Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Прижилковая мозаика и бороздчатость древесины винограда (этиология, диагностика, меры борьбы)

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Прижилковая мозаика и бороздчатость древесины винограда (этиология, диагностика, меры борьбы)"

РГБ ОД

П м?.ч '.ГОЯ

ЛЕШ НА ТА ОРЛЕНА ДРУЖБИ НАРОДІВ АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ■

ОРДЕНА ТРУДОВОГО ЧЕРЮНОГО ПРАПОРА ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГИ ТА ВІРУСОЛОГІЇ і м. Д. К ЗАБОЛОТНОГО

На правах рукопису МУЛОКИНА Н,на Анатоліївна

ПРИЖИЛКОВА ЮЗА 1 КА ТА БОРОЗННСТ ЇСТЬ ДЕРЕВИНИ ВИНОГРАДУ ( ЕТІОЛОГІЯ, ДІАГНОСТИКА, ШОДИ БОРОТЬБИ

< 03.00.06 - вірусологія )

Автореферат

лпсертаїь: на здобуття бч-;ііого ступеня кандидата ъіодогі чних наук

Кіііе • К’ЯЗ

Роботу виконано в Центрі клоновоі та фітосанітарної селекції Інституту винбградарства та виноробства їм. а Є. Таїрова, м. Одеса '

Наукові керівники: доктор біологічних наук

о

професор А. Д. БОБИР

доктор біологічних наук Б.Н Ы1ЛКУС •Офіційні опоненти: доктор біол каук.

професор М. І. МЕЦЩКУЛ кандидат Сіол. наук, зав. лаб. в і русолог.1 і _ . П. €. БОНДАРЕНКО •

Провідна організація: Інститут клітинної біологи та генної інженери і м. Київ ) ’

Захист відбудеться "(В' ^^1983 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої ради Д.016.06.01 по присудженню ечєного ступеня доктора біологічних наук при Інституті мікробіологи та вірусологи їм. Д. К. За^шотіюго АН УКРАЇНИ ( 252143, Киів-143, вул. акад. Д. К. Заболотного,

154 ). .

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту мікробіологи та вірусологи їм. Д. К. Заболотного Агі УКРАЇНИ .

Автореферат розісланий ■* 0-і‘2^%ЛсЛ^ ^93 р_

Вчений- секі^етар спеціалізованої ради кандидат ó.ojl наук

Е. 0. Коваленко

Актуальність тени. Вірусні хвороби винограду завдяки хронічному характеру завдають виноградарству постійних економічних збитків, що полягають у зниженні валового збору врожаю на 10 - 20 X, зниженні виходу саджанців на 6 - 10 X,

скороченні тривалості життя насаджень до 10 - і.? років, погіршанні якості винограду. '

В Україні виявлено 16 вірусній вахворювань винограду, серед- них 6 е найбільш шкідливими, До останніх належать бороз-нисігість деревини і пршшікова мозаїка винограду, поширені на промкслових насадженнях Закарпатської, Кримської, одеської. Миколаївської та Херсонської областей. Гфижилкова мозаїка і борозниотість деревини належать до вірусоподібних захворювань, дані про їх збудників обмежені. Збудники цих-хвороб не вид і ля сться' з листя винограду та не переносяться на трав’ янисті тест - рослини, тому серологічна діагнос;и^а їх неможлива. Прижилкова мозаїка та Сорозкистість деревини винограду -діагностуються щепленням ка сорти - індикатори, що.займає від

1 до 3 років. . ' .

Месов? виробництво садивного матеріалу, вільного від вірусних захворювань, вимагав використання швидких та вірогідних методів ідентифікації. За останніми даними, діагностику вірус-■ них захворювань рослин молі і а здійснювати на основі виділення та ідентйфікаціГ'дсГНК або з використанням метолу Чот - гібридизації, пр дозволяють проводити аналіз протягом кількох днів. . У відноікнні, до прижижовб! мозаїки та борозиистості де ренти такі дослід;«-?ніш не проводились.

■ М- та і а-гдаш доо.лідч'?ння, Мета роботи полягала у вив-

- 2 - ' чанні придаїкової мозаїки та борозниетості деревини ь>>; . ;иду та вдоскокаленні методів їх діагностики. Під час виксі .-р.я ро боти були вирішені такі видачі:

- дослідити ступінь поширення лримілкової мозаїки ті. _юроз-.нисїооті деревини винограду у південних областях Украііьі;

- з’яг -вати природу вбудника прилилкової мозаїки винограду та

шкідливість ьахворюїання; г ■

- виділити та охаратеризувати двосшральну РНК з тканин винограду, ураженого прі.жилковою мозаїкою та йорозниегютю Дс-р--вини;

- розробити метод діагностики прилилкової мозаїки та борошнистості деревини винограду, побудований на дот - гібридизації нуклеїнових кислот, який дозволив би здійснити аналіз рослим ва короткий строк;

''методом термотерапії, хіміотерапії та шляхом бракування уралених рослин отримати садивний матеріал винограду, вільний від вбудників прижилкової мозаїки та борозниетості деревини винограду.

Наукова новизна. Отримано нові дані про розповсюджуння

приміякової мо&ат' і борошнистості деревини ринограду, ьсга -

я

новлено ЇХ ШКІДЛИВІСТЬ та отупінь БбИТКІВ. ЯКІ СПРИЧИНЮЮТЬ Ці захворювання виноградарству України.

Підібрано та модифіковано метод, ир дозволяє одержувати достатню кількість двоспі¡.альної РНК, асоційованої з еоконепере-носними вірусними захворюваннями винограду. Вперше одержано та охарактеризовано очищену дсРНК, асоційовану г причілковою мозаїкою і борознисгкг’ю дереЕини.

- з -

Вперше одерлаис ЗОНДИ, Шр являють СОбСО pUUOdKlrtSHO мічену дож: и(іудкйків лоикилгаової мозаїки va оо^оінпстості дерешіш ГІШОГрї.ДУ.

Проведений гіСридизаційнчй аналіг дсзьог.яе грсСитн ви-скобки що.де шлливосгї ваетосувашя їх у практі.'Ц: виробництва садивного матеріалу чинограду, вільного від вірусоподіОсих 'захворювань.

Практична цінність, Отримані зенди використовують-? дл.і тестування кушіг. винограду на наявність в'русоподіСних во.во-рюв;ль. Аналіз викону-льси швидко та дай вірогідні регультаги.

' Методом термотерапії одержано сад.івний матеріал вико- .

граду, вільний від прклилкової мозаїки. Utatfon бракувакня хворих рослин отримано здоровий вихідний матеріал трьох сортів винограду.

Апробація роботи. Матеріал« дисертації викладені в доповідях на конференції молодих вчених і фахівціь в.шсградо-віінороб-ноі галузі f Ялта, іЛіО р. і, конференції молодих ьчєііих і Фахівців "Розроблення та вдосконалення технолог ій ьі;ри„..ицтьа, аОеріганнл та переселення винограду** ' Одеса, 1ДО1 р. ), конференції молодик вчених і фахівців іноземнимі мовами "Hay ково - ‘праіггичні доечтени* у галузі виноградарства та аиііп-роСотва" ( Ялт^, 1992 р. ), Міжнародному сімлозі/мі "Керування генетичною мінливістю сільськогосподарських- рослин" і Ялта,

1992 р, ), 101 h Meeting of the Int.. Council for the study of Viruses and Virus diseases of grapevine, ІУ90, Volos, Greece.

Публікація результаті з дослідл^нь. Головні положення дисертації подані в ю друкованих робот-іх. ■

5 •

' ■ і

Í

Структура ча обсяг роОоти. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури ( 1 розділ >, експериментальної частини (Z роздиш ). обговорення результатів,

. ' >

висновків та списку літератури ( 15,? джерела, у тому числі -127 іноземних ). Роботу викладено на 155 сторінках машинопису, ілюстровано З? рисунками ’^а 11 таблицями.

\ » ' ' і .

КОРОТКИЙ ■ ЗМІСТ РОБОТИ . •

Об'еігги досліджень Дослідженая .проведено иа сортах винограду Мускат жемчукний, ураженому пригаїлковою мозаїкою винограду, Липовина та Ранній Мя^арача, урш.них борозкистіст» деревини винограду., ■

Основні методи. Фігосанітарну селекцію проводили двічі на рік. У траыи - червні на маточниках прищепних та підивпних доз відмічали-кущі а сиштомами приглжоьої мо-зіки. У той же час, а також у серпні - вересні на маточниках пр^шепких лов відмічали кущі в симптомами борознистості деревини.

Шкідливість захворювань оцінювали, досліджуючи їх вплив на агробіолог!чні показники, приживання щея.та зелени/ чубуків. Статистичну обробку результатів проводили на комп'ютері IBM - PC ва допомогою програми багаюмі рного статистичного аналізу "Варпет*'. .

Зразки для елекгроної мікроскопії одержували, використовуючи модифіковану методику Лафта ( Luft, 1963 ). .

Повітряну термотерапію проводили по загальноприйнятій ме-'" тодиці ( Цуркан, 1073 ) протягом шести мієяціь при температурі

38 t і00 та ьоісгоспч 60 - 70 У.. 7.іміотераіи» рочлин ьд.Псию-вали за допої,'оґою препаратів, нким притаманна проїкііруепа активність. Тор.могералікі та хімютерп;о поєднували в культурою верхівок пагонів in vitro.

Двос тральну РКК виді лялі; за C:dJs et al. ( 1У64 ). Mossop et al. ( 1935 I, fezatan, Krakt ( ІУ97 ), Tpawa, Мзйор ( lyO? '. Очідені препарати доРНК, асошйозаі.ит з грмилкоиою мозаїкоп винограду, одержували на колонці з целюлозою CF - 1і ( Dodds et. al., Iі; 84 У, Фрзкціонугаиням на гідрокииапати?, за KahtBkoff, Payne ( 1973 ) або препаративним електрофорезом

і Маніатіс та ін. , 1984 J.

Радіоактивне мічення дсГТіК провадили методом хімічної модифікації з використанням лужного розчину і25ї у середовищі, щз містило хлорид талію, як м'який окислювач ( Ccrtinvirford, 1971; Altenbure et al. , 1970 ;.

Гібридизацію і мобілізованих на нейлоновому фільтрі екстрактів проводили за методикою John et зі. С 1986 , и tosutv-тіс та ін. (' 1984 ). Післл закінченая строку інкубації рану відмивали від матеріалі, цр не ¿в'язався, та результати гібридизації вия ляли авторащографічно у касетах з підсилаючим екраном.

' . РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

1. Поширення призяїлкової МОВІ;., кн та борознистості деревини инограду

. Виявлення прижи.лкоьої мозаїки та борознистості дгре?ині!

- б -

винограду /¡ос лі давали протягом трьох років на кєсадженнях виноградарських господарств півдня України. Отримані результати СЕідчать про широке розповсюдження захворювань в Одеській, Миколаївській та Херсонській областях і, таОл. 1 1.

&

\ , Таблиця і

ПОШИРЕННЯ ПРИЮШЮБОЇ МОЗАЇКИ ТА Б0Р03НКСТ0СТІ ДШТОШИ ВИНОГРАДУ НА ПІВДНІ УКРАЇНИ ,

( ІБіВ їм. а а Таірова, 1989 - 1991 ) ■

Хворих Площа Рік . Область Сорт рослин, насаджень, посадки

__________________________________________7._______ч’а_____________

ШИШКОВА МОЗАЇКА

Одеська Мускат яемчуяний 10,0 2,6 1984

Ріпар і а Глуар зе.с °-,0 19Й1

Миколаївська Аліготе 1.0 ’ 12,97^ 34,0 1031

Херсонська Сухоліманський Сідай Ріпаріа х Рупестріс 20,0 1981

3309 6,0 0.5 1984

їемчуг Саба . 4,0 1.Г 1984

БОРОЗШОТ1СТ Ь ЛЕРШ1Ш1

Одеська , Ранній Магарача Г.О 1,0 .1981

Миколаївська Ранн і й Мігарач'і 0,6 С.,46 1И

Херсонська Сурученськия білий 10.0 8,0 1031

Ранній Магарача ІІ'.О 10,0 1981

Ка^рче ОогііяіРон іг.о 5.0 ) 981

ПрС'В?ЦЄН. ДОСЛІДНИЦЯ свідчать njw ипїроїо? POJ41Ь('ЮЧ»?І*НЯ припадкової мозаїки на яасадлминях України, як стародавніх, таї? \ ноьих сортів. Шауально кількість хворих рослчч jroc*rae А - 36 %, при £:iK' pt!e'tat!Hі провокаційного 'Мічийого тесту цей ПОКіїОНИК ЗіЗіЛЬЦуі-'ТЬСЯ ДО 60 KlJ!i.«iCîb ГОСЛІш з \ СИМПТОШМИ бОрОЗЬИСЇОСТі деревин» ЕИКОГраДУ ДОСЯГЬО ІИД 2 до 17 X, в sanejjiooTi від ступеня зарааеьості вихідного оа дивного матеріалу v прищепи та mднини ), сорту та віку ин~ \д-же«ь. Прояв сиіштомів пов'язаним з изтеородогічімми уковами регіону.

2. Шкідливість пдошштавої козалкн та борспмстоет і деревини рчнотраду

ЙЇІДЛі’ЗІСТЬ прикилкової мозаїки радіше нз бую вивчено. Нами показано, що пріїлилкова мозаїка істотно впливше hj вихід щеплених садканців а ші лкк, вни«у»чи його на 18 t. ¿а -:'вор»ьання слабо впливає на агробіологічні г,ока-н.іки-( кількість плодоносних пагонів, середня кількість і рої-; на кук, врожай ‘га ін. ).

Облік кількості хворих та загиблих від борознистооті деревини куяїв. № проводився протягом 1889 - 1931 років, наочно показує збитки, спричинені цим захворюванням, причому зі збільшенням віку насаджень розмір збитків збільшується ( табл.

2

Слабкий тип борозниетості деревини винограду вііклика*? нп . -*>

итрмЗі полгу иез.чзчу--': яичагості і не педе до заги'олі

КУЦІ Б. Проте ВІН Ві4Є!!іІіуЄ КІЛЬКІСТЬ клодоиосних пагоні? у хворих кущів на 25 7. порівняно із вдоровмми рослинами. Виявлення сильного і слабкого типу борозниотості деревини винограду пов’язано з ‘використанням рівних підщеп.

\ Таблиця 2

ДИНАМІКА ПОШИРЕННЯ ЕОР^ВНЙСТОСТІ ДЕРЕВИНИ ВИЬОГРАДУ В ХЕРСОІЙЬКІЙ ОБЛАСТІ

( ІВіВ їм. а є. Таїрова, 1989 ' 1 - 1991 )

Сорт Хворі кущі X Загиблі кузді X

1989 1990 1991 198& 1990 1991

Ранній Шгарача 2 5 :г не В1ДМ 1 3 - ; Ч

Сурученський білий 1 4 10 ' не _ВІ дм .. о,ь 1,5

Каберне Совіньйон ' - 12 17 1 4 2,7

сорт Каберне Совіньйсн у 1989 році не досліджувався

3. Дослідження збудника крижилкової мозаїки винограду

Відомості про збудника, . що викликає лри.чшкоЕу мозаїку, дуже невеликі. Наш спроби перенести його на спектр рослин -індикаторів, у тому числі СЬепоросИит атагапИсоІог, СЬ. яіпоа,

- й -

СЬ. аІЬ- .і, КюоЬізга ^^аЬасиш, з Шїорлотаїшям пр" -иок./ллиії рігних бу4>?ріь та дсбоїюк < фос^тний 5у?ер бід 0,01 до 0,1 н, рН від 7,5 до 0,0 а дотиками 0.1 X Ки304 та РУР (. 2 ’>, тріс-

НСЬ Суфер, 0,1 М, рН 7,5 - 8,0 ), а такод зміна умоз рирощу-вання ( підсушування лисгя до інокуляції, затіл-тнчя роилин на дві доби після інокуляції та ін.) були невдалими.

Невдалими були й спроби виділити вірус, ю википає при-жилкову мосаїку, з лястя винограду у використанням різких мі-тодів, зокрема оа Гугерлі { Сі^вгіі, 1934 ), р екстракт Яіпгм

буфером, ПР МІОТИВ РЧР, бентоніт, тритон - * - 100 та 2- - меркаптоетанол.

Проте на ультратснких зр‘ ^ах клітин :иеза}ілу листя сорту Мускат иемчужний, ураженого прижилковою мозаїкою, ми із:иьили нитковидні вірусопо.чібк; частки близько 500 км завдовжіаі. Присутність цих часток у тканинах хворих рослин та відсутність у здороьих ткгліинах шлю свідчити про їх зв’язок із захворюванням. Виділення з тлу. ке- зразків високсмолекулярлої дво-сш рольної РНК підтвердне вірусну природу прижилкосої мозаі -ки винограду.

4. ‘Діагностика прилшкокої мозаїки та борошнистості деревки винограду

4.1. Виділення та ідентифікація дсРШ

Екстракція нуклеіногих кислот з тканин виноград/ пов’лза-На 5 рядом труднощів, зокрема.з низьким рй клітинного соку,

- 10 - -високою концентрате» ленольних епоху к та високою активністю полі <2«нс доко вдази. . '

Наші показ єно. ер дсШІ випіляетьса головним чином двома екстракціями інтзрфети; супернатант після переоі екстракції

«аЯжг не ШстЬть деРЛК. Характер ьидиення дсРНК,асоційованої

\

з прижцлково» мозаїко» та гі^роашісгістю деревини винограду, демонструє И щідаккО зв'явок'.'а кя і ходиш» компонентам.

ВаЙйіЛЬВу кількість дсїЖ було ВВДЦНЙО е тих тканин.

де інтенсивно здійснюється процес реплікації вірусної РКК

, : 1 ( шїод^ розвинене дйс'тя з сиштмаш та за кілька днів до виявлення симптоміь ). Встановлено, ер оітаальиии для виділення дсРНК, асоційованої з пргшиковою мозаїко« пшограду, е період вкяакниа сшстгомів вахворшаниа та невелики», промівж часу перся ніш. Цей період відповідає цвітінню винограду. Шждиво, ЗР виділенню дсРНК у дай час сприяв і.изька активність поліфе-нолоксидзаи * иаймгкеа еа сегетаційшій пері о" аа даними Аріс-товоі ( 1990 >. Млша припустити, ко реплікація ^ірусної РНК ¡.•акож. пов'яаана а щш періодоц. - .

Для видічевня дсРНК, асоційованої а борозпистістй деревини винограду, оптимальним е період цвітіши винограду. Проте для цього зазгворюеашя, скетш якого є «являються на штамбі постійно, наш показана мохешеть одержання дсРНК і в інші періоди ( вересень >„ при ШЬОИУ КІЛЬКІСТЬ дсРНК буває меншоо, ніж у Іазі цвітіння. Шлком імовірно, ио незначна кількість дсРНК, аку неможливо вгашш’ електрофоретично, міститься- у тканинах винограду протягом усього ЕегетаціЯкого періоду.

- 11 -

гір'1 порівнянні КІЛЬКОСТІ дсРШ ШВ, одержаної З ЛИСТЯ різній ярусів ( нижній ярус - зріле листя, середній ярус - молоде розвинене листя, верхній ярус - молоде иерозвинене листя) виявилося, що перевагу слід віддавати листю середнього та нижнього ярусів. Більшу кількість дсРНК також ' девало листя, відібране на пасинках.

Нами показано, пд дсРНК, асоційована з прішіжовою мозаїкою, не е гомогенною, а представлена щонайменше трь. ма смугами різної молекулярної маси. Лінія з найбільш високою молекулярною масою ( 7 - 7,5 х 10® Д ) стійка до впливу РШіаси А у

2 ¿55С буфері та зникає під час обробки РНКззою у 0,1 х Ь'СО,

да свідчить про її дзоспіральну природу. ' Дві лінії з більз ■ - . 1 * низькою молекулярною масою зникають під Ііас обробки РНКазоп А

у2 і ооС. >.Ьт припускаємо, що вони в проміжною формою лід

час синтезу вірусної дсИК, яка містить у своєму складі • ' двбспірагіні ділянки. Ці двоспіральні' с-пуетури е причиною елкюаання названих компонент і в з СГ • 11 разом із дво-

спірашюю РНК

Нааі дослідження показали, шр дсРНК збудника Оорозіше- . тості деревини винограду представлена однією лінією бйсОкоі иопекулярної маси, ио перевищу« молекулярну масу дсРНН ПНР. Це було встановлено в результаті дослідження рухомості в одних і тпх ге умовах та порівняння з «эркерами відомої молекулярної

каси ( ДНК - рестрікти ЕсоЯІ і ЕсоЯУ ). Молекулярна юса дсРНК, асоційованої з Сорозкистістю деревини винограду, етаног.Етть г(рк-

О-Пізно 8 - 8,Б х 10 6 Л. •

Нгзважавди на відмінності міх молекулярною месою дсРНК,

• - 12 - • ' ассоційоьаної з рівними вірусогодібними захворюванням: винограду, при масовому аналізі та електрофореаі багатьох гразків

вірогідно ідентифікувати захворювання дуже складно. Крім цьогс,

і

часто візуально здорова рослина виявляв при доолідж>‘н:;і одну чи декілька ліній дсРНК, причому наявність такої дсРЬК може свідшп . не тільки про латентну вірусну інфекцію, ілз й про присутність грибних патоген і в,' еокрема, иілдью ( Аггаш ©с аі.. 1990 ). Тому присутність дсРНК у рослинних тканинах може бути лише методой попередньої оці ні си наявності чи відсутності Еірусної інфекції. ■

. ■ і , '

4.2. Дог - гібридигадія в мічено» дсРНК, & зційованою з

прижилковою мозаїкою винограду .

* Нетод виділення дсРНК неможливо застосувати для аналізу великої кількості ерааків, толг/ ми перейшли до створення зонду на осцрві дсРНК ІШй Виділену та очищену дсРНК радіоактивно . мітили 1251. Одержаний препарат застосовували як зонд. ; . Нами Суло відпрацьовано умови гібридизації ( час проведення та темпч ратура ). .

Фенольні екстракти отримували в листя винограду, ураженого різниш вірусоподЮниш захворшаннняш та листя здорових кущів ( негативний контроль ). Негативним контролем були тестовані рослини чи піддані термотерапії протягом шести місяців.

Позитивну відповідь у дот-г:Юридизації дали усі зразки, інфіковані ІШВ; негативну - рослини після термотер-лп чи негативно тестовані на ПЫВ провокаційним тепличним тестом.

- 13 - •

Залишається нерозв’язаною проблема специфічності гібридизаційних вондіа, отриманих на основі дсРШ. Геноми аїрусів винограду недоеліддеіи, дані перехресної гібридизації отриманих зондів в РІК рівних вірусів винограду відсутні.

ДсРНК збудника прижнлкової мозаїки представляє весь його гепом, тому можна було припустити, ир такий зонд не буде зиео-коспецифічяим Дійсно, більи - іюнш ечльну ВІДПОВІДЬ Суло одержано також під час застосування зразків, інфікові.шх ко-ротковузлям, звиванням листя, иармуровісг» та борознистістю деревини винограду.

І _ Проте зонд не гібридизувався в екстрактом з листя рослин, уралюних X - вірусом картоплі. , . '

На основі проведеного тестування кулів підпвп вже 1 зараз можна виявити біля 10 7. зразків, які дають сильний гібриди -

заційнкй сигнал. Приблизно 20 7. зразків дає сигнал слабішої ,,ч

• . .

тенсивності. " ■ •

4.3. Дот - гібридизація 8 мічено» дсРНК, асоційованою з Сорознистістю деревини виноград/. .

’ Другий отриманий нами зонде міченою іг5ї дсРНК, асоційованою з борознистістю деревини винограду.

. Перехресна гібридизація ететрактів 'листя хворих та здорових рослій з міченою дсРНК збудника борознистості деревини Еинограду показала, да отриманий зонд, подібно до дсПШ ПМВ, не гібридизується з екстрактами листя здорових рослин

і дає позитивний сигнал при використанні екстрактів з листя

- - 14 - '

винограду, ураженого ЕДВ та ШЕ. З екстрактами з лис йинэ-граду, ураженого короткосувлям та вливанням листя, зо.:г. такол лае позитивну реакцію, ио свідчить про енашіу подібність uи ДСРНК ПЫВ та ВДЕ і

. Ускладнює картину гібридизаційних взаємовідносин між дсРШ збудників віруеоподібиих захворювань можливість .вмішаної інфекції. У ряді зразків з симптомами звивання листя та СорознистОсті деревини винограду зустрічаються два різних клостероьіруси та потівірус винограду у різних комбінаціях.

Проте проведені дослідяенкя свідчать, по прояв Гібридизаційного сигналу не пов’язаний з ДНК РНК винограду. Про це свідчить відсутність гібридизації із зразками чистої ДНК винограду та наявність негативних контро дів ( сорти винограду, що були піддані термотерапії, довгочасному пасаяуваншо іa vitro або ті, шо пройшли тестування^. •

Гібридизація не залежить від уражання різними грибними патогенами, які також молуть містити дсРНК. Одержано негативний резул гат при гібридизації зондів з екстрактами чистих культур Eutipa, Phomopsis, Speropsis, Botrys. Екстракти s листя винограду, ураженого оїдіумом та мівдью, дали слабкий сигнал, що свідчить про необхідність відбирати листя для аналізу до розвитку грибної інфекції 8 метою виключити можливу неспецифічну реакцій.

На підставі проведених досліджень ми робимо в^новок про високу чутливість т" простоту методу. Метод можна використо-

вугаїл у тому випадку, коли при індексації потрібно одержати відповідь лише про наявність чи відсутність вірусоподібної інфекції у тканинах винограду. Зонди використовуються у Центрі ляонової та <$ітосанітарної селекції чля масового тестування суперелітного матеріалу. •

5. Одержання оздоровленого садивного матеріалу За допомогою методу термотерапії протягом шести .іісяців та наступної культури верхівок пагонів в умовах in vitro ми одержали садивний матеріал сорту Мускат «емчужнии, вільний вij вірусних захворювань. Термотерапія вегетуючих саджанців дала можливість вробити висновок про те, що збудник прижилко-вої мозаїки винограду вилучається s рослин шестимісячною термотерапією. Зменшити тривалість термотерапії шляхом використання поэднання і 1 з попередньою обробкою антивірусними препаратам не вдалось. ' • ■

Шестимісячна термотерапія виявилася недостатньою для вилучення з тканин винограду збудника борогнистост1 деревини.

Хіміотерапія антивіруеними препаратами у поєднанні є мембраноактивними макроциклічними сполуками не привела до одержання оздоровленого садивного матеріалу, npove позитивно впливала на погазники приживлюваності'та приріст пагонів мікро-клонів та чубуків винограду. ’

' . ВИСНОВКИ

1'. Примлкова моза'іка та борезнистіеть деревини винограду

■ - 16 -

широко розповсюджені на виноградниках півдня України, Ъллйния привижово» мозаїкою досягає 37 - 60 X, кількість р^о,.ин іч симптомами борознистості деревини складає 10 - 17 У.. -

2. Вперше показало, що шкідливість прижилкової tозаіки

проявляється у вшженні до 18 X виходу прищеплених саджыпиь S шкілки. Бороанистіоть деревини веде до поступової 'вгігибєлі

кущів, слабкий тип борознистгіоті погіршує агробіологічні показники рослин. О

3. Отримано садибний матеріал, вільний від вірусо-подібних захворювань. Показано, ш збудник пркдилкової мозаїки вилучається з тканин винограду шестимісячною термотерашею у поєднанні в культурою верхівок пагонів in vitro.

Обробка антивірусними препаратами мікроклонів та чубуків винограду, ураженого прилшковою мозаїкою та бороз-

нистісгю деревини винограду, покращувала агробіологічні показники рослин і пропонується нами для застосування лри вироб-нидаві.садивного матеріалу.

4. Еиявлення у клітинах мезофілу листя винограду з симптомами прижилкової мозаїки нитковидних вірусоподібних часток,

а також в ділення в им же рослин вигокомолекулярної

. ft .

двоспіральноі РНК дозволяв припустити, що захворювання мас вірусну етіологію. .

Є. Вперше виділено дсРНК з екстрактів листя винограду, ураженого прижилковою мозаїкою та борознкстістю деревини. Кількість виділеної дсРНК 8аЛЄЮІТ! від терміну виділення та вихідного матеріалу.

Виявлено, що дсР"К, асоційована з борознистістю деревини

* 17 * .. '• винограду, подана однією лінією з молекулярною масою 8 -8,5 х 106Д. ДсРНК збудника прижилкової мозаїки подана трьома лініями, молекулярна маса найменшої за рухомістю серед ни:; складає 7 - 7,5 .х 106 Д. . ! ■ .

б. Вперше одержано, зонди для виявлення вірусоподібних вахворювань винограду. Зонди являють собою мічену доРНК, асоційовану з лрижилковою мозаїкою та Сорозшістютю деревини винограду, і внаслідок цього маять низьку специфічність. Метод е високочутливим та дозволяє одночасно аналізувати велику кількість вразків. .

і ■

; . Розроблення метод діагностики використовується з метоп.

тестування . . - ' . . .

о

Список робіт, опублікованих за темою дисертації 1. Зе.іьд Б. С. , Картузова В.Н. , Мудокина Е А. , Милкус Б. Н. -Электронно-микроскопическое исследование винограда, пораженного скручиванием листьев и прижилковой мозаикой // Тез. дс;сл. IV Респ. коь41. "Электронная микроскопия и современная технология". - Кишинев, 1990. - с. 21. '

• 2. Мулюкина Е А. - Диагностика прижилковой мозаики винограда. // // Тез. докл. Всесоюзн. научн. -практич. конф. молодых ученых и специалистов. - Ялта, 1990. - с. 89. - 91.

і 3. Фельд Б. С., Мулюкина Н. А. , Милкус Б. Н. - Применение метода выделения двуспиральной PK?. некоторых вирусов виног, ада // Виноградарство и виноделие СССР. - 1990. - 4 (7). - с. 18-20.

4. Мулюкина Н. А. - Прикижовая мозаика винограда на .Украине//

/7 Тез. докл. Всесоюзн. научн. - практич. конф. молодых ученых и специалистов. - Одессь, 1991. - с.30.

5. Мулюкина Н. А. - Прижилкспая мозаика винограда: методы ди-

агностики заболевания и меры борьбы с ним // Тез. доил. Всесо-квн. научн. -^практич. конф. молодых ученых и специалистов . -

Одесса, 199І,/’- с. 41. _

Г '• у р

6. Мулюкила Д1. Д. - Выделение и характеристика дсРНК вирусов

бороздчатости древесины и прижилковой мозаики винограда JJ Доклады конф. молодых ученых и специалистов на иностр. языках. -

- Ялта, 1992. - с. 22 - 23.

7. Ыилкус Б. Н., Каптуэова В. И. , Мулюкина Н. А., Русин А. А. -Выявление вирусов винограда в процессе производства '^ртифици-рованного посадочного материала' // Инфорк листок. - 1992.

8. Петр левич В- П. . Счволап Ю. Ы., Ушкуе Б. Н., Мулякина И. А.,

Русин А. А - Гичвл^и? инрусных забилеваьнй виноград . при по-мощ оинда, содерж&Е&га двуспиральную ПК // Тез. докл. м/н^р. сими. "Управление генетической ирменчивостью о/к гъатений". -

- Ялта. 14U2. - с. fil.

9. KarUizova V. !., Feld В. S. , Muljuktna N. A. , Melnik L. N. ,

Milkus B. N. - investigation of virus disease of pva;'t>vn,d in Ukraine // 10 th Meeting of ICVG. Abstracts of papers. - Volo: , Grcooe, 1J00. - p. CS. .

10. Milkus B. N. , Kar+.usova V. I. , Teld B. S. . Mulluklna H.A. -

-■ Detection of virus of graoevine in llkralna // Piocpedlngrs of the lOtli (feting or' ICVG. - Volos, Greece, 139U p. 390 - 395.