Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пути и методы повышения эффективности диагностики нематодозов

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Пути и методы повышения эффективности диагностики нематодозов"

на правах рукописи

ГАЕВАЯ ЭММА АНАТОЛЬЕВНА Р Г В ОД

- ? Ф£з г:1

ПУТИ И МЕТОДЫ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ДИАГНОСТИКИ НЕМАТОДОЗОВ

Специальность 03.00.19 - паразитология, гельминтология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2000

Работа выполнена в Ростовском Научно-исследовательском Институте микробиологии и паразитологии

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор, заслуженный деятель науки РФ Васерин Ю.И.

Научный консультант: доктор медицинских наук Тер'новская Л.Н. Официальные оппонент: доктор ветеринарных наук,

Ведущая организация - Московская Государственная Академия Прикладной Биотехнологии (МГАПБ)

Защита диссертации состоится " / " / 2000г.

в // часов на заседании диссертационного совета Д 020 04 01 при Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии им. К.И.Скрябина (ВИГИС)

Адрес 117259, Москва, ул.Б. Черемушкинская, д.№ 28 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИГИС

Автореферат разослан " " 2000г.

профессор Даугалиева Э.Х.. (ВИГИС), доктор биологических наук Полетаева О.Г. (ИМПиТМ).

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Р

I

Бережко В.К.

Введение

Актуальность проблемы. Анализ заболеваемости людей шфекционными (кроме гриппа и ОРВИ) и паразитарными заболеваниями :видетельствует о значительном -преобладании гельминтозов над другими юзологическнми формами (З.С. Макарова и соавт.,1994; В.П. Сергиев, 1991; Sergiev V.P., 1993). В Российской Федерации наиболее массовыми среди гельминтозов являются такие нематодозы, как аскаридоз и энтеробиоз. В последние годы резко обострилась эпидемическая ситуация по трихинеллёзу (A.C. Бессонов, 1996; А.Я. Сапунов и соавт., 1996).

В настоящее время для диагностики и изучения кишечных нематодозов (аскаридоз, энтеробиоз и др.) используются рутинные методы исследования. Для повышения низкой чувствительности копроовоскопические методов предложено 3-х - 5-ти кратное исследование фекалий одного и того же человека. Такой подход удлиняет н удорожает копроовоскопнческнх анализы. Ранняя диагностика при кишечных нематодозах затруднена, т.к. методы индикации юных и неполовозрелых паразитов не разработаны (A.C. Козлов, 1985; А.В.Маркин, 1994).

Специфическая диагностика трихинеллёза основана на выявлении антител в сыворотке крови больных и установлении сероконверсии. Серологическая диагностика трихинеллёза отличается достаточно высокой точностью и специфичностью, однако носит ретроспективны п характер (А.Ф. Костецкий, 1989; О.Г. Полетаева и соавт., 1989; Т.И. Твердохлебова и соапт., 1996).

В то же время при многих инфекционных заболеваниях используются методы индикации возбудителей с целью ранней диагностики. Общие принципы ранней диагностики заболеваний были сформулированы В.И. Иоффе (1968); П.Ф. Здродовским (1963).

Поэтому актуальной задачей диагностики гельминтозов является разработка иммунологических методов н средств определения уровня

- 3 -

гуморальных антител и индикации антигенов гельминтов на ранних стадиях заболевания и в различных биологических с>бстратах.

1(аь и задачи исследования. Целью исследования является экспериментальное обоснование подходов к повышению эффективности диагностики нематодозов в зависимости от их патогенетических особенностей.

Дпз достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

разработать общие принципы и дать оценку специфичности и чувствительности иммунологических методов, используемых для выявления антигенно-активных продуктов жизнедеятельности нематод;

изучить динамику выявления экскреторно-секреторных антигенов в различных биологических субстратах;

изучить частоту выявления гуморальных антител у больных нематодозами: дать оценку влияния растворимых компонентов нематод на состояние качественного и количественного состава микрофлоры кишечника и уровень секреторного иммуноглобулина А.

Научная постна. Установлено, что аскариды и острицы содержат фактор, вызывающий агглютинацию стафилококков. В опытах торможения агглютинации с использованием антител к антигенам аскарид и остриц выявлено, что фактор, вызывающий агглютинацию стафилококков, обладает антигенными свойствами. Показана принципиальная возможность использования реакции торможения агглютинации микробов (РТАМ) дня выявления копроантигенов аскарид и остриц.

Показано, что при нематодозач, имеющих кишечную стадию развития паразитов (аскариды, острицы, трихинеллы), могут быть выявлены копроантигены, а в фазе мигрирующих личинок в крови больных (трихинеллез) обнаруживаются циркулирующие антигены. Наличием циркулирующего антигена в крови больных трихинеллёзом в значительных количествах может

- 4 -

Зыть объяснено развитие токсико-аллергического синдрома при этом мболевании.

В эксперименте на животных показано, что в мышечной ткани инвазированных трихинеллами животных накапливаются растворимые антигены, которые могут быть выявлены методом иммуноферментометрического анализа (ИФМА) с 15-го дня инвазии, т.е. в период, когда инкапсуляции личинок ещё не происходит.

Впервые показано, что развитие дисбиотических изменений при кишечных нематодозах (аскаридоз, энтеробиоз) может быть связано с прямым воздействием структурных компонентов нематод на кишечную микрофлору. В частности установлено, что растворимые белки половозрелых аскарид и остриц изменяют адгезивную активность лактобактерий. Выявлена определённая закономерность между развитием дисбиоза и снижением уровня секреторного

Практическая значимость. Установлена принципиальная

возможность использования иммунологических реакций (ИФМА, РТАМ) для выявления копроантигеноз и антигенов нематод, циркулирующих в крови больных, что позволяет применять на практике эти серологические реакции для ранней диагностики нематодозов.

Изучение динамики иммунного ответа при трихинеллёзе показывает, что гуморальные антитела у некоторых больных выявляются на 12-й день болезни. Практически у всех больных трихинеллёзом (100%) на 30-Й-40-Й день болезни выявляются гуморальные антитела к экскреторно-секреторному антигену трихинелл.

Изучение показателей нормальной микрофлоры и секреторного 1цА при кишечных нематодозах обосновывает необходимость применения биокоррекции с использованием зубиотических (лактобактерии и др.) и иммунобиологических (лактсглсбулин) препаратов.

Положения, выносимые на защиту: использование иммунологических методов позволяет выявлять растворимые антигены гельминтов в различных биологических субстратах в зависимости от патогенетических особенностей нематодозов;

подтверждена возможность использования РИГА для серологической диагностики трихинеллёза;

одним из механизмов развития дисбиоза при кишечных нематодозах может быть снижение адгезивной активности лакгобактерий и некоторых показателей местного иммунитета, в частности выражающихся в снижении уровня секреторного IgA.

Реализация и внедрения.

1. Приоритетная справка на предполагаемое изобретение «Агглютинин нематоды A. Lumbricoides» № 97103701 от 11.03.1997г.

2. Лабораторный регламент «Иммуноглобулин энтеробиозный диагностический жидкий», утверждённый Учёным советом РНИИМП. Протокол № 6 от 13.06.96г.

3. Проект производственного регламента и ФС «Диагностикум эритроцитарный трихинеллёзный антигенный сухой». Утверждён Учённым Советом РНИИМП. Протокол № 10 от 3.12.1997г.

4. Методические указания. Профилактика трихинеллёза. Утверждены и введены в действие главным Государственным врачом по Ростовской области от 4 октября 1998.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации апробированы1 на VII научной конференции по трихинеллёзу человека и животных /Москва 1996/.

Диссертация доложена и обсуждена на заседании Учёного совета. РНИИМП /протокол № 7 от 26.11.1997г./. По теме диссертации опубликовано 3 научных работы.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 91 страницах ашинописного текста, иллюстрирована 19 таблицами, 9 рисунками. Состоит из ведения, обзора литературных данных, описания используемых методов и атериалов, 3-х глав собственных исследований, заключения, выводов, рактическнх рекомендаций: список использованной литературы включает 220 сточпиков, из них 105 иностранных.

Содержание работы

Материалы и методы. В работе использованы сыворотки крови и »екалии людей, больных аскаридозом, энтеробиозом, трихинеллезом и ругими гельминтозамн (гименолепидоз. дифнллоботриоз. описторхоз. тронгилоидоз, трихоцефалез, токсокароз, эхнкоконкоз). Определение копро-нтигенов проводили в 50% взвеси фекалий в забуференном физиологическом астворе pH 7,2 - 7.4 с 0,2% азида натрия и 0,3% твина 20, осветленной [ентрифугированием. Растворимые антигены трихинелл выявляли в мышечной кани крыс, зараженных лабораторным штаммом. T.spiralis в количестве 1 и 10 ич/г. Экстракцию антигенов осуществляли на холоде, из мясокостного фарша в |,25 М растворе сахарозы, в течение 18-20 часов (С. А. Нагорный, 1989).

Анализы на яйца гельминтов проводили по общепринятым опроовоскопическям методикам. Для определения копроантигенов 1спользовали реакции двойной иммунодиффузии (РИД) в 1% растворе гарового геля и торможения иммунодиффузии (РТИД) по Оухтерлони Г.Фримель, 1987). Титр антител в сыворотках определяли иммуноферментным нализом (ЙФА) (О.Г.Полетаева, 1988; Voller et al.. 1976) и реакцией непрямой емагглютинации (РИГА). Нами была разработана и применена на практике «акция торможения агглютинации микроорганизмов (РТАМ), теоретической 1Сиовой которой явилось установление способности Stahylococcus aureus cowan, адсорбировать на своей поверхности растворимые кутнкулярно-соматические

антигены нематод (приоритетная справка на предполагаемое изобретение № 97103.701 от 11.03.1997). Так же для определения копроантигенов в фекалиях нами был использован описанныП .М.Егоровым и соавт. (1991) вариант иммуноферментометрического анализа (ИМФА). В основе этого метода лежат конкурентные взаимоотношения в системе антиген-антитело в жидкой фазе, поэтому для его проведения необходимо фиксированное количество специфических антител, которое определяется по стандартной методике ИФА (рис. 1)

Определение секреторного иммуноглобулина А в копрофильтратах больных аскаридозом и энтеробиозом проводили по методике Манчшш.Для изучения адгезивного процесса лактобактерий под влиянием растворимых компонентов нематод, использовали методику предложенную В.И.Брилис и др. (1986), а состав микрофлоры толстого кишечника - определяли по общепринятой методике бактериологического посева фекалий человека для количественного учета микроорганизмов кишечной флоры .

СХЕМА ИГ.ШУИООЕРМЕНТОМЕТРИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

РИСУНОК 1

С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕЧЕННЫХ АНТИТЕЛ И ИММОБИЛИЗИРОВАННОГО АНТИГЕНА

1) инкубация 4

«г—

£

ОЗ-З 2)отнывка А* 3) инкуЗация

" " —О ¿Ь» Э-а ♦ ]}-© >

7Г >0

-о + оз-о

со

J

З-О ¿НЭ-яД-© я*

5)олределенне ферментативной активности. ---—,>

Сниыенне фериентзтмг-ной активности не менее чем п 2 раза по сравнению с отрицательным контролем.

-а

/1. <1

г

ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ; ХЗ 1) инкубация

- э-а < О 'М-Ш

2)отмывкз гл /I

ПН© З-о

З-о

•имиобилизмрованный О-раетвармимй З-д -антитело -вторичные

антиген антиген мочение

антитела

Собственные исследования

1.Выявление растворимых антигенов нематод в различных биологических субстратах

В литературе сведения об определении антигенов аскарид и остриц г фекалиях людей иммунологическими методами отсутствуют, мы предприняли попытку разработать методы, позволяющие выявлять продукты жизнедеятельности нематод.

Первым этапом исследования явилось определение в условиях эксперимента возможности выявления антигенов нематод в фекалиях людей.Для этого к фекалиям здоровых людей добавили от 100 до 0,1 м кг/мл антигенов нематод.

В эксперименте с внесением в фекалии точно дозированного количества кутнкулярно-соматического антигена аскарид, остриц и экскреторно-секреторного антигена трихинелл, было показано, что чувствительность иммуноферментомстрического анализа составляет: при аскаридозе и энтеробииозе - 0,2 ± 0,02 - 0,4 ± 0,02 мкг/мл, при трихинеллезе - 1,25 мкг/мл. В реакциях торможения иммунодиффузии выявляли от 3,4±0,32 мкт/мл до 10,0±3,06 мкт/мл, а в реакции торможения агглютинации микроорганизмов -3,4±0,32 мкг/мл и 10,0 ±0,52 мкт/мл растворимых антигенов аскарид и остриц, соотвественно.

Применение на практике вышеописанных методов показало, что наибольшей чувствительностью обладает иммуноферментометрический анализ. Так, при однократном обследовании этим методом выявляли растворимые копроантигены аскарид и остриц у 85.1 ±7,5% и 60,0±10.2% ннвазированных. в то время как копроовоскопическим методом диагноз был подтвержден у и 12,0+4,6% больных соответственно. Использование для этих целей реакций иммунодиффузии, торможения иммунодиффузии и торможения агглютинации микроорганизмов показало низкую чувствительность.

Определение копроантигенов в РИД положительных результатов не дало. Постановка реакций торможения иммунодиффузии и торможения агглютинации микроорганизмов показала,что у незначительного числа больных аскаридозом и энтеробиозом были выявлены копроантигены (27.2±4,3% и 30.0±9.3%:25,0±4,4% и 0%, соответственно).

Высокая чувствительность ИФМА оправдывает его применение для диагностики кишечных нематодозов, однако, период развития нематод в кишечнике человека от момента проникновения до появления половозрелых особей является относительно длительным, вследствие этого остается неясным, в какой период развития инвазии могут быть выявлены копроантигены.

Для решения этого вопроса были поставлены опыты по заражению кроликоз мышечными личинкам Т. spiralis, с последующим определением динамики уровня копроантигенов у шгаазнрованных животных. Вперзые растворимые антигены в фекалиях были выявлены на 5 день, инвазиии продолжали определяться до 12-го дня после заражения. Наиболее высокий уровнь копроантигнов зарегистрирован на 8-й день инвазии. Концентрация антигенов в фекалиях возрастает с 0,5±0,01мг/г до 1,5±0,2мг/г фекалий, а затем вновь падает. Изучение динамики растворимых антигенов трихинелл в крови при экспериментальном трихинеллёзе показало, что экскреторно-секреторные антигены выявляются с 8-го по 26-й день инвазии, достигая максимума на 19-й день после заражения. Концентрация антигенов трихинелл в сыворотке изменялась с 12,5±0.6мкг/мл до 50,0±4,2мкг/мл. Следовые количества циркулирующего антигена в крови выявлялись до 26-го дня инвазии и составили 5,0±0,6мкг/мл. В течение всего периода наблюдения антитела к антигену трихинелл в сыворотке крови выявлены не были.

При пересчете количества определяемого антигена на животное выявлено, что у кролика при заражении его T.spiralis в дозе ЮООлич/кг массы тела циркулирует 0.1 г антигена. Столь высокий уровень антигенемни

определяет высокую степень интоксикации и аллергии, которая наблюдается при этом заболевании.

В клинической практике диагностика трихинеллеза на ранних этапах заболевания затруднена из-за того, что окончательный диагноз ставится на основании клинических проявлений и лабораторного заключения о наличии антител к антигену трихинелл. Ранняя специфическая диагностика трихинеллёза должна основываться на обнаружении возбудителя или его антигенов в различных биологических субстратах. В этой связи экспериментально подтверждённая возможность обнаружения растворимых антигенов трихинелл с помощью ИФМА представляет определённый интерес для диагностики и прогнозирования клинического течения болезни.

В ветеринарной практике для обнаружения личинок трихинелл, используются различные модификации компрессорной трихинеллоскопии и метод переваривания проб мышц в искусственном желудочном соке. Нами для индикации трихинелл или продуктов их жизнедеятельности был испытан иммунологический метод, позволяющий определить антигены в ткани заражённых животных.

Применение на практике ИФМА показало, что у заражённых животных антигены трихинелл могут быть обнаружены в количестве 2,5±0,3 мкг/мл, на 15-ые сутки после заражения, когда личинки начинают приживляться. В период бескапсульных (30-е сутки) и капсульных личиночных форм (45-е сутки), количество растворимого антигена увеличилось до 5,0±0,2мкг/мл. Иммунологический метод выявления антигенов трихинелл в тканях животных имеет преимущества перед трихинеллоскопией, так как позволяет выявлять как инкапсулированные, так и неинкапсулированные личиночные формы. Кроме того, этот метод дает возможность проводить массовые обследования животных и лишён ограничений, связанных с использованием микроскопической технологии.

Недостаточно высокую чувствительность ИФМА при определении

копроантигенов аскарид (60,0+10,2%) и остриц (85,1 ±7,5%) можно объяснить

- 12 -

тем, что в наших экспериментах использовался кутикулярно-соматнческий антиген, тогда как в фекалиях определялся экскреторно-секреторный антиген.

Специфичность ИФМА при аскаридозе и энтеробиозе составила 22,8+5,4-23,8±7,1%. Высокий процент неспецифических реакций (неспецифическая специфичность по Т. Чарду. 1981) можно объяснить наличием общих антигенов у гельминтов.

Антигены нематод обладают аллергенными и иммуногенными свойствами, а иммунный ответ организма зависит от количества и длительности действия антигенного раздражителя. Эти данные указывают на определенную связь уровня гуморального ответа организма и особенности патогенеза отдельных нематодозов, так при трихенеллезе, сопровождающемся длительной миграционной фазой, уровень и частота иммунного ответа значительно выше, чем при кишечных нематодозах.

2.Выявленне гуморальных аитнтел при нематодозах

Нами было проведено изучение частоты обнаружения и уровня антител при аскаридозе, энтеробиозе и трихинеллёзе.

Гуморальные антитела в ИФА к экскреторно-секреторным антигенам аскарид и остриц были выявлены в незначительных количествах. Невысокий процент (33,3±6,2%) выявления антител к антигену аскарид свидетельствует о том, что гуморальные антитела вырабатываются на антигены личинок аскарид, а не на неполовозрелые особи. К моменту исследования крови в фекалиях больных обнаруживали яйца или половозрелых паразитов и это свидетельствует о том, что с момента заражения прошло примерно около 100 дней.

При определении гуморальных антител к антигенам остриц была этмечена аналогичная закономерность, как и при аскаридозе. Процент положительных находок был значительно ниже, чем в предыдущем случае '21,2+4,1%) и это можно объяснить тем, что энтеробиоз, являясь кишечным гельминтозом не имеет миграционной фазы и иммунный ответ развивается

местно, на уровне кишечника, и гуморальные антитела класса lgG к антигенам остриц, по-видимому, не образуются.

Исследование в ИФА этих же сывороток от больных показало, что эти антитела к антигенам аскарид и остриц были обнаружены в относительно низком проценте случаев (9.7+2,5% и 4.8±1,2%. соответственно).

ИФА обладает более высокой специфичностью, однако низкая чувствительность этого метода при определении антител, связывающихся с антигенами аскарид и остриц, не позволяет рекомендовать этот метод для серодиагностики кишечных нематодозов в том варианте, который был испытан. Можно предположить, что другие варианты ИФА могут оказаться более чувствительными и поэтому исследования в этом направлении являются перспективными.

Изучение гуморальных антител при трихинеллёзе показало, что антитела к ES-Ag трихинелл определяются с большей частотой. Однако, по литературным данным, нет единого мнения о сроках появления антител. Исходя из вышесказанного, нами был проведён анализ динамики антител у 22-х больных, употреблявших в пищу мясо, инвазированное трихинеллами. Антитела к антигенам трихинелл в сыворотке крови в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) начинают выя&тяться с 8-го - 12-го дня в 15,2±7,1% случаев, логарифм среднегеометрического тигра был равен 8,2+1,1. В первые дни заболевания антитела только начинают вырабатываться и столь низкий процент выявления их в РИГА закономерен. В последующие дни болезни титры антител к антигенам трихинелл продолжают возрастать вплоть до 20-го - 30-го дня (85,5±10.2%) и составили log2 11,6±1,3. После 31-го дня инвазии в 100% случаев, среднегеометрический титр антител к антигенам трихинелл снизился на 3,6 log2 и составил 9.0±1,4 log:.

Выявление частоты и уровня гуморальных антител имеет важное значение при оценке иммунитета к нематодам. Не менее важное значение имеют данные о состоянии местного иммунитета. Для его характеристики

ручался уровень секреторного иммуноглобулина А и состояние нормальной шкрофлоры при аскаридозе и энтеробиозе.

З.Характернетнка кишечной микрофлоры и местного иммунитета |рн нематодозах

Изучение факультативно-анаэробной и аэробной микрофлоры 25 юльных аскаридозом и 27 энтеробиозом показало, что видовой состав >сновных представителей микробиоценоза существенно не нарушен. Однако, нализ количественного и качественного состава нормальной микрофлоры :ишечника больных аскаридозом и энтеробиозом выявил, что изменения носят :оличественный характер и не затрагивают качественный состав шкробиоценоза. Основные представители анаэробной микрофлоры (бифидо-, 1актобактерии и клостридии) присутствовали в микробиоценозе всех |бследованных больных (100%). Кокковая микрофлора в наших исследованиях ¡ыла представлена двумя родами: стафилококки и энтерококки. Последние ¡ылн выделены у всех лиц инвазированных аскаридами и острицами. Более очное представлеие о дисбиотически процессах может дать количественная :арактеристка микробионоа. Наиболее существенные изменения при данных аболеваниях касаются снижения количества лактобактерий (^ 5,6±0,5 -¡ольных аскаридозом и ^ 5,2+0,4 - энтеробиозом), незначительное уменьшение оличества эшерихий с нормальной ферментативной активностью 6,6±0,8 и ^ 6,3±0,9, соответственно), при сравнительно нормальном содержании нфидобактерий (^ 7,1+0,8 и ^ 7.4±0.5. соответственно).

Проведённый анализ показывает, что кишечные папочки со сниженной >ерментативной активностью встречаются у 36,0+9,5 (Р<0,01) больных скаридозом и 48,1 ±9,3 (Р<0,01) - энтеробиозом. Предел колебаний бнаружения эшерихий с угнетённой ферментативной активностью изменяется т 5 до 100% по отношению к общему числу кишечных палочек, а средняя рифметическая величина равна 17.2±7,5% и 20,3±8,8% у больных аскаридозом

и энгеробиозом соответственно. Гемолизирующпе кишечные палочки встречаются в единичных случаях у инвазированных аскаридами (8.0±2,4%) и острицами (11.1±3,7%). а среднеарифметический процент находок от общего числа кишечных палочек, обладающих гемояизирующими свойствами, находится от 1% до 25% \ больных аскаридозом и 80% - энгеробноюм.

Представляло определенный интерес посмотреть ассоциативный состав условно-патогенных микроорганизмов.

Сопостаатенне данных изучения кишечной микрофлоры у больных аскаридозом и энтеробиозом показало, что достоверное уменьшение количества лактобактерий. кишечных палочек с нормальными ферментативными свойствами и появлением условно патогенных микроорганизмов в ассоциациях (64.0±9.3% и 70,3x9.1%. соответственно) (гемолнзнрующие и слабоферментируюшие лактозу кишечные палочки, грибы рода кандида. золотистые стафилококки). ведет к развитию дисбиоза.

Анализ характера микрофлоры привёл к заключению, что у многих больных аскаридозом и энтеробиозом отмечаются существенные изменения в составе микробиоценоза, свидетельствующие о развитии дисбиоза (88,0+6.2% и 85,2±6,5%. соответственно).Таким образом, паразитирование нематод, как было выше сказано, сопровождается нарушением целостности стенки кишечника п. как следствие этого, снижением колонизационной резистентности, что может быть причиной развития дисбиотических состояний у больных аскаридозом и энтеробиозом.

Наибольшие изменения претерпевает группа лактобактерий. которая вместе с другими представителями кишечной микрофлоры участвует в поддержании колонизационной резистентности, одним из механизмов которой является адгезивная активность. Было проведено изучение in vitro влияния растворимых компонентов нематод на адгезивно-колонизационную активность лактобактерий. Исследования выявили, что степень подавления адгезии в случае действия растворимых антигенов аскарид и остриц составила 69,0±4.6%

и 81,715.2%. соогиестиенно. Можно предположить, что в продуктах жезнеде-ятелыюстп аскарид и остриц имеются ингибиторы адгезинов лактобоктерий.

Одним из основных факторов местного иммунитета является содержание sJgA. Изучение прису тствия этого иммуноглобулина в фекалиях больных аскаридозом и энтеробиозом показало, что концентрация его колеблется в пределах от 50 до 400 мг%, однако средние данные у ггих больных (Ю3.8мг% и У0.9мг%. соотвественно). незначительно отличаются от средних данных практически здоровых людей (82,7 мг%, Я.С.Шварцман. Л.Б. Хазенсон.1978). Как выше было сказано, наиболее подвержена изменениям в микробном пейзаже.группа лактобатерий у инвазированных аскаридами и острицами. Поэтому мы проследили распределение slgA у больных с низким содержанием латобактерий. Группа обследованных, в которой отсутствовал slgA составляет половину всех лиц с дисбиотическими изменениями в кишечнике (40.0+10,3% и 51,8±10,6%, соответственно).

Таким образом, было отмечено, что показатели иммунитета находятся в определенной зависимости от патогенетических особенностей паразитов. В этой связи при кишечных нематозах в копрофильтрах могут быть выявлены растворимые антигены гельминтов, а при заболеваниях сопровождающихся "Lnrva migrans". - в сыворотке крови. Гуморальные антитела с постоянством выявляются в динамике трихиниллезной инвазии и редко - при аскаридозе и энтеробиозе. Растворимые компоненты нематод, представленных как общими, так и индивидуальными для каждого вида аптигенгм.1. вызывают подавление продукции секреторного иммуноглобулина А, что может привести к нарушению микробиоценоза. Другой причиной изменения качественного и количественного состава микрофлоры кишечника может явиться подавление процессов адгезии лактобактсрий продуктами жизнедеятельности аскарид и остриц.

Выводы.

1. Иммунологическая диагностика нематодозов. основанная на обнаружении растворимых антигенов и соответствующих им антител открывает новые перспективы в выявлении инвазированных. Использование иммунологических методов является наиболее эффективным при нематодозах, сопровождающихся миграционной стадией инвазии.

2. Экспериментально установлено, что иммунологическими методами при аскаридозе и энтеробиозе может быть выявлено от 60,0+3,6 до 0,2+0,02 мкг растворимых антигенов в грамме фекалий, что может служить дополнительным методом диагностики этих кишечных нематодозов. Сравнительный анализ использования реакций: иммунодиффузии (РИД), торможения иммунодиффузии (РТИД), торможения агглютинации микроорганизмов (РТАМ), РИГА, иммуноферментометрического анализа (ИФМА) показал, что наибольшей чувствительностью и специфичностью для выявления растворимых антигенов обладал иммуноферментометрический анализ, а для определения гуморальных антител - иммуноферментный анализ и РИГА.

3. Показано, что при экспериментальном трихинеллёзе растворимые антигены трихинелл могут быть обнаружены в фекалиях кроликов с 5-го по 12-й день инвазии, а в сыворотках крови кроликов с 8-го по 26-й день инвазии. Высоким уровнем антигенемии (ЮОмкг) может быть объяснено наличие выраженного токсико - аллергического синдрома при этом заболевании.

4. Установлено, что растворимые антигены трихинелл могут быть выявлены ИФМА в мышечной ткани уже на 15 день инвазии, когда рутинные методы индикации мышечных личинок являются неэффективными.

5. Высокий процент (35,5±17,2%) положительных реакций торможения агглютинации микробов (РТАМ) с аскаридозным и энтеробиозным антигеном у лиц больных иными гельминтозами (дифиллоботриоз. описторхоз, гнменолепидоз, стронгилоидоз, трихоцефалёз, трихинеллёз, токсокароз. эхинококкоч) может быть связан с наличием общих антигенов гельминтов, что подтверждается опытами истощения антител.

- 18 -

Дисбактериоз при кишечных нематодозах обусловлен в основном дефицитом лактофлоры. Впервые экспериментально установлено, что сомпоненты нематод способны подавлять адгезивную активность 1актобактерий, что может явиться одним из механизмов развития дисбиоза при нематодозах. Установление этого факта может служить теоретическим ^основанием необходимости использования лактосодержащих эубиотических трепаратов при лечении нематодозов.

Практические рекомендации. I. Применение иммуноферментометрического анализа позволяет выявлять антигены нематод (аскарид, остриц, трихинелл) в различных биологических субстратах.

!. При диагностике трихинеллёза может быть использован ИФМА для эпределения антигенов трихинелл в фекалиях и крови больных, на ранних стадиях заболевания. Это позволяет назначить своевременное этиотропное 1ечение.

5. Использование ИФМА открывает новые перспективы для совершенствования санитарно-ветеринарной экспертизы мяса. ». Для серодиагностики трихинеллёза рекомендуется реакция непрямой -емагглютинации, которая позволяет на 3-й - 12-й день болезни тиагностировать трихинеллёз в 15±8% случаев.

Наличие дисбактериоза у больных аскаридозом и энтеробнозом требует проведения исследования характера микрофлоры с последующим назначением 5иокорректирующих препаратов (типа лактоглобулин и лактосодержащих >убиотиков).

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гаевая, Эмма Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ | :

Глава 1 Патогенетические особенности нематодозов человека (обзор литературы) |

1.1 Влияние энтеробиозной инвазии на организм 9 человека , ¡

1.2 Влияние аскаридозной инвазии на организм 12 человека | !

1.3 Влияние трихинеллезной инвазии на организм 16 человека |

Глава 2 Материал, методы исследований |

Глава 3 Выявление растворимых антигенов нематод в различных биологических субстратах !

3.1 Выявление копроантегенов при аскаридозе, 34 энтеробиозе и трихинеллезе

3.2 Выявление растворимых антигенов трихинелл в 47 различных биологических субстратах

Глава 4 Выявление гуморальных антител при нематодозах

4.1 Выявление гуморальных антител при кишечных 54 нематодозах (аскаридоз,энтеробиоз) |

4.2 Выявление гуморальных антител при висцеральных. 57 нематодозах (трихинеллез) < I

Глава 5 Характеристика кишечной микрофлоры и местного иммунитета при нематодозах |

Введение Диссертация по биологии, на тему "Пути и методы повышения эффективности диагностики нематодозов"

1 ! ■' ■ ' ^ ■ ■ ■ - ■ ' ■ * ■ • ■ , Актуальность проблемы. Анализ заболеваемости людей инфекционными (кроме гриппа и ОРВИ) и паразитарными заболеваниями свидетельствует о значительном преобладании гельминтозов над другими нозолоj . ' гическими формами (З.С. Макарова и соавт.,1994; В.П. Сергиев, 1991; Sergiev V.P., 1993). В Российской Федерации наиболее массовыми среди гельминтозов являются такие немаггодозы, как аскаридоз и энтеробиоз. В последние годы резко обострились эпидемическая ситуация по трихинеллёзу (A.C. Бессонов, 1996; А.Я. Сапунов и соавт., 1996).

В настоящее время для диагностики и изучения кишечных нематодозов j аскаридоз, энтеробиоз и др.) используются рутинные методы исследования.

Для повышенщ низкой чувствительности копроовоскопических методов i ■ предложено 3-х- 5-ти кратное исследование фекалий одного и того же человека. Такой Подход удлиняет и удорожает копроовоскопические анализы.

Ранняя диагностика при кишечных нематодозах затруднена, т.к. методы инj i дикации юных и неполовозрелых паразитов не разработаны (A.C. Козлов, 1985; A.B. Маркин, 1994).

Специфическая диагностика трихинеллёза основана на выявлении антител в сыворотке крови больных и установлении сероконверсии. Се: 1 . ' рологическая диагностика трихинеллёза отличается достаточно высокой точностью и специфичностью, однако носит ретроспективный характер (А.Ф. Костецкий, 1989; О.Г. Полетаева и соавт., 1989; Т.И. Твердохлебова и соавт,, 1996). j |. ;„ . , .

В то же время при многих инфекционных заболеваниях используются методы индикации возбудителей с целью ранней диагностики. Общие принципы ранней диагностики заболеваний были сформулированы В.И. Иоффе (1968); П.Ф. Здродовским (1963). Поэтому актуальной задачей диагностики гельминтозов является разработка иммунологических методов и средств определения уровня гумораль

I I ных антител и индикации антигенов гельминтов на ранних стадиях заболевания и в различных биологических субстратах. | и Цель и задачи исследования, Целью исследования является экспериментальное обоснование подходов к повышению эффективности диагно I стики нематодозов в зависимости от их патогенетических особенностей. ! н Для достижения поставленных целей необходимо было решать следующие задачи: с : !

- разработать, общие принципы и дать оценку специфичности и чувствительности иммунологических методов, используемых! для выявления антигенноактивных продуктов жизнедеятельности нематод;! !

- ■ изучить динамику выявления экскреторно-секреторных антигенов в различных биологических субстратах;

- изучить частоту выявления гуморальных антител у больных нематодозами; . >

- дать оценку влияния растворимых компонентов нематод на состояние качественного и количественного состава микрофлоры кишечника и уровень секреторного иммуноглобулина А.

Научная новизна. Установлено, что аскариды и острицы содержат фактор, вызывающий агглютинацию стафилококков. В опытах торможения агглютинации с использованием антител к антигенам аскарид и остриц было выявлено, что фактор вызывающий, агглютинацию стафилококков, обладает антигенными свойствами. Показана принципиальная возможность использо I . вания реакции торможения агглютинации микробов (РТАМ) для выявления копроантигенов аскарид и остриц. |

Показано, что при немато дозах, имеющих кишечную стадию развития паразитов (аскариды, острицы, трихинеллы), могут быть выявлены копроантигены, а в фазе мигрирующих личинок в крови больных (трихинеллёз) об: ' | г наружи ваются циркулирующие антигены. Наличием циркулирующего антигена в крови больных трихинеллёзом в значительных количествах может I быть объяснено развитие токсико-аллергического синдрома при этом заболе I вании.

В эксперименте на животных показано, что в мышечной ткани инвази-рованных трихинеллами животных накапливаются растворимые антигены, которые могут быть выявлены методом иммуяоферментометрического анаI лиза (ИФМА) с 115-го дня инвазии, т.е. в период, когда инкапсуляции личинок ещё не происходит.

Впервые доказано, что развитие дисбиотических изменений при ки шечных нематодозах (аскаридоз, энтеробиоз) может быть связано с прямым воздействием структурных компонентов нематод на кишечную микрофлору. В частности установлено, что растворимые белки половозрелых аскарид и I остриц изменяют адгезивную активность лактобактерий. Выявлена опредег 1 лённая закономерность между развитием дисбиоза и снижением уровня секреторного 1|>А. I | :

I ' 1 .

Практическая значимость. Установлена принципиальная воз: ! ■ можность использования иммунологических реакций (ИФМА,;РТАМ) для выявления копроантигенов и антигенов нематод, циркулирующих в крови ! ! . ' больных, что | позволяет применять на практике эти серологические реакции для ранней диагностики нематодозов.

Изучение динамики иммунного ответа при трихинеллёзе показывает, что гуморальные антитела у некоторых больных выявляются, на 8-й 12-й день болезни^ Практически у всех больных трихинеллёзом (100%) на 30-й

40-й день болезни выявляются гуморальные антитела к экскреторносекреторному антигену трихинелл. I I

Изучение показателей нормальной микрофлоры и секр^тррного I при кишечных нематодозах обосновывает необходимость применения биокоррекции с использованием эубиотических (лактобактерин' и др.) и иммунобиологических (лактоглобулин) препаратов.

I . ■ . ' . *

Положения, выносимые на защиту:

- использование иммунологических методов позволяет выявлять раствори

I . ■ ■ мые антигены гельминтов в различных биологических субстратах в зависит мости от патогенетических особенностей нематодозов; 1 1 ■ > I ' .

- подтверждена возможность использования РИГА для серологической диагностики трихиреллёза;

- одним из механизмов развития дисбиоза. при кишечных нематодозах может быть снижение адгезивной активности лактобактерий и некоторых показателей местного иммунитета, в частности выражающихся в снижении уровня секреторного ^А. I ' '

Реализация и внедрения.

1. Приоритетная справка на предполагаемое изобретение «Агглютинин нематоды А. ЬшпЬпсо1с1еБ» № 97]03701 от 11.03.1997.

2. Лабораторный; регламент «Иммуноглобулин энтеробиозный диагностический жидкий», утверждённый Учёным советом РНИИМП. Протокол №6 от 13.06.1996.

3. Проект производственного регламента и ФС «Диагностикум эритроцитар-ный трихинеллёзный антигенный сухой». Утверждён Ученным Советом РИИИМП. Протокол № 10 от 03.12.1996. и ! г

4. Методические указания. Профилактика трихинеллёза. Утверждены и введены в действие главным Государственным врачом по Ростовской области ог 4 октября 1998. ! . -7- ' ' ■ ;

I '

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации апробированы на VII Научной конференции по трихинеллёзу человека и животных /Москва 1996/.

Диссертация доложена и обсуждена на заседании Учёного совета РНИИМП /Протокол № 7 от 26.11.1997/. По теме диссертации опубликовано 3 научных работы. 1

Объём и структура диссертации. Работа изложена на 97 страницах машинописного текста, иллюстрирована 19 таблицами, 9 рисунками.

Состоит из введения, обзора литературных данных, описания используемых методов ц материалов, 3-х глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций; список использованной литературы включает 220 источников, из них 105 иностранных.

Глава Ï Патогенетические особенности нематодозов человека ; • : . > обзор литературы).

Гельминты оказывают разнообразное воздействие на хозяина, вызывая функциональные нарушения органов, в которых они локализуются, вызывая общие расстройства обменных процессов и нейрогуморальной регуляции в организме ( К.И. Скрябин, Р.-Зд С. Шульд,1933; Е,С. Лейкина, 1985;Сох G, 1992).

Естественно, что всякого рода функциональные нарушения не могут не сопровождаться (соответствующими морфологическими изменениями, которые на протяжении инвазионного процесса в причинно-следственных отно

I • . шениях нередко меняются местами с функциональными (Б.А. Астафьев, 1987- Zhang S., Castro G.A. 1990, Yeper-Mulia L., Guadalupe О., 1994).

Общие закономерности в развитии морфологических и иммунологиче-i - ' ских реакций при гельминтрзах очень сложны. Во-первых, гельминты разнообразны по размерам, биологическим особенностям, путям миграции и локализации в органах и тканях хозяина. Во-вторых , в ходе развития паразитов происходят такие превращения их, в результате которых образуются по существу организмы, оказывающие на хозяина качественно новые воздейстj I вия . В третьих ,! чрезвычайно различны способы воздействия гельминтов на организм хозяина, которыми может определяться развитие тех или иных па-томорфологических изменений ( Dunn J., Wright К., 1987; CandoHi Е. et al., ï987;Collins S. et al, 1989; Takahashi Y. et al., 1989 ; Madas.E, et al., 1994;).

В связи этим мы считаем целесообразным дать общее описание наиболее характерных'патолого-морфологических изменений при энтеробиозе, аскаридозе, трихинеллёзе, в зависимости от стадий развития паразитов, определяющих соответствующие этапы инвазионного процесса.

1.1. Влияние знтеробиозной инвазии на организм человека.

Патогенное воздействие Enterobius vermicularis на организм человека складывается из комплекса раздражений механо- и хеморецепторов слизистой оболочки кишечника на различных её участках и воспалительных явлений, возникающих в местах травм слизистой. Выделяющиеся токсины, в состав которых входит муравьиная кислота и летучие жирные кислоты, оказывают воздействие на слизистую оболочку кишечника и Общую интоксикацию организма, наличие которой подтверждается положительным и кожными ре1 акциями и высокой эозинофилией. (Е. С. Шульман, 1989; М.Д. Великорецкая, М.Г.Маркова, 1991).

Механическое раздражение слизистой кишечника осуществляется острицами при их движении вдоль кишечной стенки. Наиболее травмирующее . i ' ■• действие на слизистую оказывает длинный и острый хвост самки, а также головная везикула, которой паразит плотно прилегает к стенке кишечника хозяина и присасывается с помощью нагнетательного действия бульбуса пара: ! ' ■ зита. На слизистой стенке кишечника вследствие разрушения поверхностных слоев слизистой оболочки возникают дефекты в виде полулунных углублений. Острицы способны внедрятся в ткань кишечной стенки до 2/3 или

3/4 длины тела. В некоторых случаях в глубине ткани кишечника обнаружи-i ' ! ■ ■ вали обьизвертвлённых остриц или их остатки в виде скопления яиц, вокруг которых образовались гранулемы, состоящие из эозинофилов, лимфоцитов и макрофагов. На всём протяжении тонкого и толстого кишечника развивается гиперемия слизистой оболочки, эрозия слизистого и нодслизистого сло-ёв.(С.В. Жукова, С.Г. Раденска, 1991; A.C. Козлов, 1982; В.П. Подъяпольская, В.Ф. Капустин, 1958; К.И. Скрябин, Р.-Эд.С. Шульц, 1933; Foltinova I., Kapeleer К., 1987; Romero-Rodriguez l. et al., 1987).

В литературе нет единого мнения о роли остриц в развитии аппендицитов. Воспалительные явления в червеобразном отростке могут возникать под влиянием токсического и травматического действия, однако основная /роль принадлежит вторичной инфекции. Скопление остриц в червеобразном отростке вызывает повреждение его стенок с последующим проникновением инфекции в дефекты слизистой ( Т. Сайдалиев и соавт., 1982). Изменения, вызываемые острицами, ведут к возникновению воспалительных явлений той • ' : I ' или иной степени в кишечной стенке не только аппендикса, но и других участков кишечника, начиная с нижних отделов тонкого кишечника и заканчивая толстым кишечником. При особо тяжёлых случаях может наблюдаться анальный зуд, диарея (А.Л. Гребнев, Л.П. Мягков, 1994; А.С. Козлов,

1985; Натаиёа к!. е1 а1., 1989). ! :

Острицы могут нарушать целостность слизистой с последующим вое

1 ; палением в периаиальной области, в промежности, в вульве, вагине и в других отделах женских половых органов, куда заползает часть мигрирующих из кишечника остриц (К.И. Скрябин, Р.-Эд.С. Шульц, 1933). По данным 211а^Сиаг^-\¥еп е1, а!, (1990), при вскрытии острицы были обнаружены в брыжеечных ¡лимфатических узлах и сосудах брыжейки, кровеносных сосудах печени и лёгких. Данное наблюдение является первым случаем, когда остриц обнаруживали в брыжеечных лимфатических узлах и кровеносных сосудах лёгких, в венах печёночной триады.

По данным Б.А. Астафьева (1987), при энтеробиозе наблюдаются аллергические реакции замедленного типа, ведущие к опосредованным изменениям во всех органах, обнаруженные при паталого-анатомическом1 исследовании. У практически здоровых детей, умерших в результате несчастных случаев, при паталогоанатомически подтверждённом диагнозе энтеробиоза наблюдается интенсивная эозинофильная инфильтрация селезёнки, желудочно-кишечного тракта, обнаруживается значительное количество эозинофилов в сосудах легких. Очаги лимфоидно-эозинофильной инфидьтрации межмы : | . | . . .:■ • - . . :., , шечной соединительной ткани миокарда и повышенное количество тучных клеток в лёгких указывает на выраженную аллергизацию организма. Мелкоочаговый кардиосклероз с признаками неспецифического воспаления меж i . . i ' -11- . . мышечной соединительной ткани, очаговый некротический паренхиматозно ' ; / .

- интерстициальный гепатит, очаговый гломерулонефрит, пролиферация всего лимфатического аппарата - все эти изменения возникают в результате аллергического процесса, вызванного энтеробиозом.

Явления иммунитета при энтеробиозе изучены недостаточно, однако • имеются данные! позволяющие считать, что у лиц, повторно инвазированных острицами, имеются сдвиги в реактивности организма. Изучение гуморального иммунитета было проведено на мышах, заражённых яйцами Syphacia I obvelata. Антитела против антигенов мышиных остриц начали выявляться i ■ через 12 дней после заражения и в дальнейшем отмечалось увеличение титров, причем титры антител тесно коррелировали с интенсивностью инвазии (Sato Yukita, 1993).

Помимо аллергических реакций при энтеробиозе наблюдаются дерма-юзы, анемии; гипоксии, а также проявление иммунодефицита, в частности лимфопения (В.П. Юровская, ВВ. Маркина, 1985; Б.А. Астафьев, 1987; Т.А. Вахабов и coáBT., 1991; М.П. Макарова и соавт., 1995). А.Я. Лысенко и соавт. (1991) М.Е. БагаЬва (1994) получили данные об отрицательном воздействии остриц на сохранение поствакцинального иммунитета против кори и дифтерии.

При энтеробиозе отмечается нарушение состава микрофлоры кишечника, снижение её антагонистических свойств по отношению к острым кишечным инфекциям, развитие дисбактериозов. По данным С.Е. Журавлёва (1975) дисбактериоз у инвазированных острицами детей, выявлен в 4 раза чаще, чем у цеинвазированных. Восстановление нормальной микрофлоры кишечника с помощью биопрепаратов повышает уровень неспецифической защиты организма от кишечной инфекции, т.к. при энтеробиозе происходит подавление микрофлоры кишечника (H.A. Благов, 1989; В.П. Сергиев и соавт., 1992; 1993)1 Однако механизм, лежащий в развитии дисбактериоза, остаётся нераскрытым.

Таким образом, эитеробиоз, являясь кишечным нематодозом, не имеющим миграционной стадии, оказывает опосредованное патогенетическое воздействие на все системы организма. Учитывая, что весь жизненный цикл остриц проходит в кишечнике, продукты жизнедеятельности и распада остриц могут быть определены в месте паразитирования нематод при использовании иммунологических методов. j- L '■ " "

Заключение Диссертация по теме "Паразитология", Гаевая, Эмма Анатольевна

Выводы. перспективы в выявлении инвазированных. Использование иммунологических методов является наиболее эффективным при нематодозах, сопровождающихся миграционной стадией инвазии. 2. Экспериментально установлено, что иммунологическими методами при еробиозе может быть выявлено от 60,0±3,6 до 0,2±0,02 мкг игенов в грамме фекалий, что может служить дополнитедь-агностики этих кишечных нематодозов. Сравнительный анализ использования реакций: имму но диффузии (РИД), торможения иммуно-диффузии (РТИД), торможения агглютинации микроорганизмов (РТАМ), РИГА, и м м уноферментометри ческого анализа (ИФМА) показал, что наибольшей чувствительностью и специфичностью для выявления растворимых антигенов обдадёл иммуцдферщд1омдтрц-Ч£Ский анализ, а для определения гуморальных антител - иммуноферментный анализ и РИГА. ;

3. Показано, что ны трихинелл могут быть обнаружены в фекалиях кроликов с 5-го по 12-й день инвазии, а Высоким уровне при экспериментальном трихинеллёзе растворимые антигев| сыворотках крови кроликов с 8-го по 26-й день инвазии, м антигенемии (ЮОмкг) может быть объяснено наличие выраженного токсико - аллергического синдрома при этом заболевании.

4. Установлено, что растворимые антигены трихинелл могут быть выявлены ИФМА в мыщечной ткани уже на 15 день инвазии, когда: рутинные методы индикации мышечных личинок являются неэффективными.

5. Высокий процент (35,5±17,2%) положительных реакций торможения агглютинации микробов (РТАМ) с аскаридозным и энтеробиозным; антигеном у лиц больных "иными гельмицтозами (дифиллоботриоз, описторхоз, гименошоидоз, трихоцефалёз, трихинеллёз, токсокароз, эхинококлегшдоз, стронги : '.Л'