Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Вредоносность латентных вирусов на груше и их диагностика методами ИФА и ПЦР

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Вредоносность латентных вирусов на груше и их диагностика методами ИФА и ПЦР"

На правах рукописи

САУНИНА ИРИНА ИВАНОВНА

ВРЕДОНОСНОСТЬ ЛАТЕНТНЫХ ВИРУСОВ НА ГРУШЕ И ИХ ДИАГНОСТИКА МЕТОДАМИ ИФА И ПЦР

Специальность 06.01.11 - защита растений

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук

Москва-2009

003461807

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства Россельхозакадемии (ГНУ ВСТИСП)

Научный руководитель: кандидат сельскохозяйственных наук,

старший научный сотрудник Упадышев Михаил Тарьевич

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук, профессор

Белошапкина Ольга Олеговна Российский Государственный Аграрный Университет - Московская сельскохозяйственная академия имени К.А. Тимирязева;

кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник Семина Нина Павловна Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт садоводства имени И.В. Мичурина

Ведущая организация: Государственное научное учреждение

Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии РАСХН

Защита диссертации состоится " vj5I "JZUpma- 2009 года в 73~час. на заседании диссертационного совета Д 006.035.01 п/и Государственном научном учреждении Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства Россельхозакадемии по адресу: 115598, Москва, Загорье, ул. Загорьевская, 4, конференц-зал, факс 8 (495) 329 31 66.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного учреждения Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства Россельхозакадемии, с авторефератом - на официальном сайте ГНУ ВСТИСП http://vstisp.org

Автореферат разослан 2009 г.

Отзывы на автореферат в 2-х экземплярах, заверенные и скрепленные гербовой печатью, просим направлять ученому секретарю диссертационного совета.

Учёный секретарь диссертационного совета

доктор сельскохозяйственных наук Л.А. Принёва

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Груша, как и другие плодовые культуры, поражается различными возбудителями вирусных болезней, способными оказывать негативное влияние на продуктивность деревьев. По наблюдениям немецких ученых, у здоровых деревьев груши по сравнению с зараженными комплексом вирусов урожай в среднем был выше в 3,4 раза, а объем кроны — в 2,3 раза (Clever, Stehr, 1996). Маршрутные обследования в условиях Тамбовской области показали, что наибольшее распространение на растениях груши имели вирусы хлоротической пятнистости листьев яблони (ACLSV), бороздчатости древесины яблони (ASGV), ямчатости древесины яблони (ASPV), мозаики яблони (ApMV), а общее заражение насаждений груши латентными вирусами по сортам колебалось от 30 до 90% при преобладании комплексных инфекций (Семина, Цуканова, 1995). Однако в условиях Нечерноземной зоны России вопросы распространенности и вредоносности вирусов на груше изучены недостаточно.

В системе сертификации и оздоровления плодовых культур важное место занимают методы ранней и точной диагностики, к которым относятся иммуно-ферментный анализ (ИФА) и полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Метод ИФА в настоящее время является наиболее доступным и практичным для массовой диагностики. Однако ограничивающим фактором при использовании ИФА служит его недостаточная чувствительность, в связи с чем актуальной проблемой является совершенствование данного метода применительно к биологическим особенностям груши.

Более чувствительным по сравнению с ИФА в настоящее время является метод ПЦР. Однако лимитирующим фактором применения ПЦР является необходимость выделения высококачественных препаратов РНК, свободных от ингибиторов ферментов (A1 Rwahnih et al., 2004; Белошапкина, 2006). Экстракция вирусной РЕПС на груше в силу особенностей её биохимического состава протекает недостаточно эффективно, в связи с чем данный этап ПЦР нуждается в отработке.

В настоящее время для повышения неспецифической устойчивости расте-

ний применяют иммуностимуляторы, что может рассматриваться и как один из путей воздействия на вирусы. Данные по действию препаратов циркон и рибав-экстра на вирусную инфекцию в литературе практически отсутствуют. В связи с этим изучение данных вопросов является актуальным.

Цель исследований - изучить распространенность и вредоносность латентных вирусов на груше и особенности их диагностики с использованием ИФА иПЦР.

Задачи исследований:

1. Изучить распространенность латентных вирусных болезней груши в Московской области;

2. Установить действие вирусов на продуктивность и биохимические показатели растений груши;

3. Усовершенствовать методы диагностики вирусов на растениях груши (ИФА, ПЦР) и дать их экономическую оценку;

4. Установить действие препаратов рибав-экстра и циркон на вирусы, биохимические показатели, продуктивность деревьев груши и оценить эффективность их применения в саду.

Методология настоящих исследований заключается в поиске путей решения проблемы снижения вредоносности латентных вирусов на груше и повышения эффективности и достоверности методов ИФА и ПЦР.

Научная новизна результатов исследований

Впервые разработана методика полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) при тестировании груши на вирусы хлоротической пятнистости листьев яблони, бороздчатости древесины яблони и ямчатости древесины яблони. Установлена необходимость использования на этапе экстракции РНК гидроксипроизводного бензойной кислоты и модифицированного метода сорбции вирусов на препарате силика с целью повышения эффективности выявления вирусной инфекции. На разработанный метод подана заявка на патент № 2008152268 от 30.12.2008 г.

Выявлена локализация вирусов по побегу в зависимости от расположения листьев. Доказано негативное влияние латентных вирусов на продуктивность и биохимические показатели у груши.

Впервые установлено антивирусное действие иммуностимуляторов рибав-зкстра и циркон в отношении латентных вирусов на груше и предложена методика по его оценке. Выявлено положительное действие этих препаратов на продуктивность деревьев груши в саду.

Практическая значимость и реализация результатов исследований

Предложен новый высокоэффективный способ экстракции РНК вирусов из листьев груши для последующей надежной диагностики латентной вирусной инфекции методом полимеразной цепной реакции.

Разработанный способ диагностики вирусов на растениях груши внедрен в условиях лаборатории вирусологии ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии и прошел испытание по выполнению ОТ-ПЦР в фирме «Агродиагностика» с эффектом 25 % по сравнению с известным.

Оптимизирована методика выполнения ИФА, которая используется в лаборатории вирусологии ГНУ ВСТИСП.

Показана эффективность применения препаратов рибав-экстра и циркон в производственных условиях отдела испытания новых технологий ВСТИСП на площади 1 га с рентабельностью 92 %.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Совершенствование методов иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции для тестирования на латентные вирусы груши.

2. Обоснование необходимости проведения закладок насаждений груши свободным от латентных вирусов посадочным материалом.

3. Обоснование целесообразности применения иммуностимуляторов в саду.

Предмет исследований

Предметом исследований является зависимость продуктивности деревьев груши от зараженности латентными вирусами и эффективности диагностики вирусов - от используемого метода (ИФА и ПЦР) и вида тест-образца.

Апробация работы

Основные материалы диссертации доложены на VII молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» в РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (4 апреля 2007 г.) и Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые - садоводству России в XXI веке» (г. Москва, 11-12 октября 2007 г.).

Публикации

Основные результаты исследований по диссертации изложены в 4 научных работах, в том числе 2 - в рецензируемых научных журналах.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах, состоит из введения, 4 глав, выводов, рекомендаций по практическому использованию, списка литературы из 154 источников, в том числе 105 - на иностранных языках; содержит 29 таблиц и 14 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении и обзоре литературы обоснована актуальность работы, сформулированы основные направления исследований, дана общая характеристика работы.

1. Материалы, методика и объекты исследований

Исследования проводили в 2006-2008 гг. на базе лаборатории вирусологии отдела защиты растений от вредителей и болезней, отдела испытания новых технологий (п. Ленинское), лаборатории физиологии и отдела агрохимии ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии.

Объектами исследований служили сорта груши: Велеса, Венера, Кокинская, Лада, Чижовская, Москвичка, Нарядная Ефимова.

Изучали следующие виды вирусов: капилловирус бороздчатости древесины яблони {Apple stem grooving capillovirus — ASGV), фовеавирус ямчатости древесины яблони {Apple stem pittingfoveavirus - ASPV), триховирус хлоротической пятнистости листьев яблони {Apple chlorotic leaf spot trichovirus - ACLSV), иларви-рус мозаики яблони {Apple mosaic ilarvirus - ApMV).

Для выявления вирусной инфекции применяли прямой сэндвич - вариант иммуноферментного анализа (DAS - ELISA) с использованием базовой методики (Clark, Adams, 1977) и в соответствии с «Методическими указаниями по экспресс-диагностике вирусов на ягодных культурах» (2002) и «Диагностикой вирусов семечковых и косточковых культур методами ИФА и ПЦР» (2008). Для анализов использовали диагностические наборы на основе поликлональных антител из НИИ садоводства Молдовы, фирм "Loewe" (Германия) и "Bio-Rad" (США).

Изучение видового состава и распространенности вирусных болезней осуществляли путем маршрутных обследований насаждений 1руши во ВСТИСП (коллекционный сад 1993 года посадки и сад отдела испытания новых технологий в п. Ленинское 1999 года посадки), РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, Главном ботаническом саду РАН имени Н.В. Цицина, ОПК «Непецино» Коломенского района Московской области в соответствии с методическими указаниями «Технологический процесс получения безвирусного посадочного материала плодовых и ягодных культур» (2001). Тестировали от 60 до 360 образцов в учреждении, каждый сорт - по 20-25 образцов; повторность анализа каждого образца - 2-кратная. В качестве образцов для ИФА отбирали цветки, а также листья у основания, в средней и верхушечной частях побега. В опыте по изучению влияния скорости протекания ферментативной реакции на получаемые результаты наряду со стандартным направлением фотометрии осуществляли переворот микроплат на 1800 с регистрацией экстинкции образцов в 4-кратной повторности на автоматическом анализаторе «Униплан».

ПЦР-тесты проводили с праймерами и реакционными смесями, разработанными в ООО "Агродиагностика", с праймерами, синтезированными в компании "СибЭнзим", наборами для ОТ-ПЦР компании "Биоком" и наборами из РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева. Экстракцию вирусной РНК осуществляли с готовыми наборами «Агродиагностика» и методом сорбции на препарате силика (по Menzel et al., 2002; Uyemoto, Al Rwahnih, 2006), модифицированным нами. Использовали праймеры на ACLSV: F5'-CAG АСС СТТ ATT GAA GTC GAA-3

R5'-GGC AAC CCT GGA ACA GA-3'; на ASGV: F5'-CTG CAA GAC CGC GAC CAA GTT T - 3R5-CCC GCT GTT GGA TTT GAT АСА CCT С - 3'; на ASPV: F5'-CTC TTG AAC CAG CTG ATG GC-3', R5'-ATA GCC GCC CCG GTT AGG TT-3'. На этапе экстракции вирусной РНК к лизирующему буферу добавляли по 10-40 мг/образец гидроксипроизводного бензойной кислоты (ГПБК), повторность - 5-кратная. Амплификацию выполняли в программируемом термостате «Тер-цик», электрофорез - в 2%-ном агарозном геле с последующей детекцией результатов с помощью видеосистемы на мониторе компьютера.

Генеративную (число плодов) и вегетативную (число и длина побегов) продуктивность оценивали на зараженных и свободных от латентных вирусов деревьях груши, повторность -10 деревьев.

Для биохимических исследований пробы листьев отбирали в мае, июле и августе с зараженных комплексом латентных вирусов и здоровых деревьев груши. Суммарный хлорофилл в образцах листьев определяли фотометрически по методике Гетри (1949), активность растворимой формы пероксидазы - по модифицированной методике Гуськова (1988). Повторность - 3-кратная.

Антивирусные свойства препаратов рибав-экстра и циркон изучали путем обработки побегов, срезанных с зараженных вирусами и здоровых деревьев груши, в растворах иммуностимуляторов с концентрациями 0,01 мл/л, ОД мл/л, 1мл/л в течение 72 часов и последующим тестированием листьев у основания побега методом ИФА. Повторность в опыте - 5- кратная.

Изучение действия иммуностимуляторов на продуктивность деревьев проводили в условиях промышленных насаждений груши (посадки 1999 г.) отдела испытаний новых технологий ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии. Закладку опыта и учеты осуществляли в соответствии с «Программой и методикой по сортои-зучению плодовых, ягодных и орехоплодных культур» (1999 г.). Сорта груши Лада, Велеса, Кокинская, Чижовская обрабатывали в фазу бутонизации водными растворами препаратов рибав-экстра и циркон в концентрациях: 0,01; 0,1 и 1 мл/л

в 5-кратной повторности. Количество плодов учитывали на 5 деревьях каждого варианта.

Статистическую обработку опытных данных осуществляли методами дисперсионного и корреляционного анализов по Доспехову (1985).

Расчёт экономической эффективности выполняли в соответствии с «Методическими рекомендациями по определению экономической эффективности научных достижений в садоводстве» (2005).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Распространенность вирусов на груше

В 2006-2008 годах осуществлен серомониторинг насаждений груши на наличие вирусов в Главном Ботаническом саду имени Н.В. Цицина, ОПК «Непеци-но» Коломенского района Московской области, РГАУ - МСХА имени К.А.Тимирязева, коллекционных насаждениях (п. Загорье) и промышленных насаждениях отдела испытания новых технологий (п. Ленинское) ГНУ ВСГИСП..

Во всех обследованных насаждениях груши был выявлен комплекс вирусов, но частота встречаемости вирусов существенно различалась. Наиболее часто (около 35 %) в насаждениях регистрировался ACLSV (таблица 1). Таблица 1 - Зараженность вирусами (%) в обследованных насаждениях Москов-

ской области (2006 -2008 гг.)

Название хозяйства Число тест-образцов Вирус

ACLSV ASGV ApMV ASPV

ОПК «Непецино» 60 17,0 20,0 0,0 10,0

ГБС имени Н.В.Цицина 120 60,0 60,0 27,0 7,0

ВСТИСП (Ленинское отделение) 360 25,0 16,2 46,3 16,0

ВСТИСП (коллекционные насаждения 1993 г) 360 52,0 24,0 45,0 70,0

РГАУ МСХА имени К.А.Тимирязева 120 18,3 1,7 0,0 5,0

X 1020 34,5 24,4 23,7 21,6

В равной степени была выявлена зараженность вирусами АрМУ, АЗвУ и

АвРУ (по 22-24 % зараженных тест- образцов).

9

Анализ зараженности по сортам груши в среднем за 3 года показал, что сорта Лада, Чижовская и Кокинская сильнее всего поражались вирусом АрМУ - в среднем 32 % (таблица 2).

Таблица 2 - Зараженность (%) различных сортов груши вирусами в ГНУ ВСТИСП, отделение Ленинское (в среднем за 2007-2008 гг.)_

Сорт Вирус

АСЬБУ АБвУ АрМУ А8РУ

Лада 1,0 24,3 31,1 37,1

Чижовская 13,7 20,9 38,3 34,3

Кокинская 18,1 27,7 25,7 5,5

X 10,9 24,3 31,7 25,6

Наименее распространенным оказался вирус АСЬБУ - 11 %. Вирус АБРУ реже всего регистрировался на сорте Кокинская, тогда как сорта Лада и Чижовская были заражены им примерно в равной степени (37 и 34 % соответственно). 2.2. Совершенствование методов диагностики 2.2.1. Совершенствование метода ИФА С целью совершенствования диагностики вирусов методом ИФА изучена локализация вирусов в разных органах и частях груши.

При выявлении вируса АрМУ на всех тестируемых образцах груши использование листьев в качестве образцов для ИФА оказалось предпочтительней, чем цветков, поскольку в цветках данный вирус диагностировать не удалось (таблица 3).

Таблица 3 - Локализация вирусов (%) в различных органах растений груши (20062007 гг.)_

Орган растения Вирус

АСЬБУ АБСУ АрМУ

Лист 4,7а 21,8а 6,36

Цветок 3,6а 44,66 0,0а

Вирус АЗвУ, наоборот, диагностировался в цветках в 2,1 раза чаще по сравнению с использованием листьев. Для вируса АСЬБУ получены примерно

10

одинаковые результаты по его наличию как при использовании листьев, так и цветков груши.

При изучении распределения вирусов в различных частях побега выявлено, что вирус АБРУ преимущественно локализован у основания побега и в средней его части, тогда как в верхушечной части побега число зараженных образцов в 2,6-2,8 раза было ниже (таблица 4).

Таблица 4 - Локализация вирусов (%) в различных частях побега груши (в среднем за 2006-2007 г.г.)

Вирус Основание побега Средняя часть побега Верхушечная часть побега

ASGV 81 29 36

ASPV 100 94 36

ACLSV 24 56 21

ApMV 78 32 24

По вирусам ASGV и ApMV имелась та же тенденция: в образцах, отобранных у основания побега, наблюдалась наивысшая концентрация вируса. Число зараженных вирусами ASGV и ApMV тест- образцов в верхушечной части побега было соответственно в 2,3 и 3,3 раза меньше, чем у основания побега. Вирус ACLSV был сосредоточен в основном в средней части побега.

Определенное значение для корректной оценки результатов имеет длительность ферментативной реакции на заключительном этапе ИФА, когда происходит взаимодействие субстрата с содержимым микроплат. При медленной реакции различия между значениями экстинкции при считывании микроплат в двух направлениях незначительные (0,1-0,3 единицы), поэтому необходимость переворота отпадает. При быстром протекании ферментативной реакции разница между показателями составляет, как правило, 0,3-0,5 единицы, поэтому необходимо осуществлять двукратное считывание микроплат на спектрофотометре: одно -обычным способом, второе - путем переворота микроплаты на 180 0 с последующим вычислением среднего арифметического между двумя значениями.

2.2.2. Совершенствование метода ОТ-ПЦР

Применение усовершенствованной технологии экстракции вирусной РНК из листьев груши позволило успешно диагностировать вирусы АСЬБУ, АБСУ и АБРУ.

Для повышения эффективности выявления вирусной инфекции установлена необходимость использования на этапе экстракции РНК гидроксипроизводного бензойной кислоты (ГПБК) и модифицированного метода сорбции вирусов на препарате силика. Оптимальными навесками препарата ГПБК являлись 20 и 30 мг, которые обеспечивали успешную экстракцию РНК вируса АСЬ8У из листьев груши сорта Чижовская (рисунок 1).

Рисунок 1 - Электрофореграмма продуктов амплификации при тестировании груши сорта Чижовская методом ОТ-ПЦР на наличие вируса АСЬ8У с применением гидроксипроизводного бензойной кислоты:

1 - Без ГПБК; 2 - ГПБК 10 мг; 3 - ГПБК 20 мг; 4 - ГПБК 30 мг; 5 - ГПБК 40 мг/образец; 6 - отрицательный контроль; 7 - положительный контроль.

Для подтверждения эффективности разработанного метода с применением ГПБК проводили диагностику 6 сортов груши на вирус АСЗ^У. Данный вирус выявлен в образцах сортов Венера (клон 5) и Чижовская (рисунок 2). Ранее в этих же образцах данный вирус был диагностирован с помощью ИФА.

Рисунок 2 - Электрофореграмма продуктов амплификации при тестировании груши с использованием модифицированного метода ОТ-ПЦР на вирус АСЬ8У: 1- Нарядная Ефимова; 2 - Венера (клон 7); 3 - Чижовская; 4 - Бере зимняя Мичурина (клон 3); 5 - Венера (клон 5); 6 - отрицательный контроль; 7 -положительный контроль.

В другом эксперименте вирус АСЬБУ успешно диагностирован на сортах

Москвичка (клон 1) и Венера (рисунок 3).

Рисунок 3 - Электрофореграмма продуктов амплификации при тестировании груши разных сортов модифицированным методом ОТ-ПЦР на вирус ACLSV: 1 - Bern Hardy; 2 - Москвичка (клон 4); 3 - Москвичка (клон 1); 4 - Венера; 5 -Румяная Кедрина; 6 - Лада; 7 - отрицательный контроль; 8 - положительный контроль.

ГПБК является активным антиоксидантом, способным предохранять вирусные частицы от разрушения вследствие воздействия на них содержащихся в тканях растений фенольных и других балластных соединений. Поэтому применение ГПБК обеспечивает успешную экстракцию вирусной РНК из листьев груши. На разработанный способ экстракции РНК подана заявка на изобретение № 2008152268 от 30.12.2008г.

При диагностике груши на другие вирусы методом ОТ-ПЦР использовали выявленные оптимальные концентрации ГПБК. Оптимизированный этап экстракции РНК позволил успешно диагностировать вирус ASGV на груше сорта Berry Hardy (рисунок 4). Ранее на данном образце вирус также был диагностирован методом ИФА. В опыте на этапе экстракции РНК из листьев была применена разработанная нами технология с применением ГПБК, транскрипция РНК была проведена диагностическими наборами производства компании «Агродиагностика», а амплификация - наборами компании «Биоком».

Рисунок 4 - Электрофореграмма продуктов амплификации при тестировании груши на вирус ASGV модифицированным методом ОТ- ПЦР.

1 - Москвичка (клон 4); 2 - Berry Hardy; 3 - отрицательный контроль; 4 -положительный контроль.

При сравнительном анализе наборов для обратной транскрипции, выпускаемых фирмами «Агродиагностика» и «Биоком», выявлено преимущество наборов «Агродиагностики», поскольку в случае использования наборов фирмы «Биоком» вирус на груше Berri Hardy диагностировать не удалось. Следовательно, для транскрипции РНК целесообразно использовать наборы фирмы «Агродиагностика», а для амплификации - фирмы «Биоком».

При диагностике на вирус ASPV 6 сортов груши указанный вирус был выявлен на сорте Велеса. Полученная электрофореграмма соответствовала 264 парам нуклеотидов. На остальных сортах вирус ASPV не был выявлен.

2.2.3. Сравнительная оценка ИФА и ОТ-ПЦР

Сравнительная оценка ИФА и ОТ-ПЦР при тестировании груши разных сортов на вирусы подтвердила большую чувствительность и специфичность по-лимеразной цепной реакции (таблица 5).

Таблица 5 - Сравнительная оценка методов ИФА и ОТ-ПЦР при тестировании груши на латентные вирусы___

Сорт (клон) ACLSV ASGV ASPV

ИФА ПЦР ИФА ПЦР ИФА ПЦР

Москвичка (клон 1) - + - + +- +

Москвичка (клон 3) +- + - - +- +

Венера +- + - - - +

Berry Hardy + - + + + -

У сорта Москвичка (клон 1) методом ИФА не удалось диагностировать все исследованные вирусы, тогда как метод ПЦР успешно их выявлял. На клоне 3 сорта Москвичка ИФА показал вероятное заражение вирусами ACLSV и ASPV, в то время как ПЦР подтвердил зараженность. На этом же клоне вирус ASGV не выявлялся ни одним из способов диагностики. На индикаторе Berry Hardy ИФА показал наличие вирусов ACLSV и ASPV, а ПЦР не подтвердил данный результат. Вероятно, это связано с недостаточной специфичностью ИФА и возможной перекрестной реакцией между антигенами.

2.3. Вредоносность латентных вирусов на груше

В 2007-2008 годах изучена зависимость количества плодов от зараженности вирусами деревьев груши. В среднем по всем изученным сортам за 2 года исследований на свободных от вирусной инфекции деревьях плодов было на 41 % больше, чем на зараженных (таблица 6). На сортах Чижовская и Кокинская в среднем за 2 года исследований установлено, что на свободных от латентных вирусов деревьях количество плодов было в 1,7 раза больше по сравнению с зараженными.

Таблица 6 - Число плодов (шт.) на зараженных и свободных от латентных вирусов деревьях груши (2007-2008 гг.)__^__

Сорт 2007 2008 х года

- + - + - +

Лада 46,56 28,6а 140,6а 149,2а 93,6а 88,9а

Чижовская 48,66 29,5а 166,96 100,4а 107,86 64,9а

Кокинская 100,76 59,0а 172,26 104,7а 136,56 81,9а

х сорта 65,36 41,1а 159,9а 118,1а 112,66 79,6а

В среднем за 2 года исследований на сорте Лада различия между рассматриваемыми вариантами по количеству плодов отсутствовали, хотя в 2007 году число плодов на зараженных деревьях было в 1,6 раза меньше, чем на свободных от вирусов деревьях.

Изучение влияния латентных вирусов на вегетативное развитие растений груши показало специфику сортовой реакции. Для сортов Венера, Кокинская и Чижовская было характерно снижение числа побегов соответственно на 43 %, 15 % и 18 % по сравнению с деревьями, на которых отсутствовали вирусы. Вместе с тем в среднем по 6 изученным сортам латентные вирусы не оказывали существенного влияния на вегетативную продуктивность деревьев груши.

Важными показателями, отражающими функциональное состояние растений, зараженных вирусами, являются содержание хлорофилла и активность ферментной системы.

В листьях всех изученных сортов груши в среднем за 3 года исследований содержание хлорофилла в свободных от вирусной инфекции образцах было на 9 % выше, чем в образцах, зараженных комплексом вирусов (таблица 7).

Таблица 7 - Содержание хлорофилла (а + Ь) в листьях зараженных и свободных от латентных вирусов деревьев груши по годам исследований

Сорт Наличие Содержание хлорофилла, мг/г сырых листьев

вируса 2006 г. 2007 г. 2008 г. X

Венера - 14,48 10,88 17,23 14,196

+ 13,76 9,60 16,41 13,25а

Кокинская 13,44 10,72 14,00 12,726

+ 13,20 9,20 12,57 11,65а

Белеса - 15,52 9,52 15,77 13,606

+ 12,64 9,20 15,00 12,28а

Москвичка - 14,48 10,24 14,44 13,056

+ 13,04 9,04 13,36 11,81а

Чижовская - 15,20 11,84 15,65 14,236

+ 12,16 9,52 14,28 11,98а

- 14,626 10,646 15,426 13,266

X + 12,96а 9,31а 14,32а 12,19а

Наибольшая разница по содержанию хлорофилла в листьях зараженных вирусами и свободных от вирусов деревьев за 3 года исследований была отмечена у сорта Чижовская и составила 19 %. Можно предположить, что данный сорт характеризуется наибольшей чувствительностью к вирусам в отношении реакции на уровень хлорофилла в листьях.

Активность пероксидазы в среднем за 2007-2008 гг. в листьях зараженных растений груши на 52 % превышала аналогичный показатель у свободных от латентных вирусов растений (таблица 8).

Таблица 8 - Активность пероксидазы в листьях зараженных и свободных от латентных вирусов деревьев груши разных сортов по годам исследований

Сорт Наличие вирусов Экстинкция, Д нм/минт хгода

2007 г. 2008 г.

Венера - 1,2 3,0 2,1а

+ 2,4 3,7 3,16

Кокинская — 1,2 3,3 2,3а

+ 2,6 4,0 3,36

Велеса 1,6 3,0 2,3а

■ 1Д 4,0 2,6а

Чижовская 0,7 2,4 1,6а

• 1,7 5,7 3,76

Москвичка — 1Д 5,5 3,3а

+ 1,8 9,9 5,56

х сорта — 1,2а 3,4а 2,3а

+ 1,9а 5,56 3,66

Наиболее существенные различия по активности пероксидазы в зараженных й безвирусных образцах отмечены у сортов Чижовская (в 2,3 раза) и Москвичка (67 %). На сортах Венера и Кокинская таковые различия были меньшими (разница соответственно на 48 и 43 %), а в случае с сортом Белеса - незначительными.

Следовательно, деревья груши большинства изученных сортов, зараженные вирусами, характеризуются более высоким уровнем активности пероксидазы по сравнению со свободными от вирусной инфекции растениями.

Полученные нами результаты хорошо согласуются с литературными данными. Так, при заражении сеянцев груши вирусом бороздчатости древесины яблони не только снижались ростовые показатели сеянцев, но и возрастала активность пероксидазы на 32,8 % (Zhang, 2003).

Таким образом, несмотря на отсутствие визуальных симптомов вирусных заболеваний на деревьях груши, латентные вирусы вызывали изменения метаболизма: способствовали снижению содержания суммарного хлорофилла и повышению активности пероксидазы в листьях.

2.4. Изучение антивирусного действия иммуностимуляторов

В эксперименте по изучению действия препаратов рибав-экстра и циркон в составе экстрагирующего буфера на оптическую плотность образцов при диагностике методом ИФА установлено, что в большинстве образцов под действием препаратов происходило изменение экстинкции, причем, как правило, в направлении ее снижения. Наиболее четко эта тенденция проявлялась при использовании циркона (снижение экстинкции образцов по вирусам АБРУ, АСЬБУ и АрМУ соответственно на 77 %, 89 % и 194 % по сравнению с контролем), в то время как рибав-экстра оказался менее активным (снижение по тем же вирусам на 14 %, 13 % и 21 %).

Обработка зараженных вирусами побегов груши в растворах препаратов рибав-экстра и циркон приводила в большинстве случаев к снижению индекса зараженности образцов. На сорте Венера препарат циркон в концентрации 1 мл/л приводил к снижению концентрации вируса АБСУ ниже порога чувствительности ИФА: вирус в данном варианте не выявлялся (таблица 9).

Таблица 9 - Действие препарата циркон на вирусы при диагностике методом ИФА в модельном опыте__

Сорт Вирус Контроль (без обработки) Концентрация циркона, мл/л

0,01 0,1 1,0

Ао/Ак* НВ** Ао/Ак НВ Ао/Ак НВ Ао/Ак НВ

Венера АБРУ 1,3 - 1,4 - 1,6 +- 1,4 -

АБСУ 2,1 + 2,4 + 2,3 + 1,3 -

АрМУ 1,1 - 1,3 - 1,0 - 1,2 -

АСЬБУ 1,2 - 1,4 - 1,2 - 1,6 +-

Велеса АБРУ 1,3 - 1,8 +- 1,6 +- 1,3 -

АБСУ 1,9 +- 2,8 + 1,7 +- 1,0 -

АрМУ 2,3 + зд + 1,9 +- 1,8 +-

АСЬБУ 2,1 + 2,1 + 1,9 +- 1,9 +-

Ао/Ак* - отношение экстинкции образца к экстинкции сероотрицательного контроля; НВ** - наличие вируса:«-» вирус отсутствует, «+» вирус присутствует.

Аналогичная тенденция на сорте Венера по этому вирусу отмечена и при использовании препарата рибав-экстра в концентрациях 0,1 и 1,0 мл/л. На сорте Велеса препарат циркон, начиная с концентрации 0,1 мл/л, ингибировал развитие вирусов АБвУ и АрМУ. Указанное действие циркона, вероятно, связано с тем, что в его состав входит комплекс фенолкарбоновых кислот (хлорогеновой, цико-риевой, кофейной), которые, как известно, обладают антивирусными свойствами.

2.5. Влияние иммуностимуляторов на содержание хлорофилла в листьях зараженных вирусами растений груши

Препараты рибав-экстра и циркон положительно влияли на содержание хлорофилла в зараженных комплексом вирусов растениях груши.

На сорте Венера наиболее высокое значение содержания хлорофилла (на 28 % выше по сравнению с контролем) отмечено при концентрации рибава-экстра 0,01 мл/л, хотя и другие его концентрации способствовали повышению данного показателя (таблица 10).

Таблица 10 - Содержание хлорофилла (а+Ь) в листьях зараженных латентными вирусами растений груши в зависимости от обработки препаратом рибав-экстра, мг/г сырых листьев (в среднем за 2007-2008 гг.)

Сорт Контроль (без обработки) Концентрация препарата рибав-экстра, мл/л

0,01 0,1 1,0 X

Венера 5,88а 7,526 6,36аб 7,206 7,03а

Велеса 6,72а 7,40аб 6,72а 9,006 7,716

хсорта 6,30а 7,46аб 6,54а 8,106

На сорте Велеса максимальное содержание хлорофилла наблюдалось при концентрации рибава-экстра 1 мл/л.

В среднем за 2007-2008 г.г. на сорте Венера достоверное увеличение содержания хлорофилла отмечено при использовании циркона 0,1 мл/л, тогда как на сорте Велеса обработка цирконом обеспечивала положительный эффект (увеличение содержания хлорофилла на 32-46 %) вне зависимости от его концентрации (таблица 11).

Таблица 11 - Содержание хлорофилла (а+Ь) в листьях зараженных латентными вирусами растений груши в зависимости от обработки препаратом циркон, мг/г

Сорт Контроль Концентрация циркона, мл/л

0,01 од 1,0 X

Венера 5,88а 5,72а 7,686 6,0а 6,47а

Велеса 6,72а 8,88аб 9,846 9,086 9,276

хсорта 6,3 а 7,3а 8,766 7,54аб

2.6. Изучение действия иммуностимуляторов на продуктивность груши

Изучение влияния рибава-экстра и циркона на количество плодов у деревьев груши показало, что эффект зависел от вида, концентрации препарата и сортовых особенностей.

В среднем за 3 года исследований на сорте груши Велеса оптимальной концентрацией рибава-экстра оказались 0,1 и 1 мл/л, Лада и Кокинская - 0,1 мл/л, Чижовская - 1 мл/л (таблица 12).

Таблица 12 - Число плодов (шт.) на деревьях груши в зависимости от обработки препаратом рибав-экстра (в среднем за 2006-2008 гг.)

Сорт Контроль (без обработки) Концентрация рибава-экстра, мл/л

0,01 0,1 1,0

Велеса 23,1а 33,2а 62,66 70,16

Лада 50,3а 67,8аб 80,96 57,0а

Кокинская 93,6а 96,1а 134,96 90,5а

Чижовская 50,2а 64,9а 95,56 122,6в

В среднем за 2007-2008 годы препарат циркон оказал положительный эффект на деревьях груши всех изученных сортов, за исключением сорта Кокинская. Самыми отзывчивыми на обработку цирконом оказались деревья сорта Велеса, что выразилось в увеличении числа плодов в 3,7 раза по сравнению с необработанными деревьями (таблица 13).

Таблица 13 - Число плодов (шт.) на деревьях груши в зависимости от обработки препаратом рибав-экстра (в среднем за 2007-2008 гг.)

Сорт Контроль (без обработки) Концентрация препарата, мл/л

0,01 0,1 1,0

Велеса 17,2а 59,06 55,46 77,46

Лада 70,0а 66,4а 119,66 67,7аб

Кокинская 130,36 88,5а 74,7а 99,1а

Чижовская 50,2а 77,06 41,2а 40,2а

На деревьях сорта Лада, обработанных препаратом циркон в концентрации 0,1 мл/л число плодов было на 71 % выше в сравнении с контролем. Для груши сорта Чижовская предпочтительней оказалась низкая (0,01 мл/л) концентрация циркона, обеспечившая увеличение числа плодов на 53 % по сравнению с контрольным вариантом.

3. Экономический эффект

3.1. Экономическая оценка ИФА и ОТ-ПЦР

При анализе материальных затрат на выполнение ИФА и 2 различных модификаций ПЦР-анализа оказалось, что стоимость тестирования одного образца на один вирус составила 546 рублей для готовых наборов и 510 рублей по разработанной технологии ОТ- ПЦР, что соответственно на 55 % и 45 % дороже стоимости диагностики методом ИФА (таблица 14).

Таблица 14 - Материальные затраты на диагностику методами ИФА и ПЦР одного образца груши на один вирус (руб.) _

Статья расхода ИФА ОТ-ПЦР

Готовые наборы («Биоком») Разработанная технология

Электроэнергия 22,20 0,85 0,85

Теплообеспечение 5,23 4,86 4,86

Водообеспечение 3,5 0,34 0,34

Амортизация оборудования 76,30 66,9 66,9

Амортизация помещений 1,20 1,08 1,08

Зарплата с начислениями 62,50 175,0 175,0

Расходные материалы 36,30 72,24 51,20

Сумма прямых затрат 207,23 321,27 300,23

Общехозяйственные затраты 145,06 224,88 210,16

Себестоимость одного теста 352,29 546,15 510,39

Основные затраты на проведение серологического и молекулярного анализов приходятся на оплату труда, амортизацию лабораторного оборудования и расходные материалы.

3.2. Экономическая оценка применения иммуностимуляторов в саду

Расчет эффективности применения иммуностимуляторов осуществляли на примере груши сорта Лада. Установлен положительный экономический эффект от применения препаратов рибав-экстра и циркон. Прибыль от применения препаратов в среднем была в 1,9 раза выше по сравнению со стандартной технологией, а рентабельность на 91,8-91,9 %, что связано с увеличением урожайности.

Таблица 15 - Эффективность применения иммуностимуляторов при выращивании груши copra Лада (концентрация препарата 0,1 мл/л)

Статья расхода Стандартная технология Предлагаемая технология

Рибав- экстра Циркон

Урожайность, т/га 7,20 11,82 11,77

Стоимость 1 т. продукции, тыс. руб. 50,0 50,0 50,0

Себестоимость 1т плодов, тыс. руб. 19,49 14,34 14,35

Стоимость валовой продукции, тыс. руб. 360,0 591,0 588,5

Производственные затраты, тыс. руб. 140,3 169,6 168,9

Чистая прибыль, тыс. руб. 219,7 421,4 419,6

Рентабельность, % 156,6 248,5 248,4

ВЫВОДЫ

1. Диагностика насаждений груши методом ИФА на наличие латентных вирусов в условиях Московской области показала, что наибольшим распространением характеризуется триховирус хлоротической пятнистости листьев яблони (35 % от числа обследованных деревьев). Капилловирус бороздчатости древесины яблони и фовеавирус ямчатости древесины яблони диагностированы на 24 %, иларвирус мозаики яблони - 13 % обследованных деревьев груши.

2. При усовершенствовании метода ИФА установлена зависимость между скоростью протекания ферментативной реакции на заключительном этапе анализа и необходимостью изменения направления фотометрии. При быстром протекании ферментативной реакции требуется изменение направления фотометрии путем переворота микроплаты на 180° и определения средней арифметической из двух показаний.

3. Выявлена локализация латентных вирусов на груше в различных частях побега: преимущественно в листьях у основания побега и в средней его части. Число зараженных вирусами тест- образцов листьев, отобранных из верхушечной части побега, в 2,3-3,3 раза ниже по сравнению с листьями из других частей побега.

4. Отработана методика ОТ-ПЦР при тестировании на вирусы хлоротической пятнистости листьев яблони, бороздчатости древесины яблони и ямчатости древесины яблони. Для повышения эффективности выявления вирусной инфекции установлена необходимость использования на этапе экстракции РНК гидроксипро-изводного бензойной кислоты и модифицированного метода сорбции вирусов на препарате силика.

5. Вредоносность латентных вирусов на груше проявляется в снижении числа плодов у зараженных деревьев на 41 % по сравнению со свободными от указанных вирусов деревьями.

6. Латентные вирусы оказывают негативное влияние на биохимические показатели у растений груши: содержание суммарного хлорофилла в листьях снижается на 9 %, а активность фермента растворимой пероксидазы возрастает на 60 %.

7. Обработка побегов груши препаратами рибав-экстра и циркон в оптимальных концентрациях способствует увеличению содержания хлорофилла в листьях соответственно на 38 % и 39 %.

8. Установлено антивирусное действие изученных иммуностимуляторов. Циркон проявляет более высокую антивирусную активность (снижение экстинкции образцов по вирусам ASPV, ACLSV и ApMV соответственно на 77 %, 89 % и 194 %

по сравнению с контролем) в отличие от препарата рибав-экстра (снижение по тем же вирусам на 14 %, 13 % и 21 %).

9. Препараты рибав-экстра и циркон положительно влияют на продуктивность деревьев большинства изученных сортов груши, увеличивая число плодов соответственно на 36-93 % и 53-272 % по сравнению с необработанными деревьями. Максимальный эффект на большинстве сортов достигается при использовании данных препаратов в концентрации 0,1 мл/л.

10. Себестоимость тестирования одного образца на вирус зависит от метода диагностики. В структуре затрат наибольшие суммы приходятся на зарплату, амортизацию лабораторного оборудования и расходные материалы. Затраты на тестирование образца методом ОТ-ПЦР составляют 510-546 руб., методом ИФА - 352 руб.

11. Применение препаратов рибав-экстра и циркон при выращивании груши способствует увеличению рентабельности производства плодов в среднем на 92 %.

РЕКОМЕНДАЦИИ ИО ПРАКТИЧЕСКОМУ ИСПОЛЬЗОВАНИЮ

1. Усовершенствованные методы иммуноферментного анализа и полимераз-ной цепной реакции рекомендуется использовать в лабораториях вирусологии для тестирования груши на латентные вирусы.

2. При тестировании методом ИФА для повышения достоверности получаемых результатов следует отбирать образцы листьев у основания и в средней части побега. При быстром протекании ферментативной реакции на заключительном этапе ИФА необходимо осуществлять изменение направления фотометрии путем переворота микроплаты на 180° и определения средней арифметической из двух показаний.

3. ОТ-ПЦР рекомендуется выполнять в соответствии с модифицированной нами методикой экстракции РНК, включающей применение гидроксипро-изводного бензойной кислоты на этапе гомогенизации растительного материала в количестве 20-30 мг/образец и сорбцию вирусных частиц на препарате силика.

4. Перед закладкой маточных насаждений груши необходимо проводить диагностику посадочного материала на латентные вирусы методами ИФА и ПЦР.

5. При выращивании насаждений груши с целью повышения их продуктивности рекомендуется применять иммуностимуляторы рибав-экстра и циркон в концентрации 0,1 мл/л в фазу бутонизации.

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Кочетова, И.И. Диагностика вирусов и бактерий на груше методом полимераз-ной цепной реакции / И.И. Кочетова, М.Т. Упадышев // Материалы VII молод, науч. конф. «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии»,-М., 2007-с. 46-47;

2. Походенко, П.А. Диагностика вирусов и бактерий на плодовых культурах методом полимеразной цепной реакции / П.А. Походенко, И.И. Кочетова, М.Т. Упадышев // Плодоводство и ягодоводство России (по матер. Всеросс. науч.-практ. конф. «Молодые ученые - садоводству России в XXI веке»).- М.: Изд. Дом МСП, 2008,- Т. XIX,- С. 112-116;

3. Саунина, И.И. Распространенность и вредоносность вирусов на груше в условиях Московской области / И.И. Саунина, М.Т. Упадышев, Е.В. Гребнева // Садоводство и виноградарство,- 2008,- № 3,- С. 16-19;

4. Упадышев, М.Т. Диагностика вирусов семечковых и косточковых культур методами ИФА и ПЦР / М.Т. Упадьппев, H.H. Мельникова, А.Д. Петрова, О.Ю. Суркова, К.В. Метлицкая, П.А. Походенко, И.И. Саунина - М.: ГНУ ВСТИСП, 2008.-35 с.

Подписано в печать: 27.01.2009

Заказ № 1502 Тираж -110 экз. Печать трафаретная. Объем: 1,5 усл.п.л. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата сельскохозяйственных наук, Саунина, Ирина Ивановна

ВВЕДЕНИЕ.

Цель исследований.

Задачи исследований.

Научная новизна результатов исследований.

Предмет исследований.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Видовой состав и распространенность вирусов на груше.

1.2. Влияние вирусов на продуктивность и биохимические показатели у плодовых культур.

1.3. Действие иммуностимуляторов на фитопатогены.

1.4. Методы диагностики вирусов.

1.4.1. Диагностика вирусов методом иммуноферментного анализа.

1.4.2. Диагностика вирусов методом полимеразной цепной реакции.

1.4.2.1. Оптимизация параметров ОТ-ПЦР.

1.4.2.2. Модификации ПЦР.

1.4.2.3. Диагностика вирусов на груше методом ПЦР.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Время, место проведения исследований.

2.2. Метеорологические условия в годы проведения экспериментов.

2.3. Методика исследований.

2.3.1. Объекты исследований.

2.3.2. Характеристика изучаемых вирусов.

2.3.3. Характеристика изучаемых сортов.

2.3.4. Характеристика иммуностимуляторов.

2.3.5. Элементы учёта и наблюдений.

2.3.6. Краткие схемы опытов.

2.3.7. Методики тестирования растительных образцов на наличие вирусов.

2.3.7.1. Методика ИФА.

2.3.7.2. Методика ПЦР.

2.3.8. Методика количественного определения хлорофилла.

2.3.9. Методика определения активности пероксидазы.

2.3.10. Методика изучения антивирусных свойств препаратов рибав-экстра и циркон.

2.3.11. Методика изучения действия иммуностимуляторов на продуктивность деревьев.!.

2.3.12. Статистический анализ результатов исследований.

2.3.13. Расчет экономической эффективности результатов исследований.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Распространенность латентных вирусов на груше в

Московской области.

3.2. Совершенствование методов диагностики вирусов на груше.

3.2.1. Совершенствование метода ИФА.

3.2.2. Совершенствование метода ОТ-ПЦР.

3.2.3. Сравнительная оценка ИФА и ПНР.

3.3. Вредоносность вирусных болезней.

3.4. Изучение действия иммуностимуляторов на латентные вирусы и содержание хлорофилла в листьях груши.

3.4.1. Изучение антивирусного действия иммуностимуляторов.

3.4.2. Влияние иммуностимуляторов на содержание хлорофилла в листьях зараженных вирусами растений груши.

3.5. Изучение действия иммуностимуляторов на продуктивность деревьев груши.

ГЛАВА 4. ЭКОНОМИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ.

4.1. Экономическая оценка ИФА и ОТ- ПНР.

4.2. Экономическая оценка применения иммуностимуляторов в саду.

ВЫВОДЫ.,.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРАКТИЧЕСКОМУ ИСПОЛЬЗОВАНИЮ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Вредоносность латентных вирусов на груше и их диагностика методами ИФА и ПЦР"

Груша является одной из ведущих плодовых культур умеренного пояса, занимает второе место в мировом производстве плодов листопадных плодовых культур, уступая только яблоне. По данным ФАО, в мире ежегодно производится около 9-10 млн. тонн плодов груши на площади 1,7 млн. га. В России груша выращивается на площади 18 тыс. га с валовым сбором около 100 тыс. тонн (www.fao.org4). из них около 40 % производится в Европе: Италии, Франции, Испании и Германии. Из-за меньшей по сравнению с яблоней зимостойкости груша более требовательна к выбору зон для промышленного возделывания. Однако пищевая ценность плодов груши так высока, что ее пытаются выращивать в самых разнообразных, даже не подходящих для нее почвенно-климатических зонах. Например, в Российской Федерации ареал возделывания груши простирается от западных границ до Дальнего Востока (Туз, 1974).

Плоды десертных сортов груши отличаются маслянистой, сочной консистенцией мякоти, непревзойденным тонким ароматом и вкусом, привлекательным внешним видом. Наличие сортов с разными сроками потребления позволяет использовать свежие плоды груши 8-10 месяцев, а при современных методах хранения - практически круглый год. Деревья груши долговечны, при хорошем уходе грушевые сады прекрасно плодоносят десятки лет.

Плоды груши используются для различных видов переработки. Из них готовят варенье, компоты, повидло, грушевый мед (бекмес), соки и вина, а также сушат.

Народная медицина использует варенье, печеные плоды груш, отвар из сушеных груш, грушевый сок как диетические, профилактические и лекарственные продукты при различных заболеваниях.

Дикорастущие виды и формы груши используются в садоводстве в качестве семенных подвоев и для озеленения населенных пунктов (Душустина, 1979).

Древесина груши отличается твердостью и высоким удельным весом, имеет красивую красновато-коричневую окраску, используется в мебельной промышленности.

Деревья груши характеризуются меньшей по сравнению с яблоней периодичностью плодоношения, что частично связано с многоцветковостыо соцветий груши (Ефимова, Гиричев, 2005). Груша обладает высоким адаптационным потенциалом и способна занять достойное место в насаждениях плодовых культур средней полосы России (Каталог мировой коллекции ВИР, 1991). Поэтому в последнее время груша приобретает все большую популярность и в условиях Нечерноземной зоны России.

Одним из главных факторов, препятствующих распространению груши, является недостаток оздоровленного посадочного материала, а также слабая изученность вопросов вредоносности вирусов и эффективных способов оздоровления от них. Вирусные и фитоплазменные заболевания ввиду хронического порядка и высокой вредоносности считаются важнейшим лимитирующим фактором повышения общей урожайности плодовых культур, в том числе и груши.

Основным направлением борьбы с этими заболеваниями является перевод питомниководства на безвирусную основу и введение системы сертификации посадочного материала, что принято в большинстве европейских стран.

За последние годы мировой наукой достигнут существенный прогресс в изучении вирусных болезней плодовых культур. Отчасти это связано с разработкой высокочувствительных серологических и молекулярных методов диагностики. Однако ввиду ряда объективных факторов (латентный характер заражения растений большинством вирусов, отсутствие экспресс-ме-/ тодов диагностики для ряда возбудителей и т.д.) существующие методы диагностики не всегда показывают хорошие результаты. Дальнейшие исследования должны быть направлены на поиск решений, позволяющих быстро и качественно диагностировать вирусные болезни. Актуальность исследований в этом направлении заключается в необходимости совершенствования методов диагностики (ИФА и ПНР) применительно к биологическим особенностям груши.

В связи с выше изложенным нами определены следующие цель и задачи исследований.

Цель исследований - изучить распространенность и вредоносность латентных вирусов на груше и особенности их диагностики с использованием ИФА и ПЦР.

Задачи исследований:

1. Изучить распространенность латентных вирусов на груше;

2. Установить вредоносность вирусов на груше путем оценки действия вирусов на продуктивность и биохимические показатели растений;

3. Усовершенствовать методы диагностики (ИФА, ПЦР) вирусов на груше;

4. Установить действие иммуностимуляторов (рибав-экстра и циркон) на вирусы, биохимические показатели и продуктивность деревьев груши.

Методология настоящих исследований заключается в поиске путей решения проблемы снижения вредоносности вирусов на груше и повышения эффективности и достоверности диагностики методов ИФА и ПЦР.

Научная новизна результатов исследований

Впервые разработана методика полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) при тестировании груши на вирусы хлоротической пятнистости листьев яблони (АСЬ8У), бороздчатости древесины яблони (АБСУ) и ямчатости древесины яблони (АБРУ). Для повышения эффективности выявления вирусной инфекции установлена необходимость использования на этапе экстракции РНК гидроксипроизводного бензойной кислоты и модифицированного метода сорбции вирусов на препарате силика. На разработанный метод подана заявка на патент № 2008152268 от 30.12.2008 г.

Установлена локализация вирусов по побегу в зависимости от расположения листьев. Показано негативное влияние латентных вирусов на продуктивность и биохимические показатели у груши.

Впервые выявлено антивирусное действие иммуностимуляторов рибав-экстра и циркон в отношении латентных вирусов на груше, предложена методика по его оценке. Установлено положительное действие этих препаратов на продуктивность деревьев груши в саду.

Практическая значимость и реализация результатов исследований

Предложен новый высокоэффективный способ экстракции РНК вирусов из листьев груши для последующей надежной диагностики вирусной инфекции методом полимеразной цепной реакции.

Разработанный способ диагностики внедрен в условиях лаборатории вирусологии ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии и прошел успешные испытания в фирме «Агродиагностика», где показано повышение эффективности выявления вирусов при выполнении ОТ-ПЦР по предложенному способу на 25 % в сравнении с известным.

Оптимизирована методика выполнения ИФА с учетом выявленных закономерностей распределения вирусов по органам и тканям груши и длительности ферментативной реакции. Указанная методика используется при тестировании груши на вирусы в условиях лаборатории вирусологии ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии.

Показана эффективность применения препаратов рибав-экстра и циркон в производственных условиях отдела испытания новых технологий ВСТИСП на площади 1 га.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Совершенствование методов иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции для тестирования на латентные вирусы груши.

2. Обоснование необходимости проведения посадок насаждений груши свободным от латентных вирусов посадочным материалом.

3. Обоснование целесообразности применения иммуностимуляторов в саду.

Предмет исследований:

Предметом исследований являются зависимость распространённости и вредоносности вирусов от местоположения насаждений и сортовых особенностей груши, а также эффективности диагностики вирусов от используемого метода и вида тест- образца.

Апробация работы Основные материалы диссертации доложены на VII молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» в РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (4 апреля 2007 г.) и Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые -садоводству России в XXI веке» (г. Москва, 11-12 октября 2007 г.).

Публикации

Основные результаты исследований по диссертации изложены в 4 научных работах, в том числе 2 - в рецензируемых научных журналах.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 116 страницах, состоит из введения, 4 глав, выводов, рекомендаций по практическому использованию, списка литературы из 157 источников, в том числе 105 - на иностранных языках, содержит 29 таблиц и 14 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Защита растений", Саунина, Ирина Ивановна

выводы

1. Диагностика насаждений груши методом ИФА на наличие латентных вирусов в условиях Московской области показала, что наибольшим распространением характеризуется триховирус хлоротической пятнистости листьев яблони (35 % от числа обследованных деревьев). Капилловирус бороздчатости древесины яблони и фовеавирус ямчатости древесины яблони диагностированы на 24 %, иларвирус мозаики яблони - на 13 % обследованных деревьев груши.

2. При усовершенствовании метода ИФА установлена зависимость между скоростью протекания ферментативной реакции на заключительном этапе анализа и необходимостью изменения направления фотометрии. При быстром протекании ферментативной реакции требуется изменение направления фотометрии путем переворота микроплаты на 180° и определения средней арифметической из двух показаний.

3. Выявлена локализация латентных вирусов на груше в различных частях побега: преимущественно в листьях у основания побега и в средней его части. Число зараженных вирусами тест- образцов листьев, отобранных из верхушечной части побега, в 2,3-3,3 раза ниже по сравнению с листьями из других частей побега.

4. Отработана методика ОТ-ПЦР при тестировании на вирусы хлоротической пятнистости листьев яблони, бороздчатости древесины яблони и ямчатости древесины яблони. Для повышения эффективности выявления вирусной инфекции установлена необходимость использования на этапе экстракции РНК гидроксипроизводного бензойной кислоты и модифицированного метода сорбции вирусов на препарате силика.

5. Вредоносность латентных вирусов на груше проявляется в снижении числа плодов у зараженных деревьев на 41 % по сравнению со свободными от указанных вирусов деревьями.

6. Латентные вирусы оказывают негативное влияние на биохимические показатели у растений груши: содержание суммарного хлорофилла в листьях снижается на 9 %, а активность фермента растворимой пероксидазы возрастает на 60 %.

7. Обработка побегов груши препаратами рибав-экстра и циркон в оптимальных концентрациях способствует увеличению содержания хлорофилла в листьях соответственно на 38 % и 39 %.

8. Установлено антивирусное, действие изученных иммуностимуляторов. Циркон проявляет более высокую антивирусную активность (снижение экстинкции образцов по вирусам АБРУ, АСЬЭУ и АрМУ соответственно на 77 %, 89 % и 194 % по сравнению с контролем) в отличие от препарата рибав-экстра (снижение по тем же вирусам на 14 %, 13 % и 21 %).

9. Препараты рибав-экстра и циркон положительно влияют на продуктивность деревьев большинства изученных сортов груши, увеличивая число плодов соответственно на 36-93 % и 53-272 % по сравнению с необработанными деревьями. Максимальный эффект на большинстве сортов достигается при использовании данных препаратов в концентрации 0,1 мл/л.

10. Себестоимость тестирования одного образца на вирус зависит от метода диагностики. В структуре затрат наибольшие суммы приходятся на зарплату, амортизацию лабораторного оборудования и расходные материалы. Затраты на тестирование образца методом ОТ-ПЦР составляют 510-546 руб., методом ИФА — 352 руб.

11. Применение препаратов рибав-экстра и циркон при выращивании груши способствует увеличению рентабельности производства плодов в среднем на 92 %.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРАКТИЧЕСКОМУ ИСПОЛЬЗОВАНИЮ

1. Усовершенствованные методы иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции рекомендуется использовать в лабораториях вирусологии для тестирования груши на латентные вирусы.

2. При тестировании методом ИФА для повышения достоверности получаемых результатов следует отбирать образцы листьев у основания и в средней части побега. При быстром протекании ферментативной реакции на заключительном этапе ИФА необходимо осуществлять изменение направления фотометрии путем переворота микроплаты на 180° и определения средней арифметической из двух показаний.

3. ОТ-ПЦР рекомендуется выполнять в соответствии с модифицированной нами методикой экстракции РНК, включающей применение гидроксипроизводного бензойной кислоты на этапе гомогенизации растительного материала в количестве 20-30 мг/образец и сорбцию вирусных частиц на препарате силика.

4. Перед закладкой маточных насаждений груши необходимо проводить диагностику посадочного материала на латентные вирусы методами ИФА и ПЦР.

5. При выращивании насаждений груши с целью повышения их продуктивности рекомендуется применять иммуностимуляторы рибав-экстра и циркон в концентрации ОД мл/л в фазу бутонизации.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Саунина, Ирина Ивановна, Москва

1. Абрамова, И.Т. Электронная микроскопия возбудителя оспы слив / И.Т. Абрамова, И.С. Литвиненко, Ю.И. Помазков // Защита растений от вредителей и болезней- Сб. науч. трудов ЛСХИ, 1971- Т.156 С.113-115.

2. Андреева, В.А. Фермент пероксидаза. Участие в защитном механизме растений / В.А. Андреева // Москва: Наука, 1988 С. 128.

3. Беликов, С.И. Молекулярно-генетические подходы к изучению РНК-содержащих вирусов / С.И. Беликов // Автореф. дис.докт. биол. наук-Иркутск, 2000.-С.41.

4. Белошапкина, О.О. Защита земляники в питомнике высших репродукций / 0.0. Белошапкина, Л.В. Безобразнова // Защита и карантин растений-2001.— №9 С.42-43.

5. Белошапкина, О.О. Система оздоровления земляники садовой от вирусов / О.О. Белошапкина//Дисс. докт. с.-х. наук.-М., 2006 370 с.

6. Вартапетян, А.Б. Полимеразная цепная реакция / А.Б. Вартапетян // Молекулярная биология-М.: Наука. 1991-Т.25 -вып. 4.-С.926-933.

7. Вердеревская, Т.Д. Вирусные и микоплазменные заболевания плодовых культур и разработка мер борьбы с ними в Молдавской ССР / Т.Д. Вердеревская // Автореф. дисс. доктора биол. наук-Кишинев, 1973. С. 42.

8. Вердеревская, Т.Д. Система оздоровления плодовых культур от вирусных и микоплазменных заболеваний / Т.Д. Вердеревская, X. Кеглер // Интенсификация садоводства и виноградорства Кишинев, 1981- С. 53-57.

9. Вердеревский, Д.Д. Хронические болезни плодовых культур и винограда / Д.Д. Вердеревский, Т.Д. Вердеревская // Кишинев: Картя молдовенясэ, 1967.- С.27.

10. Вердеревская, Т.Д. Вирусные и микоплазменные заболевания плодовых культур и винограда в Молдавии / Т.Д. Вердеревская, В.Г. Маринеску // Кишинев, Штиинца, 1985.-С. 311.

11. Гиббс, А. Основы вирусологии растений / А. Гиббс, Б. Харрисон // М.: Мир, 1978.-С. 34-37.

12. Гнутова, Р.В. Серология и иммунохимия вирусов растений / Р.В. Гнутова // М.: Наука, 1993.-С. 301.

13. Гусейнов, И.Г. Мозаика яблони в Азербайджане / И.Г. Гусейнов // Защита растений 1975.- №10 - С. 55.

14. Доспехов, Б. А. Методика полевого опыта / Б.А. Доспехов // М.: Агропром-издат.-1985.-351 с.

15. Дорожкина, Л.А. Применение циркона на виноградниках / Л.А. Дорожкина // Тез. докл. науч.-практ. конф. «Применение препарата циркон в производстве сельскохозяйственной продукции», 14 апр. 2004 г-М., 2004.— С. 33-34.

16. Душустина, К.К. Селекция груши / К.К. Душустина // Кишинев, 1979.-196 с.

17. Ефимова, H.B. Новые сорта груши / Н.В. Ефимова, B.C. Гиричев // Садоводство и виноградарство 2005. - №5. - С. 28-29.

18. Каталог мировой коллекции ВИР / Груша (источник хозяйственно-ценных признаков для использования в селекции) // Л.: ВИР, вып. 588.-1991- С. 90.

19. Каширская, Н.Я. Циркон и повышение устойчивости плодово-ягодных культур к грибным болезням / Н.Я. Каширская // Тез. докл. 6 межд. конф. «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях».- М., 2001- С. 244-245.

20. Косаковская, О.И. Серологический метод изучения неповирусов плодовых культур и винограда / О.И. Косаковская // Автореф. дис. канд. с.-х. наук: 06.01.11.- Самохваловичи, Минская обл.- 1981 22 с.

21. Маниатис, Т. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сэмбрук // М.: Мир, 1984.- 432 с.

22. Малеванная, H.H. Препарат циркон иммуномодулятор нового типа / H.H. Малеванная // Тез. докл. науч.- практ. конф. «Применение препарата циркон в производстве сельскохозяйственной продукции», 14 апр. 2004 г.— М., 2004.-С. 17-20.

23. Медведев, И.А. Оптимизация способов размножения и защиты роз от вредителей в условиях Москвы и Московской области / И.А. Медведев // Автореф. дис. канд. с.-х. н-Мичуринск, 2006.-22 с.

24. Мерцалова, О.С. Механическая передача одного из вирусов яблони / О.С. Мерцалова // Материалы науч. конференции молодых ученых.- Л., 1967.-С.24—25.

25. Мишина, А.П. Мозаика и розеточность яблони (этиология, патогенез) / А.П. Мишина// Автореф. дисс. канд. с/х. наук. -М., 1974 22 с.

26. ПауновисЬ, С. Проучаванье неких изолата вируса хлоротичне лисне нетаво-сти ja6yKe / С. ПауновисЬ // Зборник Радова Полвопривредног факултета. — 1990. № 594. - С.201 - 213.

27. Помазков, Ю.И. Вирусные болезни плодовых и ягодных культур в Нечерноземной зоне / Ю.И. Помазков // Автореф. дисс. доктора с.-х. наук. М., 1975.- 34 с.

28. Прусакова, Л.Д. Регуляторы роста растений с антистрессовыми и иммунопротекторными свойствами / Л.Д. Прусакова, H.H. Малеванная, С.Л.Белопухов, В.В. Вакуленко // Агрохимия 2005- №11.- С. 76-86.

29. ПЦР 2002,- http://molbiol.ru

30. Семина, Н.П. Изучение видового состава и распространённости вирусных инфекций на яблоне в ЦЧЗ. Пути повышения устойчивости садоводства / Н.П. Семина// Сб. науч. трудов ВНИИС им. И.В. Мичурина. -Мичуринск-1998.-С. 93-97.

31. Семина, Н.П. К вопросу о роли «латентных» вирусов яблони в явлении несовместимости / Н.П. Семина, Т.Ф. Бивол // Вирусные, микоплазменные ибактериальные болезни плодовых культур и винограда в Молдавии. — Кишинев, 1980.-С.26-38.

32. Семина, Н.П. Производство безвирусного посадочного материала яблони в Центрально Черноземной зоне / Н.П. Семина, Е.М. Цуканова // Молодые ученые - садоводству России. Тезисы докладов Всеросийского совещания. -М., ВСТИСП. - 1995. - С. 115 - 117.

33. Трофимец, Л.Н. Классификация фитопатогенных вирусов / Л.Н. Трофимец // Защита растений. 1988.- № 3 - С.22-24.

34. Тимошин, С.И. Хабаровские груши / С.И.Тимошин // Хабаровск, 1983.- С. 113.

35. Туз, A.C. Генофонд груши Советского Союза и его использование в селекции / A.C. Туз // Научные труды МОСВИР. Майкоп - 1974- вып. 8 — 120 с.

36. Тулеуов, Ж. Т. Вирусные заболевания яблони и разработка мер борьбы с ними в зонах плодоводства Казахской ССР / Ж.Т. Тулеуов // Автореф. дисс. .канд. биол. наук. Алма - Ата, 1982. - С. 22.

37. Тулеуов, Ж.Т. Получение безвирусного посадочного материала яблони / Ж. Т. Тулеуов // Плодоовощное хозяйство.-1986.-№ 10.-С. 15-17.

38. Цубера, Л.В. Хемотерапия вирусов плодовых и ягодных растений в комбинации с культурой изолированных апексов / Л.В. Цубера // Автореф.дис. канд. с.-х. наук. -М., 1998.-22 с.

39. Шмыгля, В.А. Методы диагностики вирусов в селекции и семеноводстве картофеля / В.А. Шмыгля // Методические указания для АПК.- М 1987.-27 с.

40. Babovic, M.V. Appearance and distribution of chlorotic leaf spot virus on different apple cultivars / M.V. Babovic, G.P. Delibasic // Acta Horticulturae. -1986-№ 193. -P.81 88.

41. Bar-Joseph, M. The Closteroviruses: a distinct group of elongated plant viruses / M. Bar-Joseph, S.M. Garnsey, D. Consalves // Advances Vims Res. 1979 -Vol.25-P.93 -168.

42. Barbara, M. Detection of strains of apple chlorotic leafspot vims by F (ab)2 -based in derect ELISA / M.Barbara, M.F. Clark // Acta Horticulturae. 1986 -№193.-P. 297-304.

43. Cameron, H.R. Effect of viruses on deciduous fruit trees / H.R. Cameron // Hort. Sci. 1977. - Vol. 12.-№ 5. -P.484-487.

44. Campbell, A.I. Virus diseases of fruit trees: II Latent vims in apple varieties and rootstocks / A.I. Campbell //Ann. Rep. Long. Ashton Agr. Hort. Res. Stn. 1961. — P.73 —76.

45. Clark, M.F. The detection of plum pox and other viruses in woody plants by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) / M.F. Clark, A.N. Adams, J.M. Thresh, R. Casper // Acta Hort.- 1976.- № 67.- P.51-57.

46. Clark, M.F. Characterization of the microplate of enzyme — linked immunosorbent assay for detection of plant viruses / M.F. Clark, A.N. Adams // J.Gen.Virol. 1977. - Vol. 34. - P. 475-483.

47. Clever, M. Ergebnisse einer Leistingsprufung zwischen virusfreihe nicht virusfreihe Kernobstsorten / M. Clever, R. Stehr // Mitt Obstbauversuchringes Alten Landes.- 1996.- Vol.5.- № 6. P. 236-246.

48. Coffin, R.S. The enteroviruses, capilloviruses and other similar viruses; a short revive /R.S. Coffin, R.H. Coutts//Virology.- 1993.-Vol. 174.-P. 1475-1483.

49. Cropley, R. Comparison of some apple latent viruses / R. Cropley // Ann. appl. Biol. 1968 - Vol.61 №3. -P.361 -372.

50. Demeke, T. The effects of plant polysacharide and buffer additives on PCR / T. Demeke, R.P. Adams // Biotechniques. 1992. - Vol. 12. - P.332 - 334.

51. Desvignes, J.C. Use of heat treatment and cross protection to identify some specific fruit tree virus diseases / J.C. Desvignes // Acta Phytopath. Acad. Sei. Hung.- 1980.- Vol. 15, № 1-4.-P. 371-374.

52. Desvignes, J.C. Different diseases caused by the chlorotic leaf spot virus on the fruit trees / J.C. Desvignes, R. Boye // Acta Hort.- 1989.- № 235.- P.31-38.

53. Desvignes, J.C. Quick detection of the principal apple and pear virus diseases / J.C. Desvignes, R. Boye, D. Cornaggia, N. Grasseau // Acta Horticulture. 1992 - № 309. - P.377 - 384.

54. Detienne, G. Use and versatility of the immunoenzymatic ELISA procedure in the detection of different strains of apple chlorotic leaf spot virus / G. Detienne, R. Delibos, J. Dunes //Acta Phytopath. Acad. Sei. Hung. 1980. - Vol. 15.-№ 1-4. -P. 39-45.

55. Erlich, H.A. Polymerase chain reaction / H.A. Erlich // J. Clin. Immunol-1989.- 9. -P.437-447.

56. Fidan, U. Indexing of apple trees for apple mosaic virus, apple chlorotic leaf spot virus and apple stem grooving virus by ELISA / U. Fidan // J. Tur. Phytopathol -1994. Vol. 23.-№ 3. -P.127 - 132.

57. Flegg, C.L. The detection of apple chlorotic leafspot virus by modified procedureof enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) / C.L. Flegg, M.F. Clark // Ann. Appl. Biol.-1979.-V. 91.-№ l.-P. 61-65.

58. Francki, R.I.B. Classifikation and nomenclature of viruses. 5-th report of the Int. Committee on Taxonomy of viruses / R.I.B. Francki, C.M. Fauquet, D.L. Knudson, F. Brawn // Arch.Viral.-l 991.-Supple 2.- 120 p.

59. Fuchs, E. Serological detection of apple chlorotic leaf spot virus (CLSV) and apple stem grooving virus (SGV) in apple trees / E. Fuchs // Acta Phytopath. Acad. Sei. Hung. 1980. - Vol. 15,- № 1 - 4. - P.69 - 73.

60. Fuchs, E. Untersuchungen zum serologischen nachweis mechanisch ubertragbarer viren des Kernobstes /E. Fuchs //Tag.-Ber. Acad. Landwirtsch-1980 -№ 184 — P. 453^160.

61. Fuchs, E. Vergleich verschiedener serologischet Methoden zum Nachweis des stammfurchungs viren des Apfels (SGV) und des chlorotischen blattfleckungs -virus des Apfels (CLSV) / E. Fuchs // Arch. Gartenbau. 1983. - Vol. 31.- № 5. — P.237 —245.

62. Fulton, R.W. Serology of viruses causing cherry necrotic ringspot, plum line pattern, rose mosaic / R.W. Fulton // Phytopathology. 1968. - V. 58. - P. 635638.

63. Gilmer, R.M. Latent viruses of apple. III. Indexing with Chenopodium quinoa / R.M. Gilmer, G.I. Mink // Search agriculture. 1971. - Vol. 1.- № 10. - P. 15 -21.

64. Hansen, A.J. Plant disease diagnosis present status and futhure prospects / A.J. Hansen, R.L. Wick // Adv. Plant. Pathol. 1993. - Vol. 10. - P. 65- 126.

65. Henson, J.M. The polymerase chain reaction and plant disease diagnosis / J.M.Henson, R. French // Ann. Rev. Phytopath. 1993.-№31.-P. 81-109.

66. Janecova, M. Vusledky testu ELISA pri zjistovani pritomnosti viru zlabkovitosti kmene jablone (ASGV) ve 24 izolatech ASGV separovanuch termoterapii / M. Janecova, Z. Pluhar // Zahradnictvi. 1987. - R. 14 - № 2. - S.86 - 91.

67. Karesova, R. Zkusenosti s testem ELISA viru poritivinch stromu jabloni / R. Karesova, L. Svobodova, F. Paprstein // Ved. Prace Ovocnarske. 2000. - № 14. -S. 59-66.

68. Kegler, H. Ein latent Virus in deutschen Apfel Sorten und Unterlagen / H. Kegler //Phytop. Zeitschrift. 1961. - Vol. 42.-P. 379 -400.

69. Kinard, G.R. Detection of apple chlorotic leaf spot and apple stem grooving viruses using RT-PCR / G.R. Kinard, S.W. Scott, O.W .Barnett // Plant Dis 80, 1996.-616-621.

70. Kirby, M.J. Comparison of a bioassay and laboratory assays for apple stem grooving virus / M.J. Kirby, C.M. Guise, A.N. Adams // 18th Intern. Symp. Virus and Virus-like discarders of temperate fruit crops, England. 2000 - P.54

71. Kirkpatrick, H.C. A mechanically transmissible virus latent in apple / H.C. Kirkpatrick, R.C. Lindner // Phytopathology.- 1964.-Vol. 54,-P. 229-232.

72. Koganezawa, H. A new type of elongated virus isolated from apple trees . containing the stem pitting agent / H. Koganezawa, H. Yanase // Plant.Dis1990,-Vol. 74 № 8.-P. 610-614.

73. Komorowska, B. Amplification of the coat protein gene of Apple stem pitting virus (ASPV) / B. Komorowska, T. Malinowski, B. Zavadzka // Phytopath. Polonica.- 1999.- Vol. 17/-№ l.-P. 49-59.

74. Korschineck, I. A PCR membrane spot assay for the detection of plum pox virus RNA in bark of infected trees / I. Korschineck, G. Himmker, R. Sagl, H. Steinkellerer, H.W.D. Katinger//J. Virol. Methods.- 1991.-V. 31.-P. 139-146.

75. Kristensen, H.R. Distribution of virus and virus like diseases of fruit trees (surveys 1965 -1985) / H.R. Kristensen // Acta Horticulture.- 1986.- № 193. -P.373 -384.

76. Kristensen, H.R. Apple mosaic virus strain interference plants and strains / H.R. Kristensen, A. Thomsen // Phytopath. Mediterranea. 1963. - Vol. 2- № 3. -P.100-103.

77. Kryczynski, S. Virus- infection status of some apple propagative material plantations in Poland / S. Kryczynski, M. S. Szyndel, E. Padych Cichal, M. Glowacki // Phytopathol. Polonica Poznan.- 1995. -№ 10 (22). -P.75 - 84.

78. Kummert, J. Detection of apple chlorotic leaf spot virus and apple stem grooving virus by RT-PCR and JC-RT-PCR / J. Kummert, G. Ruffland, D. Colinet, P. Lepoivre // Med. Fac. Landbouw. Univ. Gent. 1995,- Vol. 60.- № 2.- P. 277 -287.

79. Legrand, G. Utilization of indirect enzyme linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses / G. Legrand // Med. Fac. Rijksuniv. Gent. 1986. -Vol.51.-№ 2.-P.783-789.

80. Leone, G. Back transmission of a virus associated with apple stem pitting and pear vein yellows from Nicotiana occidentalis to apple and pear / G. Leone, J.L. Lindner, G. Jordedijk, F.A. van der Meer // Acta Hort.-1995.- № 386.-P.72-77.

81. Leone, G. Symptoms on apple and pears indicators after back transmission from

82. Nicotiana occidentalis confirm the identity of Apple stem pitting virus with Pear vein yellows virus / G. Leone, J.L. Lindner, F.A. van der Meer, C.D. Schoen // ActaHort.- 1998.-№ 472.-P.61-65.

83. Lister, R.M. Apple stem grooving virus / R.M. Lister // CMJ/AAB Descriptions of Plant Viruses. 1970.-№ 31. - P. 5.

84. Lister, R.M. The purification, characterization and serology of filamentous apple viruses / RM. Lister // Proceeding XIII th European Symp. Fruit Tree Virus Diseases, Bordeaux.- 1970. P. 365 - 371.

85. Lister, R.M. Apple chlorotic leaf spot virus / R.M. Lister // CMI/AAB Description of Plant Viruses 1970- № 30-P. 4.

86. Lopez, M.M. Innovative tools for detection of plant pathogenic viruses and bacteria / M.M. Lopez, E. Bertolini, A. Olmos, P. Caruso, M.T. Gorris, P. Llop, R. Penyalver, M. Cambra // Int Microbiol.- 2003. V. 6.- P. 233-243.

87. Mackenzie, D.J. Improved RNA extraction from woody plants for the detection of viral pathogens by reverse transcription polymerase chain reaction / D.J. Mackenzie, M.A. Melean, S. Mukeyi, M. Geen // Plant Disease. 1997. - Vol. 81 -P. 222-226.

88. Machita, J. Reactions of the Malus hope hens is to the inoculation of causal viruses of apple top working disease / J. Machita // Bull. Aomori Apple Exp. Sth. -1995.-№28.-P. 77-91.

89. Magome, H. Molecular variability of the genomes of Capiloviruses from apple, Japanese pear, European pear, and citrus trees / H. Magome, N. Yoshikawa, T. Takahashi, T. Jto, T. Miqakawa // Phytopathol. 1997. - Vol.87.- № 4. - P. 389 -396.

90. Marinho, V.L. Detection of apple stem grooving virus in dormant apple trees with crude extracts as templates for one-step RT-PCR / V.L. Marinho, J. Kummert, G. Raffard, D. Colinet // Plant Disease. 1998. - Vol. 82 - № 7. -P.785 - 790.

91. Martelli, G.P. Foveavirus, a new plant virus genus / G.P. Martelli, W. Jelkmann //Arch. Virol.- 1988.-Vol. 143.-№ 6.-P. 1245-1249.

92. Martelli, G.P. Trichovirus, a new genus of plant viruses / G.P. Martelli, T. Candresse, S. Namba//Arch. Virology.-1994.- Vol. 134.-P. 451-455.

93. Martelli, G.P. Classification and nomenclature of plant viruses: state of the art /

94. G.P. Martelli//Plant Dis.-1992.-Vol. 76.-P. 436-441.

95. Martelli, G.P. Vitivirus, a new plant virus genus / G.P. Martelli, A. Minafra, P. Saldarelli // Arch. Virology.-1997.-Vol. 142.-P. 1929-1932.

96. Minoiu, N. Diagnosticul unor virusuri latente le mar prin technica ELISA lu forfataza / N. Minoiu, K. Pattantyus, E. Cardei, M. Hatman, E. Zemcic // ICPP Patesti-LucrariStiintifice.-1995.-Vol. 18.-P. 317-323.

97. Milicic, D. Important plant virus diseases in Yugoslavia / D. Milicic // Zecz. Probl. Post. Nauk Roln. 1980. - № 244. - P. 9 - 24.

98. Murphy, F.A. Virus Taxonomy; 6th Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses / F.A. Murphy, C.M. Fauguet, D.H. Bishop, S.A. Ghabrial, A.W. Sarvis, G.P. Martelli, M.A. Mago, M.D. Summers // Arch. Virol. 1995. -suppl. 10.

99. Nemchinov, L. PCR-detection of apple stem pitting virus from pome fruit hosts and sequence variability among viral isolates / L. Nemchinov, A. Hadidi, F. Faggioli // Acta Hort.- 1998.- № 472,- P. 67-73.

100. Novacky, A. Peroxidase isozymes in virus-infected plants/ Novacky A., HamptomR.E. //Phytopathology. 1968. -V. 58,-№ 3.-P. 301-305.

101. Paunovich, S. Double-stranded RNA associated with fruit deformation of quince / S. Paunovich // Acta Hort.- 1995.- № 386,- P. 45-50.

102. Paunovic, S. Relationship between quince fruit deformation virus and some pome fruit viruses / S. Paunovic, M. Rancovich // Acta Hort.- 1998 № 472.-P. 125-133.

103. Paunovic, S. Characterization of a virus associated with Pear stone pit in cv. Wuttemberg / S. Paunovic, V. Maksimovic, M. Rancovic, S. Radovich // J. Phytopath.- 1999.-Vol. 147.-№ 11-12.-P. 695-700.

104. Polak, J. Diagnosis and distribution of apple chlorotic leaf spot virus in pomefruits in the Czech Republik / J. Polak, J. Zieglerova, J. Bouma // Zahradnictvi -1997. -R. 24.- № 3. S. 89 - 94.

105. Real-Time PCR- 2002., http://www.lytech.ru/Inform/pcrmethod.htm

106. Reynolds, J.E. Comparison of flowering crab apple varieties for fast detection of a common latent viruses in apples / J.E. Reynolds // Plant Dis. Rep 1962 - Vol. 46.-№4.-P. 243-245.

107. Rosner, A. Evaluating the use of immunocapture and sap-dilution PCR for the detection of Prunus necrotic ringspot virus / A. Rosner, Y. Shiboleth, S. Spiegel, L. Krisbai, M. Kolber//ActaHort. 1998. -№ 472. -P. 227-233.

108. Rowhani, A. Development of a detection system for viruses of woody plants based on PCR analysis of immobilized virions / A. Rowhani, M.A. Maningas, L.S. Lile, S.D. Daubert, D. A. Galino // Phytopath. 1995.- № 85. - P. 347-352.

109. Roy, A.S. Plum pox situation in Europe / A.S. Roy, J.M. Smith // Bulletin OEPP/EPPOBulletin. 1994. - Vol. 24 .-P. 515-523.

110. Saksena, K.N. Purification and properties of apple chlorotic leaf spot virus / K.N. Saksena, G.I. Mink//Phytopathology.-1969.-Vol. 59.-P.84-88.

111. Schwarz, K. Detection and characterization of European apple stem pitting virus isolates of apple and pear by PCR and partial sequence analysis / K. Schwarz, W. Jelkmann // Acta Hort.- 1998.- № 472,- P. 75-85.

112. Sequeira, C.A. Studies on a virus causing stem grooving and graft-union abnormalies in Virginia crab apple / O.A. Sequeira // Annal. appl. Biol. 1967. -Vol.60.-№ 1.-P. 59-66.

113. Sequeira, C.A. Application of latex fluctuation serological testing to apple viruses / C.A. Sequeira, R.M. Lister // Phytopathology. 1969. - Vol.59.- № 4. -P. 572-574.

114. Semancice, J.S. Partial purification of mechanically transmissible virus associated with tatter leaf of citrus / J.S. Semancice, L.G. Waethers // Phytopathology.-1965.-Vol. 55.-P. 1354- 1358.

115. Simons, T.J. Metabolic changes associated with systemic induced resistance to tobacco mosaic virus in Samsun NN tobacco // Phytopathology. 1971. - V. 613.-P. 293-300.

116. Sweet, J.B. Virus Diseases of some ornamental and indigenous trees an Britain / J.B. Sweet // Acta Hort.- 1976. № 5. - P.83-92.

117. Takahashi, T. Apple stem grooving virus isolated fromJapanese apricot (Prunus mumi) imported from China / T. Takahashi, N. Saito, M. Geto, A. Kawai, S. Namba, S. Jamashita // Res. Bull. Plant Prot Serv. Japan. 1990. - № 26 - P. 15 -21.

118. Thomas, H.Z. Virus diseases of apple / H.Z. Thomas // Hilgaria. 1961- Vol. 31.-№ 13—P. 435 -457.

119. Thomsen, A. Micropropagation and plant health / A. Thomsen // Combined Proceedings Int. Plant Propagators Society.- 1992.-Vol. 42.-P. 180-182.

120. Tomary, K. A proposal concerning agricultural pesticides in the twenty-first centuri: antiviral agent for plants / K. Tomary // Jap. Pest. Inf. 1987.- Vol. 50-P. 13-15.

121. Torrance, L. Development in serological methods to detect and identify plant viruses / L. Torrance // Plant Cell. Tissue and Organ Culture. 1998. - Vol. 52. -P. 27-32.

122. Torres, M. A. Reactive oxygen species signaling in response to pathogens/ M. A. Torres, D.G. J. Jonathan, and L. D. Jeffery // Phytopatology.- 1990.- V. 128.-№3.-P. 191-202.

123. Uyemoto, J.K. Apple stem grooving virus: propagating host and purification /

124. J.K. Uyemoto, R.M. Gilmer // Ann appl. Biol. 1971. - Vol. 69. - P. 17 - 21.

125. Varvery, C. Construction and use of a cloned cDNA probe for the detection of plum pox virus in plants / C. Varvery, M. Ravelonandro, J. Dunez // Phytopathology.- 1987.-Vol. 11.- P. 1221-1224.

126. Varvery, C. Use of 32P-labeled transcribed RNA probe for dot hybridization of plum pox virus / C. Varvery, T. Candresse, M. Cuqusi, M. Ravelonandro, J. Dunez //Phytopathology.-1988,-Vol. 78.-P. 1280-1283.

127. Valentines, M.C. Specific roles of enzymatic browning and lignification in apple disease resistance / M.C. Valentines, Vilaplana R., Torres R., Usall J., Larrigaudi'ere C. // Postharvest Biology and Technology 2005. - V. 36. - P. 227-234.

128. Voiler, A. The detection of viruses by enzyme-linked immunosorbent assay (ELJSA) / A. Voiler, A.Bartlett, D.E. Bidwill, M.F. Clark, A.N. Agams // J. Gen. Virol. 1976. - Vol. 33.-№ 1. - P. 165 - 167.

129. Waterworth, H. Dark green epinasty of chenopodium quinoa, a syndrome induced by a virus latent in apple and pear / H. Waterworth, R.M. Gilmer // Phytopathology. 1993. - Vol. 5. - P. 334 - 338.

130. Wetzel, T. Nucleotide sequence of the 3'-terminal region of the RNA of the El Amar strain of plum pox potyvirus / T. Wetzel, T. Candresse, M. Ravelonandro, R.P. Delbos, H. Mazyad, A.E. Aboul-Ata, J. Dunez // J. Gen. Virol 1991.- Vol. 72.-P. 1741-1746.

131. Wetzel, T. A highly sensitive immunocapture polymerase chain reaction method for plum pox potyvirus detection / T. Wetzel, T. Candresse, G. MacQuaire, M. Ravelonandro, J. Dunez //J. Virol. Methods. 1992. - Vol. 39. - P. 27-37.

132. Wood, G.A. Elimination of latent apple virus srough growth and yield improvements. // The Orchardist of NZ 1974-Vol. 47 - № 6. - P. 173.

133. Yanase, H. Correlation of pear necrotic spot with pear vein yellows and apple stem pitting and a flexious filamentous virus associated with them / H. Yanase, H. Koganezawa, P.R. Friedlund // Acta Hort.-1989 № 235.- P. 157-158.

134. Yoshikawa, N. Properties of RNAs and proteins of apple stem grooving and apple chlorotic leaf spot viruses / N. Yoshikawa, T. Takahahi // J. Gen. Virol. -1988. Vol. 69. - P. 241-245.

135. Yoshikawa, N. The nucleotide sequence of stem grooving capillovirus genome / N. Yoshikawa, E. Sasaki, M. Kato, T. Takahashi // Virology. 1992. - Vol. 191. -P.98- 105.i ,

136. Zawadzka, B. Observations and preliminary experiments on fruit tree virus diseases in Poland / B. Zawadzka // Zastita Bilja.-1965.- Vol. 16.- P. 513-516.

137. Zawadzka, B. Summer hosts of plum aphids as possible host plants of plum pox (sharka) virus / B. Zawadzka, S. Smolarz // Zesz. Prob. Post. Nauk Roln.- 1978-Vol. 214.-P.43-49.

138. Zawadzka, B. Observations and preliminary experiments on fruit tree virus diseases in Poland / B. Zawadzka // Zastita Bilja -1982,- Vol. 16.- P. 513-516.

139. Zhang, Y. Effects of apple stem grooving virus (ASGV) on growth and peroxidase activity of pear seedlings / Y. Zhang // Chinese journal of applied and environmental biology.- 2003,- V. 9.- Part 6 P. 655-656.