Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пространственно-временное распределение pH и трансмембранного потенциала вдоль клеточной мембраны водоросли Chara corallina

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Пространственно-временное распределение pH и трансмембранного потенциала вдоль клеточной мембраны водоросли Chara corallina"

На правах рукописи

Лаврова Анастасия Игоревна

ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ рН И ТРАНСМЕМБРАННОГО ПОТЕНЦИАЛА ВДОЛЬ КЛЕТОЧНОЙ МЕМБРАНЫ ВОДОРОСЛИ CHARA CORALLINA.

03.00.02-биофизика

Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2005

Работа выполнена на кафедре биофизики биологического ф-та Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научные руководители:

доктор физико-математических наук профессор Г.Ю. Ризниченко член-корр. РАН доктор биологических наук профессор А.Б.Рубин Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Н.Г. Бухов

доктор физико-математических наук профессор Ю.М. Романовский

Ведущая организация: Институт биофизики клетки РАН

Защита состоится " ..¿¿¿У 2005 г. на заседании Диссертационного совета Д.501.001.96 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, Биологический ф-т, кафедра биофизики, аудитория «Новая».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологический ф-та МГУ

Автореферат разослан "_"_2005 г

Ученый секретарь Совета

доктор биологических наук профессор

SIGO

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Для многих живых организмов экспериментально показано, что вдоль внешней поверхности плазматической мембраны могут возникать участки, различающиеся по значениям рН и трансмембранного потенциала

По предположению многих исследователей существование неоднородных по величине потенциала участков в примембранной области может играть важную роль в физиологии клетки. Так, для многих растений показано, что неравномерное распределение потенциала вдоль поверхности корешков [Weisenseel et al., 1979], корневых волосков [Miller et al., 1985] и пыльцевых трубок [Feijo et al., 1999] предшествует дальнейшей дифференциации тканей и играет важную роль в процессах роста. Также было обнаружено, что неравномерное пространственное распределение потоков у зигот водорослей (Pelvetia, Fucus) определяет дальнейшую структуру клетки во время ее роста [Jaffe, 1977]. В семействе водорослей Characea в результате освещения вдоль мембраны возникают устойчивые зоны с различными величинами рН и электрического потенциала, между которыми циркулируют токи, что возможно способствует ассимиляции органических веществ в клетке. Однако до конца не ясна причинно-следственная связь между явлением образования зон рН и потенциала и физиологическими процессами в органе или клетке.

Первоначально такого рода явления связывали со структурной неоднородностью мембран. В последнее время все большее число исследователей склоняется к тому, что они обусловлены, по-видимому, спецификой работы транспортных систем клетки: АТФ-аз, каналов, антипортеров и т.д. и неоднородным распределением потоков. Иными словами, такие зоны являются примером диссипативных структур в живых системах.

Несмотря на обилие экспериментальных работ в этой области, до сих пор не выявлен общий механизм, связывающий неравномерное распределение потоков с внутренними процессами в клетке, который приводит к образованию зон рН или неоднородному распределению потенциала в примембранной области клетки.

Клетки водорослей Chara corallina и Nitellopsys abtusa являются наиболее

удобным объектом для исследования нрдятщ^рд^щ-^^^тд^д^у шя потоков. Они

БИБЛИОТЕКА

обладают большими размерами (диаметром 0.6 -1.0 мм и длиной 40-80 мм), и имеют более простое строение по сравнению с клетками высших растений или животных. Физиология этих организмов достаточно хорошо исследована.

Был предложен ряд математических моделей [Toko et al, 1988; Leonetti, Pelee, 1994; Bulychev A.A., 2001], в которых рассматриваются возможные механизмы зонообразования. В этих моделях были сделаны попытки либо учесть изменение трансмембранного потенциала, либо изменение концентрации ионов снаружи и внутри клетки.

В настоящей работе построена и исследована модель, в которой одновременно учтены процессы изменения мембранного потенциала и изменение концентрации ионов. Предложен механизм неравномерного распределения потоков в примембранной области клетки, учитывающий взаимосвязь процессов, происходящих на мембране хлоропластов, в цитоплазме и плазматической мембране клетки. Дель и задачи работы

Цель работы: методами математического моделирования исследовать динамику возникновения зон рН вдоль клеточной мембраны водоросли Chara и предложить механизм этого явления. В работе предполагается выполнить следующие задачи:

1. Построить математическую модель, описывающую процессы, связанные с потенциалозависимым ионным транспортом через плазматическую мембрану и перемещением ионов вдоль внешней поверхности плазматической мембраны.

2. Провести исследование модели, включающее:

а) исследование временной и пространственно-временной динамики рН и потенциала в примембранной области клетки водоросли.

б) идентификацию параметров по экспериментальным данным

в) описание наблюдаемых в эксперименте нелинейных процессов: колебания мембранного потенциала и рН, возникновение зон рН и потенциала.

3. Предложить возможный механизм образования зон рН и потенциала, учитывающий связь этих процессов с процессами фотосинтеза.

Научная новизна Впервые построена модель, одновременно учитывающая изменение трансмембранного потенциала и перенос ионов через мембрану.

Подробно описана работа АТФ-азы плазматической мембраны, осуществляющей перенос протонов. Оценены диапазоны изменения параметров модели, соответствующие экспериментальным данным. Впервые предложен механизм возникновения зон рН и трансмембранного потенциала, основанный на взаимосвязи процессов, происходящих при освещении в разных компартментах клетки (хлоропласта, цитоплазма, плазматическая мембрана). Практическое значение Разработанная модель пространственно-временного распределения рН и потенциала вдоль клетки водоросли применима к широкому классу объектов, где встречаются подобные явления. Модель включает в себя подробное описание работы мембранной АТФ-азы, в модели учитываются изменение концентрации протонов снаружи и внутри клетки, потенциала - это позволяет глубже понять бифизические механизмы, лежащие в основе данного класса явлений.

Апробация работы Материалы диссертации докладывались и обсуждались на: 2nd ESMTB School, Siguenza, Spain, 2001; 5th ESMTB conference, Milan, Italy, 2002; 11-той Международной конференции «Математика. Компьютер. Образование.», Дубна, 2004, Пущино, 2005; Ш - ем съезде биофизиков России, Воронеж, 2004; семинарах кафедры биофизики

Публикации По материалам диссертации опубликковано 13 работ, из них две в рецензируемом российском журнале, три в ежегодном сб. научных трудов конференции «Математика. Компьтер. Образование, 8 в сборниках тезисов российских и международных конференций.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит го введения, пяти глав, содержащих описание методов и результатов работы, обсуждения, выводов, приложения и списка литературы. Работа представляет собой рукопись на 131 страницу, включая 37 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1 Явление пространственно-временного распределения рН и мембранного потенциала вдоль внешней поверхности плазматической мембраны.

В настоящее время накоплен большой экспериментальный материал в исследовании зон рН и мембранного потенциала вдоль клеточной поверхности для харовых водорослей [Bulychev А.А. et al., 2003; 2001; 2002; Lucas, 1975].

Были развиты фундаментальные подходы к проблеме пространственно-временного распределения рН и мембранного потенциала вдоль клеточной мембраны и предложен ряд математических моделей, описывающих данное явление. Зоны рН и мембранного потенциала в этих моделях рассматриваются как пример диссипативных структур в биологических системах. Модель Toko et al. [Toko et al, 1988], основанная на электрических характеристиках плазмалеммы, описывает неоднородное распределение потенциала, однако в ней не учитывается изменение концентрации ионов снаружи и внутри клетки. Моделирование процесса установления чередующихся зон рН вдоль клетки Chara получило дальнейшее развитие в работе Leonetti и Pelee [Leonetti, Pelee, 1994], которые рассматривали потоки протонов Н* и бикарбонат-ионов НС03" через мембрану и стационарное электрическое поле, создаваемое этими ионами Полежаевым и др. [Bulychev А.А., 2001] была разработана модель, где также рассматривались потоки Н+ и НС03". Предполагалось, что их взаимодействие и различия в коэффициентах диффузии дает основной вклад в образование чередующихся зон с разными величинами рН. В этих работах потоки ионов описывались феноменологически.

В данной работе предлагается модель процессов, связанных с потенциалозависимым протонным транспортом через плазматическую мембрану и перемещением ионов вдоль внешней поверхности плазматической мембраны. Для описания переноса протонов используются данные о каталитическом цикле работы АТФ-азы и каналов. Распределение потенциала вдоль мембраны описывается исходя из кабельных свойств клетки.

Предполагалось, что результаты моделирования будут сопоставлены с экспериментальными данными по исследованию пространственно-временной

динамики pH в примембранной области клетки водоросли Chara corallina, полученными в лаборатории A.A. Булычева на каф. биофизики Биологического ф-та МГУ им. Ломоносова. В экспериментах было показано, что при интенсивностях, выше пороговых (> 1 Вт/м2), значение pH в «щелочной» зоне увеличивается до 8.510 от исходного уровня pH = 7-8 в темноте, тогда как в «кислой» зоне значение pH уменьшается до 6-6.5. Также существует диапазон интенсивностей (10-100 Вт/м2), в котором величина пиков pH не менялась. В определенном диапазоне освещенности одной и той же величине интенсивности света могут соответствовать два состояния в распределении pH: полностью гомогенное состояние и полностью сформированные структуры.

Кроме того на модели будут воспроизведены результаты экспериментов, представленные в работах [Lucas, 1992, 1995; Fisahn J., 1986, 1988; Vanselow V, 1988; Felle, 1986; Schartzer, 1995], где описывается временная динамика pH в цитоплазме и снаружи клетки, трансмембранного потенциала в зависимости от изменения интенсивности света и начальных условий. При этом временная динамика может иметь вид затухающих и незатухающих колебаний. Глава 2 Моделирование процессов трансмембранного ионного переноса и распределения потенциала вдоль мембраны на примере клетки водоросли Chara corallina.

Главы 2-5 посвящены построению и исследованию модели, описывающей совокупность экспериментальных данных, идентификации параметров и обсуждению механизмов регуляции наблюдаемых процессов.

При построении модели для описания структурообразования (образование зон pH и трансмембранного потенциала) в качестве переменных рассматривались изменение концентрации протонов в примембранной области и изменение мембранного потенциала.

Рассмотрим ионный транспорт через плазматическую мембрану клетки. Авторами [Takeuchi Y., 1985; Tazawa М., 2003] было показано, что величина потока протонов через АТФ-азу намного выше, чем величина потоков всех остальных ионов. Также авторами [Shartzer S.A., 1992; Sanders D., Hansen U.P., 1981] утверждается, что основной вклад в общий поток ионов через мембрану дают

протоны, поэтому в модели наиболее детально мы учитывали кинетику именно протонного переноса.

Однако общее изменение концентрации протонов снаружи мембраны клетки зависит не только от потока через транспортную систему АТФ-азу и каналы, но и от обмена протонов между внешней средой и примембранным пространством снаружи клетки. Кроме того, происходит диффузия протонов вдоль мембраны клетки. Поскольку длина клетки водоросли Chara corallina (-4-6 см) во много раз превышает ее диаметр (~1 мм), будем рассматривать диффузию протонов вдоль одной пространственной координаты х.

Вывод выражения для протонного транспорта через плазматическую мембрану.

Существует большое количество экспериментальных данных о работе протонной АТФ-азы. Протонная помпа «откачивает» ионы Н* из цитоплазмы во внеклеточную среду, а по пассивным каналам ионы Н* возвращаются в клетку. Существуют предположения, что АТФ-аза и протонные каналы структурно связаны между собой в единую транспортную систему [Fisahn J., 1992].

Чтобы определить конкретный вид потока протонов через Н4-АТФ-азу рассмотрим кинетическую схему работы фермента (рис.1). Предполагается [Warnke J., 1980J, что фермент имеет два сайта связывания субстрата (протонов). Связывание протона одним сайтом не зависит от связывания другого протона другим сайтом. - концентрации фермента в различных состояниях (мольм"3). В схеме реализуется перенос как одного протона (переход из [Е3] в [£4]), так и второго протона (переход из [£5] в [£61). Оба протона высвобождаются во внешнюю среду (переход из в [£4], переход из [£J в [£2]).

Так как в модели рассматривается единая транспортная система, то, кроме переноса протона во внешнюю среду за счет энергии АТФ, учитывается перенос протона из внешней среды внутрь клетки через каналы (переход из [£4] в [Ег]). Предполагается, что вероятность переноса с внешней стороны мембраны на внутреннюю двух протонов мала, поэтому переход из Е6 в Е5, соответствующий переносу второго протона, в данной схеме не рассматривается. [#0] -концентрация протонов в среде (моль м'3), [#,] - концентрация протонов в цитоплазме (моль - м"3). В данном варианте модели [#J является параметром.

к°2е-*

2t., ж

Out - Ее

ку

2 к,

кУ

2 к,Н,

In

Рис.1. Кинетическая схема работы фермента, в которой реализуются шесть состояний: Out - внепшяя сторона мембраны, In - внутренняя сторона мембраны, Н, - концентрация

протонов в цитоплазме, На - концентрация протонов снаружи клетки, у, Еь Ег, Ез,

2 RT

Е4, Е5, Еб — различные состояния фермента. к°е*, к1ге'г, к°еу - потенциалозависимые константы скоростей переноса протона с внутренней стороны мембраны на внешнюю, кх,к^ -константы соростей присоединения и отсоединения протонов.

Предполагается, что вероятность переноса протонов через мембрану зависит от трансмембранного потенциала (р. Вероятности переноса соответствуют кинетическим константам элеюрогенного перехода к_г, кг и (из состояния £3о£4 и Е5~±Е6). Поэтому в модели константы переноса протона с одной стороны мембраны на другую зависят от потенциала <р следующим образом:

к_г - к°г ехр

■Щ кг = &2°expiЩ и к} = к° expfЩ 2RT) 2 2 42RTJ 42 RTJ

Чтобы получить выражение для изменения концентрации протонов снаружи клетки был применен метод Кинга-Альтмана (метод графов). Метод и вывод выражения для изменения протонов снаружи клетки за счет транспортной системы подробно изложены в диссертации.

Тогда уравнение для суммарного изменения концентрации протонов снаружи клетки в безразмерных переменных будет выглядеть следующим образом:

5hm, _ h^d-n) ач,

дт 2фш + e2r (1+кш)2 (п +1) /Пм 2 дг2

(1)

ГД = -

1

(1+h„fK2n

/Г - —d. V — -1 У —

' Л1 - ' 2 - ~Г~ > Л3 -

2 к,

t л К. п Dta х г , .

= —, ta=-—1—, D2 =—~-t г = -,I-длинаклетки(м).

_ u , /г, e"(l-n) .

Первьш член (-—^--r-,--) описывает поток протонов через

транспортную систему, второй член /Д, - обмен протонов между средой и клеткой за счет убыли протонов от поверхности клетки во внешнюю среду и пассивного потока через протонные каналы, не связанные с АТФ-азой, внутрь клетки.

D2 где D - коэффициент диффузии протонов (м2 ■ с"1) вдоль поверхности

Li

клетки.

Вывод уравнения изменения потенциала Уравнение распределения трансмембранного потенциала запишем, исходя из кабельных свойств мембраны клетки с учетом ионных токов через мембрану [Hodgkin A.L., 1952].

Р дг<Р г т

Ö)

где полный ток через мембрану (—^j) равен сумме емкостного (С—) и

2 Rj ох dt

ионного (I) токов. В нашем случае, ионный ток (Г) состоит из тока протонов через

АТФ-азу {1ЛТР) и тока утечки (Ii), включающего в себя потоки остальных ионов.

Здесь <р - трансмембранный потенциал (В), R, - сопротивление цитоплазмы (Омм);

|V(1 -я)

С - емкость мембраны (мкФ см'2), 1ЛТР = E0k_2 ——-!-—-Fp _ ток

л, л,

через Н4'-АТФ-азу (А- м'2); Ii - ток утечки(А м'2), включающий потоки других ионов, F - число Фарадея (Кл моль'1), р - диаметр клетки (м). Ток утечки записывается как 7, = g(<p -%), где g - проводимость пассивных каналов (Ом"1 м'2); % - потенциал покоя на плазматической мембране (В).

Таким образом, уравнение изменения трансмембранного потенциала у/ вдоль клетки водоросли в безразмерных переменных имеет вид: дуг -Vi!-»») /■ ч г,5>

г=Ша z = £E% w -&L d- p*.

2RT' C' CRT 0 2 RT' 1 lÜRjC

Система уравнений изменения трансмембранного потенциала и концентрации протонов снаружи клетки окончательно примет вид:

Зг + е2" (1+А^, )2 (л+1) Г 3 Зг2 ' ™

В качестве граничных условий принимаем отсутствие потока Н* и градиента потенциала на границах клетки:

Глава 3 Поведение во времени рН и потенциала вблизи цитоплазматической мембраны клетки. Сравнение результатов моделирования с экспериментальными данными.

Для использования модели в качестве инструмента исследования физиологии и механизмов процессов в клетке водоросли Chara corallina необходимо: 1) исследовать ее качественные свойства, 2) сопоставить результаты моделирования с экспериментальными данными.

Как выше было сказано (глава 1), изменение величин концентрации протонов и мембранного потенциала в эксперименте, измеряемых в точке, могут иметь характер как затухающих, так и незатухающих колебаний. Поэтому при исследовании локальной системы искали условия, при которых в системе возможно возникновение автоколебаний. Однако для использования результатов моделирования в построении схемы регуляции процессов в клетке необходимо провести оценку области изменения параметров, соответствующих реальной ситуации. Поэтому была проведена идентификация параметров модели АГ,, , п, q по вольт-амперной кривой (зависимости тока через мембрану от величины трансмембранного потенциала), приведенной в работе [Takeushi, 1985]. В процедуре идентификации использовалось следующее выражение для полного тока через мембрану:

—e"(l-n)

I = E0k_2 ---Fp + g{<p - %)

a, a,

1 о+к,)гКгп к.

где: n~-, q = --——, A. = —1

К,к,+1 4 h, к,

В результате процедуры идентификации были получены следующие значения параметров: К, = 2-10^ моль- м'3, *2 =3.36 109 с'1, л = 0.91, 9 = 0001, % = -200 мВ. Остальные параметры были взяты из литературы: Е0= 5-КГ'2 моль-м'3 (общая концентрация фермента) [Takeuchi Y., et al.,1985], p = 1 мм (диаметр клетки) [Fisahn J., 1995], f = 3.12 Ом"1 • м'2 (проводимость тока утечки для невозбувденной мембраны) [Колье О.Р. и др., 1993], [Я,] = 10~7 моль- м"3 (средняя концентрация протонов в цитоплазме, рН=7) [Felle Н., Berti А.,1986].

Процедура идентификации позволяет определить порядок параметров модели при определенных условиях, однако значения этих величин могут варьировать в зависимости от ионной силы раствора, температуры, pH, освещения и т.д. Так равновесный потенциал тока утечки ip0 меняется в пределах -250 + -70 мВ, тогда у/ц =-4.1-5—1 .[Sanders D., Hansen U.P.,1981], a pH цитоплазмы может меняться в пределах 6.9+7.7 [Felle Н., Berti А.,1986; Walker, 1975; Mimura, 1984], то [Я,] меняется в пределах 1.6-10"' +7.9-10"* моль-л'1. Это позволяет оценить интервалы изменения безразмерных параметров модели: А„ =8.3 + 40, п = 0.5 +0.92, д = 0.001+0.005.

Теперь обратимся к экспериментальным данным. Экспериментальные данные можно условно разделить на несколько групп. В первую группу входят данные по исследованию колебаний мембранного потенциала и pH, как затухающих, так и незатухающих при различных условиях (изменение интенсивности света, изменение pH среды и т.д.) [Fisahn, 1989, J. Fisahn, Hansen, 1986; Lefebre , 1970; Hansen, 1978; Hayashi, 1980]. Во вторую группу можно отнести эксперименты по изменению величин мембранного потенциала и pH в ответ на включение и выключение света, а в третью группу - исследование потока через транспортер

АТФ-азу и протонные каналы в зависимости от концентрации протонов снаружи клетки и от потенциала.

Для проведения численных экспериментов была введена феноменологическая зависимость концентрации протонов в цитоплазме h,„ от интенсивности света I. Так как с повышением интенсивности света концентрация протонов в цитоплазме уменьшается [Felle Н., Berti А.,1986], то вид функции был принят следующим: hm = , где h° - концентрация протонов в цитоплазме, соответствующая изначальному уровню pH цитоплазмы при определенных физиологических условиях (темнота, добавление в среду различных химических агентов), I -безразмерный параметр интенсивноста света.

IuTt leinl

Рис. 2 Колебания мембранного потенциала вдоль мембраны водоросли, полученные в эксперименте и на модели, а) Затухающие колебания мембранного потенциала при освещении (20 Wm"2) клеток Chara [Fisahn J, 1989]; б) Колебания мембранного потенциала вдоль мембраны водоросли, полученные в модели. Параметры модели: q=0 OOS, g=0 09, п=0 б, у=0 0171, щ=-1 291, z-0 б, 1=0 5, А<р=20мВ, период колебаний равен 1.6 мин

Были получены колебания потенциала (рис. 2а,б) и pH и найдены периоды колебаний, соответствующие наблюдаемым в эксперименте . Рассчитанный период колебаний потенциала, составил 1.6 мин. Амплитуда колебаний потенциала

составила порядка А<р*= 20 мВ, это сопоставимо с экспериментальными данными, где амплитуда колебаний составила 16 мВ, а период 2 мин (рис.2).

Также был получен режим, где при разных начальных условиях могут реализоваться два устойчивых состояния. В зависимости от начальных значений h0 и у/ при одном и том же наборе параметров могут существовать затухающие и незатухающие колебания потенциала и концентрации протонов, что соответствует экспериментальным данным [Fisahn, 1989, J. Fisahn, Hansen, 1986].

Shartzer S.A. и Tazawa экспериментально показали, что увеличение потока через АТФ-азу сопровождается гиперполяризацией потенциала, а уменьшение потока - деполяризацией. В нашей модели исследовалась зависимость потока через транспортер АТФ-азу от мембранного потенциала и концентрации протонов снаружи клетки. Поток через транспортер рассчитывался по формуле:

На рис. 3 приведен фазовый портрет системы (предельный цикл) зависимости потока через транспортную систему от мембранного потенциала. Видно, что при увеличении потока через АТФ-азу (7^7?) потенциал на мембране (ц/) понижается, то есть происходит гиперполяризация трансмембранного потенциала до определенного критического значения ц/ =-4.7 (-240 мВ), после которого поток через транспортер уменьшается и величина потенциала увеличивается..

_"oul v v.1 ">_

-2-fi

Рис 3 Фазовый портрет системы (предельный цикл). 1атг - поток через АТФ-азу, у- потенциал

Параметры : q=0.001, п=0.9, g=0.03, п=0.9, к=0.0087, щ—1.216, z=0 б

0 04 0 06 0 08 0.1 0 12 014 0 16 0 18

Jaw

Глава 4 Исследование_пространственно-временной_динамики_в

примембранной области клетки водоросли Chara corallina. Результаты

моделирования и экспериментальные факты.

Для того, чтобы исследовать процессы структурообразования (образование зон рН и мембранного потенциала) в примембранной области клетки водоросли была исследована система уравнений (4) с учетом диффузионных членов

условия, при которых возможно возникновение зон pH и мембранного потенциала. Результаты моделирования были сопоставлены с экспериментальными данными (см. главу 1)

Экспериментально показано [Булычев A.A., 2001], что кислые и щелочные зоны вдоль мембраны клетки водоросли возникают при освещении клеток светом надпороговой интенсивности. Пороговое значение освещенности сильно варьирует в зависимости от физиологического состояния клетки и может различаться для разных клеток. По данным Булычева А. [Булычев и др., 2002] и Lucas [Lucas JW, 1975] пороговое значение параметра интенсивности света варьирует в пределах от 0.5-2 Вт/м2. На рис. 4а изображен профиль pH, возникающий при освещении клетки светом надпороговой интенсивности (100 Вт/м2).

В численном исследовании модели было показано, что при некотором критическом значении параметра I- 0.04 в системе возникают диссипативные

• структуры, соответствующие зонам с различным значением pH в реальной системе (рис.4б, 4в). Интенсивность света вводилась в модель, как было указано в гл.З.

* Экспериментально показано [Bulychev A.A., 2003], что в определенном диапазоне освещенности одной и той же величине интенсивности света могут соответствовать два состояния в распределении pH: полностью гомогенное состояние и полностью сформированные структуры. При интенсивности света, равной 0.24 и 0.5 Вт/м2 наблюдалось гомогенное распределение pH. При интенсивности света, равной 1.78 Вт/м2 возникал устойчивый профиль с щелочными и кислыми зонами. Повышение интенсивности проводилось через каждые 30 минут. При интенсивности света, равной 1.78 Вт/м2 амплитуда структур

исследовании распределенной системы были получены

достигает максимума. После получения устойчивого профиля структур интенсивность света ступенчато понижали до 0.5 Вт/м2 через каждые 30 минут, при этом амплитуда структур не изменялась. Таким образом одной и той же интенсивности света 0.5 Вт/м2 соответствовали два типа распределения рН: гомогенное и устойчивый профиль рН с амплитудой пиков, равной 2,5 единиц рН.

0.0

Рис. 4 а)Профиль рН вдоль клетки водоросли Chara corallina [Bulychev et al., 2001] б) Профиль рН и потенциала вдоль клетки водоросли Chara corallina, полученный на модели . в) Динамика роста рН зон (диссипативных структур), полученная в модели, г -пространственная координата (соответствует длине клетки), г - время Параметры системы: z= 1, р = 0.025, g = 0.08, 9 = 0.001, и = 0.9, = -1.335 , 7 = 0.04, Z), =10"5, Ог=9Л<У*

В следующем лабораторном эксперименте [Bulychev А. А., 2003] было выявлено различное влияние повышающихся и понижающихся интенсивностей света при объединении данных, полученных на разных клетках. Поскольку

амплитуда щелочных пиков на разных клетках различаются, была проведена нормировка сдвигов рН. Для каждой клетки определяли среднее значение перепада рН между кислыми и щелочными зонами в интервале интенсивностей 10-100 Вт/м2 и принимали его за единицу (5а).

Интенсивность света, Вт/м2

Рис.5 Гистерезис распределении рН вблизи мембраны клетки водоросли Chara corallina.

а) Экспериментальный результат, полученный при обработке данных для разных клеток при циклическом повышении и понижении интенсивности действующего света. Светлые кружки соответствуют величине повышения повышение интенсивности, темные квадратики соответствуют режиму понижения интенсивности. Стрелка 1- увеличение интенсивности света, стрелка 2-уменыпение интенсивности

б) Результат численного эксперимента. Изменение максимального перепада рН между щелочными и кислыми зонами (ДрН) в зависимости от повышения и понижения интенсивности действующего света. Стрелка 1- увеличение интенсивности света, стрелка 2-уменыпение интенсивности, ромбики соответствуют повышению интенсивности, треугольники-понижению

Для модельных экспериментов (численных экспериментов в распределенной системе) мы брали последовательно ряд значений интенсивности света (I - 0.0060.0455), соответствующий значениям интенсивностей, используемых в лабораторном эксперименте.

При этом рН цитоплазмы в модели менялось от 6.9 до 7.4. Поскольку в лабораторном эксперименте интенсивность изменялась через каждые 30 минут, в численном эксперименте параметр йнтенсивности также менялся через определенный интервал времени, в размерном виде этот интервал равен -30 мин. Теоретически рассчитанная пороговая величина интенсивности света, при которой возникают структуры составляла I = 0.034 (1.6 Вт/м2)

В численном счете было обнаружено, что при увеличении параметра интенсивности в системе возникают рН структуры при значении интенсивности света больше порогового I - 0.04 (1.78 Вт/м2 ). При дальнейшем увеличении значения интенсивности их амплитуда остается постоянной. При уменьшении параметра интенсивности через тот же интервал времени структуры исчезают при значении интенсивности, ниже порогового значения I = 0.006 (0.24 Вт/м2).

Дня сопоставления результатов численного счета с экспериментальными данными (рис.5а) амплитуда рН структур определялась как величина перепада рН между кислыми и щелочными зонами и была выражена в относительных единицах. Величина амплитуды рН структур, полученная в численном счете, была нормирована на максимальную амплитуду рН структур (рис.5б).Таким образом, в модельной системе наблюдается гистерезис в изменении рН в зависимости от предыстории световых условий, как это было и в эксперименте.

Экспериментально было показано, что при добавлении в среду хлорида калия амплитуда структур уменьшается. Известно, что ионы хлорида калия вызывают деполяризацию мембраны и увеличивают проводимость калиевых каналов, что и приводит к ингибированию структур. В модели токи ионов калия, натрия, хлора и т.д. включены в ток утечки 0), поэтому в модели

исследовалось поведение системы в зависимости от параметра % (проводимости ионных каналов). Было показано, что при увеличении этого параметра от 0.08 до 0.095, амплитуда структур уменьшается. В модельной системе добавление растворов солей аммония соответствует понижению . При уменьшении

параметра й° (соответствует добавлению хлорида аммония) от 11 до 6, амплитуда структур уменьшается.

Глава 5 Исследование пространственно-временной динамики рН и мембранного потенциала с учетом изменения рН цитоплазмы. Сопоставление результатов моделирования с экспериментальными данными.

Экспериментально было показано, что рН цитоплазмы является одним из регуляторов протонной АТФ-азы плазматической мембраны [Morsomme, 2003; Mimura, 1984; Tazawa, 2002]. Повышение рН цитоплазмы на свету [Vanselow et al., 1989; Kolbowski J. et al., 1984; Felle, 1986] по-видимому связано с фотосинтетическими процессами. В клетках харовых водорослей наблюдается движение цитоплазмы (10-100 мкм/с) -циклозис. Так как возникновение рН зон и потенциала происходит после освещения, интересно было проследить взаимосвязь фотосинтетических процессов и процессов, происходящих на плазматической мембране. Цитоплазматическое рН - один из «индикаторов» процессов, происходящих в хлоропластах на свету. Поэтому нами был рассмотрен следующий вариант модели, где вводится третья переменная - рН цитоплазмы.

Для учета изменения концентрации протонов в цитоплазме в модель вводилось третье уравнение, описывающее следующие процессы:

1. поток через протонную АТФ-азу плазматической мембраны ( JATP)

2. поток протонов из цитоплазмы через мембрану хлоропластов(*), зависящий от интенсивности света G(I)

3. циклозис-направленное движение протонов в цитоплазме(* *)

4. диффузия протонов

В диссертации подробно выводится уравнение для изменения концентрации протонов в цитоплазме. В окончательном виде система выглядит следующим образом:

^г=Т.» - г К,+A ^f -.

Вт 1 + КЬ Зг 3 дг2

7 __КАУКъ_ й

где: -'лгр ~ л , >г>п, г , г и ' безразмерное выражение для

потока через транспортную систему (АТФ-аза и каналы), которое было выведено в

Ь. г ш -М. П—£í=- D-^Vi A

С ' СИГ ' ~ 2RT' ~~ 2ÉR¡C' Ü ' С " "" К, '

h -Í5ü2 IT -í± К К -!й- г-— t -—JÜi— m - ^"Ёдк^к-ьНы

K¡ k¡ 2 ~ * ~ k° t0 0 ~ 2КШ' * " * + *,)'

¿5¿6a:. , ¿д. „г/. x (i-в

a = —5 ♦ 1 , г> = ---- B = — , r = -, G(/) = exp ——

k-sk-6HM k-¡+k-(HM+k6 L L U+«

Далее система была исследована без диффузионных и конвекционного членов (локальная система). При исследовании локальной системы были получены следующие результаты:

1. Была исследована динамика изменения концентрации протонов в цитоплазме при включении и выключении света. Felle и Berti измеряли pH цитоплазмы (pH¡„) на клетках зеленых водорослей Rieda fluitants, Mimura на клетках Chara corallina. При выключении света наблюдали «быстрое» понижение рНт на 0.3 единицы pH и «медленное» (в течение двух минут) повышение pH (рис.ба). При включении света повышение рНт на 0.4 единицы (защелачивание) сменялось понижением рНт до стационарного уровня рНт - 7.1. На модели был воспроизведен этот эксперимент, где при включении (/=0.3) и выключении (7=0) света наблюдалось «защелачивание» (повышение рНт) и «закисление» (понижение рНт) (6а, 66).

2. Также на модели был получен хаотический режим. Переход к хаотическому режиму наблюдался через последовательность бифуркаций удвоения периода в зависимости от величины интенсивности света. При значении интенсивности света / = 2.2 получена квазихаотические колебания потенциала и pH, сходные с экспериментальными данными (рис.7 а,б).

Для того, чтобы описать процессы циклозиса и струкгурообразования была исследована с учетом процессов диффузии и конвекции. Система решалась численно, с помощью программы для решения уравнений в частных производных

типа «реакция-диффузия-конвекция». Были найдены параметры системы и получены соотношения коэффициентов диффузии, при которых возможно возникновение зон рН и потенциала (рис.8 а, б, в). В лабораторном эксперименте при ингибировании циклозиса рН зоны исчезали. В модели процессу циклозиса дИ

соответствует и при уменьшении скорости циклозиса (коэффициента В) от 2 ог

до 0 структуры исчезали.

.Loff

б

I"

'70

а?

а

Рис.6. Динамика концентрации протонов в цитоплазме при включении и выключении света, я) Понижение и повышение рН цитоплазмы в ответ на включение и выключение света в клетках водоросли Riccia fluitans [H.Felle and A.Bertl, 1986] б) Модельный эксперимент. Параметры модели: Кг-0 00437, g=l 81, К3~0 4, у=0.339, щ=-0.111, z=4, a=l, b=10, m=12, a =1,,/3=2.424,L0g-выключение света, 1=0, Lon - включение света, 1=0 9

so.о

rta* Iain)

120 Г

Рис.7. Квази-хаотическая динамика рН снаружи клетки харовой водоросли, а) лабораторный эксперимент рчваЬп ], 1989] б) модельный эксперимент Параметры системы: г=4, К2 =0.001, К, =0.5, я = 0.0596, ¿ = 0.01, т=1.95, ^ = 0.339, § = 1.81, у/0 = -0.21,1 = 22 ,а=1,/?=2.424

1 о

Рис.8 Профили рН (а), потенциала (б) и рН цитоплазмы (в) клетки водоросли. Параметры модели: К2=0.001, ^1.81, Кз-0.1, /=0.339, щ=-0.21, г=Ч а=0.059б, Ъ=0.01, т-1.678, а=1,р~2.424, 1=0.7,03=0.0009.,02=0.0001, 0,=00009,В=2

165 0

0.0

г

Обсуждение

В отличие от других моделей, где описываются либо только ионные потоки [Toko К, Chosa Н, Yamafttji К., 1985.,- Bulychev А.А., Polezhaev А.А., et al., 2001], либо только изменение трансмембранного потенциала [Toko К, et al., 1988], в данной модели описывается потенциалозависимый перенос ионов через клеточную мембрану, основанный на кинетике работы АТФ-азы (рис.1). Также в модели учтены цгаслозис и поток протонов через мембрану хлоропластов. Ниже вкратце перечислены экспериментальные результаты, нашедшие объяснение в модели:

I. Временная динамика рН, трансмембранного потенциала и ионных потоков через плазматическую мембрану.

1. колебания (затухающие и незатухающие) рН и потенциала в зависимости or изменения интенсивности света;

2. квазихаотические колебания рН и потенциала при изменении интенсивности света;

3. в зависимости от начальных условий (флуктуации мембранного потенциала и pH вдоль клеточной поверхности) могут возникать спонтанные колебания, незатухающие в течение нескольких часов наблюдения и затухающие минутные

4. деполяризация и гиперполяризация потенциала в ответ на включение и выключение света;

5. динамика pH цитоплазмы в ответ на включение и выключение света.

II. Зависимость структурообразования от интенсивности света и добавления в среду различных химических агентов:

1. появление чередующихся зон с различной величиной pH и потенциала вдоль мембраны клеток семейства водорослей Characea. при превышении критического значения интенсивности;

2. гистерезис при прохождении одного цикла изменения интенсивности;

3. исчезновение зон при ингибировании циклозиса (направленное движение цитоплазмы) и при добавлении в среду хлорида аммония и хлорида калия.

На рис.9 приведена возможная схема процессов, построенная на основе исследования модели и анализе экспериментальных данных. Рассмотрим последовательность процессов, изображенных на схеме.

Как известно, при освещении, в результате процессов фотосинтеза, за счет потока протонов в тилакоиды (стадия 0, рис.9) наблюдается защелачивание стромы хлоропластов (стадия 1, рис.9). Предполагается, что через мембрану хлоропластов осуществляется поток протонов из цитоплазмы внутрь хлоропластов.(стадия 2, рис.9). [Jagendorf А.Т., 1966]. Вследствие этого может происходить защелачивание цитоплазмы (стадия 3, рис.9) [Felle Н., Berti А., 1986; Mimura, 1984], которое приводи 1 к увеличению потока протонов через каналы внутрь клетки(стадия 4, рис.9) [Vanselow et al., 1989]. Увеличение пассивного потока протонов внутрь клетки вызывает деполяризацию мембраны и увеличение концентрации протонов внутри клетки. Это, в свою очередь, ведет к увеличению потока протонов через АТФ-азу (стадия 6), что, наоборот, сопровождается понижением мембранного потенциала (гиперполяризация). Поток через АТФ-азу приводит к повышению концентрации протонов в примембранном слое снаружи клетки (стадия 7), которое вызывает уменьшение потока протонов из клетки через АТФ-азу и увеличение потока через протонные каналы внутрь, затем цикл повторяется (рис.9). Таким

образом, световой сигнал вызывает увеличение протонного потока через каналы (стадии 0 - 4), что в дальнейшем приводит к увеличению протонного тока через АТФ-азу. Эта процессы активного и пассивного протонного транспорта взаимно усиливают друг друга, то есть между ними возникает положительная обратная связь, вследствие этого в системе реализуются колебания потенциала и протонов. За счет' разнонаправленных протонных потоков через каналы и АТФ-азу могут возникать локальные участки закисления'и защелачивания, которые различаются по величине трансмембранного потенциала в примембранной области снаружи клетки. Устойчивые рН зоны в примембранной области клетки образуются за счет различия в коэффициентах диффузии протонов (Д) и потенциала (П2).

Рис.9. Возможная схема процессов вблизи мембраны клетки водоросли Chara corallina. Пунктирными стрелками обозначена регуляция процессов, (fhn - мембранный потенциал (масштабы не соблюдены).

0. Свет инициирует процессы фотосинтеза, рН тилакоида понижается,

1. рН хлоропласта повышается.

2. Повышение рН внутри хлоропластов инициирует поток протонов из цитоплазмы в хлоропласта.

3. Поток протонов из цитоплазмы в хлоропласта приводит к повышению рН цитоплазмы и деполяризации мембранного потенциала.

4 Активация протонных каналов цитоплазматической мембраны.

5. Увеличение потока протонов через каналы приводит к понижению рН цитоплазмы и деполяризации мембранного потенциала.

6. Увеличение протонного потока через АТФ-азу.

7. Увеличение потока протонов через АТФ-азу приводит к понижению рН снаружи клетки и гииерполяризации мембранного потенциала.

8. Увеличение потока через протонные каналы. Цикл повторяется (со стадии 5) Поскольку потенциалозависимые АТФ-азы и каналы существуют на

мембранах разных типов клеток и клеточных органелл, можно предположить, что потснциалозависимое изменение рН является одним из основных регуляторов нелинейной пространственно-временной динамики в примембранной области. Однако полное обоснование предложенного механизма образования зон рН и потенциала, основанного на взаимодействии разных «компартментов» клетки: хлоропласта - цитоплазма - плазматическая мембрана через изменение рН и потенциала, требует более глубоких исследований.

Выводы

1. Построена обобщенная кинетическая модель транспорта протонов через АТФ-азу Р-типа и каналы плазматической мембраны. При построении модели учитывали перенос двух протонов через мембрану наружу клетки.

2. Построена математическая модель (типа «реакция-диффузия») для описания образования зон рН и трансмембранного потенциала, где переменными являются концентрация протонов в примембранной области клетки и величина трансмембранного потенциала Были найдены диапазоны изменения значений безразмерных параметров модели, при которых в системе реализуются колебательные (автоколебания и затухающие колебания) и неколебательные режимы, триггерные и пространственно-временные режимы.

3. Проведена идентификация параметров модели по экспериментальным данным. Полученные пределы изменения значений параметров модели, соответствуют реальной ситуации (рН, =6.9+7.7,р0 = -250-^-70мВ). В этих пределах могут быть реализованы все нелинейные режимы, приведенные выше. Так для колебательных режимов амплитуда колебаний потенциала и рН составляет: А<р= 5-20 мВ, 4рН = 0.4

4. Исследован пространственно-временной характер поведения рН и мембранного потенциала: получена пороговая величина интенсивности света

/ = 0.04(1.6В«/л<г), при которой возникают зоны рН и потенциала, исследована динамика возникновения, роста и уменьшения амплитуды этих зон в зависимости от интенсивности света. В системе может быть реализован гистерезис, так как одной же интенсивности света / = 0.013(0.5Вт!мг)иогут соответствовать два состояния в распределении рН: полностью гомогенное состояние и полностью сформированные структуры.

5. Предложен механизм образования зон рН и потенциала, основанный на взаимосвязи процессов, происходящих на свету в хлоропластах, цитоплазме и плазматической мембране. Увеличение протонного потока через каналы плазматической мембраны за счет фотосинтетических процессов приводит к увеличению протонного тока через АТФ-азу. Взаимное влияние процессов активного и пассивного потенциалозависимого протонного транспорта приводит к возникновению колебаний потенциала и протонов.

Список публикаций

1. Лаврова А. И., ПлюснинаТ. Ю, Лобанов А. И., Старожилова Т. К., Ризниченко Г. Ю. Моделирование воздействия электрического поля на систему ионных потоков примембранной области клетки водоросли Chara. - Труды VII Международной конференции «Математика. Компьютер. Образование», Дубна, часть 2, стр .668-674,2000

2. Лаврова А. И., Плюснина Ризниченко Г. Ю. Моделирование образования зон рН в примембранной области клетки водоросли Chara. - Труды VIII Международной конференции «Математика. Компьютер. Образование», Пущино, часть 2, стр.564-572,2001

3. Лаврова А. И., Плюснина Т. Ю, Лобанов А. И., Старожилова Т. К., Ризниченко Г. Ю. Влияние периодического электромагнитного поля на образование структур вблизи клеточной мембраны водоросли Chara (Математическая модель). - Тезисы конференции «Горизонты физико-химической биологии», 28 мая-2 июня, 2000.

4. A.I. Lavrova, T.Yu. Plusnina, A.I. Lobanov and G.Yu. Riznichenko. Pattern formation in the vicinity of chara cell membrane under applied electric field. (Mathematical model). - Abstracts collection of BEMS, Munih, 2000, P.15

5. A.I. Lavrova, T.Yu. Plusnina, A.I.Lobanov, Т.К. Starozhilova, G.Yu. Riznichenko. Electric field effects in reaction-diffusion systems. - Abstracts collection of BEMS, Minnesota, 2001, P.6

6. Плюснина Т.Ю., Лобанов А.И., Лаврова А.И., Старожилова Т.К., Ризниченко Г.Ю. Вклад самосогласованного электрического поля в пространственно-временную динамику системы реакция-диффузия. - Тезисы IX международной конференции «Математика, Компьютер, Образование», Дубна, стр. 223,2002

7. A.I. Lavrova, T.Yu. Plusnina, G.Yu. Riznichenko. Modelling of pattern formation along the cell. - Abstracts collection of BEMS, Quebec, 2002, P.34,169

8. A.I. Lavrova, T.Yu. Plusnina, G.Yu. Riznichenko Modelling of electric potential band formation along the cell of Chara corallina. - Abstracts collection of ECMBM, Milan, 2002, p. 214

9. Плюснина Т.Ю., Лобанов А.И., Лаврова А.И., Старожилова Т.К., Ризниченко Г.Ю., Рубин А.Б. Новые пространственно-временные режимы в системе реакция-электродиффузия. - Биофизика, 2002, том 47, вып.2, стр. 277-282

10. T.Yu. Plusnina A.I. Lavrova,, G.Yu. Riznichenko. Modelling of electric potential band formation along the cell membrane. - Тезисы X международной конференции «Математика, Компьютер, Образование», Пущино, стр. 228,2003

11. Лаврова А.И., Плюснина Т.Ю. Гистерезисные явления в системе ионных потоков через клеточную мембрану водоросли Chara corallina. Математическая модель. - Тезисы докладов Ш съезда Биофизиков России, 2 том, стр. 436-437, 2004

12. Лаврова А.И., Плюснина Т.Ю., Ризниченко Г.Ю., Рубин А.Б. Гистерезисе изменении рН в зависимости от интенсивности света в примембранной области водоросли Chara corallina. Математическая модель. - Труды XI Международной конференции «Математика. Компьютер. Образование», Дубна, часть 2, стр.756-764,2004

Благодарности

Я выражаю глубокую признательность к.ф. - м.н., доц. Татьяне Юрьевне

Плюсниной за помощь в работе и выбор стратегии в исследовании, без которых

работа не была бы сделана. Также выражаю благодарность д.б.н. А.А.Булычеву за

предоставленные экспериментальные данные и полезные обсуждения, и д.ф.-м.н.

А.И. Лобанову и А.В. Украинцу за предоставленное программное обеспечение.

Мне помогали своим добрым отношением и ценными советами д.ф.-м.н. А.А.

Полежаев, к.б.н. А.А. Черкашин, к.ф. - м.н. П.М. Красильников.

»-6852

РНБ Русский фонд

2006-4 5260

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 12.04.2005 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл.1,5. Тираж 100 экз. Заказ 203. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лаврова, Анастасия Игоревна

Введение

Глава

Явление пространственно-временного распределения pH и мембранного потенциала вдоль внешней поверхности плазматической мембраны. Литературный обзор.

1.1 Acetabularia acetabulum (L.) Silva

1.2 Пыльцевая трубка Lilium longiflorum

1.3 Корневые волоски и корни. Trifolium repetís, Zea mays, Hordeum vulgare L., Lepidium sativum L., Nicotiana tabacum var. Havana

1.4 " Цитоморфогенез

1.5 Явление образования чередующихся зон pH вдоль поверхности плазмалеммы клеток Chara corallina.

1.5.2 Гетерогенное распределение pH в примембранной области клетки водоросли Chara corallina.

1.5.3 Мембранный потенциал и ионный транспорт через мембрану клетки водоросли Chara corallina.

1.5.4 Протонная АТФ-аза цитоплазматической мембраны клетки водоросли Chara corallina.

1.5.5 Кинетический анализ функционирования Н+-АТФазы.

1.6 Модели, предложенные для описания чередования зон pH и мембранного потенциала вдоль клетки Chara.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Пространственно-временное распределение pH и трансмембранного потенциала вдоль клеточной мембраны водоросли Chara corallina"

Актуальность проблемы. Для многих живых организмов экспериментально ноказано, что вдоль внешней поверхности плазматической мембраны могут возникать участки, различающиеся по значениям рН и трансмембранного потенциала

По предположению многих исследователей существование неоднородных по величине потенциала участков в примембранной области может играть важную роль в физиологии клетки. Так, для многих растений показано, что неравномерное распределение потенциала вдоль поверхности корешков [Weisenseel et al., 1979], корневых волосков [Miller et al., 1986] и пыльцевых трубок [Feijo et al., 1999] предшествует дальнейшей дифференциации тканей и играет важную роль в процессах роста. Также было обнаружено, что неравномерное пространственное распределение потоков у зигот водорослей (Pelvetia, Fucus) определяет дальнейшую структуру клетки во время ее роста [Jaffe, 1977]. В семействе водорослей Characea в результате освещения вдоль мембраны возникают устойчивые зоны с различными величинами рН и электрического потенциала, между которыми циркулируют токи, что возможно способствует ассимиляции органических веществ в клетке. Однако до конца не ясна причинно-следственная связь между явлением образования зон рН и потенциала и физиологическими процессами в органе или клетке.

Первоначально такого рода явления связывали со структурной неоднородностью мембран. В последнее время все большее число исследователей склоняется к тому, что они обусловлены, по-видимому, спецификой работы транспортных систем клетки: АТФ-аз, каналов, антипортеров и т.д. и неоднородным распределением потоков. Иными словами, такие зоны являются примером диссипативных структур в живых системах.

Несмотря на обилие экспериментальных работ в этой области, до сих пор не выявлен общий механизм, связывающий неравномерное распределение потоков с внутренними процессами в клетке, который приводит к образованию зон рН или неоднородному распределению потенциала в примембранной области клетки.

Клетки водорослей Chara corallina и Nitellopsys obtusa являются наиболее удобным объектом для исследования неравномерного распределения потоков. Они обладают большими размерами (диаметром 0.6 -1.0 мм и длиной 40-80 мм), и имеют более простое строение по сравнению с клетками высших растений или животных. Физиология этих организмов достаточно хорошо исследована.

Был предложен ряд математических моделей [Toko et al, 1988; Leonetti, Pelee, 1994; Bulychev A. A., 2001], в которых рассматриваются возможные механизмы зонообразования. В этих моделях были сделаны попытки либо учесть изменение трансмембранного потенциала, либо изменение концентрации ионов снаружи и внутри клетки.

В настоящей работе построена и исследована модель, в которой одновременно учтены процессы изменения мембранного потенциала и изменение концентрации ионов. Предложен механизм неравномерного распределения потоков в примембранной области клетки, учитывающий взаимосвязь процессов, происходящих на мембране хлоропластов, в цитоплазме и плазматической мембране клетки. Цель и задачи работы

Цель работы: методами математического моделирования исследовать динамику возникновения зон рН вдоль клеточной мембраны водоросли Chara и предложить механизм этого явления. В работе предполагается выполнить следующие задачи:

1. Построить математическую модель, описывающую процессы, связанные с потенциалозависимым ионным транспортом через плазматическую мембрану и перемещением ионов вдоль внешней поверхности плазматической мембраны.

2. Провести исследование модели, включающее: а) исследование временной и пространственно-временной динамики рН и потенциала в примембранной области клетки водоросли. б) идентификацию параметров по экспериментальным данным в) описание наблюдаемых в эксперименте нелинейных процессов: колебания мембранного потенциала и рН, возникновение зон рН и потенциала.

3. Предложить возможный механизм образования зон рН и потенциала, учитывающий связь этих процессов с процессами фотосинтеза.

Научная новизна Впервые построена модель, одновременно учитывающая изменение трансмембранного потенциала и перенос ионов через мембрану. Подробно описана работа АТФ-азы плазматической мембраны, осуществляющей перенос протонов. Оценены диапазоны изменения параметров модели, соответствующие экспериментальным данным. Впервые предложен механизм возникновения зон рН и трансмембранного потенциала, основанный на взаимосвязи процессов, происходящих при освещении в разных компартментах клетки (хлоропласты, цитоплазма, плазматическая мембрана). Практическое значение Разработанная модель пространственно-временного распределения рН и потенциала вдоль клетки водоросли применима к широкому классу объектов, где встречаются подобные явления. Модель включает в себя подробное описание работы мембранной АТФ-азы, в модели учитываются изменение концентрации протонов снаружи и внутри клетки, потенциала - это позволяет глубже понять бифизические механизмы, лежащие в основе данного класса явлений. Апробация работы Материалы диссертации докладывались и обсуждались на: 2nd ESMTB School, Siguenza, Spain, 2001; 5th ESMTB conference, Milan, Italy, 2002; 11-той Международной конференции «Математика. Компьютер. Образование.», Дубна, 2004, Пущино, 2005; III - ем съезде биофизиков России, Воронеж, 2004; семинарах кафедры биофизики

Публикации По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них две в рецензируемом российском журнале, две в ежегодном сб. научных трудов конференции «Математика. Компьтер. Образование, 8 в сборниках тезисов российских и международных конференций.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, пяти глав, содержащих описание методов и результатов работы, обсуждения, выводов, списка литературы.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Лаврова, Анастасия Игоревна

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Построена обобщенная кинетическая модель транспорта протонов через АТФ-азу Р-типа и каналы плазматической мембраны. При построении модели учитывали возможность переноса двух протонов через мембрану наружу клетки.

2. Построена математическая модель (типа «реакция-диффузия») для описания образования зон рН и трансмембранного потенциала, где переменными являются концентрация протонов в примембранной области клетки и величина трансмембранного потенциала. Были найдены диапазоны изменения значений безразмерных параметров модели, при которых в системе реализуются колебательные (автоколебания и затухающие колебания) и неколебательные режимы, триггерные и пространственно-временные режимы.

3. Проведена идентификация параметров модели по экспериментальным данным. Полученные пределы изменения значений параметров модели, соответствуют реальной ситуации (рН; = 6.9 + 7.7,% = —250-ь-70мВ). В этих пределах могут быть реализованы все нелинейные режимы, приведенные выше. Так для колебательных режимов амплитуда колебаний потенциала и рН составляет: А(р = 5 - 20 мВ, АрН = 0.4

4. Исследован пространственно-временной характер поведения рН и мембранного потенциала: получена пороговая величина интенсивности света / = 0.04 (1.6Вт/мг), при которой возникают зоны рН и потенциала, исследована динамика возникновения, роста и уменьшения амплитуды этих зон в зависимости от интенсивности света. В системе может быть реализован гистерезис, так как одной же интенсивности света 1 = 0.013(0.5 Вт/м2)иогут соответствовать два состояния в распределении рН: полностью гомогенное состояние и полностью сформированные структуры.

Предложен механизм образования зон рН и потенциала, основанный на взаимосвязи процессов, происходящих на свету в хлоропластах, цитоплазме и плазматической мембране. Увеличение протонного потока через каналы плазматической мембраны за счет фотосинтетических процессов приводит к увеличению протонного тока через АТФ-азу. Взаимное влияние процессов активного и пассивного потенциалозависимого протонного транспорта приводит к возникновению колебаний потенциала и протонов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лаврова, Анастасия Игоревна, Москва

1. Al-Awqati Q., Proton-translocating ATPases, Annu.Rev. Cell Biol., 1986, 2,179-199

2. Anderson WP., Robertson RN., Wright BJ., Membrane potentials in carrot root cells, 1977, Austr. J. Plant Physiol., V.4, pp. 241-242

3. Beilby M. J., Calcium and plant action potentials, 1984, Plant Cell Env., V.7, pp. 415-421

4. Boels H. D., Hansen U. P., Light and electrical current stimulate the same feed-back system in Nitella, 1982, Plant Cell Physiol., V. 23, pp. 343-346

5. Borowitzka MA., Calcification in algae: mechanisms and the role of metabolism. In: CRS critical reviews in plant sciences, CRS Press, Boca Raton, 1987, 1-46

6. Bouget FY., Gerrtula S., Shaw SL., Quatrano RS., Localization of actin mRNA during the establishment of cell polarity and early cell division in Fucus embryos. Plant Cell, 1996, 8, 189201

7. Briskin D.P., The plasma membrane H+-ATPase of higher plant cells: biochemistry and transport function, 1990, ВВА, V. 1019, pp. 95-109

8. Briskin DP., Hanson JB., How does the plant plasma membrane H+-ATPases pump protons?, J. Exp. Bot., 1992, 43,269-289

9. Buddemeier RW., Symbiosis, calcification and environmental interactions. In: past and present biomineralization processes. Considerations about the carbon cycle. Musee Océanographique. Monaco, 1994, 119-136

10. Bulychev A.A., Cherkashin A.A., Rubin A.B., Vredenberg W. J., Zykov V. S., Muller S. C., Comparative study on photosynthetic activity of chloroplasts in acid and alkaline zones of Chara corallina, 2001, Bioelectrochemistry, V.53, pp. 225-232

11. Bulychev A.A., Zykov V. S., Rubin A.B., Muller S., Transitions from alkaline spots to regular bands during pH pattern formation at the plasmalemma of Chara cells, 2003, Eur Biophys J.,V. 32, pp. 144-153

12. Cameron J. N., Carlile M. J., Fatty acids, aldehydes, and alcohols as attractants for zoospores of Phytophtorapalmivora. 1978, Nature, V.271, pp. 448-449

13. Deacon JW., Donaldson SP., Molecular recognition in the homing response of zoosporic fungi with special reference to Pythium and Phytophtora. 1993, Mycol.Res., V.271, pp. 448-449

14. Dufour J.P., Goffeau A., Molecular and kinetic properties of the purified plasma membrane ATPase of the yeast Schizosaccharomyces pombe, 1980, Eur. J. Biochem., V. 105, pp. 145-54

15. Feijo JA., Malho RM., Obermeyer G., Ion dynamics and its possible role during in vitro germination and tube growth, Protoplasma, 1995, 187, 155-167

16. Feijo JA., Sainhas J., Hackett GR., Kunkel JG., Hepler PK., Growing pollen tubes possess a constitutive alkaline band in the clear zone and a growth-dependent acidic tip, J. Cell Biol., 1999,144,483-496

17. Felle H., Auxin causes oscillations of cytosolic free calcium and pH in Zea mays coleoptiles, 1988, Planta, V.174, pp. 495-499

18. Felle H., Bertl A., Light-induced cytoplasmic pH changes and their interrelation to the activity of the electrogenic proton pump in Riccia fluitans, 1986, BBA, V. 848, ppl76-182

19. Ferrier J. M., Apparent bicarbonate uptake and possible plasmalemma proton efflux in Chara corallina, 1980, Plant Physiol., V.66, pp. 1198-1199

20. Findlay G. P., Hope A. B., Pitman M. G., Smith F. A., Walker N.A., Ionic fluxes in cells of Chara corallina, 1969, Biochim. Biophys. Acta, V.183, pp. 565-576

21. Fisahn J, Lucas W.J, Direct measurement of the reversal potential and the current-voltage characteristics in the acid and alkaline regions of Chara corallina, Planta, 1992, V. 186, pp. 506512

22. Fisahn J., Hansen U. P., Lucas W. J., Reaction kinetic model of a proposed plasma membrane two-cycle H(+)-transport system of Chara corallina, 1992, Proc Natl Acad Sci U S A., V. 89, pp.3261-5.

23. Fisahn J., Lucas WJ., Spatial organization of transport domains and subdomain formation in the plasma membrane of Chara corallina., J. Memb. Biol., 1995, 147, 275-281

24. Fisahn J., McConnaughey T., Lucas W. J., Oscillations in extracellular current, external pH and membrane potential and conductance in the alkaline bands of Nitella and Char a, 1989, J. Exp. Bot., V. 40, pp. 1185-93

25. Fisahn J., MikschI E., Hansen U. P., Separate oscillations of the electrogenic pump and of a K-channel in Nitella as revealed by simultaneous measurement of membrane potential and of resistance, 1986, J. Exp. Bot., V. 37, pp. 34-47 .

26. Fujii S., Shimmen T., Tasawa M., Effect of intracellular pH on the light-induced potential change and electrogenic activity in tonoplast-free cells of Chara austalis, 1979, Plant Cell Physiol., V. 20, pp. 1315-1328

27. Gibbon B.C., Kropf D.L., pH gradients and cell polarity in Pelvetia embryos, 1991, Protoplasma, V.163, pp. 43-50

28. Guern J., Felle H., Mathiew Y, Kurkdjian A., Regulation of intracellular pH in plant cells, 1991, Int Rev Cytol., V. 127, pp.11-173.

29. Hansen U. P., Do the light-induced changes in the membrane potential of Nitella reflect the feed-back regulation of a cytoplasmic parameter?, 1978, J. Membr. Biol., V.41, pp. 197-224

30. Hansen U. P., Gradmann D., Sanders D., Slayman C. L., Interpretation of current-voltage relationships for "active" ion transport systems: I. Steady-state reaction-kinetic analysis of class-I mechanisms, 1981, J. Membr. Biol., V. 63, pp. 165-90.

31. Hansen U.P., Kolbowski J., Dau H., Relationship between photosynthesis and plasmalemma transport, 1987, J. Exp. Bot., V.38, pp. 1965-1981

32. Hay ME., Kappel QE., Fenical W., Synergisms in plant defenses against herbivores: Interactions of chemistry, calcification and plant quality. Ecology, 1994, 75, 1714-1726

33. Hayashi H., Hirakawa K., Nitella fluctuation and instability in the membrane potential near threshold, 1980, Biophys J., V.31, pp. 31-43.

34. Hickman C. J., Ho H. H., Behavior of zoospores in plant-pathogenic phycomycetes, 1966, Annu. Rev. Phytopatol., V.4, pp. 195-220

35. Hope A. B., Ionic relations of cells of Chara austalis. Effects of bicarbonate ions on electrical properties, 1965, Aust. J. Biol. Sci., V.18, pp.789-794

36. Jaffe L.F, Nuccitelli R, Electrical control of development, 1977, Ann. Rev. Biophys. Bioenerg, 6: 445-471

37. Jagendorf A.T., Uribe E., ATP formation caused by acid-base transition of spinach chloroplasts, 1966, Proc Natl Acad Sci U S A, V. 55, pp. 170-7

38. Johannes E., Crofts A., Sanders D., Control of CI" efflux in Chara corallina by cytosolic pH, free Ca2+ , and phosphorylation indicates a role of plasma membrane anion channels in cytosolic pH regulation, 1998, Plant Physiol., V.l 18, pp. 173-181

39. Jorgensen P.L., Nielsen J.M., Rasmussen J.H., Pedersen P.A., Structure-function relationships of E1-E2 transitions and cation binding in Na,K-pump protein, 1998, BBA, V. 1365, pp. 65-70

40. Kawamura G., Shimmen T., Tasawa M., Dependence of the membrane potential of Chara cells on external pH in the presense and absence of internal adenosinetriphosphate, 1980, Planta V. 149, pp. 213-218.

41. Keif D.W., Spanswick R.M. Activity of the electogenic pump in Chara corallina as infered from measurements of the membrane potential, conductance and potassium permeability, 1978, Plant Physiol., V. 62, pp. 653-661

42. Kim S.R., Kim Y., An G., Molecular cloning and characterization of anther-preferential cDNA encoding a putative actin-depolymerization factor, 1993, Plant Mol. Biol., 21, 39-45

43. Kinoshita T., Nishimura M., Shimazaki KI., Cytosolic concentration of Ca regulates the plasma membrane H+-ATPase in guard cells of fava bean, Plant Cell, 1995, 7, 1333-1342

44. Kishimoto U., Kamiike N., Takeuchi Y., Ohkawa T., A kinetic analysis of the electrogenic pump of Chara corallina. I. Inhibition of the pump by DCCD, 1984, J Membrane Biol., V. 80, pp. 175-183

45. Kitasato H., The influence of H+ on the membrane potential and ion fluxes of Nitella, 1968, J. Gen. Physiol., V.52, pp.60-87

46. Kolbowski J., Keunecke P., Hansen U. P., Detection of a common time constant in the response of membrane potential and of chlorophyll fluorescence in Nitella, 1984, In Membran transport in plants, 1984, Eds. Cram W. J., Academia, Prague, pp. 49-50

47. Krause G. H., The high-energy state of the thylakoid system as indicated by chlorophyll fluorescence and chloroplast strinkage, 1973, BBA, V. 292, pp. 116-24

48. Krause G. H., Vernotte C., Briantais J. M., Photo induced quenching of chlorophyll fluorescence in intact chloroplasts and algae, 1982, Ibid, V.679, pp. 116-24

49. Lauger P., Stark G., Kinetics of carrier-mediated ion transport across lipid bilayer membranes, 1970, BBA, V. 211, pp. 458-66.

50. Lauger P., The channel mechanism for electrogenic ion pumps, 1979, BBA, V. 552, pp. 143-161

51. Lefebvre J., Gillet C., Periodic variations of the chloride electrochemical potential difference during spontaneous oscillations of the membrane potential in Nitella, 1970, BBA, V. 203, pp. 575-8

52. Leonetti M., Pelce P., On the theory of pH bands in characean algae, 1994, C.R. Acad. Sci. Paris, Science de la vie/Life Sciences, V. 317, pp.801-5

53. Lino B., Baizabal-Aguirre VM., de la Vara LEG., The plasma membrane H+-ATPase from beet root is inhibited by a calcium-dependent phosphorylation, Planta, 1998,204, 352-359

54. Lucas J., Photosynthetic fixation of carbon by internodal cells of Chara corallina, 1975, Exp. Bot., V. 26, pp. 331-346

55. Lucas W. J., and Nuccitelli R., HCO3" and OH" transport across the plasmalemma of Chara. Planta, 1980, V. 150, pp. 120-131

56. Lucas W. J., Mechanism of acquisition of exogenous bicarbonate by internodal celles of Chara corallina, 1982, Planta, V.l56, pp. 181-192

57. Lucas W. J., Photosynthetic assimilation of exogenous HC03— by aquatic plants, 1983, Ann Rev Plant Physiol., V. 34, pp. 71-104

58. Lucas W.J. and Dainty J., Spatial Distribution of Functional .OH" Carriers Along a Characean Internodal Cell: Determined by the Effect of Cytochalasin B on H14C03* Assimilation, 1977, J. Membrane Biol., V. 32, pp. 75-92

59. Lucas W.J., Plasmalemma transport HCO3" and OH" in Chara corallina: non-antiporter systems, 1976, J. Exp. Bot., V. 27, pp. 19-31

60. Luhring H., Tazawa M., Effect of cytoplasmic Ca2+ on the membrane potential and membrane resistance of Chara plasmalemma, 1985, Plant Cell Physiol., V. 26, pp. 635-646

61. Lutsenko S., Kaplan JH., Molecular events in close proximity to the membrane associated with the binding of ligands to the Na,K-ATPase, 1994, J. Biol. Chem., V.269, pp. 4555-64

62. MacLennan DH, Rice WJ, Green NM., The mechanism of Ca2+ transport by sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPases, 1997, J. Biol. Chem., V. 272, pp.28815-8.

63. Malho RM., Read ND., Pais MS., Trewavas AJ., Calcium channel activity during pollen tube growth and reorientation, Plant Cell, 1995, 7, 1173-1184

64. Marin A., Ros JD., Dynamics of a peculiar plant-herbivore relationship: the photosynthetic ascoglossan Elysia timida and the chlorophycean Acetabularia acetabulum. Mar. Biol., 1992, 112, 677-682,

65. Mentze J., Raymond B., Cohen JD., Rayle DL., Auxin-induced H+ secretion in Helianthus and its implications., 1977, Plant Physiol., V.60, pp. 509-512

66. Meyer AJ, Weisenseel MH., Wound-Induced Changes of Membrane Voltage, Endogenous Currents, and Ion Fluxes in Primary Roots of Maize, 1997, Plant Physiol. V.97, pp.1153-1171.

67. Miller AL., Endogenous ion currents traverse growing roots and root hairs of Trifolium repens, 1986, Plant, Cell and Env., V.9, pp. 79-83

68. Miller AL., Gow NAR., Correlation between root-generated ionic currents, pH, fusicoccin, indoleacetic acid, and growth of the primary root of Zea mays, 1989, Plant Physiol., V.89, pp. 1198-1206

69. Mimura T., Kirino Y., Changes in cytoplasmic pH by 31P-NMR in cells of Nitellopsis obtuse, 1984, Plant Cell Physiol., V. 25, pp.813-820

70. Mimura T., Tazawa M., Light-induced membrane hyperpolarization and adenine nucleotide levels in perfused characean cells. 1986, Plant Cell Physiol., V. 27, pp. 319-330

71. Moon A., Dubin DG., The ADF/cofilin proteins: stimulus responsive modulators of actin dynamics. Molec. Biol. Cell, 1995,6, 1423 - 1431

72. Morris B.M., Reid B., Gow N.A.R., Electrotaxis of zoospores of Phyiophtora palmivora at physiologically relevant field strengths, 1992, Plant, Cell and Env., V.15, pp. 345-353

73. Morsomme P., Boutry M., The plasma membrane H+-ATPase: sttucture, function and regulation, 2000, BBA, V. 1465, pp. 1-16

74. Pierson ES., Miller DD., Callaham DA., van Aken J., Hackett G., Hepler PK., Tip-localized calcium entry fluctuates during pollen tube growth, Dev. Biol., 1996, 174, 160-173

75. Quatrano R.S., Development of celll polarity, 1978, Ann. Rev. Plant Physiol., V.29, pp. 487-510

76. Raven JA., Smith FA., Cytoplasmic pH regulation and electrogenic H+ extrusion, 1976, Curr. Adv. Plant Sci., V.8, pp. 649-660

77. Régula C.S., Pfeiffer J. R., Berlin R.D., Microtubule assembly and disassembly at alkaline pH, 1981, J.Cell Biol., V.89, pp. 45-53

78. Richards J.I. Hope A.B., The role of protons in deteming membrane electrical chaacteristics in Chara corallina, 1974, J. Membrane Biol., V. 16, pp. 121-144

79. Saito K., Senda K., The electrogenic ion pump revealed by the external pH effect on the membane potential of Nitella. Influence of external ions and electrical current on the pH effect, 1974, Plant Cell Physiol., V. 15. pp. 1007-1016

80. Sanders D., Hansen U. P., Slayman C. L., Role of the plasma membrane proton pump in pH regulation in non-animal cells, 1981, Proc Natl Acad Sci U S A. V. 78, pp. 5903-7.

81. Sanders D., Smith F.A., Walker N.A., Protone/chloride cotransport in Chara: mechanism of enhanced influx after rapid external acidification, 1985, Planta, V.163, pp. 411-418

82. Serikawa KA., Portefield MD., Mandoli DF., Asymmetric subcellular mRNA distribution correlates with carbonic anhydrase activity in Acetabularia acetabulum, Plant Physiol., 2001, 125, 900-911

83. Shiina T., Tazawa M., Ca -activated CI" channel in the plasmalemma of Nitellopsis obtusa, 1987, J. Membr. Biol., V.99, pp.137-146

84. Shiina T., Tazawa M., Ca2+ -dependent CI" efflux in tonoplast-free cells of Nitellopsis obtusa, 1988, J. Membr. Biol., V.106, pp.135-139

85. Shimmen T, Tazawa M., Dependency of H+ efflux on ATP in cells of Chara australis, 1980, Plant Cell Physiol., V. 21, pp. 1007-1013

86. Smith. F.A., Walker N.A., Chloride transport in Chara corallina and the electrochemical potential difference for hydrogen ions, 1976, Exp. Bot., V. 27: 451-459

87. Spanswick R.M., Evidence for an electrogenic pump in Nitella translucens. I. The effects of pH, K+ Na+, light and tempeature on the membrane potencial and resistance, 1972, BBA, V. 288, pp. 73-89

88. Spear D.G., Barr.J.K., Barr C.E., Localization of hydrogen ions and chloride fluxes in Nitella. J. Gen. Physiol., 1969, V. 54, pp. 397-414

89. Steinmetz P, Anderson O., Electrogenic proton transport in epithelial membranes, 1982, J Membrane Biol., V. 65, pp. 155-174

90. Sze H., H+-translocating ATPases: advances using membrane vesicles, Annu.Rev.Plant Physiol., 1985, 36, 175-208

91. Takeshige K., Shimmen T., Tazawa M., Electrogenic pump current and ATP-dependent H+ efflux across the plasma membrane of Nitellopsis obtusa, 1985, Plant Cell Physiol., V. 26, pp.661-668

92. Takeshige K., Shimmen T., Tazawa M., Quantitative analysis of ATP-dependent H+ efflux and pump current driven by an electrogenic pump in Nitellopsis obtusa, 1986, Plant Cell Physiol., V. 27, pp. 337-348

93. Takeuchi Y., U. Kishimoto, T. Ohkawa, and N. Kami-ike., A kinetic analysis of the electrogenic pump of Chara corallina: II. Dependence of the pump activity on external pH, 1985, J. Membrane Biol., V. 86, pp. 17-26

94. Tazawa M., Cell Physiological Aspects of the Plasma Membrane Electrogenic H+ pump, 2003, J. Plant Res., V. 116, pp. 419-442

95. Tazawa M., Iwasaki N., Okazaki Y., Light-induced changes in membrane potential and cytoplasmic pH in aquatic plants, Egeria and Chara, 1992, In Murata N (ed) Research in photosynthesis. Vol. IV. Kluwer Academic Publication, Netherland, pp 723-726

96. Tazawa M., Shimmen T., Artificial control of cytoplasmic pH and its bearing on cytoplasmic streaming, electrogenesis and excitability of Characeae cells, 1982, Bot. Mag. Tokyo, V. 95, pp. 147-154

97. Toko К., Chosa H., Yamafuji К., Dissipative structure in the Characeae: Spatial pattern of proton flux as a dissipative structure in characean cells, 1985, J Teor Biol., V. 114, pp. 127-175

98. Toko K., Hayashi K., Yoshida Т., Fujiyoshi Т., Yamafuji K., Oscillations of electric spatial patterns emerging from the homogeneous state in characean cells, 1988, Eur Biophys J., V. 1, pp.11-21

99. Vanselow К. H., Kolbowski J., Hansen U.P., Further evidence for the relationship between light-induced changes of plasmalemma transport and transthylakoid proton uptake, 1989, J. Exp. Bot., V.40, pp. 239-245

100. Walker N. A., Smith F. A., Intracellular pH in Char a corallina measured by DMO distribution, 1975, Plant Sci Lett., V. 4, pp.125-132

101. Walker N.A. Smith, F.A., Circulating electric current between acid and alkaline zones associated with HCO3' assimilation in Chara, 1977, J. Exp. Bot. V. 28, pp. 1190-1206

102. Warncke J., Slayman C. L., Metabolic modulation of stoichiometry in a proton pump, 1980, Biochim Biophys Acta, V. 591, pp. 224-33.

103. Weisenseel MH., Dorn A., Jaffe LF., 1979, Natural H+ currents traverse growing roots and root hairs of barley (Hordeum vulgare L), Plant Physiol., V.64, pp. 512-518

104. Weisenseel MH., Ionic currents as control mechanism in cytomorphogenesis, 1981, In Cytomorphogenesis in Plants (ed. O. Kiermayer), pp. 373-399, Springer-Verlag, New-York

105. West P., Morris B.M., Reid В., Appiah A. A., Osborne M.C., Campbell T.A., Shepherd S. J., GowN.A.R., Oomycete plant pathogens use electric fields to target roots, 2002, MPMI, V.15, pp. 790-798

106. Winkler M. M., Steinhardt R.A., Grainger J. L., Minning L., Dual ionic controls for the activation of protein synthesis at fertilization, 1980, Nature, V.287, pp. 558-560

107. Yonezawa N., Nishida E., Sakai H., pH control of actin polymerization by cofilin, JBC, 1985,260,14410-14412

108. Zentmyer G.A., Chemotaxis of zoospores for root exudates, 1961, Science, V.133, pp. 1595-1596

109. Булычев А.А., П. ван ден Вейнгард, А. де Бур, Пространственная координация активности хлоропластов и плазмалеммы в клетках Chara и ее нарушение при инактивации белков 14-3-3, 2005, Биохимия, Т.70, стр. 68-76

110. Булычев A.A., Черкашин A.A., Вреденберг В., Рубин А.Б., Зыков B.C., Мюллер С.Х., Флуоресценция и фотосинтетическая активность хлоропластов в кислых и щелочных зонах клеток Chara corallina, 2001, Физиология растений, Т.48, стр.384-391

111. Булычев A.A., Черкашин A.A., Рубин А.Б., Мюллер С., Распределение кислых и щелочных зон на поверхности клеток Chara corallina при стационарном и локальном освещении, 2002, Физиология растений, т.49, стр. 805-813

112. Дьяков Ю.Т., Введение в альгологию и микологию, 2000, Изд. Моск. Ун-та, стр. 8890

113. Каменский А., Камкин А., Фундаментальная и клиническая физиология, 2004, изд. Academa, стр. 132-142

114. Камия Н., Движение протоплазмы, 1962, изд. иностр. лит-ры, Москва

115. Колье O.P., Максимов Г.В., Раденович Ч.Н. Биофизика ритмического возбуждения, Изд-во Московского университета, 1993

116. Корниш-Боуден Э., Основы ферментативной кинетики, 1979, изд. «Мир», стр. 61-70

117. Полежаев A.A., Структурообразование, обусловленное встречными конвективными потоками, Мат. моделирование, 2004, Т. 16, стр. 41-46

118. Скулачев В.П., Биоэнергетика. Мембранные преобразователи энергии. Москва, "Высшая школа", стр.125.

119. Ходоров Б.И., Общая физиология возбудимых мембран, 1975, изд. «Наука», стр. 35971. Благодарности