Противодифтерийные антитоксические и антибактериальные антитела в сыворотках крови людей

Фирсова, Татьяна Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Противодифтерийные антитоксические и антибактериальные антитела в сыворотках крови людей
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Противодифтерийные антитоксические и антибактериальные антитела в сыворотках крови людей"

На правах рукописи

ФИРСОВА ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА

ПРОТИВОДИФТЕРИЙНЫЕ АНТИТОКСИЧЕСКИЕ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА В СЫВОРОТКАХ КРОВИ

ЛЮДЕЙ

03.02.03 - микробиология 03.01.06 — биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 3 ДЕК 2012

Москва-2012

005047454

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель: Шмелева Елена Александровна

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты: Волкова Рауза Асхатовна

доктор биологических наук, начальник лаборатории молекулярно-биологических и генетических методов испытаний Испытательного центра экспертизы качества медицинских иммунобиологических препаратов Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Шемякин Игорь Георгиевич

доктор биологических наук, профессор, заместитель директора по научной работе, заведующий лабораторией молекулярной биологии Федерального бюджетного научного учреждения «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Ведущая организация Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской Академии Медицинских Наук (г. Москва)

Защита состоится 12 г. в "Т^часов на заседании

диссертационного совета Д 20046.01 При Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

О.Ю. Борисова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время благодаря широкому охвату населения профилактическими прививками как в России, так и в других странах мира, регистрируются спорадические случаи заболевания дифтерией (Маркина С.С., Максимова Н.М., ВОЗ, 2011). Для сохранения эпидемиологического благополучия требуется не только соблюдение правил и схем национальных календарей профилактических прививок, но и постоянный мониторинг за состоянием коллективного противодифтерийного иммунитета (Максимова Н.М., Маркина С.С., 2011).

Напряженность антитоксического иммунитета в Российской Федерации определяют с помощью реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) (Максимова Н.М., Маркина С.С., 2011). В мировой практике для определения поствакцинальных антитоксических антител в сыворотках крови людей используются иммуноферментные тест-системы и реакция нейтрализации в культуре клеток Vero (Miyamura К., 1974). При этом результаты определения содержания антитоксина в крови выражают в международных единицах ME/мл (Di Giovine Р., Pinto А., 2009).

Вместе с тем антитоксический иммунитет защищает от заболевания дифтерией, но не препятствует свободной циркуляции возбудителя С. diphtheriae tox+ в иммунных коллективах, что обуславливает скрытое течение эпидемиологического процесса (Сухорукова Н.Л., Фаворова JI.A., 1979). Следовательно, антитоксический иммунитет не дает полного представления о противодифтерийной защите, поскольку при этом не учитываются противодифтерийные антибактериальные антитела, образующиеся естественным путем в ответ на бактериальные антигены при контакте с коринебактериями дифтерии. В этой связи очевидна необходимость изучения не только антитоксических, но и антибактериальных противодифтерийных антител с помощью современных иммунодиа-гностических методов (Шмелева Е.А., 1991).

Цель исследования

Выявить и определить количественное содержание противодифтерийных АТ и АБ 1§М, 1§А антител в сыворотках крови различных групп людей с помощью иммуноферментных тест-систем. Задачи исследования

1. Разработать иммуноферментную тест-систему для количественного определения АТ в сыворотках крови людей;

2. Создать иммуноферментную тест-систему для определения АБ ^М, ^А в абсолютных единицах в сыворотках крови людей;

3. С помощью разработанной тест-системы на основе ИФА определить содержание АТ в сыворотках крови взрослых людей различных возрастных групп, проживающих в Российской Федерации и ряде стран Европы;

4. С помощью биометрического анализа охарактеризовать напряженность АТ противодифтерийного иммунитета в исследованных популяциях людей;

5. Используя разработанные тест-системы выявить содержание АБ антител изотипов в, М, А в сыворотках крови людей различных возрастных групп, проживающих в Российской Федерации и других странах Европы;

6. С помощью биометрического анализа показать напряженность АБ противодифтерийного иммунитета в популяциях взрослых людей из Российской Федерации и ряда стран Европы.

Научная новизна

Впервые разработаны отечественные тест-системы на основе ИФА для выявления противодифтерийных АТ и ГцМ, ^А антител к бактериальным антигенам коринебактерий дифтерии в абсолютных единицах.

Показано, что во всех изученных сыворотках крови взрослых людей содержатся противодифтерийные АТ антитела в концентрациях от 8,0 ±1,5 до 384,5 ± 74,0 мкг/мл и наряду с ними противодифтерийные АБ антитела изотипов О, М, А в концентрациях от 19,0 ± 1,8 до 161,2 ± 19,5 мкг/мл, от 3,1 ± 0,9 до 90,6 ± 12,0 мкг/мл и от 3,4± 0,4 до 29,2 ± 3,6 мкг/мл соответственно.

Определено, что существует прямая корреляционная связь между показателями АТ антител, выявленных в одних и тех же сыворотках взрослых людей с помощью разработанной иммуноферментной тест-системы (показатели содержания в мкг/мл) и коммерческой тест-системы на основе ИФА (показатели содержания в МЕ/мл).

Выявлено, что самое высокое содержание АТ антител отмечено в сыворотках людей, проживающих в России и Финляндии, где согласно национальным календарям профилактических прививок проводится вакцинация взрослого населения, а также в Латвии, где в 90-е годы отмечались вспышки заболевания дифтерией, сопровождающиеся высоким уровнем носительства (от 14,5 ± 3,0 до 89,0 ± 8,0, от 8,0 ±1,5 до 384,5 ± 74,0 и от 32,5 ± 7,0 до 184,2 ± 32,5 мкг/мл соответственно). В сыворотках взрослых людей из Англии и Италии антитоксин содержался в самых низких концентрациях (от 14,0 ± 1,5 до 32,5 ± 6,0 и от 14,5 ± 3,0 до 51,5 ± 16,0 мкг/мл соответственно).

Определено, что с увеличением возраста содержание АТ и АБ антител в, М изотипов уменьшается, а содержание АБ ^А увеличивается, что подтверждает изменение синтеза иммуноглобулинов этих изотипов в онтогенезе.

Впервые использование биометрического метода биномиального распределения уровней концентрации АТ и АБ антител в сыворотках крови взрослых людей из разных стран позволило оценить напряженность популяционного противодифтерийного иммунитета. Показано, что оптимальная напряженность противодифтерийного иммунитета характеризуется содержанием в сыворотках крови большего количества людей невысоких концентраций АТ и АБ антител и в сыворотках меньшего количества людей - высоких концентраций (1-й и 2-й модальные пики), что подтверждает эволюционно закрепленную закономерность.

Практическая значимость

Разработанные иммуноферментные тест-системы позволяют выявлять в сыворотках крови людей поствакцинальные АТ и образующиеся естественным

путем АБ антитела и определять напряженность популяцнонного противодифтерийного АТ иммунитета, мониторинг которого входит в систему эпиднадзо-ра.

По результатам работы составлены и утверждены пособия («Определение антитоксических противодифтерийных антител в сыворотках крови людей методом иммуноферментного анализа», «Определение антибактериальных противодифтерийных антител в сыворотках крови людей методом иммуноферментного анализа», 2012) для сотрудников научных учреждений по использованию ИФА для количественного выявления противодифтерийных антител.

В 2013 году будут проведены лабораторные испытания разработанных тест-систем на основе ИФА.

Внедрение результатов работы в практику

Разработанные иммуноферментные тест-системы используются в работе Научной группы по изучению противодифтерийного иммунитета в МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского для оценки напряженности противодифтерийного антитоксического и антибактериального иммунитета у людей.

После проведения лабораторных испытаний планируется коммерческий выпуск тест-системы на основе ИФА для количественного выявления противодифтерийных АТ антител с целью дальнейшего использования в практике здравоохранения.

Результаты проведенных исследований нашли применение в лекционном цикле и практических занятиях на курсах повышения квалификации для врачей-бактериологов «Актуальные вопросы современной медицинской микробиологии», проводимых на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Ро-спотребнадзора (2009; 2010 гг.)

Основные положения, выносимые на защиту 1. Разработанная иммуноферментная тест-система позволяет выявлять концентрацию АТ в абсолютных единицах, которые коррелируют с пока-

зателями содержания антитоксина в международных условных единицах МЕ/мл, выявленных с помощью коммерческой тест-системы на основе ИФА.

2. Созданная тест-система на основе ИФА позволяет определять концентрацию образующихся естественным путем АБ антител изотипов G, М, А в сыворотках крови людей в абсолютных единицах.

3. Использование биометрического анализа дает возможность изучить напряженность противодифтерийного антитоксического и антибактериального иммунитета в популяциях людей.

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании секции Ученого Совета ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, протокол № 4 от 07 июня 2012 г.

Результаты диссертационной работы были представлены на IV Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», (2-4 июня 2008г., Санкт-Петербург), Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Биологическая безопасность в современном мире» (21-22 апреля 2009 г., Оболенск), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 90-летию Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной и 20-летию Приволжского окружного центра по профилактике и борьбе со СПИД «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения» (15-17 июня 2009 г., Нижний Новгород,), Second Annual Meeting of Dipnet and Tenth International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria (5-7 November 2008, Larnaca, Cyprus), Third Annual Meeting of Dipnet and Eleventh International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria (7-9 October 2009, Riga, Latvia), Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» (18-20 мая 2010 г., Санкт-Петербург,), X Всероссий-

ской научно-практической конференции "Дни иммунологии в Сибири" (5-6 июля 2012 г., Иркутск).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 5 - в рецензируемых изданиях, 6 — в материалах конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы (глава 1 и 2), материалы и методы (глава 3), собственные исследования (главы 4, 5, 6, 7), заключение, выводы и список цитируемой литературы. Диссертация снабжена 32 рисунками и 17 таблицами. В библиографическом указателе приведены 235 источников, из них 151 - на русском и 84 - на иностранном языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалы исследования

В исследовании использовали:

- анатоксин дифтерийный очищенный несорбированный, служащий антигеном в разработанной иммуноферментной тест-системе для определения противодифтерийных АТ

- бактериальный препарат, содержащий антигены клеточной стенки С. сПрИЛепае Юх- пептидополисахаридной природы, служащий антигеном в иммуноферментной тест-системе для определения противодифтерийных АБ антител. Одна ампула препарата содержит 3000 мкг антигенов клеточных стенок. Бактериальный препарат был получен по методике, предложенной Шмелевой Е.А. (Шмелева Е.А., 1991);

- конъюгаты моноклональных антител к у-, ц- и а-цепям иммуноглобулина человека, меченные пероксидазой хрена, для количественного определения антител изотипов Б, М и А, приготовленные методом периодатного окисления («Сорбент Лтд.», Россия);

- сыворотки крови людей: исследовали сыворотки крови доноров из шести стран Европы: Латвии, России, Литвы, Италии, Англии, Финляндии. Всего определено содержание AT IgG антител в 411 пробах сывороток крови; АБ антител IgM - в 547, IgG - в 559, IgA - в 549 пробах сывороток крови. Образцы сывороток крови предоставлены Европейской лабораторной рабочей группой по дифтерии в рамках совместной работы с сектором микробных иммуномоду-ляторов ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

Для выделения противодифтерийных AT и АБ антител с помощью аффинной хроматографии в качестве сорбента использовали сефарозу, активированную бромцианом (Sigma-Aldrich Chemie GmbH). В качестве лигандов использовали очищенный дифтерийный анатоксин и бактериальный препарат, содержащий антигены клеточной стенки С. diphtheriae tox- пептидополисахаридной природы.

Методы исследования

Гамма-глобулиновую фракцию получали из пула 100 сывороток крови здоровых взрослых людей в возрасте 18-20 лет методом ступенчатого высаливания. Освобождение растворов высокомолекулярных веществ от низкомолекулярных соединений проводили с помощью диализа (Остерман Л.А., 1983).

Выделение противодифтерийных AT IgG и АБ IgG, IgM, IgA из гамма-глобулиновой фракции пула сывороток крови проводили с помощью метода аффинной хроматографии (Остерман Л.А, 1983,1985).

Определение концентрации противодифтерийных AT и АБ антител проводили с использованием неконкурентного метода иммуноферментного анализа, вариант «сэндвич» (Фримель Г., 1987, Нго Т.Т., 1988).

Статистические методы и программное обеспечение.

Для расчета количества антител в исследуемых сыворотках крови применяли компьютерную программу для ИФА «MSFL ELA.exe», разработанную ТОО «Микрофлора» при МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского (Козлов Л.В., 1985).

Количество общих иммуноглобулинов изотипов G, М, А в референс-сыворотке определяли с помощью коммерческих наборов (ЗАО «Вектор-БЕСТ», Россия) в соответствии с инструкцией производителя. В работе применялись разведения исследуемых образцов 1:10, 1:20 (Фирсова Т.Н., 2009).

Для сравнения показателей уровня AT антител, определенных с помощью разработанной тест-системы, использовали коммерческую иммуноферментную тест-систему («Binding Site», Италия). Уровень антитоксина определяли в соответствии с инструкцией производителя.

Значения средней арифметической и среднеквадратического отклонения показателей концентрации AT и АБ антител рассчитывали по общепринятым формулам (Иванова В.М., 1981).

Для выявления связи между переменными величинами по их абсолютным значениям использовали корреляционный анализ (Иванова В.М., 1981). Для метрических величин применяется коэффициент корреляции Пирсона, который задается формулой

где X,Y— две случайные величины, определённые на одном вероятностном пространстве, хзначения, принимаемые переменной X, у,- значения, принимаемые переменой У, х - средняя по X, у- средняя по У.

Для оценки напряженности противодифтерийного иммунитета в коллективах был использован метод популяционного анализа, позволяющий охарактеризовать и сравнить обследованные группы людей по распределению показателей концентрации AT и АБ антител в популяции. Расчет осуществляли с помощью метода биномиального распределения показателей количественного содержания противодифтерийных AT и АБ антител в сыворотках крови взрослых людей (Плохинский H.A., 1961, Зайцев Г.Н., 1973).

Я,

-х)х(у, -у)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления противодифтерийных AT антител

Для выявления поствакцинальных AT антител в сыворотках крови детей и взрослых в мировой практике используется иммуноферментный анализ, с помощью которого идентифицированные антитела характеризуются в относительных показателях ME/мл (Di Giovine Р, Pinto А, 2009). Целью данного исследования была разработка иммуноферментной тест-системы для количественного определения противодифтерийных AT IgG в абсолютных единицах. На первом этапе необходимо было получить стандартный образец с известным содержанием антитоксина в мкг/мл.

Получение стандарта AT антител Методом дробного высаливания была получена у - глобулиновая фракция из пула сывороток крови от 100 доноров в возрасте 18-20 лет. Далее проводили выделение из неё противодифтерийных AT антител с помощью метода аффинной хроматографии. На рис. 1 приведена схема выделения AT антител.

0 U © и О и О

Удаление несоязаошегося ^ w Ц лигаида

Специфические антитела

Рисунок 1. Схема выделения специфических антител с помощью аффинной

хроматографии

В качестве матрицы была использована активированная бромцианом сефа-роза. На неё сорбировали лиганд, в качестве которого использовали очищенный дифтерийный анатоксин. Наносили на колонку у—глобулиновую фракцию. За-

тем отмывали не связавшиеся с антигеном антитела. После этого проводили элюцию специфических антител, связавшихся с лигандами-антигенами. Собирали фракции объемом 3 мл каждая. Сбор фракций прекращали, когда кривая оптической плотности выходила на постоянное минимальное значение.

Для определения количественного содержания выделенных из у—фракции АТ в полученных при проведении аффинной хроматографии фракциях провели иммуноферментный анализ с помощью коммерческого набора «1§0 общий - ИФА - БЕСТ» (фирмы «Вектор-Бест», г. Москва). Используемый в данном наборе твердофазный метод иммуноанализа основан на принципе «сэндвича». Определение проводили в соответствии с инструкцией производителя. По результатам анализа для последующей работы отбирали фракции с наибольшей концентрацией АТ Они служили стандартом для разрабатываемой тест-системы.

Дальнейшие эксперименты были направлены на подбор оптимальных условий проведения ИФА, а именно: выбор концентрации специфического антигена и концентрации конъюгатов, рН используемых буферных растворов, время и температуру, при которой протекала сорбция специфического антигена на полистироловых планшетах.

Выбор рабочей концентрации антигена и оптимального разведения

конъюгатов

Целью данного этапа работы явился выбор минимальной концентрации раствора антигена (дифтерийного анатоксина), используемого для сенсибилизации планшета, и максимального разведения конъюгатов моноклональных антител к у-цепям иммуноглобулинов человека с пероксидазой хрена. За рабочее разведение препаратов принимали разведение, при котором отмечается максимальное значение оптической плотности образцов на фоне минимального значения оптической плотности отрицательного контроля (оптическая плотность меньше 0,2).

Для определения рабочей концентрации антигена использовали различные разведения дифтерийного анатоксина (20, 10, 5, 2 мкг/мл). По результатам данного теста была выбрана оптимальная рабочая концентрация антигена, которая составила 10 мкг/мл.

Для определения оптимального разведения конъюгата использовали двенадцать различных разведений в диапазоне от 1:500 до 1:32000. Анализ результатов показал, что оптимальный титр конъюгата для данной тест-системы составляет 1:20000.

Выбор оптимальных значений рН буферных растворов, температурного режима и времени инкубации

В ходе оптимизации методики варьировали значения рН буферных растворов, использующихся для сорбции антигена (карбонатного буфера) и для отмывки планщетов (фосфатного буфера): 9,2-9,8 и 7,2-7,5 соответственно. Результаты показали, что сенсибилизирующая активность антигена и интенсивность реакции практически не зависели от рН использованных растворов. В качестве рабочих были выбраны буферные растворы с рН, наиболее часто используемыми в ИФА: фосфатный буферный раствор с рН = 7,4 и карбонатный буферный раствор с рН = 9,6.

Изучение влияния температуры и времени сорбции антигена на чувствительность реакции показало, что она достигает максимума после инкубации планшетов при 37°С в течение 1 часа или при 4°С в течение 14 часов.

Характеристика разработанной иммуноферментной тест-системы

В качестве контролей в разработанном ИФА использовали лунки с адсорбированным положительным контрольным образцом, в котором содержались АТ антитела, и отрицательным контрольным образцом, не содержащим исследуемых антител. Разработанная иммуноферментная тест-система характеризуется высокой чувствительностью. Воспроизводимость метода показана пятикратным титрованием 10 контрольных образцов сывороток здоровых людей. Зарегистрировано четкое повторение результатов показателей содержания спе-

цифических антител в этих сыворотках. Установлен коэффициент вариации для воспроизводимости результатов 8,9% при норме не более 10% (Таранов А.Г., 2002).

Сравнение концентрации противодифтерийных АТ антител, выявляемых с помощью разработанной и коммерческой тест-систем

Для сравнения показателей уровня АТ антител, определенных с помощью разработанной и коммерческой иммуноферментных тест-систем, использовали корреляционный анализ, включающий определение коэффициента корреляции Пирсона и построение диаграммы рассеяния.

Диаграмма рассеяния выявленных показателей содержания АТ антител в сыворотках крови людей графически отражает корреляционную зависимость между показателями концентрации антител в мкг/мл и показателями в МЕ/мл.

Рисунок 2. Диаграмма рассеяния показателей АТ антител в сыворотках крови здоровых взрослых людей

Коэффициент корреляции Пирсона составил 0,873, что говорит о наличии сильной корреляции между двумя системами (рис. 2).

Следовательно, разработанная иммуноферментная тест-система определяет достоверное содержание специфических антител в мкг/мл в сыворотках крови и может быть использована для выявления противодифтерийных АТ

Определение концентрации АТ антител в сыворотках крови людей с помощью разработанной иммуноферментной тест-системы

Изучение АТ антител проводили для сывороток крови доноров из 6 стран Европы. Всего изучено 411 проб сывороток крови здоровых взрослых людей разных возрастных групп из 6-ти стран (табл. 1).

Наибольшие значения концентрации АТ антител были зарегистрированы в сыворотках людей в возрасте 20-30 лет из Латвии, России, Литвы и Финляндии (184,2±32,5, 89,0±8,0, 78,5±12,0 и 384,5±74,0 мкг/мл соответственно, табл. 1).

Таблица 1. Противодифтерийные АТ антитела в сыворотках крови здоровых

взрослых людей различных возрастных групп

Страна возраст концентрация, мкг/мл кол-во сывороток

Латвия 20-30 184,2 ± 32,5 14 85

31-40 138,0 ± 14,5 28

41-50 94,5 ± 14,0 20

51 и старше 32,5 ± 7,0 23

Россия 20-30 89,0 ± 8,0 25 67

31-40 79,5 ± 9,0 25

41-50 13,0 ± 5,5 7

51 и старше 14,5 ± 3,0 10

Литва 20-30 78,5 ± 12,0 33 88

31-40 75,5 ± 13,0 28

41-50 62,5 ± 11,0 27

51 и старше — —

Италия 20-30 51,5 ± 16,0 10 41

31-40 30,0 ± 5,5 10

41-50 24,5 ± 3,5 11

51 и старше 14,5 ± 3,0 10

Англия 20-30 32,5 ± 6,0 33 88

31-40 25,5 ± 6,5 25

41-50 14,0 ± 1,5 30

51 и старше — —

Финляндия 20-30 384,5 ± 74,0 7 42

31-40 22,0 ± 13,5 4

41-50 36,5 ± 13,0 20

51 и старше 8,0 ± 1,5 11

Для сывороток людей той же возрастной группы из Италии и Англии содержание антитоксина составляло 51,5±16,0 и 32,5±6,0 мкг/мл соответственно, что существенно ниже. У старших возрастных групп определённые уровни антитоксина ниже. Наименьшая концентрация AT антител наблюдалась в сыворотках доноров из Финляндии, России и Италии в возрасте 51 года и старше (8,0±1,5, 14,5±3,0, 14,5±3,0 мкг/мл соответственно).

Таким образом, с увеличением возраста концентрация антитоксина в крови здоровых взрослых людей, проживающих в разных странах, уменьшается (рис. 3). Необходимо отметить, что самые низкие уровни антитоксина в крови выявлены в сыворотках крови людей, проживающих в Англии (рис. 3). В сыворотках взрослых из России и стран Прибалтики в этот же период регистрируется значительно более высокое содержание AT антител. Только к 41-50 годам уровень антитоксина в крови людей из этих стран приближается к аналогичным возрастным показателям антитоксина у взрослых людей из Италии, Англии, Финляндии.

Высокая концентрация AT антител в крови доноров 20-30 лет, отмечающаяся для людей из России, Финляндии, Латвии и Литвы может быть вызвана интенсивным антигенным раздражением: в частности, вакцинацией взрослых людей, проводящейся в России и Финляндии (согласно национальным календарям прививок), или плотной циркуляцией возбудителя среди населения в виде транзиторного или длительного носительства (Латвия, Литва).

Возрастная динамика снижения концентрации антитоксина в крови взрослых людей от 20 до 51 года и старше объясняется особенностями иммунного ответа в онтогенезе. Высокие концентрации антитоксина в крови привитых взрослых, так же как и у носителей, не препятствуя персистенции возбудителя C.diphtheriae tox+ на поверхности слизистых оболочек, отражают повышенный синтез специфических антител и большую напряженность гуморального специфического иммунного ответа.

Л-10 11-50 51 и старше

Вочраст. лет

51-10 41-50

Возраст, лет

51л старше

Литва

Италия

31-41) 41-5« Возраст, лет

51 п старше

Англия

Финляндия

250.0 225.0 • 200,0 ■ Г 5.0 ■ 150.0 ■ 125.0 ■ 100 0 • "5.0 ■ 50.0 ■ 25,0

0.0 ■

.11-40 41-50

ВофКЬ лег

51л старше

Рисунок 3. Уровень противодифтерийных АТ антител (мкг/мл) в сыворотках

крови взрослых людей

Напряженность противодифтерийного АТ иммунитета в популяции людей

Для оценки напряженности АТ иммунитета в исследуемых коллективах людей был использован метод биометрического распределения биологического признака в популяции. Известно, что нормальное распределение любого признака в природе должно соответствовать бимодальному. При этом, большее количество людей в популяции обладает оптимальным иммунным ответом на любое антигенное воздействие, то есть у большего процента людей в популяции иммунный ответ должен быть умеренным (1-й модальный пик), а у меньшего процента - показатели концентрации индуцированных антител должны быть выше оптимальной нормы (2-й модальный пик). Расчет осуществлялся с помощью биномиального вариационного ряда распределения признака (в данном случае по концентрации АТ антител в популяции из той или иной страны).

Рисунок 4. Профили распределения в популяции показателей концентрации противодифтерийных АТ антител, содержащихся в сыворотках взрослых людей

из разных стран Европы 18

Анализ показал, что большее количество здоровых взрослых людей (от 46 до 75%) из таких стран как Италия, Англия, Финляндия содержали в крови более низкую концентрацию АТ антител (от 10 до 65 мкг/мл, рис. 4; 1-й модальный пик). У меньшего процента лиц содержание АТ антител регистрировалось в более высоких концентрациях (рис. 4; 2-й модальный пик).

Полученные профили распределения показателей концентрации АТ антител выбранных контингентов из Италии, Англии, Финляндии практически соответствуют нормальному бимодальному вариационному ряду.

В группах из Латвии, России и Литвы процент людей с «умеренно низкими» концентрациями (от 10 до 220 мкг/мл) АТ антител в крови составил около 30% (1-й модальный пик). Остальные обследованные лица содержали АТ антитела в очень высоких концентрациях (от 225 до 450 мкг/мл, 2-й модальный пик). Показатели концентрации 2-го модального пика сливаются с показателями 1-го. Нормальное бимодальное распределение признака в этих группах отсутствует и носит аномальный характер. Иммунная структура выбранных контингентов из Латвии, России и Литвы характеризуется значительной долей взрослых людей с гипертитрами антитоксина.

Итак, использование метода бимодального распределения в популяции показало, что люди, вне зависимости от возраста, с оптимально низкими концентрациями антитоксина в крови составляют в коллективах из Италии, Англии, Финляндии большинство, в то время как в коллективах из Латвии, России и Литвы, наоборот, они составляют меньшинство. Влияние большей доли индивидуумов с гипертитрами антитоксина в крови на иммунную структуру коллектива неблагоприятно. Для таких индивидуумов повышенный синтез АТ антител сопровождается изменением иммунной реактивности, формированием вторичного иммунодефицита и носительством. Увеличение количества носителей повышает плотность циркуляции возбудителя среди населения. В целом, для популяции, где выявлены отклонения от нормального бимодального рас-

пределения концентрации АТ антител, изменение ее иммунной структуры сопровождается снижением уровня специфической коллективной защиты.

Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления противодифтерийных АБ антител

АТ иммунитет не дает полного представления о противодифтерийной защите, поскольку при этом не учитываются АБ антитела, образующиеся естественным путем в ответ на бактериальные антигены при контакте с циркулирующими среди населения коринебактериями дифтерии. Поэтому очевидна необходимость изучения не только АТ, но и АБ противодифтерийных антител с помощью современных иммунодиагностических методов.

Получение стандарта АБ антител

На первом этапе был приготовлен стандартный образец, содержащий АБ антитела к С. сНрЬШепае. Для этого сначала из пула сывороток крови доноров была получена у-фракция. Далее из неё методом аффинной хроматографии были выделены АБ антитела (аналогично выделению АТ 1§0) (рис.1). В качестве лиганда использовали полученный нами бактериальный препарат, содержащий антигены клеточной стенки С. сНрЫЬепае Юх- пептидополисахаридной природы (Шмелева Е.А., 1991).

Для определения количественного содержания (мкг/мл) в полученных фракциях антител изотипов О, М, А проводили иммуноферментный анализ с использованием коммерческих наборов фирмы «Вектор-Бест» («^й общий-ИФА-БЕСТ», «^М общий-ИФА-БЕСТ», «^А общий-ИФА-БЕСТ»), Фракции с известной концентрацией АБ антител и использовались в дальнейших экспериментах в качестве стандарта.

Выбор рабочей концентрации антигена и оптимального разведения

конъюгатов

За рабочее разведение бактериального препарата принимали разведение, при котором отмечается максимальное значение оптической плотности иссле-

дуемых образцов на фоне минимального значения оптической плотности отрицательного контроля (оптическая плотность меньше 0,2).

Для определения рабочей дозы антигена готовили разведения бактериального препарата в концентрациях 100; 50, 25, 12,5, 6,2, 3,1, 1,55, 0,77, 0,38, 0,19, 0,095 и 0,047 мкг/мл.

По результатам данного теста были выбраны следующие оптимальные рабочие концентрации антигена для выявления антител: при определении АБ Гцв и IgM концентрация антигена составляет 12 мкг/мл; ^А — 6 мкг/мл.

Для определения оптимального разведения конъюгата использовали двенадцать различных разведений в диапазоне от 1:500 до 1:32000. Анализ показал, что титры конъюгатов для данной тест-системы составляют для: — 1:20000,^М - 1:20000,1ёА - 1:16000.

Характеристика разработанной иммуноферментной тест-системы В качестве контролей в разработанном ИФА использовали лунки с адсорбированным положительным контрольным образцом, в котором содержались АБ антитела, и отрицательным контрольным образцом, не содержащим исследуемых антител. Тест-система специфична и характеризуется высокой чувствительностью. Для разработанной тест-системы ИФА установлен коэффициент вариации для воспроизводимости результатов 8,2% при норме не более 10% (Таранов А.Г., 2002).

Таким образом, разработанная иммуноферментная тест-система может быть использована для выявления противодифтерийных АБ ^М, в абсолютных показателях в сыворотках крови людей.

Определение концентрации противодифтерийных АБ антител в сыворотках крови людей с помощью разработанной иммуноферментной

тест-системы

Известно, что в сыворотках крови людей наряду с АТ антителами содержатся и образующиеся естественным путем АБ антитела в результате циркуляции в популяции людей коринебактерий дифтерии. Изучение АБ антител

проводили в сыворотках крови здоровых взрослых людей-доноров из шести стран Европы: Латвии, России, Литвы, Италии, Англии, Финляндии. Всего изучено - в 559, ^М - в 547, ^А - в 549 пробах сывороток крови.

Высокие концентрации АБ определялись в сыворотках взрослых в 20-30 лет из Латвии (157,2±27,8 мкг/мл), Литвы (63,8±7,0 мкг/мл), Англии (90,2±9,9 мкг/мл) и Финляндии (157,3±18,9 мкг/мл, табл. 2, рис. 5). В сыворотках взрослых (20-30 лет) из России и Италии АБ содержались в меньших концентрациях: 38,5±3,6 и 33,6±3,8 мкг/мл. Показатели концентрации АБ в сыворотках лиц из всех стран на протяжении 30 лет (от 20 до 51 года и старше) практически не изменялись.

В исследованных сыворотках взрослых людей в возрасте 20-30 и 31-40 лет высокие концентрации АБ ^М определялись в сыворотках из Латвии (90,6±12,0, 88,5±13,4 мкг/мл), Литвы (45,6±6,2, 32,1±4,1 мкг/мл) и в 30-40 лет-из Англии (55,9±10,3 мкг/мл). В сыворотках из Финляндии, Италии, России АБ ^М в возрасте 20-30 лет выявлялись в меньших концентрациях: 33,3±5,3, 18,5±2,3, 17,1±1,6 мкг/мл соответственно. Самый низкий уровень АБ 1§М в возрасте от 20 до 51 года и старше регистрировался в сыворотках из Италии (табл. 2, рис.6).

Изучение АБ 1§А в тех же сыворотках показало, что самые высокие их концентрации содержатся в крови индивидуумов из России, Литвы и Италии (табл. 2, рис. 7). В сыворотках взрослых (20-30 лет) они выявляются в концентрации 21,8±1,6, 16,2±1,8 и 23,8±2,6 мкг/мл соответственно. Самые низкие концентрации АБ 1§А в этом же возрасте определялись в сыворотках лиц из Латвии, Англии, Финляндии (8,0±1,2, 3,4±0,4, 8,0±1,2 мкг/мл соответственно). С увеличением возраста прослеживается тенденция к увеличению концентрации АБ 1дА только для жителей Италии и Англии, а для контингентов из России и Финляндии, наоборот, отмечается снижение. Показатели концентрации АБ 1§А для жителей Латвии и Литвы практически не изменяются.

Таблица 2. Противодифтерийные АБ антитела в сыворотках крови здоровых

людей различных возрастных групп

Страна Возраст ш ДО 1еА

конц-ция, мкг/мл кол-во человек конц-ция, мкг/мл кол-во человек конц-ция, мкг/мл кол-во человек

Латвия 20-30 90,6 ±12,0 17 157,2 ±27,8 16 8,0 ±1,2 15

31-40 88,5 ± 13,4 29 135,1 ±18,1 25 5,6 ± 0,6 28

41-50 27,3 ± 5,2 15 173,2 ±15,4 17 8,0 ± 1,0 18

51 и старше 34,2 ± 2,9 18 161,2 ± 19,5 21 7,4 ± 1,2 23

Россия 20-30 17,1 ±1,6 91 38,5 ±3,6 87 21,8 ±1,6 89

31-40 21,0 ±2,4 28 82,0 ± 8,0 27 19,0 ± 3,0 27

41-50 29,5 ±6,2 19 47,4 ± 8,6 20 18,4 ±3,4 15

51 и старше 19,8 ±3,2 9 38,6 ±4,8 10 13,6 ±2,4 8

Литва 20-30 45,6 ± 6,2 29 63,8 ± 7,0 30 16,2 ± 1,8 33

31-40 32,1 ±4,1 31 67,8 ± 6,9 31 22,0 ± 2,2 30

41-50 21,9 ±2,9 28 86,9 ± 9,7 27 28

51 и старше — — — — — —

Италия 20-30 18,5 ±2,3 20 33,6 ±3,8 18 23,8 ± 2,6 18

31-40 17,2 ± 1,4 31 55,9 ±6,3 36 22,8 ± 2,4 36

41-50 17,9 ± 1,5 37 19,0 ± 1,8 37 28,4 ± 3,2 37

51 и старше 11,3 ±1,2 27 63,8 ±8,7 27 29,2 ± 3,6 22

Англия 20-30 21,2 ±3,5 27 90,2 ± 9,9 33 3,4 ± 0,4 39

31-40 55,9 ±10,3 24 109,8 ± 1,6 24 6,6 ± 1,8 23

41-50 22,0 ± 3,6 27 79,3 ± 10,4 28 7,4 ± 1,4 27

51 и старше — — — — — —

Финляндия 20-30 33,3 ± 5,3 8 157,3 ± 18,9 10 8,0 ± 1,2 8

31-40 14,2 ±2,2 5 122,2 ±41,5 4 6,2 ± 1,0 4

41-50 10,9 ± 1,7 17 147,4 ±7,1 22 9,0 ± 1,4 14

51 и старше 3,1 ±0,9 10 115,0 ± 15,9 9 3,6 ± 1,0 7

11-10 -11-50 51истарше Вотраст. лет_

§ 150.0

д 1-5.о 5

3 100.0 с.

е "5,0 5

5 50.ii О

£ 25.0

.4-40 41-50

Вочраст, лет

100.0

5 Г5.0 л

| 150.0

3 ио.о |

| **

I -'5-0

0,0

Литва

Италия

>1-40 41-50

Возраст, лет

51 н старше

'1 и стршг

Англия

Финляндия

31-40 41-50

Возраст, лет

51 п старше

51-40 41-50 51 н парше

Вотраст, лет

Рисунок 5. Уровень противодифтерийных АБ (мкг/мл) в сыворотках крови

взрослых людей

но

— LOO

I 90 l SO

i""

5 60

я 5(1

?40 ¡JO S 29 Й 10 0

31-# 41-50

BoipacT, лет

51 и старше

г uo

í 100

j¡ 90

4 80 i -0

1« fr»

í *

; JO & 20

10 0

» i >

.4"» 41-50 51 и crisme

Вотраст, лег

Литва

Италия

31-40 41-50 51нтршг Bmpan, .leí_

31-10 41-50 51II старше

BoipacT, лет

Англия

Финляндия

по

£ 100

Ь м

а so

i "0

3 w

ft 50

I 40

1 5i)

0 20

■А II)

Ш_И ,

Í110

1 iw

"S 90

2 80

9 №

I 50

Ё 40 i/

| 30

,3 :o

* 10

31-4d 41-50

Вшрап; лес

51 и старше

31-40 41-50

Вшрап. ли

51 и старик

Рисунок 6. Уровень противодифтерийных АБ ^М (мкг/мл) в сыворотках крови

взрослых людей

11« ; 30."

« 25.0 «

% -0,0 |щ>

| 10.0 ^ 5.0 0.0

31*40 41-51) 51][старш?

Вотраст. лег

35)1

! 30.0

е. .5.0

1 1

31-40 41-50

Вочрпст. лет

51 п старше

Литва

Италия

¿1 1

Г; Р1 ■ [ |

1 1 \ | '

; И ; ]

51 и старше

?1-Ш 41-50 51псмрше

Вт рас г, .№1_

30.0

Е *

5 211.1)

Е 15.0

ИМ)

■Л 5.0

0.0

Англня

Финляндия

■

31-10 -11-50 51птрше Вочрасг, ЛУ1_

31--10 41-50

Вофаст, лет

1 п старше

Рисунок 7. Уровень противодифтерийных АБ ^А (мкг/мл) в сыворотках крови

взрослых людей

Напряженность противодифтерийного АБ иммунитета в популяции людей

Для оценки напряженности АБ иммунитета в исследуемых коллективах людей был использован метод биометрического распределения биологического признака в популяции. Профили распределения показателей АБ соответствовали бимодальному для контингентов из России, Англии и Италии (рис. 8), то есть у большего количества индивидуумов из этих стран в сыворотках крови содержатся оптимально низкие концентрации АБ \gC¡ (1-й модальный пик распределения), а у небольшого количества лиц - в высоких концентрациях (2-й модальный пик). Профили распределения концентраций АБ ^О в коллективах из Латвии, Финляндии, Литвы не соответствуют бимодальным. Высокие концентрации АБ ^О, характерные для индивидуумов этих стран, распределяются единым массивным пиком, продолжающимся длинным плато высоких и гипервысоких показателей (рис. 8).

Рисунок 8. Профили распределения в популяции показателей концентрации АБ Г§0, содержащихся в сыворотках взрослых 27

Профили распределения показателей концентрации АБ ^М в коллективах из России, Италии, Англии и Финляндии соответствовали бимодальному (рис. 9). Наличие высоких концентраций АБ 1»М в крови лиц в возрасте 31-40 лет из Англии изменяет профиль распределения, смещая показатели 1-го модального пика в сторону концентраций 2-го модального пика. Для взрослых из Латвии и Литвы бимодальные распределения концентраций АБ ^М отсутствуют. Профили распределения высоких концентраций АБ 1«М, содержащихся в

Рисунок 9. Профили распределения в популяции показателей концентрации АБ 1§М, содержащихся в сыворотках взрослых

Бимодальное распределение показателей концентрации АБ ^А в популяциях соответствовало контингентам из Англии и Финляндии (рис. 10). Профиль бимодального распределения совпадал и для коллектива из Латвии, но в 1-й модальный пик с низкими показателями концентраций АБ 1«А охватывал

незначительное количество людей. Следует обратить внимание на высокие по-

казатели концентрации АБ ^А в сыворотках крови из Италии. Бимодальное распределение показателей концентрации АБ ^А для этого контингента отсутствует, концентрации сливаются в сплошное плато высоких показателей.

Бимодальное распределение показателей АБ ^А отсутствует и для кон-

Рисунок 10. Профили распределения в популяции показателей концентрации АБ ^А, содержащихся в сыворотках взрослых

Таким образом, АБ антитела изотипов С, М, А содержатся в сыворотках людей в возрасте от 20 до 51 года и старше в широком диапазоне концентраций, показатели распределения которых в отдельных странах разные, то есть их распределение в популяции не всегда соответствует бимодальному. При этом существующее кооперативное взаимодействие клеток иммунной системы отражается на биосинтезе отдельных изотипов АБ иммуноглобулинов. Так, большие концентрации АБ ^М в сыворотках из Латвии, Литвы, Англии свидетельствуют об усиленной продукции иммуноглобулинов под воздействием АБ

антигенов коринебактерий дифтерии, следствием чего является отсутствие их бимодального распределения в коллективе.

Известно, что в процессе эволюции ^М появились первыми. Они же первыми синтезируются в ответ на антигенную стимуляцию и быстро связываются с бактериальными антигенами. ^С появляются в сыворотке вслед за ^М и вместе с белками системы комплемента вносят существенный вклад в элиминацию возбудителя из макроорганизма.

Функциональная роль АБ подтверждается полученными данными. Так, в сыворотках взрослых лиц из тех стран, в коллективах которых определяется высокая концентрация АБ ^М (Латвия, Литва, Англия) выявляются и высокие концентрации АБ 1§0. Исключение составляют сыворотки от взрослых из Финляндии, где выявленные низкие показатели АБ ^М по-видимому свидетельствуют о незначительном бессимптомной носительстве С. сНрЬШепае, которое не учитывается. Выявление в сыворотках взрослых из Латвии, Англии, Финляндии высоких концентраций АБ сопровождается выявлением в них же низких показателей АБ 1дА. Умеренные концентрации АБ определяемые в сыворотках из Литвы, соответствуют умеренным концентрациям в них же АБ 1§А.

^А играют большую роль в колонизационной и антибактериальной резистентности детского и взрослого организма. Основная функция ^А — предотвращение проникновения бактериальных антигенов, передающимся воздушно-капельным путем с внешней поверхности слизистых оболочек внутрь макроорганизма. Высокие концентрации АБ ^А, выявленные в сыворотках взрослых из Италии, свидетельствуют о высокой устойчивости к адгезии С. сНр^Ьепае.

Таким образом, разработанные иммуноферментные тест-системы позволили углубленно изучить противодифтерийный иммунитет и оценить в абсолютных единицах уровень не только АТ, но и АБ антител в крови людей. При этом высокие концентрации АБ антител компенсируют низкие концентрации АТ антител.

выводы

1. Разработана диагностическая иммуноферментная тест-система для выявления в сыворотках крови людей противодифтерийных АТ антител в абсолютных единицах (мкг/мл), концентрация которых коррелирует с показателями этих же АТ антител, выявляемых с помощью коммерческой тест-системы на основе ИФА в относительных показателях МЕ/мл.

2. Разработана диагностическая иммуноферментная тест-система для выявления в сыворотках крови людей противодифтерийных АБ антител в абсолютных единицах (мкг/мл).

3. В сыворотках крови здоровых взрослых людей в возрасте от 20 до 51 года и старше противодифтерийные АТ антитела с помощью разработанного ИФА определяются в концентрациях от 8,0 ± 1,5 до 384,5 ± 74,0 мкг/мл. Наиболее высокое содержание АТ антител отмечено в сыворотках взрослых людей, проживающих в России и Финляндии, что является отражением проводимой в этих странах ревакцинации взрослого населения, а также в Латвии и Литве, где в период взятия сывороток зафиксированы заболевания дифтерией и носительство возбудителя. В сыворотках взрослых людей из Англии и Италии антитоксин содержался в самых низких концентрациях.

4. Напряженность противодифтерийного АТ иммунитета в популяциях людей из Италии, Англии, Финляндии соответствует нормальному бимодальному распределению концентрации АТ антител: большее количество индивидуумов содержит в крови довольно низкие концентрации антитоксина (1-й модальный пик), а меньшее число людей - более высокие концентрации (2-й модальный пик).

5. В сыворотках крови здоровых взрослых людей содержатся противодифтерийные АБ антитела О, М, А изотипов в концентрациях ГцС - от 19,0±1,8 до 173,2±15,4 мкг/мл, ^М - от 3,1±0,9 до 90,6±12,0 мкг/мл, 1§А - от 3,6±1,0 до 29,2±3,6 мкг/мл соответственно. При этом синтез АБ антител изменяется с возрастом: количество АБ 1£0 и ^М уменьшается, а ^А - увеличивается.

Наибольший уровень АБ содержится в сыворотках крови людей из Латвии и Финляндии, АБ ^М - из Латвии, Литвы, Финляндии, АБ ^А - из Италии, России, Литвы. 6. Распределение АБ 1§М, 1§А антител в популяции взрослых людей из Италии, Англии, Финляндии имеет тенденцию к нормальному бимодальному, что соответствует оптимальной напряженности противодифтерийного АБ иммунитета в популяциях людей из этих стран.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработанная и апробированная иммуноферментная тест-система для определения противодифтерийных АТ антител планируется к производственному коммерческому выпуску на базе ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора, что позволит проводить слежение за поствакцинальным противодифтерийным АТ иммунитетом среди населения в научных, лечебных и профилактических учреждениях здравоохранения (Методические указания, МУ, 3.1.1082-01, 2002 г.).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шмелева Е.А. Экологические и иммунологические аспекты носительства возбудителя дифтерийной инфекции / Шмелева Е.А., Попкова С.М., Парамонова Ю.А., Фирсова Т.Н., Батурина И.Г. // Материалы IV Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», 2-4 июня 2008 г. (г. Санкт-Петербург). - 2008. -. С. 87.

2. Фирсова Т.Н. Разработка тест-системы ИФА для выявления антибактериальных противодифтерийных антител / Фирсова Т.Н., Шмелева Е.А., Новикова Л.И., Булыгина Г.С. // Тезисы материалов научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Биологическая безопасность в современном мире» 21-22 апреля 2009 г. (г. Оболенск, Московская область). - 2009. - С. 145-147.

3. Шмелева Е.А. Содержание антитоксических противодифтерийных антител в сыворотках взрослых людей из разных регионов Европы. Сообщение 1 / Шмелева Е.А., Фирсова Т.Н., Булыгина Г.С. и др. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. -2009. - №4. - С. 49-56.

4. Шмелева Е.А. Антибактериальные противодифтерийные антитела в сыворотках крови взрослых людей. Сообщение 2 / Шмелева Е.А., Фирсова Т.Н., Булыгина Г.С. и др. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2009. - №5. - С. 66-75.

5. Фирсова Т.Н. Использование ИФА для диагностики противодифтерийных антитоксических и антибактериальных антител / Фирсова Т.Н., Шмелева Е.А., Парамонова Ю.А., Булыгина Г.С., Новикова Л.И., Батурина И.Г. // Материалы юбилейной Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 90-летию Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Академика И.Н. Блохиной, 15-17 июня 2009 г. (г. Нижний Новгород). - 2009. - С. 197-199.

6. Шмелева Е.А. Оптимальная структура популяционного антитоксического противодифтерийного иммунитета / Шмелева Е.А., Булыгина Г.С., Фирсова Т.Н., С. von Hunolstein, Di Giovine Р., Pinto A., Efstratiou A., Neal S., Vuopio-Varkila J, Lucenko I., Paberza R., Vingre I., Dauksiene S., Kupre-viciene N. // /Материалы международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями, 18-20 мая 2010 г. (г. Санкт-Петербург). - 2010. - С. 84.

7. Фирсова Т.Н. Показатели уровня антитоксических противодифтерийных антител в сыворотках крови здоровых взрослых людей, определенные с помощью двух иммуноферментных тест-систем / Фирсова Т.Н., Булыгина Г.С., Шмелева Е.А. // Эпидемиология и вакцинопрофи-лактика. - 2011. - №3(58). - С. 53-56.

8. Шмелева Е.А. Антитоксические противодифтерийные антитела в сыворотках крови людей / Шмелева Е.А., Фирсова Т.Н., Попкова С.М., Губин М.М. // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - 2012. - № 5 (87), Часть 1. - С. 87-92.

9. Шмелева Е.А. Антитоксические противодифтерийные антитела в сыворотках крови людей / Шмелева Е.А., Фирсова Т.Н., Попкова С.М., Ракова Е. Б., Сердюк Л. В., Губин М.М. // Бюллетень ВосточноСибирского научного центра СО РАМН. - 2012. - №3 (185). - Часть 2. -С. 241-248.

10. Firsova T.N. Development of ELISA for quantitative determination of antibacterial antidiphtheritic antibodies in human blood sera / Firsova T.N., Shmeleva E.A., Baturina I.G., Paramonova Y.A. // Programme and Abstracts Book Second Annual Meeting of Dipnet and Tenth International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria, 5-7 November 2008, (Larnaca, Cyprus). -2008.-P. 49

11. Shmeleva E.A. Anti Corynebacterium diphtheriae antibodies in the sera of healthy adults from European countries / Shmeleva E.A., Firsova T.N., Buligina G.S. at all. // Programme and Abstracts Book Third Annual Meeting of Dipnet and Eleventh International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria, 7-9 October 2009, (Riga, Latvia). - 2009. - P. 26.

Список сокращений

АБ — антибактериальный (-ые)

AT - антитоксический (-ие)

ИФА - иммуноферментный анализ

РПГА - реакция пассивной гемагглютинации

С. diphtheriae tox- - Corynebacterium diphtheriae нетоксигенные

С. diphtheriae tox+ - Corynebacterium diphtheriae токсигенные

у-фракция — гамма-фракция

Подписано в печать: 02.11.2012 Объем: 1,0 п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 683 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фирсова, Татьяна Николаевна

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

Глава 1 Коринебактретии дифтерии и противодифтерийный иммунитет.

1.1. Вид Corynebacterium diphtheriae.

1.2. Дифтерийный токсин и механизм его действия.

1.3. Антитоксический иммунитет и вакцинация.

1.4.Надзор за эпидемическим процессом дифтерии в России и странах Европы.

1.5. Антибактериальный противодифтерийный иммунитет.

1.6. Морфологическая структура клеточных стенок С.diphtheriae.

Глава 2. Антитоксические и антибактериальные противодифтерийные антитела.

2.1. Иммуноглобулины.

2.2. Иммунная реактивность организма.

2.3. Методы определения содержания противодифтерийных антибактериальных и антитоксических антител.

2.3.1. Определение in vivo.

2.3.2. Нейтрализация в культуре клеток.

2.3.3. Реакция пассивной гемагглютинации.

2.3.4. Иммуноферментный анализ.

2.4. Аффинная хроматография как метод выделения антитоксических и антибактериальных противодифтерийных антител.

Глава 3. Материалы и методы исследования.

3.1. Материалы исследования.

3.2. Методы исследования.

3.2.1. Определение специфической активности бактериального антигена.

3.2.2. Диализ.

3.2.3. Аффинная хроматография.

3.2.4. Метод непрямого иммуноферментного анализа.

3.2.5. Расчет количества антител в исследуемых образцах сывороток.

3.2.6. Корреляционный анализ.

3.2.7. Популяционный анализ.

Собственные исследования.

Глава 4. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления противодифтерийных антитоксических антител в абсолютных единицах.

4.1. Получение стандарта противодифтерийных антитоксических антител.

4.1.1. Подготовка колонки к аффинной хроматографии.

4.1.2. Получение гамма-глобулиновой фракции пула сывороток крови здоровых людей.

4.1.3. Нанесение гамма-глобулиновой фракции пула сывороток крови здоровых людей на хроматографическую колонку и элюция антитоксических антител.

4.1.4. Регенерация хроматографической колонки.

4.1.5. Определение с помощью ИФА концентрации противодифтерийных в полученных после аффинной хроматографии фракциях.

4.2. Выбор рабочей концентрации антигена

- дифтерийного анатоксина.

4.3. Определение оптимальной концентрации конъюгатов.

4.4. Определение оптимального разведения образцов и стандарта.

4.5. Определение оптимальных значений рН буферных растворов.

4.6. Определение оптимального температурного режима и времени инкубации.

4.7. Контроль результатов и воспроизводимость метода.

4.8. Чувствительность.

4.9. Сравнение показателей концентрации противодифтерийных антитоксических антител, выявляемых с помощью разработанной и коммерческой иммуноферментных тест-систем.

4.10. Схема проведения ИФА для выявления противодифтерийных антитоксических IgG в сыворотках крови людей.

Глава 5. Определение концентрации противодифтерийных антитоксических антител в сыворотках крови людей с помощью разработанной иммуноферментной тест-системы.

5.1. Выявление противодифтерийных антитоксических IgG в сыворотках крови людей.

5.2. Напряженность противодифтерийного антитоксического иммунитета в популяциях людей.

Глава 6. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления противодифтерийных антибактериальных IgG, IgM, IgA в абсолютных единицах.

6.1. Получение и биохимический контроль бактериального препарата.

6.2. Получение стандарта антибактериальных антител.

6.3. Выбор рабочей концентрации бактериального антигена.

6.4. Определение оптимальной концентрации конъюгатов.

6.5. Определение оптимального разведения образцов и стандарта.

6.6. Определение оптимальных значений рН буферных растворов.

6.7. Подбор оптимального температурного режима и времени инкубации.

6.8. Специфичность.

6.9. Контроль результатов и воспроизводимость метода.

6.10. Чувствительность.

6.11. Схема проведения ИФА для выявления противодифтерийных антибактериальных IgG, IgM, IgA в сыворотках крови людей.

Глава 7. Определение противодифтерийных антибактериальных антител в сыворотках крови людей с помощью разработанной иммуноферментной тест-системы.

7.1. Выявление противодифтерийных антибактериальных

IgG, IgM, IgA в сыворотках крови людей.

7.2. Напряженность противодифтерийного антибактериального иммунитета в популяциях людей.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Противодифтерийные антитоксические и антибактериальные антитела в сыворотках крови людей"

Актуальность проблемы

В настоящее время благодаря широкому охвату населения профилактическими прививками как в России, так и в других странах мира, регистрируются спорадические случаи заболевания дифтерией. Для сохранения эпидемиологического благополучия требуется не только соблюдение правил и схем национальных календарей профилактических прививок, но и постоянный мониторинг за состоянием коллективного противодифтерийного иммунитета [80].

Напряженность антитоксического иммунитета в Российской Федерации определяют с помощью реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) [80]. В мировой практике для определения поствакцинальных антитоксических (AT) антител в сыворотках крови людей используются иммуноферментные тест-системы и реакция нейтрализации в культуре клеток Vero. ИФА характеризует уровень антитоксина в крови в международных единицах МЕ/мл [167].

Вместе с тем антитоксический иммунитет защищает от заболевания дифтерией, но не препятствует свободной циркуляции возбудителя С. diphtheriae tox+ в t к иммунных коллективах, что обуславливает скрытое течение эпидемиологического процесса [118]. Следовательно, антитоксический иммунитет не дает полного представления о противодифтерийной защите, поскольку при этом не учитываются противодифтерийные антибактериальные (АБ) антитела, образующиеся естественным путем в ответ на бактериальные антигены при контакте с циркулирующими коринебактериями дифтерии. В этой связи очевидна необходимость изучения не только антитоксических, но и антибактериальных противодифтерийных антител с помощью современных иммунодиагностических методов [145].

Цель исследования

Выявить и определить количественное содержание противодифтерийных AT IgG и АБ IgG, IgM, IgA в сыворотках крови различных групп людей с помощью иммуноферментных тест-систем.

Задачи исследования

1. Разработать иммуноферментную тест-систему для количественного определения АТ в сыворотках крови людей;

2. Создать иммуноферментную тест-систему для определения АБ ^М, 1§А в абсолютных единицах в сыворотках крови людей;

5. Используя разработанные тест-системы выявить содержание АБ антител изо-типов в, М, А в сыворотках крови людей различных возрастных групп, проживающих в Российской Федерации и других странах Европы;

6. С помощью биометрического анализа показать напряженность АБ противодифтерийного иммунитета в популяциях взрослых людей из Российской Федерации и ряда стран Европы. !

Научная новизна

Впервые разработаны отечественные тест-системы на основе ИФА для выявления противодифтерийных АТ и ^М, 1§А антител к бактериальным антигенам коринебактерий дифтерии в абсолютных единицах.

Показано, что во всех изученных сыворотках крови взрослых людей содержатся противодифтерийные АТ антитела в концентрациях от 8,0 ± 1,5 до 384,5 ± 74,0 мкг/мл и наряду с ними противодифтерийные АБ антитела изотипов в, М, А в концентрациях от 19,0 ± 1,8 до 161,2 ± 19,5 мкг/мл, от 3,1 ±0,9 до 90,6 ± 12,0 мкг/мл и от 3,4± 0,4 до 29,2 ± 3,6 мкг/мл соответственно.

Определено, что с увеличением возраста содержание АТ и АБ антител в, М изотипов уменьшается, а содержание АБ 1§А увеличивается, что подтверждает изменение синтеза иммуноглобулинов этих изотипов в онтогенезе.

Практическая значимость

Разработанные иммуноферментные тест-системы позволяют выявлять в сыворотках крови людей поствакцинальные АТ и образующиеся естественным путем АБ антитела и определять напряженность популяционного противодифтерийного АТ иммунитета, мониторинг которого входит в систему эпиднадзора.

В 2013 году будут проведены лабораторные испытания разработанных тест-систем на основе ИФА.

Внедрение результатов работы в практику

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработанная иммуноферментная тест-система позволяет выявлять концентрацию АТ в абсолютных единицах, которые коррелируют с показателями содержания антитоксина в международных условных единицах МЕ/мл, выявленных с помощью коммерческой тест-системы на основе ИФА.

2. Созданная тест-система на основе ИФА позволяет определять концентрацию образующихся естественным путем АБ антител изотипов в, М, А в сыворотках крови людей в абсолютных единицах.

3. Использование биометрического женность противодифтерийного иммунитета в популяциях людей. анализа дает возможность изучить напря-антитоксического и антибактериального

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Фирсова, Татьяна Николаевна

ВЫВОДЫ

3. В сыворотках крови здоровых взрослых людей в возрасте от 20 до 51 года и старше противодифтерийные АТ антитела с помощью разработанного ИФА определяются в концентрациях от 8,0 ± 1,5 до 384,5 ± 74,0 мкг/мл. Наиболее высокое содержание АТ антител отмечено в сыворотках взрослых людей, проживающих в России и Финляндии, что является отражением проводимой в этих странах ревакцинации взрослого населения, а также в Латвии и Литве, где в период взятия сывороток зафиксированы заболевания дифтери- V ей и носительство возбудителя. В сыворотках взрослых людей из Англии и Италии антитоксин содержался в самых низких концентрациях.

5. В сыворотках крови здоровых взрослых людей содержатся противодифтерийные АБ антитела в, М, А изотипов в концентрациях ^О - от 19,0±1,8 до 173,2±15,4 мкг/мл, ^М - от 3,1±0,9 до 90,6±12,0 мкг/мл, ^А - от 3,6±1,0 до 29,2±3,6 мкг/мл соответственно. При этом синтез АБ антител изменяется с возрастом: количество АБ и 1§М уменьшается, а 1§А - увеличивается. Наибольший уровень АБ содержится в сыворотках крови людей из Латвии и Финляндии, АБ 1§М - из Латвии, Литвы, Финляндии, АБ ^А - из Италии, России, Литвы. 6. Распределение АБ 1ёА антител в популяции взрослых людей из

Италии, Англии, Финляндии имеет тенденцию к нормальному бимодальному, что соответствует оптимальной напряженности противодифтерийного АБ иммунитета в популяциях людей из этих стран.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Вакцинопрофилактика в настоящее время занимает ведущее место в борьбе со многими инфекционными заболеваниями и остается одной из наиболее эффективных и экономичных мер. Для сохранения эпидемиологического благополучия требуется постоянный мониторинг за состоянием противоинфекци-онного иммунитета. Так, для дифтерийной инфекции важным является слежение за поствакцинальным АТ противодифтерийным иммунитетом. Проведение профилактических прививок дифтерийным анатоксином создает АТ иммунитет и спасает от заболевания дифтерией. Вместе с тем в иммунных коллективах продолжается свободная циркуляция С. сИрЫкепае Юх+ и Юх-. Носительство, а, следовательно, и колонизация коринебактериями слизистых носоглотки человека с последующей передачей другому индивидууму являются резервуаром сохранения вида в природе. Единая видовая принадлежность, а также общность антигенов клеточной стенки позволяют считать С. сИрЫкепае и /ох- частью симбионтного микробиоценоза человека. Привнесение гена 1:ох+ в С. сНркгкепае не меняет общей схемы генома микробной клетки. Развитие популяций у; 'и " ^ 1«'>' ¡>, | > " ' ' 1

С. сИрЫкепае контролируется иммунными механизмами и факторами аутоста-билизации в симбионтной системе оказывает лимитирующее воздействие на популяцию возбудителя. Наряду с антитоксином в крови людей определяются и АБ противодифтерийные антитела. Широкий диапазон показателей их концентрации в сыворотках крови является отражением интенсивности стимуляции иммунной системы бактериальными антигенами.

В Российской Федерации основной массив данных о противодифтерийном иммунитете представляют сведения о поствакцинальных АТ антителах, выявляемых в сыворотках крови людей с помощью РПГА. Эффективность иммунопрофилактики населения оценивается по коллективному уровню антитоксина в крови [39, 78, 129, 142, 150]. В то же время, очевидно, что ИФА дает возможность определить более широкий спектр специфических антител различных классов иммуноглобулинов в ответ на искусственную или естественную антигенную стимуляцию.

Поэтому для изучения иопуляционного АТ и АБ противодифтерийного иммунитета нами были разработаны новые тест-системы на основе непрямого ИФА. Выбор этого метода был обусловлен, во-первых, его возможностью количественно и дифференцированно выявлять специфические иммуноглобулины различных классов, во-вторых, относительной простотой и дешевизной данного метода, в-третьих, ИФА в настоящее время является наиболее широко применяемым для выявления иммуноглобулинов как с целью научных исследований, так и в медицинской диагностической практике во всем мире.

С помощью разработанного ИФА в сыворотках крови людей были выявлены поствакцинальные АТ и образующиеся естественным путем АБ ^М, ^А в абсолютных показателях.

Известно, что состояние специфической защиты изучаемой популяции складывается из иммунитета индивидуумов, входящих в ее состав. Генетическая неоднородность людей выражается, в частности, в вариабельности иммунного ответа, то есть разбросе показателей, определяющих коллективный имму-, нитет. Метод популяционного анализа,- использующий биномиальный вариационный ряд «распределения признаков», позволяет увидеть профили количественного распределения индивидуальных показателей в коллективе. Известно, что нормальное распределение любого признака в природе должно соответствовать бимодальному, то есть большее количество людей в популяции обладает оптимальным иммунным ответом на любое антигенное воздействие. Таким образом, у большего процента людей в популяции иммунный ответ должен быть умеренным (1-й модальный пик), а у меньшего процента - показатели концентрации антител должны быть выше оптимальной нормы (2-й модальный пик) [41, 145, 146, 149, 193].

Анализ полученных в работе данных показал, что в сыворотках крови людей, проживающих в РФ и странах Прибалтики выявлены высокие концентрации антитоксических антител в возрасте 20-40 лет, в то время как в таких странах, как Англия и Италия, они выявлялись в гораздо меньших концентрациях, за исключением, Финляндии, где в крови людей этой же возрастной группы содержатся высокие титры антитоксина. Высокие концентрации антитоксина в этих возрастных группах являются отражением проводимой вакцинации взрослых (Россия, Финляндия) и повышенной заболеваемости и носительства в странах Прибалтики (Латвия, Литва). Возрастная динамика снижения концентрации антитоксина в крови взрослых людей от 20 до 51 года и старше объясняется особенностями иммунного ответа в онтогенезе.

Высокие концентрации антитоксина в крови привитых взрослых, также как и у носителей, не препятствуя персистенции возбудителя С. ШрЫкепае Юх+ на поверхности слизистых оболочек, отражают повышенный синтез специфических антител и большую напряженность гуморального специфического иммунного ответа.

Влияние большей доли индивидуумов с гипертитрами антитоксина в крови на иммунную структуру коллектива неблагоприятно. Для таких индивидуумов повышенный синтез АТ антител сопровождается изменением иммунной реактивности, формированием вторичного иммунодефицита и носительством. Увеличение количества носителей повышает плотность циркуляции возбудителя среди населения. В целом, для популяции, где выявлены отклонения от нормального бимодального распределения концентрации АТ антител, изменение ее иммунной структуры сопровождается снижением уровня специфической коллективной защиты.

Анализ данных, полученных с помощью разработанной иммунофермент-ной тест-системы для выявления противодифтерийных АБ антител, показал, что в сыворотках крови людей в возрасте от 20 до 51 года и старше определяются АБ антитела изотипов в, М, А в широком диапазоне концентраций, показатели распределения которых в отдельных странах разные, то есть их распределение в популяции не всегда соответствует бимодальному. При этом существующее кооперативное взаимодействие клеток иммунной системы отражается на биосинтезе отдельных изотипов АБ иммуноглобулинов. Так, большие концентрации АБ 1§М в сыворотках из Латвии, Литвы, Англии свидетельствуют об усиленной продукции макроглобулинов под воздействием АБ антигенов коринебактерий дифтерии, следствием чего является отсутствие их бимодального распределения в коллективе. Известно, что в процессе эволюции ^М появились первыми. Они же первыми синтезируются в ответ на антигенную стимуляцию и быстро связываются с бактериальными антигенами. появляются в сыворотке вслед за ^М и вместе с белками системы комплемента вносят существенный вклад в элиминацию возбудителя из макроорганизма [1, 116]. Функциональная роль АБ подтверждается полученными данными. Так, в сыворотках взрослых лиц из тех стран, в коллективах которых определяется высокая концентрация АБ ^М (Латвия, Литва, Англия) выявляются и высокие концентрации АБ Исключение составляют сыворотки от взрослых из Финляндии, где выявленные низкие показатели АБ 1§М по-видимому свидетельствуют о незначительном бессимптомной носительстве коринебактерий дифтерии, которое не учитывается [20, 26, 29, 49, 117, 202].

В то же время могут подавлять биосинтез иммуноглобулинов М и А путем удаления бактериальных антигенов. Выявление в сыворотках взрослых - из Латвии, Англии, Финляндии высоких концентраций ^О сопровождается вы

1 < * I ' (у > у. И1 3 I явлением в них же низких показателей АБ 1§А. Умеренные концентрации АБ 1§0, определяемые в сыворотках из Литвы, соответствуют умеренным концентрациям в них же АБ ^А.

Иммуноглобулины А играют большую роль в антиколонизационной, антибактериальной резистентности детского и взрослого организма. Основная функция 1§А - предотвращение проникновения бактериальных антигенов с внешней поверхности слизистых оболочек к микроорганизмам, передающимся воздушно-капельным путем. Высокие концентрации АБ ^А, выявленные в сыворотках взрослых из Италии, свидетельствуют о высокой устойчивости к адгезии коринебактерий дифтерии. Низкие концентрации АБ 1§А в сыворотках крови людей, проживающих в северных странах, компенсируются высокими защитными концентрациями АБ [141, 148, 213].

Таким образом, разработанные тест-системы ИФА позволяют выявлять в сыворотках крови людей поствакцинальные АТ и образующиеся естественным путем АБ антитела в абсолютных показателях и следить за напряженностью популяционного противодифтерийного антитоксического и антибактериального иммунитета в системе эпиднадзора.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фирсова, Татьяна Николаевна, Москва

1. Анохин В.А. Эффективность гуморальной специфической защиты при различных клинических формах дифтерии / Анохин В.А., Фаткуллина Г.Р., Сафина H.A., Платонова O.A. и др. // Эпидемиол. и инф. болезни. 2004. -№ 1.-е. 20-23.

2. Аронова Е.А. Иммунитет. Теория, философия, эксперимент: Очерки из истории иммунологии XX века. М.: КомКнига, 2006. - 160 с.

3. Асфандиярова Н.С. Состояние системы иммунитета при дифтерии / Ас-фандиярова Н.С., Чайцев В.Г., Шатров В.В., Гончаренко Л.В., Букина Л .ЯЛ Журн. микробиол. 1998. - № 4. - с. 77 - 80.

4. Аффинная хроматография: Методы. Пер. с англ. / Под ред. Дина. П., Джонсона У., Мидла Ф. М.: Мир, 1988. - 278 с.

5. Басова H.H. Иммунитет населения как объект управления. В кн.: Элементы эпидемиологического надзора. Под ред. В. Ягодинского и И. Рейнарау. Таллин. Валгус, 1987. С. 203 - 220.

6. Безвершенко H.A. Аффинная хроматография // Киев: Наукова думка, 1978. -128 с.

7. Бережная Н.М. Аллергология (словарь-справочник) / Бережная Н.М., Боб-кова Л.П., Петровская И.А., Ялкут С.И. Киев: Наукова думка, 1986. - 716 с.

8. Болотовский В.М. Дифтерия. // В кн. «Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней». М.:Медицина, 1993. с. 196 - 203.

9. Бондаренко В.М. Общий анализ представлений о патогенных и условно патогенных бактериях. // Журн. микробиол. 1997. - № 4. - с. 20 - 26.

10. Бочкова В.А. Антибактериальный иммунитет при дифтерийной инфекции и его роль в патогенезе носительства токсигенных коринебактерий дифтерии: автореф. дис. . д-ра. мед. наук: 03.00.07/Бочкова Валентина Алексеевна-М., 1978.-34 с.

11. Бочкова В.А. Гуморальные показатели антимикробного иммунитета при дифтерии / Бочкова В.А., Мазурова И.К., Филиппова Л.М. // Журн. микробиол. 1971. - № 4. - с. 86 -89.

12. Брэдуэлл А. Антитела. Методы. Книга 2 / Брэдуэлл А., Кэтти Д., Дайне П., Грегори Дж. и др.-М.: Мир, 1991. с. 154 - 164, 172.

13. Бухарин О.В. Проблема персистенции патогенных микроорганизмов // Журнал микробиол. 2006. - №4. - С. 4-8.

14. Вакцинопрофилактика (справочник для врачей) под ред. Таточенко В.К. и Озерецковского H.A. М., 1994. - С. 179.

15. Варламова Е.Ю. Основные представления о структуре, биосинтезе и генетике ИГ человека. // Клиническая онкогематология: рук-во для врачей М., 2001.-С. 86-91.

16. Васенович М.И. Определение содержания дифтерийного антитоксина в гаммаглобулине крови человека с использованием культуры тканей. В кн.: научные основы производства вакцин и сывороток. - М.: Медицина, 1965.-С. 240-244.

17. Васенович М.И. Определение в культуре ткани дифтерийного антитоксина в сыворотках привитых людей / Васенович М.И., Баева Е.А., Сергеева JIM. // Журн. микробиол. 1967. - № 12. - С. 53.

18. Вельтищев Ю.Е. Становление иммунной системы у детей. Иммунная недостаточность. Иммунодиатезы // Рос. вестн. перинатологии и педиатрии. Приложение. М. 1996. - Лекция 17. - № 21.

19. Вертиев Ю.В. Изучение химического рецептора для дифтерийного токсина в клеточных мембранах / Вертиев Ю.В. Езепчук Ю.В. // Бюлл. Экспер. Биол. 1978. - т. 35. - № 5. - С. 549 - 551.

20. Воробьев A.A. Молекулярная биология дифтерийного токсина в связи с проблемой механизма действия токсичных белков / Воробьев A.A., Хав-кин Ю.А. Успехи современной биологии. - 1978. - т. 86. - № 3. - С. 345 -357.

21. Высоцкий В.В. К вопросу о строении поверхностных структур коринебак-терий // Журн. микробиол. 1976. - № 7. - С. 112-119.

22. Газизова Г.Р. Цитотоксическое и антимитотическое действие дифтерийного токсина. / Казань: Мастер-лайн, 2000. 247 с.

23. Гайц Б.М. Вакцинопрофилактика (3 изд.) / Гайц Б.М., Рахманова А.Г. СПб. Литер, 2001.-480 с.

24. Галазка А. Общая иммунология. Иммунологические основы иммуногенеза. Модуль 1. Спб., 1994. - 24 с.

25. Гервазиева В.Б. Иммуноферментный метод количественного анализа IgG-антител к основному белку миелина / Гервазиева В.Б., Воробьева Н.Л., Сверановская В.В. // Иммунология. 2000. - № 2. - С. 52 - 56.

26. Главные факторы, влияющие на результаты, полученные с применением твердофазного ИФА. Di-san Junui daxue xuebao = Acta acad. Med. Tertiae. -2001. 23. - № 7 - P. 871 - 872.

27. Гурвич А.Е. Динамика антителообразования. В сб.: Иммуногенез и клеточная дифференцировка. М.: Наука, 1978. - С. 128 - 158.

28. Далин М.В. Белковые токсины микробов / Далин М.В., Фиш Н.Г. М.: Медицина, 1980.-224 с.

29. Деркач В.В. Особенности иммунного статуса детей с атопическим дерматитом / Деркач В.В. Чиркова Л.Н., Нетесова С.Ю. и др. // Иммунология, им-муногенетика и иммунопатология: Материалы 6-ой отчетной конф. ГУ НИИКИ СО РАМН. 2003. - С. 50 - 52.

30. Дифтерия. Сборник нормативно-методических материалов. М.: Грантъ,1999.-64 с.

31. Дранник Г.Н. Клиническая иммунология и аллергология. М.: МИА, 2003. - 604 с.

32. Езепчук Ю.В. Биомолекулярные основы патогенности бактерий. М.: Наука, 1977.-215 с.

33. Еремина О.Ф. Адаптивный антитоксический иммунный ответ при различных формах дифтерийной инфекции / Еремина О.Ф., Астафьева Н.В., Вен-геров Ю.Я., Ющук Н.Д. // Инфекционные болезни. 2005. - Т. 3. - № 3. - С. 34-36.

34. Заварзин Г.А. Несовместимые признаки в системе родов бактерий // Ж. Общей биологии. 1973. - т. 34. - № 4. - С. 530 - 538.

35. Заварзин Г.А. Фенотипическая систематика бактерий. Пространство логических возможностей. М.: Наука, 1974. - 142 с.

36. Защищенность от дифтерийной инфекции населения Москвы в годы завершения эпидемического подъема. Комитет здравоохранения Москвы. -Информационное письмо № 6. - М. - 2002. - 19 с.

37. Змушко Е.И. Клиническая иммунология / Змушко Е.И., Белозеров Е.С. -Спб.:Питер, 2001. 574 с.

38. Зуева Л.П. Популяционный иммунитет в эпидемическом процессе / Зуева Л.П., Яфаев Р.Х., Сухомлина Г.И., Дездарева Е.В. // Эпидемиол. и вакци-нопроф. 2002. - № 5. - С. 35 - 36.

39. Игнатов П.Е. Иммунитет и инфекция. Возможность управления. М.: Время, 2002.-352 с.

40. Иммунодефицитные состояния. Под ред. проф. Смирнова B.C. и проф. Фрейдлин И.С. С-Пб.: Фолиант, 2000. 568 с.

41. Иммунологические методы под ред. Г. Фримеля. М. Медицина, 1987. С. 216-218.

42. Иммунология инфекционного процесса. (Руководство) / Под ред. В.И. Покровского, С.П. Гордиенко, В.И. Литвинова. М., 1994. - 305 с.

43. Иммунология. Пер. с англ./ Под ред. У. Пола. М.: Мир, 1987 - 1988. Т.1. -476 с.

44. Иммуноферментный анализ./ Нго Т.Т., Ленхофф Г.М., Яклич А. и др. М.: Мир, 1988.-444 с.

45. Караулов A.B. Клиническая иммунология и аллергология // М.: МИА, 2002.

46. Кветная A.C. Адаптационные механизмы формирования бактерионосительства С. diphtheria / Кветная A.C., Иванова С.С., Корженевская Т.Б., Родионова О.В. и др. // Журн. микробиол. 2000. - № 4. - С. 31 - 46.

47. Клиническая иммунология и аллергология / Под ред. Л. Йегера. 2-е изд. -М.: Медицина, 1990. Т. 1. - 526 с.

48. Клиническая иммунология и аллергология. Под ред. A.B. Караулова. М.: МИА, 2002.-651 с.

49. Клиническая иммунология и аллергология. Под ред. Г. Лорора-младшего, Т. Фишера, Д. Адельмана. М.: Практика, 2000. 806 с.

50. Колодкина В.Л. Иммунологическая эффективность одной, двух и трех прививок против дифтерии у взрослых / Колодкина В.Л., Фельдман Э.З., Дро-нина A.M., Титов Л.П., Кожемякин А.К. // Журн. микробиол. 1999. - № 4. -с. 34-38.

51. Комбарова С.Ю. Микробиологический и молекулярно-генетический мониторинг возбудителя дифтерийной инфекции: дис. . д-ра. биол. наук: 03.00.07 / Комбарова Светлана Юрьевна. М., 2007. - 226 с.

52. Кондрашина Н.Н. Белки поверхностной мембраны С. diphtheriae и использование их для выявления антибактериальных антител: автореф. дис. . канд. мед. наук: 03.00.07/ Кондрашина Наталья Николаевна М., 1988. - 19 с.

53. Корженевская Т.Б. Клинико-патогенетические особенности бактери<$коси-тельства.С. diphtheriae tox+ у детей: автореф. дисс. . д-ра мед.,наук. -Спб., 1998.-23 с.

54. Коршунов М.Ф. Дифтерия. Учебное пособие. Воронеж: Изд. Воронеж. Ун-та, 1995.- 176 с.

55. Косенкова Т.В. Особенности формирования иммунитета при первичном комплексе иммунизации АКДС-вакциной / Косенкова Т.В., Федоров Г.Н., Наперсников В.В., Григорьева В.Н. и др. // Журн. микробиол. 2000. - № 3. -С. 55-58.

56. Костюкова H.H. Дифтерийное бактерионосительство (микробиологическое и иммунологическое исследование): автореф. дис. . д-ра мед. наук: 096/ Костюкова Наталья Николаевна М., 1971. - 37 с.

57. Костюкова H.H. Микробиологические факторы, определяющие носитель-ство при капельных инфекциях.// Журн. микробиол. 1997. - № 4. - С. 10 -15.

58. Костюкова H.H. Патогенез дифтерийного бактерионосительства в микробиологическом и иммунологическом аспекте/ Костюкова H.H., Кадырова Х.В., Гукасян JI.A. // Журнал микробиол. 1973. - №2. - С. 135-138.

59. Крылова М.Д. Биологические, генетические, эпидемиологические аспекты дифтерии и нормальная микрофлора человека.// Журн. микробиол. 1985. -№3.-С. 37-45.

60. Крылова М.Д. Дифтерийная инфекция. М. Медицина, 1976. - 214 с.

61. Кузнецова М. Агаммаглобуленемия с повышенным уровнем IgM: клиническая и иммунологическая характеристика / Кузнецова М., Кондратенко И., Оке Г., Фимер А., Эйби М., Эспаньол Т. и др. // Клиническая медицина (Москва). 2000. - 78. - № 9. - С. 72.

62. Кузьменко Л.Г. Патология вакцинального процесса у детей / Кузьменко Л.Г., Тюрин H.A., Овсянников Д.Ю. // Вестник РУДН, серия Медицина. -1999. №2. - С. 40-59.

63. Кулаков A.B. Параметры гуморального антибактериального иммунитета у больных эхинококкозом с постоперационными гнойными осложнениями / Кулаков A.B., Карсонова М.И., Черноусов А.Д. // Иммунология. 2001. -№ 1.-С. 52-54.

64. Кулаков A.B. Особенности антибактериального иммунитета у здоровых и часто и длительно болеющих детей, проживающих в экологически неблагоприятных регионах / Кулаков A.B., Климова C.B., Серков И.Л., Серкова

65. H.A., Карсонова М.И., Черноусов А.Д. // Иммунология. 2000. - № 6. - С. 56-58.

66. Кульберг А.Я. Регуляция иммунного ответа. М.: Медицина. 1986 - С. 37.

67. Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам под. Пер. с англ. / Под ред. Микеша О. М.: Мир, 1982. - ТII. - С.405-442.

68. Ляшенко В.А. Мукозальные вакцины //Иммунология 1997. - № 6. - С. 4-8.

69. Мазурова И.К. Мониторинг возбудителя дифтерийной инфекции / Мазуроч I ' I 1 > | t i I , „ , , ;ва И.К., Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю. и др. // Эпидемиология и вакци-нопроф. -2009. №3. - С. 17-22.

70. Макарова С.И. Выявление противодифтерийных антибактериальных антител с помощью ИФА: автореф. дис. . канд. биол. наук: 03.00.07, 14.00.36 / Макарова Светлана Игоревна М., 2005. - 22 с.

71. Максимова Н.М. Динамика напряженности иммунитета против дифтерии и столбняка при профилактических прививках у детей: дисс. . д-ра мед. наук: 14.00.09, 14.00.36 / Максимова Нина Михайловна М., 1991. - 271с.

72. Максимова Н.М. Дифтерия в России в 2005 2009 годах / Максимова Н.М., Маркина С.С., Яцковский К.А. и др. // Эпидем. и вакцинопроф. - 2010. -№3(52). - С. 31-36.

73. Маркина С.С. Эпидемиологическая ситуация по дифтерии в настоящее время / Маркина С.С., Максимова Н.М., Черкасова В.В. и др. // Вакцинация. Новости вакцинопроф. 2006. - №1(43). - С. 7-11.

74. Маянский А.Н. Патогенетическая микробиология: руководство. Н. Новгород: Издательство Нижегородской государственной медицинской академии, 2006. 520 с.

75. Медуницын Н.В. Вакцинология // М.: Триада-Х, 1999.-272 с.

76. Медуницын Н.В. Лечебные вакцины // Эпидемиол. и вакцинопроф. 2002. -№3-4. - С.25-27.

77. Наркевич М.И. Особенности распространения дифтерии в России на фоне массовой иммунизации детей / Наркевич М.И., Тымчаковская И.М. // Журн. микробиол. 1996. - № 2. - С. 25 - 29.

78. Никитюк Н.Ф. Иммунитет к дифтерии у взрослого населения Оренбургской области // Журн. микробиол. 2001. - № 3. - С. 53 - 56.

79. Новиков Д.К. Противобактериальный иммунитет.// Иммунопатол, аллер-гол., инфектол. 2002. - № 2. - С. 7 - 19.

80. Определитель бактерий Берджи. Десятое издание в 2-х томах под редак. Акад. РАН Заварзина Г.А. // М.: Мир, 1977. Т.2. - С. 601-602.

81. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985.-536 с.

82. Остерман JI.A. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука, 1983.-304 с.

83. Оценка развития эпидемического процесса дифтерии в Москве в 2001 -2002 годах и мероприятия по усилению иммунной защиты в очагах дифтерийной инфекции. Методические рекомендации (№ 16). - М. - 2003. - 22 с.

84. Ощук Н.Д. Характеристика субпопуляционного состава лимфоцитов и его клинического значения у бактерионосителей токсигенных С. diphtheria / Ощук Н.Д., Еремина О.Ф., Остроухова М.В., Новикова Т.А. и др. // Журн. микробиол. 1997. - № 6. - С. 61 - 64.

85. Павелкина В.Ф. Дифтерия. Учебное пособие / Павелкина В.Ф., Мамыкина

86. B.М. Саранск: Изд. Морд. Ун-та. - 1999. - 63 с.

87. Першин Б.Б. Вакцинация и местный иммунитет. М.: Медицина, 1980. -232 с.

88. Петров Р.В. Иммунология. Учебник для мед. институтов. - М.: Медицина,1987.-414 с.

89. Петрухин Ю.П. Особенности распределения тканевых HLA-антигенов при дифтерии. Клиническое значение лейкоцитарных антигенов / Петрухин Ю.П., Нелюбых О.В., Максимкина Е.В. и др. Л., 1984. - С. 44-66.

90. Печуркин Н.С. Популяционная микробиология // Новосибирск: Наука, 1979.

91. Плохинский Н.А. Биометрия. Изд. Сибирского отд. АН СССР, 1961. С. 16 -21.

92. Покровский В.И. Приобретенный иммунитет и инфекционный процесс / Покровский В.И., Авербах М.М., Литвинов В.И., Рубцов И.В. М., 1979.1. C. 72-73.

93. Попель И.Р. Гуморальный иммунитет и HLA-фенотипы при дифтерии у взрослых // Автореф. дисс. . канд. мед. наук: 14.00.10. Попель Иван Романович - Спб., 1997. - 16 с.

94. Потемкина Е.Е. Пособие по лабораторной клинической иммунологии с курсом практических занятий / Потемкина Е.Е. Позднякова Р.З., Манукян Л.М. М.: Изд-во РУДН, 2003. - 283 с.

95. Применение иммуноферментного анализа в медицине./ Тезисы докладов респ. Науч. Конф., 28 29 ноября 1989г. - Харьков. - 1989. - 128 с.

96. Прокопенко В.Д. Структура и функции иммунной системы человека: Учебное пособие. М.: изд. РУДН, 2001. - 56 с.1 ;

97. Проскуряков С.Я. Оксид азота в механизмах патогенеза внутриклеточных инфекций / Проскуряков С.Я., Бикетов С.И., Иванников А.И. // Иммунология. 2000.-№ 4. - С. 9 - 20.

98. Рамон Г. 40 лет исследовательской работы / Г. Рамон. М.: Медицина, 1962.

99. Реакция непрямой гемагглютинации. / Отв. Редактор Т.В. Перадзе. Л., 1981.- 125 с.

100. Ройт А. Иммунология / М.: Мир, 2000. 581 с.

101. Ройт А. Основы иммунологии. М., 1996. 328 с.

102. Руденко A.B. Иммуноферментный анализ. 30 лет диагностической практики / Руденко A.B., Кругликов В.Т. // Лаб. диагностика. 1999. - № 3. - С. 11 -20.

103. Румянцев А.Г. IgA дефицит: вопросы клиники и патогенеза / Румянцев А.Г., Зиновьева Н.В., Продеус А.П., Резников Ю.П. и др. // Педиатрия (Россия). 2001. - № 4. - С. 51 - 55.

104. Ш.Румянцев С.Н. Конституциональный иммунитет и его молекулярно-экологические основы. Д.: Наука, 1983. - 210 с.

105. Санитарно-эпидемиологическая ситуация в Российской Федерации в 2002 году.//Эпидемиол. и вакцинопроф. 2003. - № 1 - С. 3.

106. Семенов Б.Ф. Вакцинопрофилактика детских инфекций // Эпидемиол. и вакцинопроф. 2002. - №3-4. - С. 17-21.

107. Сепиашвили Р.И. Основы физиологии иммунной системы. Медицина: Здоровье, 2003.-240 с.

108. Стемпковская Н.И. Естественный ингибирующий фактор активности антител класса М при различных патологических состояниях организма человека / Стемпковская Н.И., Гнеток Т.С., Давыдова Л.И. // Труды Астрах. Гос. Акад. 2000. - № 19 - С. 242 - 245.

109. Стефани Д.В., Вельтищев Ю.Е. Иммунология и иммунопатология детского возраста / Стефани Д.В., Вельтищев Ю.Е. М.: Медицина, 1996. - 382 с.

110. Сухорукова Н.Л. Эпидемиологическая оценка дифтерийной инфекции в условиях высокого уровня противодифтерийного иммунитета: Автореф. дисс. . док. мед. наук: 14.00.30 / Сухорукова Нила Леонтьевна М., 1978. -46 с.

111. Таранов А.Г. Диагностические тест-системы (радиоиммунный и иммуно-ферментный методы диагностики). М.: Издатель Мокеев, 2002 - 288 с.

112. Татишвили Н.И., Меунаргия В.В., Соселия Т.С. Молекулярные и клеточные аспекты иммунологического распознавания / Татишвили Н.И., Меунаргия В.В., Соселия Т.С. Тбилиси: Мецниереба, 1988. - С. 6.

113. Тебякина А.Е. Об антибактериальном иммунитете при дифтерии.// Журн. микробиол. 1939. - № 1. - С. 12 - 14.

114. Томпсон P.A. Последние достижения в клинической иммунологии. // Изд-во Медицина, 1983. С. 418 - 420.

115. Триполитова A.A. О роли антибактериального фактора в иммунитете противодифтерийной инфекции.// Тр. Томского НИИВС, 1955. т. 6. - С. 343 -345.

116. Турьянов М.Х. Дифтерия / Турьянов М.Х., Беляева Н.М., Царегородцев

117. A.Д. и др. М.: Медикас, 1996. - 252 с.

118. Тутов И.К. Характеристика антител, их природа, механизм и место образования (Обзор) // Вест, ветеринарии. 2000. - № 15. - С. 56 - 64.

119. Ундревич C.B. Роль антитоксического и антибактериального факторов в иммунитете при дифтерии. // Проблемы эпидемиологии и иммунологии. — М., 1936. Кн.2. - С. 83-85.

120. Учайкин В.Ф. Вакцинопрофилактика: настоящее и будущее / Учайкин

121. B.Ф., Шамшева О.В Москва: ГЭОСТАР - МЕД, 2001. - 399 с.

122. Фаворова Л.А. Эпидемиологическое значение различных источников инфекции (на модели дифтерии и менингококкового менингита): автореф. дис. д-ра. мед. наук/ Фаворова Лидия Александровна- М., 1967. 28 с.

123. Фаворова Л.А. Дифтерия / Фаворова Л.А., Астафьева Н.В., Корженкова М.П. М.: Медицина, 1988. - 208 с.

124. Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях: Тезисы докладов 14 Рос. науч. Конф., Челябинск, 2000 / Ред. Долгулин И.И. Челябинск: Юж.-Урал. Кн. Изд-во, 2000.-159 с.

125. Фрейдлин И.С., Тотолян A.A. Роль изменений иммунной системы в формировании бронхиальной астмы / Фрейдлин И.С., Тотолян A.A. // Бронхиальная астма СПб: Мед. информ. Агентство, 1996. - С. 54-69.

126. Фримель X., Брок Й. Основы иммунологии / Фримель X., Брок Й. - М.: Медицина, 1986. - 254 с.

127. Фукс И.М. Изучение антибактериального фактора в иммунитете к дифтерии // Дифтерия и коклюш: Сб.тр. МНИИЭМ, 1964. С. 62 - 66.

128. Хаитов P.M. Иммуногенетика и иммунология: резистентность к инфекциям / Хаитов P.M., Манько В.М., Алексеев Л.П. и др. Ташкент: Изд. Ибн Сины.-1991.-454 с.

129. Хаитов P.M. Иммунология / Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. М.: Медицина, 2000. - 429 с.

130. Харсеева Г.Г. Влияние полиоксидония на адгезивные свойства Corynebac-terium diphtheria / Харсеева Г.Г., Москаленко Е.П., Алутина Э.Л., Бревдо А.Н. // Журнал микробиол. 2009. №2. - С. 11-15.1.Ч ' I ^ 1 ' ' ■ , I

131. Хроматография: Практическое приложение метода. Пер. с англ. / Под ред. Хефтмана Э. Москва: Мир, 1986. - Ч. 2. - С. 34-36.

132. Ценёва Г.Я. Дифтерия (рекомендации для врачей) / Ценёва Г.Я., Рыкушин Ю.П., Быстрякова Л.В. СПб.; Хельсинки, 1997. - С. 64.

133. Чередеев А.Н. Характеристика и функциональные свойства субпопуляций лимфоцитов человека // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Иммунология, 1984.-т. 13.-С. 108- 133.

134. Черкасова В.В. Биологические свойства коринебактерий дифтерии, циркулирующих в детском коллективе / Черкасова В.В., Сухорукова Н.Л., Mapкина С.С. Острые детские инфекции: Сб.тр. МНИИЭМ. - М., 1975. - т. 16.-С. 45-49.

135. Чистякова Г.Г. Дифтерия у взрослых. Эпидемиология и вакцинопрофилак-тика: автореф. дис. . канд. мед. наук: 14.00.30/ Чистякова Галина Геннадьевна-М., 2002.-22 с.

136. Шамшева О.В. Национальный календарь профилактических прививок // Детские инфекции. 2007. - Т. 6. - № 2. - С. 3-9.

137. Шмелева Е.А. Биологическая функция антигенов клеточной стенки C.diphtheriae и научно-производственная разработка иммуномодулирую-щего препарата Кодивак: дис. д-ра биол. наук: 03.00.07/ Шмелева Елена Александровна М., 1991.-336 с.

138. Шмелева Е.А. Некоторые показатели иммунитета при дифтерийной инфекции / Шмелева Е.А., Макарова С.И., Корженкова М.П. и др. // Эпиде-миол. и вакцинопроф. 2002. -№3-4. - С. 31-35.

139. Шмелева Е.И. Современный взгляд на старые истины о противодифтерийном иммунитете / Шмелева Е.И., Макарова С.И., Батурина И.Г. // Эпиде-миол. и вакцинопроф. 2003. - № 2(9). - С. 26 - 31.

140. Шмелева Е.А. Влияние неблагоприячтных условий окружающей среды на напряженность противодифтерийного иммунитета / Шмелева Е.А., Литви-ненко Л.Н., Полищук Е.И. и др. // Эпидемиология и вакцинопроф. 2006. -№5(30). - С. 49-52.

141. Шмелева Е.А. Содержание антитоксических противодифтерийных антител в сыворотках крови взрослых людей / Шмелева Е.А., Фирсова Т.Н., Булы-гина Г.С. и др. // Эпидем. и вакцинопроф. 2009. - №4(47). - С.49-56.

142. Эпидемиологический надзор за дифтерийной инфекцией.// Методические указания, МУ, 3.1.1082-01 -М., 2002.-26 с.

143. Ярилин А.А. Основы иммунологии. Учебник. М.: Медицина, 1999. 608 с.

144. Allagapan К. Antibody protection to diphtheria in geriatric patients: need for ED compliance with immunization guidelines / Allagapan K., Rennie W., Kwiat-kovski Th., Narang V.// Ann. Emergency med. 1997. - 30. - № 4. - P. 455 -458.

145. Allagapan K. Immunologic response to tetanus toxoid in geriatric patients / Allagapan K., Rennie W., Narang V., Auerbah C. // Ann. Emergency med. 1997. - 30. - № 4. - P. 459 - 462.

146. Alzari P.M. et al. Three-demensional structure of antibodies// Annu. Rev. Immunol. 1988. - Vol. 6. - P. 555.i

147. Barber C. Le tampon-veronal. Moyen, d'extraction des antigenes bacterieus // Arch. Roum. Pathol. Exp. Microbiol. 1961. - Vol. 20. - N 3. - p. 541 - 542.

148. Barksdale L. Immunobiology of diphtheria // Immunological Hum. Infection. Pt. 1, 1981.-P. 171-199.

149. Barksdale L. Corynebacterium diphtheriae and its relatives // Bacteriol. Rev. -1970.-N. 34.-P. 378-422.

150. Basic Clinical Immunology // Ed. D.P. Stites, A.I. Terr, T.G. Parslow. New York, Appleton Lange, 1994. - 821 p.

151. Cemalettin A Gazi. Development of a diagnostic and screening ELISA system for measuring diphtheria anti-toxin levels // Medical Journal. Vol.13. - 2002. -P.177-186.

152. Christenson B. Granstrom Impact of vaccination campaign on adult immunity to diphtheria / Christenson B., U. Hellsrom, S. Sylvan, L. Henriksson, M. Granstrom //Vaccine. 2000. - 19:9-10. - P. 1133-1140.

153. Clark R. Enzymelinked immunosorbent assay (ELISA). Theoretical and practical aspects. Enzyme-Immunoassay (E.T. Maggio ed.) / Clark R., Engvall E. -Boca raton, Florida, 1981. P. 167 - 179.

154. Collier B.J. Diphtheria toxin: mode of action and structure.// Bact. Reviews. 1975.-V. 15.-N2.-P. 162-174.

155. Cummins C. Studies of the cell wall composition and taxonomy actinomycetales and related group A / Cummins C., Harris H.M. // J. Microbiol. 1958. - V. 18. -P. 173-209.

156. Cummins C. Chemical and antigenic studies on cell walls of Mycobacteria, Corynebacteria and Nocardia // Am. Rev. Resp. Dis. 1965. - V. 92. - P. 63 -72.

157. Di Giovine P. External Quality Assessment for the Determination of Diphtheria Antitoxin in Human Serum / Di Giovine P., Pinto A., von Hunolstein C. et al. // Clinical and Vaccine Immunology. Vol. 17. - No. 8. - 2010. - P. 1282-1290.

158. Dular V. Comparative studies of the in vitro toxin neutralization and the in vitro Vero cell assay methods for use in potency testing of diphtheriae component in combined vaccines toxoids.// Biologicals, 1993. Vol. 21. - P. 53 - 59.

159. ELISA and other solid phase immunoassays: theoretical and practical aspects/ Ed. By D.M. Remenia S.J. Chicheste: WILEY, cop. - 1988. - VIII. - 367 p.

160. Engvall E. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Qantitatie assay for immunoglobulin G / Engvall E. and Perellman P. Immunochemistry, 1971. -V.8.-P. 871.

161. Cox H. Technical and Diagnostic Performance of Five Commercial Anti-Diphtheria Toxoid IgG Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kits / Cox H., Alcock F., Parker A. R. // Clinical and Vaccine Immunology, 2010. P. 1612— 1616.

162. Friedman H. Antibacterial immunity, vaccines and allergy / Friedman H., Szen-tivanyi A. // Allergologie, Jabrgang. № 9. - 1985. - P. 357-363.

163. Frobisher M. Further studies in the immunization of rabbits to toxigenic Corynebacterium diphtheriae by infection of non-toxigenic diphtheria bacilli / Frobisher M., Updyke E. // J. Bacteriol. 1947. - N 54. - P. 609 - 617.

164. Frobisher M. Studies on type-specific protection with somatic antigens of C. diphtheriae / Frobisher M., Parsone E. // Am. J. Hyg. 1950. - № 52. - P. 239 -246.

165. Galazka Artur M. Immunological Basis for Immunization / Module 2: Diphtheria // Global Programme for Vaccines and Immunization Expanded Programme on Immunization // WHO/EPI/GEN/93.12. P. 12.

166. Gaspar A. H. Assembly of Distinct Pilus Structures on the Surface of Corynebacterium diphtheriae / Gaspar A. H. and Hung Ton-That. // Journal of Bacteriology. Vol. 188. - №. 4. - Feb. 2006. - P. 1526-1533.

167. Gill D.M. Observations on the structure of diphtheria toxin / Gill D.M., Dinius L.L. // Journal of Biological Chemistry. Vol. 246. №5. - 1971. - P. 1485-1491.

168. Grabowska K. Evaluation of costprecision rations of different strategies for ELISA measurement of serum antibody levels / Grabowska K., Wang X., Jakob-sson A., Dillner J. // Journal Immunol. Methods. 2002. - 271. - № 1 - 2. - P. 1 - 15.

169. Griffiss J. Biologic function of the serum IgA system: modulation of complement-mediated antigenic mass // Ann. N.Y. Acad. Scien. 1985. - Vol.143. - P. 32.

170. Gupta R.K. Use of in vitro VERO cell assays and ELISA in the USA potency test of vaccines containing adsorbed diphtheria and tetanus toxoids / Gupta R.K., Siber G.R. //Dev. Biol. Stand 1996.- Vol. 86.- P. 207-215.

171. Hardy RB. Diphtheria. Bacterial Infections of Humans // Epidemiology and Control.-1998.-P. 253-267.

172. Herbert W.J. Passive gemagglutination with special reference to tanned cell technique.// In: Handbook of experimental immunology / Ed. D.W. Weir. Vol. 1. - chap. 20. - Oxford: Blackwell scientific publications, 1973.

173. Holdsworth E.S. The nature of the cell wall of Corynebacterium diphtheriae. Isolation of an oligosaccharide // Biochem. Biophys. Acta. 1952. - Vol. 9. - P. 19-21.

174. Hoyer L.W. The significance of erythrocytes antigen syte density / Hoyer L.W., Trabolt N.C. // J. Clin. Invest. 1970. - Vol. 49. - P. 87 - 95.

175. Hu V.W. Evidence for direct insertion of fragments A and B of diphtheriae toxin into model membrances / Hu V.W., Holmer R.C. // J. Biol. Chem. 1984. - Vol. 259.-№ 19.-P. 12226- 12233.

176. Hunter W.M. Imunoassay / Hunter W.M., Corrie J Edinburgh: Churchill Leving-tone, 1983.-572 p.

177. Ishikawa E. Enzyme Immunoassay // Tokyo N.Y.: Igaku-Shoin, 1981. - 281p.

178. John T. Jacob Herd immunity and herd effect: new insights and definitions / John T. Jacob, Samuel Reuben. // Eur. J. Epidemiol. 2000. - 16. - № 7. - P. 601 -606.

179. Kalapothaki V. Prevalence of diphtheria carries in a population with dissapear-ing clinical diphtheria / Kalapothaki V., Sapounas T., Xirouchaki E. et al // Infection. -1984. -Vol 12. № 6. - P.33-35.

180. Karakus R. Evaluation of human antibody responses to diphtheria toxin subunits A and B in various age groups / Karakus R., Caglar K., Aybay C. // Journal of Clinical Microbiology and Infection. Vol. 13.-№ 11.-2007.-P. 1065-1071.

181. Karalnik B.V. Immuno-ecologic aspects of vaccination and a problem of rehabilitation / Karalnik B.V., Markova S.G., Denisova T.G., Savchenko E.Ya. // Int. J. Immunorehabil. 2000. - 2. - № 3. - P. 130 - 131.

182. Katial R. Cell mediated immune response to tuberculosis purified protein derivative: Comparition of TB skin testing to in vitro g-interferon production / Katial R., Hershey J., Purohit T. // J. Allergy and Clin. Immunol. 2000. - № 1. - P. 305.

183. Kristiansen M. Improved ELISA for determination of anti-diphtheria and/or anti-tetanus antitoxin antibodies in sera / Kristiansen M., Aggerbeck H., Heron I. // APMIS. 1999. - Nov 105. - P. 843 - 853.

184. Kuchenbauer T. Antibodies of the pentapeptide subunit of peptidoglican in human sera / Kuchenbauer T., Tympner K.D. // Biologicals properties of pepti-doglycan. Berlin - New-York. - 1986.

185. Lautrop H. Studies on antigenic structure of Corynebacterium diphtheriae // Acta Pathol. Microbiol. Scand. 1950. -N 27. - P. 443 - 447.

186. Lock R.J. Immunoglobulins and Ig subclasses in the elderly / Lock R.J., Un-sworth D.J. // Ann. Clin. Biochem. 2003. - 40, № 2. - P. 143 - 148.

187. Lucenko I. Diphtheria in Latvia 2002-2008: status and epidemiological trends / Lucenko I., Perevoscikovs J., Kantsone L. et al. // Programme and Abstracts Book. Second Annual Meeting of Dipnet &Tenth International Meeting of the

188. European Laboratory Working Group on Diphtheria. Larnaca, Cyprus. - 5-7 November, 2008. - P. 30.

189. Massa J. Serum titers of IgG antibodies against tetanus and diphtheria toxoids and risk of multiple sclerosis / Massa J., Munger K.L., O'Reilly E.J., Levin L.I., Ascherio A. // J Neuroimmunol. 208(1-2). 2009 March 31. - P. 141-142.

190. Martinetti L.M. Rapid detection of diphtheriae toxin by the polymerase chain reaction / Martinetti L.M., Gruner E., Altwegg M. // Med. Microbiol, lett. 1992. -vol. l.-P. 276-283.

191. Multon RJ. The bacterial cell wall structure and function // The Target of Penicillin, 1988.-P. 3-8.

192. Nicolay U. Diphtherie-Antitoxik Spiegel zwei jähre nach auffrischimpfung / Nicolay U., Girgsdies O.E., Banzhoff A. et al. // Wien. Med. Wochenschr. -2000. - 150. - № 22. - P. 435 - 439.

193. Nielsen P. Double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for rapid detection of toxin-producing Corynebacterium diphtheriae / Nielsen P., Koch C., Friis H. et al. // Journal of Clinical Microbiology. Vol. 25. - № 7. -1987. - P. 1280-1284.

194. Nossal G.J. Kinetics of antibody formation and regulatory aspects of immunity.- Acta endocrinol., 1975. v. 78. - Suppl. N 194. - P. 96 - 110.

195. Pappenheimer A.M. Diphtheria toxin.//Ann. Rev. Biochem., 1977. vol. 46. -P. 69 - 94.

196. Pappenheimer A.M. Studies on the molecular epidemiology of diphtheria / Pappenheimer A.M., Murphy I.R. // The lancet. 1983. - Vol. 10. - P. 923 - 926.

197. Portsmann T. Entwicklung eines Doppel-Sandwich-Enzymimmunoassays zum quantitative Nachweis von HbsAg (1. Mitteilung), Dt. Gesung 1980. - Vol. 35. -P. 598-600.

198. Raza S.A. Diphtheria in an Adult: How Well Prepared Are We in Tackling the Disease? A Case Report / Raza S.A., Nagalotimath U., Achar K. // Indian J Otolaryngol Head Neck Surg. 63(3). - July-September 2011. - P. 289-291.

199. Rees B.W.G. An automated method for the coated red cell hemmagglutination technique.// Med. Lab. Techn. 1973. - Vol. 30. - P. 167 - 177.

200. Robinson D. The serological types amongst gravis strains of Corynebacterium diphtheriae and their distribution / Robinson D., Pseney A. // J. Pathol. Bacteriol.- 1936.-Vol. 43.-P. 403-418.

201. Shelly M. Low baseline antibody level to diphtheria is associated with poor response to conjugated pneumococcal vaccine in adults / Shelly M., Pichichero M., Treanor J. // Scand. J. Infec. Diseases. 2001. - 33. - № 7. - P. 542 - 544.

202. V. Skogen. Detection of diphtheria antitoxin by four different methods // Clin. Microbiol. Infect. 1999. - №5. - P. 623 - 633.

203. The shorter Bergey's manual of determinative Bacteriology. Eighth Edition Yohn G. Holt. The Wolliams and Wilkins Company // Baltimore, 1975.

204. Tomasi T.B. Human Secretory IgA / Tomasi T.B., Kand Y.S., Galvanico N. // Feder. Proc. 1968. - vol. 27. - P. 617.

205. Underdown B.J. Immunoglobulin A: strategic defence initiative at the mucosalsurface / Underdown B.J., Schiff J.M. // Annu. Rev. Immunol. 1986. - Vol. 4. -P. 389.

206. Vasques-Rosales J.G. Comparision of five methods for the detection of measles specific immunoglobulin G antibody / Vasques-Rosales J.G., Solorsano-Santos F., Bustamante-Calvillo M.E. // Rev. Latinoamer. Microbiol. 1996. - 38. № 3 -4.-P. 167- 175.

207. Vitek C.R. Epidemiology of epidemic diphtheria in three regions, Russia, 1994 -1996 / Vitek C.R., Brisgalov S.P., Bragina V.Y., Zhilyakov A.M. // Eur. J. Epidemiol.- 15. № 1.- 1999.-P. 75-83.

208. Volzke H. Susceptibility to diphtheria in adults: prevalence and relationship to gender and social variables / Volzke H., Kloker K.M., Kramer A. et al // Journal of Clinical Microbiology and Infection. 2006. - Vol. 12. - № 10. - P. 961-967.

209. Wagner K.S. Diphtheria in the Postepidemic Period, Europe, 2000-2009 / Wagner K.S., White J.M., Lucenko I. et al. // Emerging Infectious Diseases. 2012. -Vol. 18.-No. 2.-P. 217-225.

210. Walory J. Comparison of four serological methods for the detection of diphtheria anti-toxin antibody / Walory J., Grzesiowski P., Hriniewicz W. // J. Immunol Methods. 2000 Nov. - 1 245. - 1-2. - P. 55-65.

211. World Health Organization. Immunization Summary: A statistical reference containing data through 2010. Электронный ресурс. // Сайт ВОЗ. Режим доступа: http://www.childinfo.org/files/immunizationsummaryen.pdf.

212. World Health Organization. Immunization surveillance, assessment and monitoring. Электронный ресурс. // Сайт ВОЗ. Режим доступа: http://www.who.int/immunizationmonitoring/diseases/diphteria/en/index.html.

213. Yamaizumi М. One molecule of diphtheriae toxin fragment A introduced into a cell can kill the cell / Yamaizumi M., Mekada E., Ushida T. // Ctll. 1978. -Vol. 15.-P. 245-250.

214. Jung-Hyun C. Immunogenicity and Safety of Diphtheria-tetanus Vaccine / Jung-Hyun C., Eun Ju C., Aejung H., Su-Mi Choi et al // J Korean Med Sci. №25. -2010.-P. 1727-1732.

Информация о работе

Фирсова, Татьяна Николаевна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.02.03

Диссертация

Противодифтерийные антитоксические и антибактериальные антитела в сыворотках крови людей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы