Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Природа следовой деполяризации миелинизированных нервных волокон: эффекты фармакологической модуляции натриевых и калиевых каналов

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Природа следовой деполяризации миелинизированных нервных волокон: эффекты фармакологической модуляции натриевых и калиевых каналов"

РГЗ сд

УЛЬЯНОВСКИЙ ОРДЕНА "ЗНАК ПОЧЕТА" ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕЛАГОГИЧЕСКИИ ИНСШГУТ км. И. Н.УЛЬЯНОВА

На главах рукопмсн уда 612.813.2

ВЕРТУН ОЛЬГА ВИКТОРОВНА

природа следовой деполяризации миелиниэированных нервных волокона эффекты фармакологической модыляции натриевых и калиевых каналов

03. 00. 13 - ^ияюлсгия человека и киботнни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

УЛЬЯНОВСК 1894-

Работа выполнена ш кафедре анатомии и физиологии человека и животных Ульяновского ордена "Знак почата" государственного педагогического института им И.Н.Ульянова.

Научнш руководитель:- доктор биологически« наук профессор КАТАЛЫМЭЗ Л.Л.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук профессор СИТДЖ0В Ф.Г.

доктор медицинских наук профессор ЗЕЯМРОВ A.J1.

_ Ведущая организация -. Институт общей патологии и патологической физиологии РАМН

Зенита состоится с&Р 1S04 г. в ^ часов

на заседании специализированного совета К. 113.51.01 по присуждению ученей степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13. - физиология человека и хатотнш при Ульяновском ордена "Знак почета" государственном педагогическом институте по адресу: 432700, г.Ульяновск, пл. 100-летия B.W.Лзкина, д.4.

С диссертацией мошо ознакомиться в библиотеке Ульяновского государственного педагогического института по адресу: Ульяновск, пл. 100-летая З.И.Ленина, 4.

Автореферат разослан "-¿ß' с^СС1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

О. И. Вашина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность ПРОбЛ<?№1

Следовая деполяризация (СД), следующая за спайковой частью потенциала дейс.вия СПД), играет важную роль в деятельности нервной системы. С ней связаны следовые изменения возбудимости (Graham, 1934: Lorente de No, 1947) нервный волокон. Следовая деполяризация участвует в регуляции пейсмекерной (Аракелов, 1974) и вызванной ритмической активности (.Lorente de No, 1947; Голиков. I960) возбудимых обоазований. Слеяовьм потенциалам пои-надлежит важная роль в процессах пространственного вэаимодея- -ствия и интеграции в центральной нервной системе (Adeiman, Paltl, 1972: Русинов, 1967). Следоэоп деполяризации отводится существенное место в объяснении циркуляции и реверберации импульсов в нейроналънда сетях,' она привлекается также для объяснения механизма кратковременной памяти (Hebb, 1949: Соколов, 1981).

В литературе высказано несколько альтернативных гипотез относительно природы СД. Одни авторы связывают ее возникновение с активацией Na- и С1-каналов (Shanes, 1953; Ulbrlht, 1965). Другие исследователи объясняют ее аккумуляцией К+ з примембранном пространстее (Frankenliasuser, Kod0kln. 1956; Grlngard, Straub, 1958; Каталишв, 1974) или в межклеточной жидкости (Meves, 1981; Eergaan, 1973). Третья группа исследователей (Brunet et. al., 1990; Jlroimek, Brunet, 1890) предполагает, что СД ножет отра-:ить ответ !!!ваниовския клеток на электрическую активность аксона. Имеется также гипотеза, согласно которой СД является результатом емкостного тока интернодальной мембраны (Barrett, Barrett., 1982; Blight, Soraeva, 1985).

Несмотря на большое количество выдвинутых гипотез, единой точки зрения относительно механизма СД до сих пор не существует, ни одна из высказанных гипотез не охватывает всей совокупности экспериментальным данных и не в состоянии объяснить выявленных противоречия. В связи с этим представлялось актуальным дальнейшее изучение ионнс-мембранных механизмов генерации СД мизлинизи-роваиных нервных волокон.

Лель и задачи исследования

Чель работы заключалась в исследовании механизма следовой деполяризации миелинизированных нервных волокон при фармакологической модификации натриевых и калиевых каналов. Для достижения этой цели были поставлены следующие задач»;:

1. Для проверки "калиевой" гипотезы происхождения СД изучить влияние факторов, приводящий к"увеличению и уменьшению аккумуляции К"*" в примембранном пространстве перехвата Ранвьс.

2. Изучить влияние активирования натриевого тока на СД мкз-линизированных нервнык волоко.:.

3. Исследовать влияние других факторов, изменяющих возбудимость нервных волокон Содно- и двухвалентные иона. С02), ка нормальную и фармакологически-!,юдифицироваиную СД.

Научная новизна

В работе проведен фармакологический анализ СД, следующей за распространяющимся ПД, в интактном миелинизированном нервном волокне лягушки. Полученные результата не подтвердили "калиевую" гипотезу происхождения СД.

Показано, что воздействия, способствующе аккумуляции К* в примембранном пространстве: уменьшение концентрации К"1" в омывающем растворе, блокирование Иа^/К^-насоса уабаином или заменой в наружном растворе на Ы"*" - не приводят к увеличению СД. Напротив, блокирование К^-каналов, уменьшающее выход К"* из цитоплазмы, существенно увеличивает амплитуду и длительность СД. Установлено, что бл'окатор К^-каналов тетраэтиламмония СТЭА) значительно усиливает эффекты "активатора" Ма+-каналов вератридина. На основании полученных данных впервые выдвинута гипотеза о том, что следовая деполяризация в интактиых миелинизированнкх нервных волокнах обусловлена следовым Ма+-током через медленно инактивируодиеся Ма+-каналы.

С учетом выдвинутой гипотезы проведен анализ механизма действия С02 на следовую деполяризацию в условиях модификации N3"*-и К+-каналов.

Положения, выносимые ц§ защиту

1. Воздействия, способствующие "накоплению К+ в примембранном пространстве перехвата Ранвьэ, не вызывают существенных из-

менениа СД.

2. Блокирование К+-каналов миелиниэированных нервны?: волокон вызывает увеличение амплитуды и длительности СД, что связанно с повышением соотношения Рйа/Рк за счет уменьшения Рк.

3. Блокирование К^-канаюв с помощью ТЭА на фоке действия "активатора" Ма+-к.анагов вератридина - значительно увеличивает его влияние на СД. .

4. Следовая деполяризация в • интоктньи миелинизированных нервных волокнах обусловлена неполной инактивацией Ка^-каналов к момент у окончания спайка.

Научно-практическая значимость

Проведенные исследования позволяют углубить существующие представления об ионно-мэмбранных механизмах генерации возбуждения в нервной системе, природе следовых потенциалов. Выдвинута новая гипотеза относительно механизма СД, которая хорошо объясняет имеющееся экспериментальные данные.

Результаты исследования могут найти применение в теоретической и экспериментальной нейрофизиологии, исследованиях по моделированию процессов возбуждения в нервной системе, нейрофармакологии.

Полученные результаты могут быть использованы в учебном процессе - в преподавании раздела "Ионно-мембранные механизмы генерации ПД" курса физиологии человека и животных.

Реализация результатов исследования По материалам диссертации опубликовано 5 работ, результаты полотна на ежегодных внугоивузовских кон!еоенциях Ульяновского пединститута (1991-1994), научно-практической конференции Ульяновского сельскохозяйственного института (1693), конференции молодых ученых Казанского пединститута (1903). Результаты настоящей работа включены в лекционный курс и спецкурс "Биологические мембраны" по Физиологии человека для студентов Ульяновского педагогического института.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, списания методики экспериментов, результатов исследования и их об-

суждения, заключения, выводов и указателя литературы. Работа излажена на 123 страницах машинописного текста, включая 36 рисунков и 4 таблицы. Список литературы содержит 175 источников, из ник 18 отеч&сгвышын и 157 зарубежных авторов.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводились на одиночных нервных волокнах с "закрытиы" перехватом раквье, выделенных из седашадогс нерва озерной лягушки Rana fíldlbunda.

Для получения одиночного нервного волокна с "закрытым" перехватом препаровку производили по модифицированной (Иаталымов, 1974) методике Тесаки (Тасаки, 1957) в ыежпереиватном участке, а перенват, от которого отводили ПД, оставляли интактньш в нервном стволе. Препарат размещали в специальной камере с "воздушным шетикпм-изолятором".

Раздражение нерва производили в проксимальной части прямоугольными электрическими импульсами длительностью 0.1 мс сверкпо-роговой амплитуды, используя двухканальных стимулятор ЗС-10 с радиочастотным выходом.

В качестве отводящих использовали каломельные неполяризук-•даеся электроды. Для отведения однофазных ПД дистадьный участок нерва инактивировали 2% раствором новокаина. Электрический сигнал с регистрирующих электродов подавали через катодный повторитель (входное сопротивление 20 Г'Ом) на усилитель постоянного тока УУ-2М, а затем на вход первого канала осциллограф, к через диф$еренцировочную цепочку с постоянной времени Í0 мс í(M00 КОм. 0100 ГШ на вход еторогс канала. Таким образом, на экране осциллографа воспроизводились дза процесса - ПД и первая произ-

О

водная от мембранного потенциала (V).

В опытах использовали раствор Рингера следувдго состава (в мМ): NaCl (114), КС1 (2.5), CaClü (2.0), НаНООз (2.5). Величину рН раствора поддерживали на уровне 7.2-7.3. В экспериментах с Применением С0& для предотвращения сдвига ;Н раствора в сторону закисления использовали раствора Рингера, содержащие 20 мМ N¿¡HCQ3 (с зквивалентнои заменой fe*U) или 20 мМ HEPES.

СОг из баллона подавали в газосмесителькур колонку. Скорость пропускания СО2 в камеру с препаратом поддерживали на

уровне 0,5 л/мкн.

При статистической обработке зксперихен'кшьнкх данный использовали Ь-критерий Стьюдента СЛакин, 1000).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3 "зккрьпш" пгрензахе Рачвье миелинизированньк нервньи волокон- пик ПД сопровойдттся жрсио выратенкой следовой деполяризацией ССД). Бремя полуспада С11/2) СД после одиночного спайки в пшик опытам составляло 44,29*9.52 не. Величина амплитуды СД в момент переиода быстрой реполяризацш ПД в ».^дленную была раэна 1.67*0.£9 КВ СП=156).

В процессе ритмического раздрдасния С10-50 Гц) СД сумуи-¡,угтся, образуя деполяризационкоэ плато. Амплитуде такого плато при 1-сек стимуляции частотой 10 Гц достигала 1.08*0.15 кВ. частотой 60 Гц - 2.48*0.25 «В. Нослэ прекращения стимуляции частотой 10 Гц Ц/2 сукнариоп СД было 147*24 ик, при 50 Гц - 11Ь29ис Сп=156).

Влияние блокатсров кадтавад шйтоц ца СД иидлинизиррвт-г-ыя 1,;:?рр;ш, вояжон.

С пелью проссрки "калиеЕсп" гипотеоа происхождения СД (ргапкепЬаизег, Ной2к1п, 1656: Каташ»сз, 1974; СПпеаЩ. 51гачЬ 1985:) ни правке всего исследаши нлиядаэ блокаторов К""~к?,налов ня СД. Если СД шелкткзкроканнья 'нервных волокон действительно свягша с нгчопдэнием $киюв К+, одходяфк ро время ЯД, в примгм-браинсм пространстве кекду Еганкспскся клеткой и возбудимой кеы-брачоа. то блокировало К*-каналов 'л соответственное снижение каляапого тока С1к) доляно било бы приводить к улоныяепи» акку-:■!'К*. и, следовательно - енжпениа СД.

Оддает проведенные на;,« эксперимента показали, что при б.го-киро&иши К"-келало8 тетреатиламмонмем (ТЭА) и 4-аминопирадиком <4-ГР) СД пе только из сникаэтся, но нелртив, значительно угали-чизеется и по к/ляитуде и ш длительности. Так, через 5 мчн поо~ ге начала аппликации раствора, содержась го ТЭА (10 мМ)-» происходило кздоставеряое швыиэкиэ аяшггуды ПД, от 79,50*2,27 м? в коктролз до 83,40^8,44 >,3 <п=10). Длительность счайка, измерен-

- s -

пая на давне снижения его амплитуды на 2/3, увеличивалась при действии ТЭА более, чем в 2.5 раза - от 2.30*0.37 мс в контроле до 5.83*0.76 мс в присутствии ТЭА. Амплитуда СД через 5 мин после, начала действия ТЭА возрастала на 80% от исходной и составляла 3.80*0.40 мВ. Время полуспада СИ/2) СД после одиночного спайка увеличивалось на 56.6% - от 43*8.32 мс до 69*23.46 мс. При ритмической стимуляции частотой 50 Гц амплитуда суммарной СД увеличивалась на 112% - от 3.10*1.30 до 6.60*1.35 мВ.

Опыты с применением другого блокатора К+-каналов - 4-АР, дали аналогичный результат: СД, сопровождающая спайк, также значительно увеличивалась как по амплитуде, так и по длительности.

После смены нормального раствора Рингера на раствор, содержащий 2 мМ 4-АР, происходило недостоверное (Р<0.05, п=11) повышение акплитуды ПД нервных волокон - с 76.00*0.22 до 79.6*3.40 мВ. В ответ на одиночный стимул возникал 3-8-спаяковый ответ, сопровоадашцися большой по амплитуде и длительности СД. Амплитуда СД в 4-АР возрастала на 142%, достигая при этом 5.10*0.80 «В. Время полуследа СД в 4-АР увеличивалось от 46.34*8.02 мс в исходном состоянии до 170.86*39.07 мс в 4-АР.

Возникновение "многоспаикоЕого" ответа на одиночный стиму-лируюдаи импульс в присутствии 4-АР наблюдалось многими исследователями на различных объектах (Dubois, 1982; Targ, Kocsls, 1982; Kocsls et. al, 1987; Eng et. al:, 1988; Pull et. al., 1989; Гиниатуллин, 1992). Однако механизм возникновения таких множественным ответов пока не выяснен. Возможно эти ответы объясняются тем, что под действием 4-АР наряду с блокадой К+-ка-налов г.роиснодитослабление инактивации Иа^-каналов, поскольку для возникновения ГШ на йоне,СД необходимо, чтобы часть Ма+-ка-налов была свободна от инактивации.

При ритмической стимуляции волокна частотой 50 Гц в присутствии 4-АР сильное повьшание суммарной СД происходило лишь в ответ на первые 3-4 стимула, а затем уровень деполяризационного плато снижался. Известно, что блокирующее действие 4-АР на К♦-каналы зависит от меьоранного потенциала - уменьшается при деполяризации мембранами увеличивается при ее гилерлоляризацаи C&h et. eil., 1976: Wagner, Ulbricht, 1Ö76: Heves, Pichón, 1977; AdoTiä, 1979). В связи с зтам, ю».но предположить, что уменьшение суододш СД в начале ритмической стимуляции связано с ослаб-

лением блокирующего действия 4-АР при деполяризации, вызванной симмашея СД во воемя оитаического развпажения.

Через 10 - 15 минут действия 4-АР в 7 из 11" опытов волокна начинали спонтанно генерировать ПД. Такая спонтанная актжнэсть проявлялась в виде повторяющимся пачек ПД и следующей за ними Гиперполяризации. Спонтанную активность нервного волокна при действии 4-АР, по-видимому, дакно объяснить следующим образом. При блокировании К+-каналов 4-АР уменьшается проницаемость мембраны для что ведет к деполяризации мембраны. Деполяризация, 8 свою очередь, повышает PNa, что приводит к. еие большему снижению мембранного потенциала. В ыомзнт достижения последним критического уровня акссн начинает генерировать ПД. Поскольку блокирование 4-АР является потенциал-зависимым, деполяризация мембраны ослабляет блок К^-каналов CYeh et.al., 1976; teves. Pichón, 1975: WaHner, UlbrlhL, 1975), при этом повышается Рк и происходит реполяризация мембраны. Этот процесс является циклическим, так как гиперполяризация мембраны вновь приводит к усилению блокирующего действия 4-АР (рис. 1).

8 экспериментах с использованием специфического блокатора Ка^-каналов ТТХ были получены данные, свидетельствующие, что. "многоспаяковый" ответ и спонтанная активность , вызванная 4-АР, не связаны с повышением максимальной натриевой проницаемоста,

Рис. 1. Схема изменений мембранного потенциала и лонной проницаемости миелинизированнми нервных волокон во время генерации спонтанной импульсной активности при. блокировании калиевых каналов 4-аданопиридином.

поскольку воздействие 25 jjM ТТХ на обработанное 4-АР нервное волокно вызывало лишь снижение амплитуды, но не уменьшало число спайков в "многоспайковом" ответе. Спонтанная активность волокна. вызванная 4-АР. пол действием ТТХ также не устранялась.

- Известно, что натриевый ток'Может повышаться не только путем увеличения максимальной Рка. но и за счет смещения кривой потенциал-зависимости Рна вдоль оси напряжения в сторону меньших потенциалов (Frankenhaeuser, ftodgííln, 185?). Как было показано на модели перехвата Ранвье лягушки (Ходоров и др., 1970), смещение этой кривой на 12 мВ приводит к возникновению авторитмической активности. Исходя из этого, нам представляется вероятным, что 4-АР шкет влиять на натриевую систему, одзигая кривую .зависимости PNa от напряжения в сторону более отрицательных потенциалов, подобно тому, как это происходит при уменьшении концен-. трации CCa¿+]0 Œrankenhaeitser, Vallo, 1965: Hille, 1963, а,б: Ходоров, 1969)..

Увеличеиие амплитуды и длительности СД под действием блока-торов Гл-каналоз, наблюдаемое в наших опытах, трудно объяснить исходя из "калиевой" гипотезы происхождения СД. Согласно "калиевой" гипотезе, блокирование К+-каналов мембраны должно уменьшить аккумуляцию К4" в примембранном пространстве, и следовательно, ослабить СД.

Поскольку деполяризация, мембраны является следствием преобладания входящего тока катионов над выходящим, нам представлялось вероятным предположение, что увеличение СД под влиянием ТЭА и 4-АР может быть вызвано увеличением соотношения PNa/Рк за счет уменыаения Рк. Для того, чтобы проверить, действительно ли при блокировании К+-канэлов увеличивается вклад ÍNa в генез СД, мы решили испытать г№и блокаторов К"*"-каналов в условиях воздействия на нервное волоото алкалоида вератридина, известного своей способностью вызывать длительную СД в результате модификации Ма*"-канвлоь.

Влияние веоатсидина на следовую деполяризацию "закрытого" перехвата Ранвье

Прежде, чем исследовать эффекты совместного действия вератридина (VER) и блокаторов К'чшналов, необходимо было изучить

особенности действия VER на "закрытым" перехват Ранвье.

Аппликация раствора, содержащего 0.01 мМ VER, не- изменяла амплитуду и уорму спайка. Амплитуда СД через 10 мин после добавления в гаствор VER увеличивалась на 66% - от 2.01*0.31 к,В в нормальном раствори до 3.33*0.38 мВ (n=LS). При ритмической стимуляции происходило дальнейшее увеличение СД. Через 10 мин действия VER в конце 1-сек стимуляции частотой 10 и 50 Гц ее вели- ' чина в 5.5 и 4 раза, соответственно, превышала исходную амплитуду cvMwaDHOfl СД пои той же частоте стимуляции.

Длительность СД под действием VER также очень сильно увеличивалась: ti/г СД после одиночного ПД повышалась от 43*10 мс з контроле по 364*21 мс пои действии VER. Вгемя пог.испалз сукмао-ной СД в конце 1-сек стимуляции увеличиваюсь от 250*25 мс в нормальном растворе до 1620*320 мс в присутствии VER при частоте раздражения 10 Гц, и от 116*31 мс до 2280*540 мс при 50 Гц.

Поскольку VER взаимодействует только с открытыми №У"-кана-.лами, во время спайка часть открытых На^-каналов взаимодействует с VER, вследствни чего они утрачивают способность инакта-вироваться и не закрываются послё окончания спайка до тех г.ор, пока не распадется комплекс VER-канал (см. Ходоров, 1892). СД отражает процесс медленного уменьшения числа открктых каналов.

Кинетика токов через каналы, которые не провзаимодействэва-ли с VER, остается нормальной, поэтому Зориа спайка не изменялась. В процессе ритмической стимуляции число модифицированных каналов последовательно возрастает, что отражается в сушации СД.

t

Совместное действие веШШКДИШ И. блокатсроз калиевых

Для проверки предположения о том. что ТЭА увеличивает вклад Н-!а в СД, исследовали действие ТЭА на фоне VER. В этой серии опытов волокна предварительно обрабатывались VER (в концентрации 0:01 мЮ. После того, как эффекты VER достигали максимальной величины, омывающий раствор заменяли на раствор с 0.01 мМ VER и 10 мМ ТЭА. '

При добавлении ТЭА в раствср, содержащий VER, амплитуда ПД практически не изменялась. Длительность ПД на уровне снижения амплитуды на 2/3 увеличивалась от 2,50*0.42 мс при действии VER

5.40*0.66 мс Сп=6) при добавлении ь раствор ТЭА. СД нэрвного ¿олокна в растворе с VER и ТЭА существенно увеличивалась как по » «мплитуде, так. и по длительности. Амплитуда СД после одиночного ПД повышалась с 3.04*0.34 мВ, измеренной в VBÍ, до 5.42*0.40 мВ ■ при добавлэщ-м в этот раствор ТЭА. Прирост амплитуды СД составил 78%. Время подуспада (tl/2) СД при атом увеличивалось от 317*54 мс (в VER), до 595*61 мс (в ТЭА). В процессе ритмической стимуляции происходило дальнейшее увеличение СД. Суммарная СД после добавления в р&сТЕОр ТЭА при ритмической стимуляции частотой 10 Гц увеличивалась на 160%, при 50 Гц - на 82.3%. При этом d ряде случаев (в 4 из 6 опытов) после нескольких .первых импульсов ритмической стимуляции волокна проявляли высокочастотную спайкеву» актийность, длящуюся от S до 27 сек, после чего мембрана очэнь медленно реполяризовалась.

' Под влиянием VER и ТЭА, по-видимому, происходят следующий изменения мэмбраннаго потенциала и ионной проницаемости мембраны. VER, взаимодействуя с {&*-кдаалами,• удерживает их в открытом состоянии. При этом продолжаатся .вход ионов Ма+ в волокно; что задершзаэт реполаризашпо шмбрзнц, вызывая увеличение СД. Обратный процесс - реполяризация мембраны - происходит за счет повышения проницааыости мембраны для К* ÍRO. При действии ТЭА, снижающего Рк, этот процесс зачадляется. и вклад натриевой сметами в изменение ¡«забранного потенциала увеличивается, это отражается г. еще большем увеличении СД и появлении повторной импульсной активности на соне СД.

При воздействии 2 ыМ 4-АР на обработанное VER волокно, как .ч в опытах с применением ТЭА, происходило увеличение СД. Амплитуда СД, сопровождайся одиночный ПД, увеличивалась на 31%, вре-ш полуспада - на 48% по сравнению с измеренными в VER. Несмотря на такое сильное увеличение СД после одиночного ПД, значительного изтнения суммарной СД, измеренной в конце 1-сек стимуляции, .в прис/гствии 4-АР не произошло. Ее амплитуда увеличивалась лиыь на 1% по сравнению с суммарной СД, измеренной в 'VER. Ослабление зйекга 4-АР т СД з процессе ритмической стимуляции объясняется» по-видимому, ссойенностяш потенциал-зависимого ' двястейя 4-а°, а имокно, уменьшением блока К+-каналов при деполяризации мембраны.

Опиты с совместным действием на иорвные волокна VER и бло-

катеров К+-:санэлов свидетельствуют в пользу высказанного раьее предположения о том, что увеличение СД под влиянием блокаторов К^-каналов обусловлено увеличением вклада iNa в СД.

Как указывалось выше, при действии VER на нервные волокна увеличение СД обусловлено тем, что часть Па^-каналов утрачивает способность к и..активации. Однако, нэ только при воздействии VER, ко и в естественных условиях, в возбудимых мембранах присутствует фракция Ма^-каналов, имеющих очень медленную скорость инактивации. Такие каналы обнаружены в различных возбудимых мембранах (Taylor, 1993), в том числе и в перехвате Ранвье лягушки (Dubois, Bergman, 1975, а). Вероятно, именно эти "неинактивируо-шиеся" Ка^-каналы создаст остаточный Ма*"-ток в конце ПД. Вклад этого тока в СД значительно увеличивается при уменьшении противоположно направленного К"*"-тока блокатсрами К+-канвдов. Из ска-заного следует, что повышение амплитуды и длительности СД может быть связано с увеличением соотношения PfWPK за счет либо снижения Рх, как а случае с воздействием на волокна блокаторов К+~канапов, либо за счет повышения РМа, как в случае с VER.

Сияний иаЙаиш к игшиша ионшгл сшлша

СЕЗДЫ ES СД миэлинизисованных иеванж волокон.

"пчяяие блокирования МаУК"*- насоса на СД. Проверить "калиевую" гипотезу происхоздения СД моио исследуя эффекты различ-::ах воздействия, приводя®« к увеличению аккумуляции К+ в пишм-бранном пространстве. С этой целью паки были проведены опыты с блокированием NaVK^-нассса. Известно (îtoran, Martin, 1981), что ослабление деятельности fJa. К-АТФ-азы приводит к накоплению К*, выходящего во время ПД, в примембранном пространства. Это, согласно "калиевой" гипотезы присхождения СД, должно вызвать увеличение следовой деполяризации. Как показали наши эксперименты, ни блокирование NaVK^-насоса уабаином (.'2 мМ)0 ни замена Ma-* в ошвашэм растворе на ионы Li+, которые обеспзчивеют полную ' генерацию ПД, но не откачиваются íiaVK^-нясоссм (Connelly, 1866: Skou, Esrnann, 1992), не приводят к достоверным изменениям СД после одиночного спайка и ее суммаши в процесе ритмической стимуляции.

Итак, гксперименты с ослаблением деятельности ffaVK^-насоса

заменой Иа-*- ионами И"*" и блокированием его уабаином не подтвердили "калиевую" гипотезу происхождения СД. Данные результаты говорят- также о'том, что в генерации СД не принимает участие Ма+/Са-<;+-обмен, поскольку ионы не могут обмениваться на Са*"" Ма^/Са^-обменником.

следующая серии опытов исследовали влияние без-Нг раствора на СД миелинлзированьых нарвньк волокон. Уменьшение [Но должно привести к увеличению выиодяшего 1к, повышению концентрации К+ вблизи мембраны перехвата Ронзьэ, что, согласно "калиевой" гипотеза, должно вызывать увеличение СД.

Через 10 ыин после смэны нормального раствора Рингера на без-К"1" происходило небольшее увеличение амплитуды ПД, с 55.4*1.43 к£ до 59.20*2.18 мВ Сп=1(0. Начальный, быстрый компонент СД устранялся и на его месте появлялась кратковременная гиперполяризация. Продолжительная СД при этом сохранялась и лишь несколько уменьшалась по амплитуде - с 1.40*0.10 в контроле до 1.10*0.09 мВ в без-К"- раствора (р<0.05; п=10). Амплитуда суммарной СД при ритмической стимуляции отчетливо снижалась.

Эти данные расходятся с предсказанием "калиэвой" гипотезы происхождения СД. Падение амплитуды СД при снижении [К+]о мо;шо объяснить уменьшением соотношения iNa/lK за счет повышения 1к, м, следовательно, снижзнийм вклада натриевого тока в СД.

Исходя из этого, можно было предположить, что при уменьшении СК*"Зо в растворе с VER, вклад' 1:< в реполяризаци» мембраны увеличится, что вызовет уменьшение СД. Однако, проведенные опыты ке подтвердили такого предположения. Устранение К"1" из YER-содер-кашего расгеора не только не уменьшало эффекты VER, но приводило к ик усилению. Так, через 10 мик после смены раствора на без-К"*, алшитуда СД после одиночного ПД увеличивалась на 68%, суммарной СД при 10-герцовой стимуляции - на 72%. 50-герцовой -на 79Х. Таким образом, увеличение вьмодяцзго К^-тока не вызывало повышения скорости реполяризации в обработанных VER волокнах. По-видимому, в условиях модификации Ка "'"-каналов вератридикок, когда iNa во много раз превышает IK, увеличение выходящего тока К"1" при снижении наружной концентрации К"* является недостаточным, чтобы привести к заметному ускорению реполяризации.

Эффекты повышения концентрации в омывавшем растворе. Повышение концентрации Ca'¿+ в омывающем нервное волокно растворе с 2 до 10 мМ не приводило к значительным изменениям длительного компонента СД. Его амплитуда уменьшалась примерно на 15% - с 1.10*0.Z7 мВ а контроле до 0.05*0.29 мВ (п=8) при повышении В'процессе ритмической стимуляции частотой 50 Гц уровень деполяризационного плато снижался примерно на 17% по сравнению с контролем. Однако, начальный компонент СД практически устранялся, и продолжительность спайка, измеренная на уровне перехода быстрой реполяризации в медленную, значительно уменьшалась.

Увеличение скорости реполяризации при повышении Ca*4" было особенно сильно еыраженно в обработанных VER волокнах. Так, при увеличении до 10 мМ концентрации Сай"* в растворе, содержащем 0.01 мМ VER, tl/2 СД в конце 1-сек ритмической стимуляции частотой 50 Гц уменьшалось на 42% (с 1730*340 мс до 1030*90 мс).

Такое ускорение реполяризации мембраны при повышении [Са^"*"]о, по всей видимости, связано со смещением кривой зависимости натриевой проницаемости СРМа) от потенциала в сторону более положительных потенциалов (Frankenhaeuser, Vallo, 1965: Hille, 1963; Ходоров, 1S69: Brlsmar, 1980). При этом максимальная натриевая проницаемость не изменяется, поэтому сдвиг кривой приводит к уменьшению величины PNa, главным образом, в области пороговых значений потенциалов и ускорению процесса регенеративной реполяризации мембраны (Ходоров, 1975). Кроме того, известно (Lelbovlt2 et. al., 1986), что Са*+ оказывает блокирующее действие на VER-модифицированные каналы, что также может способствовать ускорению реполяризации.

Эффекты уцаления Q&¿* из омывающего раствора. Устранение из омывающего нервное волокно , раствора не оказывало какого-либо заметного влияния на ПД и СД нервного волокна с "закрытым" перехватом. При смене же раствора, содержащего 0.01 мМ VER с нормальным содержанием Ca*"" на бескальциевый раствор с таким ж содержанием VER (в раствор добавляли 0.05 ыМ хелатооа Са*> - EGTA), все з№кты VER резко ослаблялись. Амплитуда СД при этом снижалась на 39%. Суммация СД при стимуляции частотой 10 и 50 Гц снижалась на 48% и 50%, соответственно.

Эти результаты оказались довольно неожиданными. Одно из

возмомний объяснений данного эффекта заключалось в том, что при удалении Са^* кз омывающего раствора усиливается выведение Са^"1" из цитоплазмы по механизму Mao/Cai обмена (поскольку прекращается обмен Nai/Ca0).

Для проверки этого предположения были проведены эксперименты с заменой Na* в омывающем растворе на L1*, который не может заменять Na* в NaVCa^* обмзннике CBlanstaln» 198SD. Сама по себе такая замена Na* ке сказывалась на эйектах VER. Удаление же Са^* из Ы^-содерхащего раствора привело к такому же эффекту, как и удаление Саи* из Na-раствора: СД после одиночного ПД npaic-тач2ск1 исчезла, а при ритмической стимуляции СД резко уменьшилась . Таким образом, причина ослабления эффекта VER в без-Са^* растворе остается пока невыясненной. Ото из возможны« объяснений состоит в том, что присутствие в наружной среде необходимо для связывания VER с каналом.

Влияние СС2 т следовую деполяризацию при ge. модификации блокаторами калиевых каналов и веоатридином.

На одиночных миелинизированных нервных ьолокнах было показано (Катальшв, 1974; Валюта, 1992), что С02 значительно увеличивает СД и ее суммацинэ в процессе ритаическсй стимуляции. В наших экспериментах через 5 мин после замены воздуха в камере с препаратом на углекислый газ происходило существенное увеличение амплитуды и длительности СД. Амплитуда СД возрастала примерно на 41% - с 1.75*0.32 ыВ в порт до 2.85*0.35 мВ в COg (п=8). Время полуспада СД увеличивалось с 4928.35 до 76*11.7 «с. Суммация СД при 1-сек ритмической стимуляции частотой 10 и 50 Гц возрастала пои действии СОй на 50% и 62%. соответственно.

Мы попытались исследовать природу СЩ при действии СОй, используя блокаторы и модификаторы ионных каналов.

Влияние СОй на СД миелинизированных нервных волокон при блокировании К*-каналов. Результата опытов с воздействием C0í>' на нервные волокна на фоне действия блокатаров К*-каналов оказались довольно неожиданными: С02 приводил к значительному снижению, а в некоторых случаях полному устранению эффектов блокаторов К*-каналов. Через 5 мин после начала аппликации раствора,' содержащего 10 мМ ТЭА, длительность ПД, измеренная на уровне сни-

кения его амплитуды на 2/3, достигала 5.93*0,61 мс, амплитуда СД - 3.80*0.40 мВ. При воздействи С02 длительность ПД уменьшалась на 59% и составляла 2.46*0.47 мс, амплитуда СД под влиянием С02 снижалась на 39%, a ti/2 - на 50%.

Как указывалось выше, под влиянием 4-АР нервные волокна на одиночный стимул отвечали "многоспайковым" разрядом, сопровождавшимся сильно увеличенной по амплитуде и длительности СД. Под влиянием С02 многоспайковый ответ исчезал-, вместо него на стимулирующий импульс возникал одиночный ПД. сопровождающийся СД. амплитуда которой была ниже,чем в 4-АР, но выше, чем в контроле. Амплитуда СД, следующей за одиночным ПД, при воздеятвии СОг уменьшалась от 5.00*0.5 мВ (в 4-АР) до 3.40*0.40 мВ, ti/2 СД снижалось на 60% - от 170*39.07 мс (в 4-АР) до 67*21.33 мс Сп-7) при воздействии С02. Характерное для 4-АР снижение суммацуи СД в начале ритмического раздражения под влиянием СОг исчезало, но амплитуда деполяризационного плато несколько увеличивалась. С02 устранял спонтанную активность перехвата, развивающуюся в 4-АР. После прекращения подачи С02 в камеру с препаратом и смены раствора все эффекты бло¡taroров восстанавливались.

Таким образом, наш эксперименты показали, что СС2 ослабляет или полностью устраняет изменения электрической активности перехвата Ранвье, вызываемые блокаторами К+-каналов. Снижение СД в этом случае может быть связано с уменьшением соотношения PNí/Pk, либо за счет повышения Рк, либо га счет снижения PíJa-Предположению, что COZ каким-то образом усиливает выходящий калиевый ток С 1к) противоречит тот факт, что, СОг значительно увеличивает СД нормальных волокон, а не уменьшает ее, как это можно было ожидать в случае увеличения 1к. Против допущения,что С02 ингибирует натриевый ток, говорят результата. наших экспериментов с блокированием Ма^-каналов ТТС на фоне действия 4-АР. Было показано, что частичная блокада Ма^-каналов 25 jjM ПХ уменьшает ачплитуду ПД, но не устраняет спайкову» активность и не подавляет автомат», вызванную 4-АР.

Таким образом, блокирующее действие СОг на многоспайковый разряд и спонтанную активность не обусловлено снижением максимальной Ptia- Следовательно, приходится предположить, что СОг каким-то образом препятствует взаимодействию блокагора с каналец, ьэханизм этого остается пока не ясным. Этот эффект нельзя также

объяснить швшинием ¡сонцантрацик Н+ у наружного устья канала, поскольку проведенные нами опыта показали, что подкислен*® наружного раствора до 6.0 с шкощь» КС! из приводит к теки« эФ-Сактам. Остается прэдположитъ, что рассматриваемые 'Зффекты С02 связана с зачислением цитоплазмы нервного волокна.

Влияние СО? ^а s&teiynfl г$ратрздине|. 002 значительно уси-дцздл зфйзкти VER. При воздействии COz ка обработанное VER нервное волокно викитуда одчначноп СД возрастала на 28% - с 2.86*0.29 и8 ís'VStt 3.34*0.34 вВ (в VER и СОй) Сп-5). Уэелича-5»:о сугаздии СД при рдацичзской стимуляции частотой 10 и 50 Гм ■при зоздояствии COS сострило 54л и 44%, ссответстоеино.

to оошмй отск flEiBKix isa« gusa пседполокить. что СОг действует водсбкэ 12Д, бюпууг, К^-кй.ат.д. Одогжо, отсутствие увэлшенид продолм-дальксста сшзгкй противоречит текопу допущэ-«и». ífcoTiia зтоге щхшдооггеммя сыиктаьствуйт токяга йаоти. по-лучзнш» з эксперимента;; с zjasmsu СОг на электрическую ашв-" лость нервного волокна на олие сои.:эстного действия VER j¡ ТЭА. С0й в этом сяучса устранял эф*екгг 1ЭА С подавлял вксскочастотнуэ спййковую актизшстъ волокна) и уаолтисал з<М«кт VER С увеличивал СД и ее сушецки np»t рудшчэской стимуляции). Остается пред-полезшть, что, CG2 усиливает эффекты VER, способствуя связывании VER с каналом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоадза время иаибодькш признанием пользуется - гипотеза о том, что СД, сопровоздею^зя спайге s- ¡штактпам пережата Ранвье миалштзиповежьк нзрьнш волокон обусловлена «жкумуля-цяеп К* е пркмембранкоа проетраютвэ ыензУ возбудимой ка^реноа и окрукшцима ее Ь!аашсьскмш кхатксда (Каталя,ва, 1974). Сам феггт нгхопленш К* в пгйшваЗраншм простроггетга перзквача Ран-вье во -вгекя д»гпш>иоЯ даиюляригзшя ко вазшээт свжгния СDucois. Бзгеаап, 1975.63. "Келизвая" гипотеза новою объясняет ряд згагаридояедьио установленный фачтев. Tax, отсутствие длительной СД в "откратом" перехвате Ранзьз, согласно "калиевой" гипотезе. мокно лзгко объяснять разруганном во время препаровки нзрсаого волокна жиф&геионщзга берьера, окрутошго перехват. Соотввтстеснно. сюшацаа СД да: ритаическоа стимуляции волокна

можно интерпретировать как повышение концентрации К+ вблизи мембраны пережата.

Однако, "калиевая" гипотеза наталкивается на ряд трудностей и противоречий при объяснении других фактов. Так, Stampfl i Í1953) показал, что мембранный потенциал покоя ннтактного (хорошо отпрепарированного) перехвата Ранвье очень устойчив к повышению концентрации К+ (вплоть до 20 мМ, а в отдельных случаях и до 40 мМ) в омывающем волокно растворе, поэтому не ясно, могут ли существенно меньшие изменения концентрации К+ в примембранном пространстве после одиночного ПД вызвать СД, наблюдающуюся в "закрытом" перехвате Ранвье. Кромз того, при ритмической стимуляции суммация СД фактически достигает насыщзния уже после первых 3-5 импульсов; между тем, в экспериментах, проведенных методом фиксации потенциала было показано, что накопление в ответ на деполяризацию продолжается более 30 мсек (Dubois, Bergman, 1975,6).

Наибольшее затруднение "калиевая" гипотеза испытывает при объяснении представленных в настоящей работе эффектов ТЭА и 4-АР. Казалось бы, подавление выходящего 1к этими соединениями, и. в особенности ТЭА (блокада которого, в отличии от 4-АР потенциал-независима), должно резко уменьшать накопление К* в примембранном пространстве. В действительности же, ТЭА и 4-АР увеличивают амплитуду и длительность СД как после одиночного ГШ» так и после серии импульсов. Поэтому, естественно, возникло предположение, что СД обусловлена тем, что к моменту окончания спайка на вез активиропвиит Ма'-какалы закрываются - часть их остазтся открытыми,, м через них продолжает протекать Na+-TOK, деполяризующий мембрану. Эта деполяризация мембраны частично компенсируется выходящим К^-током. В этих условиях блокада К+-каналов ТЗА увеличивает деполяризующее действие остаточного входящего Ма^-тока, что проявляется в увеличении СД.

Для проверки правильности такой гипотезы ма исследовали действие ТЭА на фоне VER, известного своей способностью резко увеличивать СД в результате специфической модификации Ка+-кана~ лов - нарушения их способности инактивироваться. СД при действии VER обусловлена входящим током именно через эти модифицированные каналы. Наши эксперименты показали, что блокирование

К^-токов на фона действия VER усиливает аффект VER, значительно 'увеличивал амплитуду и длительность СД. Основываясь на этих данных, можно предположить, что в интактных миелинизированных нервных, волокнах СД обусловлена входящим током через популяцию "неинактивирующихся" На+-каналов, существование которых в мембране перехвата Ранзье (Dubois, Bergman, 1975, а) и других возбудимых мембранах (Taylor, 1933) является доказанным.

Если "натриевая" гипотеза происхождения СД верна, то все эффекты различных воздействий на СД, в том числе изменение ионного состава среды, действия СОг, могут быть интерпретированы как результат влияния этих факторов, главным образом, на соотношение между PNa и PK после окончания пикового потенциала; судя по имеющимся данным, отношение PNa'PK может увеличиваться как за счет повышения PNa, так и за счет снижения Рк.•Не исключено, что К+, накапливающийся в примембранном пространстве в процессе ритмической стимуляции, также осуществляет своя эффект, за счет влияния на отношение Рйа/Рк.

ВЫВОДЫ

1. Следовая деполяризация (СД) интактаого перехвата Ранвье миелинизированных нервных волокон увеличивается при воздействии ТЗА (10 мЮ и 4-АР (2 иМЭ, блокирующих выход К* в примем5ранное пространство.

2. Увеличение аккумуляции К"*" в примембранноы пространстве при блокировании Na^-K*1" насоса уабаиноы или замене наружного Na* на Ll+ не влияет на амплитуду « длительность СД. Удаление К+ из омыеэюшэго раствора, усиливающее выход И"*" из волокна, не вызывает существенных изменений амплитуды СД.

3. Увеличение амплитуды и длительности.СД, вызванное активированием Ыа+-канолов вератридином, значительно усиливается при блокировании К^-каналов ТЭА; Л

4. Воздействие на нервное волокно CQ2 (замена воздуха в каеыере с препаратом на СОе) увеличивает СД интактньк и обработанных вератридином нервных волокон. С02 снижает СД, увеличенную блокаторами К"*"-каналов.

5. Полученные результаты противоречат "калиевой" гипотезе происхождения СД и могут быть удовлетворительно объяснены тем.

что СД в интактных миелинизированных нервных волокнах обусловлена неполной инактивацией №а-проницаемоста к моменту окончания спайка. Неполная Иа-инактивация возможно связана с участием в генерации ПД популяции медленно инактио^руюшдася Ма+-каналов.

6. Амплитуда СД находится о зависимости от соотноиэния натриевой и калиевой проницаэмостей (РЫд/Рк). СД увеличивав теп как при повышении Ма*-проницазмости вератрадином, тек и пр;< синении К*-ироницаешсти блокаторами К*-канэлов.

■ СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Вергун О.В. Влияние ионов К* на следову» деполяризацию миелинизированных нервных волокон // Труды Ульяновского пединститута. - Ульяновск, 1992. - С. 25-27.

.2. Valkina O.N., Vsrgun O.V., Turovetsky V.B.. Khodoro« B.I. Effects of repetitive stimulation, veratridine and ouabain on cytoplasmic pH In frog nerve fibres: role of Internal Ma* // FEES Letters. - 1993. - V. 334, fil. - P. 83435. .

3. ВалкинаО.Н., Вэргун O.B., Крончсва C.H. Влияние 4-амч-нопиридина на следовые потенциалы миелиниэированнкх нервных волокон // Успехи физиол. наук. - 1994. - N1. - С 73-79.

4. Воргун О.В., Крончева С.Н., ВалкинаО.Н. 4-оминопиридик увеличивает слеловые потенциалы и сызываат спонтанную активность одиночных миелинизированных нервных волокон // Биол. мембраны. - 1994 СВ печати). ,

5. ВалкинаО.Н., Вергун О.В., Туровецкий В.Е., Ходоров 5.Й. Дестабилизация рН гомеостаза в нервных волокнах лягушки при гиперактивации Иа^-каналов. блокировании Ма+-К*-насоса и Мя+/Н+ обменника // Биол. мембраны. - 1994 (в печати).

С—