Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Природные и синтетические антикоагулянты и их использование для регуляции клеточной активности
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Природные и синтетические антикоагулянты и их использование для регуляции клеточной активности"

На правах рукописи

РТЬ од

1 Л Л - • I г - •

1 О Г.-.!! '

ХОМЯКОВ ЮРИЙ НИКОЛАЕВИЧ

ПРИРОДНЫЕ И СИНТЕТИЧЕСКИЕ АНТИКОАГУЛЯНТЫ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ РЕГУЛЯЦИИ КЛЕТОЧНОЙ АКТИВНОСТИ

Специальность: 03.00.04. - «биохимия»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2000 г.

Работа выполнена в Московском научно-исследовательском институте медицинской экологии, Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лечения и Государственном научном центре прикладной микробиологии.

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор

Северин С.Е.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Деев С.М.

доктор биологических наук, профессор Киселев В.И. доктор медицинских наук Серебрянная Н.Б.

Ведущая организация:

Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита состоится « » £Цс7Л-$и)( 2000 г. в « / 2ч> часов на заседании Диссертационного совета Д.171.02.01. при Центре медико-биологических и экологических проблем по адресу: 113149, Москва, Симферопольский бульвар, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центра медико-биологических и экологических проблем.

Автореферат разослан 2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук В.В. Отрадиова

о /: Г)

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Нарушение равновесия между свертывающей и противосвертывающей системами крови лежит в основе патогенеза многих заболеваний. Связано это, как правило, с недостаточностью кровоснабжения критического органа и угнетения его функциональной активности. К числу наиболее известных патологий такого рода относятся заболевания сердечно-сосудистой системы и некоторые инфекционные болезни. Кроме того, в поле зрения исследователей находятся митогенные и трансформирующие эффекты факторов свертываемости. Сформировалось представление о связи способности к быстрому росту и распространению в организме клеток различных новообразований с активностью внешнего пути свертывания крови. В этом случае ведущей является роль тромбоцитов и эндотелия.

Эндогенная регуляция множественных биологических эффектов тромбина строго регламентирована и реализуется на различных уровнях, от экспрессии отдельных белковых компонентов и их последующей активации в ходе каскадных взаимодействий между отдельными факторами свертывания до возбуждения специфических рецепторов тромбина и процессов передачи сигнала. Усилия специалистов ведущих научных центров и биотехнологических фирм мира (Maganin Pharmaceutical Inc., Genzyme Molecular Oncology, AEtema и др.) направлены на поиск новых субстанций и разработку препаратов, аналогичных эндогенным веществам. Эффективными для дальнейшего использования оказываются вещества, полученные как в результате химического синтеза (пептиды; производные индола, имидазола, пиридина), так и выделенные из натуральных источников (растения, беспозвоночные, рыбы, опухолевые клетки).

В ходе таких исследований создаются теоретические основы избирательной регуляции клеточной активности; решаются проблемы синтеза новых соединений; разрабатываются новые подходы к выделению, очистке и испытанию биологической активности перспективных субстанций. Настоящая работа находится в русле упомянутых направлений.

Цель диссертационного исследования состояла в изучении молекулярно-клеточных механизмов действия природных и синтетических

антикоагулянтов и обосновании путей их использования для регуляции функций клеток и тканей.

Задачи исследования

Для достижения указанной цели были сформулированы и решены следующие основные задачи:

1. Изучить особенности внутриклеточных изменений, развивающихся в нормальных и опухолевых клетках под действием тромбина.

2. Провести сравнительный анализ морфологии и внутриклеточной динамики нормальных, опухолевых и трансформированных клеток в интактном состоянии и после воздействия различных факторов регуляции клеточной активности.

3. Определить роль тромбининдуцируемых реакций в процессах развития новообразований и нормальных тканей. Обосновать пути эндогенной регуляции множественных биологических эффектов тромбина.

4. Разработать схему получения новых и оптимизировать схему получения известных производных хинолина. Провести синтез и сравнительный токсикологический анализ полученных субстанций в опытах in vitro.

5. Оптимизировать схему получения природного ингибитора тромбина -гирудина из медицинской пиявки; исследовать его эффекты на различных уровнях; протестировать его свойства в сравнении с другими природными антикоагулянтами из медицинской пиявки.

6. Изучить специфические и токсикологические свойства рекомбинантного фактора некроза опухоли-Р и производных фактора некроза опухоли-а в качестве потенциальных регуляторов активности тромбина.

7. Провести сравнительное изучение антикоагуляционных свойств производных хинолина, индола, 10,11-дигидро-5Н-дибенз[Ь, вазелина, 2-оксо-1-пирролидино-2-бутина, камфары, дифенилуксусной кислоты, 4,5,6,7-тетрагидробензтиофена; сульфониламидосодержащих, гидразоносодержащих, гуанидиносодержащих соединений и гирудина. Исследовать возможность регуляции тромбининдуцируемой клеточной пролиферации с использованием указанных субстанций и рекомбинангных цитокинов.

8. В опытах in vivo на моделях мегастазирующих новообразований провести испытание противоопухолевой эффективности антикоагулянтов и рекомбинантных цитокинов.

Научная новизна и теоретическая ценность полученных результатов заключается, прежде всего, в фундаментальном значении теоретических выводов из диссертации.

Впервые с использованием приемов компьютерной лазерной фазовой микроскопии проведен сравнительный анализ морфологии и внутриклеточной динамики нормальных, опухолевых и трансформированных клеток в интактном состоянии и после воздействия различных факторов регуляции клеточной активности. Полученные данные соотнесены с другими параметрам! функционирования клеток.

Установлены специфические динамические характеристики Ras-трансформированкых и опухолевых клеток; отмечены особенности влияния тромбина, эпидермального фактора роста и альфа-фетопротеина.

Сформулированы представления о роли тромбининдуцируемых реакций в процессах развития новообразований и нормальных тканей. Обоснованы пути эндогенной регуляции множественных биологических эффектов тромбина

Впервые в экспериментах на разных группах животных, в том числе и на обезьянах, были изучены антикоагуляционные и токсикологические свойства рекомбинантных фактора некроза опухоли-р и производных фактора некроза опухоли-а в качестве потенциальных регуляторов активности тромбина. Данные соотнесены с результатами испытаний препаратов на культуре клеток in vitro..

Получены новые производные хинолина и испытаны их антикоагуляционные и токсикологические свойства.

Впервые проведено сравнительное изучение антикоагуляционных свойств производных хинолина, индола, 10,11-дигидро-5Н-дибенз[Ь,{]азепина, 2-оксо-1-пирролидино-2-бутина, камфоры, дифенилуксусной кислоты, 4,5,6,7-тетрагидробензтиофена; сульфониламидосодержащих, гидразоносодержащих, гуанидиносодержащих соединений и гирудина. Исследована возможность регуляции тромбининдуцируемой клеточной пролиферации с использованием некоторых перспективных для дальнейшего использования веществ.

Обнаружены центральные эффекты после введения ингибиторов тромбина экспериментальным животным.

Впервые на моделях перевиваемых метастазирующих опухолей было проведено сравнительное изучение разных способов регуляции множественных биологических эффектов тромбина и доказана их эффективность при лечении новообразований у мышей (рак легких РЛ-67; меланома В-16) и китайских хомяков (ХОП).

Практическая ценность результатов проведенной работы определяется тем, что:

• Разработаны экспериментальные модели изучения молекулярно-клеточных механизмов действия природных и синтетических антикоатушштов. Полученные данные могут бьггь использованы в медицине при диагностике, исследовании и терапии ряда патологических состояний, прежде всего, новообразований и патологий гемостаза.

• Методология, разработанная при изучении Дси-трансформированных клеток, может найти применение при дальнейших исследованиях особенностей развития опухолевых клеток.

• Оригинальный синтез и исследование биологической активности новых производных хинолина в сравнении с другими полифункциональными гетероциклическими соединениями вносят реальный практический вклад в создание новых антикоагулянтов - регуляторов клеточной активности.

• Проведено экспериментальное доклиническое испытание общей и специфической токсичности рекомбинантных фактора некроза опухоли-^ и производных фактора некроза опухоли-а. Данные соотнесены с антикоагуляционными свойствами препаратов.

• Оптимизация способа выделения гирудина из натурального сырья позволяет обеспечить эффективное получение препарата для исследовательских и практических нужд. Результаты испытаний биологической активности препаратов из медицинской пиявки могут быть использованы при создании новых лекарств с целью профилактики тромбозов и новообразований, лечения инфекционных заболеваний.

• Результаты сравнительных исследований противоопухолевой активности природных и синтетических антикоагулянтов могут найти применение при создании новых лекарственных препаратов и разработке альтернативных схем лечения новообразований.

• В процессе разработки теоретических и практических основ регуляции множественных биологических эффектов тромбина проведен патентный поиск и подготовлена заявка на изобретение.

Апробация работы

Результаты, описанные в диссертации, были представлены на Всероссийской научно-практической конференции «Состояние и перспективы научных исследований в области создания генно-инженерных препаратов для медицины и ветеринарии». Оболенск. 1992; II, Ш, IV, VI, VII Всероссийских Конгрессах «Человек и Лекарство». Москва. 1995, 1996, 1997, 1999, 2000; Научно-практической биотехнологической конференции, Степногорск, 1995; Международных конгрессах по иммунореабилитации в медицине, Сочи-Дагомыс, 1995, 1996; First FEPS congress, Maastricht, 1995; I Всероссийской конференции токсикологов «Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии», Санкт-Петербург, 1995; European research conference «Molecular pathogenesis of infectious diseases», Obemau, 1996; XIV конференции «Морфоиетрия в диагностике болезней», Москва, 1996; International meeting of scanning microscopy, Washington, 1996; Spring meeting of British society for immunology, Bristol, 1996; ХП Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра», Санкт-Петербург, 1996; 1st Joint meeting of the ICS and the ISICR, Geneva, 1996; ХХП European tumor virus group meeting, Innsbruck, 1997; 13th European Immunology Meeting, Amsterdam, 1997; SPEE Meeting, San Remo, 1997; 4th European congress of pharmaceutical sciences, Milan, 1998; Conference on biomedical laser metrology and applications, Munich, 1999; 7th European Congress of Biopharmaceutics and Pharmacokinetics, Jerusalem, 1999; Всероссийском биофизическом съезде, Москва, 1999; VI конференции Ассоциации гирудологов, Пятигорск, 1999; First euroconference on quantitative molecular cytogenetics, Bari, 2000.

По теме диссертации опубликовано 3 8 работ.

Структура и объем работы

Структура диссертации традиционно Она состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, общих выводов и указателя цитируемой литературы.

Положения, выносимые на защиту

1. Тромбининдуцируемые реакции играют заметную роль в процессах развития и функционирования новообразований и нормальных тканей. При этом имеет значение способность клеточных элементов к активации тромбина, экспрессии эндогенных ингибиторов фермента и специфических рецепторов. Одним из ключевых моментов передачи сигнала является активация белка Ras.

2. Регуляция множественных биологических эффектов тромбина может осуществляться на разных уровнях: от активации из состояния профермента в межклеточном пространстве до влияния на процессы передачи рецептор опосредованного сигнала. Наиболее перспективно одновременное воздействие на разных этапах.

3. Для регуляции тромбининдуцированных реакций могут быть использованы новые и уже известные производные хинолина наряду с природными антикоагулянтами, рекомбинантными цитокинами и их производными.

4. Природные и синтетические модуляторы активности тромбина влияют на пролиферацию чувствительных к тромбину культур клеток и подавляют рост экспериментальных метаетазирующих опухолей. Использование широкого спектра препаратов приводит к оптимизации способов воздействия на клетки-мишени.

Содержание диссертации

Главные направления и объем выполненных исследований отражены в структуре диссертации.

Для реализации поставленных задач были использованы наиболее достоверные и информативные методы исследования:

• химические (органический синтез, выделение, очистка, концентрирование и хроматография биологически активных веществ);

• физико-химические (ШС-спектроскопия, епектрофлуориметрия, центрифугирование, электрофорез, компьютерная фазовая микроскопия с элементами распознавания и анализа образа);

• биологические (методы общих и специфических токсикологических исследований; испытание препаратов на тесг-кулыурах нормальных и опухолевых клеток; определение антикоагуляционных свойств веществ на внешнем и внутреннем пути свертывания крови, исследование противоопухолевой активности на моделях экспериментальных метаетазирующих опухолей);

• методы математической и статистической обработки результатов (программы "Matlab", "Origin").

Результаты исследований и их обсуждение

Исследование роли тромбининдуцированных реакций в функционировании клеток и тканей

Представление о множественности биологических эффектов тромбина приводит к разработке большого числа независимых подходов к их избирательной регуляции. Для определения биологической значимости отдельных событий, происходящих внутри клеток и тканей под влиянием тромбина, были предприняты исследования внутриклеточной динамики, морфологии клеток и межклеточных взаимодействий. Исследование эндогенной избирательной регуляции внутреннего ггутн свертывания крови.

Исследование внутреннего пути свёртывания крови проводили с помощью теста рекальцификации плазмы. Используя данный тест, изучали возможность влияния культур опухолевых линий и их продуктов на развитие процесса. Клетки выращивали в стандартных условиях. Анализировали данные тестирования линий зпидермальиой карциномы А-431, карциномы молочной железы МСР-7"* (в дальнейшем \lCF-7), карциномы шейки матки НеЬа и их лизатов (рис.1). Также исследовали культуральные

жидкости линий В-лимфомы человека Ката1уа, остеосаркомы человека ______^

2(лкш-)

50 ДМ НО 200 250' 300 350 <00 «50 Время, сек

Рис.1 Зависимость времени рекальцификации плазмы от содержания опухолевых клеток. В каждой группе данных присутствуют последовательно сверху вниз результаты исследований линий МСР-7, НеЬа, А-431.

о

мелкоклеточной карциномы лёгкого Н-69 и рака предстательной железы LNCaP. В ряде случаев было изучено действие гирудина на развитие эффекта.

Эпидермальная карцинома А-431, а также её лизат во всех исследованных концентрациях способны воздействовать на свертываемость крови, на что указывает уменьшение времени свёртывания тромбоцитарной плазмы по сравнению с контролем. По мере увеличения концентрации клеток время рекальцификации уменьшается. Максимальный эффект оказывает клеточная культура А-431 в концентрациях - 2 х 105 и 2 х 106 о/мл. Лизат той же концентрации клеток проявляет менее выраженный эффект. Подобная закономерность обнаруживается и на культуре клеток HeLa. Наибольший эффект обнаруживается при максимальной концентрации этих клеток 2х106кл/мл.

Сокращение времени рекальцификации плазмы при повышении концентрации клеток А-431 и HeLa связано с присутствием в реакционной среде агентов, находящихся на поверхности клеток и стимулирующих процесс свертывания крови. Эти агенты, прежде всего, тканевой фактор, экспрессируются клетками, пролиферация которых связана с ответом на митогенные сигналы, в той числе и тромбина ( Баскова И.П., 1995).

Исследования влияния гирудина проводили на 2 культурах с одинаковой концентрацией клеток: А-431 и HeLa. При его добавлении (4.5 ATU) время рекальцификации увеличилось в обоих случаях. По мере возрастания величины ATU (антитромбиновых единиц) время свёртывания тромбоцитарной плазмы становится более продолжительным.

Таким образом, клепки некоторых опухолевых линий могут контролировать способность тромбоцитарной плазмы к свертыванию и запуску каскадных путей активации факторов свертывания, влиять на адгезию тромбоцитов, и, как следствие, изменять свою функциональную активность через взаимодействие вновь образованного тромбина со специфическими рецепторами. Минимальный эффект обнаружен в случае наименьшей концентрации клеток культуры MCF-7, что объясняется отсутствием тромбиновых рецепторов на поверхности этих клеток.

■ При исследовании влияния культуральных жидкостей разных опухолевых линий на время свёртывания тромбоцитарной плазмы было обнаружено, что некоторые из них обладают специфической активностью: HeLa и LNCaP в 3.5-4 раза увеличивали время рекальцификации, в случае Н-69 - свёртывания тромбоцитарной плазмы не произошло. Данные по последней культуре клеток соотносятся с результатами O'Reilly (1999),

выделившего из культуральной жидкости этой линии модифицированную форму антитромбина. Исследования, проведённые с культуральными жидкостями КашаЬ'а, М»-63 и МСР-7 не выявили такого эффекта.

В параллельных опытах на культурах клеток было установлено, что культуральные жидкости МСР-7, А431, №та1уа, Mg-63 в разных соотношениях не влияли на ускорение реакции рекальцификации плазмы, обусловленное опухолевыми клетками НеЬа и А431. Между тем, добавление культуральной жидкости от Н-69 отменяло эффект аналогично действию гирудина. В среднем, 0.1 мл пятикратного концентрата Н-69 соответствовал по результату 4.5 АТО гирудина.

Таким образом, культуральные жидкости иммортализованных опухолевых линий оказывают противоположный эффект па показатели свертывания, по сравнению с клеточными элементами.С нашей точки зрения, это, объясняется тем, что, по мере роста культуры, в среду выделяются такие продукты обмена, которые ингибируют факторы внутреннего пути свертывания, замедляя процесс. Не исключено прямое ингибирующее воздействие на тромбин. Следовательно, клетки некоторых линий способны регулировать свой рост, а уменьшение вязкости тромбоцитарной плазмы облегчает их распространение по кровеносному руслу с последующим образованием метастазов.

Изучение возможности избирательной регуляции внешнего пути свертывания крови

Агрегацию тромбоцитов здоровых доноров регистрировали по методу Борна/О'Браена. Стимуляцию агрегации кровяных пластинок осуществляли добавлением в реакционную среду тромбина (5 Ед/мл) и пептидного лиганда тромбиновых рецепторов первого типа БИХ1Ш (30 мкМ), вызывающих необратимую агрегацию. В качестве примера обратимой агрегации использовали стимуляцию процесса добавлением АДФ в концентрации 5мкМ (Духанин А.С., 1998).

Результаты изучения тромбининдуцированных реакций представлены на рис.2. Очевидно, что уже в первые минуты после добавления агрегирующего агента развивался выраженный процесс. Динамика процесса несколько отличалась при использовании тромбина и ЗБШад. Во втором случае наблюдали некоторое запаздывание реакций.

Применение гирудина в концентрации 4.5 АТи полностью отменяло эффект в случае тромбина, но оказывало ограниченное влияние на процесс, активированный

-so

so А

-20

В

Рис.2 Агрегация тромбоцитов, индуцированная тромбином (А) и 8ИХЮ\Г (В). Концентрация тромбина - 5Ед/мл; БРЬЫШ - 30 мкМ.

По оси абсцисс - время инкубации с индуктором, мин; по оси ординат слева - средний радиус агрегатов,у.е., справа - светопро пускание,%. Верхняя кривая на каждом из графиков соответствует зависимости среднего радиуса агрегатов от времени, нижняя -зависимости свегопропускания от времени.

SFLLRN. В последнем случае не удавалось уменьшить показатель свегопропускания ниже 75% от контроля.

Последние данные согласуются с представлением о протеолитической активации тромбиновых рецепторов (Vu Т-К. et al, 1991; Kahn M.L. et al.,1998; Ishihara H. et al.,1997). Пептидный лиганд не взаимодействует с гирудином, а ограниченный эффект последнего может быть связан с инактивацией тромбина, вторично образованного в среде.

Было обнаружено ингибирующее влияние гирудина на АДФ стимулированную агрегацию. При этом при увеличении концентрации ингибитора до 25 ATU не происходило снижения процента свегопропускания ниже 40% от исходного уровня, что определяет уровень участия тромбининдуцированных реакций в АДФ стимулированной

агрегации тромбоцитов и соотносится с данными Kahn M.L.(1998), установившего возрастание числа тромбиновых рецепторов на поверхности тромбоцитов после стимуляции АДФ.*

В установленных условиях данный метод пригоден и для тестироватм других потенциальных модуляторов эффектов тромбина.

Таким образом, агрегация тромбоцитов здоровых доноров может быть стимулирована как добавлением сильных агрегантов типа тромбина, так и лигандов поверхностных рецепторов (АДФ и SFLLRN). Протеолитическая активация тромбином PAR рецепторов может быть полностью заблокирована использованием специфических ингибиторов типа гирудина. В случаях рецепторопосредованной АДФ регуляции функций тромбоцитов ингибиторы протеазы также способны действовать. Механизмом реализации эффекта в этом случае может служить нейтрализация вторичнообразованного тромбина.

Регуляция тромбинип.туциоуечой пролиферации клеток

Изучение индуцированной тромбином пролиферации проводили в экспериментах на нормальных клетках (BSMC) с тромбиновыми рецепторами и опухолевых (МСТ-7), не имеющих тромбиновых рецепторов на поверхности клеток, с помощью МТТ - теста. В многочисленных опытах на культуре MCF-7 не было обнаружено достоверного влияния тромбина (5 Ед/мл) на пролиферацию клеток. Гирудин (4.5 ATU) также не оказывал митогенного эффекта.

Известно, что рост гладкомышечных элементов сосудов и бронхов зависит от присутствия тромбина в среде (Shuman,1986;Taylor,1999). Достоверно установленная стимуляция роста гладкомышечных клеток быка BSMC под влиянием тромбина явилась основой для создания экспериментальной модели для тестирования биологически активных веществ в области регуляции тромбининдуцированного клеточного роста (табл.1).

Наиболее подходящей средой для изучения пролиферации клеток являлась RPMI с 2% эмбриональной сывороткой. При этом был обнаружен максимальный митогенный эффект тромбина. Добавление специфического ингибитора тромбина -гирудина отменяло выявленный эффект во всех случаях.

* Автор выражает благодарность д.б.н. И.О. Севериной за помощь в организации и проведении экспериментов.

Обращают на себя внимание результаты изучения влияния фактора некроза опухоли-a. (TNF-ct). TNF-a для исследований любезно предоставлен д.б.н. Шмелевым В.А., ГНЦ прикладной микробиологии. На сегодняшний момент существует представление о перекрестном взаимодействии путей передачи сигнала в клетке после активации рецепторов к TNF-a и тромбину на стадии активации JNK1 и экспрессии с-Jun (Fajare L.F. et al., 1992 Rao G.N., Runge M.,1996). В этом смысле полученные на новой модели результаты подтверждают это предположение. Представляется перспективным изучение аналогичной активности у аналогов и производных TNF-a.

Таблица 1

Регуляция тромбининдуцированнои пролиферации клеток BSMC

Наименование вещества ICso

Гирудин 0.75 ATU/мл

TNF-a 103 нМ

Таким образом, митогенный эффект тромбина зависит от состава среды, типа клеток и наличия специфических ингибиторов или регуляторов внутриклеточных обменных процессов. Добавление гирудина и TNF-a способствует отмене эффекта. Изучение особенностей внутрнклеточвой динамики ионов в нормальных и опухолевых клетках под действием тромбина

Ионы Са2+ являются важным внутриклеточным регулятором и повышение их концентрации играет ключевую роль в определении функциональней активности многих клеток (Charabard J. et а)., 1987; Van W. et al.,1998; Johanson S.O. et al„ 1999). Было изучено влияние тромбина на содержание ионов Са2 в человеческих тромбоцитах, зндотедиалъных и гкадкомышечных клетках быка (АВАЕ и BSMC), а также в клетках культур эмбриональных фибробластов крысы REF-52, карциномы молочной железы MCF-7, эпидермальной карциномы А-431 и карциномы шейки матки HeLa. Для измерения концентрации Са2' применяли флуоресцентный зонд FURA-2, хромофорные группы которого изменяют свои оптические свойства при образовании комплексов с ионами Са2т

Базальный уровень Са2+в изучаемых клетках находился в пределах от 50 нМ до 90 нМ (табл.2). В таблице представлены усредненные данные, через 30 сек после начала измерения, по четырем независимым экспериментам, а при исследовании свойств пептидного лиганда тромбиновых рецепторов первого типа (PAR-1) SFLLRN - по трем

экспериментам. Каждый раз измерения проводили в трех повторах. Добавление тромбина («Sigma») в оптимальной концентрации 5 Ед/мл приводило к достоверному и очень быстрому (максимум достигался через 20-60 сек) возрастанию содержания внутриклеточного Са2" практически во всех культурах за исключением MCF-7. Последние данные не противоречат общей тенденции, а лишь подтверждают известный из литературы факт отсутствия тромбиновых рецепторов на поверхности клеток MCF-7 (Even-Ram S. et al., 1998).

Таблица 2

Изучение содержания внутриклеточного CaJ+ в культурах клеток

Типы клеток, концентрация Внутриклеточная концентрация Са2+ при различных вариантах воздействия на клетки, нМ

Вязальный уровень Тромбин 5 Ед/мл Среда без кальция и тромбин 5 Ед/мл SFLLRN 30 мкМ Тромбин 5 Ед/мл и гирудин 5 ATE SFLLRN 30 мкМ и гирудин 5 ATE

Тромбоциты человека, (0.5х107мл) 62+7 584±5* 201±10* 720±9** 78+9 70Ш2

АВАЕ, (1х106/мл) 88+6 863+8* 176+15* 787+19** 89+9 771+25

BSMC, (1х10в/мл) 63±12 577+16* 109±10* 657Í21 80+12 684±20

А-431, (1х106/мл) 57+7 489+10* 135+9* 702+14** 68+13 734±25

Hela (1х106/мл) 51+4 441+9* 113+13* 756+16** 54+9 741 ±8

MCF-7, (1х106/мл) 61±7 74+12 55±7 64+11 60±3 65±10

REF-52, (1х106/мл) 7б±8 698±6* 223+15* 543+12** 88+13 502+25

* - различия между значениями в столбцах достоверны (р<0.01);

** - данные по исследованию ЙРШУЧ достоверно отличаются от результатов действия тромбина на тот же тип клеток (р<0.01).

Для выяснения возможной зависимости кальциевого ответа клеток на тромбин от внеклеточной концентрации иона сопоставляли изменения его содержания в клетках, суспендированных в стандартной среде с 1мМ СаСЬ, и в бескальциевом буфере. Обнаружено, что в бескальциевой среде функциональный ответ клеток выражен в

меньшей степени (табл.2). Следовательно, повышение уровня внутриклеточного Ca24" происходит преимущественно в силу входа ионов из межклеточного пространства.

Результаты по измерению концентрации Ca21", полученные на различных культурах клеток соотносятся с исследованиями, проведенными зарубежными авторами на тромбоцитах и крысиных фибробластах Rat-2 (Zucker S., 1995; Kramer R. et ai., 1995). Эффект стимуляции Ca3" обмена на клетках АВАЕ, BSMC, А-431, Heia, Ref-52 был обнаружен впервые.

Фрагмент тромбикового рецептора SFLLRN, являющегося высокоаффинкым лигандом PAR-1 рецепторов, вызывал выраженный биологический эффект. Добавление гирудина 4.5 ATU/мл («Sigma») в реакционную среду не отменяло явления. В случае использования тромбина, напротив, происходило полное блокирование эффекта. Сам гирудин не оказывал достоверного влияния на базальиый уровень Ca2'.

Использование культурапьдай жидкости линии опухолевых клеток Н-69 также изменяло эффект тромбина. Действие 0.1 мл пятикратного концеьтрата соответствовало влиянию 4.5 ÄTU/мл гирудина. Результаты зтих исследований, в том числе и ка новых типах клеток, подтверждают положение о протеолитическом механизме активации тромбивдвых рецепторов.

Таким образом, в результате экспериментов на различных типах клеток была продемонстрирована возможность рецепторопосредованной модуляции содержания одного из ключевых вторичных мессенджеров - ионов Ca2 . Для проявления обнаруженных феноменов необходимо наличие ионов Са24во внеклеточной среде. Протеолитическая активация тромбиновых рецепторов является ключевым звеном процесса.

Сравнительный анализ морфологии и внутриклеточной динамики нормальных, опухолевыг в трансформированные клеток в иитактном состоянии и после воздействия различные Факторов регуляции клеточной активности

Использованный в работе компьютерный фазовый микроскоп «Цитоскан» позволяет исследователю не только пронаблюдать за клетками, но также записать и проанализировать основные морфометричесхие характеристики фазовых портретов отдельных клеток и их популяций. Помимо этого, возможно измерение изменений оптических показателей клеток в режиме реального времени, что оказывается весьма удобным при исследовании механизмов действия различных факторов, которые регулируют клеточную активность. Динамика структурно-метаболической организации клетки отражается в виде специфических спектров, являющихся результатами

преобразования Фурье исходных оптических характеристик. Активность внутриклеточных процессов отражается в виде функциональной зависимости мощности регистрируемых сигналов от их частоты, с параллельным формированием таблицы наиболее интенсивных частот в спектре, что позволяет непосредственно приблизиться к количественной характеристике отдельных метаболических процессов внутри клетки (Baidock R. et al., 2000).

В результате компьютерной обработки были получены протоколы измерений для отдельных клеток и для популяции в целом. В нашей работе были исследованы различные клетки в конечной концентрации 1х106/мл: нормальные человеческие лимфоциты и моноциты, культуры опухолевых клеток (Namalva, MCF-7), а также культура эмбриональных фибробластов крысы REF-52tetRas (любезно предоставленная A.B. Ивановым, Институт Молекулярной Биологии РАН), которая в результате траисфекции онкогеном ras приобрела способность к управляемой экспрессии Ras с помощью Tet-off системы. Культура клеток REF-52tetRas после отмены тетрациклина в среде клетки активировались самостоятельно, проявляя на 7 сутки выраженные фенотипические признаки трансформации. На 14 сутки признаки сохранялись. К концу месячного срока активированные клетки вновь переходили в нормальное (нетрансформированное) состояние.

Изучение Ras трансформированных фибробластов было предпринято с целью исследования морфомеггрических и динамических аспектов активации Ras при трансформации клеток и передаче сигнала, обусловленного тромбином и рядом других факторов (эпидермальный фактор роста, альфа-фетопротеин). Представлял интерес и поиск Ras специфических сигналов в иммортализовакных опухолевых клетках. Морфометрическая характеристика клеток

В результате опытов были записаны морфомеггрические портреты 100 интактных клеток каждой группы и по 100 клеток на каждый вариант воздействия. Наиболее интересные результаты были получены при исследовании Ras-трансформированных фибробластов.

Клетки REF-52tetRas - это относительно крупные круглые клетки, с четко выраженным ядром и минимальной высотой фазового изображения в примебранной области. Неактивированные клетки однородны. После активации Ras минимальная высота наблюдается не только в примембранных областях, а также во всем ядре (рис.3.). Суммарные данные по морфометрии, полученные в экспериментах по активации Ras представлены в табл. 3.

Рис.3 Изменения морфологии эмбриональных фибробластов крысы REF-52tetRas после активации Ras. А - интакгные клетки; В - фибробласты на 7 сутки активации Ras.

Таблица 3

Данные морфометрического анализа клеток REF-52tetRas

Тип клеток Максимальный диаметр, мкм Минимальный диаметр, мкм Периметр, мкм Высота, к Объем, мкм3 Площадь, мкм2

REF-52tet Ras 17.9±4,3 3.2±0,7 115.0±50.3 3851 ±454 560615 +207 345.5± 35.0

REF-S2tet Ras, 7 сутки активации Ras 20.0+7.1 1.9±0.В 145.3+45.3 3985 ±347 600110 +454 395.2± 23.9

REF-52tet Ras, 14 сутки активации Ras 69.8+24.8* 10 0+2.3* 189.3+37.1 3152 ±121* 162948 ±307* 1203.7 ± 106.5*

* - данные достоверно отличаются от исходных значений (р<0.05).

На 7 сутки активации Ras наблюдается сужение пределов значений практически всех показателей. Так, минимальный диаметр клеток в контроле варьирует в пределах 111 мкм, а на 7 сутки его значения соответствуют 0,5-4мкм. Незначительно возрастают значения высоты и площади клеток. При развитии процесса трансформации наблюдается увеличение диаметра клеток. На 14 сутки появляются клетки с диаметром в 5 раз превышающим исходный размер. Обнаружено значительное увеличение периметра, площади и объема (на 2 порядка). Высота клеток на 14 сутки уменьшается и становится ниже исходной.

К 14 суткам активации Ras клетки могут быть разделены по всем характеристикам на 2 группы: 5% и 95%. 5%-группа отличается наибольшими значениями по всем показателям морфометрии.

Тагам образом, активация Ras в клетках линии REF-52tetRas приводит к разделению популяции на две субпопуляции, к значительному изменению формы и увеличению размеров клеток.

Представляет интерес сравнение полученных результатов с данными морфометрического анализа этих же клеток после инкубации фибробластов с тромбином при 37° С (5Ед/мл) в течении часа.

В настоящее время тромбиновые рецепторы обнаружены на поверхности эндотелия, гладкомьппечных клеток, фибробластов, тромбоцитов, макрофагов, Т-клеток (нет на В-клегках), остеобластов (Tordai A. et al., 1993; Mari В. Et al., 1996), а также целого ряда опухолевых клеток человека и животных (Even-Ram S. et al, 1998; Kahn M.L. et al,1998; Ishihara H. et al,1997; Molino M. et al, 1997; Wojtukievicz M.Z. et al, 1995; Abraham L.A. et al., 1998). Взаимодействие тромбина со специфическими рецепторами вызывает активацию Ras-зависимых путей передачи сигнала (Takuwa N., Takuwa Y., 1997; Dhanasekaran N. et al., 1998). Результаты измерений представлены на рис.4.

Как следует из рисунка, морфомегрические показатели фибробластов в течение периода наблюдения значительно изменялись. Характер этих изменений противоположен описанному поведению Ras-трансформированных клеток.

Было обнаружено существенное уменьшение практически всех значимых параметров (р<0.05). Особенно выражены изменения периметра, объема клеток и максимального диаметра. Объяснением полученному феномену может служить активация рецепторопосредованного эндоцитоза PAR-рецепторов (Molino М. et al, 1997; Dini L. et al., 1998).

Измерение минимального диаметра клеток вскрывает новые интересные особенности поведения фибробластов в ответ на тромбин. По всей видимости, тенденция к возрастанию значений параметра наряду с уменьшением максимального диаметра отражает общее направление тромбининдуцированных изменений формы клеток в сторону уменьшения изменчивости морфометрических показателей. Гистограммы распределений, представленные на рис.4 иллюстрируют это предположение. Воздействие фермента не вызывает резкого разделения популяции клеток на подгруппы.

■ 18 2027 37032

Jl

w 3U

ta 3(96 92 Г 525 1ВС7 ■ 332 9422 48.5049 ZJ ■ 5Ш715 063 | 217117 7314]

33 I (

и в 10 I hi

1 10 б I I lit i

___O.J. 1.1 п „о! п LUI lililí i

11 3319 1Б83Э

10

height

«2208 5 ^ 333 1064

II

ñ

10 arel

■ 259 2469 ^ 67 379

Jl

15 20 <0

30 20 10 Q

I34<076 7.4062

<0

vol

I 149314 7117 37541 2778

LL

1033 20G0 3033 "0 203 1 1.5 2

x ID* В

Рис.4 Изменения морфометрических показателей неактивированных клеток Ref-52tetRas после обработки тромбином (5 ATU/мл). А - характеристика интактных клеток, В -результат обработки тромбином. Представлены гистограммы распределения клеток по параметрам: максимальный (dmax) и минимальный (dmin) диаметр, периметр (per), высота (height), площадь (area), объем (vol). Легенда содержит значения среднего и его ошибки

Морфометрические показатели клеток периферической крови здоровых доноров изучали с точки зрения оценки эффективности воздействия таких факторов, как тромбин ( 5 Ед/мл) и фактор некроза опухоли-a (TNF-a, 10 нМ) на форму клеток. Исследование влияния последнего агента было предпринято в связи с тем, что взаимодействие этих двух медиаторов внутри организма играет важную роль в процессах гистогенеза. Результат их взаимного влияния определяется, как правило, соотношением концентрации регулирующего агента и клеток-мишеней (Fajaro L. et al., 1992; Bussolino R et al., 1995; Rao G.N., Runge M.,1996). Данные измерений представлены в табл.4.

Таблица 4

Данные морфометрического анализа клеток крови здоровых доноров

Тип клеток и Макси- Мини- Периметр, Высота, Á Объем, Площадь,

состав пробы мальный мальным мкм мкм3 мкм2

диаметр, диаметр,

мкм мкм

Лимфоциты 5.8+1.4 3.6+1.8 23.7+4.2. 2975 4688 324.4

+2017 +401 ±36.0

Лимфоциты 4.1+1.5 2.9+2.0 15.312.9* 2645 2871 276.2

и тромбин ±201 ±201* ±34.5

Лимфоциты 3.7+1.2 2.3±1.7 14.8+4.7 2524 2354+ 265.0

иТОТ-сс ±178 671* ±28.7

Моноциты 15.9+3.7 2.8+1.1 112.6±43.7 2591 4933 371.0

±742 +178 +38.5

Моноциты и 10.1+1.3* 3.5±2.0 45.7±23.8 2488 2249 228.0

тромбин ±340 ±340* ±26.7*

Моноциты и 11.3+1.1 3.1±1.7 49.0+7.5* 2344 2900 254.3

ТЮ?-а +631 ±371* ±39.5

* - данные достоверно отличаются от исходных значений (р<0.05).

Очевидно, что уровень большинства морфометрических показателей после воздействия факторов был существенно ниже как в случае лимфоцитов, так и моноцитов. Характер изменения параметров схож с обнаруженным ранее на клетках REF-52tetRas после добавления тромбина.

Таким образом, при морфометрических исследованиях клеток крови человека и фибробластов крысы в зависимости от способа воздействия на клетку и, в частности, активации Ras, обнаруживаются значительные различия в направлении изменения формы клеток. Влияние экстрацеллюлярных факторов определяется, в первую очередь, интенсивностью процесса рецепторопосредованного эндоцитоза и приводит, в конечном итоге, к уменьшению значений параметров. Процесс трансформации клеток,

как следствие нарушения генетической стабильности, характеризуется, напротив, увеличением показателей.

В свете описанных результатов представляет интерес морфомегрическое изучение иммортализованньк культур опухолевых клеток человека. В табл.5 и рис.5 представлены результаты испытаний клеток MCF-7. Конечные концентрации ростовых факторов составили: тромбин - 5 Ед/мл, зпидермальный фактор роста (EGF) - 1 мкМ, альфа-фетопротеин (АФП) - 1мкМ, время инкубации - 1 ч, 37° С. Мышиный EGF был любезно предоставлен д.б.н. C.B. Луценко (МНИИМЭ), а АФП - к.х.н. А.И. Сотниченко (МНИИМЭ).

Таблица 5

Данные морфометрического анализа клеток MCF-7

Состав пробы Максимальный диаметр, МКМ Минималь- 11ЫЙ диаметр, МКМ Периметр, МКМ Высота, А Объем, МКМ1 Площадь, МКМ2

MCF-7 17.8+3.8 2.7+2.3 103.7+33.5 4036+402 718222+ 170062 406.2±20.3

MCF-7H тромбин 17.8±5.3. 2.5.+2.0 136.8+60.0 3508+583 636829± 185417 398.9±25.6

MCF-7 и EGF 8.9+3.4* 4.3+2,1 87.3±30.8 3546+156 412419+ 101573* 401.0±4.2

MCF-7 и АФП 19.4+5.8 5.1+2.5 123.7+37.1 3215+ 231* 534815+ 197865 413.2+15.3

*- данные достоверно отличаются от исходных значений (р<0.05).

Клетки опухоли отличаются хорошо выраженным ядром. Максимальная высота фазового изображения в контрольных образцах наблюдается в ядре, (рис.5.) Популяция опухолевых контрольных клеток практически однообразна по всем параметрам. В распределении колебаний любого из параметров прослеживается постепенное их изменение, без скачков и выпадений каких-либо значений.

После прибавления какого-либо фактора происходит выпадение некоторых значений. Популяции при этом могут быть разделены на группы по уровню изменений морфометрических показателей.

Так, после инкубации с тромбином диаметры и площади клеток не изменились, однако появилась возможность вычленения популяции клеток, составляющей около 25% от общего количества с уменьшенным максимальным диаметром. Обнаруживается

около 15% клеток с увеличенным периметром (до 250мкм). Также отмечена недостоверная тенденция к уменьшению высоты клеток. Наиболее вероятной причиной обнаруженных изменений может являться неспецифическое взаимодействие молекул тромбина с поверхностью клеток в отсутствии специфического взаимодействия с РАЯ-рецепторами.

Рис.5 Взаимодействие клеток карциномы молочной железы MCF-7 с EGF. А - клетки MCF-7 в исходном состоянии, В - после добавления EGF.

Исследование поведения клеток MCF-7 после добавления EGF представляло интерес в связи с известным фактом отсутствия тромбиновых рецепторов на поверхности этих клеток и возможности трансактивации рецепторов к тромбину и EGF (deBlois D., 1992; Daub Н. et al., 1996;Vaingankar S.M., 1998). Инкубация с EGF приводила к уменьшению изменчивости значений высоты, площади и объема клеток. Достоверно снижался максимальный диаметр и объем клеток.

Взаимодействие клеток MCF-7 с АФП, который является одним из наиболее активных стимуляторов рецепторопосредованного эндоцигоза без запуска интенсивных процессов передачи сигнала, через 1 ч инкубации приводит к снижению значений высоты. Остальные показатели остаются практически неизменными. Как показали дальнейшие исследования, АФП активирует рецепторопосредованный эндоцитоз уже с первых минут инкубации. Динамика морфометрических показателей при этом схожа с таковыми при добавлении EGF. Так, максимальный диаметр и периметр клеток MCF-7 могут достоверно снизиться в 1.5-2 раза по сравнению с исходными значениями. Через 1 ч происходит затухание процесса.

Таким образом, значения основных параметров после прибавления EGF и АФП, как правило, снижаются, что является проявлением процесса активного эндоцитоза

В

факторов. Обращает на себя внимание схожесть характера выявленных изменений с результатами влияния тромбина на клетки крови и крысиные фибробласты. На морфологии клеток MCF-7 инкубация с ферментом не отражается.

Аналогичные данные были получены и на клетках В-лимфомы Namalva. Добавление тромбина в инкубационную среду не влияло на морфометрические показатели, а лишь изменяло уровень изменчивости параметров. Характеристика внутриклеточной динамики

Благодаря КФМ "Цитсскан", который обеспечивает прижизненный мониторинг цитообъектов, исследователь способен регистрировать изменения внутриклеточной динамики.

Были исследованы практически все вышеописанные популяции клеток по алгоритму прижизненного анализа динамики биообъектов, включающему в себя:

• изучение параметров динамического поведения каждой отдельной клетки с учетом дисперсии отклонений фазовых высот и координат;

• преобразование Фурье оптических характеристик клеток;

• интегральный анализ особенностей динамихи клеточной популяции при статистической обработке результатов преобразования Фурье. Результаты исследований отдельных групп клеток представлены в табл.6

Таким образом, воздействие каждого из испытанных факторов приводит к возникновению новых внутриклеточных колебаний, частоты которых частично встречаются только в экспериментальных условиях опьгга и отсутствуют в контроле. Обнаруженные осцилляции характеризуют активацию специфических

внутриклеточных обменных путей, часть из которых связана с активацией онкогена Ras. Наличие сходных вновь возникших частот, указывает на единство процессов, а об их интенсивности можно судить по амплитуде колебаний.

Добавление тромбина в инкубационную среду во всех экспериментах приводило к значительным изменениям внутриклеточной динамики. Причем, в отличие от опытов по определению пролиферативной активности и по измерению концентрации кальция, сдвиги оптических характеристик были обнаружены и в клетках, не имеющих на своей поверхности тромбиновых рецепторов (MCF-7). Модуляция выявленного эффекта специфическим ингибитором тромбина - гирудином позволяет оценить возможность применения ингибиторов фермента и в тех ситуациях, когда отсутствует рецептор-лигандкое взаимодействие.

Таблица 6

Специфические изменения внутриклеточной динамики

Частота, Гц

1.1 и

1.3

1.4

1.5

1.7 2

2,2

2.6 2,9

3

3.1 33 33

3.6

3.8 ■»,1 4,4

4.7

4.8

5

3.2 5,4

5.6

5.8

6

6.4

6.5 6,8

7

7.1 71

7.3 7,5

7.7

8.2 83 8,5

8,7

8.9 9

9,2

9.4

9.7

9.8 10,5 10,9 Н.2 11,5

11.7

11.8 11,9

12

12.4 12,7

13.3

13.5

13.7

13.8

13.9 14,7

15.1

15.2

15.4

Итякпше клелсн

Лимфо- ЙТГ-шггы

Трансформированный

_ШСГУИ_

Опухолевые клетки

ш

вяш

23

Тромбин

№142 Лимфо- МСК-7 ШИая ЦК1Ы

МСР-7

ас

Е31

Лкмфо-ПЯТЫ

Обоснование путей регуляции множественных биологических эффектов тромбина Исследования роли тромбининдуцированных реакций в жизнедеятельности клеток и тканей позволили изучить особенности изменений, развивающихся в нормальных и опухолевых клетках под действием фермента. Установлено, что тромбин успешно регулирует функциональную активность клеток на разных уровнях С учетом литературных данных было сформулировано положение о многоуровневоети регуляции множественных биологических эффектов фермента (Баскова И.П., 1995; Dhanasekaran N. et al., 1998; Even-Ram S. et al, 1998; Knauer M.F., 1997) (рис.б).

Рис.6 Пути регуляции множественных биологических эффектов тромбина

Первым этапом регуляции является активация тромбина из состояния профермента. Использование природных и синтетических ингибиторов сериновых протеаз позволяет задействовать такие механизмы, как реакция превращения протромбина в тромбин; ингибирование фактора \Ша и процесса его активации; ингибирование фактора Х1а и процесса его активации; ингибирование тромбина и процессов активации факторов V и УШ. Большинство ингибиторов с разной эффективностью способны модулировать развитие процесса во всех реакциях.

За счет взаимодействия с функциональными связывающими белками (серпины, тромбомодулин и т.п.) и последующей интернализации часть тромбиновых молекул могут удаляться непосредственно с места реакции, снижая таким образом

выраженность специфического эффекта. В наших исследованиях при изучении внутриклеточной динамики линии МСР-7 после обработки тромбином наблюдали выраженные специфические изменения, свидетельствующие об зндоцигозе, не связанном с рецепторами тромбина.

Следующим этапом, являющимся продолжением предыдущего, является регуляция протеолитической активности фермента при его взаимодействии со специфическими субстратами, такими как тромбиновые рецепторы и металлопротеиназы. Активация последних может протекать по рецептор-опосредованному и независимому от рецепторов пути и приводит к возрастанию инвазивного статуса клеток. На данном уровне наиболее эффективно могут быть использованы природные и синтетические ингибиторы сериновых протеаз и металлопротеиназ. В наших исследованиях была продемонстрирована эффективность природного ингибитора тромбина - гирудина.

Влияние на деятельность рецепторов и белков, связывающих тромбин в процессе своего функционирования является одним из наиболее перспективных путей регуляции множественных биологических эффектов тромбина. Уровни воздействия могут быть следующие: РАЯ-рецепторы, наработка мРНК РАЕ.-рецепторов я связывающих белков, серпины, тромбомодулин, белок С, белок Б. Регулирующими агентами могут служить протеазы, неспецифически активирующие рецепторы (трипсин), пептиды - агонисты и антагонисты рецепторов, синтетические агонисты и антагонисты рецепторов, антисмысловые олигонуклеотиды к мРНК рецепторов, связывающие белки и их производные (например, антитромбин), а также ингибиторы внутриклеточного транспорта рецепторов. В наших исследованиях пептидный лиганд тромбиновых рецепторов вРШ^ оказался способен успешно вызывать тромбиноподобные эффекты, не подавляемые гирудином.

На стадии внутриклеточной передачи сигнала возможно использование цитоклнов и факторов роста, имеющих сходные с тромбином узловые пункты метаболизма, цАМФ и других вторичных посредников и их производных, а также ингибиторов ГТФ-аз, киназ. Как было нами установлено, Т№-а, обладая сходными чертами внутриклеточной динамики с митогенными факторами, способен подавлять индуцированную тромбином пролиферацию клеток.

Таким образом, регуляция биологических эффектов тромбина предполагает многоуровневое модулирующее воздействие. Поскольку в реальных условиях

человеческого организма фермент способен реализовывать свое функциональное предназначение сразу по нескольким независимым путям, то успешный контроль за этими путями может осуществляться с использованием одновременного влияния нескольких различных факторов. В нашей дальнейшей работе были предприняты попытки выделения, синтеза и оценки эффективности различных природных и синтетических антикоагулянгов, в том числе и в сочетании с цитокинами и их производными.

Получение природных и синтетических антикоагулянтов и оценка их эффективности

Синтез и оценка биологической эффективности производных хинолнна

Синтез пептидов-агонистов, а также полифункциональных гетероциклических конструкций, модулирующих функционирование PAR-рецепторов, позволяет проводить испытания многочисленных новых препаратов, которые могут быть использованы как для коррекции системы гемостаза, так и для контроля за процессами тканевого роста (Li М. et al. Д999, Ahn Н. et al-, 1999; Plummer I S. et al., 1999; Reiner J. et al., 1999). Как уже указывалось, усилия специалистов ведущих научных центров и биотехнологических фирм мира (Maganin Pharmaceutical Inc., Genzyme Molecular Oncology, AEterna и др.) направлены на поиск новых субстанций и разработку перспективных в этом отношении препаратов.

Поиск высокоспецифичного эффектора тромбина, истинная структура которого не определена до конца, ведется преимущественно путем скрининга многочисленных препаратов. Активно изучаются производные индола, имидазола, пиридина (Reiner J. et al., 1999; Plammer J. et al., 1999; Ahn H. et al., 1999; Li M. et al., 1999). Эти соединения характеризуются сложной полифункциональной молекулярной структурой, состоящей из фрагментов различных азотсодержащих гетероциклов, феналкильных, сульфамидных, карбоксильных и гуанидиновых групп. При этом они способны к химическим, в том числе к ферментативным превращениям. Гуанидиновая группа может влиять на ионные взаимодействия и пространственную ориентацию фермент-субстратного комплекса.

В нашей работе мы впервые обратили внимание на очень перспективную в смысле поиска антикоагуляционной активности группу производных хинолина и гидрохшкшша (табл.7). Субстанции 1-8 были получены с авторской модификацией уже известных схем синтеза (Сидорин Д.Н. и соавт.,1992; Лесничук С.А. и соавт., 1998).

Таблица?

Влияние производных хииолипа и гидрохиполнна на тромбиниидуцированную

агрегацию тромбоцитов

Пазвание вещества, индекс Брутто-формула Параметры агрегации

Пнгибирова- ние агрегации, % Максимальный средний радиус, у.е. Показатель агрегации, у.е.

2-Пиперазинил-6-нитрохинолин, 1 С13НиК4Ог 10.3+0.7* 2.9+1.1 4.8±1.7

6-Ннтро-2-тиоморфо-лшшлхинолин, 2 0.05±0.03* 2.3±1.44 4.3+1.1*

2-Тиоморфолинил-хинолин, 3 СцНм!^ 55.5±1.7* 6.1+1.3* 10.0±3.3*

1-Метил-2-(1-пиперазинил-4-0,0-диэтиламидофосфат)-хинолвний йодид, 4 С18Н271Ы30зР 100.9+9.8 20.7+4.9 429.9+13.3

и-(]\'-Тиочорфолинлл)-хинальдин, 5 С^Н,«^ 480.7+13.7* 13.0+2.3* 41.0±8.8*

2-Метил-4-пиперидил-6-метоксихинолин-гадрохлорид, 6 С16Нг2СШ20 101.7+2.3 21.9+7.7 434.7±14.2

2-Метил-4-пиперазинил-6-метоксихинолин гидрохлорид,7 С15Н2,С1зЫ20 104.2+4.5 20.9±3.4 444.5±14.7

2-Метил-4-(М-тиоморфолинил)-6-метоксихинолин, 8 С.зН^БО 130.5+5.6* 22.5±4.9 120.0+12.5*

З-Перфторцикло-гексаиамидохинолин, 9 С16Н7РМО 99.Ш.5 39.5+5.6 400.0+34.6

3-(5-Хлортенонл-2)-амидохинолин, 10 С.ЛСШгОЭ 180.918.9* 20.0±4.3 99.0+11.1*

2-Фенил-4-(3-этоксикарбонил-4,5,6,7,-тетрагндробензо[Ь]тиени л) амидохинолин, 1X СуНи^О^ 350.9+17.6* 12.2+2.1* 36.2+8.3*

2-Фенил-4-(3- этоксикарбонил-б-метнл- 4,5,6,7- тетрагидробензо[Ь] тиенил)амидохинолин, 12 С2!К27Ы2ОЗ5 90.8±7.8 20.0+1.7 43.0+4.3*

2-Фенил-4-(4-ннтрофенил-13-тиазолоил)-амидохннолин, 13 С25Н27^0з8 90.3+6.1 7.0+1.2 14.0+3.0*

2-Фенил-4-пиколнл-амидохинолин, 14 СиН17№0 95.9+7.3 19.7+3.2 67.7+4.1*

Фталоил-1,1-5ис(1,2,3,4-тетрагидрохинолин), 15 45.0±6.7* 6.1+2.1* 36.0+5.9*

1-(5-Бромфуроил-2)-1,2,3,4- тетрагидрохинолин, 16 CmHUBtNO 30.7±8.5* 6.1±2.3* 10.0±5.1*

Тромбин - 100 21.0±3.1 440.0±6.7

Гирудии - 0.02±0.01* 1.7+0.7* 3.9±1.1*

*- данные достоверно отличаются от контроля (тромбин) (р<0.01).

Вещества 9-16 синтезированы впервые. Действующая концентрация субстанций равнялась 10 мкМ. Для сравнения со стандартом приведены данные испытаний гирудина фирмы «Sigma» (5 ATXJ/мл).

Как видно из таблицы, в присутствии тромбина (S Ед/мл) производные хинолина и гидрохинолина способны оказывать выраженный агрегационный и антиагрегаыионный эффекты. Значимость отдельных функциональных групп еще предстоит окончательно уточнить, однако, очевидно, что вещества 1, 2, 3, 15, 16 успешно способствуют дезагрегации, причем вещество 2 на уровне стандарта.

Был проведен одновременный скрининг перспективных субстанций в тестах тромбинового времени и времени рекальцификации плазмы. Выраженный и достоверный эффект увеличения тромбинового времени, т.е. влияния на ферментативную активность тромбина, был обнаружен при исследовании только вещества 16 (139%). В тесте рекальцификации, характеризующем внутренний путь свертывания крови, эта субстанция несколько ускоряла процесс (88% от контроля).

Вещество 1 напротив, достоверно замедляло процессы внутреннего пути свертывания (138%), не оказывая влияния натромбиновое время.

Представляет интерес и обратный эффект веществ 5, 8, 11. Эти результаты позволяют рассматривать эти субстанции в качестве потенциальных стимуляторов агрегации тромбоцитов в присутствии тромбина. Средний радиус агрегатов при этом существенно ниже, чем при использовании только одного тромбина. Возможно использование веществ 5, 8, 11 в качестве адъюваятов при тромбининдуцированной окклюзии, создаваемой в лечебных целях.

Таким образом, группа перспективных веществ включает в себя субстанции 1, 2, 3, 5, 8, 11, 15, 16. При этом механизмы реализации эффекта могут быть различными и не затрагивать процессы непосредственной тромбиновой активации внутриклеточных процессов.

Было проведено сравнительное изучение ангикоагуляционных свойств производных хинолина с производными индола, 10,11-дигидро-5Н-дибенз[Ь, f]a3eniiHa,

2-оксо-1-пирролидино-2-бутина, камфоры, дифенилуксусной кислоты, 4,5,6,7-тетрагидробензтиофена,сульфониламидосодержащих, гидразоносодержащих,

гуанидиносодержащих соединений из банка МНИИМЭ (подробный перечень 44 протестированных веществ с указанием их физико-химических свойств приведен в тексте диссертации). Не было обнаружено существенных изменений параметров коагуляции как при исследовании внешнего, так внутреннего пути свертывания крови.

Для выяснения возможности использования для регуляции тромбининдуцированной пролиферации вещества 1,2, 3, 5,16 были протестированы на стимулированных тромбином клетках BSMC. В предварительных экспериментах на культурах MCF-7, HeLa, BSMC было обнаружено отсутствие выраженного токсического эффекта субстанций (1С5о>200мМ).

Как видно га табл.8, все испытанные вещества оказывают влияние на индуцированную тромбином пролиферацию гладкомышечных клеток, что может быть связано с модуляцией работы тромбиновых рецепторов. Наиболее выражен эффект при использовании субстанции 16.

Таблица 8

Влияние производных хинолина и гидрохинолина на тромбин индуцированную

пролиферацию гладкомышечных клеток BSMC

Индекс вещества ICso, мкМ

1 4.0

2 2.1

3 2.3

5 1.9

16 0.9

Таким образом, производные хинолина и гидрохинолина способны проявлять коагуляционную и антикоагуляционную активность, которая может быть связана с модуляцией внутреннего и внешнего пути свертывания крови, ферментативной активности тромбина, а также с функционированием специфических рецепторов. При этом присутствие тиоморфильной и тиенилоильной групп в качестве заместителей приводит к искомому результату, а придание хинолиновым соединениям амидной функции завершается, как правило, исчезновением целевой активности. Наиболее

перспективными для дальнейшего использования представляются субстанции 1, 2, 3, 5, 11, 15, 16.

Представляется целесообразным синтезировать и испытать новые производные хинолина и гидрохинолина с серусодержащими гетероциклическими заместителями в разных положениях.

Получение природных антикоагулянтов из медицинской пиявки и оценка их биологической эффективности

Гирудин является одним из наиболее эффективных ингибиторов тромбина с Ki = 6.3xlO"nM (Chang J., 1983) и рассматривается многими исследователями в качестве наиболее перспективного регулятора эффектов тромбина (Beretz А., 1991). Для выделения гирудина из натурального сырья - медицинских пиявок Hirudo medicinalis, был оптимизирован метод Markward F. (1970). Процедура выделения состояла из этапов экстракции и фракционирования (табл.9). Экстракция сводилась к последовательной обработке пиявок 96% этанолом с последующим отсечением головных частей и дополнительным обезвоживанием в этаноле в течении суток. После гомогенизации проводили экстракцию 40 % ацетоном с осаждением балластных белков и выпариванием ацетона под вакуумом. Специфическая активность экстракта была достаточно высокой и находилась в пределах от 540 до 720 ATU/мг белка в зависимости от сезона.

Таблица 9

Выделение гирудина

Содержание процедуры выделения Сухой вее, мг Специфическая активность, (ATU/мг)

Экстракция 920 720

Фракционирование 25 17200

В отличие от метода Markward F. в дальнейшем было проведено фракционирование и очистка препарата на обращеннофазовой HPLC (колонка Nucleosil-C18). Для разделения использовали градиентное элюирование в системе вода: ацегонитрил от 0 до 70% ацетонитрила за 60 мин. Воду и ацетонитрил подкисляли трифторуксусной кислотой до концентрации 0.1%, рН 2.0.

Был получен препарат ингибитора в состоянии, близком к гомогенному и идентичном гирудину фирмы «Sigma» (рис.7). Использование предложенной нами методики позволило значительно сократить время выделения и увеличить в среднем в

1.5 раза выход продукта (до 17200 АТи/мг белка). В лиофплизпрованном состоянии препарат был стабилен в течении двух лет при хранении при -20° С.

Рис.7 Результаты очистки гирудина методом HPLC. А - экстракт пиявок до очистки; В - гирудин фирмы «Sigma»; С - очищенный гирудин.

Тестирование биологической активности выделенного препарата проводили последовательно в тестах тромбинового времени, рекальцификации плазмы, агрегации тромбоцитов и пролиферации клеток BSMC. По всем характеристикам выделенный нами гирудин в концентрации 4.5 ATU/мл не отличался достоверно от гирудина фирмы «Sigma».

Системные эффекты гирудотерапии, в том числе и влияние на психологическое состояние пациентов, отмечены рядом исследователей (Савинов В.А, 1998; Никонов Г.А, 1998). Для изучения роли гирудина в этих процессах использовали тест на определение работоспособности, координации движений и выносливости на приборе «вращающийся стержень» (Rota Rod) и оценку психоэмоционального состояния лабораторных животных по методу «открытое поле».

До инъекции препарата средние показатели в удержании крыс на вращающемся стержне не имели достоверных различий. Через 20 часов после внутрибрюшинного введения экстракта наблюдали достоверное (р>0.05) уменьшение времени удержания в 1.43 раза в группе животных, получившей дозу 30 ATU/кг. Анализ значений удержания позволяет сделать вывод наличии тенденции к нарастанию тормозного действия на процесс приобретения навыков, что приводит к снижению работоспособности и координации движений.

С

Через 24 ч после внугрибрюшинного введения гирудина в дозе 30 АТи/кг было отмечено снижение пассивной и активной составляющей

ориентировочноисследовательской деятельности (принюхивание и локомоторная активность) и вертикальной (стойки) исследовательской активности по сравнению с фоновым значением этой группы и контролем (рис.8).

Критерии оценки

Рис.8 Влияние гирудина на ориентировочноисследовательскую деятельность крыс. А -принюхивание; В - локомоторная активность; С - стойки. Столбцы гистограмм последовательно отражают данные исследований контрольной группы и опытных после введения гирудина в концентрации 5 АТИ/кг и ЗОАТШкг.

Дисперсионный анализ данных позволил установить достоверность влияния разных концентраций препарата на психоэмоциональное состояние крыс, причем максимальную силу влияния фактора (91%) отмечали через сутки после введения экстракта.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что введение животным гирудина обнаруживает влияние на центральную нервную систему и приводит к снижению локомоторной, исследовательской активности, а также к тормозному влиянию на процессы обучения. По-видимому, гирудин играет определяющую роль в развитии психоэмоциональных реакций на трудотерапию. Подобная оценка центральных эффектов позволяет предположить наличие цепи тромбинзависимых нейроэндокринных реакций, по которым реализуются обнаруженные феномены.

Кроме гирудина в наших экспериментах оценивалась биологическая эффективность других препаратов натурального происхождения, выделенных из

медицинских пиявок. Фермент дестабилаза (3iiflo-s-(y-Glu)-Lys- изопептидаза), любезно предоставленный для исследований сотрудниками Института биоорганичсской химии им. М.М.Шеиякина и Ю.А.Овчииникова PAIi (Завалова Л.Л., Баскова И.П.) обладает существенной антиагрегантной активностью (Baskova et al., 1997) и проявляет способность лизировать стенки грамотридательной бактерии Micrococcus lysodecticus (Zavalova et al, 1999, Baskova et al, 1999).

В нашей работе исследовали влияние высокоочищенного препарата дестабилазы полученного по методу Zavalova ct al, (1996), на взвесь ацетонового порошка Micrococcus luteus в фосфатно-солевом буфере, рН 6,2, в сравнении с яичным лизоцимом. Лизоцимоподобную активность определяли нефелометрически по степени просветления исходной взвеси. Показано, что активность дестабилазы примерно в 10 раз выше, чем таковая яичного лизоцима. Результаты испытаний гирудина не отличались от контрольных. Такие ингибиторы сериновых и SH-зависимых протеиназ как йодацетамид, лепстатин, лейпептин, о-фенантролен, ЭДТА, PMSF не ингибировали лизоцимоподобную активность дестабилазы. Ингибиторы гликозидазной активности лизоцима - тримерные и тетрамерные олигомеры N-ацетилглкжозамина - подавляли способность дестабилазы и яичного лизоцима лизировать стенки Micrococcus luteus. Дестабилаза в концентрации 20 мкг/мл блокирует рост клеток Aeromonas hydrophila, микроорганизма-симбионта медицинской пиявки, обитающего в ее кишечном канале. Фермент также подавляет рост культуры K.coli 078 и не влияет на рост культуры клеток Salmonella dublin 373.

Таким образом, некоторые антикоагулянты натурального происхождения способны проявлять активность не только в отношении свертывания крови, но и другие виды специфической активности. Их индивидуальные особенности позволяют им определенным способом модулировать внутриклеточную динамику.

Для проверки последнего предположения были проведены опыты по сравнительному изучению способности гирудина (4.5 ATU/мл) и дестабилазы (20 мкг/мл) изменять внутриклеточные показатели. Использовали лимфоциты здорового донора и динамический режим компьютерного лазерного фазового микроскопа «Цитоскан». Наряду с появлением большого числа новых внутриклеточных осцилляций непосредственно после добавления дестабилазы (4.0; 6.0; 6.4; 7.5; 10.1 Гц), наличие в реакционной среде гирудина не вызвало достоверных сдвигов обмена.

На основании предположений ряда авторов (Голыши, 1946; Kessler, 1995) были предприняты попытки выделения дестабилазы из культуральной жидкости, полученной в результате выращивания микроорганизма-симбионта медицинских пиявок Aeromonas hydrophila.. Был успешно выделен и охарактеризован новый штамм бактерий. Однако, при выращивании на синтетической среде, содержащей сульфат магния, двузамещенный фосфат калия, однозамещенный цитрат натрия и хлористый натрий, в культуральной жидкости не было обнаружено следов изопептидазной и гликозидазной активности. Эксперименты могут быть продолжены на более сложных средах. Изучение специфически! и токсикологических свойств рекомбннантных Фактора некроза опухолн-В и производных фактора некроза опухоли-g в качестве потенциальных регуляторов активности тромбина

Описанные выше результаты модуляции тромбининдуцированной функциональной активности клеток TNF-a дали основания для продолжения поисковых исследований в области регуляции эффектов тромбина с использованием рекомбинантных препаратов фактора некроза опухоли-ß (лимфотоксина) (TNF- ß) и производных фактора некроза опухоли-a (слитные белки фактор некроза опухоли-a-al-тимозин и al-тимозин-фактор некроза опухоли-a (слитные белки TNF-a-alT и а1Т-TNF-a)). Препараты для исследований были любезно предоставлены сотрудниками ГНЦ прикладной микробиологии д.б.н. A.A. Денисовым (TNF-ß) и д.б.н. В.А. Шмелевым (слитные белки TNF-a-alT и alT-TNF-a).

Проведенные на первом этапе исследования рекомбинантных цитокинов и их производных в экспериментах по тестированию острой и хронической токсичности не выявили значительных нарушений гомеостаза в организме беспородных крыс, кроликов (шиншилла), обезьян (павианы гамадрилы). При этом в сыворотке крови подопытных животных определяли широкий спектр показателей клинической биохимии и гематологии: тестировали уровень общего белка, глюкозы, холестерина, протромбина, креатинина, мочевины, аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочной фосфатазы в сыворотке крови (Меньшиков В.В., 1987), количество гемоглобина, лейкоцитов, формула крови (Кудрявцев A.A., Кудрявцева Л.А, 1980). Как правило, отклонения не превышали 20-30% от контроля.

Тем не менее, обращает на себя внимание обнаруженная в ряде экспериментов по исследованию хронической токсичности лимфотоксина и TNF-a-alT тенденция к повышению протромбинового индекса в 1.4-1.5 раза. Максимальные изменения для

лимфотоксина отмечены на седьмые сутки внутрибрюшинного введения самкам крыс в дозе 10000 Ед/кг и самцам кроликов через сутки после однократной инъекции в дозе ЮОООО Ед/мл - 155% и 145% соответственно. TNF-ct-alT вызывал аналогичные сдвиги гемостаза в крови крыс-самок на 21 сутки введения препарата в дозе 200 мкг/кг (148%).

Эффективность TNF-p на клеточном уровне определялась как изменения морфометрических и динамических показателей лимфоцитов здорового донора после добавления в среду лимфотоксина в концентрации 100 нМ. Обнаружено, что через час после добавления препарата изменялись все основные морфометрические показатели, причем характер выявленных отклонений в целом соответствовал описанному выше для TNF-a. Достоверно снижались значения периметра клеток (на 48.5%), объема (на 42,3%) и площади (44.7%).

Динамическая характеристика лимфоцитов, обработанных TNF-P также отличалась своеобразием. Общим для действия обоих факторов некроза опухоли является усиление колебаний внутри клетки с частотой 6.2; 8.7, 9.7, 11.2; 13.5 Гц. Частоты 6.2; 8.7; 9.7; 13.5 Гц характерны для тромбинового влияния на лимфоциты. Кроме того, TNF-|J вызывал дополнительные специфические осцилляции в области 12.8; 13.0 Гц.

Изменения динамических характеристик клеток свидетельствуют о значительных сдвигах обменных процессов внутри клетки, в том числе и в ее ядре. Эти данные соотносятся с результатами изучения специфической токсичности препаратов, и прежде всего, мутагенной активности. Изучение мутагенной активности TNF-(B in vitro проводили в культуре лимфоцитов человека. Определяли структурные нарушения в метафазе 1 митоза при воздействии препаратом в дозе 5x103 Ед/л крови. Культивирование лимфоцитов проводили по стандартной методике в среде RPMI в присутствии эмбриональной сыворотки и фитогемагглютинина (ФГА) (10 мкг/мл) (МакГрегор Г. и соавт., 1986; Дарлингтон С. и соавт., 1980). В экспериментах in vivo определяли наличие хромосомных аббераций в костном мозге крыс, которым предварительно вводили TNF-P в дозах 5х103 и 5х104 Ед/мл. Оценка мутагенной активности препаратов TNF-a-alT и alT-TNF-a была проведена по тестам: учета доминантных летальных мутаций на дрозофиле (0,2 мг/мл корма); учета аберраций хромосом в культуре лимфоцитов периферической крови человека (5 мг/л, 1,0 мг/л, 0,33 мг/л среды), учета аберраций хромосом в клетках костного мозга мышей. В опытах

in vivo препарат вводили мышам СВА обоего пола однократно и в течение 5 дней в дозе 50 мкг/животное.

Полученные в итоге результаты свидетельствуют о том, что воздействие TNF-P вызывало in vitro определенный мутагенный эффект ( 0,12 повреждений на клетку). Из табл. 10 видно, что при воздействии TNF-3 возрастало количество аберрантных клеток и перестроек в хромосомах. При этом наблюдались только хроматидные и изохроматидные разрывы, обменных перестроек не было.

Таблица 10

Результаты изучения мутагенного эффекта лимфотоксииа

Препарат Количество Аберрантные Перестройки

проанализированных клетки

метафаз Число % Число %

Физиологический 376 2 0.50+ 2 0.50±0.

раствор (контроль) 0.03 03

TNF-P, 5х103 Ед/мл 207 24 11.50+ 0.50* 21 10.15± 0.60*

*- данные достоверно отличаются от контроля (р<0.01).

При воздействии лимфотоксина ш vivo мутагенный эффект составлял 0.06-0.09 перестроек на клетку и не зависел от использованной дозы.

При изучении производных TNF-a во всех тестах был выявлен мутагенный эффект. При этом степень мутагенности на ранней стадии эмбриогенеза у дрозофилы оценивается в 1 балл (слабый мутаген). В большинстве экспериментов на костном мозге мышей и лимфоцитах человека наиболее частой мутацией являлись делеции, приводящие к кольцевым образованиям, что позволило оценить уровень мутагенности препаратов как средний.

Таким образом, препараты рекомбинантных цитокинов в исследованных дозах не вызывают значительных токсических изменений на уровне как отдельных клеток, так и целостного организма. Вместе с тем, с точки зрения регуляции биологических эффектов тромбина, следует отметить умеренные сдвиги протромбинового индекса в экспериментах ш vivo, а также способность цитокинов модулировать работу наследственного аппарата.

Для развития исследований представляло интерес сопоставление результатов TNF-a-зависимой негативной регуляции тромбининдуцированного митогенного эффекта с действием лимфотоксина и производных TNF-a в тех же условиях (рис.9). Во всех экспериментах сохраняется единая направленность регуляторного воздействия.

Тромбининдуцируемая пролиферация гладкоиышечных клеток успешно угнетается всеми препаратами, причем для ТКР-[$ в меньших концентрациях, чем ТКР-а.

alphalT TNF-alpha

Препараты

Рис.9 Ингибирование тромбининдуцированной пролиферации клеток BSMC препаратами рекомбинаетных цитокинов.

Изложенные выше результаты изучения различных способов модуляции биологических эффектов тромбина позволили сформулировать гипотезу о возможности их применения для регуляции опухолевого роста. Ключевыми моментами этой регуляции могут явиться ингибирование активности тромбина в биологических жидкостях, а также изменение рецепторопосредованных сигналов на уровне тромбоцитов и опухолевых клеток, например, при применении рекомбинантных цитокинов.

Регуляция опухолевого роста с использованием препаратов природных антикоагулянтов и рекомбинантных цитокинов Противоопухолевая активность гируднна

По мнению ряда авторов, наличие тромбиновых рецепторов на поверхности опухолевых клеток является маркером метастазирования. (Even-Ram et al, 1998). При этом грызуны являются наиболее приближенной к человеку моделью для испытаний гирудина in vivo в силу схожего характера взаимодействия человеческого и мышиного тромбина с ингибиторами (Maraganore et а!., 1989). Экспериментальные исследования по применению специфического ингибитора тромбина - рекомбинантного гирудина в дозе 10 мг/кг за 60 мин до введения опухолевых клеток меланомы В-16 мышам линии

С57В1/6 показали радикальное снижение уровня метастазов в легких (Егкигш е1 а!., 1991).

Гирудин, АТШмл

Рис.10 Влияние профилактического введения гирудина на приживаемость клеток меланомы В-16. 1 - контрольная группа; 2-0.5 АТи/кг; 3-10 АТи/кг; 4 - 100 АТО/кг; 5 - 300 АТО/кг.

Сходные результаты на той же модели были получены в нашей лаборатории после семидневного профилактического подкожного введения препаратов высокоочшценного гирудина натурального происхождения в дозах от 0.5 до 300 АТи/кг. Максимальные дозы гирудина полностью препятствовали приживлению клеток меланомы В-16 в месте инокуляции и развитию метастазов у мышей самцов линии С57В1/6. В контрольной группе динамика развития опухоли не изменялась (рис.10) Эти данные соотносятся с ингибирующим влиянием рекомбинантного гирудина на экспрессию тканевого фактора на поверхности эндотелия, на поверхности бедренных артерий кролика и коронарных артерий свиньи после длительной 14 суточной инфузии через имплантированный насос в дозе 0.7 мг/кгхсут (ОеПх й а1., 1998).

Учитывая описанные ранее данные о воздействии гирудина на психоэмоциональное состояние животных и рекомендации для применения препаратов из медицинской пиявки у онкологических больных, изложенных в работе В.А. Савинова (1994) для дальнейшей проверки эффективности лечения препаратами гирудина выбирали опухоли с высоким уровнем метастазирования, но соответствующие критериям автономности и относительной независимости от

центральных регуляторных воздействий. Использовали перевиваемые культуры рака легких мышей (РЛ-67) и саркомы сирийского хомяка (ХОП). Образцы этих опухолей были получены из банка Всероссийского Онкологического Центра.

Лечение мышей С57В1/6, зараженных РЛ-67 осуществляли в ряде экспериментов. Первоначальные опыты по внутрибрюшинному и внутриопухолевому введению препарата не дали искомого результата. Однако, подкожное введение гирудина в дозах от 300 до 1500 АТО/кг приводило к существенному ингибированию роста опухоли (до 81.0% при максимальных дозах). У всех животных опытных групп не было обнаружено метастазов в легких. Эффект увеличения продолжительности жизни животных не выявлен.

Лечение саркомы хомяка осуществляли на разных сроках развития заболевания. В двух экспериментальных группах в течение двух дней перед перевивкой опухоли препарат вводили с профилактической целью в дозах 2.5 и 30.0 АТО/кг (суммарные дозы - 5.0 и 60.0 АТО/кг). В тех же дозах в двух других группах экстракт вводили в течение двух дней непосредственно после перевивки. На поздней стадии развития опухоли лечение начинали на 15 сутки в ежедневной дозе 30.0 АТи/кг и продолжали в течение 4 дней (суммарная доза 120 АТи/кг). В контрольных группах подкожно вводили эквивалентное количество растворителя (физиологический раствор).

При анализе данных по измерению массы тела животных отмечена тенденция к ее снижению во всех экспериментальных группах на 30.0-40.0%. Исключение составили группы хомяков, получивших лечение в первых два дня после перевивки опухоли. В этих группах животных отмечали возрастание массы опухоли в процессе эксперимента. Ингибирование роста опухоли отмечено только в группе с поздним началом лечения в течение непродолжительного времени (8 суток) и составляло 10,0-15,0%. Однако, в контрольные сроки (на 40 сутки эксперимента) количество выживших животных в группах, получавших лечение, всегда превышало контрольные цифры и составило 25,0% и 75,0% при раннем начале лечении в дозах 5.0 и 60.0 АТи/кг (в контрольной группе - 0%). Профилактическое введение препарата в дозе 5.0 АТи/кг обусловило выживание на 40 сутки 40.0% хомяков, в дозе 60.0 АТи/кг - 56.6% (в контрольной группе - 20.0%). При позднем начале лечения к 40 суткам в опытной группе оставалось 33.3% животных, а в контрольной - 16.6%.

На этапе завершения экспериментов с ранним началом лечения на 120 сутки после начала в контрольной группе не оставалось ни одного животного. Результаты

соотношения максимальных опытных и контрольных значений в удаленные сроки (120 сутки) наблюдения представлены на рис.11.

2 3

Способы лечения

Рис.11 Сравнительная оценка различных схем лечения гирудином саркомы сирийского хомяка. Левый столбец в каждой группе данных относится к опытной группе, правый -к контрольной. 1 - раннее начало лечения (по 30 АТи/кг в течении первых двух суток); 2 - профилактика (по 30 АТШкг в течении двух суток до перевивки опухоли); 3 -позднее начало лечения (начало лечения на 15 сутки, по 30.0 АГО/кг в течение 4 суток).

Отношение медиан времени жизни в опытной и контрольной группе отражало действие препарата на продолжительность жизни хомяков (ЗоЬпшга , 1986). Оно составило для групп с ранним началом лечения 123,0% и 158,0% (суммарные дозы-5.0 и 60.0 АШ/кг). При профилактическом введении препарата доза 5.0 АТШкг привела к увеличению продолжительности жизни до 119.0%, а доза 60.0 АТи/кг -143.8%. Позднее начало лечения обладало минимальным эффектом, продолжительность жизни по сравнению с контролем составила 109,0%. У всех животных опытных групп не было обнаружено метастазов в лимфатических узлах.

При анализе полученных результатов обращает на себя внимание разница в клинических проявлениях и исходах заболевания в зависимости от дозы препарата и сроков его введения. Максимальный эффект достигался инъекциями на ранних сроках развития опухоли в суммарной дозе 60.0 АШ/кг.

Таким образом, гирудин обладает противоопухолевой активностью в отношении саркомы сирийского хомяка, меланомы В-16 и карциномы мышей РЛ-67. Характер проявления этой активности зависит от типа опухоли, дозы препарата,

времени и способа его введения. Не исключено опосредованное влияние гирудина на иммунный противоопухолевый ответ.

Влияние гипудииа на Формирование иммунного ответа при экспериментальной сальмопеллезной инфекнин

Для изучения возможности влияния гирудина на развитие иммунного ответа использовали модель экспериментального сальмонеллеза и подкожное введение препарата в дозах от 30 до 300 ATU/кг интактным и вакцинированным штаммом S:dublin б в дозе 2х102 м.к. на животное нелинейным мышам-самцам (54 пгг.). Мышей заражали вирулентным штаммом S.dublin 373 в дозе 2х104 м.к. одновременно с введением препарата Результаты оценивали по критериям выживаемости, антителообразования и изменения массы тела.

Было показано, что в отличие от контроля, где все животные погибли к 14 сут, в опытных группах увеличивалась продолжительность жизни животных (до 80 % в группе вакцинированных и до 60 % в группе интактных мышей при лечении в дозе 300 ATU/кг) вплоть до полного выздоровления при наблюдении в отдаленные сроки (60 сут). Лечение гирудином не оказывало влияния на динамику антителообразования.

Таким образом, использование препарата природного ингибитора тромбина способствовало усилению иммунного ответа, преимущественно его клеточного звена Аналогичную гирудиновой противоопухолевую активность можно предполагать и при использовании антикоагулянтов иного происхождения.

Противоопухолевая эффективность сапониновых фракций корня красного женьшеня

Известно, что растительные экстракты, содержащие сапонины и родственные им соединения, могут обладать антикоагуляционной активностью (Beretz А, 1991; Колхир и соавт., 1995). При этом экстракты женьшеня (гинзеноиды) способны модулировать клеточный иммунный ответ у мышей с экспериментальными опухолями, а также способствовать увеличению хемотаксиса лейкоцитов, цитотоксичности естественных киллеров и угнетению пролиферации опухолевых клеток (Park et al., 1993; Lee et al., 1993; Давыдов и соавт., 1995; Александров и соавт., 1995).

Способность триоловых сапониновых фракций красного женьшеня (ТСП) усиливать резистентность к дозе трансплантируемых опухолевых клеток проверялась в эксперименте да vivo на модели перевиваемой мышиной опухоли - меланоме В-16. В качестве реципиентов использовались половозрелые самки мышей линии C57BL/6 в количестве 29 и 32 штук в контрольной и опытной группах соответственно. Суммарная

фракция триоловых сапонинов красного женьшеня для исследований была любезно предоставлена проф., д.б.н. С.А. Чепурновым.

Показано, что внутрибрюшинная курсовая премедикация ТСП в дозе 1 мг/мышь в течение 7-и суток, включая день трансплантации опухолевой ткани реципиентам в объеме 0,2 мл и разведении 1:10 (ткань-среда), приводит к увеличению латентного периода постгрансплантационной адаптации опухолевых клеток и появлению фактов полного отсутствия опухолевого роста в ходе всего эксперимента (12%). Первый результат указывает на изменение характеристики роста меланомы В-16, что выражалось в замедленном формировании пальпаторно определяемой опухоли (к 12-м суткам после трансплантации клеток количество животных с развившейся опухолью составляло в опытной и контрольной группе 69% и 100% соответственно), второй -на состояние противоопухолевой резистентности организма реципиента. Возможно, что эти события связаны с антикоатуляционной активностью препаратов, а также могут быть вызваны сдвигами в эндокринном статусе животных, в связи с близким химическим строением молекул триоловых сапонинов и стероидных гормонов; изменениями в иммунологической реактивности; прямым цитотоксическим действием ТСП на опухолевые клетки.

Таким образом, ТСП способны участвовать в формировании реакций, направленных на торможение опухолевого роста по пути усиления резистентности к дозе злокачественных клеток, инициирующих опухолевый роет. Профилактический эффект гинзеноидов соотносится с описанным ранее влиянием гирудина на приживаемость меланомы В-16.

Сравнительная оценка противоопухолевой эффективности рекомбинаитных цитокинов

Были проведены исследования противоопухолевой активности

рекомбинаитных TNF-ct, alT, а также слитных белков TNF-a-alT и alT-TNF-a. Кроме того использовали комбинацию TNF-a и alT между собой и с добавлением гирудина. Определение противоопухолевой активности препаратов проводили в опытах на самках мышей линии C57BL/6 весом 20-25 г, которым была перевита опухоль рака легкого (РЛ-67). В каждой экспериментальной группе было не менее 7 животных. Лечение начинали на 10 сутки после перевивки опухоли. Курс лечения длился в течение 7 суток. Препараты вводили внутрибрюшинно. TNF-a TNF-a-alT и alT-TNF-a использовали в дозах 5х105 Ед/кг ежедневно. Доза al- тимозина составила 1,0

мкг/кг в сутки. Комбинированное лечение производили введением фактора некроза опухоли в дозе 5х105 Ед/кг и alT в дозе 1,0 мкг/кг. При этом концентрации этих препаратов соответствовали соотношению TNF-a и alT в молекуле TNF-a-alT. Ежедневная доза гирудина при подкожном способе лечения составила 50 ATU/кг.

В ходе лечения цитокинами максимальное угнетение роста опухоли отмечали у мышей, которым вводили белок TNF-a-alT и смесь этих препаратов ( до 60,0-65,0%) (табл.11). Влияние alT на рост опухоли было минимальным, угнетение роста опухоли в этой группе колебалось от 25,0% до 50,0%. Замедление роста опухоли у мышей, которым вводили TNF-a возросло с 42,0% в начале эксперимента до 65,0% на 22 сутки. Однако, к моменту окончания наблюдения (35 сутки) угнетение роста опухоли в этой группе снизилось до 27,0%. Между тем, на 35 сутки уровень этого показателя в группах, подвергнутых лечению слитными белками и комбинацией препаратов, оставался на уровне 60,0-65,0%.

Таблица 11

Сравнительная оценка эффективности лечения рака легких мышей РЛ-67

препаратами рекомбинантных цитокинов и гирудином

Препарат Ингибирование роста опухоли на 22 сут, %

TNF-a 54.5+4.8

alT 29.3+9.3

TNF-a-alT 63.7±6.9

alT-TNF-a 50.7±4.1

TNF-a, a IT 65.2±3.8

TNF-a, alT, гирудип 83.6+3.5*

TNF-a-alT и гирудин 72.3±6.4

Гирудин 61.5+7.5

* - различия с результатами испытаний цитокинов и гирудина достоверны (р<0.05);

Наибольшего успеха удалось достичь при комбинированном лечении гирудином и смесью TNF-a и alT (до 83%). Комплексное лечение на основе смеси слитного белка TNF-a-alT и гирудина выявило несколько менее выраженный эффект (70%)..

Во всех группах отмечено умеренное увеличение продолжительности жизни животных около 110,0%.

Таким образом, в ходе экспериментов показана противоопухолевая активность TNF-a, alT и их производных. Максимальная активность отмечена у белка TNF-a-alT и при использовании комбинации этих препаратов. Добавление гирудина способствовало улучшению результатов лечения.

Результаты проведенных in vivo исследований обнаруживают значительную противоопухолевую эффективность природных ангикоагулянтов и рекомбинантных цитокинов, и, следовательно, доказывают возможность использования этих препаратов для регуляции функциональной активности клеток на организменном уровне.

Общие выводы

1. Изучены особенности внутриклеточных изменений под действием тромбина. Митогенный эффект тромбина зависит от состава среды, типа клеток и наличия специфических ингибиторов или регуляторов внутриклеточных обменных процессов. Добавление гирудина и TNF-cc способствует отмене эффекта.

2. В результате экспериментов на различных типах клеток была продемонстрирована возможность рецепторопосредованной тромбининдуцированной модуляции содержания одного из ключевых вторичных мессенджеров - ионов Са2+. Для проявления обнаруженных феноменов необходимо наличие ионов Са2+во внеклеточной среде. Протеолитическая активация тромбиновых рецепторов является ключевым звеном процесса.

3. При морфомегрических исследованиях клеток крови человека и фибробластов крысы в зависимости от способа воздействия на клетку обнаружены значительные изменения формы клеток. Влияние эксграцеллюяярных факторов приводит к уменьшению значений параметров. Процесс Ras-трансформации клеток характеризуется увеличением показателей.

4. Проведен сравнительный анализ внутриклеточной динамики нормальных, опухолевых и трансформированных клеток в ингакгном состоянии и после воздействия различных факторов регуляции клеточной активности (тромбин, EGF, TNF-a, АФП). Обнаружено, что воздействие каждого из испытанных факторов приводит к возникновению новых внутриклеточных колебаний, частоты которых частично встречается только в экспериментальных условиях опытах и отсутствуют в контроле. Для влияния тромбина характерны осцилляции 6,2; 10,9 Гц..

5. Показано, что некоторые опухолевые клетки (А-431; Н-69; LNCaP; HeLa) могут контролировать способность тромбоцитарной плазмы к свертыванию и запуску каскадных путей активации факторов свертывания, влиять на адгезию тромбоцитов, активность тромбина в биологических жидкостях, и, как следствие, изменять свою

функциональную активность. Минимальный эффект обнаружен в случае изучения культуры MCF-7, на которой отсутствуют рецепторы тромбина.

6. Сформулировано положение о многоуровневое™ регуляции множественных биологических эффектов тромбина. Регуляторные воздействия могут осуществляться как на стадии работы самого фермента и его взаимодействия со специфическими рецепторами, так и на этапе передачи сигнала внутрь клетки.

7. Осуществлен синтез и оценена биологическая активность ряда новых производных хинолина и гидрохинолина Установлено, что полученные соединения способны проявлять коагуляционную и антикоагуляционную активность, которая может бьггь связана с модуляцией внутреннего и внешнего пути свертывания крови, ферментативной активности тромбина, а также с функционированием специфических рецепторов. При этом присутствие тиоморфильной и тиенилоилыгой групп в качестве заместителей приводит к искомому результату, а придание хинолиновым соединениям амидной функции завершается, как правило, исчезновением целевой активности.

8. Усовершенствован метод выделения гирудина из натурального сырья.Обнаружено его влияние на функциональную активность центральной нервной системы. Дана сравнительная характеристика гирудина и дестабилазы (3HflO-s-(y-Glu)-Lys-изопептидазы).

9. Установлено, что препараты рекомбинантных цигокинов (слитные белки TNF-a-alT; a IT-TNF-a и TNF- ß) не вызывают значительных токсических изменений на уровне отдельных клеток и целостного организма. Умеренные сдвиги протромбиновош индекса в экспериментах in vivo, а также способность рекомбинантных цитокинов модулировать работу наследственного аппарата позволяет рассматривать данные вещества в качестве потенциальных регуляторов активности тромбина.

10. В опытах in vivo на моделях метасгазирующих новообразований установлено, что гирудин и антикоагулянты растительного происхождения обладают противоопухолевой активностью. Характер ее проявления зависит от типа опухоли, дозы препарата, времени и способа его введения. Показана противоопухолевая активность TNF-a, alT и их производных. Максимальный эффект отмечен у белка TNF-a-alT и при использовании комбинации этих препаратов. Добавление гирудина способствовало улучшению результатов лечения.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Исследование мутагенной активности человеческого рекомбинантного лимфотоксина //Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции "Состояние и перспективы научных исследований в области создания генноинженерных препаратов для медицины и ветеринарии". Оболенск. 1992. С.28. (Соавт. В.М. Борзенков, В.В. Гусев, О.М. Розанова, Е.Э. Гаяасси, Г.В. Ахмадиева).

2. Изучение эффектов рекомбинантного человеческого лимфотоксина на биохимические показатели //Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции "Состояние и перспективы научных исследований в области создания генноинженерных препаратов для медицины и ветеринарии". Оболенск. 1992. С.38. (Соавт. В.М. Борзенков, В.В.Гусев, А.А. Денисов).

3. Исследование токсикологических свойств рекомбинантного лимфотоксина человека //Тезисы докладов П Всероссийского Конгресса "Человек и Лекарство". Москва. 1995. С.49 (Соавт. А.А Денисов, И.И. Любимов, В.М. Борзенков).

4. Противоопухолевая эффективность некоторых сапониновых фракций корня красного женьшеня на модели мышиной меланомы В-16 // Тезисы докладов П Всероссийского Конгресса "Человек и Лекарство". Москва. 1995. С.149 (Соавт. В.В. Гусев, С.А. Чепурнов, И.И. Любимов, В.М. Борзенков).

5. О влиянии цитокинов и их производных на развитие экспериментальной опухоли мышей /Яезисы докладов II Всероссийского Конгресса "Человек и Лекарство". Москва. 1995. С.313 (Соавт. В.В. Гусев, Т.В. Федоров, В.А. Шмелев, C.B. Евсегнеев).

6. Опыт лечения экспериментальных опухолей препаратами из Hirudo Medicinalis //International journal on immunorehabilitation. 1995. N1, P.85 (Соавт. Т.В. Федоров, H.B. Борисов, В.В. Гусев).

7. Перспективы получения препаратов из медицинских пиявок //Материалы научно-практической конференции. Степногорск. 1995. С.67 (Соавт. В.В. Гусев).

8. Extract out of Hirudo medicinalis posseses central effect //European journal physiology. 1995. V.430, N4s, P.39 (Et I. Lyubimov, T V. Phyodorov, V.V. Gusev).

9. Препарат из медицинских пиявок ингибирует развитее саркомы сирийского хомяка //Асклепейон. 1995. N1-4, С.28-30 (Соавт. Т.В. Федоров, Н.В. Борисов. В.Б. Родин, В.В. Гусев).

10. Изучение хронической токсичности субстанции гибридного белка фактор некроза опухоли - тимозин //Тезисы докладов I Всероссийской конференции токсикологов "Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии". Санкт-Петербург, 1995. С.13-14 (Соавт. В.В. Гусев, В.М. Борзенков, С.П. Рыбалкин).

11. Результаты доклинического изучения отечественного рекомбинантного лимфотоксина человека//Биотехнология. 1996. N3, С. 19-26 (Соавт. А. А. Денисов, В.М. Борзенков, И.И. Любимов, В.В. Гусев).

12. Мутагенная активность рекомбинантного гибридного белка ФНО-тимозин //Тезисы докладов 111 Всероссийского Конгресса "Человек и Лекарство". Москва. 1996. С.55 (Соавт. В.В. Гусев, Н.А. Малыгина, Н.Н. Морозов, Д.С. Билева).

13. Living estimation of influence of tumor necrosis factor on human blood lymphocytes: use computer-aided phase microscope //European cytokine network. 1996. V.7, N3, P.476 (Et I. Vasilenko, V. Tychinsky, V. Gusev).

14. Влияние экстракта из головной части Н. Medicinalis на формирование иммунного ответа при экспериментальной сальмонеллезной инфекции // International journal on immunorehabilitation. 1996. N2, P.113 (Соавт. Т В. Федоров, Н.В. Борисов, В.В. Гусев).

15. A new cytometric method of quantitative and qualitative cell evaluation by scanning computer-aided microscope //Proceedings of International Meeting of Scanning microscopy. 1996. Washington. P.372 (Et I. Vasilenko, A. Konradov, O. Slinchenko, S. Babakova).

16. New approach to living estimation of influence of cytokines on immunocompetent cells: use of computer-aided phase microscopy //Proceedings of Spring Meeting of British Society for Immunology. Bristol. 1996. Abn. 147 (Et I. Vasilenko, V. Gusev).

17. Применение компьютерного фазового микроскопа высокого разрешения для изучения структуры ядерного матрикса //Цитология. 1997. Т.39, N1, С.114-115 (Соавт. И. А. Василенко, А.Г.Николаев, С Б. Акопов, В.П. Тычинский, В.В.Гусев).

18. Tumours immunotreatment by cytokines: fundamental aspects and possibilities for further usage //Virus researches. 1997. V.47, N2, P.128 (Et I. Lyubimov, V. Gusev).

19. Мутагенная активность рекомбинантного белка al-тамозина // Тезисы докладов IV Всероссийского Конгресса "Человек и Лекарство". Москва. 1997. С.255 (Соавт. В.В. Гусев, Н А. Малыгина, Н.Н. Морозов, Д.С. Билева).

20. Destabilase from medicinal leech influences upon vital processes in cells of blood

//Proceedings of 13th European Immunology Meeting . Amsterdam. 1997. P.5.23.09 (Et V.Gusev, I.Vasiienko, O.Slinchenko, I. Baskova, L. Zavalova, S. Bereznoy, 0. Laskina).

21. Cytometric análisis of phase images of cellular nucleus of human T-lymphoma JURKAT: use computer-aided phase microscope //Proceedings of SPIE Meeting. San Remo. 1997. Abn.319630 (Et V.Gusev, I.Vasiienko).

22. Прижизненная экспресс-оценка действия новых биопрепаратов: использование компьютерной лазерной микроскопии //Сборник научных трудов ВГНКИ. 1996. Т.59, С. 121-126 (Соавт. И А. Василенко, А. А. Конрадов. В.В. Гусев).

23. Perspectives of development of novel preparations out of medicinal leeches //European journal of pharmaceutical sciences. 1998. V.8, N1, P.79 (Et T.Phyodorov, S. Severin, I. Zykova).

24. Aeromonas hydrophila - бактерия -симбионт медицинской пиявки //Асклепейон.

1998. N1-4, С.73-78 (Соавт. В. А. Савинов, Т.Н. Хомякова).

25. Биологическая роль рецепторопосредованного эндоцитоза //Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 1998. N4, С.75-79 (Соавт. И.Е. Зыкова).

26. Исследование рецепторных систем легких - основа для производства новых лекарственных препаратов//М.: МЕДБИОЭКОНОМИКА, 1999. Ч.1,34С.

27. Исследование рецепторных систем легких - основа для производства новых лекарственных препаратов //М.:МЕДБИОЭКОНОМИКА, 1999.4.2, 32С.

28. Biomedical application of computer-aided laser phase microscope: estimation of properties of bioactive substances //Proceedings of Conference on Biomedical Laser Metrology and Applications. Munich. 1999. P. 173. (Et I. Vasilenko, G. Posypanova, S. Severin, E. Severin).

29. Study of receptor-mediated endocytosis of basic ligands for drug delivery //Proceedings of Seventh European Congress of Biopharmaceutics and Pharmacokinetics. Jerusalem.

1999. P. 153. (Et I. Vasilenko, G. Posypanova, S. Severin, E. Severin, I. Zykova).

30. Изучение рецепторопосредованного эндоцитоза эпидермального фактора роста методами фазовой морфомегрии //Материалы Всероссийского Биофизического Съезда. Москва. 1999 Т.2, С.730-731. (Соавт. И.А. Василенко, Г.А. Посыпанова, С В. Луценко, И.Е.Зыкова, С.Е. Северин).

31. Прижизненная оценка современных средств доставки лекарств //Тезисы докладов VI Всероссийского Конгресса "Человек и Лекарство". Москва. 1999. С.255 (Соавт.

И.А Василенко, Г.А.Посыпанова, С.В.Луценко, А.И. Сотниченко, И.Е. Зыкова, С.Е.Северин).

32. Влияние дестабилазы на состояние клеточных стенок и рост некоторых бактерий // Тезисы VI конференции Ассоциации гирудологов. Пятигорск, 1999, С. 109 (Соавт. С.Н. Бережной, И.И. Артамонова, И.П. Баскова, Н.В. Борисов, Т.Н. Хомякова, Л.Л. Завалова)

33. Сравнительная фазовая морфометрия рецепторопосредованного эндоцитоза эпидермального фактора роста и альфа-фетопротеина II Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2000, N.2, С. 22-28 (Соавт. И.А. Василенко, Г.А.Посыпанова, С.В.Луценко, А.И. Сотниченко, Т.И. Хомякова, И.Е. Зыкова, С.Е.Северин).

34. Новая технология анализа свойств опухолевых и RAS трансформированных клеток: использование лазерной компьютерной фазовой микроскопии // Тезисы докладов VII Всероссийского Конгресса "Человек и Лекарство". Москва. 2000, С.20 (Соавт. А.В. Иванов, И.А. Василенко, О.В. Коломенская, С.В. Луценко, С.Е. Северин)

35. Biomedical application of computer-aided laser phase microscope: estimation of optical properties of tumour and RAS transformed cells //Proceedings of the first euroconference on quantitative molecular cytogenetics. Ban, 2000, P. 183-186 (Et I. Vasilenko, O. Kolomenskaya, T. Khomyakova, G. Posypanova, S. Severin).

36. Тромбин: биологическое значение и пути регуляции активности // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2000, N.3, С.3-13 , (Соавт. С.Е. Северин, А.В. Надежкина).

37. Избирательная регуляция множественных биологических эффектов тромбина // Тезисы докладов Всероссийской конференции «Клеточная биология на пороге XXI века», СПб., 2000, в печати, (Соавт. С.Е. Северин, А.В. Надежкина, О.В. Коломенская, Г. А. Посыпанова).

38. New strategy of anticoagulant design and development: synthesis and evaluation of antithrombotic potential of derivatives of quinoline // Proceedings of 6th European congress of pharmaceutical sciences, Budapest, 2000, in press, (Et L.N. Kryukov, S.E.Severin, A.V. Nadezhkina, E.A. Vorontsov, L.Y. Kryukova, I.I. Krylov, S.L. Kuznetsov, I.A. Yankin, I.E. Zykova).

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Хомяков, Юрий Николаевич

Перечень основных сокращений, условных обозначений, символов, единиц и терминов.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1. Роль тромбина и его рецепторов в регуляции функционального состояния клеток и тканей.

2. Природные и синтетические антикоагулянты и модуляция клеточной активности.

Глава 2. Материалы и методы.

Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение.

1. Исследование роли тромбининдуцированных реакций в функционировании клеток и тканей.

1.1. Исследование эндогенной избирательной регуляции внешнего пути свертывания крови.

1.2. Изучение возможности избирательной регуляции внутреннего пути свертывания крови.

1.3. Исследование регуляции тромбининдуцируемой пролиферации клеток.

1.4. Изучение особенностей внутриклеточной динамики ионов Са2+ в нормальных и опухолевых клетках под действием тромбина.

1.5. Сравнительный анализ морфологии и внутриклеточной динамики нормальных, опухолевых и трансформированных клеток в интактном состоянии и после воздействия различных факторов регуляции клеточной активности.

2. Получение природных и синтетических антикоагулянтов и оценка их эффективности.

2.1. Синтез и оценка биологической эффективности производных хинолина.

2.2. Получение природных антикоагулянтов из медицинской пиявки и оценка их биологической активности.

2.3. Изучение специфических и токсикологических свойств рекомбинантных фактора некроза опухоли - р и производных фактора некроза опухоли-а в качестве потенциальных регуляторов активности тромбина.

3. Регуляция опухолевого роста с использованием препаратов природных антикоагулянтов и рекомбинантных цитокинов.

3.1. Противоопухолевая активность гирудина.

3.2.Влияние гирудина на формирование иммунного ответа.

3.3. Противоопухолевая эффективность сапониновых фракций корня красного женьшеня.

3.4. Сравнительная оценка противоопухолевой эффективности рекомбинантных цитокинов.

4. Обсуждение результатов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Природные и синтетические антикоагулянты и их использование для регуляции клеточной активности"

Нарушение равновесия между свертывающей и противосвертывающей системами крови лежит в основе патогенеза многих заболеваний. Связано это, как правило, с недостаточностью кровоснабжения критического органа и угнетения его функциональной активности. К числу наиболее известных патологий такого рода относятся заболевания сердечно-сосудистой системы и некоторые инфекционные болезни. Кроме того, в поле зрения исследователей находятся митогенные и трансформирующие эффекты факторов свертываемости. Сформировалось представление о связи способности к быстрому росту и распространению в организме клеток различных новообразований с активностью внутреннего пути свертывания крови В этом случае ведущей является роль тромбоцитов и эндотелия.

Эндогенная регуляция множественных биологических эффектов тромбина строго регламентирована и реализуется на различных уровнях: от экспрессии отдельных белковых компонентов и их последующей активации в ходе каскадных взаимодействий между отдельными факторами свертывания до возбуждения специфических рецепторов тромбина и процессов передачи сигнала. Усилия специалистов ведущих научных центров и биотехнологических фирм мира ("Maganin Pharmaceutical Inc.", "Genzyme Molecular Oncology", "AEterna" и др.) направлены на поиск новых субстанций и разработку препаратов, аналогичных эндогенным веществам. Эффективными для дальнейшего использования оказываются вещества, полученные как в результате химического синтеза (пептиды; производные индола, имидазола, пиридина), так и выделенные из натуральных источников (растения, беспозвоночные, рыбы, опухолевые клетки).

В ходе таких исследований создаются теоретические основы избирательной регуляции клеточной активности; решаются проблемы синтеза новых соединений; 8 разрабатываются новые подходы к выделению, очистке и испытанию биологической активности перспективных субстанций. Настоящая работа находится в русле упомянутых направлений.

Цель диссертационного исследования состояла в изучении молекулярно-клеточных механизмов действия природных и синтетических антикоагулянтов и обосновании путей их использования для регуляции функций клеток и тканей.

Задачи исследования

Для достижения указанной цели были сформулированы и решены следующие основные задачи:

1. Изучить особенности внутриклеточных изменений, развивающихся в нормальных и опухолевых клетках под действием тромбина.

2. Провести сравнительный анализ морфологии и внутриклеточной динамики нормальных, опухолевых и трансформированных клеток в интактном состоянии и после воздействия различных факторов регуляции клеточной активности.

3. Определить роль тромбининдуцируемых реакций в процессах развития новообразований и нормальных тканей. Обосновать пути эндогенной регуляции множественных биологических эффектов тромбина.

4. Разработать схему получения новых и оптимизировать схему получения известных производных хинолина. Провести синтез и сравнительный токсикологический анализ полученных субстанций в опытах in vitro.

5. Оптимизировать схему получения природного ингибитора тромбина - гирудина из медицинской пиявки; исследовать его эффекты на различных уровнях; протестировать его свойства в сравнении с другими природными антикоагулянтами из медицинской пиявки. 9

6. Изучить специфические и токсикологические свойства рекомбинантного фактора некроза опухоли-3 и производных фактора некроза опухоли-a в качестве потенциальных регуляторов активности тромбина.

7. Провести сравнительное изучение антикоагуляционных свойств производных хинолина, индола, 10,11-дигидро-5Н-дибенз[Ь, Г]азепина, 2-оксо-1-пирролидино-2-бутина, камфары, дифенилуксусной кислоты, 4,5,6,7-тетрагидробензтиофена; сульфониламидосодержащих, гидразоносодержащих, гуанидиносодержащих соединений и гирудина. Исследовать возможность регуляции тромбининдуцируемой клеточной пролиферации с использованием указанных субстанций и рекомбинантных цитокинов.

8. Провести испытание противоопухолевой эффективности антикоагулянтов и рекомбинантных цитокинов на моделях метастазирующих новообразований в опытах ш vivo.

Научная новизна и теоретическая ценность полученных результатов заключается, прежде всего, в фундаментальном значении теоретических выводов из диссертации.

Впервые с использованием приемов компьютерной лазерной фазовой микроскопии проведен сравнительный анализ морфологии и внутриклеточной динамики нормальных, опухолевых и трансформированных клеток в интактном состоянии и после воздействия различных факторов регуляции клеточной активности. Полученные данные соотнесены с другими параметрами функционирования клеток.

Установлены специфические динамические характеристики Rasтрансформированных и опухолевых клеток; отмечены особенности влияния тромбина, эпидермального фактора роста и альфа-фетопротеина.

10

Сформулированы представления о роли тромбининдуцируемых реакций в процессах развития новообразований и нормальных тканей. Обоснованы пути эндогенной регуляции множественных биологических эффектов тромбина.

Впервые в экспериментах на разных группах животных, в том числе и на обезьянах, были изучены антикоагуляционные и токсикологические свойства рекомбинантных фактора некроза опухоли-р и производных фактора некроза опухоли-а в качестве потенциальных регуляторов активности тромбина. Данные соотнесены с результатами испытаний препаратов на культуре клеток in vitro.

Получены новые производные хинолина и испытаны их антикоагуляционные и токсикологические свойства.

Впервые проведено сравнительное изучение антикоагуляционных свойств производных хинолина, индола, 10,11-дигидро-5Н-дибенз[Ь,^азепина, 2-оксо-1-пирролидино-2-бутина, камфоры, дифенилуксусной кислоты, 4,5,6,7-тетрагидробензтиофена; сульфониламидосодержащих, гидразоносодержащих, гуанидиносодержащих соединений и гирудина. Исследована возможность регуляции тромбининдуцируемой клеточной пролиферации с использованием некоторых перспективных для дальнейшего использования веществ.

Обнаружены центральные эффекты после введения ингибиторов тромбина экспериментальным животным.

Впервые на моделях перевиваемых метастазирующих опухолей было проведено сравнительное изучение разных способов регуляции множественных биологических эффектов тромбина.

Доказана эффективность использования модуляторов тромбиновой активности при лечении новообразований у мышей (рак легких PJI-67; меланома В-16) и китайских хомяков (ХОП).

11

Практическая ценность результатов проведенной работы определяется тем, что:

• Разработаны экспериментальные модели изучения молекулярно-клеточных механизмов действия природных и синтетических антикоагулянтов. Полученные данные могут быть использованы в медицине при диагностике, исследовании и терапии ряда патологических состояний, прежде всего, новообразований и патологий гемостаза.

• Методология, разработанная при изучении /?ал-трансформированных клеток, может найти применение при дальнейших исследованиях особенностей развития опухолевых клеток.

• Оригинальный синтез и исследование биологической активности новых производных хинолина в сравнении с другими полифункциональными гетероциклическими соединениями вносят реальный практический вклад в создание новых антикоагулянтов - регуляторов клеточной активности.

• Проведено экспериментальное доклиническое испытание общей и специфической токсичности рекомбинантных фактора некроза опухоли-Р и производных фактора некроза опухоли-а. Данные соотнесены с антикоагуляционными свойствами препаратов.

• Оптимизация способа выделения гирудина из натурального сырья позволяет обеспечить эффективное получение препарата для исследовательских и практических нужд. Результаты испытаний биологической активности препаратов из медицинской пиявки могут быть использованы при создании новых лекарств с целью профилактики тромбозов и новообразований, лечения инфекционных заболеваний

12

• Результаты сравнительных исследований противоопухолевой активности природных и синтетических антикоагулянтов могут найти применение при создании новых лекарственных препаратов и разработке альтернативных схем лечения новообразований.

• В процессе разработки теоретических и практических основ регуляции множественных биологических эффектов тромбина проведен патентный поиск и подготовлена заявка на изобретение.

Положения, выносимые на защиту

1. Тромбининдуцируемые реакции играют заметную роль в процессах развития и функционирования новообразований и нормальных тканей. При этом имеет значение способность клеточных элементов к активации тромбина, экспрессии эндогенных ингибиторов фермента и специфических рецепторов. Одним из ключевых моментов передачи сигнала является активация белка Ras.

2. Регуляция множественных биологических эффектов тромбина может осуществляться на разных уровнях: от активации из состояния профермента в межклеточном пространстве до влияния на процессы передачи рецептор опосредованного сигнала. Наиболее перспективно одновременное воздействие на разных этапах.

3. Для регуляции тромбининдуцированных реакций могут быть использованы новые и уже известные производные хинолина наряду с природными антикоагулянтами, рекомбинантными цитокинами и их производными.

4. Природные и синтетические модуляторы активности тромбина влияют на пролиферацию чувствительных к тромбину культур клеток и подавляют рост экспериментальных метастазирующих опухолей. Использование широкого спектра препаратов приводит к оптимизации способов воздействия на клетки-мишени.

13

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Хомяков, Юрий Николаевич

Общие выводы

1. Изучены особенности внутриклеточных изменений под действием тромбина. Митогенный эффект тромбина зависит от состава среды, типа клеток и наличия специфических ингибиторов или регуляторов внутриклеточных обменных процессов. Добавление гирудина и ТЫБ-а способствует отмене эффекта.

2. В результате экспериментов на различных типах клеток была продемонстрирована возможность рецепторопосредованной тромбининдуцированной модуляции содержания одного из ключевых вторичных мессенджеров - ионов Са2+. Для проявления обнаруженных феноменов необходимо наличие ионов Са2+во внеклеточной среде. Протеолитическая активация тромбиновых рецепторов является ключевым звеном процесса.

3. При морфометрических исследованиях клеток крови человека и фибробластов крысы в зависимости от способа воздействия на клетку обнаружены значительные изменения формы клеток. Влияние экстрацеллюлярных факторов приводит к уменьшению значений параметров. Процесс Лаз-трансформации клеток характеризуется увеличением показателей.

4. Проведен сравнительный анализ внутриклеточной динамики нормальных, опухолевых и трансформированных клеток в интактном состоянии и после воздействия различных факторов регуляции клеточной активности (тромбин, ЕОБ, ЮТ-а, АФП). Обнаружено, что воздействие каждого из испытанных факторов приводит к возникновению новых внутриклеточных колебаний, частоты которых частично встречаются только в экспериментальных условиях опыта и отсутствуют в контроле. Для влияния тромбина характерны осцилляции 6,2; 10,9 Гц.

5. Показано, что некоторые опухолевые клетки (А-431; Н-69; LNCaP; HeLa) могут контролировать способность тромбоцитарной плазмы к свертыванию и запуску каскадных путей активации факторов свертывания, влиять на адгезию тромбоцитов, активность тромбина в биологических жидкостях, и, как следствие, изменять свою функциональную активность. Минимальный эффект обнаружен в случае изучения культуры MCF-7, на которой отсутствуют рецепторы тромбина.

6. Сформулировано положение о многоуровневое™ регуляции множественных биологических эффектов тромбина. Регуляторные воздействия могут осуществляться как на стадии работы самого фермента и его взаимодействия со специфическими рецепторами, так и на этапе передачи сигнала внутрь клетки.

7. Осуществлен синтез и оценена биологическая активность ряда новых производных хинолина и гидрохинолина. Установлено, что полученные соединения способны проявлять коагуляционную и антикоагуляционную активность, которая может быть связана с модуляцией внутреннего и внешнего пути свертывания крови, ферментативной активности тромбина, а также с функционированием специфических рецепторов. При этом присутствие тиоморфильной и тиенилоильной групп в качестве заместителей приводит к искомому результату, а придание хинолиновым соединениям амидной функции завершается, как правило, исчезновением целевой активности.

8. Усовершенствован метод выделения гирудина из натурального сырья. Обнаружено его влияние на функциональную активность центральной нервной системы. Дана сравнительная характеристика гирудина и дестабилазы (3Hflo-e-(y-Glu)-Lys-изопептидазы).

9. Установлено, что препараты рекомбинантных цитокинов (слитные белки TNF-a-alT; alT-TNF-a и TNF- ß) не вызывают значительных токсических изменений на

200

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Хомяков, Юрий Николаевич, Москва

1. Александров В.А., Давыдов В.В., Беспалов В.В. и др., Эффекты и механизмы антиканцерогенного и онкопрофилактического действия препаратов растений семейства аралииевых.// Тезисы конгресса "Человек и лекарство", 1995, С. 194.

2. Барбараш А.Н. Волновые процессы в живом: основы стереогенетики и физиологии мышления. Одесса, ОМ, 1998, 349 С.

3. Баскова И.П. Белки системы гемостаза. В : Белки и пептиды. Т.1. - Под ред. В.Т. Иванова. - М., Наука, 1995, С.397-433.

4. Баскова И.П., Халиль С., Никонов Г.И. и др. Ингибирование калликреина плазмы крови человека секретом слюнных желез и экстрактом из медицинской пиявки Hirudo medicinalis. //Биохимия, 1988, Т.53, стр. 1467-1473.

5. Василенко И.А., Шабалин В.Н., Бабакова C.B., Конрадов A.A. Динамическая фазометрия как метод оценки морфофункционального состояния биообъекта// Проблемы лимфологии и количественной патологии. M., РМА, 1997, С.98-99

6. Верясова Г.В. Фактор некроза опухоли: множественность биологических эффектов и методы их оценки. Оболенск,1992, 17 С.

7. Вядро М.М. Цитокины и их роль в патогенезе и терапии инфекций//Антибиотики и химиотерапия. 1990, Т.35,№ 9, С. 12-14.

8. Габбасов З.А., Попов Е.Г., Гаврилов И.Ю. и др. Новый высокочувствительный метод анализа агрегации трмбоцитов// Лабораторное дело, 1989, № 10,С. 15-18.

9. Галактионов В. Г. Иммунология. М.,.Изд-во МГУ. 1998, 480 С.

10. Ю.Давыдов В.В., Тоскуева Е.П., Морозов В.Г. и др. Эффективность культуральных адаптогенов при различных видах вторичных иммунодефицитов//. Тезисы конгресса "Человек и лекарство", 1995,стр135.201

11. П.Дубинина Л.Г., Бигалнев А.Б. Тест-система оценки мутагенной активности загрязнений среды в культуре лейкоцитов крови человека. М.: 1978, с. 107.

12. Духанин А.С., Губаева Ф.Р. Фармакологическая регуляция активности тромбоцитов//Экспер.Клин. Фармак.,1998, Т.61, №4, С.66-71

13. Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А. Лабораторные животные. Киев, Вища школа, 1983, 384С.

14. Каменев Ю.Я., Каменев О.Ю. Вам поможет пиявка.СПб.,Комплект, 1997, 256С.

15. Колхир В.К., Сакович Г.С., Зюзин В.А. Растительные антикоагулянты. //Тезисы конгресса "Человек и лекарство", 1995,стр.236

16. Кудрявцев А.А., Кудрявцева Л.А. Клиническая гематология животных. М.: 1980 ч.2. 235С.

17. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1980, 293 с.

18. Лихачева Н.В. Клиническая энзимология// Вопр. Биол.мед.фарм.химии.,2000, №2, С.45-53.

19. Любимов И.И., Хомяков Ю.Н., Чепурнов С.А. и др. Противоопухолевая активность некоторых сапониновых фракций корня красного женьшеня на модели мышиной меланомы В-16.// Тезисы конгресса "Человек и лекарство", 1995,стр201.

20. Манишкина Р.П., Степанова Е.Б., Заугольникова Л.А. и савт. Приготовление Т+В, Т-, В-лимфоцитов для методов НЬА-типирования.//Инструкция. М., 1997,12С.202

21. Меньшиков B.B. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник. М., Медицина, 1987. 386С.

22. Методические рекомендации по оценке аллергенных свойств фармакологических средств (изд. официальное). М.: 1988.

23. Методические рекомендации по проверке мутагенных свойств у новых лекарственных препаратов.М.: 1981, с.203.

24. Пальцев М.А., Иванов A.A. Межклеточные взаимодействия. М., Медицина, 1995, 224С.

25. Практическая химия белка. Под ред. А.Дарбе. - М., Мир, 1989,623С.

26. Савинов В.А., Кучерский В.М. Гирудотерапия в комплексном лечении больных хроническим простатитом// В: Лечение медицинскими пиявками и препаратами из них. Под ред. д.б.н. И.П. Басковой, книга 1. М., 1998, С.66-68.

27. Савинов В.А., Кучерский В.М. Роль трудотерапии в профилактике рака.// Материалы третьей конференции ассоциации гирудологов. М., 1993, С.28-29.

28. Сидорин Д.Н., Козюков A.B., Захарова В. А., Породенко Н.В., Крюков Л.Н. Синтез и исследование на блокаду обратного захвата серотонина амидофосфатов пиперазинилхинолинов. //Хим.-фарм. ж. 1992. Т. 26. № 9-10. С. 82-83.

29. Соколов С.Я., Замотаев И. П., Справочник по лекарственным растениям, изд. 3. М. 1989 "Металлургия"

30. Терентьев П.В., Ростова Н.С. Практикум по биометрии. Л.:Изд-во Ленинградского ун-та. 1977, 152 С.

31. Федосеева В Н., Порядин Г.В., Ковальчук Г.В. и соавт. Руководство по иммунологическим и аллергологическим методам в гигиенических исследованиях. М., Промедэк, 1993, С.320.

32. Фукс Б.Б., Рахмилевич А.Л., Пименов А.А., Дубровская А.Г. Активация продукции фактора некроза опухоли при сочетанном действии липополисахарида и мурамилдипептида. //Бюлл. эксп. биологии и медицины. 1987,№ 10,С.497-499.

33. Хомяков Ю Н. Изучение рецепторных систем органов дыхания как основа для создания новых лекарственных препаратов// М., ГНИИ ЭМП, 1999.-вып.1, 26С., вып.2, 24С.

34. Хомяков Ю.Н., Василенко И.А., Конрадов А.А., Гусев В.В. Прижизненная экспресс-оценка действия новых биопрепаратов: использование компьютерной лазерной микроскопии// Сб.науч.тр. ВГНКИ.-1996.-Т.59,- С. 121-126.

35. Хомяков Ю.Н., Федоров Т.В., Борисов Н.В. и соавт. Препарат из медицинских пиявок ингибирует развитие саркомы сирийского хомяка// Асклепейон 1995. N1-4, С.28-30.

36. Чабан Т.Н., Капралова В.В., Савинов В.А. Гирудотерапия в гинекологической практике.// В: Лечение медицинскими пиявками и препаратами из них. Под ред. д.б.н. И.П. Басковой, книга 1. М., 1998, С.68.

37. Abraham L.A., Jenkins A.L., Stone S R. et al. Expression of the thrombin receptor in developing bone and associated tissues// J. Bone Miner. Research., 1998 V.13, P.818-827.

38. Aderka D., Engelman H., Maor Y. et all. Stabilization of the bioactivity of tumor necrosis factor by its soluble receptors.//! Exp. Med. 1992, V.175, P.323-331.

39. Aggarwal B.B., Eesalu Т.Е., Hass P.E. Characterization of receptors for human tumor necrosis factor and their regulation by gamma interferon.//Nature.l985,V.318, P.665-667.

40. Ahn H., Arik L., Boykow G. et al. Structure-activity relationships of pyrrolquinazolines as thrombin receptor antagonists//Biorg. Med. Chem. Lett., 1999, V.9, P.2073-2078.

41. Ahn H.S., Arik L., Boykow G. .et all. Structure-activity relationships of pyrroloquinazolines as thrombin receptor antagonists // Bio.Med. Chem.Lett., 1999, V. 9P.2073-2078.

42. Amar S., Van Dyke T.E., Eugster H.P. et all, Tumor necrosis factor (TNF)-induced cutaneous necrosis is mediated by TNF-receptor 1. //J.Inflamm,1996, V.47, P. 180-189.

43. Antman E.M. for the TIMI 9A Investigators: Hirudine in acute myocardial infarction: Safety report from the Thrombolysis and Thrombin Inhibition in Myocardial Infarction (TIMI) 9A trial. // Circulation, 1994, V.90, P. 1624-1630.

44. Ault K.A., Tawfik O.W., Smith-King M M. et all, Tumor necrosis factor-alpha response to infection with Chlamidia trachomatis in human tube organ culture. I I Am. J. Obstet. Gynecol., 1996, V.175, P. 1242-1245.

45. Bagdy D.,Barabas E., Szell E. et all, In vitro inhibition of blood coagulation by tripeptide aldehydes- a retrospective screening study focused on the stable D-mePHE-Pro-Pro-Arg-HH2 S04. // Thromb. Haemost. ! 992,V.67, P.325-330

46. Bajust S., Barabas E., Szell E. et all, Peptide aldehhyde -inhibitors of the fibrinogen -thrombin reaction./« Meienhofer J (Ed) //Peptides -Chemistry, Structure and Biology. Ann Arbor Science Publishers, 1975, P.603-608.

47. Bajust S., Barabas E., Tolnay P. et all, Inhibition of thrombin and trypsin by tripeptide aldehydes, // Int.J. Pept. Protein. Res, 1978, V.12, P.217-221

48. Bajust S., Szell E., Bagdy D. et all, US Patent No.4, 703,036,1987

49. Balkwill F.R. Tumor necrosis factor// Brit. Med. Bul.-1989, V.45, N.2, P.389-400.205

50. Ball R.L., Albrecht T., Thompson W. et al. Thrombin, epidermal growth factor, and phorbol myristate acetate stimulate tubulin polimerization in quiescent cells: a potential link to mitogenesis// Cell Motil. Cytoskeletion, 1992,V.23, P.265-278.

51. Barabas E., Szell E., Bajusz S., Screening for fibrinolysis inhibitory effect of synthetic thrombin inhibitors, //Blood Coagul. Fibrinolysis, 1993, V.4, P. 243-248

52. Bar-Shavit R., Kahn A., Wilner G. et al. Monocyte chemotaxis: stimulation by specific exocyte region in thrombin// Science, 1983,V.220,P.728-731.

53. Baxevanis C. N, Spanacos G., Voutsas I.F. et all Increased generation of autologous tumor- reactive lymphocytes by anti-CD3 monoclonal antibody and prothymosin alpha.// Cancer Immunol. Immunother.,1999.V.48, P.71-84.

54. Bendtzen K.Interleukin 1, interleukin 6 and tumor necrosis factor in infection, inflammation and immunity.// Immunology Letters. 1988,V. 19, P. 183-192.

55. Benezra M., Vlodavsky I., Bar-Shavit R. Thrombin enchances degradation of heparan sulfate in the extracellular matrix by tumor cell heparanase// Exp.Cell Res., 1992, V.201, P.208-215.

56. Berger D.P., Naniche D., Crowley M.T. Lymfotoxine-beta -deficient mice show defective antiviral immunity. // Virology, 1999, V.260, P. 136-147.

57. Bock L.C., Griffin L.C.,Latham J.A. et all, Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. // Nature, 1992,V.355, P.564-566.

58. Bonavida B. Role of NKCF and TNF in cell-mediated cytotoxicity. // Lymphokine Receptor Interaction. 1989 V.179., P.99-105.

59. Bowie A.G., Moynagh P.N.,O'Neill L.A.J., Lipid peroxidation is involved in activation of NF-kappa B by tumor necrosis factor but not interleukin-1 in the human endothelian cell line ECV304.//J.Biol. Chem., V.272, P.25941-25950.

60. Brewer G. Exogenous thrombin inhibits neuritogenesis in cultured neuroblastoma cells but not in hippocampal neurons/ZBrain Res., 1995, V.683, P.258-263.

61. Browning G., Ribolini A., Studies of the differing of tumor necrosis factor and lymphotoxin on the growth of several human tumor lines.// J.Immunol.1989, V.143, N.6, P.1859-1867

62. Browning J.L., Douglas I, Ngamek A. et all, Characterization of surface lymfotoxin forms. //J. Immunol., 1995, V.154, P.33-46.

63. Browning J.L., Miatkowski K., Sizing I., et all, Signaling through the lymphotoxin beta receptor induces the death of some adenocarcinoma tumor lines. // J. Exp. Med., 1996, V. 183, P.857-878.

64. Buijsman R.C., Basten J.E.M., van Dither T.G. et all, Design and synthesis of a novel synthetic NAPAP-penta-saccharide conjugate displaying a dual antithrombotic action. // Bio.Med. Chem.Lett., 1999,V.9, P.2013-2018.

65. Busing K. Pseudomonas hirudinis ein bakterieller Darmsymbiont des Blutegels (Hirudo officinalis) //Zentr. Bakt. Parasit. Infekt.Hyg.,1952, V.157, P.478-484.

66. Bussolino F., Arese M., Montrucchio G. et al. Platelet activating factor produced in vitro by Kaposi's sarcoma cells induces and sustains in vivo angiogenesis.// J.Clin Invest.,1995, V.96, P.940-952.

67. Callas D., Bacher P., Iqbal O et all, Fibrinolytic compromises by simultaneous administration of site-directed inhibitors of thrombin. // Thromb. Res., 1994, V. 74, P. 193205

68. Callas D., Fareed J., Comparative anticoagulant effects of various thrombin inhibitors as determined in the ecarin clotting method. // Thromb. Res. 1996,V.83, P.463-468

69. Calnek D.S., Grinnel B.W. Thrombomodullin-dependent anticoagulant activity is regulated by vascular endothelial growth factor// Exp.Cell Res.,1998, V.238, P.294-298.

70. Cannone C.P.Maraganore J.M. Loscalzo J. Anticoagulant effects of hirulog, a novel thrombin inhibitor. //Am J. Cardiol., 1993,V.71, P.778-782.

71. Carrell R.W. How serpins are shaping up// Science, 1999, V.285, P. 1861-1863.

72. Carter A., Haddad N., Draxler I. et all, Expression and role in growth regulation of tumor necrosis factor-receptors p55 and p75 in acute myeloblastic leukemia cells.// Br.J. Haematol., 1996, V.92, P. 116-126

73. Castellino A.M., Chao M.V. Trans-signalling by cytokine and growth factor receptors// Cytokine Growth Factor Rev., 1996, V.7, P.297-302.

74. Castellino A.M., Parker G.J., Boronenko I.V. et all, A novel interaction between the juxtamembrane region of the p55 tumor necrosis factor receptor and PIP5K. // J. Biol. Chem., 1997, V.272, P.5861-5870.

75. Castor C.W., Smith E.M., Bignal M.C., Hosier P.A.,1997Connective tissue activation. XXVII. Effects of cytokine combination, implications for an integrated cytokine network.

76. Castro J.M., Barcia M.G. Localization of prothymosin alpha in the nucleus. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1996, V.224, P. 140-146.

77. Chambard J.C., Paris S., L'Allemain G. et al. Two growth factor signalling pathways in fibroblasts distinguished by pertussis toxin// Nature, 1987, V.326, P. 800-803.208

78. Chaplin D.D. Cytokine regulation of secondary lymphoid organ development. // Curr. Opin. Immunol. 1998, V.10, P.289-297.

79. Chen L.B., Buchanan J.M. Mitogenic activity of blood component. 1. Thrombin and prothrombin//PNAS, 1975, V.72, P.131-135.

80. Chen L.B., Buchanan J.M. Mitogenic activity of blood components. 1. Thrombin and prothrombin//PNAS, 1999, V.72, P.131-135.

81. Cheng L., Scully M.F., Goodwin C.A. et all, Peptide a-aminophosphonic acids: A new type of thrombin inhibitor. // Thromb. Haemost., 1991,V.65,P.1289.

82. Chiang H.S., Swaim M.W., Huang T.F. Characterization of platelet aggregation induced by human colon adenocarcinoma cells and its inhibition by snake venom peptides, trigramin and rhodostomin// Br.J.Haematol.,1994,V.87,P.325-331.

83. Chiang H.S., Yang R.S., Huang T.F. The Arg-Gly-Asp-containing peptide, rhodostomin, inhibitsin vitro cell adhesion to extracellular matrices and platelet aggregation caused by Saos-2 human osteosarcoma cells// Br.J.Cancer, 1995,V.71,P.265-270

84. Choay J. Native antithrombin III, an activable protein. Hin Doutremepuich C. (ed.) Anticoagulation. 1994, 119-133.

85. Choi S.S., Gatanaga M.,Granger G.A.et all,Prostaglandin e-2 regulation of tumor necrosis factor receptors release in human monocytic THP-1 cells.// Cell Immunol., 1996, V.170, P. 178-184.

86. Clauss M., Grell M., Fangmann C et all, Synergistic induction of endotelian tissue factor by tumor necrosis factor: functional analysis of the tumor necrosis factor receptors. //FEBS Lett. V.390, P.334-338

87. Clerici M., Sarin A., Berzofsky J.A. et all, Antigen-stimulated apoptotic T-cell death in HIV infection is selective for CD4+ T cells, modulated by cytokines and effected by lymphotoxin. //AIDS, 1996,V.10,P.603-611.

88. Colleman R.W., Activation of plasminogen by human plasma kallikrein // Biochem Biophys . Res. Commun. 1968, V.38, P. 346-388

89. Collen D., Lijnen H.R. Todd P. A. et all, Tissue type plasminogen activator: A review of its pharmacology and therapeutic use as a thrombolytic agent. // Drugs 1989,V.38P. 346388.

90. Concise encyclopedia of biochemistry,-Berlin, New York, Walter de Gryter, 1983,460P.

91. Conway E.M., Pollefeyt S., Collen D. et al. The amino terminal lectin-like domain of thrombomodullinis required for constitutive endocytosis//Blood, 1997, V.89, P.652-661.

92. Cuff C. A., Schwartz J., Bergman C.M. et all. Lymfotoxin alpha3 induces chemokines and adhesion molecules: insight into the role of LT alpha in inflammation and lymphoid organ development.//J. Immunol., 1998, V.161,P.6853-6860.

93. Dabbous M.K., North S.M., Haney L. et all, Effects of mast cell-macrophage interaction on the production of collagenolytic enzymes by metastatic tumor cells and tumor-derived and stromal fibroblasts.// Clin. Exp. Metastasis, 1995, V.13, P.33-41.

94. Daub H., Weiss F.U., Wallasch C., Ullrich A. Role of transactivation of the EGF receptor in signalling by G-protein-coupled receptors//Nature, 1996, V.379, P.557-560.

95. De Fouw N.J., van Hinsberk V.W., de Jog Y.F. et all. The interaction of activated protein C and trombin with the plasminogen activator inhibitor released from human endotelian cells // Thromb. Haemost., 1987, V57, P176.210

96. De Kossodo S., Moore R, Gschmeissner S. et all, Changes in endogenous cytokines, adhesion molecules and platelets during cytokine-induced tumor necrosis. // Br. J. Cancer, 1995, V.72, P. 1165-1172.

97. DeBlois D., Drapeu G., Petitclerc E. et al. Synergysm between the contractile effect of epidermal growth factor and that of des-Arg9-bradikinin or alpha-thrombinin rabbit aortic rings//Br. J.Pharmacol.,1992, V.105, P.959-967.

98. Denisov A.A., Nicolaeva O.G., Investigation of biosynthesis of human lymphotoxinin cells of recombinant Escherichia coli strain. // Biotechnol. Appl. Biochem. , 1998, V.28, P. 19-23.

99. Desser L. Cytokine synthesis in human periferal blood mononuclear cells after oral administration ofpolyenzyme preparations// Oncology, 1993, V.33, P.753-762

100. Dhanasekaran N., Tsim S., Dermott J. et al. Regulation of cell proliferation by G proteins//Oncogene, 1998, V. 17, P. 13 83-1394.

101. Dichek D., Quertermous T. Thrombin regulation of mRNA levels of tissue plasminogen activator-1 in cultured human umbilical vein endothelial cells // Blood, 1989 V.74, P.222-228.

102. Dinarello C.A., The biology of interleukin-1 and comparison to tumor necrosis factor.//Immunology Letters 1987, V.16, P.227-232.

103. Dodt J., Kohler S., Schmitz T. et all, Distinct binding sitcs of Ala 48-hirudin 1-47 and Ala 48-hirudin 48-65 on thrombin. // J. Biol. Chem., 1990, V.265, P.713-718.

104. Douni E., Kollias G. A critical role of the tumor necrosis factor receptor (p75TNF-R) in organ inflammation independent of TNF, lymphotoxin alpha, or the p55TNF-R. // J. Exp. Med., 1998, V.188, p. 1343-1352.

105. Doutremepuich C., LalanneM.C, Doutremepuich F. et all, Low molecular weight heparins today./'«. Doutremepuich C. (Ed). Dekker M Low Molecular Weight Heparins in Clinical Practice, N-Y, 1992, P.85-96.

106. Duchaussoy P.,Jaurand G., Driguez P.A et all, Assessment through chemical synthesis of the size of the heparin sequence involved in thrombin inhibition. // Carb. Res., 1999,V.317, P.85-99.

107. Duchaussoy P.,Jaurand G., Driguez P.A et all, Identification of a hexasaccharide sequence able to inhibit thrombin and suitable for 'polymerization'. // Carb. Res., 1999,V.317, P.63-84

108. Duhamel C., Orvain C., Lanza F. et al. Thrombin receptor-mediated increase of two matrix metaloproteinases, MMP-1 and MMP-3, in human endothelial cells// Arteroscl.Thromb.Vasc.Biol., 1997, V.17, P.1931-1938.

109. Dutton G. Anti-angiogenesis for cancer. //Genetic Engineering news, 1999,V. 19, P.l-28.

110. Dutton G. Anti-angiogenesis for cancer// Gen. Eng. News, 1999, V. 19, №17, October 1, P. 1,28,46.

111. Eidt J.F., Allison P., Nobel S. et al. Thrombin is an important mediator of platelet aggregation in stenosed canine coronary arteries with endothelial injury// J.Clin. Invest., 1989, V.84,P. 18-27.

112. Eldor A., Orevi M., Rigbi M. The role of the leech in medical therapeutics. // Blood Rev., 1996, Y.10, P.201-209.

113. Enkemann S.A., Pavur K.S., Ryazaniv A G., Does prothymosine alpha affect the phosphorylation of elongation factor 2? // J. Biol. Chem., 1999, V.274, P. 18644-18650.

114. Ensumi N., Fan D., Filder I.J. Inhibition of murine melanoma experimental metastasis by recombinant desulfatohirudin, a highly specific thrombin inhibitor// Cancer res., 1991, V.51, P.4549-4556.

115. Eriksson B.I., Ekman S., Kalebo P. t all, Prevention of deep-vein thrombosis after total hip replacement. // Lancet, 1996, V.347, P. 635-639.

116. Ernst E., Matrai A. Orale herapie mit proteolytishen Enzymen modifiziert die Blutrheologie//Klin.Wschr., 1987, V.65, P.994-996.

117. Ettinger R., Mebius R., Browning J.L. et all, Effects of tumor necrosis factor and lymphotoxin on peripheral lymphoid tissue development. // Int. Immunol. 1998, V.10, P.727-741.

118. Even-Ram S., Uziely B., Cohen P. et al. Thrombin receptor overexpression in malignant and physiological processes// Nature Medicine, 1998, V.4, P.909-914.

119. Fajaro L.F., Kwan H.H., Kowalsky J., Prionas S.D., Allison A.C. Dual role of tumor necrosis factor-alpha in angiogenesis// Am. J. Pathol., 1992, V.140, P.539-547.

120. Fareed J., Callas D., Hoppensteadt D. et all, Recent development in antithrombotic agents. Exp. Opin. Drugs, 1995, V.4, P. 389-412.

121. Fareed J., Mesmore H.L. Kindel G. et all, Inhibition of serine proteases by low molecular weight peptides and their derivatives//NY Acad. Sei., 1981,V.370, P.765-784

122. Fareed J.Current trends in antithrombotic drug device development in Doutremepuich C. (ed.) Anticoagulation. 1994, 1-37.

123. Fareed J.Hoppensteadt D.A., Walenga J.M. et all., Antithrombin agents as anticoagulants and antithrombotics. //Med. Clin. ofNA, 1998,V.82., P.569-572.

124. Feugeas J.P., Caillns H., Poirier J.C. et all, Influence of metabolic and genetic factors on tumor necrosis factor-alpha and lymphotoxin -alpha in insulin-dependent diabetes mellitus. //Diabetes Metab., 1997, V.1997, P.295-301.

125. Flynn J.L.,Goldstein M.M., Chan J. et all, Tumor necrosis factor-alpha is required in the protective immune response against Mycobacterium tuberculosis in mice. // Immunity, 1995, V.2, P.561-572.

126. Force W.R., Walter B.N., Hession C. et all, Mouse lymphotoxin beta receptor. Molecular genetic, ligand binding, and expression. //. J. Immunol., 1995, V.155,P.5280-5288.

127. Fu Y.X., Huang G., Wang Y. et all. B- lymphocytes induce the formation of follicular dendritic cell clusters in a lymphotoxin alpha dependent fashion. // J. Exp. Med., 1998, V. 187, P. 1009-1018.

128. Gallea Robach S., Morand V., Millet S et all, A metalloproteinase inhibitor blocks the shedding of soluble cytokine receptors and processing of transmembrane cytokine precursors in human monocytic cells.// Cytokine V.9, P.340-346.

129. Garbin F., Eckert K., Immenschuh P. et all, Prothymosin alpha 1 effects, in vitro, on the antitumor activuty and cytokine production of blood monocytes from colorectal tumor patients.// Int. J. Immunol., 1997, V.19, P.323-332.

130. Gasic G. Thrombin inhibitors promote metastasis// Periodicum Biologorum, 1991, V.93, P.633-640.

131. Geiger J. Anti-aggregatory drugs: 1. Platelet receptor antagonists//Exp.Opin.Ther.Patents, 1999, V.9, P. 1389-1414.

132. Geiger J. Anti-aggregatory drugs: I. Platelet receptor antagonists. // Exp. Opin. Ther. Patents, 1999,V.9, P. 1389-1414

133. Gerszten R., Chen J., Ishil M. et al. Specifity of the thrombin receptor for agonist peptide is defined by its extracellular surface// Nature, 1994, V.368, P.648-651.214

134. Gertz S.D., Fallon J.T., Gallo R. et al. Hirudin reduces tissue factor expression in neotima after balloon injury in rabbit femoral and porcine coronary arteries// Circulation, 1998, V.98, P.580-587.

135. Gibbs C.S., Coutre S.E., Tsiang M. et all. Conversion of thrombin into an anticoagulant by protein engineering. //Nature, 1995, V.378, P.413-416.

136. Gillboa N., Villanueva M.T., Fenton J.W.II., Inhibition of fibrinolytic enzymes by thrombin inhibitors. //Enzyme, 1988,V.40, P.144-148.

137. Goldsmith G.H., Saito O.D., Ratnoff O.D., The activation of plasminogen by Hageman factor fragments. // J.Clin.Invest.1978, V.62, p.54-60.

138. Grande J.P., Melder DC, Zinsmeister A R., Modulation of collagen gene expression by cytokines. //J. Lab. Clin. Med., 1997, V.130, P.476-486.

139. Grottesi A.,Sette M., Palamara T. The conformation of peptide thymosin alpha 1 in sodium and in a membrane-like environment by circular dichroism and NMR spectroscopy.//Peptides, 1998, V.19,P.1731-1738.

140. Gruss H.J. Molecular, structural, and biological characteristics of the tumor necrosis factor ligand superfamily. // Int. J. Clin. Lab. Res., 1996, V.26, P.143-159.

141. Hall C.S. Emotional behavior in the rat. J.Physiol,Phsychol., 1934, v. 18, p.385-403.

142. Haralabopoulos G.C., Grant D.S., Kleinman H.K. et al. Thrombin promotes endothelial cell alignment in matrigelin vitro and angiogenesis in vivo//Am.J.Physiol., 1997, V.273(lPtl), C.239-245.

143. Harker L/A/ Therapeutic inhibition of thrombin activities, receptors and production, // in: Ellis J. Nuffield (ed.) Hematology/Oncology clinics of North America/ Coagulation Disorders and Treatment Strategies, 1999.

144. Hattori R, Hamilton K., Fugati R. et al. Stimulated secretion of endotelial vWF is accompanied by rapidredistribution to the cell surface of the intracellular membrane protein GMP-140// J.Biol.Chem., 1989,V.264, P.7768-7771.

145. Herbert J., Guy A., Lamarche I. et al. Intimal hyperplasia following vascular injury is not inhibited by an antisense thrombin receptor oligodeoxynucleotide.//J.Cell Physiol., 1997, V.170, P.106-114.

146. Hermann J R., Kutryk M.J., Serruys P.W., Clinical trial of direct thrombin inhibitors during invasive procedures.// Thromb. Haemost., 1997,V.78, P.367-376.

147. Hernandez M., Bayon Y., Sanches C. et al. Thrombin produces phosphorilation of cytosolic phospholipase A2 by a mitogen-activated protein kinase-independent mechanism in the human astrocytoma cell line 1321Nl//Biochem.J.,1997, V.328, P.263-269.

148. Hijikata-Okunomiya A., Okamoto S. A strategy for a rational approach to designing synthetic selective inhibitors. // Semin. Thromb. Haemost., 1992, V18, P. 135-149.

149. Hildt E., Oess S., Identification of Grb2 as a novel binding partner of tumor necrosis factor (TNF) receptor 1. // J. Exp. Med., 1999, V.189, P. 1707-1714.

150. Hooper J. A., McDaniel M.C., Thurman G. B. et all, Purification and properties of bovine thymosine.// Ann. N.Y. Acad. Sc., 1975, V.249, P. 125-144.

151. Hunt J.S.,Chen H.L., Miller L. Tumor necrosis factors: pivotal components of pregnancy? //Biol.Reprod., 1996, V.54, P.554-562

152. Iizuca K.,Chaplin D.D., Wang Y. et all, Recruitment. For membrane lymphotoxin in natural killer cell development.// Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1999, V.96, P.6336-6340.

153. Ijzerman G.N., Marquet R.L., Interferon -gamma. //A Review Immunobiology. 1989,V. 179, P.456-473.

154. Imamura K., Springgs D., Kufe D. Expression of tumor necrosis factor receptors on human monocytes and internalization of receptor bound ligand.// J. Immunology,1987,V. 139, P.2989-2992.

155. Iredat P.A., Dickenson J. M. Measurement of intracellular free calcium ion concentration in cell population using Fura-2// In.: Signal transduction protocols, Ed. by D.A. Kendal, 1995, V.41, P.203-215.

156. Ishihara H., Connoly A., Zeng D. et al. Protease-activated recepor-3 is a second thrombin receptor in humans// Nature, 1997, V.386, P.502-506.

157. Ito D.,Back T.C., Shakhov AN. et all,Mice with targeted mutation in lymphotoxin -alpha exhibit enhanced tumor growth and metastasis: impaired NK cell development and recruitment. //J. Immunol. 1999, V.163, P.2809-2815.

158. Jennings J., Van der Lander M. Histochemical and bacteriological studies on digestion in nine species of leeches// Biol.Bull., 1967, V.133, P.166-183.

159. Jennings J.B. and Van Der Lande V. Histochemical and bacteriological studies on digestion in nine species of leeches (Annelida: Hirudinea)// Biol.Bull., 1967, V.133, №1, P.166-182.

160. Kahn M., Zheng Y, Huang W. et al. A dual thrombin receptor system for platelet activation//Nature, 1998, V.394, P.690-694.

161. Kerth S., Fisslthaler B., Busse R. serotonin stimulates the expression of thrombin receptors in cultured vascular smooth muscle cells. Role of protein kinase C and protein tyrosine kinases// Circulation, 1996, V.93, P.2170-2177.

162. Kettner C., Mesinger L., Knabb R. The selective inhibition of thrombin by peptides of boroarginine. //J. Biol. Chem, 1990, V.265, P. 18289-18297.

163. Kettner C., Shaw E., The selective inhibition of thrombin by peptides of chloromethylketone. // In Lundblad R.L.et all (Ed): Chemistry and Biology of Thrombin., Ann Arbor Science Publishers, 1993, P. 129-144

164. Kim H.H., Lee D.E., Shin J.N.et all, Receptor activator of NF-kappaB recruits multiply TRAF family adaptors and activates c-Jun N-terminal kinase.// FEBS Lett., 1999, V.443, P.297-302.

165. Kinnard Karr. A preliminatory procedure for the evaluat of CNS depressant. J.Pharmacol. Exp.Therapeur, 1957, v. 121, p.354.

166. Knauer M.F., Hawley S.B., Knauer D.J. Identification of binding site in protease nexin (PN1) required for the receptor mediated internalization of PNl-thrombin complexes//J. Biol. Chem., 1997, V.272, P. 12261-12264.

167. Knobe K.E., Berntsdotter A., Shen L. et al. Probing the activation of protein C by the thrombin-thrombomodullin complex using structural analysis, site-directed mutagenesis, and computer modelling// Proteins, 1999,V.35, P.218-234.218

168. Ko Y., Totzke G., Gouni-Bertold I. et all, Cytokine inducible growth factor gene expression in human umbilical endotelial cells. // Mol. Cell Probes, V. 13, P.203-211.

169. Kobayashi H., Fucata J., Murakami N.et all, Tumor necrosis factor receptors in the pituitary cells. // Brain Res., 1997, V.758, P.45-50.

170. Kohame K., Zheng X., Sadler J. Activation of thrombin-activable fibrinolisis inhibitor requires epidermal growth factor-like domain 3 of thrombomodulinand is inhibited competitively by protein C//J.Biol.Chem., 1998, V.273, P. 12135-12139.

171. Korner H., Cook M., Riminton D.S.,Distinct roles for lymphotoxin -alpha lymphotoxin -alpha and tumor necrosis factor in organogenesis and spatial organization on lymphoid tissue. //Eur. J. Immunol. 1997, V.27, P.2600-2609.

172. Kost E R, Mutch D.G., Herzog T.J.,Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha induce synergic cytolitic effects in ovarian cancer cell lines-roles of the TR60 and TR80 tumor necrosis factor receptors. // Gynecol. Oncol., 1999,V.72, P.392-401.

173. Kost E.R., Herzog T.J., Adler L.M. et all, The role of tumor necrosis factor receptor in tumor necrosis factor-alpha-mediated cytolysis of ovarian cancer cell lines.//Am.J.Obstet.Gynecol.V.174, P. 145-153.

174. Kramer R.M., Roberts E.F., Hyslop P.A. et al. Differential activation of cytosolic phospholipase A2 (cPL A2) by thrombin and thrombin receptor agonist peptide in human platelets//J.Biol.Chem.,1995, V.270, P.14816-14823.

175. Kronke M., Schutze S., Scheurich P. et all. Tumor necrosis factor signal transduction //Cell. Signal-ling, 1990, V.2,P.l-8.

176. Kulmburg P., Radke M., Digel W. Lymphotoxin alpha is an autocrine growth factor for chronic lymphocytic leukemia B cells // Leukemia, 1998, V.12, P.493-498.

177. Lecompte T.H. Kher A., Gaillard J.L. et all, Pharmaccologie des agents antiplaguettaires. //J.desMal. Vasculaires. 1983,v.8, P.3-5219

178. Leist M.,Gantner F., Bohlinger I et all, Tumor necrosis factor -induced hepatocyte apoptosis precedes liver failure in experimental murine shock models. // Amer. J. Pathol.,1995, V.146, P.1220-1234.

179. Leo E., Welsh K., Matsuzawa S. et all, Differential requirement for tumor necrosis factor receptor associated factor family proteins in CD40 - mediated induction of NF-kB and Jun

180. Lewis C.E., Leek R, Harris A., et all, Cytokine regulation of angiogenesis in breast cancer: the role of tumor associated macrophages.// J. Leukoc. Biol., 1995, V.57, P.747-751.

181. Li M., Lin Z., Johnson M.E., Structure-based design and synthesis of novel thrombin inhibitors based on phosphinic peptide mimetics. // Bioorg and Med. Chem. Lett., 1999,V.9, P. 1957-1962.

182. Li M., Zhaolan L., Johnson M. Structure-based design and synthesis of novel thrombin inhibitors based on phosphinic peptide mimetics// Biorg. Med. Chem. Lett., 1999, V.9, P. 1957-1962.

183. Li W.X., Kaplan A.V., Grant G.W. et all. A novel nucleotide-based thrombin inhibitor inhibits clot- bound thrombin and reduced arterial platelet thrombus formation. // Blood, 1994, V.83, P.677-682.

184. Li Y.Q., Hii C.S., Costabile M., Regulation of lymphotoxin production by the p21ras-raf-MEK-ERK cascade in PHA/PMA-stimulated Jurkat cells. // J. Immunol. 1999, V.162, P. 3316-3320.

185. Li Z.R., Hromchak R., Mudipalli A., Bloch A., Tumor suppressor proteins as regulators of cell differentiation.// Cancer Res., 1998, V.58, P.4287-4285.

186. Liu L.S., Spelleken M., Rohrig K. et all, Tumor necrosis factor-alpha acutely inhibits insulin signaling in human adipocytec: implication of the p80 tumor necrosis factor receptor.// Diabetes, 1998,V.47, P.515-522.

187. Loewy A., Santer U., Wieczorek M.et al. Purification and characterization of a novel Zinc-proteinase from cultures of Aeromonas hydrofila. J. Biol. Chem., 1993, V.268, P.9071-9078.

188. Loidi L, Vidal A., Zalvide J.B. et all, Development of ELISA to estimate thymosine alpha 1, the N terminus of prothymosin alpha, in human tumors. // Clin. Chem.,1997, V.43, P.59-63.

189. Loidi L., Garcha Caballlero T., Vidal A. et all, Complex regulation of prothymosin alpha in mammary tumors arising in transgenic mice. // Life Sci. 1999,V. 64, P. 21252133.

190. Lu C., Giordano F., Bao X. et al. Antisense fosB RNA inhibits thrombin-induced hypertrophy in cultured pulmonary arterial smooth muscle cells// Circulation, 1998, V.98, P.596-603.

191. Ludke E.S., Humes G.L. Effect of tumor necrosis factor on granule release and LTB4 production in adherent human polymorphonuclear leukocytes. //Agents and actions. 1989, V.27, N.3-4, P.451-454.

192. Macaya R.F., Schultze P. Smith F.W. et all., Thrombin-binding DNA aptamer forms a unimolecular quardruplex structure in solution. // Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 1993, V. 90, P. 3745-3749.

193. Mackay F.,Browning J.L.,Lawton P. et all. Both the lymphotoxin and tumor necrosis factor pathways are involved in experimental murine models of colitis. // Gastroenterology, 1998, V. 115, P. 1464-1475.

194. Mao S.J., Yates M.T., Owen T.J. et all, Interaction of hirudin with thrombin // Biochemistry, 1988, V.27, P.8170-8173.

195. Maragarone J.M., Bourdon P., Jablonski J. et all, Design and characterization of hirulogs: A novel class of bivalent peptide inhibitors of thrombin. // Biochemistry, 1990,V.29, P.7095-7101.

196. Mardiguian J. Methods of preparation of low molecular weight heparins in Doutremepuich C. (Ed). Dekker M. Low Molecular Weight Heparins in Clinical Practice, N-Y, 1992, P. 7-12.

197. Mari B., Guerin S., Far D.F. et al. Thrombin and trypsin-induced Ca2+ mobilization in human T-cell lines through interaction with different protease-activated receptors// FASEB J., 1996, V.10, P. 309-316.

198. Markwardt F. Coagulation inhibitors from blood-sucking animals. // Pharmazie, 1994, V.49, P.313-316.

199. Marshall W.L., Brinkman B.M., Ambrose C.M. et all. Signaling through the lymfotoxin beta receptor stimulates HIV- 1 replication alone and in cooperation with soluble or membrane - bound TNF-alpha. // J. Immunol. 1999, V. 162, P.6016-6023.

200. Maruyama I., Synthetic anticoagulants. // Jpn J. Clin. Hematol., 1990, V.31, P.776-781.

201. Matsumoto M., Fu Y.X., Molina H. Distinct roles of lymphotoxin alpha and the type 1 tumor necrosis factor (TNF) receptor in the establishment of follicular dendritic cells from non-bone marrow-derived cells. // J. Exp. Med.,1997, V.186, P.1997-2004.

202. Matsuo T., Kario K., Kodama K. et all., Clinical application of the synthetic thrombin inhibitor, Argatroban (MD-805). // Semin. Thromb. Haemost., 1992, V18, P. 155-160.222

203. McCusker R H., Clemmons D.R. Effects of cytokines on insuline-like growth factor-binding protein secretion by muscle cells in vitro// Endocrinology, 1994, V.134, P.2095-2102.

204. Meager A., Leung H., Woolley G. Assays for tumor necrosis factor and related cytokines.//1989, V. 116, P. 1-17.

205. Mentz S., de Lacale S., Baerga O.A. et al. Mechanism of thrombin clearance by human astrocytoma cells//J.Neurochem., 1999, V.72, P.980-987.

206. Mentz S., de Lacalle S., Baerga O. et al. Mechanism of thrombin clearence by human astrocytoma cells// J.Neurochem.,1999, V.72, P.980-987.

207. Merlo G.R., Basolo F., Fiore L. Et all, p53-dependent activation of apoptosis in mammary epithelial cells reveals a curvival function of EGF and insulin.// J. Cell. Biol., 1995, V. 128, P. 1185-1196.

208. Molino M., Bainton D., Hoxie J. et al. Thrombin receptor on human platalets// J.Biol.Chem., 1997, V.272,P.6011-6017.

209. Morimoto A., Sakata Y., Watanabe T. et all, Characteristics of fever and acute phase response induced in rabbits by IL-1 and TNF //Amer. J. of Physiol. 1989, V.256, N.l, P.R41-R35.

210. Morris D.L., Ward J.B. Jr., Nechay P. et al. Highly purified human alpha-thrombin promotes morphological transformation of Balb/c 3T3 cells// Carcinogenesis, 1992, V.13, P. 1-7.

211. Mossman T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and cytotoxicity assays// J. immunol. meth., 1983.V.65, P.55-63.

212. Muhle R., Green D., Moore M.A. et al. Constitutive production and thrombin-induced of vascular endothelial growth factor by human megakaryocytes and platelets// PNAS, 1997, V.94, P.663-668.

213. Murphy M., Walter B.N., Pike-Nobile L. et all, Expression of the lymphotoxiln beta receptor on follicular stromal cells in human lymphoid tissues.// Cell Death Differ., 1998, V.5, P.497-505

214. Nagata S.,Golstein P., The Fas death factor.//Science,1995,V,267, P.1449-1456.

215. Natoli G., Costanzo A., Moretti F. Et all, Tumor necrosis factor (TNF) receptor 1 signaling downstream of TNF receptor-associated factor2.// J. Biol. Chem., V.272, P.26079-26082.

216. Naylor P.H., Smith M.R., Mutchnik M.G. et all, Thymosin alphal does not promote growth or oncogenic transformation. // Int. J. Immunopharmacol., 1996, V. 18, P.321-327.

217. Neises B., Tarnus C., Thrombin inhibition by the tripeptide trifluoroomethyl ketone D-Phe-Pro-Arg-CF3 (MDL73756).//Thromb. Haemost., 1991, V.65,P.1290.

218. Nierodzik M L., Plotkin A., Kajumo F., Karpatkin S. Thrombin stimulates tumor-platelet adhesion in vitro and metastasis in vivo// J.Clin.Invest., 1991, V.87, P.229-236.

219. N-terminal kinase activation.// J. Biol. Chem., 1999, V.274, P.22414-22422.

220. Ohshima Y., Yang L.P., Avice M.N. Naive human CD4+ cells are a major source of lymfotoxin alpha. //J. Immunol., 1999,V. 162,P.3790-3794.

221. Or R., Kalinkovich A., Nagler A. et all, Soluble tumor necrosis factor (sTNF) receptors: a possible prognostic marker for bone marrow transplantation-related complications.// Cytokines Mol. Ther., 1996, V.2, P.243-250.

222. Oshiro T., Kanbayashi J., Kosaki G. Antithrombotic therapy of patient with peripheral arterial reconstruction-clinical study on MD805. // Blood Vessel, 1983, V. 14, P.216-218.

223. Osoba D., Miller J. The lymphoid tissues and immune responses of neonatally thymectomized mice bearing thymus tissues in millipore diffusion chambers.// J. Exp. Med., 1964, V. 119, P. 177-194.

224. Owen L.B., Shaub W.L., Crump, Morin G.I. et all. Regulation of lymphocyte tumor necrosis factor receptors by IL-2.//J.of Immunology. 1989 V.143,N.7P.2236-2241.

225. Paborsky L.R., McCurdy S.N., Griffin L.C. et all. The single-stranded DNA aptamer binding-site of human thrombin. // J. Biol. Chem. 1993, V.268, P.20808.

226. Park Y.C., Burkitt V., Villa A.R.et all, Structural basis for self-association and receptor recognition of human TRAF2. //Nature, 1999,V.398, P.533-538.

227. Pendurthi U., Williams J.T., Rao L.V. Acidic and basic fibroblast growth factors supress transcriptional activation of tissue factor and other inflammatory genes in endothelial cells//Arteroscl.Thromb.Vasc.Biol.,1997,V. 17, P.940-946.

228. Pica F., Fraschetti C., Matteucci C. High doses of thymosin alpha 1 enhance the antitumor efficacy of combination chemo-immunotherapy for murine B16 melanoma. // Anticancer Res., 1998, V.18, P.3571-3578.

229. Plummer J.S., Berryman K.A., Cai C. et al. Potent and selective bicyclic lactam inhibitors of thrombin: part 3. PI 'modifications// Biorg. Med. Chem. Lett., 1999, V.9., P.835-840.

230. Plummer J.S., Berryman K.A., Cai C. et all, Potent and selective bicyclic lactam inhibitors of thrombin:part 3: PI'modifications. // Bio.Med. Chem.Lett., 1999,V.9P.835-840.

231. Pober J.S.Cotran R.S., Cytokines and endotelian cell biology/ZPhysiol.Rev. 1990, V.70, P.427-451.

232. Poller W., Wilnow T.E., Hilpert J. et al. Differential recognition of alpha-1-antitrypsin-elastse and alpha-1-antichymotrypsin-cathepsin G complexes by the low densitylipoprotein receptor-related protein// J.Biol.Chem.,1995,V.270,P.2841-2845.

233. Pozo D., Guerrero J.M., Sagura J.J. et all, Thymosin alphal interacts with the VIP receptor-effector system in rat and mouse immunocompetent cells. // Immunopharmacology, 1996, V.34, P. 113-123.

234. Rao G., Runge M. Cyclic AMP inhibition of thrombin-induced growth in vascular smooth muscle cells correlates with decreased JNK1 activity and c-Jun expression// J.Biol.Chem., 1996, V.271, P.20805-20810.

235. Rapuano B.E., Bockman R.S., Protein kinases A and C positively regulate G protein -dependent activation of phosphatidylinositol-speciflf phospholipase C by tumor necrosis factor-a in MC3T3-E1 osteoblasts. //J. Cell. Biochem. 1997,V.65, P. 198-208.

236. Reiner J., Lim-Wilby M., Brunck T. et al. Investigation of the S3 site of thrombin; design, synthesis and biological activity of 4-substituted 3-amino-2-pyridones incorporating Pl-argininals//Biorg. Med. Chem. Lett., 1999, V.9, P.895-900.

237. Reiner J.E., Lim-Wilby M.S., Brunck T.K. et all, Investigation of the S3-site of thrombin: design, synthesis and biological activity of 4-substituted 3-amino-2-pyridones incorporating Pi- argininals. //Bio.Med. Chem.Lett., 1999,V.9, P.895-900.

238. Rodrigues P., Vicuela J.E., Alvarez Fernandes L. et all, Overexpression of prothymosin alpha accelerates proliferation and retards differentiation in HL-60 cells. // BiochemJ., 1998, V.331, P.753-761.

239. Rothe M., Sarma V., Dixit V.M.,et all, TRAF2-mediated activation of NF-kappa B by TNF receptor 2 and CD40. // Science, 1995, V.269, P. 1424-1427.

240. Rubtsov Y.P., Zolotukhin A.S., Vorobjev I.A. et all, Mutational analisis of human prothymosin alpha reveals a bipartite nuclear localization signal.// FEBS Lett., 1997, V.413, P. 135-141.226

241. Ryuto M., Ono M., Izumi H.et all, Induction of vascular endothelial growth factor by tumor necrosis factor-a in human glioma cells. Possible role of SP-1.// J. Biol. Chem., 1996, V. 271 ,P.28220-28228.

242. Sancho-Tello M., Marcinkiewicz J.L., Justice W.M., Reduction of tumor necrosis factor-alpha bioactivity by a human ovarian epithelial cancer cell line in vitro. // Amer.J.Obstet.Gynecol., 1995, V. 173,P. 1470-1477.

243. Scharf M., Engels J., Tripier D.,Primary structures of new "isohirudins". //FEBS Lett. 1989, V.225, P. 105-110

244. Schaufberg H., Nowak G., Kaufman R. Thrombin has a bimodal effect on glioma cell growth//Br.J. Cancer, 1997, V.76, P.1592-1595.

245. Schutze S., Machleidt T., Adam D. et all, Inhibition of receptor internalization by monodansylcadaverin selectively blocks p55 tumor necrosis factor receptor death domain signaling. //J. Biol. Chem., 1999, V.274, P. 10203-10212.

246. Shaker A.M. Antiplatelet therapies: from aspirin to GPIIb/IHa-receptor antagonists and beyond // DDT, 1999,V.4, P.552-561.

247. Shapiro M.J., Trejo J., Zeng D. et al. Role of the thrombin receptor's cytoplasmic tail in intrcellular trafficing// J. Biol. Chem., 1996, V.271, P.32874-32880.

248. Shea T. Inhibition of neuronal surface proteases decreases the requirement for GAP-43 in neurite outgrowth//Brain Res.Dev.BrainRes., 1995, V.87, P.87-90.

249. Shea T., Beerman M., Nixon R. Multiple proteases regulate neurite outgrowth in NB2a/dl neuroblastoma cells//J.Neurochem.,1991, V.56, P.842-851.

250. Sheen-Chen S.M., Chen W.J., Eng H.L., et all. Serum concentration of tumor necrosis factors in patients with breast cancer. // Breast Cancer Res. Treat., V.43,P.211-215.

251. Shi C.S., Leonardi A., Kyriakis J. TNF-mediated activation of the stress-activated protein kinase pathway: TNF receptor-associated factor 2 recruits and activates germinal center kinase related. //¿Immunol., 1999, V.163, P.3279-3285.

252. Shi C.S., Leonardi A., Kyriakis J. TNF-mediated activation of the stress-activated protein kinase pathway: TNF receptor-associated factor 2 recruits and activates germinal center kinase related. //J.Immunol., 1999, V.163, P.3279-3285.

253. Shuman M.A. Thrombin-cellular interactions// Ann.NY Acad.Sci., 1986,V.485,P.349-368.

254. Simonitsch I., Krupitza G., Autocrine self-elimination of cultured ovarian cancer cells by tumor necrosis factor-a (TNF-a). //Br. J. Cancer, 1998,V.1998, P.862-870.

255. Slon-Usakiewicz J. J., Sivaraman J. Yunge L. et all, Design of PI' and P3' residues of trivalent thrombin inhibitors and their crystal structures. //Biochem., 2000,V.39,P.2384-2391.

256. Smith 1., Smith J. Regulation of sodium-calcium exchanger by glucocorticoids and growth factors in vascular smooth muscle//J.Biol.Chem., 1994, V.269,P.27527-27531.

257. Smith R.A., Baglioni C. The active form of tumor necrosis factor is a trimer//J.Biol.Chem.-1987, V.262, N.15, P.6951-6954.

258. Spies T., Morton C., Nedospasov S. et all, Genes for the necrosis factor are linked to the human major histocompatibility complex. //Proc. Nation. Acad. Sc.USA, 1986,V.83, N.22, P.8699-8702.

259. Stefanini G.F., Foschi F.G., Castelli E. et all, Alpha-1-thymosin and transcatheter arterial chemoembolization in hepatocellular carcinoma patients: a preliminary experience. //Hepatogastroenterology, 1998, V.45, P.209-215.

260. Stenflo J. Contributions of Gla and EGF-like domains to the function of vitamin k-dependent coagulation factors// Critical Reviews in Euc. Gene Expression, 1999, V.9, P.59-88.

261. Stewart AG., Tomlinson PR., Fernandes D.J. et al. Tumor necrosis factor alpha modulates mitogenic responses of human cultured airway smooth muscle// Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.,1995, V.12, P.110-119.

262. Stoufer G.A., Runge M.S. The role of secondary growth factor production in thrombin-induced proliferation of vascular smooth muscle cells// Semin.Thromb. Hemost., 1998, V.24, P. 145-150.

263. Swaim M.W., Chiang H.S., HuangT.F. Characterization of platelet aggregation induced by PC-3 human prostate adenocarcinoma cells and inhibited by snake venom peptides, trigramin and rhodostomin// Eur.J.Cancer, 1996,V.32A, P.715-721.

264. Swart A.C.W., van den Hende-Timmer E.J., van Bekkum D.W., Analysis of hormone preparation from normal and irradiated calf thymus and control preparation by sodium dodecyl sulfate electrophoresis. // Kooker Sc. Pub., Rotterdam, 1975, P.203-207.

265. Takahashi N., Udagawa N., Suda T. A new member of tumor necrosis factor ligand family, ODF/OPGL/TRANCE/RANKL, regulates osteoclast differentiation and function. // Biochem Biophys. Res. Commun., 1999, V.256, P.449-452.

266. Takuwa N., Takuwa Y. Ras activity late in Gl phase required for p27kipl downregulation, passage through the restriction point, and entry into S phase in growth factor-stimulated NIH 3T3 fibroblasts// Mol Cell Biol., 1997, V.17, P.5348-5358.

267. Tamao Y., Yamamoto T., Hirata T. et all, Effect of argipidine (MD-805) on blood coagulation //Jpn. Pharmacol. Ther., 1986,V. 14, P.869-874.

268. Tamao Y., Yamamoto T., Kimumoto R., et all, Effect of a selective thrombin-inhibitor MCI-9038 on fibrinolysis in vitro and in vivo.// Thromb. Haemost., 1986,V.562, P.28-34.

269. Tao L., Wang R. H., Enkemann S.A., Metabolic regulation of protein-bound glutamyl-phosphates: insights into the function of protnymosin alpha.// J. Cell Physiol., 1999, V.178, P.154-163.

270. Tapparelli C.,Metternich R., Ehhrhardt C et all, In vitro and in vivo characterization of a neutral boron -containing thrombin-inhibitor. // J. Biol. Chem, 1993, V.268, P.4734-4744.

271. Taylor D.S., Cheng X., Pawlowski J.E. et al. Epiregulin is a potent vascular smooth muscle cell-derived mitogen induced by angiotensin II, endothelin-1 and thrombin // PN AS, 1999,V.96, P.1633-1638.

272. Terinzagelegging 7904723 Nederland (1980). / Farmacologisch werkzame 2-(l-piperazinyl)-chinolinederivaten. (Int Cl3.: C 07 D 401/04, A 61 K 31/50). 16 P.

273. Tewari M., Dixit V.M. Recent advances in tumor necrosis factor and CD40 signaling. // Curr. Opin. Genet. Dev., V.6, P.39-44

274. Tolkatchev D., Ni F. Calcium binding properties of an epidermal growth factor-like domain from human thrombomodullin// Biochemistry, 1998, V.37, P.9091-9100.

275. Tordai A., Fenton J.W., Andersen T. et al. Functional thrombin receptor on human T lymphoblastoid cells// J.Immunol., 1993, V.150, P.4876-4886.

276. Tracey K.J., Lowry S.F., Cerami A. Cachektin /TNF-a in septic adult respiratory distresses syndrom. // Amer. Rev. Resp.Dis. 1988,V. 138, N.6, P. 1377-1379.

277. Tracey K.J., Vlassare H., Cerami A., Cachektin / tumor necrosis factor//Lancet.,1989, N.8647, P. 1122-1125.

278. Tsitsilonis O.E., Bekris I.F., Voutsas I F. et all. The prognostic value of alpha-thymosins in breast-cancer. // Anticancer Res., 1998, V.18, P. 1501-1508.

279. Vaingankar S.M., Martins G.M. Thrombin activation of the 9E3/CEF4 chemokine involves tyrosine kinases including c-src and the epidermal growth factor receptor// J.Biol.Chem.,1998, V.273, P.5226-5234.

280. Verstraaete M., Direct thrombin-inhibitors: Appraisal of the antithrombotic / hemorrhagic balance. // Thromb. Haemost., 1997, V.78, P.357-363.

281. Vito R., Guido A., Massimo G. et all. Comparative study on the antiviral activity of tumor necrosis factor (TNF-a), lymfotoxin (TNF-(3 ) and IL-1 in WISH cells.//Immunol. 1989, V.21, N.2, P. 165-169

282. Vlasuk G., Vallar P.L., Weinhouse M.L., A novel inhibitor of thrombin containing multiple recognition sequences linked by a-keto amide transition state. // Circulation, 1994, V.90.P. 1-348.

283. Voelkel Jonson C., Entingh A. J., Wold W.S. et all, Activation intracellular proteases in a early event in TNF-induced apoptosis. // J. Immunol., 1995, V.154, P. 1707-1716.231

284. Von Albertini M., Ferran C., Brostjan C. Membrane-associated lymphotoxin on natural killer cells activates endothelial cells via NF-kappaB-dependent pathway. // Transplantation, 1998, V.66, P. 1211-1219.

285. Vu T.-K., Hung D., Wheaton V. et al. Molecular cloning of a functional thrombin receptor revealsa novel proteolytic mechanism of receptor activation// Cell,1991,V.64, P. 1057-1068.

286. Wajant H., Grell M., Scheurich P. TNF receptor associated factors in cytokine signaling. // Cytokine GrowthFactor Rev., 1999, V.10, P.15-26.

287. Wallach D., Varfolomeev E.E., Malinin N.L. et all, Tumor necrosis factor receptor and Fas signaling mechanisms.// Annu. Rev.Immunol., 1999, V.17, P.331-367.

288. Waltz D.A., Fenton J.W. The role of thrombin in tumor cell metastasis// Invasion Metastasis, 1994, V.14, P.303-308.

289. Warzocha K.JBienvenu J.,Coiffier B. et all, Mechanism of action of the tumor necrosis factor and lymphotoxin ligand- receptor system. // Eur. Cytokine Netw., 1995, V.6, P.83-96.

290. Webber E.M., Bruix J., Pierce R.H .et all, Tumor necrosis factor primers hepatocytes for DNA replication in the rat. // Hepatology, 1998, V.28, P. 1226-1234.

291. White H.D. Clinical trials of direct thrombin-inhibitors in acute ischaemic syndromes.// Thromb. Haemost., 1997,V.78, P.364-366.

292. Williams R.O., Ghrayeb J., Feldmann M. et all, Successful therapy of collagen-induced arthritis with TNF-receptor-IgG fusion protein and combination with anti-CD4. // Immunology, 1995, V. 84, P.433-439.

293. Wingbield P., Roger H., Craig S., Tumor necrosis factor is a compact trimer// FEBS Letters.-1987, V.211,N. 2, P. 179-184.

294. Wojtukiewicz M., Tang D., Ben-Josef E. et al. Solid tumor cells express functional «tethered ligand» thrombin receptor// Cancer Research, 1995, V.55, P.698-704.

295. Wolf M., Zimper K. Die Sorgie for den Krebspatienten in der Genesendenfursorge und in der praxis vom Standpunkt des Krankerhauses// Mutteil, Osterr. Sanitatsv., 1974, V.75, P. 109-112

296. Wong B.R., Josien R., Lee S.Y., et all, The TRAF family of signal transducers mediates NF-kappaB activation by TRANCE receptor.// Biol.Chem., 1998, V.273, P.28355-28359.

297. Wood S., Holyoke D.,Yardley J. Mechanism of metastasis production of blood-borne cancer cells// Canad. cancer. Conf., 1961, V.4, P. 167-223.

298. Wu C.G., Boers W., Reitsima P.R. et all Overexpression of prothymosin alpha, concomitant with c-myc, during rat hepatic carcinogenesis. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997, V.232, P.817-821.

299. Wu C.L., Shiau A.L., Lin C.S., Prothymosin alpha promotes cell proliferation in N1H3T3 cells. // Life Sc., 1997, V.61, P.2091-2101.

300. Wu M.Y., Wang P.Y., Han S.H.et all,The cytoplasmatic domain of the lymphotoxin-beta receptor mediates cell death in HeLa cells.// J. Biol. Chem.,1999, V.274, P. 1186811873.

301. Wu Q., Wang Y., Wang J. et all. The requirement of membrane lymfotoxin for the presence of dendritic cells in lymphoid tissues. // J. Exp. Med., 1999, V.190, P.629-638.

302. Yamada M., Tanimoto A., Ichinowatari G et all, Possible participation of intracellular platelet- activating factor in tumor necrosis factor-alpha production by rat peritoneal macrophages.//Euro. J. Pharmacol, V.347, P.341-350.

303. Yamada M., Tanimoto A., Ichinowatari G et all, Possible participation of intracellular platelet- activating factor in tumor necrosis factor-alpha production by rat peritoneal macrophages.//Euro. J. Pharmacol., V.347, P.341-350.

304. Yan W., Tiruppathi C., Lum H. et al. Protein kinase C beta regulates heterologous desensitisation of thrombinreceptor (PAR-1) in endothelial cells// Am.J.Physiol., 1998, V.274 (2 Pt 1), C.387-395.

305. Yasuhito A.,Masazumi M.,Teiri S., Shigeru K. Enzyme linked immunisorbent assay (ELISA) for human tumor necrosis factor (h TNF).// Clin.Chem.Acta. 1988, V.176, N.2, P.213-217.

306. You L.R., Chen C.M., Lee Y.H.W. Hepatitis C virus core protein enhances NF-kappa signal pathway triggering by lymphotoxin-beta receptor ligand and tumor necrosis factor alpha.

307. Zawilska K., Zozulinska M., Turowiecka Z. et all, The effect of a long- acting recombinant hirudin (PEG-hirudin) on experimental disseminated intravascular coagulation(DIC) in rabbits. //Thromb. Res., 1993,V.69, P.315-320.

308. Zinetti M., Agyekum S., Evans T. et all. The role of lipopolysacharide, proinflammatory cytokines and bacterial superantigenes in the transcriptional regulation of lymphotoxin alpha and beta in mouse splenocytes. // Cytokine, 1998, V. 10, P.940-947.

309. Zucker S., Conner C., DiMassmo B.I. et al. Thrombin induces the activation of progelatinase A in vascular endothelial cells. Physiological regulation of angiogenesis// J.Biol.Chem., 1995, V.270, P.23730-23738.