Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протективное и диагностическое значение антигенов иерсинии псевдотуберкулеза

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Протективное и диагностическое значение антигенов иерсинии псевдотуберкулеза"

Р Г 6 од

Г- А ПО РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК 2 Э АIIГ ¡994НАЭТНО-ИССЖДОВАТЕЛЬСКЙИ ЙНСТУПУХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ

на правах рукописи

ВОСКРЕСЕНСКАЯ Екатерина А-таксандровна

ПР01ЕКТИВН0Е И ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ АНТИГЕНОВ ИЕРСИНЩ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА

□3.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1994

/

Работа выполнена о Санкт-Петербургском научио-исследо-вательском институте эпидемиологии и микробиологии имени Пастера.

Научный руководитель.* доктор медицинских наук, член—корреспондент Петровской Академии наук и искусств Г-Я.ЦЕНЕВА

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Н.А.ЗАИКИНА доктор медицинских наук, профессор Б. Н.КОЗЬМИН-СОХОЛОВ

Ведущее учреждение — Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток Министерства здравоохранения Рф.

Защита состоится 16 мая 1994 г. в 13 часов на заседании специализированного совета Д. 001.23.02 при научно—исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН С197376, г.Санкт-Петербург, ул. академика Павлова, 12>

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ РАМН.

Аь «'ореферат разослан 16 д~Пр(?Л9. 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

Л.А.БУРОВА

Актуальность проблемы

В настоящее время псевдотуберкулйз продолжает оставаться серьёзной проблемой здравоохранения. Для этой инфокции характерна эпидемическая заболеваемость, регистрировавшаяся ранее с большой частотой в организованных детских коллективах. В последние года имеет место тенденция к большему вовлечению в эпидемический продесс взрослых (военные контингента, профтехучилища и т.д.) на Фоне утяжеления клинического течения болезни.

В этой связи актуально проведение исследовании, направленных на разработку новых профилактических препаратов для защиты от инфекции. Сейчас заметно возросло внимание исследователей к поиску кандидатов для приготовления псевдотубер-кулезноа вакцины и изучению иммунологической дарестройки организма, обусловленной введением протективных антигенов (Дзадзиева М.Ф., 1981; Тимченко Н.Ф. и созпт., 1990; Быст-рова А.Н., 1991; Борисова В.Н. и соавт.,1991; Кузнецова Т.Д. и соавт., 1991).

В последние годы были получены активные антигены Virginia pseudotuberculosis с различными иммунохимическими характеристиками - высокомолекулярная Фракция липополисахарида, белки наружной мембраны, аттенуированныя бесшгазмидяый мутант (Ценева Г.Я. , 1986; Тимченко Н.Ф. и соавт., 1990;

Isberg Я.П. et „1., 19В7; . Rosqvist R. et al., 1988; Forsberg A. Et al., 1991) -.значение КОТОрЫХ ДЛЯ ИММуНОПрОФИлактики, а также для диагностических целей, изучено недостаточно .

Изложенное определило необходимость комплексной оцзнки активных антигенов иерсиний, направленной на выбор эффективных препаратов, западающих макроорганизм от псевдотуберкулезной инфекции и перспективных для создания новых диагностических препаратов.

Цель исследования - ОХЭрЗКТерИЗОВЭТЬ ИММУНОГвННЫв И

протективные свойства антигенов v.pseudotuberculosis; оценить Эффективность их применения для зашиты от ШФвкции и создания диагностических препаратов.

Задачи исследования:

1. Получение активных антигенов У.р5еис1ои|Ьегси1о51В для защиты от развития инфекции.

2. Оценка протективных свойств антигенов с различной иммунохимической характеристикой на модели экспериментальной инфекции.

3. Определение протективноа активности антигенов при сочетакком их применении.

4. Оценка эффективности применения антигенов у.рвеиао-1иьвгси1с№1а с диагностическими цзлями.

Положения, выносимые на защиту:

1. В результате сравнительного испытания протективных свойств корпускулярного (аттенуированный мутант) и субьеда-ничного ( высокомолекулярная фракция липополисахарида -ВМФ ЛПС) антигенов показано, что антигены, преимущественно содержащие липополисахарццныа комплекс, недостаточно эффективно защищали организм экспериментальных животных от инвазии возбудителя и не препятствовали его диссеминации в органы и ткани.

2. Сочотанное применение высокомолекулярной Фракции липополисахарида и белков наружной мембраны <БНМ) обеспечивало наиболее выраженную защиту организма животных от заражения высоковирулвнтным.цггаммом у.рбвис1а1иЫггси1о&1£, обусловленную активизацией факторов как клеточного, так и гуморального иммунитета, а также Факторов неспецифичоской резистентности.

3. Для оптимизации технологии получения иммунодиагнос-тических препаратов делесообразно использование ВМФ ЛПС у.рбеис)о1иЬегси1а*1.в. Её строгая специфичность и выраженная активность обусловливают терсгюктиву Эффективного использования ВМФ ЛПО для получения как антигенных < эритроцитарныа диагностику»), так и иммуноглобулиновых < тест-системы ) препаратов.

Научная новизна и теоретическая значимость

Впервые проведено комплексное изучение иммуногенных и

протективных свойств оригинальных антигенов y.pseudotuberculosis: генетического 2-х маркерного рэкомбинантэ, утратизше-го вирулентность < авторское свидетельство n 1786675 от в октября 1992 г.), ВМФ ЛПС И БНМ.

На основе микробиолого-морФологического изучения взаимодействия антигенов иерсиниа с макроорганизмо.ч на модели экспериментальных животных охарактеризованы протективные свойства изученных антигенов;определена динамика Формирования иммунного ответа; показано значение клеточных факторов иммунитета в защите иммунных животных от заражения высоковирулентным штаммом Y.pseudotuberculosis.

С учетом биологических особенностей Y.pseudotuberculosis предложен комплекс антигенов (ВМФ ЛПС и БШ>, создающий у экспериментальных животных выраженную защиту от инфекции.

Обосновано преимущество использования ВМФ ЛПС в технологии получения строго специфичных и активных гиперимунных сывороток пэрэд другими образцами антигенов. Эта сыворотки и их Фракции могут служить сенсигшом для конструирования различных имяунодиагностических препаратов.

Показана эффективность использования ВМФ ЛПС при получении антигенного эритроцэтаряого диэгностикума, превосходящего по чувствительности и специфичности аналогичный зриг-роципгарньй коммерческий диагностикум.разрабопгании на основа антигена y.pseudotuberculosis, полученного по Вестфала.

Практическая значимость

Оптимизирована технология получения псевдатуберкулззпса ЕКмуноФермс тгноя тест-системы в результате использования высокоспецифичного антигена (ВМФ ЛПС). Показана строгая специфичность и высокая чувствительность препарата.

Разработанная тест-система успешо прозла Государственные испытания. Утверждены ВфС < м 42-354-ВС-92) и ЭПР (n 389-92), даны показания к ее привэнэнст в практике, осукэствляется серианыа выпуск.

Оригинальная схема иммунизация комплексом активных антигенов (НЧФ ЛПС и БНМ) с различными гавдунохимическими характеристиками, позволяющая получить гишриммунныэ сыворотки с высоким титром специфических антител, рекомендована

- в -

для использования в технологии получения новых псевдотубер-кулазных диагностических препаратов.

Полученные характеристики безвредности, протективноа активности комплекса антигенов (ВМФ ЛПС и БНМ) v.pseudotuberculosis на Фоне выраженного специфического иммунитета позволяют рассматривать его как шрспвктивный в качестве вакцинного варианта.

Апробация РАБОТУ

Материалы диссертации доложены на международной конференции "Медицинская биотехнология, иммунология и СПИД" (Санкт-Петербург,1991г.>s на заседании Санкт-Петербургского научного общества микробиологов и эпидемиологов ( 1892 г.); на юбилейной конференции к 70-летив института имени Пастера "Актуальные проблемы инфекционной патологии" ( 1933 г.).

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ} получено авторское свидетельство.

Структура и объем работы

Материалы диссертации изложены на (56 страницах машинописи. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 20 рисунками. Диссертация построена по традиционному плану и состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследовании, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 127 отечественных и 88 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штаммы, ттодй культнйировшмя. Получение антигенов

В исследованиях было использовано 4 штамма y.pseudotuberculosis i серологического варианта. В качестве живого корпускулярного антигена при иммунизации морских свинок применен ВЕгаммм n 623 kv 0/2, полученные аттенуациэй высоковирулентяо-го штамма м 623. Аттенуированный штамм представляет собой 2-х маркерный мутант, несущий маркеры устойчивости к генцианвио-

лету (измененный синтез белков наружной мембраны) и палщщк-совоа кислоте(измененный синтез ДНК-гиразы).Штамм 623 «V 9/2, в отличие от родительского, утратил плазмиду 45 ВД, контролирующую кальциаззвдсимость бактерий при роста иг на магниевооксзлатаой среда при 37°С и синтез некоторых белков наружной мембраны, в том число «т-антигенов*. Ранее на комплекса биологических моделей (культура клеток НЕр-2, парентеральное заражение белых мышей дозой микробных клеток (м.к.), конъгоктивальнов заражение морских свинок дозой 109 м.к.) было показано, что аттенуирсванвыа мутант является безвредным для животных. В хода настояаэго исследования при эн-теральном заражении морских свияок еггзммом 623 ку э/2 (доза Зхю9 м.к.) установлено, что данный пггамм нэ вызывает псевдо-туборкулэзный инФвкщшкный процесс, а лишь обладает минимальной остаточной вирулентностью, сохраняя при этом иммунологическую активность. Это явилось основанием для последующего изучения его протективных свойств, йгамм у.раеийоыьегсшо^в I серовара N 623 ку 9/2 сзшнкрован в коллекция музея живых культур Государственного НИИСК медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасовича ¡.О И. На пего получено авторское свидетельство n 1786675 огг 8.10.1092 г.

Для получения протективЕыз антигенов ШФ ЛПС и БНМ использовали высокошрулентныэ атати у.рввийо1иьегси1ов1в: м 623,изолированный от больного в ходе вспышки в С.-Петербурге и н 2160, изолированный из органов полевой мыши сотрудниками Северо-Западной Противочумной станции. Для зарашния иммунных животных использовали •высоковирулаптвый штамм N 626, изолированный от, больного тяяэлой Формой псевдотуберкулвза.

Штаммы 623, 626, 2160, 623 0/2 использовали посла ли-офилизадаи при условиях, сохраняющих характеристику э-чюрмы. Для получения микробной массы однородные колонии э-Формы засевали в бульон Хотпшгера в пробирках. Посевы инкубировали щзи 22 или 37°С 24 часа. Затем выросшую бульонную культуру засевали на скошенную поверхность агара Хотпшгера в матрацах и выращивали в тех да условиях 48 часов. Посевы смывали

* Исследования проведаны в НИШ им.Н.Ф.Гамалеи совместно с Вик.М.Бондареико и Вл.Н.Бондарвнко

Физиологическим раствором, отмывали от питательной среда 3-кратно при 6000 об/мин по 30 мин. Осадок бактериальных клеток являлся исходной бактериальной массой для получения ЛПС, а в дальнейшем, ВМФ ЛПС, и БНМ.

Высокомолекулярную Фракцию выделяли из ЛПС, полученного по методу Грассе, в результате 6-10-кратного замораживания (-70°С)-оттаивания бактериальной массы. Полученную взвесь центрифугировали при 5000 об/мин 30 мин. Надосадок центрифугировали <*4°С) при 18000 об/мин 40 мин и затем дуализировали. Полученный ЛПС в растворе кондантрировали 8в° этанолом.

Аналитическое Фракционирование препаратов ЛПС проводили путем гельфильтрации на колонках сефарозы 2В (Pharmacie), отбирая пробы по 3-4 мл, в каждой из которых определяли поглощение при >. =205. По полученным данным (ve и d^q^) строили кривые фракционирования. При этом ВМФ ЛПС содержалась во фракциях i пика, выходящзго сразу за свободным объемом элюции*.

При получении БНМ микробные клетки первоначально переводили в сферопласты под действием ' лизоцима в присутствии ЭДТА по методике и.овьогп и R.riunson (1974), Лизирование полученных сфероплаотов осуществляли ультразвуком на дезинтеграторе Фирмы "use" (Англия) мощностью 40 Вт при сила тока 1 А в течение 10 мин. Последующее получение наружных мембран и выделение из НИХ БШ осуществляли ПО методу K.Bchnaituan (1083).

Экспериментальные модели

В опытах иммунизации на 460 морских свивках массой 200 -260 г и 38 кроликах массой 2,0 - 2,5 кг изучены упомянутыэ выше образцы антигенов с применением схем иммунизации,известных ранее или оригинальных. Всего было получено и изучено 12 серий различных антигенов.

По окончании срока иммунизации морским свинкам внутри»-лудочво о помощь» зонда вводами по 3x10® м.к./мл 2-х суточной

* Исследования провалены в научно-иссдадовательском нейрохирургическом институте им. А.Л.Подэнова совместно

о Васильевой Т.Г.

культуры высоковирулентаого штамма у.р№иасЛиь«>гси1о-»15 N 626. Контролем служили животные, зараженные той ш дозой пггамма N 628.

Опытных и-контрольных животных исследовали в динамике инфекционного процзсса на 3, 6, 9, 15 и 21 сутки. Генерализацию инфекции определяли по результатам количественных посевов гомогеяатов печени, селезенки, почек, мезентериального лимфоузла и тонкого кишечника по методике Г.А.Авдеевой (1964) в модификации Г.Я.Пановой и соавт. (1988). Одновременно в указанные сроки вскрытая у всех животных исследовали показателя иммунитета в крови, тимусе, селезенке и подчелюстном лимфоузле; параллельно аналогичные показатели определяли у кнтактных морских свинок.

Диагностические методы

Бактериологическим методом исследовали гомогенаты органов морских свинок, приготовдэнныз в асептических условиях. Предварительно взвепенныэ кусочки органов растирали в фарфоровой ступкз (с добавлением 1,0 мл Физиологического раствора) до гомогенного состояния. 0,1 мл гомогената переносили на чажу Штри со средой Серова гаи средой. с бромтимоловым синим (СБТС) (Дятлов Ф.Г. и соавт., 1991) и растирали шпателей по поверхности агара, засевая та каздоа пробы материала 4 чашки Пзтра. Посэеы инкубировали при температуре 22°С в течение 48 часов. Выросши колонии дифференцировали визуально и в реакции агглютинации на стекле с помощью псевдотуберяулазного коагглятинируиздго диэгностакума (производственные серии препарата НИШ та. Н.Ф.Гамалеи) или моновэлэнтных агглютинирующих сывороток ( производственные серии препарата НИИЭМ им. . Пастера ), производили подсчет выросших колоша и определяли концентрацию возбудителя в 1 г исследуемого органа.

Исследование покззателва клеточного, гуморального иммунитета, неспэвдФИческой резистентности организма включало:

- определение процентного содерхания Т-лимфоцитов в ткмусе, селезенке, подчелюстном лгаиюуала в реакции розаткообразова-ния с эритроцитами кролика (Е-РОК) по методу м.лопйа! и со-

авт. (1972>;

- определение прошнтного содержания В-лимфоцитов в реакции розеткообразования с ЕАС-комплексом (ЕАС-РОК) по методу С.Bianco и соавт. (1970)!

- определение индекса торможения миграции лейкоцитов периферической крови в реакции торможения миграции лейкоцитов (РШЛ) с кошсанавалинам-А (Кон-А) по методу А.Г.Аргоновой (1973);

- определение Фагоцитарной активности полиморФноядерных лейкоцитов крови (ПМЯЛ) ПО методу T.Stossel (1977);

- определение активности кислородаезависимых микробицидвых систем ПМЯЛ в лизосомально-катионном тесте (ЛК1) по методу В.Е.Пигаревского (1975);

- определение специфических антител в сыворотке крови в реакции агглютинации (РА) с типовыми культурами y.pseudotuberculosis i серологического варианта по общепринятой методике.

Для гистологических исследований* печени, селезенки, ме-зентериальных лимфоузлов, тонкой, слепой и повздрошой кишок использовали срезы материала. Фиксированного 10% Формалином или жидкостью Бузна и залитого в парафин. Парафиновые срезы (3-5 мкм) окрашивали азур-эозином или по Леишману и Романовскому -Гимза. Препараты изучали также методам прямой и непрямой иммунофлуоресценции (Coons a,, I9sa).

Получение иммунодиагностических препаратов

При разработке технологии изготовления иммунодиагности-ческих препаратов были использованы гишриммунные антисыворотки к перечисленным антигенам v.pseudotuberculosis i серологического варианта, подученные в результате применения различных схем иммунизации.

При изготовлении лабораторных серий антигенного эригроцитарного деагностикума" а!фолэинизированвыв (Носков 4>.С. И C08BT., 1970), тонизированные (Boyden S., 1953) эритроциты барана сенсибилизировали препаратами ВМФ ЛПС в

* Исследования проведены в НИИЭМ им. Пастера совместно о

Ефремовым В.Е. и ** Барашковой Л.Н.

различных концентрациях. Оптимальная концентрация составила 0,500 мг/мл.

При создании иммуноФерментной тест-системы специфические пвроксидазные конъюгаты получали методом перйодатного окисления (маклпе р., 1966) на основе 1дм-Фракций, выделенных из антисывороток к ВМФ ЛПС, и гороксдцазы хрена (пг>з,о).

Статистическую обработку ЭКСПОрИМеПТаЛЬЕЫХ ДЗННЫХ проводили в соответствии с правилами вариационной статистики, определяя величины средней арифметической,среднего квадратичного отклонения, стандартной ошибки средней величины ( Урбах В.КЗ., 1975). Достоверность разности средних величин оценивали по критерию 1 Стыодента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Характеристика взаимодействия вирулентного штамма с организмом экспериментальных.

животных

При оцэнко роли различных вариантов антигенов у.рввийо»иьегси1оз1» в защгге от развития кзсекщш важное значение придавали характеристика Еысоковирулзнтного втажяа, используеиого для заражения иммунизированных кивотшх. Из лабораторной коллэкцщ птагков У.р®еис!оыь®гсо1ов1в г свровара, обладающих наиболее выраженной вирулентностью, бая выбран штамм N 828 и изучен в предварительных мытах ентерального заражения морских свинок.

При заражении эксгориаэвтальных животных керсиниями в доге ЗхЮ9 и.к. отмечали закономерное развили генерализованной инФвнкпии с выраженным воспалением в кишечника п прогрессирующими изменениями в паранхематозных органах.

Гистологически у штатных уш на ранних сроках в тонкой шансе и в области кишечных ворсинок обнаруживали сгоцкричесноо гранулиматозноэ воспалвнш, разрушив эпителиального пласта, инвазию возбудителя и сырагопнув ЕеатроФальнуо инфильтрацию стенки кишки.

При бактериологическом посеве гомогенатов органов на 3 сутки наиЭольшее количество ' возбудителя регистрировали в кишечнике и шзентэриальных лимфоузлах (до (3,1+0.3)х10 и (4,2+0,5)х104 КОЕ/Г, соотвэтственно).

Максимальные изменения в органах и тканях отмечали на 6 сутки после заражения (пик инфекционного процесса) с абсцэдирушим мезаденигом и множественными очагами некроза в гачени и солезенке; количество микробов в них к этому сроку достигало концентраций (4,СК0,в)х104 и (9,2+1,2)х104 КОЕ/г, соответственно. Концентрация возбудителя в кишечнике и мезенториальных лимфоузлах заметно возросла и составила (9.0il,l)xl04 и (6,3t0,8)xl04 КОЕ/Г. О 9 суток инфекционный процесс у морских свинок постепенно стихал, а к 21 суткам отмечали освобождение организма экспериментальных животных от возбудителя.

Полученные характеристики взаимодействия высоковирулентного штамма м 626 с организмом морских свинок использованы нами в качество контрольных при сравнительной оценка микроби-олого-морфологических данных взаимодействия этого штамма с организмом животных, иммунизированных различными вариантами протективных антигенов.

Оценка протективных свойств аттенуировайного штамма V.pseudotuberculosis

Как было упомянуто выше, аттенуированныа штамм y.pseudotuberculosis 623 kv 9/2 не вызывал в организме экспериментальных животных патологических изменений и обладал выражений иммунологической активностью.

При определении протективного Эффекта, .создаваемого атгонуированным штаммом при его 1- и 2-кратном введении морским свинкам в дозе 1х109 м.к. с дальнейшим заражением высоковирулентным штаммом n 626 защитного Эффекта не наблюдали, несмотря на наличие в крови экспериментальных животных специфических антител в тотре 1/320.

При бактериологическом исследовании гомогенатов органов обнаруживали значительные концентрации иерсиний практически во всех органах иммунных животных и на всех сроках их вскрытия после заражения.

При дальнейшем выборе оптимальной схемы иммунизации ат-тенуированным вггаммом установлено, что максимальная защита от развития экспериментального инфекционного процесса была достигнута поело 3-кратной иммунизации с недельными

интервалами. В этом случав уже на 3 сутки количество высеваемых иерсиний было значительно меньше, чем в контрольной группе и составило в селезенке (З.г+О.ЗДОО1, в дазентериалъ-ном лимфоузла (9,0i0,8)zl01, в кишечнике (2,9+0,гб^Ш2 КОЕ/г (р<0,001),а, начиная с 6 суток,но регистрировали диссеминащи иерсиий штамма м 628 а органы и ткани, наблюдая динамичное освобождение организма животных от возбудителя.

По данным РА максимальные титры специфических антител у морских свинок также отмечены после 3-кратноа иммунизации. Срздаиа титр составил 1/800 против 1/4S0 при 2-кратноа иммунизации и 1/320 при 1-кратноа.

Полученные результаты, свидетельствующие о неэффективной защите животных от дассеминашш и размножения высоковирулант-ного штамма после 1- и 2-кратной их иммунизации изученным мутантом, объясняются, по-видимому, недостаточной кондантра-циеа активных антигенных компонентов, играющих важную роль в начальных ' этапах развитей инфекционного процэоса и стимулирующих ранниа иммунный ответ (Еербаков A.A. и соавт., 1992; Finlay В., Falko. S., 1989). ОчвВИДНО, что эти изменения в микробной клетке произошли в результате аттенуации исходного высоковирудзвтаого штамма, которая неизбежно привела к снижению концзнiращм отдельных белков в наружной мембране.В зтой связи потребовалось многократное введение антигена (на мзнее 3-х раз), чтобы защитить организм морских свинок от псевдотуберкулэзноа инфекции.

Оиенка протвктианых свойств BHW ЛПО Y.pseudotuberculosis

В настоящем разделе представлены результаты применены субьединичного антигена липополисахэрвдной природы для зашиты от псевдотуберкулазной инфекции. Как известно, аналогичные антигены предложены в качестве химических вакцин для профилактики кишечных инфекций (Карпухин Г.И. и соавт., 1979; Васильева Т.Г., 1988).

В предварительных опытах било показано, что полученные в одноименных условиях препараты ВМФ ЛПО v.pwudotubercuicui» характеризовались молекулярной однородностью, постоянным Физико-химическим составом и обладали моносгоцтаическим нмму-

ногенным действием.

При испытании их в акспериментальных исследованиях были установлены существенные различия в степени и длительности защиты от развития генерализованной инфекции в зависимости от дозы и кратности применяемого антигена.

Так, из 3-х груш животных, - иммунизированных десятикратно уменьшающимися дозами (200, 20 и 2 мкг), наиболее выраженный протекшвный зффокг наблюдали в группе животных, иммунизированных ВМФ ЛЛС в дозе 200 мкг, спустя 14 дней гюсло иммунизации. При бактериологическом

исследовании гомогенатов органов этих животных количество бактерий в них было достоверно меньше, чем у контрольных, и составило на 6 сутки после заражения в печени (З.с^оддао2, в селезенке <5,210,7)х10\ в мезентериальном лимфоузле (2,0+0,1 дао3, в кишечнике (2,4j:0,3)xl02 КОЕ/Г (рс0,001). На 35 сутки иэрсиний высевали в незначительных концентрациях лишь из мезентериальных лимфоузлов.

При гистологическом исследовании в этой j рупда животных не было обнаружено патологаческих изменений внутренних органов, характерных для контрольных неиммунных животных, зараженных высоковирулентным штаммом. Так, в тонкой кишке, в области кишечных ворсинок не отмечалось развития воспалительного процесса, ладь отмечено незначительное увеличение количества нейтрофилов в собственном слое. В печени, селезенке и мезентериальных лимфоузлах отсутствовали специфические гранулемы и абсцессы.

В другой группе животных, заращенных через месяц гюсле иммунизации ВМФ ЛПС в той же дозе, уже отмечали диссеминацию возбудителя в органы и ткани. На 6 сутки после заражения тусинт высевали из гомогенатов органов в значительных концентрациях, составивших в печени (1,7+0,2)х10^, в селезенке (2,РМЗ,2)х1сР, в ' почке (7,Б+0,8)х10<:', ' в мезентеризльном лимфоузле (3,8t0,4)xl04, в кишечнике (5,5+0,5)х10^ КОЕ/г. Гистологически у ■ большинства этих животных обнаруживали абсцедируюшдо участки и области пейеровых бляшок в различных отделах кишечника, а также значительное количество гранулем- и абсцессов в мезентериальных лимфоузлах и печени.

Таким образом, в результате сравнительного анализа данных гистологических исследований и количественных

бактериологических посевов гошгенатов органов опытных и контрольных животных, исследованных в динамика, установлено, что при однократной иммунизации максимальной испытанной дозой ВМФ Л1С более выраженная защита от инфекции регистрировала с ь через 14 дней после иммунизации.

При определении зависимости протективного аффекта от кратности иммунизация Щ? Л1С установлено, что посла 2-кратной иммунизации с 2-х недельным интервалом дозой 20О шсг и заражением высоковирулэнтным штаммом двух групп животных - через 14 давя и 1 маеяц -,соответственно, Формировался кратковременный заарггныя эффект.

При вскрытии животных i группы нэ обваруямваля патологических изменений внутренних органов.. lis бактериологическое исследование показало, что концентрация дарсшия в органах этих животных была достоверно нижа, чен у зараженных на таком же срока после однократной иммунизации <и (и, соответственно, у контрольных животных), и составила на 8 сутки в печени (1+0,08)х1СГ, в селезенка (3,1+0,4)хЮ1, в кэ~ зантериальном лимфоузле (8,0+0,6)х10:1-, в кидачника (3.2j;0,3)x хЮ1 КОЕ/г (р<0,001). К 15 суткам возбудителя высевали в незначительных концэнтрациях и только из мезентериального лимфоузла.

У животных, зараамнных через 1 месяц посла 3-кратнон иммунизации, концентрация взрсиниа в органах хотя и была достоверно нижа, чем после 1-кратной, однако имела мзсто выраженная дассеминацкя возбудителя, свидетельствующая о недостаточной защите, создаваемой ВМФ Л1С на атом сроке.

При определении показателей гуморального иммунитета установлено, что максимальные уровни антител таюйз определялись у животных через 14 дней после 2-кратной иммунизации. Концентрация антител перед заражэнизм равиялзсь среднему титру 1/640. Реакция иммунноа скстеш характеризовалась танке увеличением количества В-лкмфоцятов s органах иммунитета. Так, числа В-лимфоцитов в подчелюстном лимфоузле и селезенке иммунных животных, опрвдэллэкоэ трэд заражением высоковирулэнтным птамаом, превьаэло показатели в норме, соответственно, в 3,9 и 4.4 раза (р<0,001) и составило (1+0,1)х Х1СГ3 и (Э.О+О^хЮ2 о/кг.

Дальнеаиеэ увеличениз количества В-лимфощггов с

максимумом на 8 - 9 сутки наблюдали у этих животных посла заражения штаммом N 626. Оно превышало при этом показатели у контрольных животных на этом сроко в 1,9 и 2,3 раза, соответственно (р1<0,01, р2<0,003>.

Через 14 дней после однократной иммунизации и через 1 кесяц как после 1-кратной, так и посла 2-кратноа количество В-лшфощтов в исследуемых органах перед заражением также достоверно превышало норму, а при заражении - показатели у контрольных живота.

Аналогичную динамику количественных изменений наблюдали у иммунизированных животных в I-системе иммунитета. Максимальное количество Т-лимфоцитов в органах иммунитета таюш определяли через 14 даеа поело 2-кратного введения протоктивного антигена-. Оно превышало норку в тимусе в 1,Б раза, в селезенке в 1,8 раза, в лимфоузла в 2,6 раза (р1 2< <0,01, р3<0,003). Несколько меньшое количество I-лимфоцитов регистрировали на атом сроке после 1-кратноа иммунизации. Ча-рэо 1 месяц как посла 1-кратной, так и посла 2-кратноя иммунизации показатели Т-лимфоцитов в указанных органах приближались к норме (р>0,05).

Следует оплатить, что если у контрольных (ношмушшх) животных, зараженных высоковирулашгыым штаммом, наблюдали супросскю Г-клаточного иммунитета, сопровождающуюся достоверным снижондам количества Т-лимфоцитов, особенно на пиво процосса - на 6 сутки - (в тииусо до <4,4+0, 5 )х102, в селэзенко до- (Э.О^.в^Ш1, в лимфоузла до (7,2«;0,8)х101 кл/мг, рх 2 5<0,001), то у имвотных, зараженных чороз 14 дней поело 2-кратной иммунизации, эти показатели были в продолах нормы (в тимусе <1,2^0,1)х103, в селозенке <2,8*0,3)х10^, в лимфоузла {2,8^0,3)х103 кл/мг). У животных, зар8а!энных через 1 месяц, апалогичныо показатели были близки к таковым у контрольных швотных.

Функциональная ахспшность I-лимфоцитов, отражающая качественные показатели Т-системы,при стимуляции Кон-А, по данным 1'ХНЛ, также была наиболэо вырагана у валютных через 14 даоа после) 2-кратаой иммунизации ВМФ ЛИС: индекс торможения миграции логкоцитов составил 43,2+5,18 г трети 30,2*3,Ь% в норме (р<0,05), что свидетельствовало о развитии 131.

Таким образом, при введении ВМФ Л10 стДуляция

клеточного иммунитета была выражена в меныюа степени, по сравнению . со стимуляцией гуморального иммунитета. Очевидно, это обьясняеися Т-независимостыа ответа на антиген липополиеахаридаой природы.

Анализ проведенных экспериментов позволил установить, что под влияндам ВМФ ЛПС происходит усиление поглотительной и переваривающей активности ШЯЛ. Балаа вырзшнную активность ШЯЛ отмечали у 2-кратно иммунизированных морских свинок через 14 дней посла иммунизации: Фагоцитарный показатель возрастал в 1,2 раза, а Фагоцитарное число - в 3 раза,по сравнению с интактными животными (рх 2<0,05>.При этом, если в контрольной группе Фагоцитоз имел незавершенный характер, то у иммунных животных, зараженных высоковирулентным штаммом. Фагоцитоз являлся частично завершенным.

С приведенными данными коррелировали показатели ЛКТ, отражающие высокую степень активности микробицидкых систем ШЯЛ, наблюдаемую также через 14 дней после 2-кратной иммунизации ВМФ ЛПС: количество клеток, содержащих катионяые белки, у иммунизированных животных перед заражением превышало значения в норме в 1,Б раза (р<0,05) и, соответственно, у заражен-ныл, на пике инфокции, - значения в контроле в 3 раза (р<0,001>.

Представленные результаты гистологических исследований, количественных бактериологических посевов, а также динамики Формирования клзточвого и гуморального иммунитета и Факторов весшциФической резистентности при иммунизации морских свинок ВМФ ЛПС показывает, что данный аютген создает в организма животных кратковремейный (не более 2-х недель) лротективяыа э««кт.

Таким образом, полученные и изученные в настоящем исследовании антигены у.ртеиаокиьвгпЛоши» (корпускулярный и ВМФ ЛПС) не обесточивали выраженной и длительной защита от инфекции, что в значительной степени обусловлено Формированием иммунного опита на антигены лтоголисахаридеоа природа.

Исходя из данных, полученных при изучении протективноа активности антигенов у.р*«иао*д1Ь»гси1с»1» различной иммуно-хкмическоа природа. стало очввкцгым, что для усилэния протоктивного эффекта веобходамо сочетанноэ применение ВМФ ЛШ и белковых антигенов наружной мембраны.

Оценка протективных свойств антигенов

Y.psBUdotubercuIosis при сачетанном их применении

В результате проведенных исследования установлено, что одновременное введение морским свинкам ВМФ Л1С в дозе 200 мкг и БНМ в дозе 300 мкг обеспечивает более выраженную защиту организма животных от развития инфекционного процесса, чем при иммунизации упомянутыми выше антигенами.

Так, у животных, зараженных высоковирулентным штаммом n 626 через 14 дно2 (i группа), 1 и 3 месяца <и и и i группы) после иммунизации иерсиниа в низких концентрациях обнаруживали только в кишечнике и мозентериальных лимфоузлах, при этом наиЗольшее количество возбудителя регистрировали на 3 сутки послв заражения. Оно составило у животных i группы в кишечнике (1,7+0,2 )хЮ, в мезентериальных лимфоузлах (4,0+0,б)х1а* КОЕт, у животных и группы, соответственно. (1,2*0,1)х10^ и (3,0+0,ЗЩО2 KQE/г, у животных ш группы (7,2i0,8)xl02 и (e.OiO.bjxlO2 КОЕ/г (р<0.001). Практически полное очиздэяиэ организма от игсекции у иммунных животных наступало уже к 9 -15 суткам.

Таким образом, у всех 3-х групп животных, иммунизированных комплексом антигенов (ВМФ Ж1С и БНМ), возбудителя обнаруживали в организма кратковременно,при атом отсутствовала дас-семинация его в паранхематозные органы.

При определении напряженности гуморального иммунитета показано, что средние значения тигров антител посла сочетанноа иммунизации превышали таковые после 2-кратноа иммунизации только ВМФ ЛПС и составили через 14 дней 1/640 и через 1 месяц U32Q. Аналогичная закономерность отаечена в показателях количества В-лимфоцитов: максимальное количество В-лимфоцитов, определяемое перед заражением, выявлено у животных i группы. Так, в лимфоузле оно была достоверно выше нормы в Б раз, а в селезенке - в 8,1 раза (р12<0,001). У животных ti группы соответствующие показатели превышали норму в 3,8 и 4,6 раза 2<0,001), а у животных m группы - в 1,4 и 1,5 раза <р,<0,05, р2<0,003).

Следует отметить, что количество В-лимфоцитов заметно возрастало при заражении иммунных животных и достоверно превышало показатели в контрольной группа на всех сроках

исследования.

При введении животным ВМФ ЛПО в комплексе с БНМ происходила также и значительная стимуляция клеточного звена иммунитета. Количество Т-лимфоцитов после иммунизации на всех сроках, в том числа и через 3 месяца, превышало показатели в норме,а также аналогичные показатели у животных после 2-кратной иммунизации только ВМ$> ЛПС. Так, через 3 месяца оно составило в тимусе (1,Б+ОД)х1сР, в селезенке (3,8^0,4)х102. в подчелюстном лимфоуале (4,0±0,3>х1с£ кл/мг (р1<0,05. р2 3< <0,01).

У всех груш иммунных животных посла заражения штаммом м 626 количество Т-лимфоцигов достоверно превышало показатели в контрольной группе.

Установлено, что Функциональная активность 1-лимфоцитов также возрастала при введении ЕЧФ ЛПС в комплексе с БНМ у животных I и и групп. У животных 14 группы показатели РТЫЛ соответствовали значениям нормы.

Данные изучения Фагоцитарной активности ПМЯЛ показывают, что введение морским свинкам ВМФ ЛПС в кокпдэксе с БНМ способствует усилению их поглототельнои и даревариваюшой активности на всех сроках исследования. При этом у иммунных животных, зараженных высоковирулэнтным штаммом, фагоцитоз являлся частично завершенным.

По данным ЛКТ наблюдалась также активизация микробицидных систем ПМЯЛ, при этом количество клэток, содержащих катионные белки, у животных ни групп было выше, по сравнению с аналогичными показателями при 2-кратной иммунизации ВМФ ЛПС.

Таким образом, в результате проведенных эксшриментов показано, что сочетаиная иммунизация морских свинок ВМФ ЛПС и БНМ Формирует более длительную защиту от развития инфекционного процэсса. При этом на всех сроках исследования отсутствует дассеминация возбудителя. Формируется более полноценный гуморальный и клеточный иммунитет,а также активизируется Факторы не специфической резистентности организма.

Анализируя результата, подученные при иммунизации животных ВМФ ЛПС в сочетании с БНМ, следует подчеркнуть, что в этом случае для эффективной защиты от инфекции имела значение качественная характеристика гуморального ответа на введение

антигенов различной иммушшшической природа, в результате чего индуцировались антитела как к белковым антигенам наружной мембраны, так и к О-антигену. Об этом свидетельствую ранние находки антител с помощью диагностических препаратов на осново БНМ и более позднее обнаружение их к О-антигену (Цэне-ва Т.Н., Кулдаова Л.Б., 1993).

Диагностическое значение антигенов Y.pseudotuberculosis

При изучении про т ектив н ых сво и ств вышеупомянутых антигенов была оценена их иммунологическая активность. Полученные результаты позволили отобрать ВМФ ЛПС и БНМ, как антигены, вызывающ© в организма экспериментальных животных выраженный гуморальный ответ. Дальнейшее изучение их антигенной активности проводили в оштах иммунизации кроликов как отдельными антигенами, так и их сочетаниями по различным

СХеМаМ И В Сравнении С ВЫСОКОВИруЛЭНТКЫМ ШТаММОМ V.pseudotuberculosis i серовара, кнактивированного формалином.

Показана высокая антигенная специфичность ВМФ ЛПС, инду-шруипвй выработку только гомологичных антител (тигр не ниже 1/160Q), в отличив от корпускулярного Формалинизированного антигона, стамулируюарго прдукцшо готерологичяых антител (тигр 1/80).

Как и ожидали, сыворотки, полученные на БНМ, содержали антитела как К Y.pseudotuberculosis, ТЭК И К Y.enterocoHtica вирулентных шта\ашв, и а то ю время они не атлютташроважи авирулзитада культуры. Ташз сыворотки, как . показали исследования И.В.Сиирнош и Г.Я.Цэневой (1991), моншо применять для Дофэронциацщ! вирулонтшх ii эвирулэнтных юриакз в роавди агпагптацки на стекло.

Отсутствие юрокростЕороагируюзях антител в вативдых сыворотках ва ВМФ ЛПС рассматривали как сущзствошшй Факт, гозволпада оптимизировать тохполопш изготовления на is осново 1&шувоФерцоптной тест-скстеш для вшшлания антигенов у.pseudotuberculosis i серовара за счот исключения этапа адсорбции при получений стцетитаского коиьюгата. Это позволило повысить экономичность технологии, так как из единицы объема сыворотки на ВМФ ЛЮ получали на ЗОХ больта готового препарата, что, в, свою очередь, удовошшло конечный продукт.

В модельных опытах при испытании штаммов v.pseudotuberculosis i - vi сероваров и других энтеробактериа показана высокая чувствительность и строгая специфичность тест-системы. При исследовании материала от больных (испражнения, моча, слюна) с установленным диагнозом псевдотуберкулез, ОКЗ и здоровых людей и смывов с об ектов окружающей среда установлена выраженная диагностическая эффективность препарата (82S положительных результатов у больных псевдотуберкулозом и 4-6S ложношложигельвых >.

Тест-система успешно прошла Государственные испытания; утверждены ВФС n 42-354-ВС-92 и ЭПР N 389-92. Препарат внедрен в практику здравоохранения.

Учитывая моносшцифический характер взаимодействия ВМФ ЛПС сQ специфическими антителами, была предпринята попытка создания на ее основе лабораторных серия эршроцитар-ного диэгностикума для выявления антител к

V.pseudotuberculosis I СврОБЭра. ИХ СПеЦИФИЧН^СТЬ И

чувствительность изучена при исследовании сывороток больных псевдотуберкулезом, другими ОКЗ и здоровых ладей. Число положительных результатов при исследовании сывороток больных различными инфекционными заболеваниями (дизентерия,садьмонеллез, иерсиниоз) не превышало 63 в разведениях 1/10-1/80. При исследовании сывороток больных псевдотуберкулезом с помощью экспериментального диагностикума было получено на 15% больше положительных результатов, по сравнению о коммерческим препаратом, и определяемые тигры специфических антител были на 2-3 разведения выш.

Результаты, полученные при изучении антигенной и иммуногенной активности ВМФ ЛЙС обосновывают перспективное.!, ее использования для создания специфичных иммунодиагностических препаратов для выявления как антигенов v.pseudotuberculosis, так и антител к нин. Наиболее эффективные препараты для экспрессной диагностики псевдртуберкулоза могут быть подучены при сочетанием использовании гкшриммун-ных сывороток на ВМФ ЛПС и БНМ.

выводы

1. Подученные Образцы протективных антигенов Y.pseudotuberculosis харакгэризуется различной степенью специфической активности.

2. Аттенуироващшй 2-х маркерный мутант y.pseudotuberculosis 623 kv Э/2, .обладая минимальной остаточной вирулентностью и являясь безвредным для животных, защищает их от разви-, тия экспериментального псевдотуберкулозяого процесса при заражении высоковирулонтным штаммом y.pseudotuberculosis по ранее, чем после 3-кратаой иммунизации с недельным интервалом.

3. ВМФ ЛПС не может рассматриваться в качество оптимального протекггивного антигена, так как создает в организме морской свинки кратковременный (14 дней) защитный зф-Фекг на Фоне слабого иммунного ответа со стороны 1-клоточного звена иммунитета и выращенными реакциями В-системы.

4. Сочетанная иммунизация активными антигенами ЕЧФ ЛПС и БНМ создает у животных более длительную <ве менее 3-х месяцев) защиту от инфекционного процрсса, что позволяет рассматривать комплекс ВМФ Л1С и БНМ в качестве перспективного протекггивного антигена, надожно защищающего от развития псев-дотуборкулезноя енфокции.

5. Комплексная сцонка кммун ore иных свойств ВМФ ЛПС демонстрирует ее высокую активность и сгоцифичность, позволя-шиз повысить на 303 экономичность технологии получения моно-сгоцадических псевдотуберкулозных сывороток, используемых в производства иммунодиагностических препаратов.

в. Высокое качество нативных сывороток к ВМФ ЛПС обеспечивает стабильное производство тест-системы иммунофермэнтной для обнаружения возбудителя (антигенов) в различных биологических субстратах.

7. Создавши на основе ВМФ ЛПС эритроцитарный антигенный диагностику« отличается от коммерческого препарата диагностической Эффективностью. С его помощью антетела удается выявить в больших разведениях и чаща, чем с производственным аналогом.

список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Некоторые иммунологические показатели при экспериментальной иерсиниознон инфокции // Тез. докл. ш съезда инфекционистов Белоруссии "Диагн. и лечение осн. инф. забол. в совр. усл." - Минск. 1990. - С.76-78 (соавт. Аленушш-на Т.В.).

2. Характеристика^антигенов y.pseudotuberculosis, перспективных для конструирования вакцин // Тез..докл. Всероссийск. съезда микробиол., эпидемиол. и паразитол. - М., 1991.-Т.2. - С.168 (соавт. Шнева Г.Я., Бондаренко В.М.).

3 Получение псевдотуберкулезного эритроцитарного даагностикума с использованием ВМФ ЛПС иерсиний // Тез. докл. научн.-практ. конф. к 85-латию Томского НИИ вакцин и сывороток " Актуальн. вопр. мед. биотехнол. " - Томск, \ 1991.-4.1.-С.147-148 (соавт. Барашкова Л.Н., Ценева Г.Я.).

4. A poseible method for development оf a pseudotuberculosis vaccines // Int. conf. "Med. Biotechn. lmmuniz.; ana AIDS.— june 12- is, wl. Leningrad.- s5-7 <co-authors Tseneva g.Ya., Bondarenko V.M.>.

5. New approaches in the development of immunrdiagnostic pseudotuberculosis preparations •// In the ■ same place.— p2-22 (co-authors Tseneva g.Ya., Kuljaehova L.s., Dalter А.В., Burova L.A., Barasbkova L.N.).

6. Антигены возбудителя псевдотуберкулеза, их Функциональная активность и перспективы использования // Тез.докл.научн.-практ. конф. к 70-летию СПб ЮПСМ им. Пастера "Актуальн. пробл. инФекцион. патологии".- СПй, 1993.- 4.2.-С.20.

7. Штамм бактерий y.pseudotuberculosis i серовара, используемый для приготовления протективного антигена // Авт. сввд. к 1796675 от 8 октября 1992 г. (соавт. Ценева Г.Я., Бондаренко Вик.М., Бондаренко Вл.М.>.