Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протон-транслоцирующая активность митохондриального Комплекса I

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Протон-транслоцирующая активность митохондриального Комплекса I"

Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова

Биологический факультет

на правах рукописи

Ргв О Л

Галкин Александр Сергеевич

ПРОТОН-ТРАНСЛОЦИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО КОМПЛЕКСА I

03.00.04 - биологическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 2000

Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент Гривенникова В.Г.

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Самуилов В.Д.

кандидат биологических наук Богаче н А.В.

Ведущая организация: Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН

Защита состоится 13 ноября 2000 года в 1530 на заседании диссертационного совета Д.053.05.32 по адресу 119899 Москва, Воробьёвы горы, Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет, аудитория ББА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского Государственного Университета

Ав тореферат разослан $ октября 2000 года.

Учёный секретарь Диссертационного Совета

кандидат биологических наук , у ,/, ..... Медведева М.В.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ сгуалыюсть проблемы. Протон-транслоцирующая МАВН:убихинон-оксидоредукгаза ггохондрий млекопитающих или Комплекс I (КФ 1.6.99.3, ЫАВН-дегидрогеназа, первый нкт сопряжения) - самый сложный компонент дыхательной цепи. Фермент, имеющий юсу около 1 млн. Да, состоит не менее чем из 42 различных полипептидов и содержит сколько редокс-комгонентов, потенциально способных участвовать в реакциях переноса еюронов и протонов: прочносвязанный Г МИ, по крайней мере 5 железо-серных астеров и не менее двух молекул прочносвязанного убихинона. Фермент в составе утренней мембраны митохондрий катализирует реакцию окисления КАТЭН убихиноном и его водорастворимыми гомологами и аналогами, сопровождающуюся векторной анслокацией протонов:

ЫАОН+(З + Н+ + ИН; <->ЫАО++дн2 + йн; (1)

где С) и С>Н2 - окисленный и восстановленный эндогенный убихинон <3ю или его 'бавленный водорастворимый гомолог, Н* и Н* - протоны, векгорно перенесённые рез мембрану, а Н+ - «скалярный» протон, входящий в левую часть уравнения 1 [АОН - донор гидрид-иона, а хиноны - акцепторы водорода).

Величина стехиометрического коэффициента п (II* ¡2е) в уравнении 1 является жнейшим параметром ЫАОП:уб1гхинон-редуктазной реакции, так как любая модель ектрогенеза ферментом должна основываться на точно определенном значении и. сспериментальное определение стехиометрического коэффициента для Комплекса I -ожная задача. Методические подходы к решению этой проблемы были разработаны еще 60-х годах П. Митчеллом. Они основаны на измерении быстрореагирующим рН-ектродом кратковременного изменения рН в анаэробной, елабозабуференной суспензии ггохондрий в присутствии субстратов окисления, к которой добавляют небольшие, чно известные количества («пульс») кислорода. При этом происходит кратковременное кисление среды инкубации, обусловленное протон-транслоцирующей активностью всей «ательной цепи (1ЫЙ, 2ой и 3й" пункты сопряжения). Суммарный коэффициент Н+¡2е и всей дыхательной цепи в таких опытах оценивают как отношение количества шедших из митохондрий протонов к количеству добавленного кислорода.

жращения: СМЧ, субмитохондриальные частицы; БСА, бычий сывороточный ьбумин; ЭДТА - этилендиаминтетраацетат; РММ, флавинмононуклеотид; Сь убихинон-

децилубихинон; КЕМ, ЪГ-этилмалеимид; дЩ-Г, трансмембранная разность ектрохимических потенциалов ионов водорода; ДМ', электрическая составляющая дрН+

Измеренные или вычисленные величины Н*¡2ё для первого пункта сопряжения пс данным литературы варьировали от 2 до 5. Предложенные различными авторами модели протон-транслоцирующего механизма для Комплекса I основаны на этих величинах I представляют собой формальные спекулятивные схемы. Большой разброс I экспериментально определяемых значениях Н* ¡2ё прежде всего связан < невозможностью прямого измерения протон-транслоцнрующей активности Комплекса 11 составе традиционно использующегося для этих целей препарата интактных митохондрий Огчасти поэтому в настоящее время механизм векторного переноса протонов в первои пункте сопряжения неизвестен.

Реакция восстановления природного убихинона, катализируемая Комплексом I 1 составе дыхательной цепи, полностью (> 95%) чувствительна к специфически ингибиторам убихинон-связывающего центра фермента - пиерицидину А и рогснону Считается общепринятым, что эти ингибиторы блокируют протон-транслоцирующуи активность Комплекса I. Реакции Комплекса I с искусственными водорастворимым! гомологами или аналогами убихинона только частично (50-90% в зависимости от хинона акцептора и препарата фермента) чувствительны к пиерицидину А или ротенону.

По многим до сих пор известным параметрам взаимодействие ротенона Комплексом I вызывает те же изменения, которые происходят в структуре фермента пр| его спонтанной деактивации - явлении, открытом в нашей лаборатории в начале 90-годов. Было обнаружено, что Комплекс I дыхательной цепи митохондрий млекопитающи существует в двух медленно взаимопревращающихся формах (активной деактивированной). Только активная форма фермента катализирует ротсног чувствительные реакции прямого (КАОН-оксидаза и ЫАОН.С^-редуктаза) и обратног переноса электронов (аэробное, ДрН+-зависимое восстановление ЫАЕ>+ сукцинатом). ] отсутствие субстратов окисления (МАПН, МАОРИ) происходит спонтанная деактиваци фермента при температурах выше 30°С. Это явление выражается в том, что препара катализирует ротенон-чувствительные реакции с отчётливой лаг-фазой и становитс чувствительным к ЫЕМ. Деактивированный фермент становится полностью активны после одного или нескольких «активационных» оборотов (окисление NADH и медленнс восстановление убихинона). До настоящего времени вопрос о том, сопровождается л деактивация фермента потерей его протон-транслоцирующей активности, оставалс открытым.

Механизм функционирования Комплекса I представляется актуальной проблеме

современной молекулярной биоэнергетики. Кроме того, существуют многочисленнь

2

казания на непосредственное вовлечение дефектов Комплекса I в развитии различных атолошй.

Цель настоящей работы состояла в разработке надёжного метода регистрации и зучении протол-транслоцирующей активности Комплекса I в составе дыхательной цепи рочносопряжённых субмитохондриальных частиц и определении стехиометрического оэффициента Й* ¡2е ятя МАВН:убихинон-реду1сгазной реакции. Кроме того, редставлялось важным исследовать влияние специфических ингибиторов и деактивации юрмента на процесс векторного переноса протонов.

Научная новизна работы. Разработан метод регистрации транслокации протонов . ".омилексом I в составе прочносопряж&нных субмитохондриальных частиц сердца быка. >пределён стехиометрический коэффициент для Комплекса I в ЫАОН^-редуктазной еакции, оказавшийся равным 4 Й* ¡2ё. Впервые показано, что при взаимодействии !омплекса I со специфическими ингибиторами убихинон-связывающего участка (ротенон, иерицидин А, тритон Х-100) не происходит нарушений в протон-транслоцирующем [еханизме фермента. Показано, что структурные перестройки фермента, происходящие в езудьтате его гермодеактивации, не влияют на его протон-транслоцируюшую активность.

Практическая значимость работы. Проведённые исследования расширяют редставления о механизмах транслокации протонов КАСН:убихинон-оксидоредуктазой. очное определение стехиометрического коэффициента реакции Н*¡2е необходимо для азработки модели функционирования фермента. Подходы, применённые в данной работе, также полученные результаты могут использоваться при изучении функционирования ругах мембранных ферментов, осуществляющих векторную транслокацию протонов, езультаты данной работы используются при обучении студентов и аспирантов кафедры иохимии Биологического факультета МГУ.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на научных гминарах кафедры биохимии Биологического факультета МГУ, на II Съезде Биофизиков оссии (Москва, 1999), на 10 Европейской Международной Студенческой конференции "ермания, Берлин, 1999), на Международной конференции «Митохондрии, клетки и ктивные формы кислорода» (Россия, Пущино, 2000), на 18 Международном Конгрессе по иохимии и Молекулярной Биологии (Великобритания, Бирмингем 2000.

Публикации. Результаты исследования опубликованы в 2 статьях и 7 тезисах окладов.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит стр. машинописного текста, 7 таблиц и 35 рисунков. Список литературы включает 270 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Препарат ингактных митохондрий сердца крысы получали по стандартному методу [Jacobus, Saks, 1982]. Препарат субмитохондриальных частиц митохондрий сердца быка получали методом, принятым в нашей лаборатории, с некоторыми модификациями [Kotlyar et al., 1990] и хранили в жидком азоте. Перед началом опытов суспензию частиц размораживали и разводили до концентрации 5 мг/мл средой, содержащей 0,25 М сахарозу,. 0,2 мМ ЭДТА и 1 мг/мл БСА. Для сопряжения СМЧ к полученному препарату при постоянном перемешивании медленно добавляли олигомицин (0,5 мкг/мг белка).

Деактивированный Комплекс I получали прогреванием суспензии СМЧ 30 минут при 30°С.

Для активации Комплекса I к СМЧ (5 мг/мл) добавляли 400 мкМ NADPH и инкубировали в течение 25 минут при 20°С, постоянно перемешивая для аэрации. Активированные таким образом частицы во время опыта хранили при 0°С. Концентрацию белка в препаратах определяли с биуретовым реактивом, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин [Gomal et al., 1949].

\АОН:хинон-редукта1ную и протои-транслоцируюшую активности измеряли спектрофотометрически в стандартной среде, содержащей 0,25 М сахарозу, 3 мМ Трис-НС1 (рН 6,5-8,5), 0,2 мМ ЭДТА, 100 мкМ Ch и 1 мг/мл БСА. Препарат активированных СМЧ (5мг/мл) предварительно инкубировали 1 час при 0°С с миксотиазолом (1 нмоль/мг белка СМЧ) - специфическим ингибитором bc¡ комплекса. Для измерения концентрации ионов водорода во внешней среде к суспензии добавляли рН-индикатор Феноловый красный (30 мкМ), не проникающий через мембрану СМЧ. Для качественной регистрации рН внутри частиц использовали индикатор Нейтральный красный (90 мкМ). Относительно быстрые спектральные ответы рН-индикаторов и изменения концентрации NADH в мутных средах (суспензия СМЧ) регистрировали с помощью простого двухволнового фотометра, изготовленного на основе фотоколориметра ФЭК-60 производства Загорского (Сергиево-Посадского) оптико-механического завода выпуска 70-х годов. Выходное напряжение на низкоомной нагрузке усилителя регистрировали самописцем «Kipp&Zonen BD 111».

Все добавки вносили с помощью гамильтоновских шприцев (объемы ~ 5-10 мкл). земя ответа прибора (включая перемешивание) составляло меньше 1 секунды, [ггерференционные фильтры были подобраны следующим образом: для измерений с еноловым красным - 555-620 нм; Нейтральным красным - 522-702 нм; для измерений 366-405 нм.

Протон-транслоцирующую активность митохондрий определяли с помощью тановки, в состав которой входили специальная кювета, оснащенная «ггроотвечающим рН-электродом фирмы «Fisher), рН-метр фирмы «Orion» и усилитель самописцу «Kipp&Zonen BD 111». Все компоненты были установлены внутри гталличсского контейнера и тщательно заземлены.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Транслокация протонов Комплексом I в составе митохондрий На рисунке 1 изображена регистрация протон-транслоцирующей активности ггактных митохондрий сердца крысы в присутствии цианида в условиях, когда утримитохондриальные пиридиннуклеотиды восстановлены (5 мМ глугамат и 5 мМ шат в среде измерения). Необходимым условием регистрации протон-транслоцирующей тивности является присутствие в среде измерения ионов калия и калиевого ионофора линомицина. Свободное перераспределение ионов калия компенсирует электрическую ставляющую (AVF) мембранного потенциала, возникающего при векторном переносе ютонов Комплексом I, и создает возможность дтя переноса большего количества ютонов. Добавление субстрата акцептора Qi вызывает быстрое закисление среды [кубации, которое продолжается 2-4 секунды. Затем значение pH экспоненциально звращается к первоначальному значению. Полувремя спада кривой защелачивания ставляет около 35 с. Абсолютная величина максимального изменения pH (высота пика) 1И восстановлении Q! прямо пропорциональна количеству добавлешюго акцептора в ггервале концентрации убихинона до 20 мкМ (рис.1 на вставке справа). При льнейшем увеличении концентрации Q! кривая выходит на плато, что, по-видимому, язано с ограниченной буферной емкостью митохондрий. Величину стехиометрического эффициента п можно рассчитать как отношение количества перенесённых протонов к личеству добавляемого субстрата-акцептора. В литературе количество перенесенных рез мембрану митохондрий протонов оценивают либо по высоте пика максимального менения pH, либо экстраполируя кривую уравновешивания ДрН за время деэнергизации епарага после исчерпания субстрата (фаза защелачивания на рис.1) к нулевому моменту

времени. Второй способ расчета учитывает то обстоятельство, что из-за спонтанной проводимости митохондриальной мембраны для ионов водорода реальное количество перенесённых протонов всегда больше, чем видимое изменение рН на кривой регистрации. При обоих способах расчёта считают, что именно в максимуме изменения рН' происходит полное исчерпание субстрата реакции и начинается деэнергизацш

мембраны. Найденное нами с помощью экстраполяции значение Н*¡2ё составило 3,9.

20 мкг-ионов НУл 1

30 с

18мкМд,

Рис.1. рН-метрическая регистрация транслокации протонов интактными митохондриями сердца крысы (2,3 мг/мл) после добавки 18 мкМ <31 (слева). Зависимость высоты пика изменения рН от количества добавляемого <31 (на вставке).

Интерпретировать полученный результат трудно, так как, на наш взгляд, препара митохондрий является крайне неудачным объектом для изучения протон транслоцирующей активности Комплекса 1. Во-первых, внутренняя мембран митохондрий непроницаема для пиридиннуклеотидов, что приводит к необходимост использовать субстраты КАО+-зависимых дсгидрогеназ вместо ЫАБН. При это внугримитохондриальные пиридиннуклеотиды почти полностью восстанавливаьтся, создаются условия для протекания протон-транслоцирующей трансгидрогеназно реакции, которая может давать существенный положительный вклад в определяему1 величину Н*¡21. С другой стороны, присутствие в матриксе митохондрий эндогенны ионов, а во внутренней мембране дДТГ -зависимых систем для их переноса создав условия для образования вторичных ионных потоков и снижению определяемо! коэффициента Н*¡2е .

Препарат СМЧ лишён многих из этих недостатков, однако ранее его практически не пользуют из-за низкого уровня сопряжённости. В нашей лаборатории был разработан ггод получения препарата прочносопряжйнных СМЧ, который характеризуется кггаточно высокой величиной коэффициента дыхательного контроля - 6,0-7,0 в ЫАОН-сидазной реакции и 2,5-3,0 в КАБН:С>гредуктазной реакции (20°С, в присутствии .'Л). Мы использовали этот препарат для изучения протон-транслоциругощей активности мплекса I.

П. Транслокация протонов Комплексом I в составе СМЧ и определение пношения Н*¡2ё для ЫАОН:()гредуктазной реакции

На рисунке 2 показана спектрофотометрическая регистрация протон-анслоцирующей активности СМЧ в ЫАБН-оксидазной реакции (всех трёх пунктов пряжения дыхательной цепи), которую проводили в слабозабуференной среде, держащей рН-индикатор Феноловый красный. Добавление небольшого количества М)Н вызывает кратковременное защелачивание внешней среды, амплитуда которого, к и следовало ожидать, сильно увеличивается в присутствии валиномицина.

Рис.2. Спектрофотометрическая (ответ Фенолового красного) регистрация транслокации протонов в полной NADH-оксидазной реакции после добавки 5 мкМ NADH. Концентрация белка СМЧ 0,4 мг/мл. Среда измерения содержала 20 мМ КС1. Где указано, добавляли 6 мкМ валиномицин (Val) и 25 мкМ ротенон (Rot).

Видно также (рис.2), что присутствие в среде ротенона полностью блокирует анслокацию протонов, сопряжённую с окислением NADH.

На рисунке 3 представлен образец кривых регистрации векторной транслокации отонов Комплексом I в NADH:QrpeflyKTa3H0ñ реакции.

Добавление ЫЛПН вызывает быстрое защелачивание внешней среды (рис.ЗА) обусловленное переносом ионов водорода внутрь СМЧ, которое затем сменяете; относительно медленным возвращением к постоянному уровню рН, отличающемуся а исходного на величину, определяемую скалярным протоном (уравнение 1). Быстро' поглощение протонов из среды сопровождается синхронным закислением внутренней пространства СМЧ, которое регистрируется по ответу Нейтрального красного (рис.ЗБ) Хотя динамика ответа НК полностью соответствует изменению рН снаружи СМЧ результаты таких экспериментов практически невозможно интерпретироват количественно. Линейная калибровка концентрации Н+ добавлением точно известны количеств НС1 к суспензии позволяет количественно оценивать изменение рН во внешне среде в случае использования Фенолового красного. Регистрируемое изменение рН «протонный пульс», чувствителен к разобщителю (рис.ЗА и рис.ЗБ). В присутстви разобщителя протонный пульс, регистрируемый по ответу Нейтрального красной исчезает, а изменение рН во внешней среде по окончании реакции («скалярный» пропи уравнение 1) сохраняется. Количество протонов, поглощенных во время реакции присутствии БССР или грамицидина после полного окисления ЫАБН, в точности равн тому, которое наблюдается после уравновешивания наружного и внутреннего рН сопряженных частицах (рис.ЗА,Б). Это защелачивание прямо пропорциональн количеству добавляемого ЫАБН. Следует отметить, что по ответу Нейтрального красно! поглощение скалярного протона не регистрируется, так как в этом случае среда измерена была сильно забуферена (в среде измерения 50 мМ Трис-НС1, рН 8,0).

В отличие от КАБН-оксидазы (рис.2), протон-транслоцирующая активность ЫАЕ)Н:С>1-редуктазной реакции регистрируется в отсутствие К+-ионофора валиномицина, В настоящее время мы не можем дать исчерпывающего объяснения это* неожиданному наблюдению. Формально оно означает, что в данных условиях опы мембрана СМЧ имеет высокую проницаемость для каких-либо ионов, движение которь предотвращает возникновение ДТ. Мы полагаем, что последнее обусловлю использованием СЬ в качестве акцептора в среде, содержащей БСА.

Рис.3. Транслокация протонов после добавления ИАОН к СМЧ (0,4 мг/мл) в присутствии избытка (21 (100 мкМ). А - регистрация внешнего защелачивания (Феноловый красный), Б - регистрация внутреннего закисления (Нейтральный красный), В - окисление КАБН. Концентрация РССР 17 мкМ.

На рисунке 3 также приведена параллельная регистрация окисления МАГ)Н (рис.ЗВ). опреки сложившемуся в литературе мнению, в пике максимального поглощения ротонов в среде остается приблизительно треть добавленного ЫДОИ. Это означает, что ощепринятыми способами (по высоте пика изменения рН или процедурой кстраполяции) нельзя оценивать максимальное количество перенесённых протонов.

В нашей работе для определения коэффициента п мы сравнивали начальные скорости кисления Ы/МЭН и защелачивания среды в начальный момент времени, т.е. сразу после

добавки субстрата, пока еще мала скорость утечек ионов водорода обратно из-за неспецифической Непроводимости мембраны. Как следует из уравнения реакции (1):

- где Ун+ - начальная скорость общего изменения концентрации ионов водорода в среде, ^N-/^1)11 - начальная скорость окисления ИАОН, а значение 1 с правой стороны уравнения соответствует «скалярному» протону, наличие которого согласуется с теоретическими и экспериментальными данными.

На рисунке 4 показаны синхронные кривые регистрации окисления КАБП (нижние кривые) и изменения рН с Феноловым красным (верхние кривые) при высоком временном разрешении. Значение стехиометрического коэффициента, рассчитанное по соотношению

начатьных скоростей в соответствии с уравнением 2, оказалось равным 4Н* ¡2ё.

п (Н*/2ё) = (Ун+ / УКАСН) - 1

(2)

I

5мкКШАШ

Рис.4. Расчет стехиометрического коэффициента для ИММСЬ-редуктазной реакции из начальных скоростей изменения рН (вверху) и окисления ЫАСН (внизу). Цифры рядом с кривыми показывают абсолютные скорости защелачивания среды (мкг-ионов Н7мин/мг белка) и окисления Ь'АБН (мкмоль ЫАОН/мин/мг белка).

Для того, чтобы повысить точность измерений в пробу добавляли АИР-рибозу -курентный по отношению к N741)11 ингибитор Комплекса I. При этом пульс, по-яснему чувствительный к разобщителю, как бы растягивается во времени, а начальные роста процессов окисления ЫА1)Н и защелачивания среды инкубации снижаются и ут быть измерены с большей точностью. На графике (рис.5) представлена зависимость роста изменения рН среды и скорости окисления ЫАПН Комплексом I от центрации АВР-рибозы в пробе (левая ось). Видно, что две эти. сопряженные явности - скорость окисления КАГ)Н и скорость защелачивания среды - падают почти аллельно. На правой оси показана зависимость значения стехиометрического

ффициента Н* ¡2ё от концентрации АПР-рибозы в пробе. Видно, что величина ффициента не зависит от концентрации АБР-рибозы и при любых её концентрациях на 4 Н* ¡2ё.

100-

80

и

0

1

о и 3 а:

3

60

40-

20

0

50 100 150

АЮР-рибоза, мкМ

200

-3

4

¡5»

Рис.5. Влияние АОР-рибозы на начальные скорости окисления ЫАОН (V) и поглощения прогонов (А) Комплексом I. Значение и "" Н* ¡2ё (О) рассчитывалось согласно уравнению 2.

Таким образом, использованный нами способ, основанный на измерении начальных >ростей, позволил нам впервые прямо измерить стехиометрический коэффициент ^12с для митохондриального Комплекса I, равный 4. Представляется весьма юятным, что величина 4 Й+¡2ё, часто встречающаяся в литературе для Комплекса I, валась верной в результате суперпозиции завышающих и занижающих методических ибок.

Ш. Влияние разобщителя на величину коэффициента Й*¡2е Сопряженность мембраны СМЧ или отсутствие Непроводимости являет необходимым условием регистрации протон-транслоцирующей активности. На рисунке показана зависимость скорости окисления ЫА1)Н и защелачивания среды в 1ЧАОН:С редуктазной реакции при рН 8,0 ог концентрации разобщителя грамицидина. Видно, ч уже при малых концентрациях разобщителя скорость окисления ЫАОН сильно возраста а скорость изменения рН среды почти не меняется. При концентрациях грамициди 1-5 мкг/мл скорости окисления ЫАОН и защелачивания среды становятся пракгичес равными. Таким образом, коэффициенты Й* ¡2ё рассчитанные для препаратов СМЧ разной степенью сопряжения, должны сильно различаться.

1,00

1

з йц

2 V

0,01 0,02 0,03 1 2 3 4 5 Грамицидин, мкг/мл

Рис.6. Влияние грамицидина на начальные скорости окисления МАБН (А) и поглощения протонов (V) Комплексом I. Скорости выражены в мкмолях ЫАОН/мин/мг белка и миг-ионов Н*/мин/мг белка соответственно. Значение п =Н* ¡2ё (•) рассчитывалось согласно уравнению 2.

IV. Влияние рН на величину стехиометрического коэффициента Н*¡2е д МАОН:хинон редуктазной реакции

Одним из способов, позволяющих получить сведения о деталях механиз энергетического сопряжения, является изучение зависимости протон-транслоцируюш активности генераторов ДрН+, а также стехиометрических коэффициентов Й* ¡21 отр Такой подход часто применяют при изучении обычных ферментативных реакций, ч позволяет выявить участие отдельных групп белка в связывании субстратов, а также катализе самой реакции.

На рисунке 7 А (кривая 1) показана зависимость величины стехиометрического эффициента II* ¡2ё ЫАОНгСЬ-редуктазной активности Комплекса I от рН среды персты. Видно, что максимальное значение коэффициента п достигается при рН 8,0-8,5 (аметно снижается при сдвиге в более кислую или щелочную области. Дополнительной эбенностью МЛШВДрредуктазной реакции являлась абсолютная необходимость исутствия бычьего сывороточного альбумина в среде измерения - в отсутствии БСА мы обнаружили векторного переноса протонов при любых значениях рН.

I

гч 2

ТЙ!

1

6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0

РН

- -

'о-. 2

6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 рН

Рис.7. Значение стехиометрического коэффициента н*¡2ё в зависимости от рН среды измерения для КАОН^1 (А) и МАБН РО^редуктазной (Б) реакции, катализируемой Комплексом I в составе контрольных СМЧ (—), или СМЧ в присутствии 20 мМ КС1 и 6 мкМ валиномицина (—).

При использовании в качестве субстрата-акцептора другого хинона - децилубихинона 0), рН зависимость стехиометрии для Комплекса I меняется. В этом случае (рис.7Б, ивая 2) колоколобразная зависимость исчезает, а величина коэффициента п плавно ижается при изменении рН от 6,5 до 8,5. Следует отметить важное различие векторного реноса протонов, сопряженного с восстановлением двух различных хинонов-субстратов. (мплекс I в ЫЛОН-редуктаз!юй реакции катализирует векторный перенос протонов в сутствие К+-ионофора валиномицина (рис.3, рН 8,0). В противоположность этому, анслокация протонов в ИАОНДО-редуктазной реакции может быть зарегистрирована пько в том случае, если в среде измерения активности присутствуют ионы калия и ганомицин (рис 7Б, сравните кривые 1 и 2). А наличие в среде БСА практически не ияет н измеряемые параметры.

Можно было думать, что увеличение коэффициента Н+[2ё для К'АПН^, редуктазной реакции при защелачивании связано с появлением ионной проводимосг мембраны СМЧ, которая эквивалентна присутствию валиномицина и компенсируе образующийся при векторной транслокации протонов электрический заряд. Огсутстви такой проводимости при кислых рН приводит к кажущемуся снижению коэффициент Н*¡2ё. Результаты, приведенные на рис.7, подтверждают наше предположена Действительно, добавление в среду измерения ионов калия и валиномицина приводит, одной стороны, к повышению коэффициента Н* ¡2ё при кислых значениях рН, а другой стороны, рН-зависимость фермента становится похожей на ту, котора наблюдается при использовании в качестве субстрата децилубихинона (рис.7А, кривая 2 рис.7Б, кривая 1).

Следует отметать, что в присутствии калия и валиномицина максимальны стехиометрический коэффициент Н+¡2ё ЫАОНжинон-редукгазной реакции Комплекса снижается с 4 до 3. Мы объясняем это разобщающим эффектом валиномицин; Действительно, в специальных опытах мы показали, что в присутствии калия валиномицина величина коэффициента дыхательного контроля в ЫАОНфр и ЫАЦ>Н:1Х редуктазной реакциях снижается с 3,5-3,0 до 2,5-2,0.

Кратко суммируя, можно убедиться, что при использовании 01 (в присутстви альбумина) в качестве акцептора при рН~8,0 система ведет себя так, как если б сопрягающая мембрана имела высокую проводимость по иону, движение которо! компенсирует возникновение ДУ. При замене (З1 на децилубихинон (в присутствии иг отсутствии БСА) такой проводимости нет. Для объяснения этого неожиданного явлеш необходимо специальное детальное исследование. Это явление, однако, представляет« методически важным и еще раз наглядно показывает необходимость крайш осторожности при интерпретации результатов измерения протон-транслоцирующ< активности ферментов.

V. Влияние ротенона на транслокацию протонов

Известно, что в отличие от М/ШН-оксидазной и ЫАВН:В<3-редуктазной реакци реакция Комплекса I с СЬ только частично чувствительна к ротенону. В зависимости 1 условий эксперимента, доля ротенон-нечувствительной активности Комплекса составляет 5-10% от общей КАСН:01 -редуктазной активности Комплекса I СМ измеренной в присутствии разобщителя, и ротенон-нечувствительная составляющ общей активности всегда рассматривалась как не сопряженная.

Рис.8. Регистрация транслокации протонов (А) и окисления ЭДАОН (Б) в КАОЦ^г редуктазной реакции в присутствии 25 мкМ ротенона при медленном (слева) и быстром (справа) временном разрешении. Реакцию начинали добавлением 5 мкМ МЛ1)Н (показано стрелками). Цифры рядом с кривыми показывают абсолютные скорости защелачивания среды (мкг-ионов Н^/мин/мг белка) и окисления ЫАОН (мкмоль КАОН/мин/мг белка).

Па рисунке 8 показана регистрация векторного переноса протонов и окисления Х)И н КАОП:р1-ре/тукгаз1Г0й реакции в присутствии 25 мкМ ротенона. Оказалось, что в [X условиях Комплекс I по-прежнему функционирует как генератор ДрН'. Скорость юления ЫАБН экзогенным 0! в присутствии ротенона составляет около 25% ивности без ингибитора в отсутствие разобщителя. Необходимо отметить, что ■аточная ЫЛШ^СЗгредуктазная активность не связана с недостатком ротенона: яичение концентрации ингибитора не меняло картины, показанной на рисунке 8. Более о, КАОН.СЬ-редуктазная активность Комплекса I в присутствии пиерицидина А, :цифического необратимо действующего ингибитора фермента, также была сопряжена с >еносом протонов. Сходные результаты были получены и для еще одного ингибитора -

15

тритона Х-100, который, как было недавно показано ведет себя аналогично ротенону пиерицвдину.

Так как в присутствии ротенона NADH окисляется медленнее, сопряженный переас протонов также существенно заторможен, что приводит к уширению пика. Величик стехиометрии, рассчитанная по отношению начальных скоростей (рис.8 справа), при это не изменяется и по-прежнему составляет 4 протона на два перенесенных электрона.

Полученный результат позволяет считать, что действие ротенона (пиерициднв тритона Х-100) направлено на стадию, следующую за теми, которые составляют механиз транслокации протонов Комплексом I. В присутствии ротенона СЬ способен реагировать одним из редокс компонентом фермента, который оказывается доступным д." реокисления после конформационных перестроек Комплекса I, вызванных связывание ингибитора. Таким образом, Qi обеспечивает постоянный поток электронов от NADI который сопровождается векторным переносом протонов через мембрану СМЧ.

VI. Транслокация протонов деактиеированной формой Комплекса 1

Функциональная роль обратимых переходов Комплекса I из активного деактивированное состояние в настоящее время неизвестна. В связи с этим, вопро сопровождается ли деактивация Комплекса I потерей его протон-транслоцирующс активности, приобретает особый интерес.

СМЧ после термодеактивации (30 минут при 30°С) катализируют ротецо] нечувствительную МАОН.С^-редукгазную реакцию с активностью, величина которс составляет около 25% от активности Комплекса I в сопряженных СМЧ. Кинетш окисления NADH и защелачивания среды деактивированным препаратом показаны i рисунке 9.

Видно, что деактивированные СМЧ окисляют NADH медленнее по сравнению контрольным активированным препаратом (рис.3); перенос протонов также происходит меньшими скоростями, что приводит к уширению пика. Однако величш стехиометрического коэффициента Я1 ¡2е, рассчитанная как отношение начальнь скоростей (уравнение 2), не изменяется и составляет 4 протонов на два перенесеннь электрона. Ротенон не влияет на скорость окисления NADH деактивированны ферментом, и его присутствие при регистрации переноса протонов также не меня' параметров реакций, показанных на рис.9.

Рис.9 Регистрация транслокации протонов (А) и окисления NADH (Б) в NADH:Qr редуктазной реакции катализируемой деактивированным Комплексом I СМЧ при медленном (слева) и быстром временном разрешении. Для предотвращения активации фермента за время реакции, деактивированные СМЧ предварительно были проинкубированы с 1 мМ NEM. Реакцию начинали добавлением 5mkMNADH (показано стрелками). Концентрация FCCP 17 мкМ. Цифры рядом с кривыми показывают абсолютные скорости защелачивания среды (мкг-ионов ЬГ/мин/мг белка) и окисления NADH (мкмоль NADH/мин/мг белка).

Таким образом, мы показали, что деактивированный Комплекс I полностью сохраняет тон-транслоцирующий механизм, хотя перенос электронов на эндогенный убихинон в их препаратах полностью блокирован. При обсуждении вопроса о физиологической шмости активации / деактивации ранее полагали, что деактивированный Комплекс I, 5удучи способным к транслокации протонов, не представляет потенциальной «угрозы»

для электрических свойств мембраны, в отличие от активной формы фермен Полученные в настоящей работе результаты противоречат этому предположению, присутствии водорастворимого гомолога убихинона Q, деакгавированная фор Комплекса I катализирует векторный перенос 4 протонов, сопряженный с переносом да электронов от NADH на центр фермента, взаимодействующий с акцептором.

Свойства деактивированного Комплекса I и активного фермента, обработана ротеноном, практически идентичны. Мы полагаем, что в присутствии ротенона или по< деактивации фермента, один из его редокс компонентов становится доступным х добавленного Qj. Таким центром может быть прочносвязанный убисемихиш постулированный ранее в качестве непосредственного участника механизма сопряжени Комплексе I [Vinogradov 1993].

выводы

1. Предложен способ определения стехиомефичсского коэффициента Й*)2с МАОН:убихинон-редуктазной реакции, катализируемой Комплексом I субмнтохопдриалышх частиц сердца быка. Метод основан на одновременном измерении начальных скоростей поглощения протонов и окисления ИЛБН.

2. Определён стехиометрический коэффициент для МЛТ)Н:убихинон-редуктазной реакции, катализируемой Комплексом I в субмитохондриалышх частицах, равный 4 Й*¡2е .

3. Конкурентный (по отношению к ЫАОН) ингибитор Комплекса I АОР-рибоза снижает протон-транслоцирующую активность фермента, не влияя на величину

стехиометрического коэффициента Й*¡2ё.

4. Протон-транслоцирующая активность Комплекса I, измеренная в присутствии децилубихинона или эндогенного убихинона, полностью исчезает после термодеактивации фермента, или в присутствии специфических ингибиторов ЫАОН:убихинон-редуктазной активности: ротенона, пиерицидина А и тритона Х-100.

5. Связывание пиерицидина А, ротенона и тритона Х-100 Комплексом I и термодеактивация фермента не приводят к блокированию его протон-транслоцирующей активности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Галкин А.С. Взаимодействие ротенона с Комплексом I субмитохондриальш частиц митохондрий сердца быка Тезисы Международной конференции студент и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов 96», Россия, Москва, 1996

2. Галкин А.С., Гривенникова В.Г. Й* f2ё стехиометрия в NADH:xhhoii редуктазт реакции катализируемой Комплексом I дыхательной цепи митохондр] млекопитающих. Тезисы П съезда биофизиков России, т.1,191, Москва 1999.

3. Galkin AS., Grivennikova V.G., Vinogradov A.D. fl* 12ё stoichiometry in NAD: quinone reductase reactions catalyzed by the bovine heart submitochondrial particli FEBS Lett., 451,157-161, 1999.

4. Galkin AS., Grivennikova V.G. Determination of H*¡2ё stoichiometry in NAD! quinone reductase reactions catalyzed by the bovine heart submitochondrial particli Abstracts of 10th European Students Conference for students and young doctors, 1( Berlin, 1999.

5. Галкин A.C., Гривенникова В.Г., Виноградов А.Д. Сравнение различных способ определения Н*¡2ё стехиометрии Комплекса I дыхательной цепи. Тезн( Международной конференции «Митохондрии, клетки и активные форд кислорода», 32, Пущино, 2000.

6. Гривенникова В.Г., Галкин А.С., Виноградов А.Д. Стехиометрия Н*¡21 NAD убихинон редуктазного участка дыхательной цепи митохондрий. Тези Международной конференции «Митохондрии, клетки и активные фор.« кислорода», 41, Пущино, 2000.

7. Galkin A.S., Grivennikova V.G. Determination of H*¡2ё stoichiometry in NAD quinone reductase reactions catalyzed by mitochondrial Complex I. 1831, Abstracts 18th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, Birmingham (Gri Britain), 2000.

8. Roth R, Galkin A.S., Grivennikova V.G., Vinogradov A.D., Hagerhall C. Rotenc interaction with bacterial Complex I. A-30, Abstracts of 11th European Bioenerget Conference, Sussex (Great Britain), 2000.

9. Гаткин A.C., Гривенникова В.Г., Виноградов А.Д. Стехиометрическ

коэффициент Н* ¡2г МАВН.убихинон-редуктазной реакции Комплекса субмитохондриальных частиц. Биохимия, в печати. ^

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Галкин, Александр Сергеевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Комплекс I и организация дыхательной цепи.

Субъединичный состав и фрагменты Комплекса 1.

Полипептидный состав и редокс-компоненты Комплекса I.

Субъединицы, принадлежащие митохондриальному геному.

Субъединицы Комплекса I, принадлежащие ядерному геному.

Нуклеотид-связывающие субъединицы.

Флавинмононуклеотид-связывающие субъединицы.

Железо-серные кластеры.

Прочносвязанные семихиноны как интермедиаты переноса электронов.

Субъединицы ответственные за связывание хинона.

Ацилпереносящий белок.

Структурная модель организации Комплекса 1.

Реакции, катализируемые Комплексом 1.

Прямой перенос электронов.

КАЕ)Н-оксидазная реакция.

ЫА1)Н:хинон-редуктазная реакция.

Окисление ИАОН искусственными акцепторами электронов.

КАОН: фумарат-редуктазная реакция.

Трансгидрогеназная, а также другие МАХ)Р(Н)-зависимые реакции.

Обратный перенос электронов.

Гистерезисное поведение Комплекса 1.

Ингибиторы Комплекса 1.

Ингибиторы ЫАОН связывающего центра.

Дициклогексилкарбодиимид.

Ингибиторы хинон-связывающего центра.

Транслокация протонов ферментами дыхательной цепи и определение стехиометрического коэффициента п (Й+¡2ё) для КАБНгубихинонредуктазной реакции.

Модели протон-транслоцирукяцего механизма Комплекса 1.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Препаративные методы.

Выделение митохондрий сердца быка.

Выделение СМЧ.

Получение деактивированного и активированного препарата

Комплекса I.

Выделение митохондрий сердца крысы.

Аналитические методы.

Регистрация переноса протонов и окисления МАЕ)Н СМЧ.

Регистрация переноса протонов с помощью рН-метра.

Определение концентрации белка.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Транслокация протонов Комплексом 1 в составе митохондрий.

Транслокация протонов Комплексом I в составе СМЧ.

Определение коэффициента Н+¡2ё для МАБН:убихинон-редуктазной реакции.

Влияние условий измерения на протон-транслоцирующую активность

Комплекса 1.

Измерение при различных концентрациях добавленного ЫАХ)Н.

Влияние количества СМЧ на регистрацию их протонтранслоцирующей активности.

Влияние разобщителей на величину коэффициента Й+¡2ё.

Влияние pH на величину стехиометрического коэффициента Н+¡2е для КАБН'.хинон-редуктазной реакции.

Влияние ротенона на транслокацию протонов.

Транслокация протонов деактивированной формой Комплекса 1.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Галкин, Александр Сергеевич, Москва

1.Лузиков В.Н. (1973) // Стабилизация системы окислительного фосфорилирования. В книге «Структура и механизм действия ферментов» выпуск 2, под ред. Северина С.Е., Издательство МГУ, стр. 21-62

2. Ahmed I., Krishnamoorthy G. (1992) // The non-equivalence of binding sites of coenzyme quinone and rotenone in mitochondrial NADH-CoQ reductase. FEBS Lett., 300, 275-278

3. Albracht S.P.J., Dooijewaard G., Leeuwerik F.J., Van Smol B. (1977) // EPR signals of NADH:ubiquinone oxidoreductase shape and intensity. Biochim. Biophys. Acta., 459, 300-317

4. Albracht S.P.J., Leeuwerik F.J., Van Swol B. (1979) // The stoichiometry of the iron-sulfur clusters la, lb and 2 of NADH:Q oxidoreductase as present in beef heart submitochondrial particles. FEBS Lett., 104, 197-200

5. Albracht S.P.J., de Jong M.A.Ph. (1997) // Bovine heart NADHrubiquinone oxidoreductase is a monomer with Fe-S clasters and 2 FMN groups. Biochim. Biophys. Acta., 1318,92-106

6. Albracht S.P.J., Mariette A., De Jong Ph. (1997) // Bovine heart NADHrubiquinone oxidoreductase is a monomer with Fe-S clasters and 2 FMN groups. Biochim. Biophys. Acta., 1318, 92-106

7. Alexandre A., Reynafarje В., Lehninger A.L. (1978) // Stoichiometry of vectorial ЕГ movements coupled to electron transport and to ATP synthesis in mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 5296-5300

8. Alexandre A., Galiazzo F., Lehninger A.L. (1980) // On the location of the H+-extruding steps in Site 2 of the mitochondrial electron transport chain. J. Biol. Chem.,255, 10721-10730

9. Anderson R.F. (1983) // Energetics of the one electron reduction steps of riboflavin, FMN and FAD to their fully reduced forms. Biochim. Biophys. Acta., 722, 158-162.

10. O.Anderson S., De Bruijn M.H.L., Coulson A., Eperon I.C., Sanger F.,Young I.G. (1982) // Complete sequence of bovine mitochondrial DNA. J. Mol. Biol., 156, 683-717

11. Archbold G.P., Farrington C.L., Lappin S., McKay A.M., Malpress F.H. (1979) // Oxygen-pulse curves in rat liver mitochondrial suspensions. Some observations and deductions. Biochem. J., 180, 161-174

12. Arizmendi J.M., Runswick M.J., Skehel J.M., Walker J.E. (1992) // NADHrubiquinone oxidoreductase from bovine heart mitochondria: a fourth nuclear coded subunit with a homologue encoded in chloroplast genomes. FEBS Lett., 301, 237-242

13. Bakker P.T.A., Albracht S.PJ. (1986) // Evidence for two independent pathways of electron transfer in mitochondrial NADH:Q oxidoreductase. Pre steady state kinetics with NADH. Biochim. Biophys. Acta., 850, 413-422

14. Beales K.J., Cooper W.D., Eley D.D. (1978) // Protein quinone complexe. Bovine plasma albumin and halogenated p-quinones. J. Bioenerg. Biomembr., 10, 101-104

15. Beinert H., Sands R.H. (1959) // On the function of iron in DPNH cytochrome c reductase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1, 171-174

16. Beinert H., Palmer G. (1965) // Kinetic studies on reduced diphosphopyridine nucleotide dehydrogenase by EPR spectroscopy. J. Biol. Chem., 240, 475-480

17. Beinert H., Albracht S.PJ. (1982) // New insights, ideas and unanswered questions concerning iron-sulfur clusters in mitochondria. Biochem. Biophys. Acta., 683, 245-277

18. Belogrudov G.I., Hatefi Y. (1996) // Intersubunite interaction in the bovine mitochondrial Complex I as revealed by ligand blotting. Biochem. Biophys.Res. Commun., 227, 135-139

19. Boekema E.J., Van Breemen J.F.L., Keegstra W., Van Bruggen E.J.E., Albracht S.P.J. (1982) // Structure of NADH:Q oxidoreductase from bovine heart mitochondria studies by electron microscopy. Biochim. Biophys. Acta., 679, 7-11

20. Boumans H., Grivell L.A., Berden J.A. (1998) // The respiratory chain in yeast behaves as a single functional unit. J. Biol. Chem., 273, 4872-4877

21. Brand M.D., Reinafarje B., Lehninger A.L. (1976) // Re-evaluation of if/Site ratio of mitochondrial electron transport with the oxigen pulse technique. J. Biol. Chem., 251, 5670-5679

22. Brand M.D., Harper W.G., Nicholls D.G., Ingledew WJ. (1978) // Unequal charge separation by different coupling spans of the mitochondrial electron transport chain. FEBS Lett., 95, 125-129

23. Brandt U. (1999) // Proton translocation in the respiratory chain involving ubiquinone a hypothetical semiquinone switch mechanism for Complex I. BioFactor, 9, 95-101

24. Brown G.C., Brand M.D. (1988) // Proton/electron stoichiometry of mitochondrial Complex I estimated from the equilibrium thermodynamic force ratio. Biochem. J., 252,473-479

25. Burbaev D.Sh., Moroz I.A., Kotlyar A.B., Sled V.D., Vinogradov A.D. (1989) // Ubisemiquinone in the NADH:ubiquinone reductase region of the mitochondrial respiratory chain. FEBS Letter., 254, 47-51

26. Burgos J., Redfearn E. (1965) // The inhibition of mitochondrial reduced nicotinamidadenine dinucleotide oxidation by rotenoids. Biochem.Biophys.Acta., 110,475-486

27. Capaldi R.A. (1982) // Arrangement of proteins in the mitochondrial inner membrane. Biochim. Biophys. Acta., 694, 291-306

28. Castresana J., Alonso A., Arrondo J.L., Goni F.M., Casal H. (1992) // The physical state of ubiquinone-10, in pure form and incorporated into phospholipid bilayers. A. Fourier-transform infrared spectroscopic study. Eur. J. Biochem., 204, 1125-1130

29. Chance B., Hollunger G. (1960) // Energy linked reduction of mitochndrial pyridine nucleotide. Nature, 185, 666-672

30. Chance B., Mela L. (1966) // Intramitochondrial pH changes in cation accumulation. Biochemiatry, 55, 1243-1250

31. Chance B., Erecinska M. (1975) // 12-(9-Anthroyl)stearic acid, a fluorescent probe for the ubiquinone region of the mitochondrial membrane. Eur. J. Biochem., 54, 521-529

32. Chance B. (1977) // Electron transfer: pathways, mechanisms, and controls. Ann. Rev. Biochem., 46, 981-995

33. Chen Sh., Guillory R.J. (1979) // Interaction of arylazido-p-alanyl NAD+, a photoaffinity analogue of NAD+, with mitochondrial NADH-ubiquinone reductase. J. Biol. Chem., 254, 7220-7227

34. Chen Sh., Guillory R.J. (1981) // Studies on the interaction of arylazido-p-alanyl NAD+ with the mitochondrial NADH dehydrogenase. J. Biol. Chem., 256, 8318-8323

35. Chen Sh., Guillory RJ. (1984) // Identification of the NADH-NAD+ transhydrogenase peptide of the mitochondrial NADH: ubiquinone reductase (Complex I). J. Biol. Chem., 259, 5124-5131

36. Chenas N.K. (1989) // Reaction of complex I of the mitochondrial electron transport chain with artificial oxidizers. Ukr. Biokhim. Zh., 61, 23-29

37. Chomyn A., Cleeter M., Ragan I.C., Riley M., Doolittle R.F., Attardi G. (1986) // URF6, last identified reading frame of human mtDNA, codes for an NADH dehydrogenase subunit. Science, 234, 614-618

38. Clark W.M. (1960) // Oxidation reduction potentials of organic systems. Williams&Wilkins, Baltimor

39. Cleeter M.W.J., Banister S.H., Ragan C.I. (1985) // Chemical cross-linking of mitochondrial NADH dehidrogenase from bovine heart. Biochem. J., 227, 467-474

40. Clejan L., Bosch C.G., Beattie D.S. (1984) // Inhibition by dicyclohexylcarbodiimide of proton ejection but not electron transfer in rat liver mitochondria. J. Biol. Chem., 259, 13017-13020

41. Cornell B.A., Keniry M.A., Post A., Robertson R.N., Weir L.E., Westermann P.W. (1987) // Location and activity of ubiquinone 10 and ubiquinone analogues in model and biological membranes. Biochemistry, 26, 7702-7707

42. Costa L.E., Reynafarje B., Lehninger A.L. (1984) // Stoichiometry of mitochondrial H* translocation couplrd to succinate oxidation at level flow. J. Biol. Chem., 259, 4802-4811

43. Crane F.L., Glenn J.L., Green D. (1956) // Studies on the electron transfer system. IV. The electron transfer particles. Biochim. Biophys. Acta., 22, 475487

44. Crane F.L., Hatefi Y., Lester R.L., Widmer C. (1957) // Isolation of a quinone from beef heart mitochondria. Biochim. Biophys. Acta., 25, 220-221

45. De Jong A.M., Albracht S.P. (1994a) // Ubisemiquinones as obligatory intermediates in electron transfer from NADH to ubiquinone. Eur. J. Biochem., 222, 975-982

46. De Jong A.M., Kotlyar A.B., Albracht S.P. (1994b) // Energy-induced sructural changes in NADH:Q oxidoreductase of the mitochondrial respiratory chain. Biochim. Biophys. Acta., 1186, 163-171

47. Deng P., Hatefi Y, Chen Sh. (1990) // N-arylazido-ß-alanyl NAD+ photoaffinity analogue. Synthesis and labelling of mitochondrial NADH dehydrogenase. Biochemistry, 29, 1094-1098

48. Di Bernardo S., Fato R., Casadio R., Fariselli P., Lenaz G. (1998) // A high diffusion coefficient for coenzyme Q10 might be relatedd to folded structure. FEBS Lett., 426, 77-80

49. Di Virgilio F., Azzone G.F. (1982) // Activation of site I redox-driven H+ pump by exogenous quinones in intact mitochondria. J. Biol. Chem., 257, 4106-4113

50. Djavadi-Ohaniance L., Hatefi Y. (1975) // Oxidation of NADPH by submitochondrial particles from beef hert in complete absence of transhydrogenase activity from NADPH to NAD+. J. Biol. Chem., 250, 93979403

51. Dooijewaard G., Slater E.C. (1976) // Steady-state kinetics of high molecular weight (Type I) NADH dehydrogenase. Biochim. Biophys. Acta., 440, 1-15

52. Dupius A., Skehel J.M., Walker J.E. (1991b) // NADHrubiquinone reductase from bovine mitochondria: complementary DNA sequence of a 19 kDa cysteine rich subunite. Biochem. J., 277, 11-15

53. Dupius A., Skehel J.M., Walker J.E. (1991a) // Plant chloroplast genomes encode a homologue of a nuklear coded iron-sulfur protein subunit of bovine mitochondrial Complex I. Biochemistry, 30, 2954-2960

54. Dutton P.L., Moser C.C., Sled V.D, Daldal F., Ohnishi T. (1998) // A reductant-induced oxidation mechanism for Complex I. Biochim. Biophys. Acta., 1364, 245-257

55. Earley F.G.P., Ragan C.I. (1980) // Identification of the subunits of bovine heart mitochondrial NADH dehydrogenase that are exposed to the phospholipid bilayer by photolabelling with 5-iodonaphth-l-yl azide. Biochem. J., 191, 429-436

56. Earley F.G.P., Ragan C.I. (1984) // Photoaffinity labelling of mitochondrial NADH dehydrogenase with arylazidomorphigenin, an analogue of rotenone. Biochem. J., 224, 525-534

57. Earley F.G., Patel S.D., Ragan C.I., Attardi G. (1987) // Photolabelling of a mitochondrial encoded subunits of NADH dehydrogenase with 3H. dihydro-rotenone. FEBS Lett., 219, 108-113

58. Ernster L., Dallner G., Azzone G.F. (1963) // Differential effects of rotenone and amytal on mitochondrial electron and energy transfer. J. Biol. Chem., 238, 1124-1131

59. Esposti D.M., Ghelli A., Crimi M., Estornell E., Fato R., Lenaz G. (1993) // Complex I and complex III of mitochondria have common inhibitors acting as ubiquinone antagonists. Biochem. Biophys. Res. Commun., 190, 1090-1096

60. Esposti D.M., Ghelli A., Ratta M., Cortes D., Estornell E. (1994) // Natural substances (acetogenins) from the family Annonaceae are powerful inhibitors of mitochondrial NADH dehidrogenase (Complex I). Biochem. J., 301, 161167

61. Esposti D.M., Ngo A., McMullen GL., Ghelli A., Sparla F., Benelli B., Ratta M., Linnane A.W. (1996b) // The specificity of mitochondrial complex I for ubiquinones. Biochem. J., 313, 327-334

62. Esposti D.M. (1996) // Aspects of Complex I interaction with ubiquinone and its antagonists. Biochim. Biophys. Acta., EBEC short reports, 9, 143

63. Esposti M.D. (1998) // Inhibitors of NADH-ubiquinone reductase: an overview. Biochim. Biophys. Acta., 1364, 222-235

64. Esposti M.D. (1999) // Ubiquinone and inhibitors sites in Complex I: one, twothor three? Biochem. Soc. Trans. 668 Meeting, Glasgow, 27, A83

65. Fato R., Castelluccio C., Palmer G., Lenaz G. (1988) // A simple method for determination of kinetic constants of membrane enzymes utilizing hydrophobic substrates: ubiquinol cytochrom c reductase. Biochim. Biophys. Acta., 932, 216-222

66. Fearnley I.M., Finel M., Skehel J.M., Walker J.E. (1991) // NADH:ubiquinone oxidoreductase from bovine heart mitochondria; cDNA secuences of the import precursors of the nuclear coded 39-kDa and 42-kDa subunits. Biochem. J., 278, 821-829

67. Fearnley I. M., Walker J. E. (1992) // Conservation of sequences of subunits of mitochondrial Complex I and their relationships with other proteins. Biochim. Biophys. Acta., 1140, 105-134

68. Festenstein G.N., Heaton F.W., Lowe J.S., Morton R.A. (1955) // A constituent of the unsaponifiable portion of animal tissue lipids (Xmax 272 mp). J. Biol. Chem., 59, 558-566

69. Finel M. (1993) // The proton-translocating NADH:ubiquinone oxidoreductase: discussion of selected topics. J. Bioenerg. Biomemr., 25, 347355

70. Fontaine E., Bernardi P. (1999) // Progress on the mitochondrial permeability transition pore: regulation by Complex I and ubiquinone analogs. J. Bioenerg. Biomemr., 31, 335-345

71. Frenkin M.V., Kotlyar A.B. (1999) // Arylazido-p-alanine ADP-ribose, a novel irreversible competitive inhibitor of mitochondrial NADH-ubiquinone oxidoreductase. Biochim. Biophys. Acta., 1413, 139-146

72. Friedrich T., Strohdeicher M., Hofhaus G., Weiss H. (1990) // The same motif for ubiquinone reduction in mitochondrial or chloroplast NADH dehydrogenase and bacterial glucose dehydrogenase. FEBS Lett., 265, 37-40

73. Fukushima T., Decker R.V, Anderson W.M., Spivey H.O. (1989) // Substrate channaling of NADH and binding of dehydrogenases to Complex I. J. Biol. Chem., 264, 16483-16488

74. Galante Y.M., Hatefy Y. (1979) // Purification and molecular properties of mitochondrial NADH dehydrogenase. Arch. Biochem. Biophys., 192, 559-568

75. Gavrikova E.V., Grivennikova V.G., Sled V.D., Ohnishi T., Vinogradov A.D. (1995) // Kinetics of the mitochondrial three-subutit NADH dehydrogenase interaction with hexammineruthenium(III). Biochim. Biophys. Acta., 1230, 23-30

76. Gavricova E.V., Vinogradov A.D. (1999) // Active/de-active state transition of the mitochondrial Complex I as revealed by specific sulfhydryl group labeling. FEBS Lett., 455, 36-40

77. Gibb G.M., Ragan C.I. (1990) // Identification of the subunits of bovine NADH dehydrogenasewhich are encoded in the mitochondrial genom. Biochem. J., 265, 903-906

78. Glinn M.A., Lee C.P., Ernster L. (1997) // Pro- and anti-oxidant activities of the mitochondrial respirotory chain: factors influencing NAD(P)H-induced lipid peroxidation. Biochim. Biophys. Acta., 1318, 246-254

79. Gondal J. A., Anderson W. M. (1985) // The molecular morfology of bovine heart mitochondrial NADH:Ubiquinone reductase, J. Biol. Chem., 260, 1269012694

80. Gornal A.G., Bardawill C.J., David M.M. (1949) // Detemination of serum proteins by means of the biuret reaction. J. Biol. Chem., 177, 751-766

81. Green D.E., Hatefi Y., Fechner W.F. (1959) // On the role of coenzyme Q in electron transport. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1, 45-48

82. Grigorieff N. (1998) // Three-dimentional structure of bovine NADH:ubiquinone oxidoreductase (Complex I) at 22 A in ice. J. Mol. Biol., 277, 1033-1046

83. Criddle R.S., Bock R.M., Green D.E., Tisdale H. (1962) // Physical characteristics of the electron transfer system and interpritations of the structure of mitochondria. Biochemistry, 1, 827-851

84. Grivennikova V.G., Gavrikova E.V., Timoshin A.A. (1993) // Fumarate reductase activity of bovine heartsuccinate-ubiquinone reductase. New assay sistem and overall properties of the reaction. Biochim. Biophys. Acta., 1140, 282-292

85. Grivennikova V.G., Maklashina E.O., Gavricova E.V., Vinogradov A.D (1997) // Interaction of the mitochondrial NADH-ubiquinone reductase with rotenone as related to the active/inactive transition. Biochim. Biophys. Acta., 1319,223-232

86. Gutman M., Singer T., Beinert H., Casida J. (1970a) // Reaction site of rotenone, piericidin A and amital in relation to the non-heme iron components of NADH dehydrogenase, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 65, 763-770

87. Gutman M, Singer T, Casida J. (1970b) // Studies on the respiratory chain-linked NADH dehydrogenase, reaction sites of piericidin A and rotenone. J. Biol. Chem, 245, 1992-1997

88. Gutman M, Singer T.P. (1971) // EPR studies on the iron-sulfur centers of DPNH dehydrogenase during the redox cycle of the enzyme, Biochem. Biophys. Res. Commun, 44, 1572-1578

89. Gutman M. (1980) // Electron flux through the mitochondrial ubiquinone. Biochim. Biophys. Acta, 594, 53-84

90. Han A.L, Yagi T, Hatefi Y. (1988) // Studies on the structure of NADH:ubiquinone oxidoreductase complex: topography of subunits of the iron-sulfur flavoprotein component. Arch.Biochem.Biophys, 267, 490-496135

91. Han A.L., Yagi T., Hatefi Y. (1989) // Studies on the structure of NADH:ubiquinone oxidoreductase complex: topography of subunits of the iron-sulfur protein component. Arch.Biochem.Biophys., 275, 166-173

92. Harry C.Au., Byoung B.S., Matsuno-Yagi A., Yagi T„ Scheffler I.E. (1999) // The NDUFA1 gene product (MWFE protein) is essential for activity of Complex I in mammalian mitochondria. Biochemistry, 96,4354-4359

93. Hatefi Y., Haavik A.G., Griffiths D.E. (1962) // Studies on the electron respiratory chain. XL. Preparation and properties of the mitochondrial DPNH-coenzyme Q reductase. J. Biol. Chem., 237, 1676-1680

94. Hatefi Y. (1963) // Coenzyme Q (Ubiquinone). Adv.in Enzymol., 25, 275328

95. Hatefi Y., Stempel K. (1969) // Isolation and enzymatic properties of the mitochondrial reduced diphosphopyridine nucleotide dehydrogenase. J. Biol. Chem., 244, 2350-2357

96. Hendler R.W., Setty O.H. (1988) // Direct measurement of the initial and early ratios of proton extrusion to oxygen uptake accompanying cytochrome c oxidation by rat liver mitoplasts. Bioph. J., 53,205-213

97. Heron C., Ragan C.I., Trumpower B.L. (1978) // The interaction between mitochondrial NADH-ubiquinone oxidoreductase and ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase. Biochem. J., 174, 791-800

98. Heron C., Gore M.G., Ragan C.I. (1979a) // The effects of lipid phase transitions on the interaction of mitochondrial NADH-ubiquinone oxidoreductase with ubiquinole-cytochrom c oxidoreductase. Biochem. J., 178,415-426

99. Heron C., Smith S., Ragan C.I. (1979b) // An analysis of the polypeptide composition of bovine heart mitochondrial NADH:ubiquinone oxidoreductase by two-dimensional polyacrylamide-gel electrophoresis. Biochem. J., 181, 435-443

100. Hinkle P.C., Horstman L.L. (1971) // Respiration-driven proton transport in submitochondrial particles. J. Biol. Chem., 246, 6024-6028

101. H0 Y., Wang J.H. (1981) // Effect of pyridine homologues on respiratory control and H+/O ratio in mitochondria. J. Biol. Chem., 256, 2611-2614

102. Hofhaus G., Weis H., Leonard K. (1991) // Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (Complex I). J. Mol. Biol., 221, 1027-1043

103. Hommes F.A. (1963a) // The succinate-linked nicotinamide-adeninedinucleotide reduction in submitochondrial particles. I. Kinetic studies of the reaction. Biochim. Biophys. Acta, 77, 173-182

104. Hommes F.A. (1963b) // The succinate-linked nicotinamide-adeninedinucleotide reduction in submitochondrial particles. I. Studies with inhibitors. Biochim. Biophys. Acta, 77, 183-190

105. Honkakoski P.J., Hassinen I.E. (1986) // Sensitivity to NN'-dicyclohexylcarbodi-imide of proton translocation by mitochondrial NADH:ubiquinone oxidoreductase. Biochem. J., 237, 927-930

106. Jeng M., Hall C., Crane F.L., Takahashi N., Tamura S., Folkers K. (1968) // Inhibition of mitochondrial electron transport by piericidin A and related compounds. Biochemistry, 7, 1311-1322

107. Junge W., Auslander W., McGeer A.J., Runge T. (1979) // The buffering capacity of the internal phase of thylakoids and the magnitude of the pH changes inside under flashing light. Biochim. Biophys. Acta., 546, 121-141

108. Kean E.A, Gutman M., Singer T.P. (1971) // Studies on the respiratory chain linked nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase. XXII. Rhein, a competitive inhibitor of the dehydrogenase. J. Biol. Chem., 246, 2346-2353

109. Kikuno R., Miyata T. (1985) // Sequence homologies among mitochondrial DNA-coded URF-2, URF-4 and URF-5. FEBS Lett, 189, 85-88

110. Kotlyar A.B., Sled V.D., Burbaev D.Sh., Moroz I.A., Vinogradov A.D. (1990) // Coupling site I and rotenone sensitive ubisemiquinone in tightly coupled submitochondrial particles. FEBS Lett., 264, 17-20

111. Kotlyar A.B., Vinogradov A.D. (1990) // Slow active/inactive transition of the NADH:ubiqinone reductase. Biochim. Biophys. Acta., 1019, 151-158

112. Kotlyar A.B., Gutman M. (1992) // The effect of A|iHf on the interaction of rotenone with Complex I of submitochondrial particles. Biochim. Biophys. Acta., 1140, 169-174

113. Kotlyar A.B., Sled V.D., Vinogradov A.D. (1992) // Effect of Ca2+ ions on the slow active/inactive transition of the mitochondrial NADH:ubiquinone reductase. Biochim. Biophys. Acta., 1098, 144-150

114. Kowal A.T., Morningstar J.E., Johnson M.K., Ramsay R.R., Singer T.P. (1986) // Spectroscopic characterization of the number and type of iron-sulfur clusters in NADH:ubiquinone oxidoreductase. J. Biol. Chem., 261, 92399245

115. Krishnamoorthy A.I.G., Hinkle P.C. (1988) // Studies on the electron transfer pathway, topography of iron-sulfur centers, and site of coupling in NADH-Q oxidoreductase. J. Biol. Chem., 263, 17566-15575

116. Kroger A., Klingenberg M. (1973a) // The kinetics of the redox reactions of ubiquinone related to the electron-transport activity in the respiratory chain. Eur. J. Biochem., Vol 34, 358-368

117. Kroger A., Klingenberg M. (1973b) // Further evidence for the pool function of ubiquinone as derived from the inhibition of the electron transport by antimycin. Eur. J. Biochem., 39, 313-323

118. Landi L., Pasquali P., Cabrini L., Lenaz G. (1979) // Effect of endogenous ubiquinone on the reduction and oxidation of short exogenous ubiquinone homologs in beef heart mitochondria. Boll. Soc. Ital. Biol. Sper., 55, 21422148

119. Lass A., Agarwall S., Sohal R.S. (1997) // Mitochondrial ubiquinone homologues, superoxide radical generation, and longevity in different mammalian species. J. Biol. Chem., 272, 19199-19204

120. Lawford H.G., Garland P.B. (1972) // Proton translocation coupled to quinone reduction by reduced nicotinamide-adenine dinucleotide in rat liver and ox heart mitochondria. Biochem. J., 130, 1029-1044

121. Lemasters J.J., (1984) // The ATP-to-oxygen stoichiometries of oxidative phosphorylation by rat liver mitochondria. J. Biol. Chem., 259, 13123-13130

122. Lenaz G. (1998) // Quinone specificity of Complex I. Biochim. Biophys. Acta., 1364, 207-221

123. Leonard K., Haiker H., Weiss H. (1987) // Tree dimentional stucture of NADH:ubiquinone reductase (Complex I) from Neurospora mitochondria determinet by electron microscopy of membrane crystals. J. Mol. Biol., 194, 277-286

124. Leung K.H., Hinkle P.C. (1975) // Reconstitution of ion transport and respiratory control in vesicles formed from reduced coenzyme Q-Cytochrome c reductase and phospholipids. J. Biol. Chem., 250, 8467-8471

125. Lindahl P.E., Oberg K.E. (1961) // The effect of rotenone on respiration and its point of attack. Exp. Cell Res., 23, 228-237

126. Low H., Yallin I. (1963a) // Succinat linked diphosphopyridine nucleotide reduction in submitochondrial particles. Biochim. Biophys. Acta., 69, 361374

127. L6w H., Vallin I., Aim B. (1963b) // Some aspects of oxidative phosphorilation and its reversal in submitochondrial particles. In "Energy -linked functions of mitochondria" ed. B. Chance, 5-25

128. Masui R., Wakabayashi S., Matsubara H., Hatefy Y. (1991b) // The amino acid sequence of the 9 kDa polypeptide and partial amino acid sequence of 20 kDa polypeptide of mitochondrial NADH:ubiquinone oxidoreductase. Biochem. J., 110, 575-582

129. Meng B., Matsubayashi T., Wakasugi T., Shinozaki K., Sugiura M., Hirai A., Mikami T., Kishima Y., Kinoshita T. (1986) // Ubiquity of the genes for components of a NADH dehydrogenase in higher plant chloroplast genomes. Plan. Sci., 47, 181-184

130. Meng R.I, Griffith M, Day D.A, Wiskich J.T. (1992) 11 Matrix NADH dehydrogenase of plant mitochondria and sites of quinone reduction by Complex I. Eur. J. Biochem, 208, 481-485

131. Minakami S, Schindler F.J, Estabrook R.W. (1964a) // Hydrogen transfer between reduced diphosphopyridine nucleotide dehydrogenase and the respiratory chain. I. Effect of sulfghydryl inhibitors and phospholipase. J. Biol. Chem, 239, 2042-2048

132. Mitchell P. (1961) // A chemiosmotic hypothesis for the mechanism of oxidative and photosynthetic phosphorilation. Nature, 191, 144-145

133. Mitchell P, Moyle J. (1965a) // Stoichiometry of proton translocationthrough the respiratory chain and adenosine triphosphatase system of rat liver mitochondria. Nature, 208, 147-151

134. Mitchell P, Moyle J. (1965b) // Evidence discriminating between the Chemical and the Chemiosmotic mechanisms of electron transport phosphorilation. Nature, 208, 1205-1206

135. Mitchell P. (1966) // Chemiosmotic coupling in oxidative and photosynthetic phosphorilation. Biol. Reviews, 41, 455-502

136. Mitchell P, Moyle J. (1967a) // Proton-transport phosphorilation: Some experimental tests. Biochemistry of mitochondria. Ed. By Slater E.C. et al. N.Y. Acad.Press, 53-74

137. Mitchell P, Moyle J. (1967b) // Respiration-driven proton translocation in rat liver mitochondria. Biochem. J, 105, 1147-1162

138. Mitchell P, Moyle J, Smith L. (1968) // Bromthymol blue as a pH indicator in mitochondrial suspension. Eur. J. Biochem, 4, 9-19

139. Mitchell P, Moyle J. (1969) // Estimation of membrane potential and pH difference across the cristae membrane of rat liver mitochondria. Eur. J. Biochem, 7, 471-484

140. Mitchell P, Moyle J. (1979) // Respiratory-chain protonmotive4 t iLstoicheiometry. Biochem. Soc. Trans. 583 meeting, Cambridge,, 7, 887-894

141. Moyle J, Mitchell P. (1973) // The proton-translocating nicotinamide-adenine dinucleotide (phosphate) transhydrogenase of rat liver mitochondria. Biochem. J, 132, 571-585

142. Miyoshi H, Inoue M, Okamoto S, Ohshima M, Sakamoto K, Iwamura H. (1997) // Probing the ubiquinone reduction site of mitochondrial Complex I using novel cationic inhibitors. J. Biol. Chem, 272, 16176-16183

143. Miyoshi H., Iwata J., Sakamoto K., Furukawa H., Takada M., Iwamura H., Watanabe T., Kodama Y. (1998) // Specificy of pyridinium inhibitors of the ubiquinone reduction sites in mitochondrial Complex I. J. Biol. Chem., 273, 17368-17374

144. Moncelli M.R., Becucci L., Nelson A., Guidelli R. (1996) // Electrochemical modeling of electron and proton transfer to ubiquinone-10 in a self-assembled phospholipid monolayer. Biophys.J., 70, 2716-2726

145. Morton R.A. (1958) // Ubiquinone. Nature, 182, 1764-1767

146. Murphy M.P., Brand M.D. (1988) // Membrane-potential-dependent changes in the stoichiometry of charge translocation by the mitochondrial electron transport chain. Eur. J. Biochem., 173, 637-644

147. Mustafa M.G., Cowger M.L., Labbe R.F., King T.E. (1969) // General nature of «Wurster's Blue shunts» in the respiratory chain. J. Biol. Chem., 243, 1908-1918

148. Patel S.D., Cleeter M.W.J., Ragan C.I. (1988) // Transmembrane organization of mitochondrial NADH dehydrogenase as revealed by radiochemical labelling and cross-linking. Biochem. J., 256, 529-535

149. Pilkington S.J., Walker J.E. (1989) // Mitochondrial NADH-ubiquinone reductase: complementary DNA sequences of import precursors of the bovine and human 24 kDa subunit. Biochemistry, 28, 3257-3264

150. Pilgington S.J, Skehel J.M, Gennis R.B, Walker J.E. (1991) // Relationship between mitochondrial NADH-ubiquinone reductase and NAD+ reducing dehydrogenase. Biochemistry, 30, 2166-2175

151. Pozzan T, Miconi V, Di Virgilio F, Azonne G.F. (1979) // HVSite, charge/Site, and ATP/Site ratios at coupling Sites I and II mitochondrial e" transport. J. Biol. Chem, 254, 10200-10205

152. Preis D, Vandes Pas J, Nehls U, Rohlen D, Sackmann U, Jahnke U, Weiss H. (1990) // The 49 kDa subunite of NADH:ubiquinone reductase (Complex I) from Neurospora Crassa mitochondria: primary structure of the gene and protein. Curr. Genet, 18, 59-64

153. Ragan C.I., Hinkle P.C. (1975) // Ion transport and respirarory control in vesicles formed from reduced nicotinamide adenine dinucleotide coenzyme Q reductase and phospholipids. J. Biol. Chem., 250, 8472-8476

154. Ragan C.I. (1976) // The structure and subunite composition of the particulate NADH- ubiquinone reductase on bovine heart mitochondria. Biochem. J., 154, 295-305

155. Ragan C.I., Galante Y.M., Hatefi Y. (1982b) // Purification of the three iron-sulfur proteins from the iron protein fragment of mitochondrial NADH:ubiquinone reductase. Biochemistry, 21, 2518-2524

156. Ragan C.I., Galante Y.M., Hatefy Y., Ohnishi T. (1982a) // Resolution of mitochondrial NADH dehydrogenase and the isolation of two iron-sulfur proteins. Biochemistry, 21, 590-594

157. Ragan C.I. (1987) // Structure of NADHrubiquinone reductase (Complex I). Curr. Top. Bioenergetics., 15, 1-36

158. Ramsay R., Salash J., Dadgar J., Singer T. (1986) // Inhibition on mitochondrial NADH dehydrogenase by pyridine derivatives and its possible relation to experimental and idiopathic parkinsonism. Biochem. Biophys. Res. Commun., 135, 269-275

159. Ramsay R.R., Krueger M., Yongster S., Gluck M., Casida J., Singer T. (1991) // Interaction of l-Methyl-4-Phenylpyridinium ion (MPP+) and its analogs with the rotenone/piericidin binding site of NADH dehydrogenase. J. Neurochem., 56, 1184-1190

160. Rao N.A., Felton., Huennekens F.L., Mackler B. (1963) // Flavine mononucleotide: the coenzyme of reduced diphosphopyridine nucleotide dehydrogenase. J. Biol. Chem., 238, 449-455

161. Reynafarje B., Brand M.D., Lehninger A.L. (1976) // Evaluation of the HVsite ratio of the mitochondrial electron transport from rate measurements. J. Biol. Chem., 251, 7442-7451

162. Rich P.R., Harper R. (1990) // Partition coefficient of quinones and hydroquinones and their relation to biochemical reactivity. FEBS Lett., 269, 139-144

163. Robertson D.E., Daldal F., Dutton P.L. (1990) // Mutants of ubiquinol-cytochrome c2 reductase resistant to Qo site inhibitors: consequences for ubiquinone and ubiquinol affinity and catalysis. Biochemistry, 29, 1124911260

164. Runswich M.J., Cennis R.B., Fearnley I.M., Walker J.E. (1989) // Mitochondrial NADH:ubiquinone reductase: complementary DNA sequenceof the import precursor of the bovine 75 kDa subunit. Biochemistry, 28, 94529459

165. Runswick M.J, Fearnley I.M, Skehel J.M, Walker J.E. (1991) // Presence of an acyl carrier protein in NADH:ubiquinone oxidoreductase from bovine heart mitochondria. FEBS Lett, 286,121-124

166. Ruzicka FJ, Crane F.L. (1970a) // Quinone interaction with the respiratory chain-linked NADH dehydrogenase of beef heart mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 223, 71-85

167. Ruzicka F.J, Crane F.L. (1970b) // Four quinonereduction sites in the NADH dehydrogenase complex. Biochem. Biophys. Res. Commun, 38, 249254

168. Ruzicka F.J, Crane F.L. (1971) //Quinone interaction with the respiratory chain-linked NADH dehydrogenase of beef heart mitochondria. II. Duroquinone reductase activity. Biochim. Biophys. Acta, 226, 221-233

169. Rydstrom J, Montelius J, Backstrom D, Ernster L. (1978) // The mechanism of oxidation of reduced dinucleotide phosphate by submitochondrial particles from beef heart. Biochim. Biophys. Acta, 501, 370-380

170. Sackmann U, Zensen R, Rohlen D, Jahnke U, Weiss H. (1991) // The acyl carrier protein in Neurospora crassa mitochondria is subunite of NADH:ubiquinone reductase (Complex I). Eur. J. Biochem, 200, 463-469

171. Salerno J.C, Ohnishi T, Lim J, Widger R, King T.E. (1977) // Spin coupling between electron carriers in the dehydrogenase segments of the respiratory chain. Biochem. Biophys. Res. Commun, 75, 618-624

172. Schneider H, Lemaster J.J, Hackenbrock C.R. (1982) // Lateral diffusion of ubiquinone during electron transfer in phospholipid- and ubiquinone-enriched mitochondrial membranes. J. Biol. Chem, 257, 10789-10793

173. Scholes P, Mitchell P. (1970) // Respiration-driven proton translocation in Micrococcus denitrificans. Bioenergetics, 1, 309-323.

174. Schuler F, Yano T, Di Bernardo S, Yagi T, Yankovskaya V, Singer T.P, Casida J.E. (1999) // NADH-quinone oxidoreductase: PSST subunit coupleselectron transfer from iron-sulfur cluster N2 to quinone. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96,4149-4153

175. Shimomura Y., Kawada T., Suzuki M. (1989) // Capsaicin and its analogs inhibit the activity of NADH-coenzyme Q oxidoreductase of the mitochondrial respiratory chain. Arch. Biochem. Biophys., 270, 573-577

176. Sigel E., Carafoli E. (1978) // The proton pump of cytochrome c oxidase and its stoichiometry. Eur. J. Biochem., 89, 119-123

177. Singer T.P., Ramsay R. (1992) // NADH:Ubiquinone oxidoreductase, in Molecular Mechanisms in Bioenergetics, ed. by L. Ernster, Elsevier Amsterdam, 145-162

178. Sled V.D., Vinogradov A.D. (1993a) // Kinetics of the mitochondrial NADH-ubiquinone oxidoreductase with hexammineruthenium(III). Biochim. Biophys. Acta., 1141, 262-268

179. Sled V.D., Vinogradov A.D. (1993b) // Reductive inactivation of the mitochondrial 3 subunite NADH dehydrogenase. Biochim. Biophys. Acta., 1143, 199-203

180. Smith S., Ragan C.I. (1980) // The organization of NADH dehydrogenase polypeptides in the inner mitochondrial membrane. Biochem. J., 185, 315-326

181. Srivastava D.K., Bernard S.A. (1986) // Metabolite transfer via enzymeenzyme complexes. Science, 234, 1081-1086

182. Sumegi B., Srere P.A. (1984) // Complex I binds several mitochondrial NAD-coupled dehydrogenases, J. Biol. Chem., 259, 15040-15045

183. Suzuki H., King T.E. (1983) // Evidence of an ubisemiquinone radical from the NADH:ubiquinone reductase of the mitochondrial respiratory chain. J. Biol. Chem., 258, 352-358

184. Thierbach G., Reichenbach H. (1981) // Myxothiazol, a new inhibitor of the cytochrom bei segment of the respiratory chain. Biochim. Biophys. Acta., 638, 282-289

185. Trumpower B.L. (1981) // New concept on the role of ubiquinone in the mitochondrial respiratory chain. J. Bioener. Biomem., 13, 1-24

186. Turrens J.F, Boveris A. (1980) // Generation of superoxide anion by the ANDH dehydrogenase of bovine heart mitochondria. Biochem. J, 191, 421427

187. Ulrich E.L, Girvin M.E, Cramer W.A, Markley J.L. (1985) // Location and mobility of ubiquinones of different chain lengths in artificial membrane vesicles. Biochemistry, 24, 2501-2508

188. Ushakova A.V, Grivennikova V.G, Ohnishi T, Vinogradov A.D. (1999) // Triton X-100 as a specific inhibitor of the mammalian NADH:ubiquinone oxidoreductase (Complex I). Biochim. Biophys. Acta, 1409, 143-153

189. Vallin I, Low H. (1964) // Succinat-linked nicotinamide-adenine dinucleotide reduction coupled with the aerobic oxidation of reduced tetramethyl-p-phenylendiamine in submitochondrial particles. Biochim. Biophys. Acta, 92, 446-457

190. Van Belzen R, Albracht S.P.J. (1989) // The pathway of -electron transfer in NADH:Q oxidoreductase. Biochim. Biophys. Acta, 974, 311-320

191. Van Belzen R, Van Gaalen M.C.M, Cuypers P.A, Albracht S.P.J. (1990) // New evidence for dimeric nature of NADH:ubiquinone oxidoreductase in bovine-heart submitochondrial particles. Biochim. Biophys. Acta, 1017, 152159

192. Van Belzen R, De Jong A, Albracht S.PJ. (1992) // On the stoichiometry of the iron sulfur clusters in of mitochondrial NADH:ubiquinone oxidoreductase. Eur. J. Biochem, 209, 1019-1022

193. Van Belzen R, Kotlyar A, Dunham W, Albracht S.P.J. (1996) // EPR-spectroscopic studies on the iron-sulfur cluster 2 of Complex I in coupled submitochondrial particles. Biochim. Biophys. Acta, EBEC short reports, 9, 150

194. Vinogradov A.D. (1993) // Kinetics control and mechanism of ubiquinone reduction by the mammalian respiratory chain linked NADH:Ubiquinone reductase, J. Bioenergetic. Biomemran, 25, 367-377

195. Vinogradov A.D. (1998) // Catalitic properties of the mitochondrial NADH:ubiquinone oxidoreductase (Complex I) and pseudo-reversible active/inactive enzyme transition. Biochim. Biophys. Acta, 1364, 169-185

196. Vuokila P.T, Hassinen I.E. (1988) // DCCD-sensitivity of bovine heart mitochondrial NADH-ubiquinone reductase. Inhibition of activity and binding to subunits. Biochem. J, 249, 339-344

197. Vuokila P, Hassinen I.E. (1989) // DCCD-sensitivity of electron and proton transfer by NADH-ubiquinone reductase in bovine heart submitochondrial particles a thermodynamic approach. Biochim. Biophys. Acta, 974, 219222

198. Walker J.E. (1992) // The NADHrubiquinone oxidoreductase (complex I) of respiratory chain. Qurterly Reviews of Biophysics, 25, 253-324

199. Wikstrom M. (1977) // Proton pump coupled to cytochrome c oxidase in mitochondria. Nature, 266, 271-273

200. Wikstrom M. (1984) // Two protons are pumped from the mitochondrial matrix per electro transferred between NADH and ubiquinone. FEBS Lett, 169, 300-304

201. Yagi T. (1990) // Inhibition by capsaicin of NADH-quinone oxidoreductase is correlated with the presence of energy-coupling site I in various organisms. Arch. Biochem. Biophys, 281, 305-311

202. Yagi T. (1987) // Inhibition of NADH-ubiquinone reductase activity by N,N'-dicyclohexylcarbodiimide and correlation of this inhibition with the occurence of energy-coupling site I in various organisms. Biochemistry, 26, 2822-2828

203. Yagi T, Hatefi Y. (1988) // Identification of the dicyclohexylcarbodiimide binding subunit of NADH-ubiquinone oxidoreductase (Complex I). J. Biol. Chem.,263, 16150-16155

204. Yagi T, Dinh T.M. (1990) // Identification of the NADH-binding subunit of NADH:Ubiquinone oxidoreductase of Paracoccus denitrijicans. Biochemistry, 29, 5515-5520

205. Yagi T. (1991) // Bacterial NADH-Quinone oxidoreductases. Mini-review. J. Bioenerg. Biomembran, 23,211-225

206. Yamaguchi M, Belogrudov G.I, Hatefi Y. (1998) // Mitochochondrial NADH-Ubiquinone oxidoreductase (Complex I). Effect of substrates on the fragmentation of subunits by trypsin. J. Biol. Chem, 273, 8094-8098

207. Yu Ch, Yu L. (1981) // Ubiquinone-binding protein. Biochim. Biophys. Acta, 639, 99-128

208. Zakharova N, Zharova T.V, Vinogradov A.D. (1999) // Kinetics of transhydrogenase reaction catalyzed by the mitochondrial NADH-ubiquinone oxidoreductase (Complex I) imply more than one catalytic nucleotide-binding sites. FEBS Lett, 444,211-216

209. Zensen R, Husmann H, Schneider R, Peine T, Weiss H. (1992) // De novo synthesis and desaturation of fatty acids at mitochondrial acyl-carrier protein, a subunit of NADH:Ubiquinone oxidoreductase in Neurospora crass a. FEBS Lett, 310, 179-181

210. Zharova T.V, Vinogradov A.D. (1998) // A competitive inhibition of the mitochondrial NADH-ubiquinone oxidoreductase (Complex I) by ADP-ribose. Biochim. Biophys. Acta, 1320, 256-264