Прогнозирование и закономерности распространения вирусов растений в биоценозах Украины

Полищук, Валерий Петрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Прогнозирование и закономерности распространения вирусов растений в биоценозах Украины
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Прогнозирование и закономерности распространения вирусов растений в биоценозах Украины"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

V».

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ВІРУСОЛОГІЇ „ ; ім.Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

Ч - гМ

. \’. •

ПОЛІЩУК Валерій Петрович

УДК 578.4

ПРОГНОЗУВАННЯ ТА ЗАКОНОМІРНОСТІ РОЗПОВСЮДЖЕННЯ ВІРУСІВ РОСЛИН В БІОЦЕНОЗАХ УКРАЇНИ

03.00.06 - вірусологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

Київ - 2000

Дисертацією € рукопис.

Робота виконана в Київському національному університеті імені Тараса Шевченка

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор

Бойко Анатолій Леонідович,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач кафедрою вірусології.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший

науковий співробітник Щербатенко Іван Степанович,

Інститут мікробіології та вірусології ім.Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу фітопатогенних вірусів;

доктор біологічних наук, професор Мітрофанова Ольга Володимирівна, Державний Нікітській ботанічний сад УААН, завідувач відділу біотехнології;

доктор біологічних наук, професор Радавський Юрій Леонідович,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу структури та функцій білків та пептидів.

Провідна установа: Інститут захисту рослин УААН, м. Київ.

Захист відбудеться “18” жовтня 2000 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 252143, м. Київ, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (252143, м. Київ, вул. Заболотного, 154).

Автореферат розісланий “/У” вересня 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради • Пуриш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність. Протягом останнього часу в фітовірусологи' спостерігається значний інтерес до розвитку досліджень на популяційному та еколого-популяційному рівні, і ця тенденція є загальною для багатьох традиційно молекулярно-біологічних дисциплін (Бойко, 1990). Значні успіхи у фітовірусологи', такі як розшифровки структури генів, білок-білкової та нуклеїнова кислота-білкової взаємодії, встановлення амінокислотних послідовностей та тривимірної будови структурних та регуляторних вірусних білків та ін. контрастують з нашими знаннями відносно поведінки вірусів рослин у природних умовах. Нове покоління діагностичних методів для визначення наявності фітовірусів (таких як ІФА, РІА, DELFIA, RIPA, ПЛР, JIJIP, та ін.) дало змогу на новому рівні вивчати розповсюдженість фітовірусів у навколишньому середовищі. Актуальність даного питання полягає як в його фундаментальності, так і в практичному значенні. Визначення ареалу розповсюдженості, механізмів передачі, кола рослин-господарів, реакції на зміни оточуючого середовища дають можливість не тільки більш повно характеризувати того чи іншого представника царства Vira, але і прогнозувати появу та розвиток вірусних хвороб і правильно виробляти стратегію і тактику боротьби з ними - запровадження стійких сортів, цілеспрямовану боротьбу з резервантами та переносниками, отримання безвірусного посадкового матеріалу та ін. (Щербатенко, 1996). Перспективними у цьому напрямку є моделювання розвитку хвороб рослин. Однак для більшості вірусних хвороб, на відміну від фітопатогенних грибів та бактерій, адекватні моделі практично відсутні (Nelson, 1999). Віруси, які передаються через грунт і зберігають свої інфекційні властивості (Furoviridae, Nepoviridae, Tobamoviridae, Cucumoviridae та ін.) досить інтенсивно вивчалися тільки останнім часом, тоді як епідеміологічне вивчення вірусів, що передаються за допомогою векторів, розвивається швидкими темпами протягом останніх десятиріч (Шпаар, 1995). Класичний підхід до вивчення вірусів у ґрунті передбачає вивчення в першу чергу їх біологічних характеристик; інші віруси, для яких передача через ґрунт та зберігання інфекційних властивостей не доведена, залишаються поза увагою такого підходу (Koenig, 1994). В той же час можливість використання інформації про знаходження того чи іншого антигену вірусу в ґрунті (навіть якщо цей вірус і не може передаватися через ґрунт) може бути використаною для загальної оцінки фітосанітарного стану з точки зору наявності вірусних інфекцій та для прогнозування розвитку вірусних хвороб і попередження втрат від них.

Збільшення антропогенного тиску на навколишнє середовище приводить до фізіологічних змін у рослин та їх угрупувань (Гуральчук Ж.З., 1994; Andren О. et all, 1998), що в свою чергу прямо чи опосередковано відбивається на властивостях вірусів рослин. Встановлення можливих

взаємозв’язків між наявністю вірусних антигенів в культурних та дикоростучих рослинах, ґрунті є дійсно необхідним для розуміння процесів розповсюдження вірусів рослин та циркуляції їх в ценозах.

Важливим для вивчення шляхів розповсюдження фітовірусів є знання їх взаємодії з представниками дикої флори та бур’янами, що стало предметом детального вивчення тільки в останній час (Stevens М. et ail, і 994). Для встановлення взаємозв’язків між вірусами, культурними рослинами, бур’янами, переносниками, ґрунтом потрібно враховувати багато факторів (біологію збудника та хазяїна, умови зовнішнього середовища тощо) та оперувати даними про ці фактори. Існуючі на сьогодні спроби комп’ютеризувати моделі часового та просторового розповсюдження збудників хвороб рослин стосуються в першу чергу інфекційних агентів бактеріального та грибкового походження(ВозсЬ F. et all,1999), для фітовірусів такі моделі практично відсутні (Anderson Р.К., 1999). Актуальність створення комп’ютерних моделей та баз даних обумовлена великим обсягом інформації, що має тенденцію збільшуватися з кожним роком (Campbell C.L., Madden L.D., 1990). Всі вище перераховані проблеми не можуть бути вирішені без можливості оперативного одержання об’єктивної інформації (надійної діагностики вірусних інфекцій). Перспективним та актуальним з цієї точки зору можна вважати методи дистанційної діагностики, що базуються на спектральних параметрах рослин та можуть бути отримані за короткий час на значних площах (Шадчина Т.М., Колинько О.А., 1993). В той же час застосування новітніх методів растрової мікроскопії, таких як атомно-силова мікроскопія (ACM), відкриває нові можливості як для діагностики, так і для отримання принципово нової інформації про структуру і функції вірусів та їх популяцій.

Оскільки техногенне навантаження на природне середовище в найближчому майбутньому буде скоріш зростати, ніж зменшуватися, а в агроценози будуть приходити все нові й нові, в тому числі і генетично модифіковані, культурні рослини, проблеми екологічного балансу в агроценозі будуть набувати все більшого значення, і питання розповсюдження фітовірусних інфекцій та їх шкодочинності в майбутньому може розглядатися як одне з найгостріших.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Наукові дослідження по темі виконано відповідно проектів «Розробка комплексної еколого-економічної оцінки території України та системи оптимізації сільськогосподарського виробництва з урахуванням природно-ресурсного потенціалу та еколого-токсикологічної ситуації», «Науково-методичні основи екотоксико-логічного моніторингу. Підрозділ: Вірусні інфекції» (№ держреєстрації 01.196U012976), «Оцінка агроценозів в різних екологічних регіонах України на ураженість фітовірусними інфекціями» (ДКНТ, № 03.11.1/74), «Створення технології оздоровлення сільськогосподарських рослин з метою підвищення їх продуктивності» (№ 03.01.12/110-92).

Мета і завдання дослідження. На основі багаторічних обстежень біоценозів різних екологічних регіонів України дати оцінку розповсюдженості основних фітовірусних інфекцій, виявити їх закономірності та обґрунтувати можливості прогнозування розвитку епіфітотій.

У відповідності з поставленою метою було необхідно виконати такі завдання:

- вивчити біологічні властивості та провести діагностику 16 основних шкодочинних фітовірусів, які відносяться до різних таксономічних груп у різних регіонах України;

- проаналізувати динаміку чисельності поширених вірусів рослин в обстежених ценозах із використанням сучасних вірусологічних методів;

- дослідити взаємозв’язки між збудниками вірусних захворювань та їх можливими резервуарами, такими як одно-, дворічні та багаторічні бур’яни, ґрунт;

- створити базу даних та комп’ютерну модель для прогнозування розвитку вірусних хвороб рослин у динаміці репродукції патогенів;

- вивчити взаємозв’язок між екологічним станом конкретного ценозу та розповсюдженістю фітовірусних інфекцій у регіонах, розглянути можливі механізми їх взаємодії;

- вивчити біологію збудників рослин закритого ґрунту на моделі орхідних та розробити технологічну схему отримання оздоровленого безвірусного посадкового матеріалу;

- на основі спектральних методів відбиття розробити модельну систему дистанційної бездеградаційної експрес-діагностики РНК-вмісних вірусів у динаміці їх взаємодії з різними видами рослин.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведена якісна та кількісна оцінка агроценозів та природних екологічних ніш України на наявність шкодочинних вірусів сільськогосподарських культур на основі імуноферментного аналізу з урахуванням біологічних, молекулярних та антигенних властивостей патогенів. Розкрито взаємозв’язок між частотою знаходження антигенів фітовірусів у культурних рослинах, бур’янах і ґрунті та вірогідністю розповсюдження тієї чи іншої вірусної хвороби в наступні роки. Створено комп’ютерну базу даних із застосуванням Microsoft Access-2 та на її основі вперше створено систему управління базами даних по аналізу розповсюдженості фітовірусів у культурних рослинах, бур’янах, ґрунті в різних агроценозах України. Показано можливість застосування багатофакторного комп’ютерного аналізу для коротко-, середньо- та довгострокових прогнозів розвитку вірусних захворювань. Встановлена залежність розповсюдження фітовірусних інфекцій від антропогенного навантаження на агро- чи біоценоз. Експериментально обґрунтовано та запропоновано методику оцінки можливості розповсюдження фітовірусних інфекцій на основі комплексної діагностики рослин та застосування комп’ютерної бази даних.

Виявлено нові види рослин-резерваторів для деяких вірусів, такі як талабан польовий (ТМа$рі агуеше) для вірусу слабкого пожовтіння буряку (ВСПБ) та костриця лучна (ТезШсаргаіеіт.і) для вірусу жовтої карликовості ячменю (ВЖКЯ). Описано новий РНК-вмісний бациловидний вірус, що уражує цукрові буряки. •

Розроблено технологічну схему контролю для отримання високоякісного безвірусного посадкового матеріалу орхідей мікроклональним розмноженням на основі створення здорових рослин-донорів.

Показано відмінності в спектрах відбиття світла між інфікованими та контрольними рослинами. Показана можливість використання спектральних параметрів для бездеградаційної дистанційної експрес-діагностики вірусних хвороб рослин в різних умовах їх вирощування.

Розроблено новий спосіб візуалізації віріонів методом атомно-силової мікроскопії (АСМ).

Практичне значення одержаних результатів. Експериментально обґрунтовано та запропоновано методику оцінки можливості розповсюдження фіто-вірусних інфекцій на основі комплексної діагностики рослин; виявлено нові види рослин-резерваторів для деяких вірусів; розроблено технологічну схему контролю для отримання високоякісного безвірусного посадкового матеріалу орхідей мікроклональним розмноженням; показано відмінності в спектрах відбиття між інфікованими вірусами та здоровими рослинами та можливість застосування спектральних параметрів для бездеградаційної дистанційної експрес-діагностики вірусних хвороб рослин у різних умовах їх вирощування; модифіковано методику обстеження ґрунтів на вірусоносійство за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА), що дозволяє швидко та ефективно проводити детекцію антигенів фітовірусів в ґрунтах та ґрунтових водах.

На основі досліджень обґрунтовано стратегію оцінки та створено карту розповсюдженості фітовірусів у ґрунтах у досліджених регіонах України. Її використання дозволяє простежити кореляцію між виявленням антигенів вірусів в рослинах та ґрунті та техногенним навантаженням довкілля іншими полютантами.

Створено рекомендації для сільськогосподарських дослідних станцій та станцій захисту рослин для запобігання втрат врожаїв від вірусних інфекцій.

Особистий внесок здобувана. Автором запропонована ідея роботи. Мета і завдання досліджень сформульовані автором особисто. Відбір зразків рослин та ґрунту з різних екологічних регіонів України, виділення та накопичення вірусів, проведення імуноферментного аналізу, електронна, імуноелектронна мікроскопія, аналіз і узагальнення отриманих результатів, побудова комп’ютерного банку даних були виконані автором особисто та за участю аспірантів і співробітників на базі кафедри вірусології Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Проведення досліджень спектральних характеристик відбиття листя та протопластів

проводилося на базі Інституту фізіології рослин та генетики НАНУ за участю д.б.н. Т.М.Шадчиної.

Дослідження фізико-хімічних властивостей грунтів проводилися в лабораторії оцінки якості сільськогосподарської продукції Інституту агроекології та біотехнології УААН разом з Саженюком А.Д. та Харківським Інститутом агрохімії та ґрунтознавства УААН .

Дослідження вірусів в умовах закритого ґрунту та in vitro проводилися на базі Центрального республіканського ботанічного саду за участю к.б.н. А.М. Лаврентьевой

Дослідження за допомогою ACM проводилися в Інституті напівпровідників НАНУ за участю к.б.н. Бекетова Г.В.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи доповідались на: Міжнародній конференції “Фундаментальні та прикладні аспекти фітовірусологи” (Ялта, Україна, травень 1994); Міжнародному симпозіумі “75 років фітопатологічних досліджень в Асершлебені” (Асершлебен, Німеччина, червень 1995); Всеросійському з’їзді “Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологичность” (Санкт-Петербург, Росія, грудень 1995); 10 Міжнародному Конгресі по вірусології (Єрусалим, Ізраїль, серпень 1996); 1-му Європейському фікологічному конгресі (Кьольн, Німеччина, серпень 1996); Європейському симпозіумі “Аерокосмічна дистанційна діагностика” (Лондон, Великобританія, вересень 1997); Міжнародній конференції “Лютео-віруси” (Чіренчестер, Великобританія, березень 1997); Міжнародному регіональному семінарі “Охорона довкілля” (Ужгород, травень 1997); Конференції “Збереження біорізноманітності в Україні” (Канів, жовтень, 1997); Міжнародній конференції “Пути решения проблем и перспективы развития биотехнологии в декоративном садоводстве и плодоводстве” (Крим, Ялта, вересень 1997); 2 Міжнародній конференції “Біоресурси та віруси” (Київ, вересень 1998); 4 Міжнародному Симпозіумі “Забруднення навколишнього середовища в Центральній та Західній Європі” (Варшава, Польща, вересень 1998); 16 Всесвітньому Конгресі з ґрунтознавства (Монпелье, Франція, серпень 1998), 7 Міжнародному симпозіумі з епідеміології вірусів рослин (Алмерія, Іспанія, квітень, 1999); 11 Міжнародному конгресі

з вірусології (Сідней, Австралія, серпень 1999).

Публікації. За матеріалами дослідження опубліковано 48 робіт, з них 23 - статті у наукових журналах, 25 - матеріали конференцій.

Структура і об’єм роботи. Дисертація складається із вступу; огляду літератури, в якому здійснено аналіз сучасного стану досліджень в області епідеміології вірусів рослин, прогнозування виникнення епіфітотій та закономірностей розповсюдження фітовірусів; опису об’єктів та методів досліджень, п’яти експериментальних розділів; висновків; списку цитованої літератури та трьох додатків. Останні включають карти районів відбору зразків,

візуальні симптоми хвороб на рослинах та дослідних полях, схеми циркуляції досліджуваних вірусів. Робота викладена на 288 сторінках машинописного тексту, включає 32 таблиці та 76 рисунків. Список цитованої літератури нараховує 515 найменувань, з них 382 іноземних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ Матеріали та методи досліджень

Відбір та аналіз зразків. Загальний стан поля обстежувався методом рендо-мізованого польового експерименту за такими параметрами: фаза розвитку рослин в онтогенезі, вид рослини, стан посівів, кількість рослин-бур’янів, відсоток рослин з симптомами вірусних захворювань. Для обстеження поля цукрового буряку вибиралися три ділянки площею 100 м2, де підраховувалась кількість рядків, кількість рослин у кожному рядку і кількість рослин з симптомами вірусних захворювань на листкових пластинках у кожному рядку. Підрахунок інших культур, які мали симптоми вірусного ураження, проводився: кукурудзи, соняшнику (по три ділянки площами 100 м2); пшениці - три ділянки площею 1 м2. Також реєстрували симптоми, які переважали.

Для досліджень розповсюдження вірусів з полів сільськогосподарських культур (таких як злакові, цукровий буряк, картопля) та необроблюваних ділянок (заповідників, балок та ін.) відбирали зразки культурних рослин, супутніх бур’янів та ґрунту в трьох повторах з трьох точок методом рендо-мізованого польового експерименту та вносили в стерильний пакет для подальших досліджень.

Дослідження проводилися в чотирьох регіонах України, таких як: Волинська область (Шацький Національний парк); Київська область (Богу-славський полігон), Харківська область (район Зміївської ДРЕС) та Одеська область (район Комінтерново).

Після відбору зразки ґрунту гомогенізували з буфером (0,0 ЇМ фосфатно-сольовим буферним розчином (ФСБР), pH 7,2-7,4) в шутель-апараті протягом ночі. Потім проводили виділення та очистку вірусу. Для цього розчинений у буфері зразок рослин або ґрунту піддавали серії центрифугувань: низькошвидкісне центрифугування на центрифузі РС-6 (5000 g, 20 хв); одержаний надосад піддавали високошвидкісному центрифугуванню на центрифузі фірми “Beckman” (70000 g, 60 хв), після чого одержаний осадресуспендували в буфері. Частину отриманого матеріалу використовували для зараження рослин-індикаторів, а частину-длядосліджень за допомогою ІФА та електронної мікроскопії (ЕМ). Проби з рослин-індикаторів відбиралися для імуносорбентної електронної мікроскопії (ІСЕМ) та ЕМ.

Біологічні властивості вірусів вивчали за допомогою спектру загальноприйнятих рослин-індикаторів, таких як: Chenopodium amaranticolor

(некротична реакція для типового штаму ВТМ), Datura stramonium, Nic-otiana tabacum cv. Samsun (некрози та деформації для ВТМ), N. glutinosa (некротична реакція для BTM),N. tabacum cv. Trapeson (системна реакція), N. debneyi (системна реакція), N. sylvestris L (системна реакція) та Ріап-tago major L. (некротична реакція для подорожникових штамів ВТМ), Triticum durum, Lycipersicon esculentum, Capsicum annum, Agropiron repens, Gomfrena globosa та ін. Ураження проводили механічно для таких вірусів як ВТМ, BOM, ХВК, УВК, ВШМЯ. Матеріал інокулювали за допомогою абразиву (карборунд) з концентрацією вірусного препарату в діапазоні 50-200 мкг/мл у 0,1М ФСБР, рН7,4 у трьохкратному повторенні на стадії чотирьох справжніх листків.

Накопичення ВТМ здійснювали на рослинах Nicotiana tabacum сорт Самсун. Виділення вірусного матеріалу проводили за модифікованою нами методикою шляхом гомогенізації свіжозаморожених інфікованих рослин в 0,1М калій - фосфатному буфері, рН7,4 з додаванням 0,0ЇМ Na,S03, освітленням вірусного екстракту хлороформом у співвідношенні 1:7 та подальшим низькошвидкісним центрифугуванням 20 хв при 4 тис. об/хв на центрифузі РС-6. Концентрацію препарату проводили за допомогою інкубації надосадової рідини на магнітній мішалці з додаванням 5% поліетиленгліколю 6000 (“Serva”, США) та 1,2% NaCl протягом 60 хв при

4 °С. Після інкубації матеріал центрифугували при 10 тис об/хв протягом 15 хв. Осад ресуспендували в 0,01М калій-фосфатному буфері, рН7,4 з подальшим високошвидкісним центрифугуванням його в режимі 30 тис. об/хв - 1,5 год на центрифузі “Beckman”, ротор SW-40. Осад відбирали, знову ресуспедували в 0,0ЇМ калій-фосфатному буфері та проводили центрифугування в градієнті сахарози при 30 тис. об/хв протягом 2,5 год у тому ж роторі. Осад ресуспендували в 0,0ЇМ тріс-НСІ буфері, рН7,6 та діалізували протягом ночі при 4 °С проти того ж буферу. При роботі з вірусним матеріалом використовували буфери, що не містять солей натрію для зручності подальшого виділення нуклеїнової кислоти та білку. Концентрацію вірусу визначали спектрофотометрично за формулою:

C = A260N/Ke де С - концентрація вірусу в мг/мл,

А2М - екстинкція при довжині хвилі 260 нм,

N - розведення вірусного препарату,

Ке - коефіцієнт екстинкції, що для ВТМ становить 2,7.

Для отримання числових результатів на стадії обробки польових зразків використовували непрямий метод das-ELISA (Гнутова, 1993).

Для його проведення використовували антитіла, специфічні до 18 вірусів (Табл. 1).

Таблиця 1.

Перелік специфічних антитіл, які були використані в роботі

Специфічність антисироватки Скоро- чена назва Місце одержання. Робоче розве- дення

вірус смугастої мозаїки пшениці ВСМП МДУ, Росія 1:100

вірус жовтої карликовості ячменю ВЖКЯ МДУ, Росія 1:100

вірус штрихуватої мозаїки ячменю ВШМЯ MSU, USA 1:100

вірус мозаїки цу крового буряку ВМБ МДУ, Росія 1 : 100

вірус жовтяниці цукрового буряку ВЖБ КДУ 1:100

вірус некротичного пожовтіння жилок буряку ВНПЖБ ІБОХ РАН, Росія 1:100

вірус слабкого пожовтіння цукрового буряку ВСПБ RES, UK 1 : 100

Х-вірус картоплі ХВК ІСМ УААН 1: 25

Х-вірус картоплі ХВК ДВНЦ РАН, Росія 1:100

У-вірус картоплі • УВК ІСМ УААН 1 : 20

У-вірус картоплі УВК ДВНЦ РАН, Росія 1:100

М-вірус картоплі МВК ІСМ УААН 1 : 32

Б-вірус картоплі SBK ІСМ УААН 1 : 32

Б-вірус картоплі FBK ІСМ УААН 1 : 32

вірус скручування листя картоплі ВСЛК МДУ, Росія 1:100

вірус жовтої мозаїки квасолі ВЖМК КДУ 1: 100

вірус мозаїки люцерни ВМЛ МДУ, Росія 1 : 100

вірус тютюнової мозаїки ВТМ ІСМ УААН 1:16

вірус тютюнової мозаїки ВТМ ДВНЦ РАН, Росія 1:100

вірус огіркової мозаїки вом ІСМ УААН 1:16

Аналіз проводили в 96-лункових планшетах (“Labsystems”, Фінляндія).

Крім того, використовувався tas-ELISA (triple antibody sandvich), який проводили за загальноприйнятою методикою. Як антивидові використовували антитіла, мічені пероксидазою з хрону та лужною фосфатазою.

Для вивчення морфологіївірусів застосовувалися трансмісійні електронні мікроскопи JEM-1200 (JEOL, Японія) JEM-100B (JEOL, Японія), ЕМ-75, ЕМ-125 (Суми, Україна) з негативним контрастуванням вірусних часточок. Для виготовлення плівок-підкладок використовували 0,2% розчин

формвару (полівінілформальдегіду) в хлороформі. Для негативного контрастування зразків використовували 2% розчин фосфорновольфрамової кислоти (ФВК) рН7-7,4 та 2% розчин уранілацетату (Миронов, 1994).

Електрофорез досліджуваних зразків проводили за Laemmli з використанням 14% розділяючого поліакриламідного гелю та 5% концентруючого гелю.

Для вивчення впливу важких металів на перебіг вірусної інфекції проводили серію експериментів на рослинах Nicotiana tabacum та Datura stramonium та (з ВТМ та ХВК відповідно). Рослини піддавали сукупній дії вірусів та солей важких металів (Ni, Zn, Pb, Си), в концентраціях, визначених експериментально в ґрунтах Харківської області.

Вимірювання спектрів відбиття та поглинання у інфікованих рослинних тканин. Для лабораторних досліджень відбиття світла рослинами використовували оснащений інтегруючою сферою двопроменевий реєструючий спектрофотометр СФ-10. Для приготування зразків використовували середні частини листків. Швидкість розгортки складала 90 нм/хв. Відтворюваність запису одного й того ж зразка по абсцисі (довжина хвиль) складала 1 нм, по ординаті (коефіцієнт відбиття) - 0,3%.

Результати у цифровому вигляді паралельно передавались на ЕОМ, сполучену із спектофотометром СФ-10. За допомогою ЕОМ проводили математичну та статистичну обробку результатів (Кочубей и др., 1990).

Визначення концентрації хлорофілу у витяжках проводили спектрофотометрично. Вміст хлорофілу розраховували за формулою:

C = D652V/34.5S,

де D6J, - оптична густина при довжині хвилі 652 нм;

V - об’єм одержаного екстракту, мл;

S - площа висічки, дм2;

34.5 - сталий коефіцієнт.

При ААС для переведення зразку в розчин застосовували способи, які використовуються при аналізі мінеральної сировини.

Дослідження морфології виконувались на атомно-силовому мікроскопі (Nanoscope D 3000, Digital Instruments, USA). У дослідах використовували вірус тютюнової мозаїки, який мав концентрацію 0,8 мг/мл. Краплину розчину (25 мкл) наносили на свіжосколоту слюду, через 20-30 хв препарат промивали водою та поступово висушували на повітрі в закритій чашці Петрі. В іншій модифікації препарат наносили на слюду, витриману 10 с в

0,2% розчині формвару (полівінілформальдегіду) в хлороформі.

Коротка характеристика бази даних і програм їх аналізу. В процесі обробки структури даних їх типи змінюються, таким чином, вони потребують нової структури для свого збереження. Структурами, що зберігають дані, є таблиці. В таблиці “Ukraine” зберігаються необроблені дані, тобто детальні

описи всіх зразків, результати ІФА і т.п. При семантизації цих даних отримували нову структуру (масив) даних: замість цифрових даних ІФА - дані логічного формату типу “Так / Ні”, причому дані контролів відсівалися і в подальшому не приймали участь в ієрархії об’єктів.

Модуль “UpDate_Table” містить процедуру автоматизації введення даних та перевірки їх синтаксичної вірності (наприклад, забороняє вводити у комірку числового значення символьні дані).

Основну роботу по введенню, відбору, обробці даних виконують форми. Форма - це складний об’єкт, що містить власне форму та пов’язаний з нею модуль - сукупність процедур та функцій на “Access Basic”, що беруть участь у обробці даних форми.

“AreaSelect” - пропонує обрати: роботу із необробленими даними; обробку семантизованих (логічних) даних та відкриває форми “Plate”; “Area”.

“Choice” - пропонує обрати вид роботи: відкрити об’єкт звіту, редагувати та друкувати його або відкрити форму “AreaSelect” (якщо передбачається робота з необробленими даними)..

“Plate” - головна форма, статично пов’язана із об’єктом, забезпечує введення, сортування, перевірку синтаксису, пошук, друк, редакцію даних та поновлення (“Update”) даних таблиці “Ukraine”. Відкриває форму “AreaSelect”.

“Area” - форма, статично пов’язана з таблицею “Ukraine”, модуль цієї форми, базуючись на її даних створює (поновлює) таблицю “Tkriterium”, тобто займається обробкою даних ІФА. Форма враховує кількість контролів, що потрібно брати до уваги, сортує, друкує, редагує дані таблиці “Tkriterium”. Відкриває форму “SearchCompound” або “AreaSelect”.

“SearchCompound” - створює нові об’єкти. Модуль цієї форми завантажує ключові слова з таблиці “KeyWords” і при потребі їх поновлює; динамічно зв’язує форму з новими об’єктами; за допомогою метода OLE (Object Linking & Embeding - зв’язування та будова об’єктів) інкрустує форму об’єктами “CompoundForm” або “LastForm”, поновлює в них дані, поновлює власні дані, сортує, редагує, поєднує, відбирає, групує, друкує власні та інкорпоровані дані. Відкриває об’єкт звіту (що в свою чергу відкриває інкрустований) об’єкт запиту, що в свою чергу відкриває об’єкт “LastTable”) або форму “Plate”.

Форми, що лишились не описані, виконують деякі внутрішні функції (поєднання об’єктів, роблять користування базою більш зручним та зрозумілим). Звіт - об’єкт, що статично пов’язаний з об’єктом запиту, групує та готує дані до друку.

Запит - спеціалізована структура (об’єкт) описана мовою SQL. Робить запит до таблиці “LastTable” і вертає віртуальний об’єкт, що містить всі унікальні записи таблиці. Цей об’єкт далі використовують форма “LastTable” та звіт “LastTableReport”.

Макроси виконують послідовний набір нескладних команд, в тому випадку, коли стандартними засобами це зробити неможливо, а використання SQL або Access Basic недоцільно.

Модулі утримують процедури та функції на Access Basic та SQL -аналоги. З цими процедурами пов’язані всі арифметичні операції, операції сортування, групування, редагування і т.п.

Моніторинг вірусних захворювань сільськогосподарських культур в агроценозах регіонів України

Першим етапом нашої роботи було обстеження областей України для порівняльної оцінки ризику розповсюдження фітовірусних епідемій в залежності від конкретних характеристик регіону.

У кожній області обстежувалися від 10 до 15 полів з сільськогосподарськими культурами та супутніми бур’янами. Зведені дані статистичної обробки результатів візуальної оцінки посівів цукрового буряку наведені на рис. 1. Встановлено, що 15-76% рослин цукрових буряків мають симптоми вірусних або вірусоподібних захворювань.

Рис. 1. Результати обстежень посівів цукрового буряку в різних регіонах України на симптоми вірусних захворювань.

Аналіз результатів досліджень впродовж декількох польових сезонів дає можливість розглянути деякі факти збереження і розповсюдження вірусів, що уражують сільськогосподарські культури. Порівнюючи результати детектування антигенів вірусів у культурних рослинах (агроценоз) та диких рослинах (біоценоз) досліджуваних аграрних регіонів та наявність їх у ґрунтах, відмічається взаємозв’язок між знаходженням антигенів у ґрунті та рослині: ХВК, УВК, ВМБ, ВШМЯ, ВТМ - у Волинській області; ХВК, УВК, ВМБ, ВСПБ, ВТМ, ВОМ, ВЖКЯ, ВШМЯ - у Київській області; ХВК, УВК, ВМБ, ВЖКЯ, ВШМЯ, ВТМ - у Харківській області. Розглядаючи ці результати в динаміці, звертає на себе увагу факт не тільки кореляції між знаходженням антигенів вірусів в ґрунті та рослині, але й деякі закономірності динаміки виявлення вірусів у ґрунті. Так, наприклад, на полі під картоплею (Б-6) ХВК детектувався тільки на рослинах, у фунті не виявлявся, що могло бути пов’язане з ранніми етапами онтогенезу рослини (під час відбору зразків). У наступні роки антигени цього вірусу вже детектувалися в ґрунті, не дивлячись на те, що на полі вирощувалася пшениця. Однак в тих ценозах, які не використовувалися під сільськогосподарські угіддя (Б-5

- екологічна балка), відбувалося більш-менш стабільне детектування вірусів, як у рослинах, так і в ґрунті.

Такий патоген, як вірус смугастої мозаїки пшениці, детектувався у Волинській, Київській та Одеській областях як у ґрунті, так і на пшениці; у Харківській області тільки на пшениці (рис.2). Співпадає з літературними даними той факт, що вірус огіркової мозаїки зустрічається в ґрунті (у Харківській, Одеській та Київській областях).

Харківська Київська Волинська Одеська

Рис. 2. Порівняння результатів ідентифікації деяких вірусів злакових методом ІФА (ELISA) в різних регіонах України (по областях).

На полях під цукровим буряком виявлялася зовсім інша картина (рис.З). В Харківській та Київській областях частіше всього зустрічався вірус жовтяниці буряку, антиген якого детектувався як в рослинах, так і в ґрунті. На полях Харківської області крім антигенів вірусу жовтяниці буряку відмічено також вірус мозаїки буряку, вірус слабкого пожовтіння буряку та вірус штрихуватої мозаїки ячменю (або серологічно близький до нього). Слід відмітити, що практично всі обстежені поля цукрового буряку в Харківській області є зволожуваними. Характерно, що ці ж віруси детектувалися і на цукровому буряку, однак фактів передачі вірусу мозаїки, жовтухи та слабкого пожовтіння буряку через ґрунт в літературі не зустрічається. Якщо порівнювати в цілому, то Харківська область знову звертає на себе увагу наявністю вірусів цукрового буряку в “диких” ценозах, що може мати зв’язок з загальним забрудненням середовища. Загалом якраз у Харківській області в обстежених “диких” ценозах найширше представлені віруси рослин (рис. 4).

бо

ЗО 90 ' ІО

IU,

Z7I

4Z7I

LsZ.

їй

Харківська Волинська Київська

Одеська

ЕЗВЖБ

□ ВМБ

□ ВТМ

□ ВШМЯ 0ВСМП

Рис. 3. Порівняння результатів ідентифікації деяких вірусів цукрового буряку методом ІФА (ELISA) в різних регіонах України (по областях).

При дослідженні біоценозів Волинської області також спостерігалась кореляція між наявністю вірусів у рослинах та ґрунті. Були одержані позитивні результати ІФА в окремих точках на віруси жовтяниці та мозаїки буряку, Y-вірус картоплі та вірус тютюнової мозаїки. Однак деякі віруси

зустрічалися або тільки в рослинах, або тільки в ґрунті в залежності від місця відбору зразків. Антиген вірусу слабкого пожовтіння буряку був діагностований тільки в ґрунті.

ІО

□ ВЖБ

□ ВМБ QBTM

□ ВШМЯ ШВСМП

Харківська Волинська

Київська

Одеська

Рис.4. Порівняння результатів ідентифікації деяких вірусів з природних . ценозів методом ІФА (ELISA) різних областей України.

Обстеження лісостепових зон Одеської області, які не використовуються для сільськогосподарських потреб, виявило слабку кореляцію між знаходженням вірусів в рослинах та ґрунті. Виявлені віруси знаходились, в основному, тільки в рослинах (Y-вірус картоплі, вірус мозаїки буряку, вірус тютюнової мозаїки). Ці віруси накопичуються в лободі (Chenopodium album L.), лопуху (Arctium lappa L.), кульбабі (Taraxacum officinale Wigg.), що співпадає з літературними даними. В осоті (Cirsium arvense L.) жоден з вірусів, діагностика яких проводилася, не був виявлений, а в ґрунті був виявлений тільки антиген вірусу жовтяниці буряку.

При електронномікроскопічному вивченні ізолятів вірусів, отриманих з досліджених агроценозів, за морфологією та розміром вірусні частки практично не відрізнялися між собою та від стандартних показників, що підтверджується також і даними седиментаційного аналізу.

Оскільки з одного боку віруси детектуються в сільськогосподарських рослинах, а з другого боку в ґрунті, стає можливим використовувати факти наявності антигенів тих чи інших вірусів як для загальної оцінки агроцено-

зу, так і для прогнозування можливостей розвитку вірусних захворювань рослин в наступні роки. Як приклад, можна розглянути точку Б-2 в Київській області. В перший рік досліджень ВЖКЯ та ВШМЯ детектуються як в ґрунті, так і в рослинах кукурудзи, причому в ґрунт ці віруси могли потрапити з попередньо вирощуваних рослин (в даному випадку це кукурудза гібридна). Виходячи з біології збудників ВЖКЯ (група лютеовірусів) та ВШМЯ (група гордеівірусів), ми не можемо припустити інфікування рослин через Грунт. Так, ВЖКЯ має широке коло господарів з родини Огашіпеае, передається за допомогою попелиць персистентним шляхом, не розмножується у цьому векторі, не передається трансоваріально, не передається механічно (в тому числі й через ґрунт), не передається контактом між рослинами, не передається насінням та пилком. Передача до нових рослин-господарів відбувається за рахунок попелиць ІІЬораІозірЬит таісііз. Ші. раді, МугиБ регеісае та ін. В свою чергу ці попелиці в умовах температурного режиму досліджуваних регіонів (абсолютний мінімум температури січня - 32-4ГС) зимують виключно в стадії яєць, а не імаго (дорослої особини), таким чином передавати лютеовіруси в умовах України попелиці можуть тільки в разі прямого контакту з резервуарами вірусних інфекцій (багаторічні бур’яни або дерев’янисті рослини), оскільки віруси не можуть передаватися через яйця. При сприятливих погодних умовах розвитку цих векторів можуть відбуватися масові ураження чутливих сільськогосподарських посівів, що в свою чергу призводить до значних економічних збитків. Однак, як було сказано вище, при рості, розвитку рослин та при збиранні врожаїв віруси та (або) їх антигенні детермінанти можуть слугувати сигналом про наявність стійкої циркуляції цього вірусу в даному агроценозі, даючи змогу прогнозувати несприятливий розвиток подій та запобігати цьому. Розглядаючи цей агроценоз в динаміці, ми можемо бачити, що після того, як вірус детектувався в рослинах (кукурудза) і ґрунті, на наступний рік при висіві цукрових буряків вірус детектувався тільки у ґрунті. І дійсно, виходячи з літературних даних та власних експериментів, відомо, що ВЖКЯ не уражує цукрові буряки, маючи вузьке коло господарів з родини Огашіпеае, хоча існує багато спільних для цукрових буряків та пшениці шкідників - векторів цих вірусів (ІІІіораІозірЬит расіі, Мугиз регеісае, Асуіїозіріїоп сіігіїосіит, Маотеіріїит а\'епае та ін). Однак дослідження наступного року (коли висіяли пшеницю) показали наявність ВЖКЯ тільки на рослинах пшениці, що якраз і є доказом можливості використання детекції антигенів в ґрунті, як прогнозуючого фактору розвитку інфекції в залежності від сівозмін та погодно-кліматичних умов.

На Волині в точці В-6 антигени ХВК детектувалися в ґрунті, коли вирощували пшеницю (перед цим була картопля), і наступного року при культивуванні картоплі вона була інфікована цим вірусом. ХВК належить до групи потексвірусів, уражує багато сільськогосподарських та диких рослин

з 16 родин. Передається контактом між рослинами, механічно, не передається за допомогою векторів. Може передаватися насінням бур’янів, а також зооспорами збудника рака картоплі (БупсЬіуІгіит епсІоЬіоІісит). У деяких випадках картопля може уражуватись через коріння ХВК. Не передається пилком. Тож цілком природно, що вірус може інфікувати рослини картоплі, які будуть висаджені в контамінований ХВК ґрунт, або безпосередньо через корені, або при контакті бур’янів-резерваторів та культурних рослин, або за допомогою векторів-комах, що могли інфікуватися з супутніх бур’янів, і такий перебіг подій можливо прогнозувати та попереджувати шляхом своєчасної детекції антигенів вірусів.

У точці Х-1 (Харківська область) ми можемо простежити “міграцію” антигену ВМБ (група потівірусів). У перший рік досліджень антигени ВМБ детектувалися тільки на цукрових буряках (попередня культура - пшениця). Наступного року антиген ВМБ визначаєтьсяє і у ґрунті, і в сільськогосподарських рослинах (в даному випадку капусті). Виходячи з біології збудника відомо, що ВМБ уражує рослини 13 родин, в тому числі і ВгазБІсасеае. Вірус передається неперсистентно більш ніж 28 видами попелиць, механічною інокуляцією; за допомогою щеплень; не передається контактом між рослинами; насінням та пилком. Через дуже широке коло рослин-резерваторів (в більшості бур’янів) існує велика ймовірність попадання вірусних антигенів в ґрунт з рослинними залишками. Наступного року при посіві пшениці вірус детектувався тільки в ґрунті. Взагалі для потівірусів не доведена передача через ґрунт, але, як видно з проведених досліджень, ґрунт може виступати одним з найперших факторів визначення можливої циркуляції цих вірусів при короткострокових прогнозах.

При культивуванні кукурудзи протягом всього періоду досліджень вірусні антигени представлені дуже широко в перший рік мають тенденцію до збільшення протягом наступних двох років. Це може бути пов’язане з погіршенням санітарного стану посівів та збільшенням контамінації вірусами ґрунту. Антигени ВШМЯ у 1994 році детектувалися в рослинах кукурудзи; в 1995 - тільки в ґрунті; в 1996 - і в рослинах, і в ґрунті. Такий патоген, як ВШМЯ, належить до групи гордеівірусів. Він може уражувати рослини з З родин, таких як СЬепоросііасеае, Огатіпеае та Боїапасеае. Передається механічною інокуляцією, за допомогою насіння (до 90-100%), пилком на рослини, які запилюються. З рослинами або пилком вірус та/або антиген може потрапляти у ґрунт та підтримувати епідемічний ланцюг.

На прикладі ВТМ та ВЖКЯ показано, що концентрація вірусних антигенів у рослинах та ґрунті залежить також і від зміни культурних рослин в агроценозах (рис. 5), в той час як у природних ценозах цей рівень концентрації знаходиться на більш менш постійному рівні.

Так для ВЖКЯ резервантами можна вважати Elytrigia intermedia N., Che-nopodium album L., що здатні навіть після сівозміни (цукрових буряків) призвести до нового циклу поширення вірусу (вже на озимій пшениці). Для ВСПБ такими резервантами можуть виступати Senesio vulgaris L., Chenopo-dium amaranticolor L. та Datura stramonium L. Особливо слід відзначити реєстрацію (як електронномікроскопічним ,так і імуноферментним аналізом) високої концентрації вірусу слабкого пожовтіння буряку в талабані (Thlaspi L.). Талабан польовий (Т. arvensis) і талабан ранній (Т. ргаесох) широко зустрічаються як у вигляді бур'янів на полях цукрового буряку, так і в необроблюваних ділянках ландшафту. Важлива роль талабану як резерва-тора вірусних інфекцій витікає з того, що це дворічна (Т. arvensis), або багаторічна (Г. ргаесох) рослина; таким чином талабан виступає підтриму-вачем безперервної циркуляції ВСПБ в агроценозах. У світовій літературі дані про Thlaspi L. як чутливого або безсимптомного господаря представників родини Luteoviridae нами не були знайдені.

При досліджені грунтів по трьох горизонтах (10-20, 20-40, 40-60см в глибину) спостерігався найбільший вміст вірусів у верхньому шарі ґрунту і по мірі збільшення глибини кількість антигену вірусу зменшувалась. Подібна тенденція може мати пояснення в тому випадку, якщо припустити, що адсорбційні властивості ґрунту є менш важливими для збереження антигенів вірусів, і знаходження цих антигенів в першу чергу буде залежати від концентрації вірусів в оточуючому середовищі, тобто в рослинах агро-та біоценозів.

/ лопух подорожник

□ шприца ■лобода

□ горець

□ осот В пирій а в" юнок В берізка

□ кульбабі В гірчак

В подорожник

□ лопух________

Рис. 7. Відсоткова діаграма ураженості супутніх бур’янів вірусами

За даними, отриманими протягом 5 років досліджень, була створена карта розповсюдженості антигенів фітовірусів різних таксономічних груп, таких як ТоЬашо-, ЬШео-, Роїех-, Ногсіеі-, Cucumoviшs, РоСууігісІае в ґрунтах чотирьох регіонів України (рис. 8). Вона показує нерівномірність розповсюдження фітовірусів та її залежність від ступеня антропогенного навантаження агро- та природних ценозів.

Рис. 8. Карта розповсюдженості фітовірусів в ґрунті регіонів України (за

результатами ІФА). '

У серії експериментів з модельними системами ВТМ -Nicotiana tabacum та ХВК - Datura stramonium аналізували ситуації вирощування рослин в ґрунті з різними концентраціями важких металів. В експериментах використовувалися інтактні рослини; рослини, що вирощувалися в таких самих умовах та були інфіковані вірусом; рослини, що вирощувалися в ґрунті з додаванням солей важких металів (мідь, свинець, цинк), розраховані за показниками концентрацій цих полютантів в Харківській області (рис. 9); та рослини, вирощені на ґрунті з важкими металами та уражені вірусом (усі рослини вирощували на стерильній ґрунтовій суміші: пісок-торф-ґрунт у співвідношенні 1:1:1). Результати візуального обстеження показали, що контрольні рослини мали абсолютно нормальний, здоровий вигляд, тоді як рослини, вирощені на грунті з важкими металами помітно відставали у рості. Рослини, уражені вірусом дали симптоми вірусної інфекції (деформація листкової пластинки, пожовтіння) через два тижні після зараження,

а рослини і уражені вірусом, і вирощені на ґрунті з полютантами найбільше відставали у рості, дали симптоми вірусного ураження на 10-й день (раніше, ніж без полютантів) та загинули на 20-й день після ураження. . ..

OCd ONі

□ Pb ■ Си

□ Zn

Київська обл. Харківська обл. Волинська обл.

Рис. 9. Концентрація мікроелементів в ґрунтах, обстежених на наявність антигенів фітовірусів (мг/кг).

Встановлено, що у рослин контрольних та вирощених на ґрунті з важкими металами антиген ВТМ був відсутній. У той же час в уражених вірусом рослинах, як з полютантами так і без них, вірус був детектований в значних кількостях. При цьому показано, що у рослин, які вирощувалися на ґрунті без полютантів, загальна концентрація вірусу вища, ніж у рослин, які вирощувалися на ґрунті з додаванням важких металів. Порівнюючи ці результати з впливом вірусів та важких металів на загальний стан рослин, можна дійти висновку, що сумісна дія вірусів та важких металів призводить до погіршення фізіологічного стану рослин, що в свою чергу негативно відбивається на розвитку вірусної інфекції та загальній концентрації вірусів у рослині.

В нашій роботі обстежувалися та тестувалися декілька локальних регіонів в Зоні ЧАЕС: Копачі, Ново- та Старо-Шепеличі (10-км зони), околиці Чорнобиля, с. Опачичі, згарище в районі с. Шепеличі та с. Бурякіівка. Звертає на себе увагу той факт, що частота виявлення практично всіх вірусів в зоні ЧАЕС вища в порівнянні з іншими регіонами. При аналізі окремих представників (Elytrigia repens - пирій повзучий, Taraxacum officinale-кульбаба, Plantago major- подорожник великий, Cirsium arvense

- осот польовий), показано значні відміни між чорнобильськими та іншими зразками. Так, Taraxacum officinale не відрізнявся за наявністю УВК, ВТМ та ХВК, всі інші рослини з ЧАЕС показали значну “насиченість” фітовірус-ними антигенами. •

При ураженні лабораторних рослин-індлкаторів витяжкою з рослин осоту польового (Cirsium arvense) на тютюні (N. tabacum сорт Трапезон) з’явились характерні для ВТМ симптоми.

Порівняльний аналіз інтегрального показника частоти виявлення вірусів рослин (ХВК, ВТМ, УВК) з зони ЧАЄС та Шацького Національного парку, також показуєзначне перевищення цих показників в Зоні, що повинно свідчити про необхідний ретельний контроль за циркуляцією фітовірусів для запобігання виходу більш патогенних штамів в агроценози України.

Обстеження двох полів в районі Опачичів показало значну зустрічаємість вірусів рослин у відібраних зразках. Тестування в імуноферментному аналізі було підтверджено в біологічних тестах та електронно^ліікроскопічним методом. Порівнюючи результати проведеної роботи на території зони ЧАЕС з іншими агроценозами, розташованими в екологічно чистих районах (Шаць-кий Національний парк, Волинь), відмічено, що в зоні відчуження віруси детектувалися значно частіше. При проведені біологічних тестів з екстрактами соку рослин з Зони показаний розвиток системної інфекціїз утворенням енацій та виростів наpocnHHiNicotiana tabacum copTSamsun (витяжказ подорожника Plantago major), який дав позитивну реакцію на всі три віруси, аналогічні симптоми спостерігалися і після зараження витяжкою з горошку польового (Vicia sativa). Електронномікроскопічні дослідження показали наявність в інфікованих рослинах ВТМ-подібних вірусних часточок.

Показана відмінність в кількісному та якісному складі фітовірусних популяцій на території Зони, що може пояснюватись як зниженням захисних реакцій рослин, що ростуть в умовах радіаційного забруднення, так і підвищеною інфекційною активністю вірусів.

Приймаючи до уваги отримані результати, можна сформулювати деякі загальні закономірності впливу забруднення оточуючого середовища на віруси рослин: полютанти з оточуючого середовища можуть впливати на ґрунт, на якому ростуть рослини (шляхом зміни кислотності, концентрації іонів металів, концентрації органічних речовин, вологості та ферментативної активності ґрунту та ін.), на онтогенез рослин, що призводить до зміни стійкості рослини, на процеси взаємодії вірус - рослина або вірус -переносник, або безпосередньо на вірусні частки.

Діагностика, ідентифікація вірусів та аналіз їх розповсюдженості в умовах закритого грунту

Значний інтерес становить також діагностика та ідентифікація вірусів і аналіз їх розповсюдженості в умовах закритого ґрунту.

Як модель ми обрали рослини родини Orchidaceae які представляють значний науковий і практичний інтерес. У результаті досліджень біологічних властивостей вірусів, виділених з Cymbidium hybridum, на рослинах-індикаторах нами були отримані такі результати: на листках дурману

звичайного (Daturastramonium), який було інокульовано соком мозаїчного цимбідіуму, повільно розвиваються локальні симптоми, а не системні, типові для ВМІД; на гомфрені головчастій (Gomfrena globosa) через 20 діб після ураження на інокульованих листках з’являються чіткі місцеві некрози брунатного кольору 2-3 мм в діаметрі, що відповідає реакції, яку викликає при інокуляції ВКПО; на лободі (Chenopodium amaranticolor), яку інокулювали соком мозаїчних рослин цимбідіуму, на 8 день з’являються розпливчасті хлоротичні плями,на16-18-й- чіткі некрози - локальна некротизація, а не системна реакція; на тютюні (Nicotiana glutinosa) - зони некротизації, що повільно розвиваються (через три тижні), не системна реакція. Ця реакція свідчить про те, що рослини Cymbidium hybridum уражені двома видами вірусів: ВКПО та ВМЦ.

Електронномікроскопічні дані підтвердили, що всі досліджувані зразки містили ВМЦ та ВКПО (рис. 10).

Рис. 10. Електронномікроскопічне зображення суміші ВМЦ (1) та ВКПО (2)

(х 125 000).

Для ідентифікації ВМЦ і ВКПО в інфікованих рослинах цимбідіума за допомогою ELISATa dot-ELISA використовувались отримані нами моно-клональні антитіла і поліклональні імунні сироватки.

У випадку дослідження трьох сортів рослин Cymbidium hybridum hort на різних етапах мікроклонального розмноження в соку зразків виявилась суміш ВМЦ та ВКПО. •

Спостерігалося зниження концентрації вірусу в процесі росту рослин. Меристемні рослини містили менше вірусу, ніж просто протокорми, а рослини у віці двох років ніж рослини, що вирощені у пробірці.

Виявлена різниця у ступені ураженості трьох сортів. Хоч тенденція розвитку інфекції у всіх сортів була однакова, найбільша концентрація вірусів, була у Cassandra “Gennifer”, а найменша - у Lillian Stewart “Sundown”.

Отримані результати підтверджують, що кроляча поліклональна сироватка специфічна до ВКПО, хоча в значно меншій мірі, але реагує з білками ВМЦ, в той час, як отримані МАТ до ВМЦ високоспецифічні тільки для ВМЦ. Це демонструє зручність застосування отриманих моноклональних антитіл до ВМЦ для його ідентифікації в інфікованих рослинах за допомогою різних імунохімічних аналізів. Беручи до уваги переваги моноклональних антитіл в порівнянні з поліклональною сироваткою, і перш за все їх високу специфічність, перспективним є їх використання для діагностики вірусних інфекцій орхідей, перш за все, імпортованих. Наші дослідження показали значне розповсюдження (до 50-70% обстежених рослин) ВМЦ та ВКПО на рослинах родини орхідних у умовах закритого ґрунту.

Крім того, проводилися дослідження рослин цукрового буряку з тепличних господарств Миколаївської області. Нами було виявлено та виділено новий вірус. Електронномікроскопічні дослідження дозволили розрахувати розміри виявлених віріонів, що дорівнювали 300±15 х 38±3 нм (рис. 11).

Рис. 11. Електронномікроскопічне зображення вірусу, виділеного з цукрового буряку (х70 000).

Пепломери у віріонів розміщуються регулярно, відповідно до ротаційно-трансляційної симетрії, відстань між ними (крок спіралі) ~ 3,0 нм, тобто на віріон припадає « 100x30=3000 пепломерів продуктів гену L. Крім електронно-мікроскопічної ідентифікації проведено дослідження по встановленню кола рослин-індикаторів. В експериментах використовували Chenopo-dium amaranticolor L, Chenopodium album L, Chenopodium quinoa L, Nicoti-ana glutinosa, Nicotiana tabacum L., Lycopersicon esculentum Murr., Tetragonia expansa Murr., Datura stramonium, Gomphrena globosa, Petunia hibrida. Якщо у випадку з нитковидним вірусом картина зараження соком з експериментального матеріалу повністю збігалася з описаною в літературі для вірусів ВЖБ та ВМБ, то передачу таким шляхом бациловидних вірусів встановити не вдалося.

На наш погляд, важливо, що вірус було виділено з тепличних господарств. Проте, поки що важко судити про його розповсюдження в умовах сільськогосподарського виробництва та спричинені ним економічні збитки.

Бездеградаційна експрес-діагностика захворювань рослин, спричинених

вірусами

Важливим для прогнозування епіфітотій є рання діагностика вірусної інфекції рослин. Спосіб бездеградаційної діагностики стресів рослин вірусної етіології, що базується на візуальній оцінці забарвлення листя, є суб’єктивним та дозволяє діагностувати вірусну інфекцію на досить ранніх етапах розвитку патологічного процесу. Ми оцінювали перспективи використання для тестування вірусних захворювань рослин оригінального спектрального параметру, що являє собою величину відношення амплітуд максимумів першої похідної від кривої відбиття в області 650-750 нм. Цей відносний параметр, що характеризує форму кривої відбиття рослинності в області червоного спектру, має ряд властивостей, які роблять його перспективним для дистанційного вимірювання хлорофілу. Були вивчені рівні зміни вмісту хлорофілу в листках і чутливість до нього спектрального параметра Г/І, в рослинах тютюну та дурману, уражених ВТМ та ХВК відповідно, в різні строки розвитку інфекційного процесу.

Спектри відбиття листків записували в цифровому і аналоговому вигляді на спектрофотометрі СФ-10 у діапазоні довжини хвиль 400-750 нм.

Паралельно із зміною вмісту пігментів спостерігалися зміни характеристик відбиття листків (рис. 12.).

Насамперед, у інфікованих рослин збільшилось відбиття світла з довжиною хвилі 550 нм, а також мала місце зміна відбиття в області червоного краю. Як кількісна характеристика форми кривої відбиття в цій області була розглянута величина відношення максимумів першої похідної. У рослин, уражених вірусом, відносна інтенсивність хвильового максимуму змінювалась на користь більш короткохвильового.

695 Ю5 ?{5 725 ?35^л.<--

а б

Рис. 12. а - спектри відбиття листків тютюну у видимій області контрольних (1) і уражених вірусом тютюнової мозаїки (2) рослин; б - перші похідні від спектрів відбиття в області червоного краю листків тютюну контрольних (1) і уражених вірусом тютюнової мозаїки (2) рослин.

Достовірна різниця між значеннями спектрального параметра І,/І, спостерігалась при різниці вмісту хлорофілу в листках близько 0,8 мг/дм2.

У середньому зміна хлорофілу на 0,1 мг/дм2 відповідала зміні спектрального параметра на 0,01. Якщо врахувати, що достовірність визначення останнього становить ±0,05, то можна зробити висновок, що за допомогою даного спектрального параметра можливо розрізнити листя, різниця в кількості хлорофілу між якими становитиме 0,5 мг/дм2. В умовах нашого експерименту це було можливим протягом двох тижнів після інфікування ВТМ рослин тютюну.

Одержані результати показують, що за допомогою спектрального параметра відбиття ІД можливе виявлення рослин тютюну, уражених ВТМ, після двох тижнів з моменту інфікування. У випадку з рослинами дурману, інфікованими ХВК, тестування було можливе лише на 21-у добу розвитку захворювання. Зазначимо, однак, що при розвитку патологічного процесу під впливом застосованих вірусів має місце також зменшення площі листкової поверхні. Це означає, що достовірність тестованих вірусних рослин при дистанційному зондуванні посівів буде збільшуватись за допомогою вимірювання абсолютних параметрів відбиття, які є доволі чутливими до зміни величини листкового індексу.

Таким чином, можна зробити висновок про те, що за допомогою характеристик відбиття рослин у видимому діапазоні можлива експрес-діагностика тих вірусних інфекцій, які викликають зміну пігментації листків. Надійність діагностики буде зростати при вимірюванні також ще •листкового індексу. •

Крім того, для експрес-діагностики вірусів рослин в умовах референс-лабораторій можуть бути використані сучасні методи растрової мікроскопії, зокрема, атомно-силової.

Однією з проблем дослідження зразків за допомогою АСМ є нанесення препарату на ідеально рівну поверхню та його закріплення на ній. Показано, що білкові молекули адсорбуються для вивчення в АСМ на золоті, або слюді. Золото демонструє досить високі адсорбуючі властивості, але має недолік - нерівну поверхню. Слюда, навпаки, мас значно кращі,характеристики рельєфу поверхні, однак для адсорбції на слюді потрібно додатково проводити її обробку. У нашому випадку для покращення адсорбції, по аналогії з приготуванням препаратів для електронної мікроскопії, ми використовували формвар, який наносили на слюду. Для контролю поверхні були зняті показники рельєфу чистої слюди та слюди, обробленої формваром. Вони становили 0,087 нм та 0,239 нм відповідно.

Порівнюючи зображення ВТМ на золоті та формварі при одній і тій же концентрації ВТМ, було встановлено, що слюда, яка підлягала попередній обробці формваром, має більшу адсорбуючу здатність і гладку поверхню при дослідженні в АСМ. ...

На відміну від електронної мікроскопії АСМ дає зображення у трьох проекціях, тобто досліджуваний об’єкт має об’ємний вигляд, що дає змогу за допомогою комп’ютерної системи більш точно моделювати поверхневі структури віріонів. Дослідження за допомогою АСМ доповнять інформацію про структурну організацію як зовнішніх, так і внутрішніх компонентів віріону, дозволять вирішувати питання, пов’язані з вивченням їх внутрішньої будови та упаковки нуклеїнової кислоти всередині віріону. Виконані дослідження відкривають нові перспективи для дослідження вірусів та їх діагностики за допомогою АСМ.

Стратегія прогнозування появи та розвитку фітоепідемій

Аналіз епіфітотій, що викликаються вірусами у різних видів рослин, пов’язаний із встановленням характеру впливу різноманітних екологічних факторів на віруси та їх шкодочинність, а також зв’язків між ланцюгами біоценозу.

При оцінці ризику виникнення епіфітотії необхідно більш комплексно підходити до аналізу умов в конкретному біо- чи агроценозі. Порівняльний аналіз великої кількості ценозів в різних регіонах України дозволив вивчити природні шляхи циркуляції вірусів, час їх знаходження в резервуарах, загальну розповсюдженість окремих вірусів на території України. Інформація такого плану необхідна для прогнозування розвитку епіфітотій та створення рекомендацій про заходи щодо їх попередження.

Були проведені дослідження різних екологічних регіонів України (Волинської, Харківської, Київської, Одеської, Вінницької областей) на присутність

вірусних антигенів на найважливіших сільськогосподарських культурах: цукровому буряку, пшениці, кукурудзі, ячмені, соняшнику та картоплі. Обстежувався загальний стан поля, відбиралися комплексні проби з культурних рослин, бур’янів та ґрунту під ними. При проведенні досліджень особливу увагу приділяли взаємозв’язку між наявністю вірусного антигену в сільськогосподарській рослині, в бур’янах та/або ґрунті.

Наші дослідження показали, наприклад, часту детекцію в ґрунті антигену ВЖКЯ з чіткою кореляцією його і на злакових. Аналогічна залежність виявлена і для ВШМЯ. Потрібно відмітити, що аналогічним чином ці два віруси проявляли себе і в біоценозах (необроблюваних ділянках землі

- неугіддях, балках та ін.).

Отримані дані потребували з одного боку обробки, а з іншої - зберігання в систематизованій формі. Специфіка даної роботи в тому, що дослідження проводилися протягом декількох років і будуть проводитись у майбутньому. Це робить необхідним побудову гнучкої системи аналізу отриманих даних, зважаючи на отримані раніше. З цією метою була створена база даних в середовищі MS Access, яка здатна, крім збереження та систематизації даних, проводити їх аналіз. Інтеграція процесу обробки та систематизації даних дозволяє контролювати правильність постановки експерименту на початкових етапах та їх корекцію в подальшому. Легкість доопрацювання обробляючих модулів, швидкість роботи, зручність інтерфейсу та можливість представлення результатів в будь-якій формі та будь-якому Windows-додатку робить систему відкритою та зручною.

У базі даних зберігається початкова інформація, отримана при скануванні планшетів з ІФА (рис. 13). Це дозволяє швидко проводити переоцінку результатів навіть через декілька років, якщо алгоритм аналізу змінився. Таблиця таких даних пов’язана з таблицею, що описує час, коли проводився аналіз, місце відбору, тип і інші атрибути зразків, відібраних для аналізу. Реляційність даних виключає, шляхом розбивки даних на групи, повторення опису однієї з груп в іншій. Таким чином, при внесенні нових даних немає необхідності перегруповувати старі, тому що нові дані стають їх частиною з успадкуванням всіх їх властивостей. Для підвищення продуктивності результати первинної обробки зберігаються у вигляді логічного “так”- “ні”. В базі зберігаються останні результати складних відборів (які неможливо здійснити одноранговим запитом SQL-запитом) та звіти на їх основі (звіти можуть аналізуватися як з MS Access, так і експортовані в MS Word або MS Excel).

Після внесення вхідних (первинних) даних, якими є результати ІФА, встановлюються рівні контрольних значень, якщо ставили декілька контро-лів - контрольні значення розбивають на групи і далі вони можуть динамічно підключатися або не підключатися. Ці дані обробляються вбудованою програмою аналізу та, з врахуванням підключених контролів, будується

Зразки відбирають кожного року по «СІК теритогіТ України

Оггтичні густини за даними 1ФА

ІФА

Волинська Г 1В9 144 455 102 127

Волинська ІЯІ11МЯ 199 189 378 68 83 іуо

Київська | 606 677 439 474 404

Київська {ВЖЕ 1401 1018 1243 1096 761

Київська Івшмя 400 зез 104! 284

Київська !у 971 654 392; У’’, -^32 644

Київська ІВЖБ 1000 775 11>£>І93 754 877

Київська Івшмя 78І 65£ 128 139 309

ЄеагсЬСотроипсІ5

Комп'ютерний аналіз, перевірка та вибір коректних коктролів, групування даних за ознаками попередніх

8а6*ріяьр*4Ьш | віру* 11 §т4*р(ш* | &4»яш*т

нолг ія.иішНсумии*

Крий -. Я^І ВРУ® ТжН Зразок Ти> зразка

воіинськ» X Тк •Чмж тая 9 актом (суігі«).1 20МД-2(12т .і

Киюсьм ННВьіа м н І*ККЖ іме) ютем (су*гіі),120МД*2(12т .і

Одеські У » •Юкх ТОМ > жигои (су%м),1 20МД-3{12ті

[■ТІІІІПІ>ДИ^ЬЦ І вели н . |*0«| и* і ютом (суміа),120МД-2(12т .1

І ^ЦПППІЬКА КСНТР. н іЧка юм » юггсм (сумі ■) ,120МД-2(12т і

1 ВОЛИНСЬКА м т« І*КИОК х>т і житом ,№0Р6(Хі2О*6От/« гне

1 ВОЛИНСЬКА X Тш ІІМЯ ■«м» > шпчм^оогайкі 20*€0та« ік

1 ВОЛИНСЬКА V н ііва т** іжктом/<ЗСР6СИ120^0тЛ» гс

Логічта Іктерсрепиі* числових даймі ІФА

Доспідюиа область; Г" і ВОЛИНСЬКА Р

івушгшвкгрвгьАТ1»АТ2 |7 >»у«*п»к>«рогьАТ*ЛТ1 Ф

іу»«т Юитм'Ь АГ«М5*АГ2 іуі«тм «онтро» Аґ*АТ2

1 ? 1 ^ І і і «; 1 В 1 у 1 її а _10_! 11 І п І

1 СаГ І..ГУ, Ус* У*» І V» ІУ» |уи гаг 1 V*. |у« У„

ч N0 N0 ГнГ гіг 1 У» * | Ум Г*

М 1 * 1 »■ І» N0 |у» У« ІУИ !« | Тез IV» У«*

•СУК 1 *■ І * * N0 | Ум 1 * їй. І" 1 Ма І * І N0

кошт. І.«. І» N0 р-“ |«ї_ 1» І» І « I- I»

Риямьяутцій

•сі ж 6

Ц|<ЬТ>ИМЦ»#>*<ИНМ І Сергу І

Рис. 13. Аналіз та обробка даних за допомогою комп’ютерної системи керування базами даних.

зо

аналогічна таблиця даних, але вже зі значеннями булевського типу (ТакІ Ні). Такі дані, являючись більш інформативними, все ж таки не являють собою прикладного інтересу із-за своєї численності (тільки за один сезон їх кількість сягає 20.000). Подальшим засобом їх візуалізації був вибраний комплексний умовний відбір. Приклад: необхідно визначити взаємозв’язок між наявністю вірусу в сільськогосподарській культурі в залежності від його наявності в ґрунті та/або рослині-супутнику на протязі довільного проміжку часу паралельно в декількох регіонах. Такий аналіз забезпечує інша група функцій Access Basic та SQL-запитів. Спираючись на такого роду дані можна робити висновки про закономірності розвитку епідемій (епіфітотій), характер циркуляції вірусів в ценозах, простежувати шляхи передачі фіто-вірусів та впливу агротехнічних заходів на увесь комплекс вірус-рослина.

З теоретичної точки зору в цій проблемі цікава можливість опосередкованого, але статистично достовірного виявлення взаємозв’язків типу вірус-переносник-резервуар-господар та їх динаміки.

ВИСНОВКИ

1. Вперше проведена якісна та кількісна оцінка агроценозів та природних екологічних ніш на наявність шкодочинних вірусів сільськогосподарських культур на основі імуноферментного аналізу з урахуванням біологічних, молекулярних, антигенних властивостей РНК-вмісних вірусів та показана нерівномірність розповсюдженості фітовірусів на території України.

2. Встановлено взаємозв’язок між частотою знаходження антигенів фітовірусів - представників ТоЪашо-, Luteo-, Potex-, Hordei-, Cucumovirus, Clostero-, Potyviridae в культурних рослинах, бур’янах, ґрунті і вірогідністю розповсюдження тієї чи іншої вірусної хвороби в наступні роки.

3. Створено комп’ютерну базу даних та систему управління базами даних для аналізу розповсюдженості фітовірусів в культурних рослинах, бур’янах і ґрунті агроценозів та показана можливість її застосування для коротко-, середньо- та довгострокових прогнозів розвитку вірусних захворювань.

4. Встановлена залежність міжрозповсюдженістю фітовірусних інфекцій та техногенним навантаженням наагро- чи біоценоз. У Харківській області в районі Змієвської ДРЕС частота виявлення антигенів фітовірусів в 1,52,2 рази перевищувала аналогічні показники в Київській, Одеській та Волинській областях.

5. Експериментально обґрунтовано та запропоновано методику оцінки розповсюдження фітовірусних інфекцій на основі комплексної діагностики рослин-предикторів, можливості застосування для цього створеної нами комп’ютерної бази даних.

6. Встановлено нові види рослин-резерваторів для деяких вірусів, такі як талабан польовий (Thlaspi arvense) для ВСПБ та костриця лучна (Festuca

pratensis) для ВЖКЯ, в яких антигени вірусів досягають значних концентрацій практично без симптомів вірусного захворювання.

7. Описано новий РНК-вмісний бациловидний вірус, що уражує цукрові

буряки, який належить до родини Rhabdoviridae і відрізняється за розмірами (38x300 нм) від відомого вірусу скручування верхівок буряку (80x250 нм). Доведено, що він передається механічним шляхом. 1

8. В умовах закритого Грунту показано значну розповсюдженість ВМЦ та ВКПО на рослинах родини Orchidaceae. Нами отримані моноклбнальні антитіла до ВМЦ, придатні для діагностики захворювання орхідей.

9. Розроблено технологічну схему контролю отримання високоякісного

безвірусного посадкового матеріалу орхідей мікроклональним розмноженням. '

10. На модельних системах Nicotiana debney - ВТМ та Datura stramonium - ХВК показано відмінності в спектрах відбиття між інфікованими та інтактними рослинами і показана можливість застосування даного параметру для бездеградаційної дистанційної експрес-діагностики вірусних хвороб рослин в різних умовах їх вирощування.

11. Розроблено спосіб візуалізації віріонів методом атомно-силової

мікроскопії, що дає можливість його застосовування для швидкої та надійної діагностики вірусів та вивчення їх структури. '

12. У природних ценозах фітовіруси мають постійну концентрацію, яка практично не змінюється від сезону до сезону і може розглядатися як критерій стабільності рослинного угрупування.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Поліщук В.П., Сенчугова Н.А., Будаанівска І.Г., Головенько О JI., Бойко А Л. Моніторинг та стратегія прогнозування вірусних захворювань сільськогосподарських рослин в різних агроценозах України //Доповіді Національної академіїнаукУкраїни,- 1998. - №2.-С. 184-187.

2. Поліщук В.П., Бойко A.JL, Будзанівська І.Г., ТивончукТ.П. Контроль за

лютеовірусними інфекціями в різних агроценозах України //Вісник Київ, універс. ім. Т.Шевченка. - 1998. - Вип. 28. - С. 56-58; ;

3. ПоліщукВ.П., Бойко A.JL, Будзанівська І.Г.Детекція антигенів фітовїрусів

в ґрунті як складова частина моніторингу та прогнозування розвитку епіфітотій //Вісник Аграрної Науки. - 1999. — Лгэ И. — С. 59-63. .

4. Поліщук В.П., Демьяненко Ф.П. Розробка комп’ютерної бази даних' для моніторингу фітовірусних інфекцій на Україні II Доповіді Національної академії наук України. - 1999. - №2. - С. 185-188.

5. Поліщук В.П., Сенчугова Н.А., Бойко A.JI. та ін. Поширення вірусних

хвороб цукрових буряків в Україні//Вісник аграрної науки. - 1994. - № 2. -С. 33-38. . -

6. Поліщук В.П., Шадчина Т.М. Перспективи тестування біотичних стресів у рослин по спектрам відбиття листя //Доповіді Національної академії наук України. - 2000. - №1. - С.182-186.

7. Будзанівська І.Г., Тивончук Т.П., Поліщук В.П., Бойко A.JI. Зв’язок між наявністю антигенів фітовірусів в ґрунті, структурою ґрунтів та екологічним станом зовнішнього середовища //Вісник аграрної науки. - 1998. -№ 9.-С. 61-63.

8. Тивончук Т.П., Поліщук В.П., Будзанівська І.Г., Бойко A.JI. Вивчення бур’янів як резервантів вірусних інфекцій в агроценозах //Вісник аграрної науки. - 1998. - №2. - С. 20-22.

9. Polischuk V., Boyko A., Spaar D., Budzanivska I., Boubriak O. and Tyvonchuk T. Monitoring of some phytoviral infections in Ukraine //Arh. Phytopath. Pflanz., 1998. - Vol. 31. - P. 459-464.

10. Polischuk V.P., Michalsky L.A., Ovod V.V. Diagnostics of Cymbidium Mosaic Virus it the help of monoclonal antibodies //Microbiologichny Jorn. 1995. - V.57 -N l.-P. 76-80.

11.Polischuk V.P., Shadchina T.M., Kompanetz T.I., Budzanivskaya I.G., Boyko A.L., Sozinov A.A. Changes in reflectance spectrum characteristics of Nicotiana debney plant under the influence of viral infection //Arh. Phytopath. Pflanz., 1997. - Vol. 31. - P. 115-119.

12.Polischuk V.P., Lavrentyeva A.N., Boyko A.L., Belonog S.A., Koroteeva A.V. The virusological control of Cymbidium hybridum hort. Plants at different stages of microclonal reproduction /В кн. Охорона і культивування орхідей. - К.:Наук. думка, 1999. - С. 112-116.

13. Поліщук В.П., Ренгневич О.В., Бекетов Г.В., Тивончук Т.П., Бойко A.JI. Вивчення вірусу тютюнової мозаїки за допомогою атомно-силового мікроскопу //Биополимеры и клетка. - Т. 15. - №5. - 1999.- С. 456-460.

14.Бойко A.JI.,Ткачук І.П., Поліщук В.П.,ВойтюкЮ.О., Загородній Ю.В. Патогени вірусної природи //Захист рослин. - 1997. - № 11. - С. 9.

15.Бойко А.Л., Муж Г.В., Сенчугова Н.А., Бойко О.А., Капустіна Н.О., Кир’яченко С.С., Поліщук В.П. Здорові лікарські рослини //Захист рослин. - 1999.-№10.-С. 24-25.

16.Литвинов Г.С., Полищук В.П., Бойко A.JI. Изменение структуры

бактериофага Т4 под воздействием постоянного магнитного поля // Биополимеры и клетка. - 1992. - Т. 8. - 1. - С. 46-51.

17. Сенчугова Н.А., Яцківська JI.I., Барановська О.М., Васильєва Н.О., Поліщук В.П., Бойко A.JI. Про новий вірус цукрових буряків.// Вісник Київ, універс. ім. Т. Шевченка. - 1991. - Вип. 3. - С. 26-27.

18.Рябой С.М., Поліщук В.П. Розробка методів ідентифікації вірусних хвороб орхідей роду Cymbidium SW //Укр. ботан. журн. - 1990. - Т. 47.

- №4. - С. 94-96.

19. Литвинов Г.С., Князева Н.А., Кондратюк О.А., Ромашев С.А., Смірно-ва С.О., Поліщук В.П., Бойко А.Л. Діагностика вірусних інфекцій на ранніх стадіях розвитку соняшнику в лабораторних умовах //Охорона, вивчення і збагачення рослинного світу. - 1990. - Вип.17. - С. 92-99.

20. Рижкова А.Є., Поліщук В.П., Вервес Ю.Г., Бойко А.Л. Білокрилки (Homoptera: Aleyrodinea) - переносники вірусів рослин //Известия Харьковского энтомологического общества. -1999. - Вии. 2. - Т. VII. - С. 99-107.

21. Юхименко А.І., Гірко A.I., Поліщук В.П., Бойко A.JI. Жовта карликовість ячменю. Епіфітотія вірусу в сезоні 1998/1999 років//Захист рослин.

- 2000. - № 3. - С. 7-8.

22. Boyko A.L.,Zagorodny Yu.V., Polischuk V.P. Critical state of plants under the influence of viral infection and ecological disbalance //Arch. Phytopath. Pflanz. - 1996. - Vol. 30- P. 367-370.

23.Boyko A.L., Spaar D., Polischuk V.P. et al. The exploration of Rhabdovi-ruses, which are infecting the agricultural plants in conditions of Ukraine // Arch. Phytopath. Pflanz. - 1995. - Vol. 30. - P. 85-90.

24. Бойко А.Л., Поліщук В.П., Будзанівська І.Г. Перспективи використання методів дистанційного зондування для прогнозу та профілактики вірусних захворювань сільськогосподарських культур /В сб. “Теоретичні та практичні аспекти довгострокового прогнозування агрометеорологічних чинників і прогноз їх аномалій на період до 2005”. - Київ, Україна, 14-15 лютого, 1995. - С. 20-22.

25. Полищук В.П., Сенчугова Н.А., Будзанивская И.Г., Головенько Е.Л., Бойко АЛ. Мониторинг и прогнозирование вирусных заболеваний сельскохозяйственных растений в различных агроценозах Украины /В сб. “Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологичность”. - Всероссийский съезд по защите растений. - Санкт-Петербург, Россия, декабрь 1995.-С. 74-75.

26. Дем’яненко Ф.П., Будзанівська І.Г., Поліщук В.П., Головенько О.Л. Використання математичних моделей для оцінки розповсюдженості фітовірусів в деяких регіонах України //2 Міжнародна конференція “Біоресурси та віруси”, Київ, Україна, 7-10 вересня, 1998. - С. 79.

27. Полищук В.П. Экология и эпидемиология некоторых вирусов растений в Украине 112 Міжнародна конференція “Біоресурси та віруси”, Київ, Україна, 7-10 вересня, 1998. - С. 101.

28.Поліщук В.П., Сенчугова Н.А., Яцківська Л.І., Стасевич О.М. Поширення вірусів слабкого пожовтіння та жовтухи цукрових буряків в різних регіонах України //Тези 1 (8) з’їзду Українського мікробіологічного товариства. - Одеса, Україна, 8-13 вересня, 1994. - Мікробіол. журн. - 1994.-Т. 56. - №5.-С. 101.

29. Polischuk V.P., Litvinov G.S., Boyko A.L. Bacteriophage T4 tale sheet contraction induced by constant magnetic field //Intern. Symp. “Molecular organisation of biological structure”. - Moscow, Russia, 1989. - V. 1. - P. 82.

30. Rjaboy S.N., Polischuk V.P., Michalsky L.A., Ovod V.V. Diagnostic of the viruses deseases Cymbidium sp. on different development stages by monoclonal antibody //Intern. Symp. “Breeding, Propagation, disease control of glasshouse flowers and other ornamental plants”. - Salaspils, Latvia, 1991. -P. 58.

31.Litvinov G.S., Polischuk V.P., Malaya E.V. Laser action on the structure and function of T4 bacteriophage //First World Congress for Electrisity and Magnetism on Biology and Medicine. Lake Buena Vista, Florida, USA. -1992.-P. 97.

32. Poliscuk V.P., Litvinov G.S., Boyko A.L. Changes of structure bacteriophages under influence constant magnetic fields //IXth Int. Congress of Virology. - Glasgow, Scotland, August, 8-13. - Glasgow. - P. 366.

33. Polischuk V.P., Senchugova N.A. The discovery of viruses strincing sugar-beet in soil, weeds and cultural plants of West Polissya //Int. Conferense “Fundamental and applied problems of phitovirology”. - Yalta, Ukraine, May, 1994.-P. 41.

34. Boyko A.L., Spaar D., Mischenko L.T., Polischuk V.P., Senchugova N.A. Investigations on phytopathohenic rhabdoviruses in the Ukraine//Int. Symp. “75 Years of phytopathological and resistance research at Aschersleben” Aschersleben, Germany, 12-16 June, 1995. - P. 5.

35. V.P. Polischuk, N.A. Senchugova, I.G. Budzanivskaya, F.P. Demyanenko. Diagnostics, control and prognosis of plant viral diseases in different ecological regions of Ukraine //Xth Int. Congress of Virology, Jerusalem, Israel, 11-16 August, 1996. - P. 241

36. Polischuk V.P., Kostikov I.Y., Romanenko P.A., Boyko V.R. Probable viral etiology of the disease of soil alga Chlorococcum elkhartiense Arch, et Bold //1st European Phycological Congress, Cologne, Germany. August 11-

18, 1996.-P. 431

37. Polischuk V.P., Boyko A.L., Budzanivsklaya I.G., Boubriak O.A. Prognosis and an attempt to forecasts the spread of plant luteovirus diseases in Ukraine. //Int. Conf. “Luteoviruses”, Chirenchester, UK, 24-26 March, 1997. - P. 27.

38. Polishcuk V., Demyanenko F., Budzanivskaya I., Smalius E., Tyvonchuk T. Identification of plant viruses in different agrocenosis of Ukrane and creation computer database //International regional seminar “Environment protection: modern studies in ecology and microbiology”, Uzhgorod, Ukraine, 1997.-P. 204-208.

39. Boyko A.L., Polischuk V.P., Bondarenko P.E. Problems of viral infections in ecological niches and biothecnological process //Int. Conf. “Problems and perspectives of biothecnology”, Yalta, Ukraine, September 25-26, 1997. - P. 83.

40. Demyanenko F.P., Polischuk V.P., Bydzanivskaya I.G. Creation a database to handle information on virus spread in Ukraine//Nat. Conf. “Conservation and biodiversity in Ukraine”, Kaniv, Ukraine, 21-24 October 1997. - P. 63-64.

41.Kobets N., Voinov O., Polischuk V. Spectral response of some cultivated plants on viral infection //Eur. Symp. Aerospase Remote Sensing, London, UK, 22-26 September 1997. - P. 21.

42.Polischuk V., Budzanivskaya I., Demyanenko F. Relationship between phytovirus availability in soils of Ukraine and ecological condition of agrocenosis //Fourh International Symposium and Exhibition on Environmental Contamination in Central and Eastern Europe. - Warsaw, Poland, September 15-17, 1998. - P. 156-157.

43. Budsanivskaya I., Polischuk V., Smalius E., Tyvonshuk T., Boyko A. Correlation between phytovirus infection in soils of Ukraine and ecological condition of agrocenosis//16 World Congress of Soil Science.-Montpellier, France, August 20-26, 1998.-P. 204.

44. Polischuk V.P., Tyvonshuk T., Budzanivskaya I.G., Demyanenko F.P. et al. Beet Mild Yellowing Luteovirus in Ukraine - Epidemiology and Host Range // XI Int. Congress of Virology. - Sydney, Australia, August 9-14, 1999. - P. 194.

45. Polischuk V.P., Budzanivskaya I.G., Boyko A.L. Epidemiology and Monitoring of Some Plant Viruses in Ukraine.//Vllth Int. Plant Virus Epidemiology Symposium. - Almeria, Spain, April 11-16, 1999. - P. 126-127.

46. Budzanivskaya I.G., Polischuk V.P., Boyko A.L. Relationship between irrigation of arable lands and phytoviral infection spreading.//Internationas Symposium Drought and Plant production. - Lepencki Vir, Yugoslavia, September, 17-20, 1996.-P. 23.

47. Shevchenko A.V., Tyvonchuk T.P., Polischuk V.P. A comparative study of molecular and biological properties of two isolates of tobacco mosaic virus (TMV) and its common strain Ul//Conf. on Genetics and Molecular biology.-Lviv, Ukraine, April 20-22, 2000. - Lviv. - P.51.

48.Koroteeva A.,Rijkova A., Polischuk V. Physiological changes among some members of Orchideaceae family affected by viruses //12th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology. - Budapest, Hungary, August, 21-25, 2000. - Budapest. - P. 20.

Поліщук В.П. Моніторинг, прогнозування та закономірності розповсюдження вірусів рослин в біоценозах України. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 - вірусологія. Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2000.

Робота присвячена вивченню розповсюдженості фітовірусів різних таксономічних груп (таких як ТоЬашо-, ЬіНео-, Роїех-, Ногсіеі-, СисишоуігиБ, Сіозіего-, Роїууігісіае) в сільськогосподарських рослинах, бур’янах, дикоростучих рослинах та ґрунті різних екологічних регіонів України.

Експериментально обґрунтовано та запропоновано методику оцінки розповсюдження вірусів рослин на основі комплексної діагностики рослин-предикторів.

Результати роботи дозволяють розглянути та сформулювати закономірності впливу забруднення довкілля полютантами (такими як важкі метали) на фітовіруси: опосередкований вплив на ґрунт та рослину змінює середовище і для розвитку вірусів, що може призводити до зміни інфек-ційності вже відомих патогенів та, можливо, виникнення нових, більш шкодочинних штамів вірусів.

Описано новий РНК-вмісний бациловидний вірус, що уражує цукрові буряки та належить до родини ІІЬаЬсіоуігісІае і має розміри 38 х 300 нм.

В умовах закритого ґрунту показано значну розповсюдженість ВМЦ та ВКПО. Проведена їх ідентифікація за допомогою отриманих монокло-нальних антитіл.

Створена комп’ютерна база даних розповсюдження фітовірусів на території України та система управління базами даних є необхідною умовою для фітосанігарної оцінки агроценозів та вироблення стратегії прогнозування і запобігання епідемій (епіфітотій) вірусів рослин.

Досліджена можливість бездеградаційної дистанційної експрес-діагностики вірусних хвороб рослин яка може бути основою для створення нового покоління методів діагностики фітовірусних інфекцій на великих територіях. Впровадження методу атомно-силової мікроскопії дозволяє дати відповідь на питання про тонку поверхневу структуру віріону та повніше зрозуміти зв’язок між фізико-хімічними та біологічними властивостями вірусів.

Ключові слова: фітовірус, розповсюдження, циркуляція, частота виявлення, база даних, прогнозування, бездеградаційна експрес-діагностика, техногенне навантаження, предиктори, атомно-силова мікроскопія.

Полищук В.П. Прогнозирование и закономерности распространения вирусов растений в биоценозах Украины. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени доктора биологических наук по специальности 03.00.06 - вирусология. Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2000. •

Работа посвящена изучению распространенности фитовирусов разных таксономических групп (таких как ТоЬато-, Ьи1ео-, Ро1ех-, НогсШ-, Сиситоуциз, С1оз1его-, Ро1уутс1ае) в сельскохозяйственных растениях, сорняках, дикора£тущих растениях и грунте различных экологических регионах Украины.

Экспериментально обосновано и предложено методику оценки распространения вирусов растений на основе комплексной диагностики растений-предикторов.

Результаты роботы позволяют рассмотреть и сформулировать закономерности влияния загрязнения окружающей среды полютантами (такими как тяжелые металлы) на фитовирусы: опосредованное влияние на грунт и растения изменяет среду и для развития вирусов, что может приводить к изменению инфекционности уже известных патогенов и, возможно, возникновению новых, более вредоносных штаммов вирусов.

Описано новый РНК-содержащий бациловидный вирус, который поражает сахарную свеклу, относится к семейству ИИаЫоушс1ае размером 38x300 нм.

В условиях закрытого грунта показано значительную распространенность ВМЦ и ВКПО. Проведена их идентификация с помощью полученных моноклональных антител.

Созданная компьютерная база данных распространения фитовирусов на территории Украины и система управления базами данных является необходимым условием для фитосанитарной оценки агроценозов и разработки стратегии прогнозирования развития эпидемий (эпифитотий) вирусов растений.

Исследована возможность бездеградационной экспресс-диагностики вирусных заболеваний растений, которая может быть основой для создания нового поколения методов диагностики фитовирусных инфекций на больших площадях. Предложенный метод атомно-силовой микроскопии позволяет ответить на вопрос о тонкой поверхностной структуре вириона и полнее понять связь между физико-химическими и биологическими свойствами вирусов.

Ключевые слова: фитовирус, распространение, циркуляция, частота встречаемости, база данных, прогнозирование, бездеградационная экспресс-диагностика, техногенная нагрузка, предикторы, атомно-силовая микроскопия.

Polischuk Y.P. Forecasting and spreading features of plant viruses in bio-cenoses of Ukraine. - Manuscript.

Thesis for Dr. Sci (Biol) by speciality 03.00.06 - Virology. Kyiv National University by Taras Shevchenko, Kyiv, 2000.

Thus, for the first time both plants and soils are investigated not only as eservoirs of virus infections but also as reservoirs of their traces - antigens.

Viruses that are transferred by soil and maintain there infectious traits (Furoviridae, Nepoviridae, Tobamoviridae, Cucumoviridae etc) have been intensively studied only recently, whilst epidemiology of viruses that are transferred by vectors are well established in the last decades (130).

As it was mentioned in literature, the classical approach to investigation of soil viruses is based predominantly on their biological characteristics; for other viruses, with no proven record of transfer by soil (and maintenance of their infection traits) this approach is not normally used. The proposed work demonstrates a possibility of using the information on presence of viral antigens in soil (even if these viruses are not transferred by soil) for general evaluation of phy to-sanitary conditions, which can help to predict development of viral diseases and prevent possible losses.

This is the first study to localise phyto-virus antigens in the agricultural plants, weeds, wild plants and soils from different ecological regions of Ukraine and to show that virus concentrations depends upon soil characteristics of agro-and biocenosis (mechanical structure, physical and chemical parameters), antropogenic pressure and general phyto-sanitary state of cenosis. Levels of the virus antigens are found to be variable in different regions which proves their uneven distribution on the territory of Ukraine and necessity for targeted action to prevent crop losses in the particular cenosis.

Level of fluctuation for the phytoviral antigen concentrations in the different seasons depends upon plant species that are cultivated and should be taken into account both in the planning of crop rotations and in the prediction of disease spreading. Continuos investigation of circulation of phytoviruses in agrocenoses will permit (after considering weather data, biology of crops and agents) precise prediction of spreading of the disease with an aim to reduce crop yield losses. Computer data base are extremely important for such predictions and should be introduced for evaluation of phyto-sanitary status of agrocenosis (with further expanding to include other pests and disease agents such as insects, nematodes, bacteria, fungi etc).

On the basis of data from this research it is possible to conclude that presence of plant viruses in different ecological conditions of Ukraine does not depend upon antropogenic pressure (specifically upon concentration of heavy metals). Both in ecologically safe Volinskij region (Sadskij National park) and in region with increased antropogenic pressure (Charkiv region, Zmievskaya

power station) viruses’ spectra are not different, but their emergence frequencies and antigen concentrations are much higher in agrocenosis with heavy antropogenic pressure.

Such trend can be seen not only on crops (this may be explained by using of not-resistant crop varieties), but, what is much more important, in biocenoses-plots with no human interference. In these “wild” cenoses virus antigens have been detected in low levels and regularity which has not change year by year. It is possible that such constancy of the virus presence in natural cenoses may be an indirect proof of the virus role in maintenance of system stability and elimination of “foreign to such system” species.

From the results of this work it is possible to establish regular effects of environmental contamination (such as by heavy metals) on phytoviruses: - contamination of soil and plants results in the modified conditions for virus development, that may lead to changes in virulence of known pathogens and creation of new more aggressive forms of viruses. The differences in the (quantity and quality) composition of phytoviruses at the contaminated areas of Chernobyl power station may be explained both by the reduction of immune reactions of plants that are growing under radioactive pollution and by the higher virulence of viruses.

Potential for non-destructive remote express diagnostic of viruses shown in this research may be a step towards the establishment of a new generation methods for phytoviruses diagnostic at the large territories. Also method of “atom-power” microscopy may help to answer the question about detail surface structure of viroids and help to understand a link between physical, chemical and biological properties of viruses.

Because the antropogenic pressure to environment tend to grove (not to decline) in future and new crops (including genetically modified) will enter agrocenoses, a problem of ecological balance in them will become more important in future as well as more acute become an issue of prevalence and harmfulness of phytoviruses.

Key words: phytovirus, spreading, circulation, detection frequency, database, prognozing, degradationless express-diagnostics, technogenic pressure, predictors, atomic force microscopy.

Информация о работе

Полищук, Валерий Петрович
доктора биологических наук
Киев, 2000
ВАК 03.00.06

Автореферат

Похожие работы