Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Анализ распространения вредоносности, этиологии вирусных и вирусоподобных болезней красной и черной смородины и разработка мер борьбы с ними в средней полосе России

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Анализ распространения вредоносности, этиологии вирусных и вирусоподобных болезней красной и черной смородины и разработка мер борьбы с ними в средней полосе России"

РГ6 од

М!? РОгаШСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОачИСТВЕННШС НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ СЕЛЕКЦИОННО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ САДОВОДСТВА И ПИТОМНИКОВОДСТВА

На правах рукописи

СУРКОВА Ольга Юрьевна

УДК 634.723:632.38

АНАЛИЗ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ВРЕДОНОСНОСТИ, ЭТИОЛОГИИ ВИРУСНЫХ И ВИРУСОПОДОБНЫХ БОЛЕЗНЕЙ КРАСНОЙ И ЧЕРНОЙ СМОРОДИНЫ И РАЗРАБОТКА МЕР БОРЬБЫ С НИМИ В СРЕДНЕЙ ПОЛОСЕ РОССИИ

Специальность: 06.01.II - защита растений от вредителей и болезней

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Москва - 1994

Работа выполнена во Всероссийском селекционно-технологическом институте' садоводства и питомниководства (ВСТИСП) в 1990-1993 г.г.

Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук,

профессор МЕТЛЩКИЙ 0.3.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор ПШЫГЛЯ В.А.

кандидат сельскохозяйственных наук ГОЛОВИН С.Е.

Ведущее предприятие - Республиканская плодопитомническая

станция

Защита диссертации состоится " ■■ .'.,/■•/ ■ .. 1994 г. в 13 часов на заседании специализированного совета К 020.20.01 во Всероссийском селекционно-технологическом.институте садоводства и питомниководства по адресу: II5598, Москва, М-598, Загорье, ВСТИСП, ученый совет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВСТИСП.

Ученый секретарь

специализировав"'"'™ ппорфя

кандидат

Актуальность теш. Черная и красная смородина занимают наибольшие площади из ягодных культур в Нечерноземье и в целом по России. Урожайность насаждений, однако, все ещэ далека от среднемирового уровня не только из-за низкой агротехники, но и массовых потерь продукции от вредителей и болезней, в особенности вирусных. Последние нередко вызывают полное бесплодие пораженных ими кустов уже в первые годы после вступления в плодоношение (Ю.И.Помазков, 1972; H.Krczal,I968; J.Thresh,1971).

В свое время в России были достигнуты несомненные успехи в анализе этиологии реверсии и рябухи черной смородины, терапии от них растений, обнаружении некоторых других вирозов, создание системы производства оздоровленного посадочного материала (Ю.И.Помазков, 1964,1975; В.Г.Трушечкин,1974; В.И.Гладких,1978; А.А.Кузнецова,1982 и др.). Однако эти работы не носили комплексного характера и за последние 10-15 лет были во многом свернуты. Резко Еозросше же объемы межгосударственного и межрегионального обмена неконтролиру-мым, часто неоздоровленным посадочным материалом не могли не сопровождаться интродукцией новых патогенов. Для выявления вирусов смородины в России почти не использовались современные-методы диагностики, в частности иммуноферментный анализ, в связи с чем было упущено массовое поражение растений сокопереносимыми вирусами. Оздоровление смородины ранее в основном ограничивалось использованием метода суховоздушнои термотерапии без детальной отработки применительно к конкретным патогенам. В то же время, хорошо зарекомендовавшие себя на других культурах методы культуры апикальных меристем in vitro, хемотерапии и их комбинирование оставались практически неразработанными.

Цели и задачи исследования. Целью настоящих исследований явилось изучение вирусных и вирусоподобных болезней черной и красной сцородины в средней полосе европейской части России.

В конкретные задачи исследования входило:

- изучить видовой оостав и распространение вирусов в насаждениях черной и красной смородины средней полооы России и прилагающих регионов;

- провести предварительную оценку вредоносности некоторых вирусных болезней черной и красной смородины в условиях средней полосы европейской части России;

■ - уточнить методы диагностики вирусных и микоилазменных болезней черной и красной смородины;

- усовершенствовать способы оздоровления черной и красной смородины от вирусных и шкоплазменных болезней.

Научная новизна исследований. Путем использования комплексного тестирования проведен анализ видового состава и распространенности вирусов в коллекционных и производственных насаждениях черной и красной смородины в 7 областях Российской Федерации. Впервые в России проведена отработка методики иммуноферментного анализа для массового тестирования растения смородины на наличие сокопере-носимых вирусов. Для этого отработана методика отбора средних проб, определены сроки проведения анализов, усовершенствованы экстрагирующие буферы. Применительно к местным условиям усовершенствован индикаторный метод диагностики основных вирозов смородины. Определены оптимальные сроки и способы проведения тестирования на древесных растениях-индикаторах. Выявлен новый высокоэффективный индикатор для диагностики реверсии черной и красной смородины. Оценена эффективность различных травянистых индикаторов и стабилизирунцих веществ в составе экстрагирующих буферов для диагностики сокопере-носимых вирусов. Исследована природа ряда вирусоподобных аномалий красной и черной смородины. Впервые в России оценена эффективность метода культуры апикальных меристем и его сочетания с суховоздуш-ной термотерапией в оздоровлении растений смородины от возбудителей реверсии, желтухи, НЕПО-вирусов. Впервые, в культуре тканей смородины проведено испытание 7 препаратов-ингибиторов вирусов. Заложен многолетний полевой опыт по оценке вредоносности для черной смородины реверсии,желтухи и окаймления жилок.

Практическая значимость работы. Отработаны методические аспекты проведения иммуноферментного анализа и биотестов на травянистых и древесных растениях-индикаторах для массового тестирования растений смородины на наличие вирусов. Разработана улучшенная технология оздоровления смородины от вирусов. Получены безвирусные растения 4 сортов смородины.

Апробация работы. Полученные автором результаты работы доложены во ВСТИСП на заседаниях ученого совета и секции ягодных культур в 1991,1992,1993 годах, а также на конференции молодых ученых ТСХА в 1992 г.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликованы две статьи.

Объем работы. Диссертационная работа изложена на ¿¿^У страницах машинописного текста, содержит У с таблиц, fd^ рисунков, фотографий, состоит из введения, 5 глав, выводов, рекомендаций производству иЛО приложений. Список литературы включает W/ наименований, в т.ч. /// иностранных.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава представляет собой сводку мировой литературы по затрагиваемой проблеме. Большое внимание уделено видовому составу и распространенности вирусов смородины в России, странах СНГ и Европы. Проанализированы зарубежные данные по вредоносности вирусных и ми-коплазменных болезней культуры. Проведен критический анализ методов диагностики вирусов на смородине и способов оздоровления от них этой культуры, обсуждены пути их совершенствования.

ШАБА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ .

Исследования проведены на базе лаборатории вирусологии ВСТИСД. Для оценки зараженности вирусами обследованы также коллекционные, селекционные и производственные насаждения черной и красной смородины в 13 хозяйствах 7 областей России (табл.1,2). Отобранные образцы растений смородины после доставки во ВСТИСП подвергали параллельному тестированию с цомощью иммуноферментного анализа (ИФА), прививок щитком коры на древесные растения-индикаторы и инокуляции соком травянистых растений-индикаторов.

При проведении ИФА по методу сэндЕич-варианта ( м.Clark, A.Adams, 1977) с регистрацией результатов на автоматическом абсор-бциоыетре "Динатек" при длине волны 405 нм использовали диагностические сыворотки к вирусам латентной кольцевой пятнистости земляники (ВЛКПЗ), мозаики резухи (BMP), черной кольчатости томата (ВЧКТ), кольцевой пятнистости малины (ВКПМ) - из Института микробиологии РАН; к вирусам огуречной мозаики (ВОМ), табачной мозаики (ВТМ), аспермии томата (ВАТ) - из Института прикладной биохимии Эстонии и к У-вирусу картофеля - НИИ картофеля, а также с наборами на основе моноклональных антител к BOM, BMP и ВАТ из Института биоорганической химии РАН.

В качестве стабилизаторов инфекционнооти вирусов в соке растений при проведении ИФА испытывали поливиншширролидон (ДШ, м.в. 10000, "Serva" ) и 1% бычий сывороточный альбумин (м.в. 67000, "Serva " ) в фосфатном буфере, рН 7,5. Оценивали пригодность длА анализа листьев разного возраста, вегетатившк и генеративных почек смородины.

Биотест на травянистых растениях-индикаторах ( Chenopodium qui-noa L., Nicotiana tabacum Ь. cv.Xantii, Samsun, N.chlevelandii Gray, N.rustica L., N.glutinosa Ь., Gomphreng globosa L,.Phaseolus vulgaris, проводили по методике Г.Кляйнхешеля ( H^Kleinhempei, 1968). Для стабилизации вирусов в соке растений смородины и травянистых индикаторов применяли никотин-основание (НО), м.в. 162,2, "Serva" ), поливинилпирролидон (ПШ, м.в. 10000, "Serva" ), полиэтиленгли-коль (ПЭГ, м.в. 6000, "Serva" ) и диэтилдитиокарбомат натрия (ДИЕКА, м.в. 225,3, "Serva" ).

Для отработки диагностики возбудителей окаймления жилок крыжовника, желтухи и реверсии использовали стандартные растения-индикаторы черной смородины Амос Блэк и красной - Голландская красная, которые в 3-6-кратной повторности рано весной (март) или в конце лета (август) прививали щитком коры зеленых и одревесневших побегов, почками, верхушками побегов. Для идентификации реверсии испытывали также здоровые растения сортов Вологда, Катюша, Одаебьен, Йонкхер ван Тете и их сеянцы.

Предварительную оценку вредоносности реверсии, желтухи и окаймления жилок для растений черной смородины сортов Загадка и Наследница после искусственного заражения проводили на лабораторном участке отдела защиты растений ВСШСП в I99I-I993 г.г. по числу образовавшихся побегов, их приросту, воличеству завязей.

При изучении режимов оздоровления растений смородины от вирусов использовали суховоздушную термотерапию при 37-38°С на протяжении 20,30,40,60 и 75 суток в переоборудованном инкубаторе "Универ-сал-50". По окончании экспонирования срезали верхушки побегов,око-реняли в условиях искусственного тумана и тестировали.

Иэристоматические верхушки растений смородины культивировали in vitro по В.А.Высоцкому и др. (1976). В качестве антивирусных препаратов в этих культурах меристем испытывали никотиновую кислоту, интерферон, циаяогуащщин, рифастин, ридостин, биназу. Препараты.

вводили в питательные среды на всех этапах культивирования. Полученные регенеранты адаптировали к нестерильным условиям и тестировали методом ИФА и на древесных индикаторах.

Цифровые данные подвергали дисперсионному анализу с использованием многократного t-критерия Дункана (Т.Литтл,Ф.Хиллз,1981).

Автор выражает благодарность зав.лабораторией вирусологии ВСТИСП кандидату с.-х.-наук Ю.Н.Приходько за консультативную помощь при проведении исследований.

4

ГЛАВА 3. АНАЛИЗ ВИДОВОГО СОСТАВА, РАСПРОСТРАНЕНИЯ И ВРЕДОНОСНОСТИ ВИРУСОВ КРАСНОЙ И ЧЕРНОЙ СМОРОДИНЫ

Результаты обследования насаждений. В ходе проведенных в 19901993 г.г. маршрутных обследований насаждений черной и красной смородины констатировано широкое распространение реверсии, в особенности в селекционных посадках и на госсортоучастках (табл.1, 2). Селекционная коллекция красной смородины ВСТИСП была на 50$ поражена этой болезнью, причем чаще всего ее вирулентным штаммом, вызывающим серьезные деформации цветков и редукцию листовых пластинок. Зараженность реверсией коллекций красной и черной смородины Ленинградской ПООС составила 22 и 73$ соответственно. Таким образом, красную смородину нельзя более считать устойчивой к реверсии.

Широко распространенными оказались и НЕПО-вирусы, их присутствие можно было предварительно Диагностировать по наличию на •листьях различных желтых и желто-зеленых пятнистостей, крапчатос-тей, хлоротических пятен и колец, но чаще всего заражение смородины было латентным.

Иммуноферментным анализом отобранных образцов красной смородины выявлено широкое распространение вируса латентной кольцевой пятнистости земляники (ВЛКПЗ),. причем в насаждениях Ленинградской ПООС и селекционного участка ВСТИСП он отмечен на 55 и 35$ сортов соответственно. Несколько реже встречались вирусы мозаики резухи (BMP) и черной кольчатости томата (ВЧКТ)',' хотя зараженность ими сортов красной смородины в раде хозяйств достигала почти 50$. Наличие ви-руоа кольцевой пятнистости малины (ВКПМ) отмечено только во ВСТИСП (на 75$ сортов) и Ленинском ГСУ Московской области (на 65$).

На черной смородине из НЕПО-вирусов наиболее распространенным оказался ВЧКТ,который встречался в 8 хозяйствах из 9 обследованных. Широко распространены были также ВЛКПЗ и BMP, причем зараженность

Таблица I

Зараженность вируоаш оортообразцов красной смородины в оболедоваяных насаждениях средней полосы России и сопредельных регионов

Облаоть, хозяйство :Тип на- :сааде- :нийх) ;Оценено ;сортооб- :разцов влкпз Из них ( в % ) Заражено 1 вмр :вчкт ■: • • • вкпм :Ревер-:сия Не заражено

Московская, ОПХ "Центральноеп Сел. 20 35 0 0 80 50 0

Московская, ВСТИСП СЭМ 8 0 0 0 0 0 100

Московская, ВСТИСП Ж 2 0 0 0 0 0 100

Московская, ВСТИСП пп 2 50 50 50 0 0 0

Московская, Ленинский ГСУ пп 14 7 7 36 64 7 0

Ленинградская, Ленинградская ПООС Сел. 18 56 50 44 о- 22 17

Кировская, Кировский ГСУ пп 3 67 33 0 0 0 0

Кировская, оовхоз "Ягодный" эм 3 33 0 0 0 0 33

Тульская, Тульокий ГСУ пп 4 0 0 0 0 _хх) 100

Тамбовская, ВНИИС им.Мичурина Сел. 18 6 0 0 0 6 33

Самарокая, "Самарская ЗОСС Сел. 3 0 0 0 0 0 100

В среднем: 95 23 13 12 13 8 44

Пшшечание: х) СеЛ- _ селекционная коллекция; СЭМ - оуперэлитный маточник; ЭМ - элитный маточник; Ш1 - плодоносящая плантация.

хх) Реверсию не учитывали.

Таблица 2

Зараженность вирусами сортообразцов черной смородины в обследованных насаждениях средней полооы Роосии и оопредельных регионов

Область, хозяйство

Оцене-: но оор:-тооб- :-разцов:ВЛКПЗ

Из них ( в % ) Заражено:"

ВМР

вчкт

вш

--:Не за-

Ревер-:ражено сия :

Московская, СЛХ "Центральное" Сел.

Мооковокая, ВСШСП " СЭМ

Московская, ВСТИСП ЭЫ'1990 г.

Московская, ВСТИСП ЭМ 1995 г.

Московская, ВСТИСП ЛП

Московская, Ленинокий ГС7 Ш

Ленинградская, Ленинградская ПООС Сел.

Кировокая, Кировокий ГЗУ Ш

Кировская, совхоз "Ягодный" ЭМ

Тульская, Тульский ГСУ ПП

Орловская, ВНИИСПК Сел.

Тамбовская, ВНИИС им.Мичурина Сел.

Самарская, Саыарокая ЗОСС Сел.

25

5 4 4 4 19

15

7

6

8 14 35

16

8

О

О , 100 о 21

20

71

О

О О .20 31

12

О О О

о 16

13

43 17

38

О

О

44

24

О

О

О

О

5

7

57 33

О

21

3

6

28

О

О

50.

О

42

О О

О

21

О

25

36

О

О

О

О

О

73

О

33

_хх)

XX)

36 100 100 о 100 31

14

О

63

14

26 7 О 25

В ореднем: ~ 159 21

х) См.спиоки к таблице I. Примечание:**) Исследования на реверсию не проводили.

14 12

13

15

30

I

03 I

BMP сортов смородины на Самарской ЗОСС достигала 44%, а ЕПКПЗ в Кировском ГСУ - 71%. ВКПМ был зарегистрирован в четырех точках с наибольшей встречаемостью в Ленинском ГСУ (42$ зараженных сортов). Достоверность выявления НЕГО-вирусов методом ИФА в целом раде случаев была подтвервдена результатами тестирования на травянистых индикаторах.

С помощью ИФА нами также выявлено 12-50$ заражение растений смородины во ВСТИСП вирусами аспермии томата, огуречной и табачной мозаик. Образцы с высокой концентрацией этих вирусов обычно характеризовались и высоким показателем Ар/Ад для НЕПО-вирусов, поэтому нельзя было исключать возможность перекрестных реакций сывороток* с гетерологичными антигенами. Повторный анализ этих образцов с помощью высокоспецифичных к ВОМ и ВАТ моноклональных антител,однако, не подтвердил первоначальный диагноз.

Почти во всех насаждениях красной смородины, но с относительно невысокой частотой встречаемости, был выявлен и идентифицирован на древесных индикаторах вирус окаймления жилок крыжовника (ВОЖ). В Кировском ГСУ, совхозе "Ягодный" Кировской области и ОПХ "Сокское" Самарской ЗОСС на посадочном материале из Сибири отмечено наличие рябухи.

В ходе комплексного исследования природы ряда вирусоподобных аномалий установлено', что встречающиеся симптомы посветления главных жилок листа хлоротического узора по жилкам в виде "дубового листа", зеленой кралчатости и желтухи развиваются на начальной стадии заражения реверсией, что является косвенным показателем многообразия штаммов возбудителя этой болезни. Однако в нескольких других случаях симптомы желтухи были вызваны заражением другим патогеном, очевидно- одноименным вирусом желтухи черной смородины. Константировано также; что симптомы желтой кралчатости в сочетании с изменением формы листьев вызывает ВКПМ, а . межжилковый хлороз вместе и окаймлением мелких жилок возникает в результате комплексного заражения смородины вирусом окаймления жилок и одним или несколькими НЕПО-вирусами.

Оценка вредоносности основных вирусных болезней. В полевом опыте после инокуляции растений смородины двух сортов изолятом I возбудителя реверсии на сорте Загадка уже в 1992 г. были отмечены желтуха, изменение формы листа, первые махровые цветки и угнетение

роста. В 1993 году побегообразований ослабло, завязи на кустах не формировались. На сорте Наследница этот изолят в 1993 году ослабил рост кустов на фоне определенной его стимуляции в 1992 году, но не затронул генеративные органы растений (табл.3).

Таблица 3

Влияние заражения реверсией, желтухой и окаймлением жилок на рост и образование завязей у растений черной смородины двух сортов в 1993 году

Сорт

Заболевание

; Число '.Средняя; Число ; Прирост ¡побегов¡длина ;завязей¡побегов ;в сред-:однолет;в сред-;(в %) к :нем на :него ¡нем на ¡преды-¡1 рас- ¡побега,-I рас- -дущему •тение • см :тение :году

Контроль 20,6 35,8 48,5 467,2

Реверсия(изолят I) 15,0 31,0 0,5 442,4

Загадка Желтуха 16,3 34,2' 7,8 364,5

Окаймление жилок 25,0 37,6 37,2 598,2

НСР005=26,0

Контроль 16,7 39,6 92,1 598,2

Реверсия(Изолят I) 19,8 31,8 75,0 281,9

Наследница Реверсия (изолят 2) 14,0 42,0 118.5 412,9

Желтуха . 26,8 29,9 157,8 329;8

НСР005=5,3 НСРтн=6,1

005"

Ранее аналогичную стимуляции и последующее ингибирование роста у устойчивого сорта было отмечено в Англии (а.тьгевЬ, 1971), а быстрое проявление видоизменения генеративных органов со снижением урожая уже в первые годы плодоношения у восприимчивых сортов наблюдали в ФРГ (н.Кгсга!., 1976). Очевидно, в последующие годы

должно произойти снижение урожая и выносливого сорта Наследшшл как это наблюдали за рубежом.

Вирус окаймления жилок пока на оказывал существенного влияния на рост побегов смородины, хотя и привел к снижению в пределах' ошибки числа завязей.

ГЛАВА 4. УТОЧНЕНИЕ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ И МИКОПЛАЗМЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЧЕРНОЙ И КРАСНОЙ СМОРОДИНЫ

Уточнение методов диагностики сокопереносимых вирусов.

Серией опытов установлено, что для первичного выделения и диагностики НЕПО-Еирусов на травянистых индикаторах в качестве стабилизаторов инфекционности вирусов в соке зараженных растений смородины наряду с никотин-осноЕанием (НО) можно использовать поливинилпирро-лидон (ПШ), полиэтиленгликоль (ПЭГ) и ДИЕКА. ПШ приводит, однако, к запаздыванию проявления симптомов на растениях-индикаторах в сравнении с никотиноснованием.

При сопоставлении нескольких традиционных растений-индикаторов было установлено, что в случае НЕПО-вирусов на смородине растения c.quinoa, несомненно, превосходят другие травянистые индикаторы в плане развития симптомов. Однако дня накопления этих вирусов предпочтительнее всего использовать растения Ph.vilgarus, N.chlevelan-dii u N.glutinosa.

Параллельное тестирование заведомо зараженных растений краоной и черной смородины на с. quinoa и методом ИФА показало довольно высокую степень соответствия двух методов (в пределах от 50 до 78$). Однако чувствительность ИФА, несомненно была более высокой, поскольку позволяла выявить вирусы в бессимптомных растениях травянистого индикатора.

В целях отработки методики ИФА для массового тестирования .растений смородины мы оценили содержание вирусов в листьях различ-. ного возраста, вегетативных и генеративных почках и пришли к предварительному заключению о приуроченности ВМР к молодым, а ВКПМ - к более зрелым листьям и принципиальной возможности использования для ИФА усредненных проб обоих типов почек. Подобраны оптимальные буферы для экстрагирования ВМР из вегетативных и генеративных почек.

Оптимальным сроком выявления НЕПО-вирусов с помощью ИФА признан период начала вегетации (февраль-март в теплицах; конец апреля - май в открытом грунте Подмосковья). В зимних теплицах юстирование возможно и в период второго незначительного увеличения концентрации БМР и ВЧКТ во вторую волну активного роста смородины в середине мал, а в открытом грунто в прохладную и дождливую погоду - в начало осени (сентябрь). В июле-августе концентрации НЕПО-вирусов

в явно зараженных ими растениях снижались ниже порога чувствительности ИФА. Тестирование в это время констатировало ложное отсутствие инфекции.

Уточнение методов диагностики механически непередащихся вирусов. Для уточнения методов диагностики реверсии и желтухи на древесных растениях-индикаторах сравнивали различные сроки и способы индикаторных прививок. Хорошую приживаемость прививок и воспроизводимость симптомов обеспечили прививки щитками зеленых побегов, почками и верхушками побегов, худиую - прививки щитками одревесневших побегов. Предпочтение следует отдать прививке щитком коры зеленого побега как наименее трудоемкой.

Для диагностики реверсии установлена пригодность как весеннего (март), так и позднелетнего (август) сроков прививки. При летнем сроке латентная фаза реверсии сокращалась и ее симптомы проявлялись уже весной следующего года. Выявлена перспективность использования в качестве нового стандартного древесного индикатора реверсии выведенного во ВСТИСП сорта черной смородины Катюша. Этот индикатор позволял эффективно выявлять реверсию как на черной, так и на красной смородине. Вирус окаймления жилок крыжовника на красной смородине достаточно эффективно выявляли традиционные индикаторы Йонкхер ван Тете и Голландская красная, но не индикаторный клон крыжовника (сеянец сорта Финик).

• ГЛАВА 5. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СПОСОБОВ ОЗДОРОВЛЕНИЯ РАСТЕНИЙ КРАСНОЙ И ЧЕРНОЙ СМОРОДИНЫ ОТ ВИРОЗОВ

Нами осуществлена комплексная работа по отработке технологии оздоровления смородины от вирусов с помощью методов суховоздушной термотерапии, культуры меристематических верхушек и хемотерапии in-vitro. Для большинства избранных объектов такие исследования проведены впервые; поскольку ранее сообщалось лишь о разработке способа подавления реверсии с помощью суховоздушной термотерапии (Ю.И.По-мазков,1969,1975) и о возможности элиминирования БКПМ в культуре меристем красной смородины (P.Krodstrup,A.Thomsen,I985).

Совершенствование способов оздоровления от реверсии и желтухи.

Нами подтверждена эффективность суховоздушной термотерапии против возбудителя реверсии. Впервые проведено испытание данного . приема против имеющегося иэолята вируса желтухи черной смородины. Продемонстрирована возможность подавления этого патогена на основе

использования достаточно мягкого режима (22 дня при температуре 37-38°С). В то же время, показано, что использование меристематиче-ских верхушек величиной 0,5-1,0 мм не гарантирует оздоровления растений смородины от реверсии и желтухи. Это противоречит сложившемуся мнению о сравнительной простоте терапии реверсии.

В единственном эксперименте отмечено эффективное подавление цианогуанидоном (в концентрации 100 мг/л) возбудителя желтухи и культуре тканей черной смородины. Однако полного ингибирования реверсии с помощью этого препарата достигнуто не было.

Совершенствование способов оздоровления от НЕПО-вирусов.

Впервые в эксперименте по оценке эффективности суховоздушной термотерапии против НЕПО-вирусбв на черной смородине установлено, что прогревание в течение 22, 38 и 58 дней эффективно инактивирует эти патогены в верхушках побегов. Однако они, несомненно, сохраняются в более старых расположенных ниже тканях и при продолжении » термообработки (до 75 дней) вновь'начинают размножаться и достигают верхушек побегов. Это было явственным в случае ВЧКТ и в меньшей степени - BMP и ВКПМ. Выявленные факты адаптации вирусов ранее отмечены не были и имеют важное значение для методологии борьбы с этими пластичными фитопатогенами.

В последующих экспериментах по сочетанию термотерапии и культуры апексов также отмечена тенденция увеличения резистентности НЕПО-вирусов к термотерапии при экспозиции в 43 дня и более. В этом плане использование одной лишь культуры меристеыатических верхушек даже давало лучший эффект, чем длительная термотерапия. Оптимальным же вариантом .оказалось сочетание термотерапии в течение 22-38 дней с последующей культурой апексов прогретых побегов (табл.4). в свою очередь, выход оздоровленных растений находился в обратной зависимости о!г величины экспланта для культуры тканей, что является вполне закономерным. Хотя экспланты величиной 0,5-0,7 мм и обеспечивали неоднократно получение свободных от НЕПО-вирусов регенерантов, но для повышения доли их выхода все же более целесообразно использовать меристематические апексы величиной менее 0,5 мм.

Впервые установлена обратная зависимость между продолжительностью культивирования микрорастений in vitro и выходом оздоровленных от НЕПО-вирусов растений. Это означает, что вычленяемые меристематические верхушки, несомненно, содержат эти вирусы, но

- -

Таблица 4

Влияние предшествующей термотерапии и величины экспланта на оздоровление in vitro растений черной смородины от НЕПО-вирусов (сорт Черная Лисавенно)

Продолжительность термотерапии (сут.) Пип энсп-Гланта х) Номер пассажа ag/ajj для вирусов: вмр : вчкт : вкпы .

0 4 1,7 2,3 1,9

Л 5 2,8 2,4 2,3

6 3,0 2,3 2,1

22 Л 4 1,2 1,2 1,3

5 1,7 1,7 2,4

6 1,9 1,0 0,7

а 4- 2,1 2,1 2,0

38 Л 4 1,4 1,1 1,2

5 1,0 1,3 0,8

6 1,4 2,7 2,0

58 Л 4 2,0 1,2 1,7

а 4 2,3 1,5 1,3

х^ Л - меристематичесние Еерхупши латеральных почек (0,2-0,5 мм); А - меристематические верхушки апикальных почек (0,5-0,7 мм).

в низких концентрациях. Затем на протяжении первых 4-х субкультур размножение вирусов идет сравнительно медленно и они не успевают распространиться во все развившиеся и отделяемые для укоренения микропобеги. При более длительном культивировании инфекция, очевидно, становится системной и выход свободных от вирусов растений резко снижается.

Против вирусов смородины в культуре тканей этой культуры наг/л впервые испытаны семь ингибиторов вирусов различного спектра действия. С некоторыми из них (рифастин, ридостин, интерферон) удалось провести лишь ограниченное число экспериментов, что не позволяет делать окончательных еыводое.

Таблица 5

Влияние термотерапии, культуры апикальных меристем и хемотерашш in vitro на оздоровление растений черной смородины от НЕПО-вирусов (сорт Черная Лисавенко, величина эксплантов 0,2-0,4 мм)

Длительность термотерапии (сут.) : Йомер '.пассажа : Препарат ;Концентра-;ция ABU, : иг/л •: Число адап; :тированных: ;регенеран-;-; тов Результаты ИФА (AVA,.) вирусов: для

\ HJP : вчкт : вкпм

6х) Без препарата _ 3 3,0 2,3 2,1

0 Цианогуанидин 100 5 1.9 2,0 2,2

дгт 100 3 2,3 2,1 1.9

grx) Без препарата - 9 1,7 1.7 2.4

22 Цианогуанидин 100 2 1.2 1.5 2,1

Цианогуанидин 200- I 1,1 0.7 0,8

дпг 100 I 2,1 0.7 0,7 .

6Х) Без препарата' - 8 1.9 1.0 0,7

Цианогуанидин 100 2 2,2 1.7 1.3

дгт 100 4 2,1 1.3 1.4

АВП вводили в питательную ореду для микроклонального размножения в 6 пассаже; регенеранты через 60 дней пересаживали на среду для укоренения микропобегов без АВП и затем адаптировали к неотерильным условиям.

АВП вводили в питательную ореду для укоренения микропобегов в 5 пассаже культивирования; через 60 дней регенеранты адаптировали к нестерильным уоловиям.

х) хх)

Более детально изученные препараты ДГТ и цианогуанидин оказывали определенное ингибирующее действие на НЕПО-вирусы, что выражалось в снижении концентрации последних (табл.5 ). Однако либо уже в следующих субкультурах in vitro, либо спустя некоторое время после адаптации растений к нестерильным условиям, это действие снималось. По всей видимости, однократного применения этих препаратов недостаточно для надежного ингабироЕания НЕПО-вирусоЕ. В сеязи с отсутствием какого-либо видимого фитотоксического действия этих препаратов на микрорастения, в дальнейшем целесообразно испытать' их более высокие концентрации.

"Перспективным представляется также одновременное или последовательное применение препаратов различного спектра действия. Интересные в этом плане установленные нами факты пролонгирования инги-бирования вирусов при совместной обработке ДГТ и никотиноеой кислоты, а также повышение эффективности биназы на фоне применения в предшествующей субкультуре цианогуанидина. ' '

Стабильного избирательного действия ДГТ и цианогуанидина на какой-либо изучаемый вирус НЕПО-гругшы.не отмечено.

Проведенные эксперименты, таким образом, показали несомненную перспективность дальнейшей разработки метода хемотерапии вирусов в культуре тканей смородины.

ОБЦИЕ ВЫВОДЫ :

1. Вирусные болезни обнаружены во всех обследованных насаждениях черной и красной смородины в 6 областях Российской Федерации, за исключением питомников и маточников высших категорий оздоровления. Первоисточником распространения вирозов служат селекционные коллекции и сортоиспытательные участки.

2. Реверсия по-прежнему широко распространена на черной смородине и выявлена на отдельных сортах красной смородины в большинстве обследованных коллекций. Повсеместно встречаются НЕПО-вирусы, с преобладанием вируса латентной кольцевой пятнистости земляники,

а затем - вирусов мозаики резухи и черной кольчатости томата. Вирус кольцевой пятнистости малины выявлен на смородине лишь в Подмосковье. Вирус окаймления жилок крыжовника достоверно идентифицирован лишь на красной смородине. Предварительные результаты

ИФА свидетельствуют о большой вероятности заражения обеих культур вирусами астермии томата, огуречной и табачной мозаик. Констатированы случаи завоза рябухи черной смородины из Сибири.

3. В условиях полевого опыта, на третий год послб искусственного заражения двух сортов черной смородины, возбудитель реверсии Еызывал, в зависимости от сорта, редукцию либо роста, либо образования завязей, а вирус желтухи - угнетение роста у обоих сортов и снижение числа завязей у сорта Загадка. Влияние вируса окаймления жилок но было статистически существенным.

4. С помощью ИФА и тестирования на древесных и травянистых индикаторах исследована природа ряда вирусоподобных аномалий и черной и красной смородины, и показано, что на первой симптомы зеленой крапчатости, хлоротического рисунка в виде "дубового листа", по-светления главных жилок и, иногда, - желтухи являются ранним проявлением реверсии, а на второй - желтая крапчатость и изменение формы листьев вызывается вирусом кольцевой пятнистости малины;, а меж-жилковый хлороз с окаймлением жилок - совместной инфекцией вирусами НЕПО-грушы и окаймления жилок крыжовника.

5. При диагностике НЕПО-вирусов на травянистых растениях-индикаторах в экстрагирующих буферах наряду с никотин-основанием можно использовать также поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль и ДИЕКА. Поливинилпирролидон оказывает, однако, некоторое ингибирующее действие на размножение вирусов, что проявляется в заметном запаздывании проявления симптомов на индикаторах.

6. Концентрация НЕПО-вирусов в растениях смородины подвержена сезонным флуктуациям и зависит от погодных условий и степени старения листового аппарата, снижаясь в середине лета ниже порога чувствительности ИФА. Оптимальным сроком проведения ИФА является начало вегетации, а при прохладной погоде возможны повторные анализы в конце лета - начале осени. Для выявления НЕПО-вирусов в растениях смородины с помощью ИФА пригодны листья или средние пробы вегетативных и генеративных почек с добавлением бычьего сывороточного альбумина в экстрагирующий буферный раствор.

7. Наиболее технологичным споообом передачи возбудителей реверсии и желтухи на стандартные древесные индикаторы является прививка щитками коры зеленых побегов весной и в конце лета. Наилучшими дрзвасныгли индикаторами реверсии в местных условиях являются

саженцы черной смородины сортов Катюша и Оджебьен, сеянцы последнего и сеянцы красной смородины сорта Йонкхер ван Тете.

8. Суховоздушная термотерапия при 37-38°С достаточно эффективно освобождает верхушки побегов смородины от вирусов НЕПО-группы, реверсии и желтухи при экспозиции 30-38 дней. Дальнейшее увеличение продолжительности термообработки ведет к восстановлению концентрации НЕПО-вирусов во всех тканях обеззараживаемых растений.

9. Подобраны оптимальные размеры вычленяемых меристематичоских верхушек для освобождения смородины от конкретных вирусов. Установлено, что культивирование in vitro свыше четырех-пяти субкультур приводит к значительному росту концентрации НЕПО-вирусов в тканях регенерантов. Эффективность оздоровления от НЕПО-вирусов может быть повышена при сочетании термотерапии продолжительностью до 38 дней

с введением в культуру in vitro эксплантов величиной менее 0,5 мм и их культивированием не более чем в 5 субкультурах.

10. Продемонстрирована принципиальная возможность янгибирова-ния НЕПО-вирусов в культуре тканей черной и красной смородины с помощью препаратов цяаногуанидин, ДГГ, интерферон, ридостин, рифас-тин и биназа. Целесообразна дальнейшая разработка метода хемотера-пии этих вирусов in vitro.

11. Из-за способности вирусов адаптироваться к используемым против них терапевтическим приемам необходимо тестировать нее потомство получаемых мериклонов. Только индивидуальный отбор безвирусных растений с помощью надежных диагностических методов может гарантировать необходимый уровень комплексного оздоровления смородины.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1. Предварительное тестирование растений смородины на наличие сокопереносимых вирусов осуществлять методом ИФА, используя для анализов сборные образцы покоящихся вегетативных и генеративных почек в ранневесенний период, либо молодых листьев в начале вегетиро-вания растений или при прохладной погоде в начале осени в экстрагирующих буферах вместо поливинилпирролидона использовать бычий сывороточный альбумин или сочетание этих препаратов.

2. Для основного тестирования растений смородины применять травянистые и древесные растения-индикаторы и повторный ИФА:

- в качество травянистого индикатора в зимних теплицах с февраля по май использовать chenopodium quinoa, а в экстрагирующие буферные смеси включать одно из следующих веществ: никотин-оо-нование, полившшлпирролидон, полиэтиленгликоль, или ДИЕКА;

- латентную инфекцию реверсии на смородине выявлять путем прививки 3-4 щитков коры зеленых побегов тестируемых растений на каждый индикатор (саженцы сортов Катюша, Оджебьен, сеянцы Оджебьена -.для черной смородины, саженцы сортов Катюша, Голландская красная, сеянцы йонкхер ван Тете - для красной смородины) при продолжительности теста 1-1,5 года.

3. Оздоравливать растения смородины от реверсии-, желтухи и НЕПО-вирусов с помощью суховоздушной термотерапии (30-38 дней при 37-38°С) в отдельночти или в сочетании с культурой in vitro мери-стематических верхушек при величине инициальных эксплантов не более 0,5 мм и продолжительности их культивирования не более 5 пассажей. Полученные в культуре тканей регенеранты тестировать тотально, но не ранее, чем через 7-8 месяцев после их адаптации к нестерильным условиям.

4. На договорной основе в сочетании с законодательным обеспечением практиковать:

- визуальную и при необходимости лабораторную вирусологическую проверку питомнических клонов смородины", на всех этапах их размножения;

- постепенный перевод на безвирусную основу селекционных насаждений и участков сортоиспытания смородины с ведением селекции на вирусоустойчивость в специальных инфекционных; пространственно изолированных насаждениях;

- увеличение объемов проверок и ужесточение санкций за реализацию несертифицированного посадочного материала.

ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ (ЖДУЩИЕ РАБОТЫ:

1. Приходько Ю.Н., Суркова О.Ю. Передача вируса мозаики резухи от СЬепоро<11шп quinoa на индикаторные клош лесной земля-ники//Перспективы отечественного садоводства/Тезисы докладов

II Республиканской конференции молодых ученых специалистов. -Йиев, 1991. - С.24-25.

2. Суркова О.Ю. Вирусные болезни красной и черной смородины. Деп.рукопись ВИНИТИ й 139/65 ВС-1992. 9 стр.