Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протективное действие бактериальных гликополимеров при стафилококковой инфекции

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Протективное действие бактериальных гликополимеров при стафилококковой инфекции"

од

:: оз

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ* Я УКРАЇНИ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ О. О. БОГОМОЛЬЦЯ

Грабченко Наталія Іванівна

УДК 578. 245: 579

ПРОТЕКТИВНА ДІЯ БАКТЕРІАЛЬНИХ ГЛ1Ю0П0ЛІМЕРІВ ПРИ СТАФІЛОКОКОВІЙ ІНФЕКЦІЇ

03.00.07 - мікробіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 1998

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті мікробіології та вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України Науковий керівник: Доктор біологічних наук, професор Співак Микола Якович Інститут мікробіології та вірусології і м. Д. К. Заболотного НАН України, завідуючий відділом проблем інтерферону та імуномодуляторії Офіційні опоненти: Доктор біологічних наук, професор.

Руденко Адель Вікторівна

Інститут урології та нефрології Академії

медичних наук, завідуюча лабораторією

мікробіології і вірусології

Доктор медичних наук,професор

Борисов Вадим Анатолійович

Київський Університет ім. Тараса Шевченкои

професор кафедри мікробіології та загальної

імунології

Провідна установа: Київський науково-дослідний інститут епідеміолог: та інфекційних хвороб ім. Л. Е Громашевськоко МОЗ України лабораторія загальної мікробіології

Захист відбудеться "«?/'" 1998 р. о________годині н:

засіданні спеціалізованої вченої Ради Д.26. 003.01 при Національної медичному університеті ім.акад.О.О.Богомольця (м.Київ,проспект Перемоги, 34, медико-профілактичний корпус, аудіторія N2). З дисертацій можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету (м. Київ, вул. Зоолог і чна, 3).

Автореферат розісланий <£/ 1998 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук, професор 0. Е Яворовський

- з -

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Вступ. Інфекційні захворювання людини, викликані патогенними чи умовно-патогенними бактеріями, е однією з актуальних проблем сучасної біології та медицини. Провідне місце серед них належить інфекціям, етіологічним фактором яких є стафілокок (Спивак Е Я., 1987; Сычева В. В. ,1993). Надзвичайно широке поширення бактеріальних захворювань, особливо викликаних стафілококом, обумовлене нераціональним використанням антибіотиків, що призвело до виникнення високопатогенних та антибіотикорезистентних штамів зтафілококів, а також дією на організм екологічно-несприятливих та соціально-зкономічних факторів, які пригнічують імунну систему (Чистович Г. Е , 1969; Черномордик А. Б. ,1989). Характерною рисою стафілококових інфекцій є те., що вони виникають на фоні зниження неспецифічної резистентності організму, клітинного імунітету, головним чином, в результаті пригнічення функціональної активності клітин фагоцитарної системи (Бережной КЕ із співавт. , 1990; Лазаренко Л. М. ,1991).

З іншого боку відомо, що неспецифічна резистентність організму цо інфекцій може бути підвищена деякими продуктами мікробного походження - бактеріальними токсинами, ліпополісахаридами (ЛПС), ад’-ювантами мікобактерій та ін. Серед яких особливий інтерес представляють, в першу чергу, бактеріальні ЛПС. ЛПС мають відносно високу біологічну активність, в тому числі вони досить дієво впливають на !>актори неспецифічної резистентності організму до інфекції та на становлення специфічного клітинного та гуморального імунітету (Рах-милевич А. Л.,1990). Однак, використання препаратів ЛПС у медичній практиці обмежується їх токсичністю та пірогенністю, яка, в основному, пов’язана з ліпідом А. У зв’язку з вищесказанним, достатньо перспективними в плані подальшого клінічного впровадження можуть Зути нетоксичні та апірогенні бактеріальні полісахариди, яким також притаманна імуномодулююча дія. Однак вивчення протективної дії бактеріальних глікополімерів при імунодефіцитних станах практично не проводилось. Тому питання про можливість використання полісахаридів цля регуляції імунітету та корекції його порушень при бактеріальних інфекціях до теперішнього часу залишається відкритим. Це й вищезгадане обумовило необхідність проведення порівняльного вивчення іму-номодулюючої активності ряду природних бактеріальних глікополімерів га їх синтетичних аналогів при бактеріальних інфекціях.

Актуальність роботи Імуномодулюючі препарати використовуються зараз у різних галузях медицини для підвищення ефективності комп-

лексної терапії інфекційних захворювань, а також з метою усуненн хронічного бактеріоносійства. Серед різноманітних груп неспе цифічних стимуляторів імунітету мікробного походження, як відрізняються структурою та механізмом дії, лише деякі отримал практичне застосування. Це пов’язано з їх високою токсичністю т побічними реакціями, а також недостатністю або непостійністю стиму люючого ефекту. Тому проблема пошуку нових імуномодулюючих преп ратів бактеріального походження, вивчення механізмів протективно дії та розробка оптимальних схем їх використання при бактеріальни інфекціях є актуальною.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація є фрагментом Державної програми ”Імунопрофілактик населення на 1993-2000 р. р. " за темами: Держ. N01950027764 "Розроби! нові імуномодулюючі препарати на основі похідних глікополімерів дл профілактики та лікування імунодефіцитних станів" т Держ. Ш19бЙ318119 "Вивчити вплив інтерферону та його індукторів в формування імунозапальних процесів з метою розробки рекомендаці для установ охорони здоров’я".

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягала у визначень антибактеріальної та імуномодулюючої ефективності бактеріальни глікополімерів - Ю^ігоЬіит Іегшпіпозагиш, ВДП,а також його синтє тичних похідних на моделі стафілококової інфекції.

Для досягнення цієї мети були поставлені слідуючі основні заЕ дання:

- визначити вплив стафілококової інфекції на показники неспецифічк резистентності організму;

-дослідити протективну дію бактеріальних глікополімерів пр стафілококовій інфекції;

- визначити вплив бактеріальних глікополімерів на фактори неспє цифічної резистентності організму - функціональну активність фагс цитів, природних клітин-кілерів, а також на продукцію фактора нен розу пухлин (ФНП);

- вивчити інтерфероногенну здатність досліджуваних препаратів бар теріального походження.

Наукова новизна робот Вперше показано :

- глікополімери ИіігоЬіит ієйшпіповагит, мурамоїлдипептид (МДП) і його синтетичні похідні самі по собі виявляють імуностимулюючу аь тивність - індукують продукцію інтерферону II типу (ІФН), активухн систему природних кілерів та фагоцитуючих клітин, а також стимулк ють продукцію ФНП;

-при стафілококовій інфекції пригнічується активність природних клітин-кілерів та порушується продукція фактора некрозу пухлин;

- глікополімери бактеріального походження, виявляють протективний ефект при стафілококовій інфекції. Отримані експериментальні дані свідчать, що їх захисна дія пов’язана з модулюючим впливом на показники неспецифічної резистентності організму - фагоцитарну активність макрофагів, а також на активність природних кілерів та на продукцію фактора некрозу пухлин;

-при експериментальній стафілококовій інфекції одночасне введення препаратів р-ФНП-а та р-ІФН-?- призводить до синергідної протективної та імуномодулюючої ефективності, яка зумовлюється підвищенням функціональної активності фагоцитуючих клітин.

Теоретичне значення роботи полягає у встановленні принципового факту імуномодулюючої здатності глікополімерів грамнегативних мікроорганізмів та нових синтезованих похідних класу мурамоїлдипептиду.

У зв’язку з цим перспективним вважається подальше вивчення широкого спектру речовин згаданих типів, як потенційних імуномодулюючих агентів.

Показано, щр імуномодулююча дія нових дослідних препаратів бактеріального походження ( глікополімери НіігоЬіит Іедитіпозагит, мурамоїлдипептид та його нові синтетичні похідні) пов’язана, в першу чергу, з їх здатністю індукувати продукцію інтерферону II типу та модулювати функціональну активність імунних клітин.

Практичне значення роботи. Продемонстрована принципова можливість заміни токсичних бактеріальних ЛПС нетоксичними та апіро-генними глікополімерами, які можуть використовуватись для корекції порушень імунітету. Встановлена синергідна протективна та імуномо-дулююча ефективність р-ФНП-а та р-ІФН-у при експериментальній стафілококовій інфекції може бути врахована при удосконаленні схем використання цих препаратів в комплексній терапії бактеріальних інфекцій.

Декларація конкретного особистого внеску в розробку наукових

результатів, цо виносяться на захист.

Особистий внесок дисертанта полягає в аналізі актуальності та ступеня дослідженості тематики роботи, виборі методик дослідження. Всі експериментальні дані, наведені автором в дисертаційній роботі, одержані самостійно. Дисертантом проведено аналіз усього отриманого фактичного матеріалу та його статистична обробка. Розробка основних положив та висновків роботи також належить дисертанту.

Глікополімери ЯЬігоЬішп Іедишіпозагиш були люб'зно надані

- б -

д. б. н. JL В. Косенко.

Препарати нових похідних МДП були синтезовані в Сімферопольському держуніверситеті під керівництвом д. х. н., професора R П. Чирви.

Апробація роботи.

Основні положення роботи були представлені на: VI11 Міжнарод-

ному Конгресі вірусологів (Берлін, 1990); Робочій нараді " Иммуномодуляторы природного происхождения" (Владивосток, 1990); 2-му Всесоюзному з’їзді "Теоретические и прикладные аспекты молекулярної биологии" (Самарканд,1991); X Черговому з'їзді ISIR (Торонті ,1992); Всесоюзній конференції "Актуальные вопросы микробиологии эпидемиологии и иммунологии инфекционных болезней" (Харьков,1993) 1-му Установчому (V111) з’їзді УМГ (Одеса,1993)

За матеріалами дисертації опубліковано 9 наукових робіт у жур налах і збірниках.

Об'єм та структура роботи.

Дисертацію викладено на 147 сторінках машинопису. Робота скла дається з вступу, огляду літератури, розділу матеріали та метод: досліджень, 3-х розділів власних досліджень, обговорення резуль татів досліджень, висновків та списку літератури, який включає 18 джерел. Робота ілюстрована 3 таблицями та 23 рисунками.

Огляд літератури. Викладені відомості про біологічні власти вості препаратів бактеріального походження, яким притаманні імуномі дулюючі властивості. В результаті їх дії при бактеріальни інфекціях посилюється фагоцитоз, активується синтез біолопчно-ак тивних сполук -інтерлейкіна і, інтерферона, фактора некрозу пухли та ін. В огляді, на основі аналізу літературних даних, зроблено вис новок, що застосування даних препаратів у медичній практиці н завжди ефективне, оскільки вони викликають ряд побічних ефектів : організмі. На основі цього висновку проведено теоретичне обгрунту вання перспективи вивчення нових імуномодуляторів бактеріальног походження. У зв’зку з вищезгаданним, проблема пошуку нових імуном дулюючих препаратів бактеріального походження, вивчення механізмі протективної дії при бактеріальних інфекціях та розробка оптималь них схем їх використання є актуальною.

Матеріали та методи досліджень.

Бактерії: використовували культуру Staphylococcus aureus (му зейні штами 209, 8325, Wood).

Віруси: вірус везикулярного стоматиту /ВВС, штам Індіана/, от риманий з музею ВДІ епідеміології і мікробіології ім. ЕФ. Гамане

(Москва), розмножували на курячих ембріонах або мишачих клітинах L-929 і використовували для індикації інтерферону.

Тварини: дослідження проведені на мишах ліній СВА, С57В1/6, BalB/c, SHK масою 18-20 г. Мишей заражали внутрішньочеревно введенням живої добової культури стафілококу /ЬП^чи LEW-/-

Культури клітин і середовищ: для титрування інтерферону використовували культуру перевивної лінії фібробластів миші L-929.

Клітини культивували на середовищах RPMI-1640 з додаванням 5-10% фетальної сироватки телят /"Serva"/, 25 мМ HEPES, 10 мМ глютаміну і антибіотиків - пеніциліну і стрептоміцину /по 100 од/мл кожного/. Для виділення клітин з порожнини та органів тварин використовували охолоджений до розчин Хенкса з 5Z сироватки великої рогатої худоби (ВРХ).

У дослідах використовували слідуючі препараты:

- гдікополімери Rhizobium leguminosarum , люб'язно надані д.б.н. JL В. Косенко;

- мурамоїлдипептид (МДП)/"Serva"/ та його нові синтетичні похідні -рС,\\ьШ 1 ґзС^Н^МДП, які були синтезовані в Сімферопольському держуніверситеті під керівництвом д. хім. наук B.IL Чирви;

- офіцінальний вітчизняний препарат продігюзан та ліпополісахарид /"Serva"/.

- препарат рекомбінантного r~І® миші / AML Biological USA/, люб'язно наданий проф. G. Sonnenfeld (США). Активність препарату складала 10* МО /мг, концентрація - 1x10’ МО/мл, препарат рекомбінантного ФНП-а /"Serva”/.

Визначення активності інтерферону: антивірусну активність

інтерферону визначали шляхом мікротитрування у перевивній культурі клітин L-929, проти 100 ТЦД 50 вірусу-індикатора (ВВС, вірус везикулярного стоматиту шт. Індіана) в умовах постійного рівня СО*

Захисну дію глікополімерів бактеріального походження та ци-токінів при експериментальній стафілококовій інфекції визначали за показником виживання інфікованих тварин та тривалістю збереження мікробів в організмі на фоні попереднього введення дослідних препаратів.

Макрофаги тшей отримували за загальноприйнятим методом, описаним І. Я. Учителем (1978). Оцінку фагоцитарної активності макрофагів проводили шляхом підрахунку фагоцитарного числа- ФЧ(число фа-гоцитуючих клітин з 100 підрахованих) та фагоцитарного індексу -ФІ(середнє число мікробів, які були поглинуті одним фагоцитом). Бактерицидну активність визначали: а) за тестом відновлення

нітросинього тетразолію (НСТ-тест) (Грачева М. П.,1984).

б) методом люмінол-залежної хемілюмінесценції(Владимиров Ю.А.,

1989).

Клітини селезінки отримували за загальноприйнятою методикою, описаною ХФрімель (1979).

Активність природних кілерів селезінки мишей визначали у 18-годинному тесті мікроцитотоксичності проти клітин-мішеней L-92S ( Н. А. Кузовкова,1991).

Рівень ФШІ оцінювали за цитотоксичною дєю на фібробласти миші L-929 (Малайцев ЕЕ із співавт. , 1991).

Математична обробка отриманих результатів.

Результати досліджень статистично обробляли згідно І.П. Аш-маріну (1962). Результати, що подані графічно, отримували за допомогою програми Grapher версія 1.75, фірми Golden Software та програми Quattro Pro версіі 4.0 фірми Borland International Inc.

Результати досліджень та їх обговорення.

Імуномодулюючу дію препаратів - глікополімерів Rhizobiui leguminosarum, продігіозану, МДП та його нових синтетичний

похідних /зС/Н«ОДП та ^зС,*Н^,-МДП визначали при експериментальній стафілококовій інфекції. Вибір стафілококової інфекції, як експериментальної моделі, був зумовлений тим, що вона характеризується широким розповсюдженням в сучасній клініці, важкістю перебігу,різноманітними клінічними формами та неефективністю традиційних методі] лікування (Чистович Г. R,1967; Беляков В. Д. ,1980; Горшевикова Е. В. 1988). Раніше було показано, що при зараженні мишей линії СВ Staphylococcus aureus (LD^j) спостерігається тривале збережена збудника в організмі, що пов’язано з пригніченням показників неспе цифічної резистентності,особливо, функціональної активності кліти фагоцитарної системи (Спивак М.Я., 1984;Лазаренко JL Е , 1991). Фато цитарна активність макрофагів, моноцитів та поліморфноядерних лей коцитів (ПМЯЛ) є першою лінією захисту організму при бактеріальни інфекціях ( Ляшенко Е А. ,1994). Відомо, що макрофаги не тільк елімінують мікроорганізми шляхом фагоцитозу, але й взаємодіють з Т та В -лімфоцитами при формуванні імунної відповіді, крім того, сек ретуюгь протизапальні цитокіни (ІЛ-1, ФНП та інші) (Фрейдлин И.С. 1994).

В наших дослідженнях інфікування мишей линії СЕ Staphylococcus aureus шт. 8325 (LD^p) призводило до зниження актив ності ЫФПЕ , яку оцінювали методом люмінол-залежної хемілюмінес ценції. Так, індекс стимульованої хємілюмінісцєнції макрофагів ві

інфікованих мишей на 1-у, 3-ю та 5-ю доби досліду був в два рази

нижчим, ніж у макрофагів від інтактних тварин. Пригнічення функціональної активності ШІЕ мьпяей, інфікованих стафілококом, пов'язане с порушенням активності ряду ферментних внутрішньоклітинних систем ( ферментів обміну аденозину, гідролітичних ферментів), а також із підвищенням рівня внутрішньоклітинного цАМФ при одночасному зниженні рівня цГМФ та індукцією Т-супрессорів макрофагів (Спивак Н.Я. із спіЕавт. ,1990, Лазаренко Л.ЕД991).

Макрофаги є основними клітинами-продуцентами фактора некрозу пухлин (ФНП), який відіграє значну роль як в ефекторному, так і в регуляторному ланцюзі імунної реактивності організму(2рейдлин К С.,1994). В зв'язку з цим, нами було досліджено продукцію ФНП макрофагами перитонеального ексудату при стафілококовій інфекції. Встановлено, що іфікування мишей стафілококом призводить до підвищення спонтанної продукції ФНП МФПЕ в порівнянні з МФГО інтактних тварин. В той же час.продукція ФНП МФПЗ іфікованих мишей in vitro у відповідь на індукцію ЛПС була зниженою протягом 7 діб. Порушення продукції ФНП при стафілококовій інфекції пов'язане, ймовірно,з пригніченням фукціональної активності макрофагів.

Зокрема системи фагоцитів, у імунологічному нагляді організму важливу роль відіграють також і природні кілери (Ломакин М.С. ,1990), активність яких при бактеріальних іфекціях практично не досліджена. В подальших експериментах було встановлено, що при стафілококовій інфекції активність ПКК знижується, що спостерігається на протязі 7 діб після зараження мишей стафілококом. Слід відмітити,що кілерна активність пригнічується при всіх співвідношеннях ефектор : мішень / 100: І; 50:І; 25: І /. Так, індекс цитоток-сичності клітин-кілерів інфікованих мишей складав лише 23,6 ±.2,4% -28,3 ±. 1,8% на 3-7 доби відповідно в порівнянні з 52,1 ± 1,3% ПКК інтактних тварин /р < 0,05/.

Таким чином, при стафілококовій інфекції пригнічується функціональна активність фагоцитуючих клітин, природних клітин-кілерів та порушується продукція ФНП. Зниження функціональної активності макрофагів може призвести до формування малоефективної імунної відповіді на стафілокок, так як поряд зі зниженням інтенсивності фагоцитозу стафілокока, може порушуватись здібність фагоцитів переводити антиген в імуногенну форму, доступну для Т- та В-лімфоцитів (Вихоть ЕЯ., 1988).

В наступних експериментах вивчали дію глікополімерів Rhizobium ieguirdnosarum, ВДП та його нових синтезованих похідних на

функціональну активність фагоцитів, природних клітин-кілерії інтактних та інфікованих стафілококом мишей та визначали здатність дослідних препаратів індукувати продукцію интерферону та ФНП.

Встановлено, що препарати бактеріальних глікополімерів в концентрації 10 мкг/мл in vitro підвищують функціональну активність МФПЕ інтактних мишей лінії СВА. Так, ПФ фагоцитуючих клітин, які культивувались з ЕПС-97 складав 76,2 ±1,8%, а з продігіозаном 82,С ±.0,7% в порівнянні з 51,3+2,4% для МФПЭ, не оброблених цими препаратами /р<0,05/ (контроль). Крім того, під дією глікополімерії спостерігали посилення інтенсивності фагоцитуючої функції МФПЕ. Прі цьому, величина ФІ підвищувалась до 9,2 ± 2,3 ум. од. та 8,8+1,4 ум. од. для МФПЕ, оброблених ЕПС-97 та продігіозаном відповідно, порівняно з 6,7+ 1,5 ум. од. в контролі /р < 0.05/.

Досліджувані препарати стимулювали in vitro здатність ЫФШ інтактних мишей до відновлення нітросинього тетразолію. Більш ефективно на киснево-залежну бактерицидну активність МФПЕ впливаї продігіозан - показники зростали до 76,1±.3,5 ум. од. проти 35,8 j 4,2 ум. од. /р < 0.05/ для МФПЕ, які культивувались без препарату. ] результаті інкубації МФПЕ з ЕПС -97 показник бактерицидної активніші зростав до 56,2 ± 2,3 ум. од. / р<0,05 /.

Критерієм функціональної активності фагоцитуючих клітин є також посилення їх хемілюмінесцентної відповіді. Культивування ШЛЕ 5 ЕПС-97 викликало підвищення ІС до 9,1 +.0,4 ум. од /р <0,05/, а ; продігіозаном до 10,3 ± 1,5 ум.од. /р < 0,05/. Хемілюмінесцентн; відповідь МФПЕ також посилювали МДП та його синтетичні похідні. Так, інкубація МФПЕ з ВДП у концентрації 10 мкг/мл призводить де підвищення індексу хемілюмінесценції до 12,3 + 0,8 ум. од. ІС макрофагів, оброблених препаратами /зС^Н^ВДП та /зС^Н^МДП підвищувався ;

11.5 ± 1,5 ум. од. та 9,8 і 0,4 ум. од. відповідно /р < 0,05/.

В подальшому виявилось, щр препарати ЕПС-97, продігіозан, ЫД1 та його нові синтетичні похідні in vitro індукують продукцію ФНП. Так, рівень ФНП в інкубаційній рідині МФЮ, які культивували ; продігізаном та ЕПС-97 підвищувався до 2,8 нг/мл та 2,1 нг/м. порівняно з 0,15 нг/мл ФНП для МФПЕ, які препаратами не оброблялись. Під впливом МДП, ґзС^Н^ЩП та рівень ФНП зростав ді

3.5 нг/мл, 2,2 нг/мл та 1,5 нг/мл відповідно.

Препарати ЕПС-97, продігіозан, ЩП та його синтетичні похідн у концентрації 10 мкг/мл in vitro впливали на активність природни: клітин-кілерів (ПКК) селезінки мишей лінії СВА. Так, продігіозаі підвищував індекс ПКК доб7 %, а ЕПС-97 - до 63% в той час, як у

контролі індекс цитотоксичності складав 52 %. МДП та його нові похідні менш ефективно впливали на активність ПКК селезінки мишей проти ПК-чутливої мішені L-929. Максимальна активність ПКК, яка була досягнута, коли клітини були оброблені МДП - ІЦ дорівнював 58% . ІЦ для клітин-кілерів, оброблених гзС^НдМДП та /зС^Н^МДП підвищувався до 56% і 53 % відповідно.

В експериментах по проведенню скринінгу можливих індукторів ІФН виявилось, що досліджувані глікополімери, МДП та його синтетичні похідні являються індукторами ІФН II типу (рис. 1). Виявилось, шр серед цих препаратів найбільш перспективним індукторами ІФН II типу є препарат ЕПС-97. Наші дані узгоджуються з даними літератури про спроможність глікополімерів Clavibacter michiganense та Pseudomonas solanacearum, викликати продукцію ІФН II типу ( Варба-нец JL Д. , 1990).

Таким чином, було встановлено, що ЕПС -97, продігіозан, МДП та його синтетичні похідні in vitro активують фагоцитарну та бактерицидну активність макрофагів, індукують продукцію ФНП та активують ПКК. Крім того, встановлено, що досліджувані препарати є індукторами інтерферону II типу. Виявлення цих властивостей викликало необхідність подальшого вивчення впливу досліджуваних препаратів на стафілококову інфекцію.

Встановлено, що бактеріальним глікополімерам - ЕПС -97, іродігіозану та ВДП і його синтетичним похідним притаманна протек-гивна дія при стафілококовій інфекції. Так, введення мишам, інфікованим Staphylococcus aureus шт. 8325, внутрішньочеревно препаратів у цозі 10 мкг на мишу підвищувало їх виживання. Захисна дія була 5ільш вираженою, коли препарати вводили двічі - за 24 години до інфікування та через добу після зараження. Серед глікополімерів іайбільш ефективнішим виявився продігіозан. Так, продігіозан забез-іечував захист 90% дослідних тварин, тоді як ЕПС-97- 65%. Протек-гивна активність досліджуваних препаратів супроводжувалась приско-зенням елімінації стафілококів із нирок. При цьому,більш ефективно '.корочували строки збереження стафілококів в нирках мишей і зменшу-іали кількість мікробів продюгіозан та ЩІ .

Встановлено, що захисна дія препаратів була пов’язана з підвищенням функціональної активності фагоцитів. Як видно на рис. 2, .ндекс стимуляції хемілюмінесценції був вищий у МФПЕ інфікованих :тафілококом тварин, яким вводили продігіозан. ІС складав 8, 2 +. .,4 ум. од., порівняно з показником ІС макрофагів контрольних тварин

2, 1+0,4 ум. од.)/ р< 0,05 /.

титр інтерсреро ну, о9/ліл

т

ЙЙЯ'-

Н

ш

2 3 4

препарати

Рис. 1. ІНГЕРФЕРОНОГЕННА АКТИВНІСТЬ ГЛІКОПОЛІМЕРІВ БАКТЕРІАЛЬНОГО ПОХОДЖЕННЯ по осі ординат-титр інтерферону од/мл; по осі абсцис -препарати:

1- продігіозан; 2 -ЕПС-97;

З - МДП 4-рС+Н/£ЩП; 5 - ^зС^Н^ДП;

Крім того при введенні інфікованим мишам бактеріальних гліко-олімерів спостерігалась активація природних клітин-кілерів. Причо-у, у мишей, яким вводили продігіозан, індекс цитотоксичності ПКК авіть у першу добу дорівнював 38,1 ±.2,3%. проти 23,8 ±. 1,2% у нфікованих мишей, яких препаратом не обробляли. У тварин, яким водили ЕПС-97 активність клітин-кілерів на першу добу була трохи ижчою - близько 29, 5 ±.1, 8Z. Однак на 7 добу перебігу експери-

[ентальної стафілококової інфекції під впливом ЕЇЇС -97 рівень іілерної активності лімфоцитів мишей був значно вищим і наближався ;о рівня ІЦ ПКК інтактних тварин.

Нами було встановлено, що ВДІ та його похідні також посилювали ктивність ПКК селезінки інфікованих стафілококом мишей, причому фективніше, порівняно з ЕПС-97 (рис.3). Серед похідних МДП більш ктивнішим виявився рС/Н^.ЩЩ Можливо, це зумовлено особливостями :імічної структури цих препаратів, а саме включенням у склад охідних аліфатичного вуглецевого ланцюга. Це полегшує взаємодію іктиватор - мембрана клітини-мішєні. Існує думка, шр фіксація МДП :а носії викликає до того ж більш ефективну взаємодію з відповідни-и рецепторами клітини (Медведев А.Э. із співавт., 1990).

Таким чином, ЕПС-97, продігіозан, МДП та його синтетичні юхідні виявлять протективну дію при експериментальній стафілоко-:овій інфекції, яка пов'язана з підвищенням неспецифічної резис-'ентності організму - активацією фагоцитуючих клітин та ПКК «кільки, досліджувані препарати є ідукторами інтерферону II типу, і також стимулюють продукцію ФНП, як встановлено нами in vitro, южливо припустити, що їх захисна дія при стафілококовій інфекції іпосередковується за рахунок індукції ендогенного ІФН та ФНП. З ме-'ою підтвердження цього припущення нами був досліджений вплив ре-:омбінантних препаратів ШВгг та ФНП-а на експериментальну стафіло-юкову інфекцію. Раніше було показано (Співак М.Я.ІЗ співавт. ,1987; Іазаренко JLM. ,1991; Ганова JLO. ,1992 ), шр введення мишам препа-іатів гомологічного а-інтерферону (ІФН) підвищувало виживання тва-іин, інфікованих летальними дозами стафілококів, скорочувало строки ібереження та кількість стафілококів в організмі та стимулювало іункціональну активність фагоцитів.

Встановлено,що введення інфікованим Staph, aureus тваринам і-ІФН-у у дозах 10 МО; 100 МО та 500 МО не впливало на функціональ-іу активність макрофагів, а також на прискорення елімінації збудни-а з нирок мишей. Очевидно, це пов’язано з тим, що в препаратах фиродного походження можуть бути присутні і деякі монокіни, в пер-

ІНДЕКС ЦИТОТОКСИЧНОСП. % ІШЕКС СТИМУЛЯПІІ УМ.ОЛ.

9 '

в-'

7 - ІІІ

6- Ш

5- \й

4- Щл

з- ш.

2-

1 ■ яіі^ і

о- ' ■ І [ц- г цщ-1

« о*

І! Ь 11 II

я « 8 »

з

ЛОБИ

1 з

ЛОБИ

Рис. 2. ВПЛИВ ІМУНОМОДУЛЯТОРІВ БАКТЕРІАЛЬНОГО ПОХОДЖЕННЯ НА БАКТЕРИЦИДНУ АКТИВНІСТЬ МАКРОФАГІВ, ІНФІКОВАНИХ СТАФІЛОКОКОМ МИШЕЙ

к - тварини, яким не вводили препарати;

а) 1-продігіозан; 2- ЕПС;

б) 1-МДП; 2-/зС;Н/^уЩП; З-^зС/^Н^ІДП;

' 60 -

ЛОБИ

Рис. З ВПЛИВ ІМУНОМОДУЛЯТОРІВ БАКТЕРІАЛЬНОГО ПОХОДЖЕННЯ НА АКТИВНІСТЬ ПРИРОДНИХ КІЛЕРІВ ІНФІКОВАНИХ ТВАРИН 1 - інфіковані тварини, яким не вводили препарати; К - здорові тварини;

а) 2 -ЕПС-97; 3 - продігіозан

б) 2 - ^зСлН^МДП; 3 - /?С7Н,ДГ[П; 4 - МДП

іу чергу фактор некрозу пухлин, який діє з ним синергідно (Кузнецов І П. , 1989; Ершов Ф. И. , 1997).

Тому, нами було досліджено вплив препаратів р-ФНП-а та р-ІФН->-;а перебіг експериментальної стафілококової інфекції при сумісному іведенні. Встановлено, що цим препаратам притаманна синергідна дія. 'ак, синергідна дія р-ІФН-у та р-ФВП-а проявлялась у прискоренні ілімінації мікробів з організму тварин , а також в підвищенні функціональної активності макрофагів.

Припускається, що синергізм базується на можливості ІФН-г .ндукувати експресію рецепторів до ФШІ-а, які були знайдені на мак-юфагах (БоппепГеїсІ В., 1992).

Таким чином, виходячи з даних, отриманих в роботі захисна дія іактеріальних глікополімерів при стафілококовій інфекції опосередковується підвищенням функціональної активності фагоцитів, природ-іих клітин-кілерів, а також впливом на продукцію фактора некрозу іухлин. Виявлені імуномодулюючі властивості ЕПС-97, МДП та його :интегичних похідних дають змогу знайти широке застосування цих ірепаратів для профілактики та терапії бактеріальних інфекцій, встановлена синергідна антибактеріальна ефективність препаратів та р-ІФИ-г може бути врахована при удосконаленні схем вико-шстання цих препаратів в комплексній терапії при бактеріальних інфекцях.

ВИСНОВКИ

[. Вперше встановлено, до пригнічення неспецифічної резистентності )рганізму при стафілококовій інфекції пов’язане із зниженням функціональної активності фагоцитуючих клітин,природних кілерів, а також порушенням продукції основних протизапальних цитокінів.

І. Вперше встановлено, шр препарати бактеріального походження ’лікополімери 1?ЫгоЫшп Іедатіпозагит - ЕПС-97 та нові синтетичні зохідні МДП -^Н^МДП та^НзВДП, являються індукторами інтерферону [І типу, підвищують функціональну активність фагоцитуючих клітин та іриродних клітин-кілерів, а також впливають на продукцію фактора іекрозу пухлин.

В. Вперше показано, що глікополімер ШігоЬішп Іедатіпозагшп та нові :интезовані похідні МДП виявляють протективний ефект при стафілоко-совій інфекції, який опосередковується активацією функціональної іктивності фагоцитів, клітин-кілерів, а також впливом на продукцію рактора некрозу пухлин.

1. Встановлено, що комплексу препаратів р-ФЇЇП-а та р-ІФН-^ .притаманна синергідна протективна та імуномодулююча ефективність при

стафілококовій інфекції, яка зумовлюється активацією функціонально активності фагоцитуючих клітин.

Список наукових праць, опублікованих за тйиою дисертації.

1. Влияние тимуса на активацию интерфероном выработки фактора, по вышающего функциональное состояние макрофагов мышей //Иммунология. 1990.-N5.-С. 26-29. СФильчаков Ф. В., Фильчаков И. В., Ганов JL А., Грабченко Е И., Спивак ЕЯ.].

2. Синергидное действие рекомбинантных препаратов ^-интерферона фактора некроза опухоли на течение экспериментальной стафилококко вой инфекции // Антиб, и химиотер. -1994. -Т. 39, N 11. - - С. 42- 4 [Грабченко ЕИ. , Симонова А. А., Спивак ЕЯ., Парфенов ЕВ.].

3. Цитокины и невирусные инфекции // Мікробіол. журн. , -1995.-Т.5

N6. -С. 63-78 [Грабченко Е И., Зоценко В. Е , Спивак Е Я.]

4. Современные методы диагностики вирусных респираторных инфекций их терапии с использованием препаратов интерферона и его индукторо //Метод, реком., М3 Украіни.-К., 1994. 18 с. // [епівавт. Дяченк Е С., Співак М. Я., Тарасидшн JL 0. Михайлова Е. Г., та ін. ]

5. The induction of ^-interferon by bacterial lectins // Abstract

Vlll-th International congress of virology. Berlin,1990. P. 34

[епівавт. V. Ivanenko. , A. Karpov. , L. Lazarenko. , E. Kovalenko]

6. Бактериальные лектины - новые перспективные индукторы ^-интерфе рона // Тез. доп. Мат. роб. наради "Иммуномодуляторы природного про исхоадения". Владивосток. 1990. с. 52-53 Еспіавт. Коваленко Е. 0. Іваненко В. К., Кривохатська Л. Д., Гетьман Е. I].

7. Antibacterial effects of recombinant gamma interferon and tumo necrosis factor on experimental models of Staphylococcus an Salmonellosis infections// Journal of interferon research, V. 12 Supl. 1. 1992. [епівавт. Spivak N. Ya , Simonova A.]

8. Протекгивное действие иммуномодуляторов бактериального происхож дения при стафилококковой инфекции // Всесоюзна конф. Актуальны вопросы микробиологии, эпидемиологии и иммунологии инфекционных бо лезней. Сб. робіт, Харків,1993. 323с. Сспіавт. Косенко JL Е, Оле винська 3. М. , Ті мошок Е 0. ]

9. Сравнительное изучение иммуномодулирующих свойств различных бак териальных препаратов на модели стафилококковой инфекции у мьпцей /, Матеріали 1 установчого (V111) з'ізду УМТ (13-15 вер. 1993 р. , Оде са) [ спіавг. Олевинська 3. М., Андрейчук JL О. ]

Грабченко Н. І. їїротективна дія бактеріальних глікополімерів при стафілококовій інфекції. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних аук за спеціальністю 03. 00.07-мікробіологія - Національний медич-ий університет ім. акад. 0.0. Богомольця,Київ, 1998.

В дисертаційній роботі представлені результати дослідження ротективної дії бактеріальних глікополімерів при стафілококовій нфекції. Вперше встановлено, що протективна дія цих препаратів бумовлена прискоренням елімінації збудника з організму, активацією агоцитів, природних клітин-кілерів та впливом на продукцію ФНП. акож встановлена синергідна антибактеріальна ефективність р-ФШї-а і-ІФН-у при стафілококовій інфекції у мишей, яка опосередковується короченням строків очищення організма від збудника інфекції та іідвищенням фагоцитарної та бактерицидної активності макрофагів Ключові слова- стафілококова інфекція, бактеріальні гліко-юлімери, мурамоїлдипептид, цитокіни, імуномодулююча дія.

’рабченко Е И. Протективное действие бактериальных глікополімеров іри стафілококковой інфекции - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологичес-:их наук по специальности 03.00.07 - микробиология, Национальный іедицинский университет им. акад. А. А. Богомольца,Киев,1998

В диссертационной работе представлены результаты исследования іротективного действия бактериальных гликополимеров различного происхождения при стафилококковой инфекции. Впервые установлено, что гротективное действие этих препаратов обусловлено ускорением элими-гации возбудителя из организма, активацией фагоцитов, естественных теток-киллеров и влиянием на продукцию ФНО. Также установлена си-іергидная антибактериальная эффективность р-ФНО-а и р-ИФН -у при :тафилококковой инфекции у мышей, которая реализуется через сокращение сроков очищения организма от возбудителя и повышением фагоци-.’арной и бактерицидной активности макрофагов.

Ключевые слова: стафилококковая инфекция, бактериальные глико-голимеры, мурамилдипептид, цигокины, иммуномодулирующее действие.

ЗгаЬсЬепко N. I. Protect і v action of bacterial glycopolymeres under staphylococcus infection - Manuscript.

Thesis for a degree of Doctor of Phylosophy (PhD) in Biology"' special option - 03.00.07 - microbiology.

Acad. 0. 0. Bogomoletz National medical university,Kiev,1998.

The thesis contains the results on investigation of the

protective action of bacterial glycopolymeres of different origi: under staphylococcus infection. For the first time it wa established that protective action of these preparations i; conditioned by encreasing of staphylococcus elimination from th organism, activation of phagosytes system, natural cell-killers an influence on TNF production. Antibacterial efficiency of r-TNF -and r-lFN-y under mice staphylococcus infection is also determined that realizes through reducing date of organism purificatio against pathogene and encreasing of phagocytosis and bactericida activity.

Key words: staphylococcus infection, bacterial glycopolymers

muramildipeptid, cytokines, immunomodulating action