Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Радиационно-индуцированный адаптивный ответ в лимфоцитах человека в норме и при синдроме Дауна

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Радиационно-индуцированный адаптивный ответ в лимфоцитах человека в норме и при синдроме Дауна"



...

ч о

^ V?

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ

РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи УДК 616.899.65-092:61 2.42.94.0»4.482.014.49

ЗВЕРЕВА Светлана Викторовна

РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННЫЙ АДАПТИВНЫЙ ОТВЕТ В ЛИМФОЦИТАХ ЧЕЛОВЕКА £ НОРМЕ И ПРИ СИНДРОМЕ ДАУНА

03.00.15. "Генетика"

Автореферат

диссертации нэ соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1992

Работа выполнена в Проблемной научно-исследовательской лаборатории возрастной биохимии межфакультетского лабораторного комплекса Российского государственного медицинского университета.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор А.П.Акифьев, доктор медицинских наук, профессор Г.Р.Мутовин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Чеботарев А.Н., кандидат биологических наук Жлоба A.A. ведущее учреждение: Институт общей генетики РАН.

Защита диссертации состоится "j/P" 199jTr. в _ часов на

заседании специализированного Совета Д-001.16.01 Медико-

генетичсского научного центра РАМН по адресу: 115478 Москва, ул. Москворечье д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГНЦ РАМН.

Автореферат разослан "/f" 1992 г.

Ученый секретарь специализированного Совете доктор медицинских наук, профессор

Л.Ф.Курило

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Адпптипный отпет (АО) представляет собой защитную реакцию клетки и ответ на действие малых доз повреждающих агентов, в частности, таких мутагенных факторов, как ионизирующее излучение и алкилирующие соединения. Сам феномен АО был известен, по-видимому, давно. Однако количественный анализ клеточных адаптивных реакций стал интенсивно изучаться с использованием современных методов регистрации биологических эффектов лишь около 10 лет назад. Першие патогенетические данные . о радиационно-индуцироншшом адаптивном ответе (РИАО) в клетках человека были опубликованы в 1984г. (0!теп е< а1., 1984).

АО можно рассматривать как одно из проявлений клеточного гомеостаза. В этом отношении он составляет часть единого комплекса реакций клетки, направленных на защиту ее важнейших структур, в первую очередь генетического аппарата. АО наблюдается у абсолютного большинства здоровых людей, однако не у всех. В то же время в литературе отсутствуют данные о том, как проявляется радиационно- и химически индуцируемый АО при различных патологических процессах. Между тем известны многие наследственные заболевания, общим признаком которых является повышенная чувствительность хромосом к действию мутагенных факторов. В частности, чувствительность генетического аппарата клеток при синдроме Дауна к дейепшю ионизирующих излучении повышена по сравнению с нормой (А.П.Чудина, 1968; А.П.Акифьеа и др., 1983). Для этих же больных характерны и другие клинические признаки синдромов хромосомной нестабильности: склонность к злокачественным опухолям, иммунодефицптное состояние, снижение продолжительности жизни, признаки преждевременного старения, неврологические расстройства. Традиционная точка зрения в отношении этиологии болезней хромосомной нестабильности сводится к тому, что они возникают в результате мутаций в генах, кодирующих ферменты репарации ДНК, или каких-либо других нарушений самого репарационного процесса. Однако нельзя исключить, что по крайней мере какие-то звенья биохимических процессов, конечным следствием

которых является хромосомная нестабильность, вызнаны дефектом системы АО.

Пока что нет единого мнения о механизме и природе тех клеточных процессов, которые ведут к формированию самого ЛО. В связи с этим нет и общепринятой схемы тестирования индивидуумов по показателям АО. В литературе имеются лишь единичные сведения о факторах, модифицирующих реакцию ЛО. Неизвестно, как влияют на РИАО радиопротекторы и радиосенсибилизаторы. Не вполне ясны также условия, определяющие то физиологическое состояние клеток, при которых формируется реакция АО на действие малых доз мутагенных факторов. Между тем очевидно, что если бы такие тесты существовали и были бы достаточно экспериментально обоснованы, то они вполне могли бы использоваться в качестве диагностического признака, характеризующего клеточный, в частности генетический гомеостаз в норме и при различных, как наследственных, так и ненаследственных, заболеваниях человека.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение реакции РИАО в клетках нормальных людей и больных с синдромом Дауна. По своим биофизическим характеристикам, ответственным за радиочувствительность, хромосомный аппарат клеток больных с этим заболеванием занимает в человеческой популяции крайнее положение. Поставленная цель определила необходимость решения следующих задач:

1. Разработка наиболее надежной, пригодной для массового исследования методики анализа РИАО в лимфоцитах человека, культивируемых с ФГА, по тесту "аберрации хромосом" (АХ).

2. Изучение РИАО в лимфоцитах больных с трисомной и мозаичной формами синдрома Дауна.

3. Экспериментальная оценка влияния синтетического антиоксиданта - анфена на АО у нормальных людей.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Впервые показано отсутствие РИАО в лимфоцитах больных с синдромом Дауна. В случае больного с мозаичной формой синдрома

Дауна установлено, что АО отсутствует как в трисомных, так и в диплоидных клетках.

Предложена методика цитогенетического тестирования индивидуумов на РИЛО как показатель генетического гомсосгаза.

Обнаружена неоднозначность эффекта стимулирующего действия малых доз ионизирующих излучений в зависимости от физиологического состояния клетки. Показано, что в некоторых случаях стимуляция, регистрируемая в хачестве феномена АО, не наблюдается и что возможен противоположный АО эффект, то есть радиосенсибилизация при действии малых доз.

Показано отсутствие защитного действия малых доз радиации в системе ЛО при инкубации лимфоцитов в присутствии синтетического аятиоксиданта анфепа, обладающего радиопротекторным действием.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Разработка цитогенетического метода регистрации АО в лимфоцитах человека, культивируемых с ФГА, пригодного для практического применения.

2. Обнаружение зависимости формирования АО от генетических и средовых факторов, в том числе от способа облучения.

3. Отсутствие АО в клетках больных с синдромом Дауна, как при трисомнои, так и при мозаичной формах, причем в последнем случае АО не возникал и в трисомных, и в диплоидных клетках.

Aupofinniui работы. Основные положения диссертации доложены на I Всесоюзном съезде радиобиологов (Москва, 1989), Рабочем совещании по исследованию механизмов радкациоино-ипдуцированного мутагенеза и репарации ДИК (Дубна, 1990), II Всесоюзном съезде медицинских генетиков (Алма-Ата, 1990), VIII Международном конгрессе по генетике человека (Вашингтон, 1991), Рабочем совещании "Методы радиационной цитогенетики" (Нойерберг, 1991).

Получено положительное решение от 3.01.92 по заявке No 4939474/14 (043764 от 24.05.91) МКИ G01N 33/483 "Способ отбора лиц в группу риска по заболеваниям, обусловленном хромосомной нестабильностью" (свидетельство No 140702).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на Ж листах машинописного текста, содержит таблиц, ^рисунков, библиографический указатель

включает -^^наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Настоящая работа выполнена на лимфоцитах периферической крови человека, культивируемых с ФГА по стандартной методике Хангерфорда. К 0,5 мл венозной крови добавляли 6 мл среды Игла, 1,5 мл эмбриональной сыворотки и 0,15 мл ФГЛ ("Маипсх", Болгария). АО был исследован у 6 клинически здоровых доноров (контрольная группа) и 7 больных с синдромом Дауна. Клиническое обследование доноров выполнено сотрудниками кафедры нервных болезней педиатрического факультета, кафедры детских болезней лечебного факультета Российского государственного медицинского университета и Детской городской больницы N0 6 г.Москвы. Краткие сведения о донорах приведены в таблице 1.

Анализ аберраций хромосом проводили метафазным методом. В каждом варианте эксперимента исследовали от 50 до 350 метафаз. Всего изучено около 20 тыс. метафаз. Для анализа отбирали пластинки, отвечающие стандартным требованиям относительно спирализации хромосом, имеющие не более 3 наложений и с числом хромосом от 44 до 47. Подсчитывали обмены (дицентрнки, три- и тетрацентрики, центрические и ацентрические кольца) и свободные парные фрагменты, а также хроматидные аберрации.

При изучении АО облучение проводили адаптирующей (стимулирующей) и повреждающей дозами в различных стадиях клеточного цикла в зависимости от условий эксперимента. Облучение повреждающей дозой (ПД): 3,0 Гр (в в) -фазе) и 1,5 Гр (в Сз-фазе)

проводили от источника 60Со (мощность дозы - 40 рад/мин) на установке ГУБЭ-3000. Облучение адаптирующей дозой (АД) проводили на передвижном рентгеновском промышленном аппарате типа РУП-200-20-5 (РУП1 МЗ). Доза стимулирующего рентгеновского облучения (190 кВ, 6 мА, 2 мм Си, мощность дозы 3 сГр/мнн) составила

3 сГр. При культивировании в присутствии тритиевой воды активность выбирали таким образом, чтобы суммарная доза за все время культивирования (54 часа) составила около 3 сГр (4 мкКюри/мл),

Таблица 1.

Список оПследон:иип.1\ доноров

N0 п/п Донор Возраст Карнотип

Контрольная группа доноров

1 К1 35 лет 46,XX

2 К2 25 лет 46.ХХ

3 КЗ 23 года 46,Х^

4 К4 25 лет 46,ХУ'

5 К5 27 лет 46,ХУ

6 Кб 6 мес. 46, ХУ-

Доноры с синдромом Дауна

7 СД1 4 мес. 47.XX + 21

8 СД2 6 мес. 47,ХУ + 21

9 СДЗ 6 мес. 47,ХУ + 21

10 СД4 16 лет 47,XX + 21

И СД5 16 лет 47.ХУ + 21

12 СД6 14 лет 47,ХУ + 21

13 СД7 3 мес. 25%-46,ХУ/ /47,ХУ + 21-75%

При оценке индукции АО считалось, что АО существует, если наблюдаемое (Н) число аберраций хромосом в клетках, облученных как адаптирующей, так и повреждающей дозой было достоверно ниже ожидаемого (О) числа аберраций хромосом, определяемого как сумма эффект«» от двух доз в отдельности. Срлпнение с наблюдаемой частотой проводили по (-критерию. Вывод о существовании АО делался на 95%-ом уровне значимости; если '«'о.оо- считалось, что

АО отсутствует.

Изучено влияние на АО синтетического антиоксиданта анфена (соединение относится к классу затрудненных фенолов, синтезировано А.А.Володькиным в Институте химической физики РАН). Анфеи хорошо растворим в воде и, следовательно, в культуральной среде, он

не токсичен для лимфоцитов в пределах концентраций, различающихся на два порядка, 10"3 — 10~5М. В наших экспериментах концентрация анфена составила 10"4М. Антиоксидант присутствовал в культуральной среде в течение всего времени культивирования.

В качестве другого возможного модификатора АО использовали лазерное облучение кропи. Облучение венозной кропи проводили внутрисосудистым способом через световод за 2 часа до стимуляции лимфоцитов ФГА с помощью аппарата лазерного облучения АЛОУ-2 с длиной волны 0,63 мкм, мощностью 2 мВт и длительностью 15 минут каждого из пяти сеансов. Исследование АО в этих случаях проводили по схеме З-вг-

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Исследование АО в клетках контрольных доноров при различных схемах эксперимента.

Для исключения влияния индивидуальных особенностей доноров каждый раз контрольные доноры группировались в разных экспериментах и исследование проводили на клетках двух доноров, при этом для одного из обследуемых доноров данный вариант повторялся 2-3 раза. В каждом отдельном варианте обработки различий между донорами выявлено не было, поэтому результаты были объединены и в дальнейшем рассматривалась контрольная группа в целом (К). В повторных экспериментах на лимфоцитах одного и того же донора по определенной схеме или даже по разным схемам феномен АО воспроизводился.

С целью выбора оптимальной схемы индукции АО были испытаны различные протоколы экспериментов с учетом стадий клеточного цикла, на которые приходятся воздействия, временного интервала между облучениями и качества излучения, которым создается адаптирующая доза (рис.1 и 2).

а) Облучение адаптирующей дозой - в стадии во за 1 час до

стимуляции ФГА, повреждающей дозой 3,0 Гр - через 6 и 16 часов после начала культивирования (О0-О1);

б) Облучение адаптирующей дозой - через 2 часа после стимуляции ФГА, повреждающей (3,0 Гр) - через 6 часов и через 16 часов (б|-О,);

9ГА )К $ог/>

%

£ |

Ы В 4

а) Со -С*

№ г ЗОГр \

ш т €Н ■ . _ Н

0,1

Ф С"Со

ФЫ г

у

&

00 0£

5С&П

¡1 I

т

%г %\т

СО Ф 4*?$ о,2в

з) Оо'Оо

*

I

№

00 <5/ 5 02С2П

Рис.1. Схемы экспериментов по ¿зучешно адаптивного ответа в клетках группы контрольных доноров при различных зэрлактах адаптирующего и поврездавдего воздействия.

6о -

Б. ~ Б.

0,3

о,г

0.1-

61 - 0г

Б ~ Ъг

[51 - Ъг

НТО -

Рисунок 2. Адаптивныи ответ в клетках группы контрольных доноров различных схемах эксперимента. Варианты 6о - 61 и 61 - относятся схемам а) и 6) на рис.1, соответственно.

Примечание. На рис.2 и далее по оси ординат - число аберраций на клетк (и - ожидаемое, Н - наблюдаемое)

в) Адаптирующее облучение в О0 за 1 час до стимуляции ФГА, повреждающее в дозе 1,5 Гр - на 48 часу культивирования (во-Оз);

г) Облучение адаптирующей дозой проводили через 2 часа после начала культивирования, а повреждающей - через 48 часов (С|-01);

д) Адаптирующая доза 3 сГр - на 30 часу после ФГА-стимуляции, повреждающая - на 48 часу (Б-йг),

с) Адаптирующая доза 3 сГр в поздней 8 - [Б] на 44 часу от начала стимуляции ФГА, повреждающая 1,5 Гр в вз на 48 часу культивирования ([8] -в^);

ж) Повреждающей дозой 1,5 Гр на 48-м часу облучали клетки, культивируемые в присутствии тритиевой воды, 4 мкКюрн (ПТ0-02>;

з) Адаптирующая доза 3 сГр в во за 6 часов до

стимулирования ФГА, повреждающая - 1,5 Гр через 5 часов после первого облучения, в Со фазе, (Оо-Од), в данном варианте проводили

облучение первой дозой как цельной крови, так и клеток с добавлением среды Игла; в промежутке между облучениями первой и второй дозами кровь находилась как при I - + так и при

I = + 4"С.

и) При изучении модифицирующего действия антиоксидантов на АО облучение проводили по схеме Б-вг- В течение всего времени

культивирования в питательной среде присутствовали анфен в концентрации 10~4М.

к) При изучении модифицирующего действия лазерного облучения АО исследовали по схеме Э-Оз- Предварительно проводили 5 сеансов

облучения венозной крови лазерным излучением через световод с помощью аппарата лазерного облучения АЛОУ-2, длительность каждого сеанса составила 15 минут.

Следует оговорить, что обозначение протокола как 8-С2 является

достаточно условным, так как к 30 часу лишь небольшая часть популяции лимфоцитов вступает в фазу синтеза ДНК.

Первая группа экспериментов была спланирована таким образом, чтобы облучение повреждающей дозой приходилось на стадию в]. При этом облучение АД проводили н стадиях во и в). Ни в одном варианте (Со-С^ и (С|-0|) индукции АО не обнаружили.

Вторая группа экспериментов предполагала облучение ПД в фазе Ог- Облучение АД при этом приходилось на Сд-, Ор, 8- и [Б]-

стадии клеточного цикла. При предварительном рентгеновском облучении в Go-, G|- и S- стадиях наблюдалось снижение на 30-50 % выхода хромосомных аберраций, индуцированных в G2. При этом наиболее эффективными оказались схемы (Gq-Gj) и (S-G2). Индукцию АО при предварительном облучении в Gq наблюдали Cai и Liu (1989), однако эти данные не согласуются с данными Shadley et al. (1987). Для дальнейших исследований мы выбрали схему (S-G2), наиболее часто используемую и другими авторами. АО возникал также и в клетках, предварительно облученных в Gj, схема (Gi-Gj); но не наблюдался в случае ([S]-G2>.

Клетки культивировали в присутствии тритиевой воды (HTO-Gj), мощность дозы /З-облучения в этом случае была ничтожной по сравнению с Х-лучами - в 103 раз меньшей. В этом варианте отмечен достоверный защитный эффект НТО по отношению к последующему действию ПД.

2. АО в клетках больных с синдромом Дауна. В группу обследованных больных с синдромом Дауна вошли дети в возрасте 46 мес. (доноры СД1-СДЗ) и в возрасте 14-16 лет (СД4-СД6). Эксперименты проводились по схеме S-G2. Поскольку при синдроме

Дауна отмечается выраженный клинический полиморфизм, то объединение результатов мы сочли нецелесообразным. Контрольной группой для изучения индукции АО в клетках больных с синдромом Дауна были доноры К2-К5 и донор Кб. Следует отметить, что донор Кб, ребенок 6 мес., имел нормальный АО. Этот факт спидетел!>ствует о том, что АО как клеточная гомеостатичсская реакция формируется уже в грудном возрасте. У 5 из 6 обследованных больных с синдромом Дауна АО отсутствовал (рис.3).

Относительно одного из них, донора СДЗ, достоверный вывод об отсутствии или наличии АО сделать нельзя из-за недостаточного количества метафаз, доступных для анализа (t0.09<<t<'t0>95) Следует

отметить, что повышения радиочувствительности клеток больных с синдромом Дауна по сравнению с контролем при облучении в G2

обнаружено не было.

Исследован АО по схеме S-G2 в лимфоцитах больного с

мозаичной формой синдрома Дауна. 75% клеток этого больного имели

набор 47,ХУ + 21, тогда как 25% были диплоидными. АО отсутствовал как в трисомных, так и в диплоидных клетках.

0,4

0,3

0,2

0,1

I

I

¿1

46,ХУ 47,ХУ+21 контроль С/11 СД2 СДЗ СД4 СД5 СДб СД7

Рисунок 3. Адаптивным ответ в лш-уоиитах больных с синдромом Дауна

3. Модификация АО. Для учета возможного влияния на результаты индукции АО вторичного излучения продуктов раднолиза воды, возникающих после облучения АД, было проведено облучение первой дозой как цельной крови, так и клеток в среде Игла без добавления ФГА. Облучение ПД в этом эксперименте проводили в стадии во (табл.2).

Таблица 2

Адаптивный ответ в клетках контрольных доноров при облучении по схеме вд-во в двух вариантах эксперимента

Вариант опыта Количество клеток Число АХ на клетку

наблюдаемое ожидаемое

контроль 50 0,02 ± 0,02

0.03 Гр(а,«) 100 0,04 ±0,02

1,5 Гр(а.*) 178 0,25 ± 0,04

0,03 Грч- 1,5 Гр(а.*) 0,03 Гр(б") 200 0,23 ± 0,03 0,29 ± 0,04

81 0,02 ± 0,02

1,5 Гр(б,**) 95 0,13 ±0,04 0,15 ±0,04

0,03 Гр + 1,5Гр(б.**> 50 0,31 ±0,08 0,15 ± 0,04

0,03 Гр(а,*> 100 0,03 ± 0,02

1,5 Гр(а.*) 344 0,24 ± 0,03

0,03 Гр + 1,5 Гр(а.*) 189 0,30 ± 0,04 0,27 ± 0,03

0,03 Гр(б,**) 121 0,07 ± 0.02

1,5 Гр(б,»*) 169 0,24 ± 0,04

0,03 Гр + 1,5 Гр(б,") 109 0,45 ± 0,06 0.30 ±0,05

контроль 50 0,02 ±0,02

0,03 Гр(б,"> 122 0,07 ± 0,02

1,5 Гр(б,**> 77 0,95 ±0,11

0,03 Гр+1,5 Гр(б,**) 104 1,04± 0,10 1,02 ±0,03

Примечание. Между двумя облучениями цельную кровь (*) или клетки в среде Игла без добавления ФГА (**) помещали в термостат при температуре + 37°С (а) или в холодильник при температуре + 4"С (б).

Индукция АО в схеме (Од-Со) отсутствует в случае, если в промежутке между облучениями, составляющем 5 часов, цельная кронь или лимфоциты в среде Игла находились при температуре + 37°С. В случае же воздействия холодом в промежутке между облучениями, когда в течение указанного интервала кровь или клетки находились при температуре + 4°С, в результате совместного действия АД и ПД наблюдается явление сенсибилизации, заключающееся в том, что

ожидаемый выход АХ от действия двух доз оказывается достоверно выше суммы аффектов от каждого облучения в отдельности. Этот эксперимент был полностью повторен на клетках того же донора через год. 15 атом случае отсутствовало как адаптирующее, так и сенсибилизирующее действие АД 3 сГр рентгеновских лучей.

Мы изучили влияние синтетического антиоксиданта анфена на индукцию АО. Как и другие авторы (Ц.А.Чихладзе, 19S9), мы наблюдали радиозащитное действие антиоксиданта (табл.3).

Таблица 3.

Адаптивный отпет п клетках контрольных доноров при культивировании в присутствии анфена по схеме S-Gj.

Вариант опыта Количество клеток Число АХ на клетку

наблюдаемое ■и ожидаемое

контроль 50 0

анфен 50 0,02 ±0.02

0.03 PpS 131 0,04 * 0,02

анфен + 0,03 Гр S 100 0,02 ±0,01

1,5 Гр G2 200 0,18 ± 0,03

анфен + 1,5 Гр Gj 250 0,10 + 0,02

0,03 Гр S + + 1,5 Гр Сп 198 0,11 ±0,02 0,22 ± 0,03

анфен + 0,03 Гр S + 1,5 Гр 02 173 0,12 ±0,03 0,10 ±0,03

Количество аберраций хромосом при действии дозы 1,5 Гр снижалось на 30-40%. В отношении дозы 3 сГр о защитном действии судить трудно, поскольку цитогенетичсский эффект этой дозы очень мал. При комбинированном воздействии антиоксиданта и двух доз облучения по схеме Э-Оз выход аберраций хромосом был точно таким

же, как и после облучения второй дозой в присутствии антиоксиданта. Отсюда можно заключить, что дополнительного снижения частоты АХ после действия малой дозы (3 сГр) не происходит.

Мы изучали также модифицирующее действие предварительного лазерного облучения (внутривенного) на индукцию радиационно-индуцированного АО (табл.4).

Таблица 4.

Адаптивный ответ в клетках контрольного донора после одного и пяти сеансов терапевтического лазерного облучения.

Вариант опыта Количество клеток Число АХ на клетку

наблюдаемое ожидаемое

контроль 100 0,03 ± 0,02

1 сеанс 100 0,03 ± 0,02

5 сеансов 100 0,03 ± 0,02

0,03 Гр Б 150 0,07 ± 0,02

1 сеанс + + 0,03 Гр 8 50 0,06 ± 0,03

5 сеансов + + 0,03 Гр 8 133 0,04 ± 0,02

1,5 Гр С2 150 0,27 ± 0,04

1 сеанс + + 1,5 Гр 02 66 0,21 ± 0,05

5 сеансов + + 1,5 Гр 02 69 0,36 ±0,10

0,03 Гр 5 + + 1,5 Гр в2 131 0,15 ±0,03 0,34 ±0,04

1 сеанс + + 0,03 Гр Б + + 1,5 Гр С2 58 0,29 ± 0,07 0,27 ±0,06

5 сеансов + + 0,03 Гр Б + +1,5 Гр бг 67 0,36 ±0,07 0,40 ±0,12

Известно, что лазерное излучение обладает значительной биологической активностью: противовоспалительным действием, оказывает анальгизирующий и противоотечный эффект, нормализует процессы перекисного окисления липидов, положительно влияет на

состояние иммунной системы. У донора, подвергшегося воздействию лазерного облучения ранее в нашей лаборатории был показан ЛО в опыте, где в качестве адаптирующей дозы использовали [3Н]-тимидин (данные Л.В.Якименко). Однако, у отого донора в схеме Б-Сп после

воздействия однократного лазерного облучения АО исчезал; он не проявлялся и после пятикратного воздействия лазером. Восстановление способности к АО в клетках данного донора было отмечено через два месяца после окончания курса.

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе показано, что реакция Р11ЛО, регистрируемая цитогенетическим методом с помощью изучения аберраций хромосом, зависит как от генетических, так и от негенетических ! факторов. Контрольная группа допоров, сформированная нами, включала 5 человек. У одного из доноров, клинически здоровой женщины 35 лет АО не наблюдался при постановке опыта с интервалом в 3 года. Однако, главным аргументом, свидетельствующим в пользу роли генетических факторов, служит впервые обнаруженный нами факт отсутствия АО у 6 из 7 больных с синдромом Дауна. С другой стороны, результаты, полученные при исследовании клеток больного с мозаичной формой синдрома Дауна, указывают на то, что генетические факторы в данном случае влинкм на АО, по-видимому, иным путем, нежели гены, контролирующие репарацию ДНК. Отсутствие АО в диплоидных клетках у донора СД7 говорит о том, что клеточная реакция на малые дозы формируется в зависимости от состояния организма. Таким образом, в данном случае влияние генетических факторов на АО непрямое. Можно предположить, что диплоидные клетки в организме больного с мозаичной формой синдрома Дауна реагируют на низкие дозы как трисомные.

Интересно отметить также, что у 7 изученных нами больных с синдромом Дауна чувствительность к однократному воздействию дозы 1.5 Гр практически не отличалась от таковой контрольных доноров. Этот факт может свидетельствовать о том, что радиозащитное действие малых доз и репарация ДНК осуществляются различными и независимыми механизмами и являются, таким образом, взаимодополняющими реакциями клеточного гомеостаза.

Проведенные нами эксперименты по модификации АО, в частности, воздействие температуры и лазерного облучения, указывают на то, что АО может зависеть от многих неспецифических факторов. Поэтому мы полагаем, что изучение АО может служить показателем состояния генетического гомеостаза не только при наследственных заболеваниях, подобных синдромам хромосомной нестабильности (атаксия телеангиэктазия, анемия Фанкони и др.), но и при заболеваниях, не имеющих явной наследственной компоненты.

Проведенные нами и другими авторами исследования позволяют считать, что АО при схеме Б-Сг является устойчивым показателем

радиозащитною действия малых немутагенных доз радиации. В особенности в этом убеждает наличие АО у шестимесячного ребенка. На основании проделанной работы можно заключить, что АО характеризует возможности сопротивления клетки повреждающим воздействиям, в частности ионизирующей радиации. Поэтому мы предлагаем тест на АО использовать в медицинской практике в качестве показателя генетического гомеостаза. Особый интерес и значение тест на АО может иметь для лиц, испытывающих стрессирующие воздействия, а также проживающих на территориях, где временно или постоянно наблюдается повышенный уровень антропогенных повреждающих факторов.

ВЫВОДЫ

1. Экспериментально определены условия, обеспечивающие надежную и хорошо воспроизводимую регистрацию радиационно-индуцированного адаптивного ответа (АО) по тесту аберрации хромосом (АХ) в лимфоцитах человека, культивируемых с ФГА. АО был обнаружен у 5 практически здоровых людей (из 6 обследованных) при облучении адаптирующей дозой 3 сГр в ранней Б-фазе и повреждающей дозой 1,5 Гр в Сг-фазе и фиксации клеток

на 54 часу.

2. Впервые изучен АО в клетках больных с синдромом Дауна. У 5 из б больных АО отсутствовал.

3. У больного с мозаичной формой синдрома Дауна АО отсутствовал как в трисомиых, так и в диплоидных клетках. Это

означает, что на АО непрямое воздействие может оказать состояние организма.

4. Показано, что реакция АО может быть модифицирована такими факторами, как лазерное облучение, низкая температура, антиоксиданты.

5. На основании полученных результатов высказано предположение, что АО может быть предложен в качестве теста, характеризующего состояние генетического гомеосгаза при наследственных и пснлследстиснных болезнях человека, а также у лиц, проживающих на территориях, загрязненных радионуклидами.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Цитогенетика радиационно-индуцироплнпого адаптивного отпета в лимфоцитах человека.// Труды Рабочего совещания по исследованию механизма рлдиацнонно-индуцнрованного мутагенеза и репарации ДНК. - Дубна, 1990. - С.148-156. (Соавт.: Е.К.Хандогина, Г.Р.Мутовин, Д.0.Зверев, А.В.Антипов, А.П.Акнфьев).

2. Клеточные и молекулярные механизмы синдромов хромосомной нестабильности.// Тез. докл. I! Всесоюзного съезда медицинских генетиков. -- Алма-Ата, 1000. - 0.310. (.Ооапт.: Г.Р.Мч юини, Е.К.Хандогина, П.И.Лндрющенко, Л.Ф. Марченко, Д. О. Зверев, Г.А.Худолий, А.И.Потапенко. Л.В.Якименко, А.П.Лкифьев).

3. Отсутствие ра д на цнон по-индуцированного отпета в лимфоцнгах больных с синдромом Дауна.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1991, т.112, N4)9. - С.290-292. (Соавт.: Е.К.Хандогина, Г.Р.Мутовин, Д.О.Зверев, Е.В.Неудахин, Б.А.Архипов, А.П.Акнфьев).

4. Репарационные процессы в клетках больных с синдромом Дауна.// Республиканский сборник научных трудов "Иммунопатология эндокринной системы у детей и подростков". - Москва, 1091. - СЛ5--78. (Соавт.: Г.Р.Мутовин, Е.К.Хандогина, Е.В.Неудахин, А.Н.Архипе», Д.О.Звереп, А.П.Дкифьеп).

5. Adaptive response in irradiated human lymphocytes: radiobiological and genetical aspects.// Mutation Research. - 1991, v.251. - P.181-186. /E.K.Khandogina, G.R.Mutovin, A.V.Antipov, D.O.Zverev, A.P.Akifyev/. -

6. Adaptive response in lymphocytes from patients with Down's syndrome,// 8th International Congress of Human Genetics, »Washington, October 1991, Abstracts* v.49, No4, Nol473./E.K.Khandogina, G.R.Mutovin, A.P.Akifyev/.