Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пространственные и временные характеристики экспрессии генов, кодирующих регуляторные факторы TGFbeta2, PITX2 и FOXC1, в тканях глаза человека в ходе пренатального развития

ВАК РФ 03.00.30, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Пространственные и временные характеристики экспрессии генов, кодирующих регуляторные факторы TGFbeta2, PITX2 и FOXC1, в тканях глаза человека в ходе пренатального развития"

На правах рукописи

ФИРСОВА НАТАЛЬЯ ВИКТОРОВНА

ПРОСТРАНСТВЕННЫЕ И ВРЕМЕННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ РЕГУЛЯТОРНЫЕ ФАКТОРЫ ТСРЬе1а2, Р1ТХ2 И ЕОХС1, В ТКАНЯХ ГЛАЗА ЧЕЛОВЕКА В ХОДЕ ПРЕНАТАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ

03.00.30 -эмбриология, биология развития 03.00.15-генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

003458917

Работа выполнена в лаборатории молекулярно-генетических механизмов онтогенеза Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук ЗИНОВЬЕВА Рина Дмитриевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук СТРОЕВА Ольга Георгиевна

доктор биологических наук ЖУКОВА Ольга Владимировна

Ведущая организация: кафедра эмбриологии биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Защита диссертации состоится оЪи&лрЛг 2009г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 002.238.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26). Сайт: http://idbras.comcor.ru/indexr.htm. email: idbras@bk.ru.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Автореферат разослан «/5"»2008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук ele0806@mail.ru

Абрамова Е.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение экспрессии регуляторных генов, их дифференциальной активности в ходе развития организма, участие в дифференцировке клеток различного типа представляет собой одно из центральных направлений современной биологии, находящееся на стыке молекулярной генетики и биологии развития. Глаз является уникальной модельной системой для исследования молекулярно-генетических механизмов эмбриональной индукции, пролиферации, дифференцировки, миграции клеток, апоптоза. Существенным достижением последних десятилетий в области исследования глаза стало обнаружение высокой консервативности молекулярных механизмов, направляющих развитие глаза у представителей различных систематических групп (Heanue et al., 2002; Hsieh et al., 2002). В настоящее время известно, что формирование глаза находится под контролем основного каскада дифференциально экспрессирующихся транскрипционных факторов РАХ6/ЕYА1/S1X3/DACH 1 /PROX1 /Р1ТХ2. Изучение молекулярно-генетических механизмов развития глаза имеет не только фундаментальное, но и прикладное значение, так как нарушение экспрессии регуляторных генов глазного поля является причиной возникновения множества наследственных заболеваний глаз. Однако данные, имеющиеся в литературе, разрознены и в основном касаются изучения экспрессии генов в отдельных структурах глаза. Кроме того, большинство исследований регуляторных генов, в частности Р1ТХ2 и FOXC1, носит сугубо медико-биологический характер и направлено на идентификацию мутаций этих генов у пациентов с различными патологиями глаза (Davies et al., 1999; Holmberg et al., 2004). В связи с этим актуальным является систематическое исследование экспрессии генов, принимающих участие в развитии глаза человека. Мы сосредоточили наше внимание на полифункциональных регуляторных факторах: сигнальном белке TGFbeta2 и транскрипционных факторах PITX2 и FOXC1, поскольку известно, что гены, кодирующие эти регуляторныс факторы, начинают экспрессироваться на самых ранних этапах развития глаза позвоночных. Существуют данные, что TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в глазу функционируют в составе одного сигнального пути. Нарушение работы любого из этих регуляторных факторов приводит к серьезным, часто фенотшшчески сходным аномалиям глаза. Данные о характере экспрессии генов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в ходе развития глаза человека будут способствовать дальнейшим исследованиям, направленным на выявление взаимодействий регуляторных факторов, кодируемых этими генами.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение пространственных и временных характеристик экспрессии генов, кодирующих сигнальный белок TGFbeta2 и транскрипционные факторы PITX2, FOXC1, в различных структурах глаза человека на последовательных стадиях пренатального развития.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Сконструировать кДНК библиотеки, комплементарные мРНК из различных тканей глаза человека с 9,5 до 22-й неделгь пренатального развития.

2. Идентифицировать и изучить паттерн экспрессии генов ЮРЬе1а2, Р1ТХ2 и РОХС1 в тканях глаза на последовательных стадиях развития.

3. Исследовать локализацию белковых продуктов ТСРЬе1а2, Р1ТХ2 и РОХС1 в тканях глаза с 8 до 22-й недели развития.

4. Выявить пространственные и временные особенности экспрессии анализируемых регуляторных факторов в различных структурах развивающегося глаза человека.

Научная новизна и практическая значимость работы. Для исследования характера экспрессии генов ТОРЬеш2, Р1ТХ2 и РОХС1 в ходе развития глаза человека впервые применен комплексный подход. Получены данные об активности этих генов и локализации белков ТСРЬе1а2, Р1ТХ2 и БОХС1 в тканях глаза человека на последовательных стадиях пренатального развития (с 8-й по 22-ю неделю). На основании полученных данных сделан вывод о том, что сигнальный белок ТОРЬйаЗ и транскрипционные факторы Р1ТХ2 и РОХС1 принимают участие в формировании различных структур глаза человека: роговицы, хрусталика, цилиарного тела и сетчатки. Одним из основных результатов работы является установление того факта, что гены, кодирующие транскрипционные факторы Р1ТХ2 и РОХС1, которые ранее считались регуляторами развития переднего сегмента глаза, экспрессируются в формирующейся сетчатке и пигментном эпителии, то есть принимают участие в формировании тканей глаза нейрального происхождения. Анализ полученных результатов приводит к заключению, что экспрессия генов 7,GF¿eía2, Р1ТХ2 и РОХС1 в развивающемся глазу зависит от типа клеток. Таким образом, получен ряд принципиальных результатов, которые расширяют и углубляют представления о молекулярно-генетических механизмах дифференцировки различных тканей глаза человека в ходе эмбриогенеза.

Полученные данные могут быть использованы в медико-биологических исследованиях механизмов развития наследственных заболеваний глаз, а также при чтении лекций по биологии и генетике развития.

Личное участие автора. Вся работа выполнена непосредственно автором. Поставленные задачи решены с применением современных молекулярно-генетических методов и классического метода иммуногистохимии. Все выводы сделаны на основании собственных оригинальных данных.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на научно-практической конференции «Современные методы диагностики и лечения заболеваний роговицы и склеры» (Москва, 2007 г.); IV и V Международных научно-практических конференциях «Пролиферативный синдром в офтальмологии» (Москва, 2006, 2008 гг.); на конференциях молодых

ученых Института биологии развития им. Н.К.Кольцова (Москва, 2006, 2007 гг.); на Симпозиуме с международным участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза» (Москва, 2007 г.); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 3 статьи в журнале, рекомендованном ВАК, 4 статьи в научных сборниках и 9 тезисов конференций.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на /&Р страницах, содержит 32 рисунка, 5 таблиц и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 145 цитируемых источника.

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Исследование выполнено на глазах абортивных плодов человека на стадиях, соответствующих 8, 9.5, 10.5, 11, 12. 13-14, 17-18 и 22 неделям пренатального развития, полученные из лицензированных учреждений Министерства Здравоохранения в рамках законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан.

Препарирование тканей. Для молекулярно-генетических исследований на 9.5, 11, 14, 17-18 и 22-й неделях развития отрезали передний сегмент от заднего по лимбу. Затем отделяли хрусталик от роговицы, выделяли цилиарное тело вместе с радужкой. Сетчатку аккуратно отделяли от заднего отдела, подрезая глазной нерв. Пигментный эпителий брали вместе с сосудистой оболочкой (на 9.5 неделе вместе с сосудистой оболочкой и склерой).

Выделение тотРНК из различных тканей глаза, хранившихся при -70°С, проводили при помощи смеси TRI® Reagent (Sigma, США) по протоколу предоставленному производителем.

Получепие и нормировка кДНК библиотек. Синтез первой цепи кДНК проводили на матрице мРНК из различных тканей развивающегося глаза человека с помощью обратной транскриптазы SuperScript (GIBCO BRL, США) и гексануклеотидов фирмы Силекс М (Россия). Для оценки уровня экспрессии исследуемых генов, кДНК были предварительно отнормированы по рибосомалыюму белку, RPL19. Нормировка осуществлялась между тканями, выделенными из одного глаза. Праймеры, сконструированные по нуклеотидной последовательности RPL19, указаны в таблице 1.

Контроль на загрязнение геномной ДНК. Используемый нами протокол синтеза кДНК на матричной РНК позволяет на несколько порядков снизить вероятность контаминации геномной ДНК. Однако, был проведен дополнительный контроль. Были синтезированы праймеры для РАХб из разных экзонов (9-го и 10-го). Нуклеотидные последовательности праймеров указаны в таблице 1. Получение двух ПЦР-фрагментов (252 и 350 н.п.) означает считывание последовательности интрона в 98 н.п., которая находится между 9-

м и 10-м экзонами. На всех проанализированных кДНК библиотеках был получен только один фрагмент размером 252 н.п., что свидетельствует об отсутствии контаминации геномной ДНК.

Полимеразиая цепная реакция. ПЦР проводили на матрице кДНК с помощью Taq-пoлимepaзы, дНТФ и реакционный буфер. Все составляющие взяты из набора для амплификации ДНК фирмы Силекс М. Названия анализируемых генов (в том числе генов Ш>Ы9 и РАХб), структуры и положение праймеров, а также размеры соответствующих ПЦР-фрагментов перечислены в таблице 1.

__Таблица 1.

Ген Структура праймеров Размер ПЦР-фрагмента, н.п.

РАХб Пр. 5'tcgaagggccaaatggagaag3' (экзон 9) Обр 54gcataggcaggttatttgcc3' (экзон 10) 252/350

PITX2 Пр 5'tgtggaccaaccttacggaa3' (экзон 5) Обр 5'gttattgaggctgttgagac3' (экзон 6) 374

FOXCl Пр 5'-agcccaaggacatggtgaag-3' (экзон 1) Об. 5э- gtccttcttcttgaagcgcc -Зэ (экзон 1) 306

TGFbeta2 Пр. 5'-gcaggataattgctgcctacg-3' (экзон 7) Об. 5'-ctgcatttgcaagactttacaatc-3' (экзон 8) 302

RPL19 Пр. 5'agggtacagccaatgcccga3' (экзон 4) Обр. 5'ccttggataaagtcttgatgatc3' (экзон 6) 326

Условия амплификации для РАХб, РГТХ2 и TGFbeta2: 94°С — 1 мин, 56°С -1 мин, 72° С - 1 мин, 40 циклов. Условия амплификации для FOXC1: 94°С — 1 мин, 58°С - 1 мин, 72°С - 1 мин, 40 циклов. Условия амплификации для RPL19: 94°С - 1 мин, 5б°С - 1 мин, 72°С - 1 мин, 30 циклов. Для анализа ПЦР-продуктов использовали 1.5% агарозный гель в трис-ацетатном буфере.

Приготовление криосрезов. Целые глаза фиксировали в 4% параформальдегиде в 100 шМ фосфатном буфере с 5% сахарозой. Затем проводили по растворам сахарозы воезодящей концентрации (5%, 10%, 20% и 30%). Глаза замораживали на -70° в растворе сахарозы и ОСТ. С помощью криостата были получены криостатные срезы толщиной около 16 мкм.

In situ гибридизация проведена на 9.5 и 20 неделях пренатального развития по модифицированному протоколу Памелы Раймонд (Barthel, Raymond, 2000). В качестве отрицательного контроля использовали гибридизацию с sense РНК зондами. Используемые РНК зонды были мечены дигогеигенином с помощью набора DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) Roche Applie Science

Иммуногистохимическое исследование проводили по стандартной методике на криосрезах глаз человека на 8, 10.5, 12, 13-14, 17 и 22 неделях пренатального развития. Использовали антитела Rabbit to PITX2 (Sigma, USA, 1:200), Rabbit polyclonal to FOXC1 (Abeam, UK, 1:180); Mouse monoclonal to TGFbeta2 (Abeam, UK, 1:20), Antirabbit Aleksa 488 (MolecularProbs, США,

1:1000); Antimouse Aleksa 586 (MolecularProbs, США, 1:1000); Hoechst 42333 (Leica, Германия, 1:1000). В качестве отрицательного контроля, параллельно с ходом опыта на каждом препарате анализируемых стадий развития глаз ставили реакцию в отсутствие первичных антител.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Анализ экспрессии генов TGFbetal, PITX2 и FOXC1 в тканях глаза человека в ходе пренатального развития

Анализ экспрессии генов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в тканях глаза на последовательных стадиях развития: 9.5, 11, 13-14, 17-18 и 21 недели. На 9.5 неделе пренатального развития идет активный морфогенез глаза, в котором уже присутствуют зачатки всех основных структур. Происходит дифференцировка и пролиферация эпителиальных клеток и клеток стромы роговицы. В эпителии хрусталика также наблюдаются пролиферирующие клетки, которые перемещаются от периферии к экватору хрусталика, удлиняются и формируют первичные хрусталиков ые волокна. Сетчатка представлена двумя слоями нейробластов: внутренним и наружным. В обоих слоях есть пролиферирующие клетки, максимальное количество которых сконцентрировано на периферии сетчатки. Во внутреннем нейробластическом слое идет дифференцировка мюллеровских и ганглиозных клеток. В пределах наружного нейробластического слоя формируются биполяры и горизонтальные клетки. Пигментный эпителий на 9.5 неделе представляет собой один слой пигментированных клеток. Со стороны наружной поверхности пигментного эпителия различима формирующаяся сосудистая оболочка.

Анализ уровня экспрессии генов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 на стадии, соответствующей 9.5 неделе эмбриогенеза, проводился на кДНК библиотеках, синтезированных на мРНК из роговицы, хрусталика, сетчатки и пигментного эпителия вместе с сосудистой оболочкой и склерой. Результаты ПЦР-анализа, свидетельствуют о наличии транскриптов TGFbeta2, РГГХ2 и FOXC1 во всех исследуемых тканях (Рис. 1.А). Мы впервые идентифицировали экспрессию генов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в тканях глаза человека на 9.5-й неделе развития, когда интенсивно идет морфогенез глаза.

Для анализа экспрессии генов TGFbeta2, Р1ТХ2 и FOXC1 на 11 неделе пренатального развития проводилось более детальное препарирование тканей глаза Нам удалось отделить пигментный эпителий с сосудистой оболочкой от склеры. Кроме роговицы, хрусталика и сетчатки, мы выделяли краевую область сетчатки - зону формирующихся цилиарного тела и радужки. На 11 неделе развития складчатости, характерной для цилиарного тела, еще наблюдается, однако, уже к 12-й неделе в этой области начинается формирование складок.

Результаты ПЦР-анализа свидетельствуют о наличии на 11 неделе развития транскриптов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в роговице, хрусталике, сетчатке и пигментном эпителии/сосудистой оболочке (Рис. 1.Б). Причем уровень экспрессии гена TGFbeta2 высокий во всех анализируемых тканях. В

кДНК библиотеке, ситезированной на мРНК из области формирующегося цилиарного тела, также детектируются транскрипты ТОЬ~Ьеш2. Р1ТХ2 и 1-ОХС1. Следует отметить, что уровень экспрессии ТСРЪекг2 и Р1ТХ2 в формирующемся цилиарном теле на 11 неделе несколько выше, чем в сетчатке. Ото наблюдение особенно важно, поскольку морфогенез цилиарного тела только начинается и морфологических изменений в ¡той области еще не наблюдается. Эти данные могут быть существены для понимания молекулярно-генетических механизмов развития »той структуры глаза. Они хронометрируют начало развития цилиарного тела как минимум с 11 недели пренатального развития.

Морфологическая характеристика глаза 14-недельного плода человека свидетельствует о еще более выраженных изменениях в гистологии тканей, по сравнению с 11 неделей эмбриогенеза. Цилиарные складки уже хорошо различимы. В сетчатке начинают формироваться наружный и внутренний сетчатые слои. Продолжается дифферен цировка ганглиозных и фоторецепторных клеток. Анализ экспрессии исследуемых генов в тканях глаза на 14 неделе развития выявил наличие транскриптов Т(]ГЬе1а2, Р1ТХ2 и РОХС! во всех тканях глаза (Рис. 1.В).

А Б В

Рисунок 1. Результаты 1 ЩР-анализа. иллюстрирующие характер экспрессии генов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в различных структурах глаза человека на 9.5 (А). ! I (Б). 14 (В). 17-18 (Г) и 21 (Д) неделях развития. В качестве гена для норми- Г Д

ровки использован RPL19. 1 - роговица; 2 - хрусталик; 3 - сетчатка; 4 -цилиарное тело/радужка: 5 - пигментный эпителий/сосудистая оболочка. На рис. 1а четвертая колонка - пигментный эпителий/сосудистая оболочка/склера.

Существенных морфологических изменений роговицы и хрусталика на 17-18-неделе, по сравнению с таковыми у 14-недельного плода, не наблюдается. В сетчатке к этому времени уже отчетливо выражены все основные слои: наружный ядерный слой, наружный сетчатый слой, внутренний ядерный слой, внутренний сетчатый слой, слой ганглиозных клеток. Продолжается формирование сетчатых слоев и слоя нервных волокон сетчатки. Идет активный морфогенез цилиарного тела. Результаты ПЦР-анализа, свидетельствуют о наличии транскриптов TGFbeta2, Р1ТХ2 и FOXC1 во всех анализируемых тканях (Рис. 1.Г).

К 21 неделе пренатального развития все анализированные ткани глаза практически сформированы. Роговица и хрусталик увеличились в размере, по сравнению с 17-18 неделей. В сетчатке присутствуют все ядерные и сетчатые слои. Цилиарное тело сформировано. ПЦР-анализ показал наличие транскриптов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 на 21 неделе плодного развития в всех анализируемых тканях глаза, однако уровень экспрессии генов в большинстве тканей несколько снижается (Рис. 1 .Д).

Таким образом, нами выявлены мРНК TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 во всех исследуемых тканях глаза с 9.5 до 21 недели развития, когда активно идет морфогенез глаза. Впервые идентифицирована экспрессия гена PITX2 в хрусталике, сетчатке и пигментном эпителии/сосудистой оболочке. Обнаружение экспрессии гена FOXC1 в развивающемся глазу человека также является новым фактом. Функциональная роль этих транскрипционных факторов в развитии глаза не вполне ясна и требует дальнейших исследований.

Локализация мРНК PITX2 в тканях развивающегося глаза

Для подтверждения данных ПЦР-анализа об экспрессии одного из исследуемых генов - PITX2 - был использован метод in situ гибридизации, который позволил локализовать мРНК этого гена в глазу человека на 9.5-10 и 20 неделях развития. Транскрипты PITX2 на ранней стадии, соответствующей 9.5-10 неделям, выявлены в эпителии и формирующихся волокнах хрусталика (Рис. 2.А), в которых активно идут процессы пролиферации и дифференцировки. Наши результаты о наличии мРНК PITX2 в клетках нейромезенхимы, которые формируют волны миграции (Рис. 2.В), находятся в соответствии с данными литературы об экспрессии этого гена в клетках окологлазной мезенхимы у человека на 7 и 9 неделях развития и у мышей в раннем эмбриогенезе. Эти клетки участвуют в формировании всех структур переднего сегмента глаза и склеры. Существует гипотеза, что именно PITX2 запускает каскад генов, контролирующих дифференцировку клеток эндотелия и стромы роговицы (Gage et al., 2005; Ittner et al., 2005).

Рисунок 2. Локализация мРНК Р1ТХ2 в глазу человека на 9.5-10 неделе развития. А - угол глаза (опыт); Б - угол глаза (контроль); В - иридо-корнеальная область (опыт); Г - иридо-корнеальная область (контроль); Д - сетчатка (опыт); Е - сетчатка (контроль). Ув.: ок. х10, об. х20 (А, В, Г); ок. хЮ, об. хЮ (Б, Д, Е). ВЯС - внутренний ядерный слой, НЯС - наружный ядерный слой, ПЭ - пигментный эпителий, Р -роговица, С - сетчатка, Эп.Х - эпителий хрусталика, МК - мезенхимные клетки, волны миграции указаны стрелками.

Рисунок 3. Локализация мРНК PITX2 - глаз человека на 20 неделе развития. А -роговица (опыт); Б - роговица (контроль); В

- хрусталик (опыт); Г - хрусталик (контроль); Д - сетчатка (опыт); Е -сетчатка (контроль). Ув.: ок. хЮ, об. х20 (А, Б); ок. хЮ, об. х40 (В, Г); ок. хЮ, об. хЮ (Д, Е). ВСС - внутренний сетчатый слой, ВЯС

- внутренний ядерный слой, ГК -ганглиозные клетки, НСС - наружный сетчатый слой, НЯС - наружный ядерный слой, ПЭ - пигментный эпителий, Энд.Р -эндотелий роговицы, Эп.Р - эпителий роговицы, Эп.Х - эпителий хрусталика.

Нами впервые локализована экспрессия гена PITX2 в сетчатке развивающегося глаза. На 9.5-10 неделях гибридизационный сигнал выявлен в наружном и внутреннем нейробластических слоях (Рис. 2.В), в которых идет дифференцировка клеток. В контроле сигнал не наблюдается (Рис. 2.Б,Г,Е). Черная полоса на Рис. 2.Г соответствует пигментному эпителию. К сожалению, метод in situ гибридизации не позволяет выявить окрашивание в этой структуре из-за содержания в клетках пигментных гранул.

На поздней стадии, соответствующей 20 неделе, глаз значительно продвинут в развитии, по сравнению с 9.5-10 неделей. Гибридизационный сигнал выявлен в клетках эпителия, эндотелия и стромы практически сформированной роговицы (Рис. З.А). Существуют данные, что в роговице 15-недельного плода человека мРНК Р1ТХ2 локализуется в клетках эпителия и стромы, т.е. тканях мезенхимного происхождения. Нам впервые удалось показать наличие мРНК Р1ТХ2 в тканях эктодермального происхождения -эпителии роговицы, эпителии и волокнах хрусталика на 20 неделе.

В сетчатке к 20 неделе, по сравнению с 9.5-10 неделей, произошли существенные изменения в морфологии. Сформировались все слои сетчатки, продолжается дифференцировка клеток ганглиозного и внутреннего ядерного слоев. Кроме морфологических изменений наблюдается изменение в распределении мРНК Р1ТХ2 в этой структуре. мРНК Р1ТХ2 локализуется в клетках внутреннего ядерного и ганглиозного слоев (Рис. З.В). В контроле гибридизационный сигнал отсутствует (Рис. З.Б,Г,Е).

Таким образом, по мере дифференцировки клеточных слоев сетчатки изменяется локализация экспрессии Р1ТХ2, что может быть связано с участием транскрипционного фактора, кодируемого этим геном, в судьбе клеток внутреннего и наружного ядерных слоев. Идентификация Р1ТХ2 в сетчатке является принципиально новым фактом и функциональная роль этого гена требует дальнейших исследований.

Результаты исследования локализации мРНК Р1ТХ2 подтверждают и дополняют данные ПЦР-анализа. Показаны различия в распределении мРНК Р1ТХ2 в сетчатке в зависимости от стадии развития. Полученные данные расширяею наши представления о характере экспрессии регуляторного гена Р1ТХ2 в ходе развития роговицы, хрусталика и сетчатки.

Локализация белка ТвРЬе(а2 в тканях развивающегося глаза

8 и 10.5 недели развития. С помощью иммуногистохимии получены данные, свидетельствующие о наличии ТйРЬе1а2 в глазу, начиная с самой ранней анализируемой стадии развития, соответствующей 8 неделе. В сетчатке локализация ТОРЬс1а2 на 8 и 10.5 неделях развития имеет сходные черты: ТвРЬеГа2 выявлен во внутреннем безъядерном слое сетчатки (Рис. 4, 5; указано стрелками), который образован отростками Мюллеровских клеток. В других слоях сетчатки ТОРЬе1а2-позитивные клетки не выявлены. В отличие от 8 недели, на 10.5 неделе иммунопозитивная реакция на антитела против ТОРЬе1а2 детектируется и в пигментном эпителии (Рис. 5). Совмещение изображения, выявляющего ТОРЬе1а2-по'штивные клетки, с изображением того же участка среза глаза, окрашенного ядерным красителем, демонстрирует локализацию ТОРЬе1а2 практически во всех клетках пигментого эпителия. Сходную локализацию ТСРЬс(а2 имеет в пигментном эпителии у взрослых обезьян и человека. Пигментный эпителий, расположенный между сетчаткой и сосудистой оболочкой, является барьером «кровь-сетчатка» и необходим для

поддержания гомеостаза сетчатки. Существуют данные о том, что TGFbeta2 во взрослом глазу предотвращает прорастание кровеносных сосудов в сетчатку (Holtkamp et al., 1999). Наши данные позволяют предположить, что в развивающемся глазу этот сигнальный белок выполняет аналогичную функцию, по крайней мере, с 10.5 недели. В хрусталике на 10.5 неделе TGFbeta2 выявлен в эпителии и формирующихся волокнах (Рис. 5), что, вероятно, связано с участием этого сигнального белка в регуляции пролиферации. Полученные данные о наличии TGFbeta2-no3HTHBHbix клеток в глазу на 8 и 10.5 неделях развития находятся в соответствии с результатами ПЦР-анализа (Рис. 1.А,Б).

IGFb«ta2 шхр III j

ВХ|> шт у ж

Рисунок 4. TGFbeta2 в сетчатке на 8 неделе развития, пэ -пигментный эпителий.

Рисунок 5. ТОРЬе1а2 в тканях глаза человека на 10.5 неделе развития, вхр - волокна хруста-лика, пэ — пигментный эпителий, эпхр - эпителий хрусталика.

На 12 неделе развития нами проанализированы следующие структуры глаза: роговица, хрусталик, сетчатка, область формирующегося цилиарного тела и пигментный эпителий (Рис. 6). В роговице на 12 неделе ТСРЬе1а2 детектируется только в эпителии. В клетках эндотелия и стромы роговицы, несмотря на активную дифференцировку и пролиферацию этих клеток, сигнал не обнаружен. Наличие белка ТОРЬе1а2 выявлено также в пролиферирующих клетках герминативной зоны, а также в транзиторной зоне и формирующихся волокнах хрусталика. В эпителии хрусталика окрашивание не наблюдается.

Рисунок 6. ТСРЬе1а2 в тканях глаза человека на 12 неделе развития, вхр -волокна хрусталика, гз - герминативная зона, вне - внутренний нейробластический слой, ннс - наружный нейробластический слой, пэ -пигментный эпителий, стр - строма роговицы, тз - транзиторная зона, энр -эндотелий роговицы, эпр - эпителий роговицы, эпх - эпителий хрусталика.

В формирующейся сетчатке, представленной на 12 неделе двумя слоями нейробластов, TGFbeta2 имеет дифференциальный характер экспрессии. TGFbeta2-no3HTHBHbie клетки локализованы во внутреннем нейробластическом слое, которые включают дифференцирующиеся ганглиозные клетки. В наружном нейробластическом слое TGFbeta2 не обнаружен.

На 12 неделе начинается формирование цилиарного тела, появляется складчатость этой структуры. TGFbeta2-no3HTHBHbie клетки локализуются в непигментированном эпителии цилиарного тела (Рис. 6, указано стрелками). Известно, что TGFbeta2 обнаруживается в презумптивном эпителии цилиарного тела уже на 6 неделе эмбриогенеза (Gatherer et al., 1990). В цилиарном теле взрослого человека также выявлено наличие этого белка. Наши результаты о наличии TGFbeta2 в активно формирующемся цилиарном теле и данные литературы, полученные на взрослом глазу, свидетельствуют об участии этого регуляторного фактора не только в функционировании цилиарного тела, но и в формировании его в эмбриогенезе. Полученные данные о наличии белка TGFbeta2 в роговице, хрусталике, сетчатке и цилиарном теле на 12 неделе находятся в соответствии с результатами ПЦР-анализа (Рис. 1.В).

На 17 неделе локализация TGFbeta2 в тканях глаза несколько меняется по сравнению с предыдущими стадиями (Рис. 7). ГОРЬе1а2-позитивные клетки выявлены не только в эпителии роговицы, как на 12 неделе, но и в эндотелии. В строме роговицы на этой стадии развития, так же как на 12 неделе, иммунохимической реакции не наблюдается. В хрусталике TGFbeta2 выявлен в клетках герминативной, транзиторной зон и в формирующихся волокнах. В клетках эпителия хрусталика, как и на 12 неделе, иммунохимического окрашивания не наблюдается. В сетчатке к 17 неделе развития произошли существенные изменения, что связано с появлением всех слоев этой структуры. Белок TGFbeta2 локализуется в слое ганглиозных клеток и в формирующихся внутреннем сетчатом слое и слое нервных волокон. В других слоях сетчатки окрашивания не выявлено. Вероятно, экспрессия TGFbeta2 в сетчатке связана с дифференцировкой ганглиозных и амакриновых клеток. Интенсивный иммунохимический сигнал детектируется также в клетках пигментного эпителия. На 17 неделе развития идет морфогенез цилиарного тела, которое уже имеет отчетливо выраженную складчатость. На этой стадии TGFbeta2 впервые выявлен не только в непигментированных клетках эпителия, производных нейроэпителия, но и в клетках стромы цилиарного тела, большинство которых имеет мезенхимное происхождение. Таким образом, нам удалось хронометрировать экспрессию этого сигнального белка в строме цилиарного тела, что может внести вклад в понимание молекулярно-генетических механизмов развития этой структуры. Полученные данные о локализации TGFbeta2 в роговице, хрусталике, сетчатке, цилиарном теле и пигментном эпителии на 17 неделе находятся в соответствии с результатами ПЦР-анализа (Рис. 1.Г).

Рисунок 7. ТОРЬе1а2 в тканях глаза человека на 17 неделе развития, вхр -волокна хрусталика, всс - внутренний сетчатый слой, вяс - внутренний ядерный слой, гк - ганглиозные клетки, нее - наружный сетчатый слой, няс -наружный ядерный слой, пэ - пигментный эпителий, стр - строма роговицы, тз

- транзиторная зона, энр - эндотелий роговицы, эпр - эпителий роговицы, стцт

- строма цилиарного тела.

На поздней стадии, соответствующей 22 неделе, наблюдается дальнейшее изменение локализации регуляторного фактора ТОРЬе1а2 (Рис. 8). В роговице этот белок выявлен в клетках эпителия; в эндотелии и строме сигнал не детектируется. В то время как на 12-й неделе развития этот белок локализуется в эпителии, а на 17-й неделе - в эпителии и в эндотелии. Таким образом, наблюдаются региональные изменения локализации белка ТвРЬе1а2 в развивающейся роговице. Возможно, экспрессия ТСРЬе1а2 в эндотелиальных клетках является специфической на определенной стадии формирования роговицы. Причины дифференциальной экспрессии ТСРЬе1а2 в роговице не ясны, поскольку молекулярные механизмы регуляции этого гена изучены недостаточно и требуют дальнейших исследований. Данные о наличии ТОРЬе1а2 в роговице на различных стадиях развития расширяют наши представления об экспрессии гена, кодирующего этот сигнальный белок, так как к настоящему времени имеются лишь отдельные сведения о локализации ТОРЬе):а2 в роговице 6-недельного эмбриона и взрослого человека.

В хрусталике на 22 неделе, так же как на 12 и 17 неделях, ТОРЬе1а2 детектируется только в клетках герминативной, транзиторной зон и в формирующихся волокнах. В целом локализация белка ТОРЪе1а2 в хрусталике человека с 12 до 22 недели сходна с таковой в глазу взрослых мышей.

В сетчатке к 22 неделе ТОРЬе1а2 локализуется только в нервных волокнах, образованных аксонами ганглиозных клеток, дифференцировка которых близка к завершению. Таким образом, можно сделать вывод, что экспрессия этого сигнального белка зависит от типа клеток. Так же как на 17 неделе, ТОРЬе1а2 детектируется в клетках стромы и непигментированного эпителия цилиарного тела. В пигментном эпителии иммунохимическую реакцию на окрашивание антителами против ТОРЬе1а2 проявляли лишь единичные клетки. Мы не исключаем недостаточности чувствительности метода для детекции белка во всех клетках пигментного эпителия, однако

наличие даже единичных ТСРЬе1а2-позитивных клеток в этой структуре на 22 неделе свидетельствует об экспрессии этого регуляторного фактора не только в период активного морфогенеза глаза, 17 недель, но и на стадии, когда глаз практически сформирован.

Рисунок 8. '['ОРЬсЧа! в тканях глаза человека на 22 неделе развития, вхр -волокна хрусталика, вяс - внутренний ядерный слой, гз - герминативная зона, гк - ганглиозные клетки, няс - наружный ядерный слой, пэ - пигментный эпителий, стр - строма роговицы, тз - транзиторная зона, энр - эндотелий роговицы, эпр - эпителий роговицы, стцт - строма цилиарного тела.

Локализация белка Р1ТХ2 в тканях развивающегося глаза 8 и 10.5 недели развития. С помощью иммуногистохимии впервые получены данные, свидетельствующие о наличии белка Р1ТХ2 в тканях глаза человека, начиная с 8 недели эмбрионального развития (Рис. 9). Характер распределения Р1ТХ2 на 8 и 10.5 неделях сходен как в клетках хрусталика, так и сетчатки (Рис. 9, 10). В хрусталике на обеих стадиях развития интенсивная иммунохимическая реакция на антитела против Р1ТХ2 детектируется в ядрах клеток эпителия и формирующихся волокон. В сетчатке Р1ТХ2-позитивные клетки локализуются во внутреннем и наружном нейробластических слоях. Совмещения изображений среза, окрашенного антителами против Р1ТХ2 и ядерным красителем, демонстрирует локализацию Р1ТХ2 практически во всех клетках формирующейся сетчатки.

вхр вне вне

ЭГЕф/ ннс — ,1Г) ♦"'чЕ*^' • * * / ннс го \

32 ига: 1ЯЯВВЯЯ!Ц,Ш1 РШ: Сегчатка(х20)|

Рисунок 9. Р1ТХ2 в тканях глаза человека на 8 неделе развития, вхр - волокна хрусталика, вне - внутренний нейро-бластический слой, ннс - наружный нейробластический слой, пэ - пигментный эпителий, эпхр - эпителий хрусталика.

Рисунок 10. Р1ТХ2 в сетчатке на 10.5 неделе развития, вне -внутренний нейробластический слой, ннс — наружный нейробластический слой, пэ -пигментный эпителий.

Важным фактом было обнаружение Р1ТХ2-позитивных клеток в пигментном эпителии на 8 и 10.5 неделях (Рис. 9, 10). Это совпадает с данными ПЦР-анализа, а также дополняет и уточняет результаты in situ гибридизации, которая не позволила судить о наличии мРНК PITX2 в пигментированных клетках. Полученные данные о локализации Р1ТХ2-позитивных клеток во всех анализируемых тканях на 8 и 10.5 неделях развития согласуются с результатами ПЦР-анализа и in situ.

На 13-14 неделе развития иммунопозитивный сигнал на окрашивание антителами против PITX2 детектируется в ядрах клеток эпителия, эндотелия и стромы роговицы (Рис. 11), в которой продолжаются пролиферация и дифференцировка клеток. Известно, что на 15 неделе PITX2 экспрессируется в эндотелии и строме, т.е. тканях нейромезенхимного происхождения. Нами же впервые показано, что на 13-14 неделе белок PITX2 локализуется не только в клетках эндотелия и стромы, но и эпителия роговицы, имеющего эктодермальное происхождение. Таким образом, экспрессия этого транскрипционного фактора не является тканеспецифической. В хрусталике PITX2 локализуется в ядрах клеток эпителия и формирующихся волокон (Рис. 11). В сетчатке иммунохимическая реакция детектируется практически во всех клетках обоих нейробластических слоев (Рис. 11). В клетках пигментного эпителия также выявляется белок PITX2 (Рис. 11). Полученные нами данные свидетельствуют о наличии PITX2 в клетках формирующегося цилиарного тела (Рис. 11, указано стрелками), в котором на 13-14 неделе развития появляется складчатость. Р1ТХ2-позитивные клетки детектируются в непигментированном эпителии цилиарного тела (Рис. 11). О специфичности окрашивания пигментированных клеток эпителия цилиарного тела судить сложно из-за высокой автофлуоресценции этих клеток. Наличие белка PITX2 в роговице, хрусталике, сетчатке и цилиарном теле на 13-14 неделе согласуется с результатами ПЦР-анализа.

утар эшр^ вне рггх: рпх:

вхр ннс

стр

I I

— энр 1 1

1Д|тТТТТТТМ»Ш1 :тгх: 1 Щилнарное тело(*40)Р

Рисунок 11. Р1ТХ2 в тканях глаза человека на 13-14 неделе развития, вхр -волокна хрусталика, вне - внутренний нейробластический слой, ннс -наружный нейробластический слой, пэ - пигментный эпителий, стр - строма роговицы, энр - эндотелий роговицы, эпр - эпителий роговицы, эпхр -эпителий хрусталика.

На 17 неделе плодного развития, когда продолжается активный морфогенез глаза, локализация белка Р1ТХ2 в тканях глаза существенно не изменяется (Рис. 12). Так же как на 13-14 неделе, Р1ТХ2-позитивные клетки выявлены в эпителии, эндотелии и строме роговицы. В хрусталике Р1ТХ2-позитивные клетки детектируются в эпителии и формирующихся волокнах. В сетчатке интенсивный иммунохимический сигнал детектируется практически во всех основных клеточных слоях сетчатки - ганглиозном, внутреннем ядерном, включающем амакриновые, горизонтальные клетки и биполяры, и наружном ядерном слоях, включающем фоторецепторные клетки. Таким образом, нами впервые показано наличие белка Р1ТХ2 как в недифференцированных клетках сетчатки на 10.5 неделе эмбриогенеза, так и в дифференцированных клетках 17- недельного плода, что свидетельствует о новых, еще не известных функциях этого фактора транскрипции в гистогенезе сетчатки. Иммунопозитивными к антителам против Р1ТХ2 являются также клетки пигментного эпителия. Идентификация белка Р1ТХ2 в сетчатке и пигментном эпителии является принципиально новым фактом, поскольку известно, что этот фактор контролирует развитие только переднего сегмента глаза.

Рисунок 12. Р1ТХ2 в тканях глаза человека на 17 неделе развития, вхр -волокна хрусталика, вяс - внутренний ядерный слой, гк - ганглиозные клетки, няс - наружный ядерный слой, пэ - пигментный эпителий, ссхр - сосудистая сумка хрусталика, стр - сгрома роговицы, стцт - строма цилиарного тела, энр - эндотелий роговицы, эпр - эпителий роговицы, эпхр - эпителий хрусталика.

На 17 неделе развития, когда морфогенез цилиарного тела приближается к завершению, нами выявлено наличие белка Р1ТХ2 в непигментированных клетках эпителия цилиарного тела (на рисунке указано стрелками). В пигментированных клетках цилиарного тела иммунохимический сигнал отсутствует. Полученные данные о локализации белка Р1ТХ2 в роговице, хрусталике, сетчатке, цилиарном теле и пигментном эпителии на 17 неделе развития находятся в соответствии с результатами ПЦР-анализа.

На 22 неделе плодного развития локализация белка Р1ТХ2 несколько меняется (Рис. 13). В роговице Р1ТХ2 выявлен в эпителии, эндотелии и строме. В хрусталике, также как на 8-17 неделях, белок Р1ТХ2 детектируется в эпителии и формирующихся волокнах.

стр Ч ВЦ) эпхр^ г -н рггх2 вяс г* .С™ N 1 1 ргтхГ] Л

| Рог овица( ШЕШШ нзквшм Цнлиарное тело (х40)|

Рисунок 13. PITX2 в тканях глаза человека на 22 неделе развития, вхр -волокна хрусталика, вяс - внутренний ядерный слой, гк - ганглиозные клетки, няс - наружный ядерный слой, стр - строма роговицы, энр - эндотелий роговицы, эпр - эпителий роговицы, эпхр - эпителий хрусталика.

Идентификация PITX2 в хрусталике развивающегося глаза свидетельствуют о существовании еще не известных функций этого транскрипционного фактора. В сетчатке к 22 неделе, когда завершается дифференцировка всех клеточных типов, наблюдается изменение локализации Р1ТХ2, по сравнению с 8-17 неделями развития. На 22 неделе иммунопозитивная реакция выявлена только в ядрах ганглиозных клеток. В других слоях сетчатки иммунохимический сигнал не детектируется. Также не выявлено этого белка в клетках пигментного эпителия. Отсутствие иммунохимического окрашивания в этих клетках может быть связано с недостаточной чувствительностью метода, однако с помощью ПЦР-анализа показано наличие мРНК PITX2 в пигментном эпителии/сосудистой оболочке на 22 неделе (Рис. 1.Д). В цилиарном теле на 22 неделе, так же как на 13-14 и 17 неделях развития, интенсивная иммунохимическая реакция на антитела против Р1ТХ2 детектируется только в клетках непигментированного эпителия (рис. 13, указано стрелками). Полученные данные о локализации белка PITX2 в роговице, хрусталике, сетчатке и цилиарном теле на 22 неделе развития согласуются с результатами ПЦР-анализа и in situ гибридизации (Рис. 1 .Д).

Локализация белка FOXC1 в тканях развивающегося глаза

8-10.5 недели развития. С помощью ПЦР нами впервые идентифицирована экспрессия гена FOXC1 в развивающемся глазу человека. Локализация соответствующего белкового продукта проведена методом иммуногистохимии. Полученые данные свидетельствуют о наличии белка FOXC1 в хрусталике, начиная с самой ранней анализируемой стадии развития, соответствующей 8 неделе эмбиогенеза. Интенсивный иммунохимический сигнал выявлен в клетках эпителия и формирующихся волокон хрусталика (Рис. 14).

ГОХС1 РохсТ

эпхр ,1*

вхр

вне

ннс

Сетчатка (х20)| го

Г0ХС1 мне

Рисунок 14. РОХС1 в тканях глаза человека на 8 неделе развития, вхр - волокна хрусталика, вне - внутренний нейробластический слой, ннс - наружный нейробластический слой, пэ - пигментный эпителий, эпхр - эпителий хрусталика.

Рисунок 15. РОХС1 в сетчатке на 10.5 неделе развития, вне - внутренний нейробластический слой, ннс - наружный нейробластический слой.

В сетчатке на 8 и 10.5 неделях развития РОХС1-позитивные клетки локализуются во внутреннем и наружном нейробластических слоях (Рис. 14,

15). Наибольшей интенсивностью свечения обладали ядра дифференцирующихся ганглиозных клеток центральной области сетчатки. Важным фактом является также обнаружение белка РОХС1 в клетках пигментного эпителия на 8 неделе развития (Рис. 14). Полученные данные о наличии белка РОХС1 в хрусталике, сетчатке и пигментном эпителии на 8 и 10.5 неделе эмбриогенеза находятся в соответствии с результатами ПЦР-анализа (Рис. 1.А,Б). Функциональная роль этого транскрипционного фактора в морфогенезе глаза требует дальнейших исследований. Наши результаты свидетельствуют об экспрессии РОХС1, принадлежащего к каскаду генов, контролирующих морфогенез глаза человека, начиная с самых ранних стадий развития.

На 13 неделе развития белок РОХС1 выявлен в эпителии, эндотелии и строме (Рис. 16). Распределение РОХС1 в хрусталике и сетчатке на 13 неделе, по сравнению 8 и 10.5 неделями эмбриогенеза, существенно не меняется (Рис.

16). Иммунопозитивную реакцию проявляют ядра клеток эпителия и формирующихся волокон хрусталика. РОХС1, как и Р1ТХ2, локализуется в обоих нейробластических слоях сетчатки - наружном и внутреннем, включающем дифференцирующиеся ганглиозные клетки. Существенной разницы в интенсивности свечения отдельных клеток, наблюдаемой в сетчатке на 8 и 10.5 неделе эмбриогенеза, на этой стадии не выявлено. На 13 неделе развития, как на 8 и 10.5 неделях, белок РОХС1 выявляется в клетках пигментного эпителия (Рис. 16). В цилиарном теле интенсивный иммунохимический сигнал детектируется в непигментированных клетках эпителия (Рис. 16; указано стрелками). Полученные нами сведения о наличии белка РОХС1 во всех исследованных тканях на 13 неделе развития находятся в соответствии с результатами ПЦР-анализа (Рис. 1.В).

ЮХС1 гохс1. го.\с1 гот|

стр вхр эИхр ИНГ "а*

ш2 мийк! ннс

'г^шл?! | Сетчатка(х20) вг |Цилиа|>ное тело (*40)|

Рисунок 16. РОХС1 в тканях глаза человека на 13 неделе развития, вхр -волокна хрусталика, вне - внутренний нейробластический слой, ннс -наружный нейро-бластический слой, пэ - пигментный эпителий, стр - строма роговицы, энр - эндотелий роговицы, эп - эпителий роговицы, эпхр -эпителий хрусталика.

Рисунок 17. РОХС1 в тканях глаза человека на 17 неделе развития, вхр -волокна хрусталика, вяс - внутренний ядерный слой, гк - ганглиозные клетки, няс - наружный ядерный слой, пэ - пигментный эпителий, стр - строма роговицы, энр - эндотелий роговицы, эп - эпителий роговицы, эпхр -эпителий хрусталика.

/ 7

Рисунок 18. РОХС1 в тканях глаза человека на 22 неделе развития, вхр -волокна хрусталика, вяс - внутренний ядерный слой, гк — ганглиозные клетки, няс — наружный ядерный слой, пэ - пигментный эпителий, стр - строма роговицы, энр - эндотелий роговицы, эп - эпителий роговицы, эпхр -эпителий хрусталика.

К 17 неделе развития характер распределения FOXC1 практически не меняется. В роговице шн белок локализуется в эпителии, тпдотелии и с громе (Рис 17) В хрусталике имму нохнмичсску ¡о реакцию проявляли ядра эшме.тпя и формирующихся волокон (Рис. 17).

В centalке I-OXCI выявлен в гашлиозных клетках. которые к пому времени обособляются в oiдельный слой, а также клсчках внутреннею и наружною ядерных слоен (Рис 17). ИммуHtinoiii iикными яилякнся и клетки шпментпото эннтслия (Рис. 17).Как и на !3 неделе, интенсивный сигма.'! наблюдается в ядрах юлько непигментированных клеток эпителия цилиарното тела (Рис. 17). Полученные нами результаты о локализации белка FOXCI в роговице. хрусталике. сетчатке, цилиарном теле и пигментном лштелии на 17 неделе разни гия находятся в соответствии с данными ПЦР-анализа (Рис. 1. Г).

На 22 неделе развития распределение белкаРОХО в роговице и хрусталике не изменяется. Гак же как и PITX2. FOXC1 локализуется в эпшелпн. )ндотелии и строме роговицы (Рис. 18.Л). что демонстрирует сходный характер распределения этих транскрипционных факторов в формирующейся роговице Предполагается, что взаимодействие !'itx2 и Foxel необходимо для уплощения нейромезенхимных клеток, формирующих эндотелий роговицы (Berry et al.. 2006). Хотя наши данные lie позволяют с полной уверенностью говорить о колокалнзации изучаемых транскрипционных факторов, однако, наличие >тих белков практически во всех клетках роговицы и данные литературы о взаимодействии Pitx2 и Foxcl п роговице мышей (Beery et al.. 2006) позволяют предположить не только их колокализацию. но и вюимодействие. Известно, что Foxcl у мышей участвует в дифференцировке клеток эндотелия и стромы роговицы. Мы предполагаем, что FOXC1 в дифференцирующихся клетках эндотелия и стромы роювицы человека выполняет аналогичную функцию. В хрусталике, как и на предыдущих стадиях. FÜXC1 локализуется в эпителии и формирующихся волокнах (Рис. IS). Данные об экспрессии FOXCI в хрусталике развивающегося глаза человека нами получены впервые. Для понимания функциональной роли этого транскрипционного фактора требу ются дальнейшие исследования.

В сетчатке на 22 неделе наблюдаются изменения локализации FOXCI, коюрый. как и РГГХ2. детектируется только в слое ганглиозных клеток, дифференцпровка которых близка к завершению. В цилиарном теле, так же как и на предыдущих стадиях развития. FOXC1 локализуется то.лько в клетках непигмешированното эпителия Результаты о наличии белка FOXC1 в хрусталике, сетчатке и цилиарном теле на 22 неделе согласуклся с данными ПЦР-анализа. Данные об идентификации экспрессии и локализации FOXC1 в развивающемся глазу человека представляются новыми и весьма интересными, поскольку современные знания об экспрессии этого гена у человека ограничивают сведениями, полученными при исследовании тканей взрослого глаза.

Анализ полученных результатов и данных литературы позволяет заключить, что регулягорные факторы ТСтРЬе1а2, Р1ТХ2 и РОХС1, функционирующие в составе ТОРЬе1а сигнального пути, контролируют развитие структур глаза, имеющих различное эмбриональное происхождение. Несмотря на то, что мРНК ТОГЬега2, Р1ТХ2 и РОХС1 выявлены во всех проанализированных тканях глаза, пространственные и временные характеристики распределения соответствующих белковых продуктов имеют ряд различий. Причем, гены, кодирующие транскрипционные факторы Р1ТХ2 и РОХС1, имеют сходный характер экспрессии, несколько отличающийся от экспрессии гена, кодирующего сигнальный белок ТОРЬе1а2. Причины этого могут быть найдены при изучении взаимодействий этих регуляторных факторов, а также при идентификации и более подробном анализе промежуточных звеньев сигнального каскада ТОРЬе1а.

Работа выполнена при поддержке РФФИ, гранты №05-04-48026, №08-0400462.

Выводы

1. Впервые проведено комплексное исследование характера экспрессии генов, кодирующих регуляторные факторы TGFbeta2, PITX2 и FOXC1, в тканях глаза человека на 8-22-й неделях пренатального развития.

2. Показано, что сигнальный белок TGFbeta2 и транскрипционные факторы PITX2 и FOXC1 принимают участие в формировании тканей глаза, имеющих различное эмбриональное происхождение: эктодермалыюе, нейромезенхимное и нейралыюе. Экспрессия генов TGFbeta2, PITX2 и FOXCI в глазу не является тканеспецифической.

3. Впервые получены данные об экспрессии в формирующейся сетчатке и пигментном эпителии человека генов, кодирующих транскрипционные факторы PITX2 и FOXC1, которые считаются регуляторами развития переднего сегмента глаза. Установлено, что уровень экспрессии этих генов в клетках сетчатки зависит от степени их дифференцировки.

4. Наличие транскриптов PITX2 в мигрирующих клетках нейромезенхимы и увеличение уровня экспрессии генов TGFbeta2 и PITX2 в краевой области сетчатки являются доказательствами того, что молекулярно-генетические процессы, в регуляции которых принимают участие TGFbeta2 и PITX2 предшествуют видимым признакам морфогенеза цилиарно-радужного комплекса.

5. Показано, что экспрессия TGFbeta2 в роговице, хрусталике и сетчатке в ходе развития имеет дифференциальный характер, который зависит от типа клеток. В роговице региональные изменения локализации белка TGFbeta2 могут быть связаны со специфичностью экспрессии TGFbeta2 в эндотелиальных клетках на 17 неделе развития, а в хрусталике - с участием TGFbeta2 в гистогенезе в качестве регулятора пролиферации. В сетчатке в ходе развития источником секретируемого белка TGFbeta2 являются ганглиозные и мюллеровские клетки.

Список работ, опубликованных по теме диссертации а) статьи в изданиях согласно перечню ВАК:

1. Маркитантова Ю.В., Фирсова Н.В.. Смирнова Ю.А., Панова И.Г., Сухих Г.Т., Зиновьева Р.Д. Локализация экспрессии гена PITX2 в клетках глаза человека в ходе пренатального развития // Известия РАН. Серия биологическая. 2008. № 2. С. 139-145.

2. Панова И.Г., Маркитантова Ю.В., Фирсова Н.В.. Подгорный О.В., Смирнова Ю.А., Сухих Г.Т., Зиновьева Р.Д. Исследование экспрессии P-III тубулина в тканях глаза человека в пренатальном развитии // Известия РАН. Серия биологическая. 2008. № 2. С. 146-150.

3. Фирсова Н.В.. Зиновьева Р.Д. Молекулярно-генетические аспекты развития глаза человека // Известия РАН. Серия биологическая. 2008. № 4. С. 398-408.

б) статьи в других научных сборниках:

1. Панова И.Г., Маркитантова Ю.В., Смирнова Ю.А., Фирсова Н.В., Сухих Г.Т., Зиновьева Р.Д., Миташов В.И. Молекулярно-генетические механизмы морфогенеза роговой оболочки глаза человека // Сб.: Современные методы диагностики и лечения заболеваний роговицы и склеры. Научно-практическая конференция. Москва. 2007 г. С. 117-120.

2. Маркитантова Ю.В., Фирсова Н.В., Смирнова Ю.А., Панова И.Г., Милюшина Л.А., Подгорный О.В., Сухих Г.Т., Александрова М.А., Зиновьева Р.Д., Миташов В.И. Исследование молекулярно-генетических механизмов пролиферации и дифференцировки клеток в пренатальном развитии глаза человека // Сб.: Пролиферативный синдром в офтальмологии. IV Международная научно-практическая конференция. Москва. 2006 г.

3. Маркитантова Ю.В., Фирсова Н.В., Авдонин П.П., Панова И.Г., Смирнова Ю.А., Зиновьева Р.Д. Исследования молекулярно-генетических основ развития и регенерации сетчатки позвоночных // Сб.: Пролиферативный синдром в офтальмологии. V Международная научно-практическая конференция. Москва. 2008 г. С. 16-19.

4. Панова И.Г., Фирсова Н.В.. Милюшина Л.А., Маркитантова Ю.В., Смирнова Ю.А., Дубровина И.В., Подгорный О.В., Зиновьева Р.Д. Экспрессия ЫН-тубулина в тканях глаза человека. Сб.: Пролиферативный синдром в офтальмологии. V Международная научно-практическая конференция. Москва. 2008 г. С. 10-13.

в) тезисы конференций:

1. Фирсова Н.В.. Маркитантова Ю.В., Панова И.Г., Зиновьева Р.Д., Миташов В.И. Исследование экспрессии TGFbeta2 и транскрипционных факторов Рахб, Pitx2 и Foxcl в ходе развития глаза человека // Онтогенез. Тезисы докладов конференции молодых ученых Института биологии развития. Москва, 2006 г.

2. Фирсова Н.В.. Маркитантова Ю.В.. Смирнова Ю.А., Панова И.Г., Сухих Г.Т., Зиновьева Р.Д., Миташов В.И. Исследование роли гена Р1ТХ2 в морфогенезе глаза человека // Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза. Симпозиум с международным участием. Москва. 2007 г. С. 159-

3. Фирсова Н.В. Исследование активности регуляторных факторов в ходе морфогенеза глаза человека // Онтогенез. Тезисы докладов конференции молодых ученых Института биологии развития. Москва. 2008 г. С. 11-12.

4. Фирсова Н.В.. Маркитантова Ю.В., Зиновьева Р.Д. Молекулярные механизмы развития глаза человека // Сборник трудов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск. 2008 г. С. 238.

5. Фирсова Н.В.. Маркитантова Ю.В., Смирнова Ю.А., Сухих Г.Т., Панова И.Г., Зиновьева Р.Д. Изучение экспрессии генов - регуляторов развития переднего сегмента глаза человека // Сб.: Пролиферативный синдром в офтальмологии. V Международная научно-практическая конференция. Москва. 2008 г. С. 14-15.

С. 319.

161.

Подписано в печать 3.12.2008 г. Печать на ризографе. Тираж 100 экз. Заказ № 1418. Объем 1,3 п.л. Отпечатано в типографии ООО "Алфавит 2000", ИНН: 7718532212, г. Москва, ул. Маросейка, д.6/8, стр. 1, т. 623-08-10, www.alfavit2000.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фирсова, Наталья Викторовна

Введение

Глава 1. Обзор литературы. Молекулярно-генетические аспекты развития глаза позвоночных, в том числе человека

1.1. Транскрипционные факторы, принимающие участие в развитии глаза позвоночных

1.2. Роль сигнальных белков в морфогенезе глаза

1.3. Определяющая роль взаимодействий регуляторных факторов в развитии глаза

1.4. Медико-биологические аспекты развития глаза человека

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Объект исследования

2.2. Препарирование тканей

2.3. Выделение тотРНК

2.4. Выделение мРНК

2.5. Синтез кДНК

2.6. Контроль на загрязнение геномной ДНК

2.7. Нормировка кДНК библиотек

2.8. Конструирование праймеров

2.9. Полимеразная цепная реакция

2.10. Агарозный электрофорез

2.11. Выделение ДНК из агарозного геля

2.12. Клонирование в векторе pCR® II-TOPO®

2.13. Выделение плазмидной ДНК

2.14. Подготовка РНК зондов

2.15. In situ гибридизация

2.16. Иммуногистохимия

2.17. Интернет-ресурсы

Глава 3. Результаты исследования

3.1. Анализ уровня экспрессии генов TGFhetal, PITX2 и FOXC1 в структурах глаза в ходе развития

3.2. Локализация мРНК PITX2 в тканях развивающегося глаза

3.3. Локализация белков TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в тканях глаза на различных стадиях развития

3.3.1. Локализация белка TGFbeta

3.3.2. Локализация белка PITX

3.3.3. Локализация белка FOXC

Глава 4. Обсуждение

4.1. Экспрессия TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в роговице и иридо-корнеальном углу глаза человека в ходе пренатального развития

4.2. Экспрессия TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в хрусталике в ходе пренатального развития

4.3. Экспрессия TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в сетчатке в ходе пренатального развития

4.4. Экспрессия TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в цилиарном теле в ходе пренатального развития

4.5. Экспрессия TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в пигментном эпителии в ходе пренатального развития

Введение Диссертация по биологии, на тему "Пространственные и временные характеристики экспрессии генов, кодирующих регуляторные факторы TGFbeta2, PITX2 и FOXC1, в тканях глаза человека в ходе пренатального развития"

Изучение экспрессии регуляторных генов, их дифференциальной активности в ходе развития организма, участие в дифференцировке клеток различного типа представляет собой одно из центральных направлений современной биологии, находящееся на стыке молекулярной генетики и биологии развития. Глаз является уникальной модельной системой для исследования молекулярно-генетических механизмов эмбриональной индукции, пролиферации, дифференцировки, миграции клеток, апоптоза и других процессов в ходе его развития в онтогенезе.

Глаз позвоночных, в том числе человека, состоит из морфологически и функционально различающихся тканей, в формировании которых принимают участие различные эмбриональные ткани: поверхностная эктодерма, нейроэктодерма и мезенхима — производная нервного гребня. В ходе эмбриогенеза, кроме экспрессии основного каскада регуляторных факторов, важную роль играют и межклеточные взаимодействия тканей.

Развитие глаза обеспечивается согласованной работой множества регуляторных факторов, к которым относятся транскрипционные и РНК-связывающие факторы и сигнальные белки. Большинство этих факторов активирует или ингибирует транскрипцию генов-мишеней. В настоящее время в литературе существует много данных по молекулярно-генетическим исследованиям формирования и нормального функционирования отдельных тканей глаза позвоночных. Многие работы посвящены изучению паттерна экспрессии регуляторных генов в ходе развития хрусталика, дифференцировки клеток сетчатки, иридо-корнеального угла, трабекулярной сети и др. (Cvekl, Piatigorsky, 1996; Close et al., 2005; Hsieh et ah, 2002; Zhao et ah, 2002). Существенным достижением последних десятилетий в области исследования глаза было обнаружение высокой консервативности молекулярных механизмов, направляющих развитие глаза у представителей различных систематических групп. Большой прогресс в понимании молекулярно-генетических механизмов развития достигнут при изучении глаза дрозофилы (Pignoni et al., 1997; Chen et al., 1997; Haider et al., 1998). Полученные данные послужили отправной точкой для дальнейших исследований представителей других систематических групп животных. В геноме позвоночных, в том числе и человека, идентифицирован ряд высоко консервативных регуляторных генов, направляющих развитие глаза (Heanue et al., 2002; Hsieh et al., 2002; Tyas et al., 2006). В настоящее время известно, что для правильного формирования глаза необходима согласованная работа основного каскада селективно экспрессирующихся транскрипционных факторов Р АХ6/Е YA1 /SIX3 /D АСН1 /PROX1 /Р1ТХ2. На вершине этой иерархии находится ген Рахб/РАХб, который играет определяющую роль в развитии глаза (Gehring, 1996). Изучение механизмов генетического контроля развития глаза имеет не только фундаментальное, но и прикладное значение, так как нарушение экспрессии регуляторных генов глазного поля является причиной возникновения множества наследственных заболеваний глаз (Glaser et al., 1994; Graw, 2003). Однако данные, существующие в литературе, разрознены и в основном касаются экспрессии генов, кодирующих регуляторные факторы, в отдельных структурах глаза. Кроме того, исследования генотип-фенотип корреляции при заболеваниях глаз не позволяют составить полное представление о событиях, происходящих в ходе нормального развития глаза.

Мы сосредоточили внимание на полифункциональных регуляторных факторах: сигнальном белке TGFbeta2 и транскрипционных факторах PITX2 и FOXC1, поскольку известно, что гены, кодирующие эти факторы, начинают экспрессироваться на самых ранних этапах развития глаза позвоночных. Существуют данные о том, что TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 являются участниками одного сигнального каскада. Нарушение работы любого из этих регуляторных факторов приводит к серьезным, часто фенотипически сходным аномалиям развития глаза.

Целью настоящей диссертационной работы являлось изучение пространственных и временных характеристик экспрессии генов, кодирующих сигнальный белок TGFbeta2 и транскрипционные факторы PITX2, FOXC1, в различных структурах глаза человека на последовательных стадиях пренатального развития (8-22 недели беременности).

Основные задачи работы:

1. Сконструировать кДНК библиотеки, комплементарные мРНК из различных тканей глаза человека с 9.5 до 22 недели пренатального развития.

2. Идентифицировать и изучить уровень экспрессии генов TGFbetal, Р1ТХ2 и FOXC1 в тканях глаза на последовательных стадиях развития.

3. Исследовать локализацию белковых продуктов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в тканях глаза с 8 до 22 недели развития.

4. Выявить пространственные и временные особенности экспрессии анализируемых генов в различных структурах развивающегося глаза человека.

Детальный анализ полученных данных позволил сделать выводы об особенностях экспрессии генов, кодирующих регуляторные факторы, в ходе развития глаза человека, а также высказать предположения о роли этих факторов в гистогенезе тканей глаза.

Заключение Диссертация по теме "Биология развития, эмбриология", Фирсова, Наталья Викторовна

Выводы

1. Впервые проведено комплексное исследование характера экспрессии генов, кодирующих регуляторные факторы TGFbeta2, PITX2 и FOXC1, в тканях глаза человека на 8-22-й неделях пренатального развития.

2. Показано, что сигнальный белок TGFbeta2 и транскрипционные факторы PITX2 и FOXC1 принимают участие в формировании тканей глаза, имеющих различное эмбриональное происхождение: эктодермальное, нейромезенхимное и нейральное. Экспрессия генов TGFbeta2, PITX2 и FOXCI в глазу не является тканеспецифической.

3. Впервые получены данные об экспрессии в формирующейся сетчатке и ПЭ человека генов, кодирующих транскрипционные факторы PITX2 и FOXC1, которые считаются регуляторами развития переднего сегмента глаза. Установлено, что уровень экспрессии этих генов в клетках сетчатки зависит от степени их дифференцировки.

4. Наличие транскриптов PITX2 в мигрирующих клетках нейромезенхимы и увеличение уровня экспрессии генов TGFbeta2 и PITX2 в краевой области сетчатки являются доказательствами того, что молекулярно-генетические процессы, в регуляции которых принимают участие TGFbeta2 и PITX2 предшествуют видимым признакам морфогенеза цилиарно-радужного комплекса.

5. Показано, что экспрессия TGFbeta2 в роговице, хрусталике и сетчатке в ходе развития имеет дифференциальный характер, который зависит от типа клеток. В роговице региональные изменения локализации белка TGFbeta2 могут быть связаны со специфичностью экспрессии TGFbeta2 в эндотелиальных клетках на 17 неделе развития, а в хрусталике - с участием TGFbeta2 в гистогенезе в качестве регулятора пролиферации. В сетчатке в ходе развития источником секретируемого белка TGFbeta2 являются ганглиозные и мюллеровские клетки.

Работа выполнена при поддержке РФФИ, гранты №05-04-48026, №0804-00462.

4.6. Заключение

С помощью молекулярно-генетических и иммуногистохимических методов впервые проведено исследование характера экспрессии генов, кодирующих сигнальный белок и транскрипционные факторы, в различных тканях глаза человека на последовательных стадиях пренатального развития. На рисунке 32 приведена схема, суммирующая полученные результаты о локализации регуляторных факторов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в глазу человека на различных этапах развития. Выявление широкого спектра тканей глаза, в которых обнаружено наличие белков TGFbeta2, PITX2 и FOXC1, приводит к заключению, что экспрессия этих регуляторных факторов в глазу не является тканеспецифической. Анализ полученных результатов и данных литературы позволяет заключить, что эти регуляторные факторы, функционирующие в составе TGFbeta сигнального пути, контролируют развитие структур глаза, имеющих различное эмбриональное происхождение.

Нужно признать, что имеющейся в литературе информации, полученной в основном при изучении моделей животных, в частности, мышей, недостаточно, чтобы объяснить молекулярно-генетические механизмы развития глаза. Полученные нами данные являются основой для дальнейших исследований, направленных на изучение генной регуляции в ходе морфогенеза глаза.

Исследования глаза человека являются необходимыми из-за ряда особенностей морфологии, отличающих человека от других позвоночных. Проведение некоторых экспериментальных исследований (например, направленный мутагенез, нокаут генов и т.д.) возможно только с использованием моделей животных. Таким образом, интеграция знаний, полученных при исследовании механизмов развития глаза человека и других позвоночных, позволяет получить наиболее целостную картину.

Несмотря на то, что мРНК TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 выявлены во всех проанализированных в настоящей работе тканях глаза, пространственные и временные характеристики распределения соответствующих белковых продуктов имеют ряд различий. Причем, гены, кодирующие транскрипционные факторы PITX2 и FOXC1, имеют сходный характер экспрессии, несколько отличающийся от характера экспрессии гена, кодирующего сигнальный белок TGFbeta2. Причины этого могут быть найдены при изучении взаимодействий этих регуляторных факторов, а также при идентификации и более подробном анализе промежуточных звеньев сигнального каскада TGFbeta.

Изучение регуляторных механизмов и набора регуляторных генов, экспрессия которых необходима для формирования глаза, находится в начальной фазе исследования. Огромное значение этого вопроса для понимания молекулярно-генетических основ развития и функционирования организмов, несомненно, будет стимулировать быстрый прогресс в развитии этой области биологии развития.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фирсова, Наталья Викторовна, Москва

1. Маркитантова Ю.В., Смирнова Ю.А., Панова И.Г., Сухих Г.Т., Зиновьева Р.Д., Миташов В.И. Исследование экспрессии регуляторных генов Рахб, Proxl, Pitx2 в дифференцирующихся клетках глаза плода человека // Изв. РАН. Сер. Биол. 2006. № 4. С. 421-429.

2. Ahmad I., Das A.V., James J., Bhattacharya S., Zhao X. Neural stem cells in the mammalian eye: types and regulation // Sem. Cell Dev. Biol. 2004. V. 15. P. 53-62.

3. Amaya L., Taylor D., Russell-Eggitt I., Nischal K.K., Lengyel D. The morphology and natural history of childhood cataracts // Surv. Ophthalmol. 2003. V. 48. №2. P. 125-144.

4. Asai-Coakwell M., Backhouse C., Casey R.J., Gage P.J., Lehmann O.J. Reduced human and murine corneal thickness in an Axenfeld-Rieger syndrome subtype // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2006. V. 47. № 11. P. 4905-4909.

5. Ashery-Padan R., Gruss P. Рахб lights-up the way for eye development // Curr. Opin. Cell Biol. 2001. V. 13. P. 706-714.

6. Ashery-Padan R., Marquardt Т., Zhou X., Gruss P. Рахб activity in the lens primordium is required for lens formation and for correct placement of a single retina in the eye // Genes Dev. 2000. V. 14. P. 2701-2711.

7. Barthel L.K., Raymond P.A. In situ hybridization studies of retinal neurons // Methods Enzymol. 2000. V. 316. P. 579-590.

8. Beebe D.C., Coats J.M. The lens organizes the anterior segment: specification of neural crest cell differentiation in the avian eye // Dev. Biol. 2000. V. 220. P. 424-431.

9. Beebe D., Garcia C., Wang X., Rajagopa R., Feldmeier M., Kim J., Chytil A., Moses H., Ashery-Padan R., Rauchman M. Contributions by members of the TGFbeta superfamily to lens development // Int. J. Dev. Biol. 2004. V. 48. P. 845-856.

10. Bian Z.M., Elner S.G., Elner V.M. Regulation of VEGF mRNA expression and protein secretion by TGF-beta2 in human retinal pigment epithelial cells // Exp. Eye Res. 2007. V. 84. № 5. P. 812-822.

11. Chamberlain C., Mcavoy J. Induction of lens fibre differentiation by acidic and basic fibroblast growth factor // Growth Factors. 1989. V. 2. № 1. P. 125134.

12. Chen R., Amoui M., Zhang Z., Mardon G. Dachshund and eyes absent proteins form a complex and function synergistically to induce ectopic eye development in Drosophila // Cell. 1997. V. 91. № 7. P 893-903.

13. Cheng H.C., Но T.C., Chen S.L., Lai H.Y., Hong K.F., Tsao Y.P. // Mol. Vis. 2008. V. 18. № 14. P. 95-104.

14. Chow R., Altman C., Lang R., Hemmati-Brivanlou А. Рахб induces ectopic eyes in a vertebrate // Development. 1999. V. 126. P. 4213-4222.

15. Close J., Gumuscu В., Reh T. Retinal neurons regulate proliferation of postnatal progenitors and Muller glia in the rat retina via TGFp signaling // Development. 2005. V. 132. P. 3015-3026.

16. Cox C.J., Espinoza Н.М., McWilliams В., Chappell К., Morton L., Hjalt T.A., Semina E.V., Amendt B.A. Differential regulation of gene expression by PITX2 isoforms // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. № 28. P. 25001-25010.

17. Creuzet S., Vincent C., Couly G. Neural crest derivatives in ocular and periocular structures // Int. J. Dev. Biol. 2005. V. 49. P. 161-171.

18. Cvekl A., Piatigorsky J. Lens development and crystalline gene expression: many roles for Рахб // BioEssays. 1996. V. 18. P. 621-630.

19. Cvekl A., Tamm E.R. Anterior eye development and ocular mesenchyme: new insights from mouse models and human diseases // Bioessays. 2004. V. 26.№ 4. P. 374-386.

20. Davies A.F., Mirza G., Flinter F., Ragoussis J. An interstitial deletion of 6p24-p25 proximal to the FKHL7 locus and including AP-2alpha that affects anterior eye chamber development // J. Med. Genet. 1999. V. 36. № 9. P. 70810.

21. Davis J.A., Reed R.R. Role of Olf-1 and Pax-6 transcription factors in neurodevelopment // J. Neurosci. 1996. V. 16. P. 5082-5094.

22. Dawes L.J., Elliott R.M., Reddan J.R., Wormstone Y.M., Wormstone I.M. Oligonucleotide microarray analysis of human lens epithelial cells: TGFbeta regulated gene expression // Mol. Vis. 2007. V. 13. P. 1181-1197.

23. De Jong W.W. Evolution of lens and crystallins. Molecular and cellular biology of the eye lens. Willey, New York, NY. 1981. P. 221-278.

24. Diehl A., Zareparsi S., Qian M., Khanna R., Angeles R., Gage P.J. Extraocular muscle morphogenesis and gene expression are regulated by Pitx2 gene dose // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2006. V. 47. № 5. P. 1785-1793.

25. Doe С., Chu-LaGraff Q., Wright D., Scott M. The prospero gene specifies cell fates in the Drosophila central nervous system // Cell. 1991. V. 65. № 3. P. 451-464.

26. Du Y., Funderburgh M. L., Mann M. M., SundarRaj N., Funderburgh J.L. Multipotent stem cells in human corneal stroma // Stem Cells. 2005. V. 23. P. 1266-1275.

27. Duncan M.K., Haynes J.L, Cvekl A., Piatigorsky J. Dual role for PAX6: a transcriptional repressor of lens fiber cell-specific beta-crystallin genes // Moll. Cell Biol. 1998. V. 18. P. 5579-5586.

28. Duncan M.K., Kozmik Z., Cveklova K., Piatigorsky J., Cvekl A. Overexpression of PAX6(5a) in lens fiber cells results in cataract and upregulation of (alpha)5(beta)l integrin expression // J. Cell Sci. 2000. V. 113. P. 3173-3185.

29. Dunker N., Krieglstein K. Reduced programmed cell death in the retina and defects in lens and cornea of Tgfbeta2 (-/-) Tgfbeta3 (-/-) double-deficient mice // Cell Tissue Res. 2003. V. 313. № 1. P. 1 -10.

30. Dyer M., Livesey F. Proxl function controls progenitor cell proliferation and horizontal cell genesis in the mammalian retina // Nat. Genet. 2003. V. 34. № 1. P. 53-58.

31. Engenheiro E., Saraiva J., Carreira L, Ramos L., Ropers H.H., Silva E., Tommerup N., Tiimer Z. Cytogenetically invisible microdeletions involving PITX2 in Rieger syndrome // Clin. Genet. 2007. V. 72. № 5. P. 464-470.

32. Evans A.L., Gage F.J. Expression of the homeobox gene Pitx2 in neural crest is required for optic stalk and ocular anterior segment development // Hum. Mol. Gen. 2005. V. 14. № 22. P. 3347-3359.

33. Fleenor D.L., Shepard A.R., Hellberg P.E., Jacobson N., Pang I.H., Clark A.F. TGFbeta2-induced changes in human trabecular meshwork: implications for intraocular pressure // Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 2006. V. 47. № 1. P. 226234.

34. Furuta Y., Hogan В. BMP4 is essential for lens induction in the mouse embryo // Genes Dev. 1998. V. 12. № 23. P. 3764-3775.

35. Gage P.J., Rhoades W., Prucka S.K., Hjalt T.A. Fate maps of neural crest and mesoderm in the mammalian eye // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2005. V. 46. № 11. P. 4200-4208.

36. GageP.J., Camper S.A. Pituitary homeobox 2, a novel member of the bicoid-related family of homeobox genes, is a potential regulator of anterior structure formation // Hum. Mol. Genet. 1997. V. 6. № 3. P. 457-464.

37. Gatherer D., Ten Dijke P., Baird D.T., Akhurst R.J. Expression of TGF-beta isoforms during first trimester human embryogenesis // Development. 1990. V. 110. №2. P. 445-460.

38. Gehring W. The master control gene for morphogenesis and evolution of the eye // Genes Cells. 1996. V.l. P. 11-15.

39. Glaser Т., Jepeal L., Edwards J.G., Young S.R., Favor J., Maas R.L. PAX6 gene dosage effect in a family with congenital cataracts, aniridia, anophthalmia and central nervous system defects //Nat. Genet. 1994. V. 7. № 4. P. 463-471.

40. Gottanka J., Chan D., Eichhorn M., Lutjen-Drecoll E., Ethier C.R. Effects of TGF-p2 in perfused human eyes // Invest. Ophthalmol. 2004. V. 45. № 1. P. 153-158.

41. Gordon-Thomson C., de Iongh R.U., Hales A.M., Chamberlain C.G., McAvoy J.W. Differential cataractogenic potency of TGFbetal, -beta2, and -beta3 and their expression in the postnatal rat eye // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1998. V. 39. P. 1399-1409.

42. Gould D.B., Smith R.S., John W.M. Anterior segment development relevant to glaucoma // Int. J. Dev. Biol. 2004. V. 48. P. 1015-1029.

43. Graham A., Francis-West P., Brickell P., Lumsden A. The signaling molecule BMP4 mediates apoptosis in the rhombencephalic neural crest // Nature. 1994. V. 372. P. 684-686.

44. Graw J. The genetic and molecular basis of congenital eye defects // Nat. Rev. Gen. 2003. № 4. P. 876-888.

45. Griep A.E. Cell cycle regulation in the developing lens // Semin. Cell Dev. Biol. 2006. V. 17. P. 686-697.

46. Grindley J., Davidson D., Hill R. The role of Pax-6 in eye and nasal development//Development. 1995. V. 121. P. 1433-1442.

47. Haider G., Callaerts P., Flister S., Walldorf U., Kloter U., Gehring W.J. Eyeless initiates the expression of both sine oculis and eyes absent during Drosophila compound eye development // Development. 1998. V. 125. № 12. P. 2181-2191.

48. Haider G., Callaerts P., Gehring W. Induction of ectoping eye by targeted expression of the eyeless gene in Drosophila // Science. 1995. V. 267. P. 17881792.

49. Hanson I., Fletcher J., Jordan Т., Brown A., Taylor D., Adams R.J., Punnett H.H., van Heyningen V. M utations at the PAX6 locus are found in heterogeneous anterior segment malformations including Peters' anomaly // Nat. Genet. 1994. V. 6. P. 168-173.

50. Hatakeyama J., Kageyma R. Retinal cell fate determination and bHLH factors // Sem. Cell Dev. Biol. 2004. V. 15. P. 83-89.

51. Hayashi H., Kume T. Foxc transcription factors directly regulate D114 and Hey2 expression by interacting with the VEGF-Notch signaling pathways in endothelial cells // PLoS ONE. 2008. V. 3. № 6. P. 1-9.

52. Hjalt T.A., Semina E.V., Amendt B.A., Murray J.C. The Pitx2 protein in mouse development // Dev. Dyn. 2000. V. 218. P. 195-200.

53. Hogan B. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development// Genes Dev. 1996. V. 10. P. 1580-1594.

54. Holmberg J., Liu C.Y., Hjalt T.A. Pitx2 gain-of-function in Rieger syndrome eye model // Am. J. Pathol. 2004. V. 165. № 5. P. 1633-1641.

55. Hsieh Y., Zhang X., Lin E., Oliver G., Yang X.J. The homeobox gene Six3 is a potential regulator of anterior segment formation in the chick eye // Dev. Biol. 2002. V. 248. P. 265-280.

56. Huang L., Chi J., Berry F., Footz Т.К., Sharp M.W., Walter M.A. Human p32 is a novel FOXC1-interacting protein that regulates FOXC1 transcriptional activity in ocular cells // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2008 Aug 1. Epub ahead of print.

57. Itoh Y., Kimoto K., Imaizumi M., Nakatsuka K. Inhibition of RhoA/Rho-kinase pathway suppresses the expression of type I collagen induced by TGF-beta2 in human retinal pigment epithelial cells // Exp. Eye Res. 2007. V. 84. № 3. p. 464-472.

58. Kamachi Y., Sochanathan S., Liu Q., Breitman M., Lovell-Badge R., Kondoh H. Involvement of SOX proteins in lens-specific activation of crystalline genes // EMBO J. 1995. V. 14. P. 3510-3519.

59. Kamachi Y., Uchikawa M., Tanouchi A., Sekido R., Kondoh H. Рахб and SOX2 form a co-DNA-binding partner complex that regulates initiation of lens development// Genes. Dev. 2001. V. 15. P. 1272-1286.

60. Keck P.J., Hauser S.D., Krivi G., Sanzo K., Warren Т., Feder J., Connolly D.T. Vascular permeability factor, an endothelial cell mitogen related to PDGF // Science. 1989. V. 246. P. 1309-1312.

61. Kidson S.H., ICume Т., Deng K., Winfrey V., Hogan B.L. The forkhead/winged-helix gene, Mfl, is necessary for the normal development of the cornea and formation of the anterior chamber in the mouse eye // Dev. Biol. 1999. V. 211. P. 306-322.

62. Kimoto K., Nakatsuka K., Matsuo N., Yoshioka H. p38 МАРК mediates the expression of type I collagen induced by TGF-beta 2 in human retinal pigment epithelial cells ARPE-19 // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2004. V. 45. № 7. P. 2431-2437.

63. Kozlowski K., Walter M.A. Variation in residual PITX2 activity underlies the phenotypic spectrum of anterior segment developmental disorders // Hum. Mol. Genet. 2000. V. 9. № 14. P. 2131-2139.

64. Kume Т., Deng K.Y., Winfrey V., Gould D.B., Walter M.A., Hogan B.L. The forkhead/winged gelix gene MF1 is disrupted in the pleiotropic mouse mutation congenital hydrocephalus // Cell. 1998. V. 93. P. 985-996.

65. LaGier A.J., Yoo S.H., Alfonso E.C., Meiners S., Fini M.E. Inhibition of human corneal epithelial production of fibrotic mediator TGF-2 by basement membrane-like extracellular matrix // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2007. V. 48. №3. P. 1061-1071.

66. Lamba P., Hjalt T.A., Bernard D.J. Novel forms of Paired-like homeodomain transcription factor 2 (PITX2): generation by alternative translation initiation and mRNA splicing // BMC Mol. Biol. 2008. V. 9. № 31.

67. Lee E.H., Joo C.K. Role of transforming growth factor-beta in transdifferentiation and fibrosis of lens epithelial cells // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1999. V. 40. № 9. P. 2025-2032.

68. Lee J.H., Wan X.H., Song J., Kang J.J., Chung W.S., Lee E.H., Kim E.K. TGF-beta-induced apoptosis and reduction of Bcl-2 in human lens epithelial cells in vitro // Curr. Eye Res. 2002. V. 25.№ 3. P. 147-153.

69. Lengler J., Graw J. Regulation of the human SIX3 gene promoter // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. V. 287. № 2. P. 372-376.

70. Lengler J., Krauzs E., Tomarev S., Prescott A., Quinlan R.A., Graw J. Antagonistic action of Six3 and Proxl at the y-crystallin promoter // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. № 2. P. 515-526.

71. Liu W., Lagutin O., Mende M., Streit A., Oliver G. Six2 activation of Рахб expression is essential for mammalian lens induction and specification // The EMBO Journal. 2006. V. 25. P. 5383-5395.

72. Maier P., Broszinski A., Iieizmann U., Bohringer D., Reinhardau T. Active transforming growth factor-beta2 is increased in the aqueous humor of keratoconus patients // Mol. Vis. 2007. V. 13. P. 1198-202.

73. Mann I. The development of the human eye. L.: Brit. Med. Assoc. 1949. P.313.

74. Martin D.M., Skidmore J.M., Fox S.E., Gage P.J., Camper S.A. Pitx2 distinguishes subtypes of terminally differentiated neurons in the developing mouse neuroepithelium //Dev. Biol. 2002. V. 252. P. 84-99.

75. Martin D.M., Skidmore J.M., Philips S.T. et al. PITX2 is required for normal development of neurons in the mouse subthalamic nucleus and midbrain // Dev. Biol. 2004. V. 267. P. 93-108.

76. Mikkola I., Bruun J.A., Holm Т., Johansen T. Superactivation of Рахб-mediated transactivation from paired domain-binding sites by dnaindependent recruitment of different homeodomain proteins // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 4109-4118.

77. Mirzayans F., Gould D.B., H'eon E., Billingsley G.D., Cheung J.C., Mears A.J., Walter M.A. Axenfeld-Rieger syndrome resulting from mutation of the FKHL7 gene on chromosome 6p25 // Europ. J. Hum. Genet. 2000. V. 8. P. 71 -74.

78. Miyazono K. Regulation of transforming growth factor-beta signaling and vascular diseases // Cornea. 2002. V. 21. P. 48-53.

79. Nishina S., Kohsaka S., Yamaguchi Y., Handa H., Kawakami A., Fujisawa H., Azuma N. PAX6 expression in the developing human eye // Br. J. Ophthalmol. 1999. V. 83. P. 723-727.

80. O'Dwyer E.M., Jones D.C. Dental anomalies in Axenfeld-Rieger syndrome // Int. J. Paediatr. Dent. 2005. V. 15. № 6. P. 459-463.

81. Ogino H., Yasuda K. Sequential activation of transcription factors in lens induction // Dev. Growth Differ. 2000. V. 42. P. 437-448.

82. Oliver G., Sosa-Pineda В., Geisendorf S., Spana E.P., Doe C.Q., Gruss E.P. Proxl, a prospero-related homeobox gene expressed during mouse development //Mech. Dev. 1993. V. 44. P. 3-16.

83. Ozcan A.A., Ozdemir N., Canataroglu A. The aqueous levels of TGF-beta2 in patients with glaucoma // Int. Ophthalmol. 2004. V. 25. № 1. P. 19-22.

84. Pasquale L.R., Dorman-Pease M.E., Lutty G.A., Quigley H.A., Jampel H.D. Immunolocalization of TGF-beta 1, TGF-beta 2, and TGF-beta 3 in the anterior segment of the human eye // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1993. V. 34. № 1. P. 23-30.

85. Perees N.S., Perillo E. TGF and TGF-ЬЗ immunoreactivity within the ciliary epithelium // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1994. V. 35. № 2. P. 453-457.

86. Pignoni F., Ни В., Zipursky S.L. Identification of genes required for Drosophila eye development using a phenotypic enhancer-trap // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. № 17. P. 9220-9225.

87. Quigley H.A., Nickells R.W., Kerrigan L.A., Pease M.E., Thibault D.J., Zack D.J. Retinal ganglion cell death in experimental glaucoma and after axotomy occurs by apoptosis // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1995. V. 36. № 5. P. 774-786.

88. Quiring R., Walldorf U., Kloter U., Gehring W. Homology of the eyeless gene of Drosophila to the Small eye gene in mice and Aniridia in humans // Science. 1994. V. 265. P. 785-789.

89. Reza H., Takahashi Y., Yasuda K. Stage-dependent expression of Рахб in ' optic vesicle/cup regulates patterning genes through signaling molecules // Differentiation. 2007. Epub ahead of print.

90. Saika S., Saika S., Liu C.Y., Azhar M., Sanford L.P., Doetschman Т., Gendron R.L., Kao C.W., Kao W.W. TGFbeta2 in corneal morphogenesis during mouse embryonic development // Dev. Biol. 2001. V. 240. № 2. P. 419432.

91. Saleem R.A., Banerjee-Basu S., Murphy T.C., Baxevanis A, Walter M.A. Essential structural and functional determinants within the forkhead domain of FOXC1 //Nucleic Acids Research. 2004. V. 32. № 14. P. 4182-4193.

92. Shirai K., Saika S., Tanaka Т., Okada Y., Flanders K.C., Ooshima A., Ohnishi Y. A new model of anterior subcapsular cataract: involvement of TGFbeta/Smad signaling // Mol. Vis. 2006. V. 14. № 12. P. 681-691.

93. Shiraishi A., Converse R.L., Liu C.Y., Zhou F., Kao C.W., Kao W.W. Identification of the cornea-specific keratin 12 promoter by in vivo particle-mediated gene transfer // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1998. V. 39. P.2554-2561.

94. Smith W.C. Tgfbeta inhibitors. New and unexpected requirements in vertebrate development//Trends Genet. 1999. V. 15. P. 3-5.

95. Sowden J.C. Molecular and developmental mechanisms of anterior segment dysgenesis //Eye. 2007. V. 21. P. 1310-1318.

96. Stanescu D., Iseli H.P., Schwerdtfeger K., Ittner L.M., Reme C.E., Hafezi F. Continuous expression of the homeobox gene Рахб in the ageing human retina //Eye. 2007. V. 21. P. 90-93.

97. Terzic J., Saraga-Babic M. Expression pattern of PAX3 and PAX6 genes during human embryogenesis // Int. J. Dev. Biol. 1999. V. 43 P. 501-508.

98. Tomarev S.I., Callaerts P., Kos L., Zinovieva R., Haider G., Gehring W., Piatigorsky J. Squid Рахб and eye development // Proc. Natl. Acad. Sci. 1997. V. 94. P. 2421-2426.

99. Tomarev S.I., Sundin O., Banerjee-Basu S., Duncan M.K., Yang J.M., Piatigorsky J. Chicken homeobox gene Proxl related to Drosophila prospero is expressed in developing lens end retina // Develop. Dyn. 1996. V. 206. P. 354367.

100. Tomarev S., Wistow G., Raymond V., Dubois S., Malyukova I. Gene expression profile of the human trabecular meshworlc: NEIBank sequence tag analysis // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2003. V. 44. № 6. P. 2588-96.

101. Treessmar K., Loosli F., Wittbrodt J. A screen for co-factors of Six3 // Mech. Dev. 2002. V. 117. P. 103-112.

102. Tropepe V., Coles B.L., Chiasson B.J., Horsford D.J., Elia A.J., Mclnnes R.R., van der Kooy D. Retinal stem cells in the adult mammalian eye. // Science. 2000. V. 287. P. 2032-2036.

103. Tyas D.A., Simpson T.I., Carr C.B., Kleinjan D.A., van Heyningen V., Mason J.O., Price D.J. Functional conservation of Рахб regulatory elements in humans and mice demonstrated with a novel transgenic reporter mouse // BMC Dev. Biol. 2006. №4. P. 6-21.

104. Van Raamsdonk C., Tilghman S. Dosage requirement and allelic expression of PAX6 during lens placode formation // Development. 2000. V. 127. P. 54395448.

105. Vincent A., Billingsley G., Priston M., Glaser Т., Oliver E., Walter M., Ritch R., Levin A., Heon E. Further support of the role of CYP1B1 in patients with Peters anomaly//Mol. Vis. 2006. V. 12. P. 506-510.

106. Walter M.A. PITs and FOXes in Ocular Genetics // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2003. V. 44. № 4. P. 1402-1405.

107. Wang W.H., McNatt L.G., Shepard A.R. Optimal procedure for extracting RNA from human ocular tissues and expression profiling of the congenital glaucoma gene FOXCI using quantitative RT-PCR // Mol. Vis. 2001. V. 7. P. 89-94.

108. Wawersik S., Purcell P., Rauchman M., Dudley А.Т., Robertson E.J., Maas R. BMP7 acts in murine lens placode development // Dev. Biol. 1999. V. 207. № l.P. 176-188

109. Wigle J.T., Chowdhury К., Gruss P., Oliver G. Proxl function is crucial for mouse lens-fibre elongation //Nat. Genet. 1999. V. 21. № 3. P. 318-322.

110. Wilke T.A., Gubbels S., Schwartz J., Richman J.M. Expression of fibroblast growth factor receptors (FGFR1, FGFR2, FGFR3) in the developing head and face //Dev. Dyn. 1997. V. 210. № 1. P. 41-52.

111. Wormstone I.M., Tamiya S., Eldred J.A., Lazaridis K., Chantry A., Reddan J.R., Anderson I., Duncan G. Characterisation of TGF-beta2 signalling and function in a human lens cell line // Exp. Eye Res. 2004. V. 78. № 3. P. 705714.

112. WuDunn D. Genetic basis of glaucoma // Curr. Opin. Ophthalmol. 2002. V. 13. №2. P. 55-60.

113. Xia K., Wu L., Liu X., Xi X., Liang D., Zheng D., Cai F., Pan Q., Long Z., Dai H., Hu Z., Tang В., Zhang Z., Xia J. Mutation in PITX2 is associated with ring dermoid of the cornea // J. Med. Genet. 2004. V. 41. № 12. P. 129.

114. Xu S., Sunderland M., Coles B. The proliferation and expansion of retinal stem cells require functional Рахб // Dev. Biol. 2007. V. 304. № 2. P. 713-721.

115. Yamagami S., Yokoo S., Mimura Т., Amano S. Effects of TGF-2 on immune response-related gene expression profiles in the human corneal endothelium // Invest. Ophthal. Vis. Sci. 2004. V. 45. № 2. P. 515-521.

116. Yao K., Ye P.P., Tan J., Tang X.J., Shen Tu X.C. Involvement of PI3K/Akt pathway in TGF-beta2-mediated epithelial mesenchymal transition in human lens epithelial cells // Ophthalmic. Res. 2008. V. 40. № 2. P. 69-76.

117. Zhao S., Chen Q., Hung F., Overbeek P. BMP signaling is required for development of the ciliary body // Development. 2002. V. 129. P. 4435-4442.

118. Zhao S., Overbeek P.A. Elevated TGFbeta signaling inhibits ocular vascular development//Dev. Biol. 2001. V. 237. №1.P. 45-53.

119. Zhang W., Cveklova K., Oppermann В., Kantorow M., Cvekl A. Quantitation of PAX6 and PAX6 (5a) transcript levels in adult human lens, cornea, and monkey retina // Mol. Vis. 2001. V. 7. P. 1-5.

120. Zinovieva R.D., Duncan M.K., Johnson T.R., Torres R., Polymeropoulos M.H., Tomarev S.I. Structure and chromosomal localization of the human homeobox gene Proxl // Genomics. 1996. V. 35. P. 517-522.