Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протеинкиназа-С-зависимый механизм ингибирования клеточной, пролиферации под действием фарнесола.

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Протеинкиназа-С-зависимый механизм ингибирования клеточной, пролиферации под действием фарнесола."

НАЦИОНАЛЬНА АТСАДЕМ¡Я НАУК YKPAÏHH 1нституг 6íoxímíI ím. O.B. Палладша

>. m» На правах рукопису

ЯЗЛОВИЦЬКА бвгешя Михайл1вна

ПРОТЕ1НКИГЛЗЛ-С-ЗАЛЕЖНИЙ МЕХА1ПЗМ 1НПБУВАННЯ КЛ1ТИШЮ1 ПРСШФЕРАЦЙ ШД ВПЛИВОМ ФАРНЕСОЛУ

03.00.04 - 6ioxiMiH

Автореферат дисертацп "на здобутгя наукового ступеня кандидата бюлопчних наук

Kjiîb 1997

Дисертац1ею е рукошс.

Роботу виконано в-лабораторЦ кМтинко! б!олог11 факультету м1кроб1олог11 та молекулярно! генетики Медичного центру Канзаського ун1верситету, США та у в1дд1л1 бюх1м11 м'яз1в 1нституту 61ох1м11 1ы.- 0. В. Паллад1на НАН Укра1ни.

Науков! кер!вники: доктор 61олог1чних наук, професор

Михайло Ддатрович Курський

професор м!кроб1олог11 - • Юр1й Мельннкович

0фЩ1йн1 опоненти: доктор б!олог1чних наук, професор

Зинов1й Дмитрович Воробець

доктор б!олоПчних наук, професор Микола Федорович Стародуб

Пров1дна орган!зац!я - Нац1ональний университет

1мен1 Тараса Шевченка

Захист В1дбудеться " 24 " берерня 1997 р. о 14 годин! на зас!данн1' спец1ал1зовано! вчено! рада Д 01.84.01 в 1нститут1 6ioxlfolI 1м.'\0.В. Паллад1на HAH Украгни за адрё-сою: 252601-МПС, КИ1В, йул. Миколи Леонтовича, 9.

ч3 дисертащею можна ознайошгися в б1бл!отец1 1нституту _j5ioxlMli iM. O.B.Паллад1на HAH Укра1ни.

Автореферат розлслано " 20 " литого 1997 р. Вчений секретар

спец1ал1зовано1 вчево! рада И

кандидат б1олог1чних наук //uJru^-f о. В. К1рсенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальн1сть теми.

1зопрено1ди - це ключов1 попередники синтезу холестерину de novo в кл1тинах тварин i людини. МетаболХзм 1зопреноШв коктролюеться багатостад1йним регуляторним механ!змом (Edwards, 1991). Досконала регуляц1я р1вня 1зопрено1д1в у кл1-тинах необх1дна тому, що ц1 сполуки в1д1грають важливу роль також у процесах кл1тинно1 пролхферацП. Так, якщо б1осинтез таких 1зопрено1д1в. як фарнесолп!рофосфат та зкеранилжеранолп!-рофосфат, заблоковано, синтез кл1тинно! ДНК 1. в1дпов1дно, кл1тинна прол1ферац1я припиняються (Chen. 1979). Цей ефект пов'язаний з посттрансляц1йною модиф!кац1ею ряду кл1тинних npoTeïHlB, яка полягаг в ковалентному приеднанн1 залишк1в фар-несолу та жеранилжеранолу до специф!чно1 С-к1нцево1 посл!дов-HOCTl пол1пептиду. Б1льш1сть з таких протеШв в1дноситься до G-6iflKlB - ключових молекул в процесах трансмембраннох переда-ч1 Штинних сигнал1в; пренилювання цих б1лк!в е необх!дною умовою ïxHboï участ1 в регуляцП кл!гиннох прол1ферацП (Faust and Krieger, 1987).

Фарнесилпротехнтрансфераза - фермент, що забезпечуе фар-несилювання протеШв, вимагае для катал!тичнох реакцП лише фосфорильований 1зопрено1д 1 не може використовувати нефосфо-рильовану форму - в1льний фарнесол (Lal et al., 1990). Але оск1льки. в тваринних кл1тинах в1льний фарнесол е продуктом метабол1чного перетворення фарнесолп!рофосфату (Das and Allen, 1991), то властивЮть фарнесолу 1нг1бувати р1ст кл1тин (Melnykovych et al, 1992; Chakrabarti and Engleman, 1991) св1дчить про його можливу участь в регуляцП процес1в кл1тин-hoï прол!фераШ. Однхею з перших спроб з'ясувати механ1зм 1н-Нбуючох д11 в1льного фарнесолу на pier кл1тин було припущен-ня, що в1н може д1яти як конкурентний 1нг1б1тор фарнесилпроте-хнтрансферази (Chakrabartl and Engleman, 1991). ПодальшРдос-л1дження, однак, показали, що механ1зм д11 фарнесолу б1льш складний 1 непрямий. Наприклад. з'ясовано, що в1льний фарнесол спричинюе прискорену деградац1ю г!дроксиметилглутарил-СоА-ре-дуктази, основного регуляторного ферменту синтезу холестерину та .1зопренохд1в (Correll et al., 1994). Це св!дчить про можли-в1сть участ! в1льного фарнесолу в регуляцП сигнальнох транс-

дукцИ. Незважаючи на-те, що 1нг1бування кл!тинно! прол!фера-ц11 фарнесолом та 1ншими в1льними 1зопрено!дами мае над!йне експериментальне Шдтвердзкення (Meigs et al., 1995; Ohizuml et al., 1995), механ1зм цього ефекту ще не з'ясоваш.

Мета 1 задач! досл!дження. Основна мета дано! робота по-лягала у вивченШ механ!зму 1нг1бування кл1тинно! прол!фера-ц11. спричиненого фарнесолом. Експерименгальна стратег1я робота спиралася на висунуту нами Ппотезу про вплив фарнесолу на кл1тинну прол!ферац!ю .. внасл!док. 1нг1бування протешина-за-С-залежно! системи трансдукцП кл1тинних сигнал1в. Для пе-рев1рки ц1е! г1потези ми поставили перед собою так! задач1:

1. Вивчиги к1льк!сн1 та як!сн! особливост! ефекту фарнесолу на р!ст га шгтездагн!сть р!зних кл!тинних культур; виз-начити можливий зв'язок смерт1 кл!тин, спричинено! фарнесолом. з трансдукц!ею сигнал!в га регульованою смерти кл!тин.

2. ДослШти вплив фарнесолу на метабол1чн! шляхи синтезу фосфол!п1дних посередник!в проте!нк!наза-С-залежно! трансдук-ц!! сигнал!в.

3. Вивчити вплив фарнесолу на регуляц!ю активност1 проте-!нк!нази-С (ПКС).

Наукова новизна робота. Робота е першим систематичним досл!дженням по з'ясуванню механ1зму вдтотоксично! д1! в1льних 1зопрено!д1в на приклад! фарнесолу. В робот! вперше показано, що цей механ1зм включае 1нг!бування синтезу вторинних посеред-ник!в ПКС-залешо! трансдукцП сигнал!в 1 вибуваеться через 1н1ц!ац1ю генегично запрограмованого механ!зму регульовано! смерт! кл!тин - апоптозису. На п!дстав! отриманих даних залро-поновано механ!зм регуляц!! кл!тинно! прол!ферац!!, основою якого е фосфорилювання - дефосфорилювання 1зопрено1д1в.

В робот1 вперше встановлено, що !нг!буючий вплив фарнесолу на р!ст та життездатн1сть ракових кл!тин е значно сильнИне виявленим пор!вняно з клатинами не ракового походження.

Практична ц!нн!сть робоги. Одержан! результата розшрюють уявлення про зв'язок попередник!в синтезу холестерину з проде-сами регульовано! смерг! кл!гин.

Результата робота можуть бути теоретичною передумовою для використання фарнесолу в антираков1й Tepanii.

Апробаи!я робота. Основн! результата робота допов!дались

на 12-му М1жнародному симпоз!ум1 з глюкокон'югат!в (Закопане,

1993); щор1чних симпоз1умах Американського товариства з рако-вих досл1джень (Сан Франциско. 1994; Торонто, 1995); коферен-Ц11 Американського 1нстигуту ракових досл!джень (Вашингтон,

1994); науковому сем!нар1 1нституту 61ox1mîï 1м. О.В. Паллад!-на HAH Укра1ни (Ки1в, 1996).

Публ1капП. За матер1алами дисертацП опубл1ковано 7 дру-кованих праць.

Об'ем I структура дисертацП. Дисертап1йну роботу викла-дено на 120 стор1нках машинописного тексту. Бона складаеться з1 вступу. огляду л1тератури та експериментально! частини, яка м1стить опис матер1ал1в та метод!в досл1джень, викладення одержаних результат1в та 1хне обговорення, заключения, виснов-ки та список цитовано! л1тератури. що включае 162 найменуван-ня. Робота м1стить 10 таблиць та 1люстрована 23 рисунками.

МАТЕРIАЛИ ТА МЕГОДИ Д0СЛ1ДЖЕННЯ.

В робоП були використан! культури кл1тин гостро! лейке-Mlï людини СЕМ-С1 та СЕМ-С7, карциноми шийки матки людини С-4-1, ф!бробласти шйри людини CF-3, ендотел1альн1 кл!тини аорти бика ВАС та аорти свин1 РАС, культура кл1тин нормально! простати людини D.S., пром1елоцитн1 лейкем1чн1 кл!тини людини HL-60, еп1тело1дн1 кл1тини карциноми шийки матки людини HeLa S3K, кл1тини карциноми простата людини DU-145, кл1тини мишачо! л1мфоми L5178Y-R (канцерогенн1) та L5178Y-S (неканцерогенн!). Суспензован! кл!тини СЕМ-С1, СЕМ-С7 та HL-60 вирощували в се-редовищ1 RPMI 1640 з 10 % 1нактивовано1 телячо! сироватки (FBS). MoHOiuapOBl кл1тани С-4-1, CF-3, HeLa S3K, ВАС. РАС. DU-145 та D.S.' вирощували в середовищ! DMEM з 10 % FBS. L5178Y-R та L5178Y-S вирощували у середовищ1 Fisher з 10 % ко-нячо! сироватки (HS). Bel поживн1_середовища м1стили пен1цил1н (100 од./мл) та стрептом1вдн (100 мг/мл). За 24 години до початку експерименпв кл1тши переносили в середовище Iscove's, яке не м1стило сироватки. Фарнесол та його аналоги додавали у вигляд1 етанольного розчину безпосередньо в поживне середовище.

Суспензован! кл1тини рахували за допомогою Coulter Counter Model В. К1льк1сть моношарових кл1тин визначали. вим1-

рюючи концентрате протешу в кл!тинному л!зат! за методом Ло-ypi, використовуючи за стандарт БСА. Для визначення життездат-HicTi кл1тин використовували метод флуоресцентно! м1кроскопП Jones i Senft (1985) з власними модиф1каЩями (Haug et al.. 1994). Життездатность СЕМ-С1 кл!тин також визначали за допомо-гою цитофлуориметра EPICS 752 п1сля фарбування розчином 1одида пропШя (10 мг/мл) 1 д!оцетата флуоресце!ну (5xlO"7 М).

Для вивчення метабол!чних перегворень фосфатйдйлхолшу (ФХ) рад!о!зотопними методами кл!тини СЕМ-С1 1нкубували на протяз! 2 годин з фарнесолом (20 мкМ) та 1 години з хлоридом [метил-3Н] -хол!ну або [3Н]-м1риствдною кислотою. Шсля шкуба-цП кл1тини пропивали холодним розчином 0.85 % NaCl з нем1че-ними хлоридом хол1ну або м!рйстидною кислотою (1 мМ).

Л1п1ди екстрагували за методом Bligh i Dyer (1959). В експериментах з м1ченим хлоридом хол!ну орган1чн1 фази експе-риментальних зразк1в висушували у струм1 азоту, алiквота в1д-бирали для визначення сумарно! рад1оактивност1 на сцинциляц1й-ному л1чильнику Packard 2200 CA. Залишок орган1чно! фази роз-чиняли в 30 мкл хлороформу з нем1ченим ФХ та наносили на пластинки для тонкошарово! хроматограф!I. вкрит1 сшпкагелем-G, як1 розганяли в систем! хлороформ/метанол/вода (27:12:2 -v/v/v). В експериментах з м!ченою м1рйстидною кислотою для визначення sn-1.2-д1ацилгл!церолу (ДАГ) зразки орган1чно1 фази наносили на пластинки для тонкошарово! хроматограф!I, вкрит1 сил1кагелем-60, розганяли в систем! гексан/д1етиловий еф!р/формова кислота (90 %) (60:40:1). Для визначення фосфа-тидно! кислота та фосфатидалетанолу використовували систему етйлоцетат/1зооктан/оцтова кислота/вода (65:10:15:50). Зразки водяно! фази заморожували, висушували на л!эф1льн!й сушарт та розчиняли в метанол! (50 %), який м1стив в co6i нем!чен1 хлорид хол1ну. фосфохолш та хол1нцитидилдифосфат (ЦДФ-хол1н)_____

Зразки наносили на пластинки для тонкошарово! хроматограф!i, вкрит1 силшагелем-С], та розганяли в систем! оцетат амон1я (1 М, pH 5.0)/етанол (95 %) (3:7). JliniflHi плями проявляли в парах йоду, зчищали та вим1рювали 1хню рад1оактивн!сть на сцин-циляц1йному л1чильнику.

Для визначення ДАГ з штин, !нкубованих з фарнесолом (20 мкМ), лШди екстрагували за методом Bligfi i Dyer (1959). ДАГ

визначали за допомогою Assay Reagent System (Amersham). Основою методу е реактя перегворення ДАГ у [32Р]-фосфотидну кислоту в присутност! [у-32РШФ та ДАГ-к1нази. [32Р]-Фосфотидна кислота визначалася за допомогою тонкошарово! хроматограф!I. Пластинки, вкрит! сил1кагелем-С, розганяли в систем! хлороформ/метан о л/оцтова кислота (13:3:1), використовуючи за стандарт нем!чену фосфогидну кислоту.

Активность хол!нфосфатцитшшлтрансферази (XT) вим1рювали за методом Sleight i Kent (1980) в 20 мМ трис/сукцинат буфер! (рН 7.8), який mícthb 6 мМ MgCl2, 8 мМ ЦТФ, 4 мМ [14С]-фосфо-хол1н (0.4 Ci/M) та 0 - 80 мкг проте!ну. К1льк!сть м1чених ЦДФ-хол1ну га фосфохол1ну визначали за допомогою сцинциляц!й-ного л!чильника п!сля тонкошарово! хроматограф!i, як описано вще.

Активн!сть хол1нфосфотрансферази (ЦФТ) вим1рювали за методом Sleight 1 Kent (1980) в 175 Mil трис/HCl буфер! (рН 8.5), який mlстив 8 мМ MgCl2> 0.5 MM EGTA, 1 мг/мл БСА ! 2 мМ ДАГ В 0.1% розчин! таурохолагу, 0.1 мМ [14С]-ЦДФ-хол1н та 0 - 25 мкг проте!ну. Шсля розд!лення фаз рад1оактивн1сть орган!чно! фази вим1рювали на сцинцйляШйному л!чильнику.

Для визначення ПКС за допомогою Вестерн блоту кл!тини л1-Hiñ CF-3 1 HeLaS3K !нкубували з фарнесолом (20 мкМ) i/або РМА (200 нМ) та збирали. зчищаючи в холодному л1зуючому буфер! (25 мМ трис-HCl (рН 7.5) 3 2 мМ ЕДТА, 0.5 мМ ЕГТА, 1 M дитЮт-ре!толом (ДТТ), 20 мкг/мл лейпептином, 20 мкг/мл апротен1ном, 1 мМ пол1метилсульфон1лфлуоридом). 3i6paHi кл1тини гомоген1зу-вали на криз! в гомоген!затор1 Даунса (30 шшпв). Гомогенати центрифугували 30 хвилин (100.000 g); отриман1 супернатанти (цитозольн! фракцП) збирали. Осади ресуспендували в 1 мл л1-зуючого буферу з тритоном Х-100 (1 %), додатково ресуспендували за допомогою ультразвукового диспергатора та центрифугували 30 хвилин (100.ООО g); отриман! супернатанти (м1кросомальн! фракци) збирали. Концентраци проте!н1в у зразках визначали за допомогою методу ВСА, використовуючи за стандарт БСА. Про-те!н (50 мкг) з kojkhoï фракци наносили на град1ентний 4-20 % 303-пол1акрилам1дний гель. Електрофорез проводили за методом Леммл1 при денатуруючих умовах. Шсля електрофорезу б1лки

електрофоретично переносили з гелю на н!троцелюлозну мембрану.

7

Мембрану блокували в розчинх нежирного сухого молока (0.1 %) з TbIhom 20 (0.1 %) протягом ноч1. Мембрану 1нкубували з мишачи-ми моноклональними анти-ПКС антит!лами МС-5 та козячим антими-шачим 1муноглобул1ном, кон'югованим з пероксидазою. Мембрану проявляли хем!люм1несцетним реагентом.

Еид1лення ДНК проводили за методом Compton 1 Cidlowski (1986). До ыйтин, з!браних п1сля гнжубацИ з фарнесолом (20 мкМ), додавали 1 мл розчину протехнази К (1 мг/мл) в 10 мМ трис-HCl буфер! (рН 7.5) з 150 мМ НаС1, 10 мМ ЕДТА. 0.4 % SDS та 1нкубували 30 хвилин при 65°С i додатково 16 годин при 37°С на качалць ДНК вид1ляли екстрагуванням в сум1ш1 хлороформ/фе-нол/1зоам1ловий спирт (25:25:1), очищали в д1етиловому еф1р1, насиченому водою, та д1ал1зували при 0° С проти 10 мМ трис-HCl буферу (рН 7.5) з 1 мМ ЕДТА. П1сля д1ал1зу до зразк1в додавали розчин РНКази (10 мг/мл), виьнох в1д ДНКази, та 1нкубували 5 годин при 37е С. Фенольно-хлороформну екстрактю ДНК повторюва-ли. КонцентраЩю та чистоту ДНК визначали за допомогою спектрофотометра. 25 мкг ДНК кожного зразка наносили на 1.8 % ага-розний гель, до складу котрого входив бром1д етид1ю (0.4 мкг/мл). Фрагментовану ДНК з довжинсю фрагмент1в, кратною 123 пар основ, використовували за стандарт. Гель фотографували в ультраф1олетових променях.

Для цитофлуориметрп ДНК фарбували розчином 1одиду nponi-д1я, ^поперед ф1ксуючи кл1тини 10 хвилин в етанол! при 0еС. Ф1ксован1 кл1тини осадаували центрифугуванням, ф1ксуючий розчин злиевли 1 кл1тини фарбували в розчин1 цитрату натрхю (1 мг/мл) з 0.3 % NP40 та 0.02 мг/мл РНКази. Ф1ксован1 та пофар-бованх ядра аналхзували в цитофлуориметр1 EPICS 752. обладна-ному аргоновим лазером. Довжина хвнп! збуджуючого випремхню-вання була 488 нм. ЕмШю в1д пофарбованих ядер вим1рювали в пром1жку в1д 615 до 645 нм_

РЕЗУЛЬТАТ« I ОБГОВОРЕННЯ.\

На першому етаШ наших досл1джень ми пЬказали, що фарне-сол пригн!чуе р1ст та життездатн1сть р1зних тип1в кл1тин. В семи ракових культурах кл1тин та п'яти неракових 10-45 мкМ фарнесол 1нг1бував р1ст кл1тан та викликав ххню смерть на про-тяз1 24-72 годин 1нкубацхх. При цьому вплив фарнесолу на рако-

в1 кл1тини був значно сильн!ше, як пор!вняти з нормальними кл!тинами. Так, експерименти з нераковими (СР-З 1 РАС) та не-опластичними Штанами (НеЬа 1 С-4-1) св1дчили про достов1рну р1зницю в чутливост1 цих кл!тинних л!н1й до фарнесолу п!сля 72 годин 1нкубац11 (Рис. 1). Д1 дан1 також узгоджуються 1з впли-вом фарнесолу на життездатн1сть кд1тин СЕМ-С1, вим!ряну за до-помогою р1зних методДв (Табл. 1).

! 10

120

100

Рис. 1. Вплив фарнесолу в р1зних концентра-ц1ях на р1ст кл1-тин П1СЛЯ 72 годин 1нкубац11. О - СР-З; О - РАС;

НеЬа; 7- С-4-1

0,5 10 15 20 25 50

Концентрац1я фарнесолу, мкМ ТаблИЦЯ 1

Вплив фарнесолу на к1ль:<1сть 1 жигтездагн!сть кл1тин СЕМ-С1 в залежност! в1д його концентрацП

Зразок К1льк1сть КЛ1ТИН Життездатн1сть кл1тин

Вс1 кл1ти-ни, % Кл1тини норм. розм1ру, % М1кроскоп1я, % живих, М+ш Цитофлуориметр1я, % живих, М+т

Контроль 100 95 94.2+1. .4 94. 2+0.7

Фарнесол

10 /Ш 88 93 94.5+1. .7 93. 4+1.4

20 рМ 71 87 91.5+3. .0 92. 8+1.3

22 )М 72 89 89.0+3. 6 92. 2+1.6

25 ¡¡М 69 85 84.0+8. 1 89. 3+1.5

29 рМ 5 35 9. 0+3. 2 6. 8+2.3

30 рМ 1 18 0. 6+0. 8 0. 7+0.7

Така р!зниця у виявленш токсичност1 фарнесолу може бути пов'-язана з р!зною швидк1стю метабол!зму в ракових та норыальних кл1тинах. В1домо, що б!лыи активнЗ. метабол1чно~раков1 кл1тини також б1льш чутлив1 до будь-яких порушень метабол!чних проце-cíb. Таким чином, отриман! результата св1дчать за те, що меха-н1зм токсичного впливу фарнесолу виявляеться на piBHi кл1тин-ного метабол1зму.

Подалыв! эксперимента проводили, в основному, на ракових кл!тинах двох л1н!й - СЕМ-С1 та HeLa S3K.

Електрофорез ДНК. вщцлено! з клшш СЕМ-С1. 1нкубованих з фарнесолом, виявив Ha6ip полос, характерний для м1жнуклео-comhoí фрагментацП - апоптозису, який е ознакою регульовано! смерт! кл1тин (Рис. 2). Под1бн1 результата були також огриман! за допомогою цитофлуориметр1i (Рис. За, Ь). Вони свадчать про те. що механ1зм викликано! фарнесолом смерт1 кл1тин складае низку метаболачних процесав, як1 вмикають генетично запрогра-мований механ1зм апоптозису.

I 2 3 4 5 6 7

Рис. 2. Агарозний гель-електрофорез ДНК з :-:л:тин CEM-Ci. 2, 7 - контроль (24, 48 гол.); 2, 4.-29 мк1-: фар-несол (24, 48 гсд.;; 5 - зс мкг/мл $>: (24 гон.;; 6-29 мкЫ фаркесол з 30 мкг/мл ФХ Í24 гон. )

о а с.

о >>

20 « 60 80 100 120 1ВД 160

20 60 80 100 120 1£+0 160 Винсска флусре:ц=г:и;л

20 ад 60 60 100 120 140 160

Рис. 3. Цитофлуориметричний анал1з ДНК з кл1тин СЕМ-С1. Контроль^ клхтини (а), кл1ти-ни 1нкубован1 з 29 мкМ фарнесолом (Ь) або з 29 мкМ фарнесолом та 30 мкг/мл ФХ (с) на протяз! 24 годин

В попереднхх дослШеннях (Ме1пукоуусЬ ег а1., 1992) було показано, що найбиьш значним ефектом фарнесолу на метабол1зм кл!тин е його зплив на синтез Л1п1д1в. зокреиа, фосфатидилхо-л1ну та д1ацилгл1церолу. Спираючись на ц1 дан1 ми показали, що з найбьчьш пошрених кл1тикних лшШв лише ФХ та ДАГ здатн1 блокувати 1нг1буючу д!ю фарнесолу на р1ст кл1тин СЕМ-С1 (Рис. 4). Як в1домо, ДАГ е метабол1чнпм продуктом ФХ. Таким чином, це п1дтверджуе наш! припущення про те, що механ1зм цитотоксич-ност1 фарнесолу полягяе у його дП на синтез та деградащю ФХ. Це також тдтверджуеться одержаними нами даними про здатн1сть

ФХ блокувати апоптичну фрагментац!» ДНК (Рис. 2, Зс).

И

КонцентраШя речовин. икг/ш Рис. 4. Вплив разних фосфол!п1д1в та ДАГ на picT кл1тин СЕМ-С1 Шсля 48 годин 1нкубування з 20 мкМ фар-несолом. О - ФХ;© - ДАГ; V- кардЮлИпн; у- фос-фатщщлсерин;й - фосфатадилетанол

Основним джерелом ФХ в кл1тинних культурах с метабол1чний шлях його синтезу з холшу, так званий шлях Кеннед1 (Kennedy and Weiss, 1955). Наш! эксперимента з використанням радШзо-топних методов показали, що 20 мкМ фарнесол 1нг1буе синтез ФХ по шляху Кеннед1 на piBHi ферменту холшфосфотрансферази через 30-60 хвилин в1д початку 1нкубац11 (Рис. 5). Таке 1нг1бування в1дбувалося опосередковано 1 вимагало присутност! 1ндукованого фарнесолом термостаб1льного низькомолекулярного цитозольного компоненту.

Фарнесол також 1нпбуе деградацИо кл!тинного ФХ 1, в1дпо-в1дно, -эшжуе синтез ДАГ. Дань одержан! в цих експериментах i представлен! на Рис. 6. свШать про те, що основн! фермента. як1 забезпечують деградацш ФХ, фосфолШаза С (ФЛС) та фосфо-л1паза D (ФЛО), гнПбуються в присутност! фарнесолу. При цьому активн1сть ФЛС знижуеться приблизно через 1 годину Шсля дода-вання фарнесолу до о!тш; зниження активност1 ФЛВ потребуе подовжено! 1нкубац11 - приблизно 2 години. Таким чином, iHri-бування фарнесолом грьох ферментов - ЦФТ, ФЛС та ФЛ0 - призво-

XOJll н

Фосфохол1н

ЦДФ-ХОЛ1Н

ФХ

Рис. 5. Вплив фарнесолу на м!чення ФХ та попередник1в йо-го синтезу.О - контроль,© - 20 мкМ фарнесол

дить в результат! до зниження синтезу ДАГ. Сл!д в!дзначити. що загальний ви!ст ФХ в кл!тинах на протяз! всього часу 1нкубац!1 з фарнесолом не зм1нювався. Це св1дчить про те. що зниження синтезу РС п1д впливом фарнесолу' мае регуляторне значения 1 таке зниження не впливае на структурну ц1л1сн!сть кл!тинних мембран.

Як було згадано вище, екзогенний ФХ здатен блокувати !н-г!буючу д!ю фарнесолу на р!ст кл1тин. Однак, така д1я ФХ проявляемся лише, якщо його додавати до клхтин протягом перших 60 хвилин шкубацп з фарнесолом, тобто до того моменту, коли спостер1гаеться пом!тне 1нг!бування б1осинтезу ФХ (Рис. 7). Таким чином, зниження синтезу ФХ та ДАГ вмикае процес, котрий не може бути зупинений простим п1дви1денням р!вня цих л1п1д!в в кл1тинах. Ми показали, що таким процесом е 1нг1бування актив-

ност! ПКС. ГПсля того, як синтез ДАГ - ф!з1олог!чного актива-

13

Рис. 6. Вплив фарнесолу на м1чення ДАГ (а), фосфатидно!

кислоти (Ь). фосфохол!ну (с) та хол1ну (<3) в кл1тинах СЕМ-С1, пре!нкубованих з [3Н]-м!ристид-ков кислотою (а, Ь) або [3Н]-хол1ном (с, <1). О - контроль,© - 20 мкМ фарнесол

тора ПКС - знижуеться, а та 5 1зоформи ферменту переходять з

мембранозв'язано!, активно!, форми в цитозольну, неактивну

(Рис. 8). В1домо, що така 1нактивац1я ПКС здатна 1н1Щювати

фрагменташю ДНК 1 веде до апоптозиснох смерт! кл!тин

(Еа1с1еП а1., 1993; БапсЬег-Маг^а!^ ег а1., 1993).

14

Рис. 7. Короткочасна д1я фарнесолу на р1ст клгтин СЕМ-С1. □ - без фарнесолу та без ФХ;о- 29 мкМ фарнесол, без ФХ;га- 29 мкМ фарнесол та 30 мкг/мл ФХ

—; '¿-г: — 30 кйа

2 3 4 5 6 7 8

Рис. 8. Вплив 20 мкМ фарнесолу на розпод1л ПКС м1ж цито-зольною (непарн1 лШ1) та м1кросомальною (пар-Н1 лшШ фракциями кл1тин НеЬа БЗК. 1, 2 - контроль (24 години); 3, 4 - 20 мкМ фарнесол (1 година); 7, 8 - 200 нМ РМА (30 хливин); 5, 6 -

20 мкМ фарнесол та 200 нМ РМА (30 хвилин) 15

Узагальнюючи огриман1 нами дан1. можна запропонувати та-кий механ!зм !ндуковано! фарнесолом кл1тинно! смерт1. Л1по-ф!льний фарнесол в1дносно легко проходить через плазматичну мембрану ктитини 1 приблизно через 30-60 хвилин п1сля початку !нкубацП знижуюе активн1сть ферменту ЦФТ, !нг!буючи таким чином синтез ФХ. Через 60-120 хвилин п1сля додавання до кл1тин фарнесол також знижуе активн1сть ФЛС та ФЛБ, як1 забезпечують деградац1ю ФХ. 1нг1бування акгивност! цих трьох ензим1в приз-водить до зниження синтезу ДАТ 1 дал! - до 1нактивац!1 ПКС. Це, в свою чергу, 1н1ц1юе !нтернуклеосомну фрагментац!ю ДНК та смерть кл!тин через апоптозис. Схема цього механ!зму представлена на Рис. 9.

ЭОВН1ИЬОЫ1ТЯНШ1Я

сигнал

I

Мембранния рецептор

в-б1лок *---Фарнесол-РР —----Ацетил-СоА

гмг-СсА

релуктаза

ч-

+

фдс <---ФАРНЕСОЛ---1

Фосфо-

ЦДф-Х0Л1нч-Х0Л1К -«- Хол1н

|флр <__

ЛАГ-»—ФХ

4-

ПКС____К1назник___Решт1кащ.я

каскад

ДНК

Рис. 9. Регуляторна роль фарнесолу в ПКС-залеяаий

трансдукцП кл1тинних сигнал!в 16

Недавно було показано, що в1льний фарнесол прискорюе дег-радац!ю ГМГ-СоА-редуктази - ключового ферменту мевалонатного шляху синтезу фосфорильованих 1зопреноШв (СоггеИ ег а1., 1994). Разом з запропонованим в ц!й робот1 механ1змом цитоток-сичност! фарнесолу ц1 два процеси можуть забезпечувати регуля-ц1ю кл1тинно1 прол1ферац11 та кл1тинно! смерт: на р1вн1 фосфо-рилювання - дефосфорилювання фарнесолу. Насправд!, прискорене дефосфорилювання фарнесслп1рофосфату та наксгачення в1лького фарнесолу буде не т1льки 1н1ц1ювати кл1тинну смерть, але також зупиняти прол1ферац1ю кл1тин. зменшувчи концентращю фарнесол-п!рофосфату, необх!дного для забезпечення сигнально! трансдук-цП. Навпаки, накопичення фарнесолп1рофосфату буде не т1льки зменшувати концентрац1ю цитотоксичного фарнесолу. а й забезпечувати пренилювання С-б1лк1в. стимулюючи, таким чином, залежну в1д ростових фактор!в прол1ферац!ю клотин. Можна припустити, що под!бний механ1зм включас не т1льки в1льний фарнесол та фарнесолп1рофосфаг, а й 1ни1 1зопрено1ди. У зв'язку з цим зас-луговус на увагу нещодавне пов1домлення про цитотоксичн1сть в1льного жеранилжеранолу (ОМгилИ е1 а!.. 1995).

ВИСНОВКИ.

1. Фарнесол !нг!буе рост та знижуе життездатн1сть 12 ви-користованих в робот! культур кл1тин. Цей ефект особливо вира-жений щодо ракових культур: кл1тин гостро! лейкемп людини СЕМ-С1 та СЕМ-С7, карциноми шийки матки людини С-4-1, пром1е-лоцитних лейкем!чних кл!тин людини Н1-60, еп1тело!дних кл!тин карциноми шийки матки людини НеЬа 53К, кл!тин карцином простата людини ои-145, кл1тин мишачо: л1мфоми Ь5178У-Р (канцероген-них). Культури кл1тин неракового походження - ф1бробласти шк1-ри людини СГ-З, ендотел1альн1 юитини аорти бика ВАС та аорта свин1 РАС, кл1тини нормально! простата людини П.Б., кл!тини мишачо! л!мфоми Ь5178У-5 (неканцерогенн!) - виявили меншу чут-лив!ть до токсичност1 фарнесолу.

2. Найб1льш ранн1м метабол!чним ефектом фарнесолу (30-60 хвилин) е зниження швидкост! б1осинтезу истинного фосфатйдйл-холдну за рахунок !нг1бування активност! ферменту хол1нфосфот-рансферази. Це 1нг1бування в1дбуваеться опосередковано через метабол1т фарнесолу або активований ним посередник, котрий на-

количуеться в цитозол1.

3. Фарнесол знижуе швидкЮть деградацП фосфатидйлхолшу, 1нг1буючи фосфол1пазу С через 1 годину теля додавання до культури кл!тин. фосфол1паза D також 1нПбуеться фарнесолом. але пЮля б1лыи тривало! мкубацН - б1ля 2 годин. Така д1я фарнесолу приводить до пом!тного зниження синтезу ДАГ - вто-ринного посередника та Ф1з1олог1чного активатора ПКС.

4. Фарнесол стимулюе перех!д ПКС з II активно!, мембра-нозв'язано! форми в неактивну, цитозольну форму.

5. Ц1 метабол!чн1 ефекти фарнесолу призводять до м1жнук-леосомно! фрагментацП ДНК та кл!тинно! смерт1 через апоптозис.

СПИСОК Р0Б1Т, ОПУБЛ1КОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦП.

1. G. Melnykovych, P. A. Voziyan, J.S. Haug, Ch.M. Goldner. E.M. Yazlovitskaya. Effect of farnesol on growth and phospsholipid biosynthesis in CEM-C1 line of human acute lymphoblastic leukemia //Abstracts of the Satellite Meeting to the 12th International Symposium on Glucoconjugates.-Zakopane,

1993. - P. 53.

2. P. A. Voziyan. J.S. Haug. E.M. Yazlovitskaya, I. Adany. G. Melnykovych. Farnesol induces apoptosis in cultured cells: comparison of neoplastic and non-neoplastic cells // Proceedings of the American Association for Cancer Research. V. 35 - San Francisco. CA, 1994.- P. 1.

3. J.S. Haug, Ch.M. Goldner, E.M. Yazlovitskaya, P.A. Voziyan, G. Melnykovych. Directed cell killing (apoptosis) in human lymphoblastoid cells incubated in presence of farnesol: effect of phosphatidylcholine // Biochim. Biophys. Acta -

1994.- 1223 - P. 133-140.

4. I. Adany, E.M. Yazlovitskaya, J.S. Haug. P. A. Voziyan, G. Melnykovych. Differences in sensitivity .to. farnesol toxicity between neoplastically and non-neoplastically-derived cells in culture // Cancer Lett. - 1994.- 79.- P. 175-179.

5. G. Melnykovych, P.A. Voziyan, J.S. Haug, E.M. Yazlovitskaya. Mechanism of farnesol-induced apoptotic cell death may involve PKC-dependent signal transduction pathway // Proceedings of the American Association for Cancer Research, V. 36 - Toronto, Ontario. 1995.- P. 4.

6. E.M. Yazlovitskaya, G. Melnykovych. Toxic effect of farnesol on cell viability is preceded 'by inhibition of protein Kinase С (PKC) ■ activity: differences between neoplastic HeLaS3K cells and non-neoplastic CF-3 cells /Diet and cancer. Molecular mechanisms of interactions. - Plenum Press, New York and London. 1995.- P. 199.

7. E.M. Yazlovitskaya, G. Melnykovych, Selective farnesol toxicity and translocation of protein kinase С in neoplastic HeLaSSK and non-neoplastlc CF-3 cells // Cancer Lett. - 1995.88. - P. 179-183.

Язловицкая E.M. Протеинкиназа-С-зависимый механизм инги-бйрования клеточной, пролиферации под действием фарнесола. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины. Киев. 1996.

В диссертационной работе рассмотрен механизм действия изопреноида фарнесолана различные линии клеток. Показано, что фарнесол ингибирует рост и снижает жизнеспособность клеток; этот эффект особенно проявляется в раковых клетках. Наиболее ранним метаболическим действием фарнесола является снижение скорости биосинтеза клеточного фосфатидилхолина за счет инги-бирования холинфосфотрансферазы. Фарне,сол также уменьшает скорость деградации фосфатидилхолина, последовательно ингибируя .фосфолипазу С и фосфолипазу D, что приводит к снижению синтеза диацилглицерола - активатора протеинкиназы-С. Протеинкиназа-С переходит из активной, мембраносвязанной- формы в неактивную, цитозольную. Такое дейстие фарнесола на метаболизм клетки приводит к межнуклеосомной фрагментации ДНК и клеточной смерти -апо'птозису.

Yazlovitskaya E.M. Protein kinase C-dependent mechanism of inhibition of cellular proliferation by farnesol. The dissertation Thesis for Obtaining a scientific Degree of Phylosophy Doctor (Biology) in the Speciality 03.00.04 -Biochemistry. Palladin Institute of Biochemistry of National

■Academy of Science of Ukraine, Kyiv. 1997.'

19

The dissertation deals with the mechanism of farnesol induced inhibition of cell growth and proliferation. This effect Is more pronounced in neoplastic cells. The early effect of farnesol on cell metabolism is the inhibition of phosphatidylcholine biosynthesis by decreasing cholinephospho-transferase activity. Farnesol also inhibits phosphatidylcholine degradation by consecutively decreasing phospholipase С and phospholipase С activity. This leads to reduced level of diacylglycerol, activator of protein kinase C- Protein kinase С changes from active membrane-bound form to inactive cytoso-lic form. These metabolic effects of farnesol cause internuc-leosomal fragmentation of DMA' and cellular death through apoptosis.

Ключов! слова: фарнесол, культури клШн, токсичн1сть фарнесолу, б1осинтез та деградатя фосфатйдилхолшу, вторинн1 пэсередники, трансдуктя сигнал1в. фосфолШаза С та D. проте-1нк1наза-С. апоптозис.

Подписано до друку 12.02.97 Формат 60x84/16. Ilanip друк. Офсетний друк. Ум.фар6ов1д6. 6. Ум.друк.арк.1,16. Обл.-вид. арк. 1,25. Тираж 100 прим. Замовлення № 15-6. Цша Вид. № 24/1V.

Видавництво КМУДА

252058. Киш-58, проспект Космонавта Комарова,!.