1987). В то же время немногочисленные опубликованные сведения по изучению функционального состояния гонад и коры надпочечников у больных РА являются достаточно разрозненными и противоречивыми: в одних случаях не обнаружено каких-либо различий при оценке андрогенного статуса у больных РА по сравнению со здоровыми лицами на фоне повышенного уровня кортизола (Spector T.D. et al., 1987); в других - приводятся данные об увеличении концентрации эстрогенов и снижении андрогенов (Lauman N.S. et al., 1986) или, наоборот, снижении уровня эстрадиола и повышении тестостерона (Chevallast М. et al.,1987); в третьих - высказывается мнение о защитной роли половых гормонов в развитии этого заболевания (Spector T.D. et al., 1989). Изучению состояния коры надпочечников посвящены лишь единичные исследования (Бабынина Л.Я., 1984; Потемкин В.В. и др., 1986; Шелихов В.Г., 1987; Gordon D. et al.,1988; Schatz H.,1988), в то время как широкое применение кортикоидных препаратов диктует необходимость изучения механизмов функционирования коры надпочечников при патологии. В связи с недостаточностью и противоречивостью литературных сведений нами изучена возможность использования РИА для оценки функционльного состояния коры надпочечников и

гонад у больных РА путем анализа концентрации основных половых гормонов (тестостерона, прогестерона, эстриола, эстрадиола) и кортизола до и после лечения и выяснена взаимосвязь его с клинической симптоматикой заболевания и видом проводимой терапии.

У больных РА базальный уровень прогестерона был повышен по сравнению со здоровыми лицами и составлял 1,182 ± 0.188 нмоль/л ( здоровые лица - И,62 1 3,04, Р<0.1 ) Концентрация тестостерона у этих же больных, наоборот, имела тенденцию к снижению и составляла 1,995 + 0,248 нмоль/л (здоровые - 2,48 ±0,5, Р>0,1), что на 19,6% ниже контрольного уровня. Концентрация эстрадиола достоверно не отличалась от нормальных значений, однако, можно заметить некоторую тенденцию к ее снижению (больные РА - 0,158 ± 0,04 нмоль/л, здоровые - 0,25 + 0,08 нмоль/л, Р>0,1), она была ниже контрольного уровня на 26,8%. В то же время, уровень эстриола был значительно выше у больных РА, чем у здоровых лиц (больные РЛ - 1,08 ± 0,1 нмоль/л, здоровые - 0,7 + 0,04 нмоль/л, Р<0,05). Отношение концентраций эстриола к зстрадиолу составляло до лечения 6.867, что существенно превышало данный показатель у здоровых лиц, равный 2,8.

Базальный уровень кортизола у больных РА имел некоторую тенденцию к снижению и составлял 401,74 + 37,69 нмоль/л - 79 % от контрольного уровня (здоровые лица - 508,29 ± 76,87 нмоль/л, Р>0,1).

С целью оценки особенностей функционального состояния изучаемых гормональных систем была проведена фармакологическая разовая нагрузка АКТГ (рис.5). У здорвых лиц реакция каждого из изучаемых гормонов на нагрузку АКТГ была однотипной и проявлялась либо увеличением концентрации, как, например, кортизола (до нагрузки

АКТГ - 508,29 + 76,87, после - 973,6 + 195,61 нмоль/л, Р<0,01) и прогестерона (0,62 ± 0,04 и 1,3 ± 0,09 нмоль/л соответственно, Р<0,01), либо ее уменьшением, в случае с эстриолом (до нагрузки -0,7 ± 0,04 нмоль/л, после - 0,24 ± 0,02, Р<0,05 ) и тестостероном (до нагрузки - 2,48 + 0,5 нмоль/л, после - 0,79 + 0,1, Р<0,01). Однако, нагрузка АКТГ не меняла концентрацию эстрадиола (до нагрузки - 0,25 ± 0,08 нмоль/л, после - 0,24 ± 0,01, Р>0,5). Как и следовало ожидать, реакция кортизола на нагрузку АКТГ у больных РА была однотипной и проявлялась достоверным повышением концентрации гормона, как у здоровых лиц, что говорит о сохранении резервных возможностей коры надпочечников. А реакции со стороны половых гормонов в ряде случаев были атипичными. Так у больных РА обнаружено два типа реакций прогестерона на АКТГ: в виде увеличения концентрации гормона - I тип ответа (группа 1) и в виде отсутствия изменений ее - II тип ответа (группа 2). В этих же группах отсутствовала реакция на АКТГ со стороны других половых гормонов (тестостерона, эстрадиола, эстриола). Такие атипичные реакции происходили на фоне изменений концентраций изучаемых гормонов. После проведения противовоспалительной терапии в I группе реакция прогестерона на АКТГ не менялась и проявлялась увеличением концентрации, однако, степень этого повышения была значительно меньше, чем до лечения. Во второй группе после лечения концентрация прогестерона в ответ на нагрузку увеличилась, т.е. происходило восстановление нормальной ответной реакции на нагрузку и уровень этого гормона практически не отличался от контрольного уровня.

Ответная реакция тестостерона на нагрузку АКТГ проявлялась также двумя типами реакций: при первом типе ответа концентрация

до'лечения после лечения до лечения после лечения

ЭСТРИОЛ ЭСТРАДКОЛ

нмоль/л

КОРТИЗЭЛ нмоль/л

мин

Рис.5. Динамика концентраций половых гормонов и кортизола в крови больных РА при нагрузке АКТГ

1 - здоровые лица

2 - 1-й тип ответа

3 - 11-й тип ответа

оставалась без изменений (1 группа), а при втором - уменьшалась (2 группа). Реакция прогестерона на АКТГ в этих группах практически не отличалась от реакции здоровых лиц и проявлялась повышением концентрации гормона. Уровень эстрадиола и эстриола не изменился при нагрузке АКТГ. Характерно, что и концентрации некоторых половых гормонов у больных этих групп также различались. Так, исходный уровень прогестерона у больных I группы был повышен, а во 2 - соответствовал контрольному уровню. Уровень эстриола был повышен у лиц I группы, в то время как во второй группе он не менялся. После лечения противовоспалительными препаратами изменений типов ответной реакции у большинства гормонов не обнаружено.

Нагрузка АКТГ выявила диссоциацию ответа и эстриола, которая у одних больных проявлялась в виде увеличения (I тип ответа, группа 1), а у других в виде уменьшения концентрации (II тип ответа, группа 2), как и у здоровых лиц. После лечения проявлялся третий тип ответа на нагрузку: в обеих группах концентрация гормона оставалась без изменений после введения АКТГ. Целый ряд различий как исходных концентраций, так и типов ответа на нагрузку обнаружен у других гормонов. Концентрация тестостерона и эстрадиола в обеих группах не изменилась после нагрузки АКТГ, в то время как концентрация прогестерона у больных РА 1 группы повысилась, а во второй группе - не измененилась. После лечения каких-либо изменений ответных реакций этих гормонов на АКТГ не происходило. Описанные колебания концентраций эстриола на нагрузку АКТГ происходили на фоне изменений уровней других гормонов: повышенной концентрации прогестерона в обеих группах, тенденции к повышению уровня тестостерона.

Уровень эстрадиола оставался без изменений в ответ на пробу с АКТГ как до, так и после лечения. Общим для всех остальных половых гормонов этой группы явилось отсутствие ответной реакции на АКТГ. В то время нак исходные концентрации эстриопа, прогестерона и кортизола у лиц этой группы были повышены, а после противовоспалительной терапии они снижались и не отличались от таковых у здорорыу "кг;.

Таким образом, совершенно очевидно, что реакция изучаемых гормонов на нагрузку АКТГ носит в большинстве своем полиморфный характер и, в одних случаях, со стороны одного и того же гормона это проявляется в виде увеличения или уменьшения концентрации, а в других - она остается без изменений, т.е. у больных РА выявлена диссоциация большинства ответов в виде аномальных ответных реакций. которая сопровождается, как правило, изменением исходного уровня того или иного гормона. Противовоспалительная терапия в некоторых случаях приводила к восстановлению нормального типа реакции на нагрузку АКТГ, в других же - не сказывала влияния как на тип ответной реакции, так и на концентрацию изучаемого гормона.

Изучение функционального состояния гонад и коры надпочечников при различной клинической симптоматике и сроках заболевания выявило следующие особенности. Значения концентраций кортизола и половых гормонов у больных РА с различными сроками заболевания (менее 2-х лет - 1 группа, от 2 до 5 лет - 2 группа, более 5 лет -3 группа) представлены в таблице 11. Уровень тестостерона по мере развития заболевания имел тенденцию к снижению и составлял во 2 группе 64%, а в 3-ей - 74,2% от контроля.

Таблица 11.

Назальный уровень кортизола и половых гормонов у больных РА с различной длительностью заболевания

Обследуемые К П Т ЕЗ Е2

группы п нмоль/л нмоль/лнмоль/л нмоль/л нмоль/л ЕЗ/Е2

Здоровые 508,29± 0,62+ 2,48± 0,25± 0,7± 2,8

(контроль) 15 76,87 0,04 0,5 0,08 0,04

> 2 лет 15 434,4± 0,92± 3,99± 0,4± 1,26+ 3,15

40,19 0,21х 1,36 0,13х 0,32х

2-5 лет 20 577,25± 1,43± 1,59± 0,13± 1,11± 8,64

140,99 0,6х 0,76 0,08 0,27х

> 5 лет 15 387,02± 1,158± 1,84± 0,09± 0,953+ 10,47

45,86 0,28х 0,2 0,02х 0,1

Примечание: х - различия с контролем достоверны при Р<0,01

Следует заметить отсутствие реакции тестостерона на нагрузку АКТГ у больных РА первой и второй групп, в то время как у здоровых лиц она проявлялась снижением концентрации. Лишь у лиц с давностью заболевания более 5 лет проявляется выраженная реакция на АКТГ в виде повышения концентрации (2,894 ± 0,604 нмоль/л, Р<0,01). Вероятно, этот выброс тестостерона можно рассматривать как защитную реакцию - проявление скрытых резервных возможностей желез, ответственных за секрецию этого гормона. Концентрация прогестерона во всех трех группах больных РА была выше, чем у здоровых лиц. Тип ответной реакции на нагрузку АКТГ на ранних стадиях заболевания был аналогичным контрольной группе,что проявлялось повышением концентрации гормона после нагрузки, однако, по мере "старения" болезни происходила инверсия ответа - в виде отсутствия реакции на АКТГ. Концентрация эстрадиола на начальной стадии заболевания была несколько выше контрольных

значений, однако, по мере-развития'заболевания она снижалась. Так же как и у здоровых лиц ответная реакция на нагрузку АКТГ отсутствовала. Уровень эстриола на первых двух сроках заболевания был повышен.

Реакция на нагрузку АКТГ со стороны этого гормона отсутствовала, в то время как у здоровых лиц она проявлялась снижением концентрации. При заболевании свьше 5 лет уровень эстриола был ниже, чем на начальных стадиях, а характер ответа на нагрузку был уже другим - в виде повышения концентрации. По мере развития болезни обнаруживается динамика в сторону уменьшения концентрации кортизола. Если на начальных этапах уровень кортизола был ниже контрольного на 14,6%, то при заболевании свыше 5 лет его концентрация была ниже контрольного уровня на 23,9%. При этом резервные возможности коры надпочечников на всех сроках заболевания сохранены, что подтверждается ответной реакцией на АКТГ в виде повышения концентрации кортизола. Однако, степень этого повышения на поздних стадиях заболевания менее выражена,чем на начальных этапах болезни и по сравнению со здоровыми лицами.

Анализ зависимости уровня половых гормонов и кортизола от степени активности процесса показал, что наиболее выраженные изменения происходят при III степени, которые прежде всего проявляются инверсией нормального ответа на нагрузку АКТГ (табл. 12). Уровень эстрадиола повышается в ответ на АКТГ (нормальный тип ответа - концентрация не изменяется), прогестерона, тестостерона и кортизола не изменяется (в норме - повышение концентрации для прогестерона и кортизола и уменьшение для тестостерона).

Таблица 12.

Базальный уровень кортизола и половых гормонов у больных с различной степенью активности РА

Обследуемые К П Т Е2 ЕЗ Е2/ЕЗ

группы п нмоль/л нмоль/л нмоль/л нмоль/л нмоль/л

Здоровые 508,29+ 0,62± 2,43+ 0,25+ 0,7± 2,8

лица 15 76,87 0,04 0,5 0,08 0,04

I степень 15 578,82± 1,03± 1,71± 0,11± 1,02± 9,125

168,12 0,15х 0,43 0,06 0,29

II степень 15 492,15± 1,45± 4,14± 0,27± 1,09± 4,059

80,85 0,39х 1,08 . 0Д 0,13х

III степень 15 415,01± 1,48± 1,92± 0,08± 0,92± 11,3

118,23 0,09х .0,4 0,01х 0,09

Примечание: х - различия с контролем достоверны при Р<0,01

Результаты по изучению концентраций половых гормонов и кортизола у больных с функциональной недостаточностью суставов I и II степени представлены в таблице 13. У больных РА при I степени ФНС обнаружено повышение исходного уровня прогестерона и эстриола на фоне некоторой тенденции к понижению концентрации кортизола. При. II степени ФНС сохранились те же изменения, однако, концентрация эстрадиола еще более снижалась. Характерно, что у большинства половых гормонов реакция на АКТГ была атипичной и проявлялась отсутствием изменений концентрации тестостерона (у здоровых - повышение) и эстриола (у здоровых - снижение). Несмотря на сниженный уровень кортизола, реакция на АКТГ была, как и у здоровых лиц, в виде повышени концентрации, что говорит о сохранении резервных возможностей коры надпочечников у этих больных.

Таблица 13.

Базальный уровень кортизола и половых гормонов у больных РА с функциональной недостаточностью суставов (ФНС) I и II степени

п К П Т Е2 ЕЗ ЕЗ/Е2

нмоль/л нмоль/л нмоль/л нмоль/лнмоль/л

Здоровые 15 503,29± 0.62t 2,48+ 0,25± 0, 7± 2,8

76,87 0,04 0,5 0,08 0,04

ФНС I ст. 26 413,88± 1,24± 1,84+ 0,14+ 1,08+ 7,71

55,26 0,25х 0,2 0,03 0,13х

ФНС II ст. 19 379,87± 1,04± 1,78± 0,08± 1,09± 13,36

37,86 0,22х 0,34 0,003х 0,12х

Примечание: х - различия с контролем достоверны при Р<0,01.

Давность заболевания, степень активности РА и ФНС оказывают заметное влияние на показатель - соотношение концентраций эстри-ол/эстрадиол (рис.6). Так наиболее низкий уровень этот показатель имел у здоровых. С ростом давности заболевания это отношение возрастало в 3-4 раза. Значительный рост этого показателя наблюдался при II степени ФНС и при I и III степени активности РА.

Таким образом, обнаруженные на первых стадиях заболевания изменения концентрации половых гормонов по мере развития его усугубляются и становятся более выраженными как со стороны эстрогенов, так и со стороны прогестерона и андрогенов. Начальное повышение концентраций эстриола и эстрадиола, вероятно, есть результат компенсаторного напряжения в функционировании желез, ответственных за их секрецию. По мере "старения" болезни, резервные возможности этой гормональной системы истощаются, что подтверждается снижением концентрации эстрадиола в сочетании с

давность степень ФНС

заболевания активности

Показатель эстриол /эстрадййл у больны* РА

атипичнымии типами ответов половых гормонов на нагрузку АКТГ, тенденцией к снижению концентрации тестостерона, повышением уровня прогестерона.

Изменения концентрации кортизола - тенденция к ее снижению по мере утяжеления процесса, которая после лечения остается сниженной, отсутствие типичной реакции на нагрузку АКТГ при III степени активности - позволяют говорить о снижении резервных возможностей коры надпочечников и . развитии надпочечниковой недостаточности.

Можно заключить, что более выраженная клиническая симптоматика - утяжеление заболевания (III степень активности процесса, ФНС II

ст., большие сроки заболевания) вызывают глубокие изменения

функционального состояния изучаемых эндокринных желез и большие

изменения концентраций секретируемых ими гормонов.

Сравнительное изучение уровня половых гормонов и кортизола у

больных РА и ПДО (табл. 14) показало, что несмотря на некоторую

Таблица 14.

Назальный уровень кортизола и половых гормонов у больных РА и ПДО

Больные

Здоровые _

п=15 РА ПДО

п=45 п=40

Кортиз ол, нмоль/л 508,29±76,87 401,74±0,19 524,64±62,44

Прогестерон, нмоль/л 0,62±0,04 1,182±0,18х 1,67+0,32х

Тестостерон, нмоль/л 2,48±0,5 1,99±0,24 2,5+0,46

Эстриол, нмоль/л 0,7±0,04 1,08±0,1х 1,17+0,15х

Зстрадиол, нмоль/л 0,25+0,08 0,16+0,04 0,09+0,01х

Примечание: х - достоверные различия с контролем при Р<0,01

- различия между РА и ПДО при Р<0,01

общность изменений секреции некоторых половых гормонов при двух формах патологии, обнаружены различия в типах ответных реакций на нагрузку АКТГ как со стороны половых гормонов, так и со стороны кортизола. При этом при ПДО концентрации тестостерона и кортизола не отличаются от нормальных значений. Все вышеизложенное позволяет сказать, что обнаруженные андроген-эстрогенный дисбаланс и явления надпочечниковой недостаточности характерны для РА, в то время как функциональное состояние эндокринных желез, ответственных за секрецию этих гормонов, при ПДО не страдает.

Анализируя результаты этого раздела исследования можно заключить,

что с помощью РИА при РА обнаружены значительные изменения концентраций половых гормонов и кортизола, которые позволяют говорить о развитии относительной эстрогенной и надпочечниковой недостаточности в сочетании с гормональной дезинтеграцией изучаемых эндокринных желез, связанных с клинической симптоматикой, тяжестью и длительностью заболевания.

3.3. РАДИОИММУНОАНАЛИЗ В ОЦЕНКЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ СИСТЕМЫ "ГИПОФИЗ-ЩИТОВИДНАЯ ЖЕЛЕЗА"

Изучению изменений функционального состояния системы "гипофиз-щитовидная железа" при соматических заболеваниях посвящено мало исследований, несмотря на то, что роль щитовидной железы в патогенезе основных заболеваний общепризнана (Gambert S.K., 1982). Исследованию тиреоидного статуса при РА посвящено лишь несколько, достаточно противоречивых сообщений, в которых, однако, не изучались все звенья данной системы одномоментно (Мурза A.A., 1979; Хетагурова З.В., 1982 и др.) и взаимозависимость функционального состояния системы "гипофиз-щитовидная железа" с клинической - симптоматикой заболевания, не оценивалась эффективностью терапевтического лечения в зависимости от уровня гормональной регуляции.

В связи с вышеизложенным нами была изучена возможность использования РИА для углубленного исследования функционального состояния различных звеньев системы "гипофиз-щитовидная железа" при РА; оценена динамика и особенности функционирования данной системы, ее резервные возможности на разных сроках и стадиях заболевания и взаимосвязь с клинической симптоматикой и видом проводимой терапии.

~~У~ больных РА выявлено достоверное повышение базального уровня ТТГ (здоровые - 2,09 ± 0,38 мЕд/л, больные - 3,57 ± 0,32, Р<0,01). Кроме того, у больных РА при длительности заболевания до 2-х лет обнаружен также повышенный уровень ТТГ (3,30 + 0,41 мЕд/л, Р<0,05), который по мере развития процесса возрастал и в группах со сроками заболевания 2-5 лет и более 5 лет уровень ТТГ составлял 3,41 + 0,24 и 3, 57 + 0,31 соответственно (Р<0,01 и Р<0,001). При всех степенях (1-111) активности процесса обнаружено достоверное увеличение тиреотропной активности гипофиза, но оно более выражено при III степени активности РА (табл.15). Функциональная недостаточность суставов I степени сопровождается также повышением концентрации ТТГ, которая при II степени недостаточности несколько снижается (табл.15). Тиреотропная функция гипофиза была оценена с помощью фармакологической пробы с АКТГ. Через 60 мин наблюдения уровни ТТГ у больных РА с различными

Таблица 15. Назальный уровень тиреоидных гормонов и белков у

больных РА с различной степенью активности процесса

Здоровые 15 2, 09± 1,47 + 123,09+ 13 ,37+ 0, 43 +

лица 0, 38 0,34 10,87 2, 8 0, 09

I степень 15 2, 97* 0,88± 76,15+ 36 ,37+ 0, 26+

активности 0, 34х 0,14х 12,4х 12 , 1X 0, 09

II степень 15 3, 04+ 0,7 + 61,02± 5, 97+ 0, 33+

активности 0, 26х 0, Их 11,81х 2/ Их 0, 1

III степень 15 3, 97+ 0,9+ 69,19± 25 ,5+ 0, 5+

активности 0, 28 х 0.15х 6,87 х И ,7 0, 1

Примечание: х - различия с контролем достоверны при Р<0,01

сроками заболевания, степенями активности процесса и Функциональной недостаточности суставов под влиянием АКТГ не менялись, т.е. о~вет на нагрузку у здоровых и больных РА был одинаков.

Таблица 16.

Базальный уровень тиреоидных гормонов и белков у больных РА с функциональной недостаточностью суставов I и 11 степени

| п | ТТГ | ТЗ | Т4 | ТГ | ТСГ

мЕд/л нмоль/л нмоль/л мг/л мкмоль/л

Здоровые лица 15 2,09± 1,47 + 123,09* 13.37+ 0,43+

0,38 0,34 10,87 2,8 0,09

ФНС I степени 26 3,24± 0, 8± 57,021 17,64± 0,34±

0,24х 0,09х 7,38 X 6,39 0,06

ФНС II степени 14 2,77± 0,59± 47,27± 7,93± 0,36+

0,33 0,12х 10,24х 4,17 х 0,09

Примечание: х - различия с контролем достоверны при Р<0,01

После противовоспалительной терапии концентрация и реакция ТТГ на нагрузку не менялась. Таким образом, у большинства больных РД имеется повышение тиреотропной Функции гипофиза, причем разная степень нарушения этой Функции сочетается с различными клиническими проявлениями болезни.

Базальная концентрация тиреоидных периферических гормонов -Т4 и ТЗ - у больных РА была снихена (табл.17). В то же время уровень ТГ, являющегося, предшественником синтеза Т4, ТЗ, и ТСГ, который образует в кровяном русле комплексы с этими гормонами, практически не отличался от контрольных значений.

Описанные изменения концентраций периферических

тиреоидных гормонов на Фоне повышенного уровня ТТГ и нормальных значений ТГ и ТСГ позволяют заключить, что у большинства больных

РА возникает гипотиреоз как следствие серьезных нарушений функции щитовидной железы.

Таблица 17.

Тиреоидный статус у больных РА до и после лечения

Изучаемые Здоровые соединения лица п=15

Больные РА

Базальный__после лечения__

уровень п/в терапия гормонотерапия п=60 п=45 п=15

ТТГ, мЕд/л 2,09±0,38 ТЗ,нмоль/л 1,47±0,34 Т4,нмоль/л 123,09±10,9 ТГ.мг/л 13,37+2,8 ТСГ,мкмоль/л 0,43±0,09

3,57±0,32х 3,96±0,39х 2,77+0,2

0,74+0,07х 0,83±0,06х 0,73+0,1х

53,92±5,96х 62,49+7,43х 50,04±9,1х

14,5±4,55 18,01+3,98 10,67+3,14

0,35±0,05 0,33±0,05 0,38±0,1

Примечание: х - различия с контролем достоверны при Р<0,01

Для выяснения характера этих изменений была проведена фармакологическая проба с АКТГ. В норме нагрузка кортикотропином снижает содержание ТЗ, не меняя уровень Т4 (De Groot L.J., 1979). В

наших исследованиях

До лечения.

Посде леченюг

ни огл/п

2,Of

1,0

кмо ni/л 2,0'

1.0

Рис.7. Дияамика концентрации ТЗ в крови больных РА

при нагрузке АКТГ г _ ,_ца тп„ 0„е„ 115,47 1 - здоровые пица 3 _ 2-ой тип ответа

у здоровых ЛИЦ получены аналогичные результаты. Концентрация ТЗ до нагрузки - 1,47 + 0,24 нмоль/л, после нее -1,04 + 0,15, Р < 0,001, а Т4 - 123,09 + 10,87 нмоль/л и + 19,65 (Р>0,001). У больных

РА выявлено два типа ответа ТЗ на нагрузку - в виде понижения концентрации гормона, как и у здоровых лиц, и в виде отсутствия ее изменений (рис.7). Причиной такой резистентности могут быть изменения чувствительности рецепторного аппарата системы "гипофиз-щитовидная железа", либо истощение ее резервных возможностей (Се Groot Ь.Л., 1979). В то же время нагрузочная проба не вызывала существенных изменений концентраций других изучаемых соединений - Т4, ТСГ, ТГ. Полиморфизм ответа периферического звена изучаемой системы на нагрузку обусловлен, вероятно, стимулирующим действием АКТГ на глюкокортикоидную Функцию надпочечников, которые при этом проявляют периферическое угнетающее действие на конверсию Т4 в ТЗ.

Анализ взаимосвязи тиреоидного статуса с давностью заболевания показал (табл.18), что уже на начальных стадиях болезни уровень ТТГ повышен и сохраняется таковым на всех изучаемых сроках

Таблица 18.

Тиреоидный профиль у больных РА с различной длительностью заболевания

Обследуемые |.п | ТТГ | ТЗ 1 Т4 | ТГ | ТСГ

Здоровые лица 15 2, 09+ 1,47 + 123,09+ 13,37+ 0,43+

(контроль) 0, 38 0,34 10,87 2,8 0,09

> 2 лет 15 3, 3+ 0,7 + 51,44+ 3,69+ 0,26+

0, 41X 0,21X 13,42х 1,45х 0,08

2-5 лет 20 3, 40+ 0,69+ 60,79+ 22,45+ 0,33+

0, 39х 0,17х 17,04х 16,06 0,15

> 5 лет 25 3, 57+ 0,82+ 60,96+ 32,34+ 0,46+

0, 32х 0,08х 6,96х 10, 21х 0,06

Примечание: х - различия с контролем достоверны при р<0,01

- РА,-параллельно с'этим концентрация Т4 и ТЗ остается сниженной. Различия касаются лишь ТГ, концентрация которого на начальных сроках заболевания снижена, а затем повышается выше контрольного уровня. Вероятно, . повышенный уровень ТГ есть результат усиления его секреции под влиянием ТТГ (Ткачева Г. А. и др., 1983). Аналогичная тенденция обнаружена и с ТСГ, концентрация которого по мере развития заболевания претерпевает динамику от сниженного уровня на начальных этапах болезни через его повышение до контрольного уровня на поздних сроках. Таким образом, обнаруженные уже на начальных стадиях заболевания явления гипотиреоза усугубляются и по мере развития болезни становятся более выражены.

Не обнаружено существенных различий в концентрациях изучаемых соединений у больных РА, имеющих ФНС I и II степени (табл.16). Уровень тиреоидных гормонов и регуляторных белков у больных с различной степенью активности болезни (I-III) приведен . в таблице 15. I и II степени активности РА характеризовались снижением концентраций Т4, ТЗ и ТСГ на фоне повышенного уровня ТТГ. Однако, при III степени активности уровень ТГ и ТСГ повышался, в то время как концентрация ТТГ снижалась до контрольных значений. Такие изменения в концентрациях изучаемых соединений позволяют говорить о том, что обнаруженный на первых стадиях активности заболевания слабо выраженный гипотиреоз у больных PA III ст. активности становится более выраженным.

Таким образом, у больных с различной клинической симптоматикой выявлены полиморфные нарушения в системе "гипофиз-щитовидная железа" с развитием гипотиреоидного состояния.

Изучение тиреоидного статуса у больных ПДО (группа сравнения)

показало, "что система "гипофиз-щитовидная железа» практически не подвергается каким-либо существенным изменениям при этом заболевании: концентрации ТГ, ТТГ, ТЗ и ТСГ не отличались от здоровых лиц (табл,19).Таким образом, обнаруженные нами явления гипотиреоза характерны именно для РА, в то время как при другой патологии, приводящей также к поражению суставов, функционирование системы "гипофиз-щитовидная железа" не претерпевает таких серьезных нарушений.

Следовательно, в результате исследования гормонального тиреоидного статуса у больных РА с помощью РИА обнаружено нарушение гомеостатического равновесия механизмов обратной связи в функционировании системы "гипофиз-щитовидная железа", проявляющееся в виде гипотиреоза и функциональной дезинтеграции как отдельных эндокринных звеньев, так и всей системы в целом.

Таблица 19.

Базальный тиреоидный статус больных РА и ПДО

Изучаемые Здоровые лица РА ПДО, п=40

соединения (контроль), п=15 п=60 группа сравнения

ТТГ, мЕд/л 2,09±0,38 3,57±0,32 х 2,17±0,23о

ТЗ, нмоль/л 1,47±0,34 0,74±0,07 х 1,34±1,13о

Т4, нмоль/л 123,09±10,87 53,92±5,96 х 68,31±7,61х

ТГ, мг/мл 13,37±2,81 14,5±4,55 20,08+4,18

ТСГ, мкмоль/л 0,43±0,09 0,35±0,05о 0,53+0,05

Примечание: х - различия с контролем достоверны при Р<0,01 о - различия между РА и ПДО при Р<0,01

3.4. РАДИОИММУНОАНАЛИЗ В ОЦЕНКЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ

Особый интерес представляет оценка эффективности проводимой терапии при том или ином заболевании, так как, с одной стороны, отсутствуют количественные критерии результатов лечения, а, с другой - до сих пор нет единого подхода к назначению лечебных, особенно гормональных препаратов. В последние годы все чаще предпочитают подключение к лечебному комплексу уже на ранних стадиях РА стероидной терапии, что, по мнению ряда авторов, является необоснованным (Hess E.V. et al., 1989), несмотря на то, что кортикостероиды являются эффективным средством подавления воспалительных изменений суставов. Однако, их применение связано с риском серьезных осложнений из-за отсутствия разработанных четких показателей к их назначению (Weiss М.М., 1989). Поэтому полагают, что пока рано перестраивать общепринятую схему противовоспалительной нестероидной терапии в лечении РА.

В связи с этим было важно изучить возможность оценки целесообразности и эффективности проводимой терапии с помощью РИА, проанализировать уровень изучаемых соединений у больных РА до и после различных типов лечения - противовоспалительной и гормональной терапии.

Данные изученных гормональных показателей у больных РА до и после лечения представлены в таблицах 17 и 20. У больных РА после проведения курса противовоспалительной терапии происходила нормализация уровня эстриола и прогестерона, которые до лечения были повышены. Однако, это лечение не оказывало положительного влияния на атипичные реакции половых гормонов на нагрузку АКТГ (рис.5). Так, уровень эстриола и тестостерона не изменялся при введении

Таблица 20.

Концентрации половых гормонов и кортизола до и после лечения у больных РА

Изучаемые Здоровые _БольныеРА_

гормоны лица Базальный _после лечения_

п=15 уровень п/в терапия гормонотерапия

п=60 п=45 п=15

К,нмоль/л

П,нмоль/л Т,нмоль/л ЕЗ,нмоль/л Е2,нмоль/л ЕЗ/Е2

>08,29+ 76,87 0,62±0,04 2,48±0,5 0,7+0,04 0,25±0,08 2,8

01,74+ 37,63 1,18±0,18х 1,99±0,24 1,09±0, 1х 0,16±0,04 6,86

315,46± 36,05х 0,49±0,08о 1,83±0,28 0,9±0,12 0,47±0,17о 1,91

265,37± 47,08x0 0,44+0,120 3,41±0,09х 0,79+0,26 0,75±0,32хо 1,06

Примечание: х - различия с контролем достоверны при Р<0,1 о - достоверные различия до и после лечения

АКТГ как до, так и после лечения, в то время как у здоровых лиц концентрациия обеих гормонов после нагрузки снижалась. Противовоспалительная терапия не оказывала нормализирующего эффекта на измененные концентрации гормонов тиреоидного профиля (ТТГ, ТЗ и Т4) и их ответные реакции на пробу с АКТГ.

В результате гормонотерапии происходила также нормализация уровня эстриола с восстановлением нормальной реакции на нагрузку и повышением концентрации тестостерона после обнаруженной тенденции к его снижению до лечения. Но тип ответной реакции тестостерона как и после противовоспалительного лечения не восстанавливался. Обращает на себя внимание и тот факт, что при обеих типах терапии уровень кортизола после лечения остается сниженным, хотя реакция на АКТГ носит характер, соответсвующий таковому у

здоровых лиц,- Совершенно очевидно, что под влиянием гормонотерапии функциональные резервы коры надпочечников не меняются и сохранены, что позволяет говорить о целесообразности применения гормональных препаратов в данной группе больных. В то яе время гормонотерапия приводила к нормализации уровня ТТГ у больных РА, не оказывая существенного влияния на понижение концентрации ТЗ и Т4. Кроме того, у больных РА под- влиянием гормональных препаратов происходило снижение уровней ТГ и ТСГ, в то время как после противовоспалительного лечения их концентрации не менялись и не отличались от здоровых лиц.

Таким образом, можно заключить, что противовоспалительная и гормональная терапии оказывают нормализующий эффект на концентрации некоторых половых гормонов, не влияя на секрецию гормонов щитовидной железы. Общим в оценке функционального состояния изучаемых систем у больных РА является восстановление резервных возможностей гонад и коры надпочечников после двух типов терапии. Однако, гормонотерапия вызывает угнетение синтеза ТГ и ТСГ, что при длительном применении может привести к еще большему нарушению секреции Т4 и ТЗ. Все вышесказанное диктует необходимость избирательного назначения гормональных препаратов и постоянного контроля за функцией эндокринных желез во время лечения. Изменение функционирования гонад, коры надпочечников, щитовидкой железы под влиянием этих препаратов следует учитывать при применении их в клинике РА.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, с помощью РИА показано, что при РА происходят сложные и многообразные изменения гормонального гомеостаза,

которые выражаются в развитии эстроген-андрогенного дисбаланса, надпочечниковой недостаточности и гипотиреоза. Причем функция каждого эндокринного звена в пределах одной системы изменяется по-разному. Об этом свидетельствуют возникающие разные типы ответных реакций на фармакологическую нагрузку АКТГ со стороны одного и того же гормона. Анализ полученных результатов дает возможность говорить о том, что у больных РА более выраженно страдают системы, ответственные за продукцию эстрадиола. (активной фракции эстрогенов) по сравнению с эстриолом (неактивной фракцией эстрогенов). Иными словами, в организме развивается относительная эстрогенная недостаточность. "Относительность" эстрогенной недостаточности у этих больных, видимо, обусловлена изменением реце-пторного аппарата, так как периферическое действие эстрогенов зависит от состояния цитоплазматических рецепторов в тканях (Фанченко Н.Д., 1978), в тон числе и внутриклеточных рецепторов фибробластов - основных клеточных элементов соединительной ткани. Вероятно, нарушение рецепции эстрогенов в фибробластах может быть одним из патогенетических механизмов развития РА путем их действия на генетический аппарат клетки, которое опосредовано синтезом индуцируемых белков (Гроздова М.Д., Панасюк А.Ф., 1983). С другой стороны, снижение резервных возможностей желез, ответственных за продукцию эстрадиола, также может способствовать развитию эстрогенной недостаточности. Однако, в постменопаузе синтез эстрадиола уже не происходит в строме яичника, а осуществляется лишь в скелетной мускулатуре, коже, жировой ткани, и ФСГ не оказывает влияния на этот процесс (Hadgins М.В., 1989). В то же время яичники продолжают образовывать андрогены: тестостерон и андростендион, которые на периферии превращаются в эстрогены (Paul

J. Davis, 1982). При этом ароматазы - группы ферментов, трансформирующих андрогены в эстрогены, также локализованы в фибробластах соединительной ткани (Lihita R.G., 1985). Участие зстрадиола в регуляции функциональной активности фибробластов и метаболизме соединительной ткани общепризнано. При РА уменьшается скорость роста фибробластов, их энергетический обмен, в результате чего происходит гиперпродукция нязкомолекулярной гиалуроновой кислоты, обмен которой контролируется гормонами половых и щитовидной желез, и, кроме того, выделение активного С1-компонента комплемента. Все это подтверждает существование связи между фибробластами соединительной ткани, половыми гормонами и иммунной системой. Развитию эстрогенной недостаточности может способствовать и обнаруженная нами тенденция к снижению уровня тестостерона - одного из основных андрогенов - предшественников синтеза эстрогенов (Розен В.В., 1980). В свою очередь причиной недостаточной продукции андрогенов может быть как снижение функциональной активности гонад и коры надпочечников (Sakaaara М. et al., 1975), так и ускоренный переход андрогенов в эстрогены в результате усиления активности внутриклеточного ц-АМФ и аро-матазной активности цитохрома Р-450 в фибробластах соединительной ткани в ответ на местное повреждение (Lihita R., 1985). Выявленный андроген-эстрогенный дисбаланс, по мнению ряда авторов, можно рассматривать как следствие аутоиммунного процесса (Алек-берова З.С. и др., 1990), результатом которого является нарушение механизмов взаимодействия иммунной и эндокринной систем. А существование связи между двумя системами подтверждается наличием рецепторов к половым гормонам не только в фибробластах, но и в тимусе, ретикуло-эндотелиальной системе и иммунокомпетентных

клетках (Maramon G., 1987), участием этих гормонов в синтезе регулятора иммунитета - интерлейкина-2 (Talal et al., 1981), влиянием половых гормонов на активность и ранние этапы становления Т- и В-лимфоцитарных систем (Шилов Ю.И., Кеворнов H.H., 1980), снижением количества и активности Т-клеток и гиперактивностью B-клеток при недостатке андрогенов (Козлов В.А. и др., 1982), стимулирующим действием эстрогенов на В-систену иммунитета путем увеличения количества плазмобластов, антителообразующих клеток и, тем самым, влиянием на синтез иммуноглобулинов (Paavonen Т. et al., 1981).

Претерпевающий изменения у больных РА процесс секреции тестостерона и прогестерона может явиться источником субстратного материала для продукции кортизола, которая носит также полиморфный характер и изменяется в зависимости от вышеперечисленных клинических фаторов. Общепризнано защитно-адаптационное значение коры надпочечников, при этом кортизол оказывает противовоспалительное и антиаллергическое действие путем его физиологического воздействия на функцию иммунной системы через механизм антигенной стимуляции (Schatz Н., 1988), результатом которого является повышение секреции кортизола под влиянием АКТГ. Эти процессы, в свою очередь, приводят к подавлению неспецифического иммунного ответа, и, возможно, специфической антигенной активации лимфоцитов, то есть возникает еще один механизм взаимодействия эндокринной и иммунной систем. Вероятно, при РА эти регуляторные механизмы нарушаются как результат снижения функции коры надпочечников, что подтверждается обнаруженной нами тенденцией к снижению концентрации кортизола. У большинства больных на начальных стадиях заболевания резервные возможности коры

надпочечников еще сохранены, однако, по мере утяжеления заболевания они снижаются, реакция на АКТГ становится атипичной, т.е. ЯБпения надпочечниковой недостаточности нарастают, и контролем, за ее развитием может служить определение концентрации кортизола в крови. Снижение функции коры надпочечников сопряжено и с недостаточностью яичников: при гипофункции надпочечников развивается гипофункция яичников (Kobert И. Show, 1982). Такая тесная функциональная взаимосвязь между надпочечника«:; и яичниками обусловлена, вероятно, общностью их эмбрионального происхождэния и тем фактом, что они вырабатывают соответствующие стероидные гормоны посредством одинаковых биосинтетических путей.

Реакция различных гормонов на нагрузку АКТГ носит в большинстве своем полиморфный характер: у одних больных это проявляется в виде увеличения или уменьшения концентрации, а у других она остается без изменений, хотя в норме ответ на нагрузку должен быть однотипным. Полагают, что такая диссоциация ответа обусловлена исходным функциональным состоянием гормональных систем, дезинтеграцией их отдельных звеньев, нарушением биосинтеза, секреции и метаболизма гормонов и характеризует чувствительность рецепторного аппарата эндокринных желез (Лившиц И.В., 1982). Следует заметить, что между функциональным состоянием гормональных систем, длительностью и тяжестью течения РА существуют сложные взаимоотношения: с возрастанием тяжести течения РА развивается более выраженная функциональная разобщенность эндокринных желез, т.е. усугубляется их дезинтеграция. Полиморфный характер изменений концентрации половых гормонов в ответ на нагрузку АКТГ, зависящий от перечисленных клинических факторов, позволяет заключить следующее. По мере развития забо-

левания й старения организма физиологическая секреция половых гормонов снижается и возникает дефицит некоторых из них, в том числе и андрогенов типа тестостерона, обладающих, по мнению ряда авторов, защитной ролью при развитии аутоиммунных заболеваний и оказывающих анаболическое действие на костно-хрящевой аппарат (Розен В.Б., 1980), а это может быть одним из патогенетических звеньев и РА. При этом половые гормоны играют важную роль, так как модулируют течение многих аутоиммунных заболеваний (Та1а1 N.. 1987).

Обнаруженные нами явления гипотиреоза, вероятно, также связаны с аутоиммунными процессами, так как существует мнение, что истинный гипотиреоз, чаще всего, является следствием развития аутоиммунного тиреоидита (БсЬиз51ег еЬ а1., 1978). Рядом авторов высказано предположение о возможности генетической взаимосвязи между РА и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы на основании того, что частота поражений щитовидной железы аутоиммунного генеза выше у больных РА и у членов их семей (811шапеЪа1, 1989). В основе недостаточности щитовидной железы, вероятно, лежат нарушения метаболизма тиреоидных гормонов, а именно конверсии Т4 в ТЗ, а повышение тиреотропной функции гипофиза следует рассматривать как компенсаторное усиление стимулирования гипофизом щитовидной железы. Известно, что взаимодействие эндокринных функций, обеспечивающих гомеостатическое восстановление гормонального равновесия организма, осуществляется путем непосредственного действия циркулирующего в крови гормона на секретирующую его железу и (или) также путем установления равновесия между функциональной активностью желез и количеством их гормонов посредством тропных гормонов гипофиза (Алешин Б.В.,

1981). Полученные результаты говорят о нарушении при РА обеих путей регуляции гомеостатического равновесия в изучаемой гормональной системе. При этом одной из основных причин нарушения периферического метаболизма гормонов щитовидной железы может быть любое острое или хроническое заболевание (Levis Е., 1982) и характер морфофункциональной перестройки ее при патологии определяется прежде всего спецификой общесоматического заболевания (Gambert- a. Barboriak, 1982). В свою очередь функциональная недостаточность щитовидной железы и дефицит ее гормонов могут быть одним из патогенетических механизмов развития аутоиммунного РА, так как доказано влияние гормонов щитовидной железы на резистентность и регенерацию костно-мьшечного аппарата и их участие в процессах иммуногенеза и антителообразования (Gems G., 1983, Войткевич В.З., 1965). Выявленные нарушения гормонального гомеостаза у больных РА в виде гипотиреоза и надпочечниковой недостаточности взаимосвязаны, так как в норме под влиянием тиреоидных гормонов в организме происходит усиленная продукция АКТГ, которая стимулирует функцию коры надпочечников (Krieger L.T., 1985). Снижение уровня тиреоидных гормонов способствует угнетению вплоть до истощения функционирования коры надпочечников, а это может явиться одной из причин развития надпочечниковой недостаточности.

Сравнительный анализ уровня и характера ответа на нагрузку изучаемых гормонов у больных РА и ПДО показал, что выявленные изменеия гормонального гомеостаза в виде надпочечниковой недостаточности, гипотиреоза и андроген-эстрогенного дисбаланса характерны именно для РА - заболевания аутоиммунного генеза, и отсутствуют при поражении суставов другой этиологии.

Противовоспалительная и гормональная терапия оказывают нормализирующий эффект на концентрацию некоторых половых гормонов и восстановление ответа на нагрузку АКТГ систем, ответственных за их секрецию, сохраняя функциональные резервы коры надпочечников. Это позволяет говорить о целесообразности применения гормональных препаратов в данной группе больных. В то же времяя оба вида терапии не оказывают нормализующего эффекта на функцию щитовидной железы. Более того, под влиянием гормонотерапии изменяется метаболизм таких белков как ТГ и ТСГ, что может усугубить развитие гипотиреоза. Поэтому следует учитывать изменения функции эндокринных желез под влиянием лечебных прапаратов при применении их в клинике, а назначение гормональных препаратов должно быть индивидуализированным и избирательным с предварительной оценкой функционального состояния эндокринных желез.

Таким образом, в результате проведенных исследований с помощью РИА обнаружены глубокие взаимообусловленные изменения гормонального гомеостаза, характеризующиеся полиморфизмом и дезинтеграцией функционального состояния эндокринных желез, истощением их резервных возможностей, нарушением секреции и метаболизма гормонов. Комплекс этих факторов является одним из важных звеньев в патогенезе РА. Можно с уверенностью заключить, что РИА в сочетании с нагрузочными пробами является надежным адэкватным методом для количественной оценки нарушений гормонального гомеостаза и изучения его роли в патоген зз заболевания, позволяющим контролировать течение болезни, эффективность и целесообразность терапии, прогнозировать ее исход.

ВЫВОДЫ'

1. Разработаны новые эффективные методы получения антител к регуляторным белкам, белково-пептидным, стероидным и тиреоидным гормонам с улучшенными аналитическими параметрами для целей радиоиммуноанализа (РИА), ' отличительной особенностью которых является использование высокоочищенных иммуногенов и гаптенов с различной плотностью посадки на белках, чередования белков-носителей в сочетании с различными адъювантными системами -вакцинами АКДС, БЦЖ, коклюшной моновакциной и твердофазными носителями.

2. Доказана возможность использования высоковалентных коньюгатов стероидных гормонов с белками (30-50 моль гаптена/моль белка) для получения антисывороток с улучшенными аналитическими параметрами.

3. Аналитические параметры антител меняются в динамике иммунизации, что выдвигает требование их контроля ■ при каждом очередном взятии" крови у экспериментальных животных.

4. Разработаны критерии оценки основных аналитических параметров антисывороток и пригодности их для радиоиммуноанализа различных биорегуляторов. Главным критерием при отборе антисывороток для РИА является их специфичность, оцененная как в модельных экспериментах, так и в конкретной РИА-системе. Недостаточная специфичность делает их непригодными для РИА даже при наличии высокого титра и хорошей аффинности.

5. Создана биотехнология получения антисывороток для радиоиммуноанализа регуляторных белков, белково-пептидных, стероидных и тиреоидных гормонов, на основе которых осуществлен

серийный выпуск отечественных радиодиагностических наборов 25 наименований.

6. С помощью РИА у больных ревматоидным артритом обнаружены изменения концентраций половых гормонов (повышение уровня прогестерона и эстриола, снижение содержания эстрадиола, тенденция к понижению уровня тестостерона) на фоне тенденции к снижению концентрации кортизола в сочетании с диссоциацией уровней этих гормонов в ответ на. фармакологическую пробу с АКТГ. Выявленные нарушения связаны с клинической симптоматикой, тяжестью и давностью заболевания и свидетельствуют о дезинтеграции деятельности изучаемых гормональных систем.

7. Методом РИА у больных ревматоидным артритом обнаружен гипотиреоз, что подтверждается снижением уровней ТЗ и Т4 на фоне повышенной концентрации ТТГ. Степень выраженности гипотиреоза зависит от клинической симптоматики заболевания: по мере развития и утяжеления ревматоидного артрита явления гипотиреоза нарастают.

В. С помощью РИА выявлены изменения в функционировании гонад, коры надпочечников, системы "гипофиз-щитовидная железа" и, тем самым, обнаружены серьезные нарушения гормонального гомеостаза при ревматоидном артрите в виде андроген-эстрогенного дисбала'нса, надпочечниковой недостаточности и гипотиреоза, которые играют существенную роль в патогенезе этого заболевания.

9. Доказана возможность использования РИА для оценки эффективности и целесообразности противовоспалительной и гормональной терапии, контроля за функционированием эндокринных желез под влиянием применяемых препаратов и разработки обоснованных рекомендаций для избирательного назначения лечебных, особенно гормональных препаратов с учетом функционального состояния эндокринных систем.

10. Радиоиммуноанализ в сочетании с нагрузочными пробами является надежным адэкватным методом для количественной оценки нарушений гормонального гомеостаза и изучения его роли в патогенезе ревматоидного артрита, позволяющим контролировать течение болезни, эффективность и целесообразность проводимой терапии, прогнозировать исход заболевания.

Основные результаты диссертации изложены в монографии,

обзорах, публикациях и авторских свидетельствах:

1. Иммунохимическая идентификация антигенов нервной системы // В монографии "Иммунонейрофизиология", Ленинград, Медицина,1978, стр. 128-155 (совместно -ШтаркМ.Б.).

2. Специфические антитела в методах радиоиммуноанализа (обзор)// Мед. радиология, 1986, N 12, стр. 87-93.

3. Свободные легкие цепи иммуноглобулинов: проблемы клинической интерпретации их появления в организме (обзор)// Иммунология, 1990,N4,стр.16-19 (совместно-Вигдорович И.П., Резников Ю.П.).

4. Модификация радиоиммунологического метода измерения концентрации РЭА // Мед. радиология, 1983, т. 28, N 8, стр. 61-65, (совместно - Ткачева Г.А., Соколов A.B.).

5. Возможности и перспективы использования радиоиммунологического метода для диагностики в онкологии //Тезисы докладов Межд. симпоззиума стран - членов СЭВ по радиофармацевтическим препаратам РФП и наборам для радиоиммунологического анализа РИА, 20-23 сентября 1983, Шверин, ГДР, стр. 52 (совместно -Ткачева Г.А.).

6. Радиоиммунологическая тест-система для определения инсулина в сыворотке крови человека // В сб.: "Химия и биохимия пептидно-белковых гормонов", Тезисы докладов Всес. симпозиума, Суздаль, 1985, стр.19(совместно - Мороз И.Н., Дрожденюк А.П.).

7. Получение антител к раково-эмбриональному антигену для целей радиоиммуноанализа // В сб.: "Химиотерапия опухолей в СССР", в. 45, Москва, 1986, стр. 177-181 (совместно - Вигдорович И.П., Корень H.A.).

8. Получение антител к инсулину для целей радиоиммуноанализа // В сб: "Химиотерапия опухолей в СССР", в.45, Москва, 1986, стр.182-187.

9. Радиоиммунологическая тест-система для определения концентраций тиреоглобулина в сыворотке крови человека // Мед. радиология, 1986, N 4, стр.71-74 (совместно - Щербань А.И., Шолькина Л.В., Иванов П.К., Чинарева И.В.).

.0. Набор реактивов для радиоиммунологического определения РЭА в сыворотке крови человека // Тезисы докладов на Межд. симпозиуме стран-членов СЭВ по радиофармацевтическим препаратам и наборам для радиоиммунологического анализа, Обнинск, 1986, стр.107 (совестно - Шолькина Л.В., Щербань А.И. и др.).

1. Принципы получения и использования специфических антител в методах радиоиммунологического анализа // Тезисы докладов на Межд. симпозиуме стран- членов СЭВ по радиофармацевтическим препаратам и наборам для радиоиммунологического анализа, 06-

нинск.1986,стр.107 (совместно - Вигдорович И.П.,Карпова Т.В. и др.).

Основные принципы создания радиоиммунологических систем для количественного определения белков// УН Всесоюзный симпозиум по химии белков и пептидов, Таллин, 1987, стр.49-50 (совместно - Мороз И.Н., Дрожденюк А.П.).

Радиоиммунологическая тест-система для определения бета-2-микроглобулина // Мед.радиология, 1989, N 2, стр. 44-47 (совместно - Чащин B..JI., Дрожденюк А.П., Кравчук В.Н. и др.). Подходы к разработке радиоиммунодиагностиков для анализа свободных легких цепей с применением моноклональных антител // Тезисы Общесоюзной конференции "Актуальные вопросы в биохимической и иммунологическои диагностике злокачественных нобооб-разований", Москва, 1989. стр. 69-70 (совместно - Вигдорович И.П., Макаренко М.В.).

Получение антител к плацентарному лактогену для радиоиммунологического анализа // Проблемы эндокринологии, 1989, т. 35, N 2, стр. 77-81 (совместно - Вигдорович И.П., Мороз И.Н., Хведченя Е.А.).

К вопросу создания иммунологических тест-систем для анализа свободных легких цепей иммуноглобулинов с применением моноклональных антител // Тезисы докладов Первого Всес. иммунологического съезда, Москва, 1989, т. I, стр.167 (совместно - Вигдорович И.П.).

Набор реактивов для радиоиммунологического определения плацентарного лактогена (РИО-ПЛ-1251) // Сб. пятого Международного симпозиума по радиофармацевтическим препаратам и наборам для радиоиммуноанализа, НРБ, София, 1989, стр. 26 (совместно -Мороз И.Н., Вигдорович И.П., Макаренко М.В.,Хведченя Е.А.). Радиоиммунологическая тест-система для анализа свободных легких цепей иммуноглобулинов // Сб. пятого Международного симпозиума по радиофармацевтическим препаратам и наборам для радиоиммуноанализа, НРБ, София, 1989, стр. 26 (совместно -Вигдорович И.П., Макаренко М.В.).

Rardioimnmimeassay application for the esttimaation of the peculiaritis of tne functional state of hormone systems in angina pectoris // Intern. XXY Symposium fiiz huklearmedizin, Leipzig,1989,p.77 (совместно с - Лившиц И.В., Романчак М.Н.). Атрыманне антыцел да стэро1дных i тырэо1дных гармонау для ix радые1ммунаанал1зу // Весц1 АН БССР, сер. xím. навук, 1990, HI, стр.76-79 (совместно-Вигдорович И.П..Гончарик A.B.). Оптимизация иммуноферментной аналитической системы для определения прогестерона и кортизола с применением лактатдегидро-геназы // Сб.:.Проблемы биотехнологии физиологически активных веществ,Москва, 1990, стр.115-126 (совместно - Метелица Д.И., Маркина В.Л., Еремин А.Н.).

Специфические антитела для иммунохимического анализа бел;. -вых антигенов // Весц1 АН БССР, сер. xím. навук, 1990, К стр. 97-101 (совместно с - Вигдорович И.П., Гончарик A.B.). Approaches to the development of Radiodiagnostic test for the analysis of light chains of immunoglobulins in vitro // Europ. Journal Nuclear Medicine, 1990, v.16, N 739, p.S 169 (совместно - Вигдорович И.П.).

СЗа and С4а anaphylatoxins of complement system in autoimmune disease // Complement and Inflamation Abstr. 3rd Europ. Meeting on Complement in Human Disease, Kargur, 1990, N 7/3, . 162 (совместно - Ложкина Т.А., Титов Л.Н.). спользование радиоиммуноанализа для оценки функционального

состояния организма при аутоиммунной патологии /7 I Иммунологический съезд Белоруссии, Минск, 1990, стр. 40 (совместно - Ложкина Т.А., Лившиц И.Б., Романчак М.Н., Мрочек А.Г.).

26. Оптимизация иммуноферментной аналитической системы для определения пргестерона с использованием пероксидазы хрена // Сб.: Проблемы биотехнологии физиологичсеки активных веществ, Москва, 1990, стр. 100-114 (совместно - Нетелица Д.И., Артемчик В.Д.).

27. Иммунорадиометрическая тест-система для анализа легких лямбда-цепей иммуноглобулинов// I Иммунологический съезд Белоруссии, Минск, 1990, стр. 40 (совместно - Вигдорович И.П., Макаренко М.В.).

28. Радиоиммунологическое определение плацентарного лактогена человека набором реактивов РИО-ПЛ-1251 // Пробл. эндокринол., 1990, т. 36, N 3, стр. 33-37 (совместно - Вигдорович И.П., Мороз И.Н., Хведченя Е.А. и др.).

29. Функция щитовидной железы у жителей Минской области // Здравоохранение Белоруссии, 1991, N 7, стр. 19-22 (совместно -Лившиц И.Б., Ващенко В.А., Романчак М.Н., Шерстюк Г.В.).

30. Роль показателей гомеостаза у женщин и профилактика осложнений при преждевременных родах // Тезисы докл. Y съезда акушеров-гинекологов и неонотологов Белоруссии, Брест, 1991, стр.359-361 (совместно - Вавилова Л.В., Дуда И.В.,Гончарик A.B., Дудко Н.В.).

31. Особенности фето-плацентарной системы при угрожающих преждевременных родах у больных с инфекционными заболеваниями // Сб.: Репродукция, планирование семьи и экстрагенитальная патология, Бобруйск, 1992, стр. 89-90 (совместно - И.В.Дуда, Л.Б.Вавилова, А.В.Гончарик).

32. Immunoradioniettric test for quantitation of human immunoglobulin free light chains // Europ. J. Nuclear Medicine, 1992, vl9, N8, p.692 (совместно - Вигдорович И.П., Бакович Л.И.).

33. Radioimmunoassay study of somatostatine level in vessel violations // XYI Congr. of Spanish Society of Nucl. Med., May 24-28 1992, Madrid, p.119 (совместно - Шерстюк Г.В., Романчак М.Н.).

34. Функциональное состояние фето-плацентарной системы при угрожающих преждевременных родах у больных с экстрагенитальной патологией // Сб.: Репродукция, планирование семьи и экстрагенитальная патология, Бобруйск, 1992, .стр. 89-90 (совместно - Вавилова Л.В., Дуда И.В., Дудко Н.В.).

35. Радиоиммуноанализ в оценке функционального состояния системы гипофиз-щитовидная железа // Вести АН Беларуси, сер. хим. наук, 1993,N2 (совместно - Мрочек А.Г.).

36. Радиоиммуноанализ в оценке функциональных резервов гонад и коры надпочечников у больных ревматоидным артритом // Вести АН Беларуси, сер. биол. наук 1993, N4 (совместно-Мрочек А.Г., Романчак М.Н.).

37. Способ получения ферритинспецифических антител // А.С.СССР N 1503508 (совместно - Марцев С.П., Вигдорович И.П., Лепе-шева Г.И., Чейкина A.B., Василевский В.И.).

38. Способ получения антисыворотки К раково-эмбриональному антигену // А.С.СССР N 1361763 (совместно - Чащин В.Л., Корень H.A., Вигдорович И.П.).

39. Состав для радиоиммунологического определения трийодтиронина в сыворотке KDOBH // А.С.СССР N1256749 (совместно - Стрель-ченок O.A., Свиридов О.В., Круненко С.А., Деркач Т.А.).

40. Способ очистки инсулина // A.C.СССР N 1312779 (совместно -

Чащин В.JI., Мороз А.П., Дрожденюк А.П.).

41. Способ иммуноферментного определения прогестерона в сыворотке крови человека и животных // А.С.СССР N1381402,( совместно -Нетелица Д.И., Артеичик В.Д., Шостак H.D.).

42. Способ получения антисыворотки к кортизолу // A.C. СССР N 1324134 (совместно - Каопова Т.В., Гончарик A.B., Матве-енцев В.Д.).

43. Состав для радиоимунологического определения тироксинсвязы-вающего глобулина // А.С.СССР N1338603 (совместно - Марцев С.П., Чейкина A.B., Свиридов О.В.).

44. Способ получения антисыворотки к инсулину // A.C. СССР N 1349046 (совместно - Чащин В.Л., Корень H.JI., Цыбовская В.В.).

45. Способ получения антисывороток к гормонам // A.C. СССР N1264428 (совместно - Карпова Т.В., Вигдорович И.П., Матве-еицев В.Д.).

46. Состав для радиоиммунологического определения тироксина в сыворотке крови человека // A.C. СССР N 1256750 (совместно -Стрельченок O.A.,Крупенко С.А., Бабынина И.Д., Свиридов О.В.)

Информация о работе

Пивень, Надежда Викторовна
доктора медицинских наук
Москва, 1993
ВАК 03.00.04

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Радиоиммуноанализ в оценке гормонального гомеостаза ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Радиоиммуноанализ в оценке гормонального гомеостаза"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Радиоиммуноанализ в оценке гормонального гомеостаза
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия