Прионные и неприонные амилоиды: изучение в дрожжевой модели

Кушниров, Виталий Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Прионные и неприонные амилоиды: изучение в дрожжевой модели
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Прионные и неприонные амилоиды: изучение в дрожжевой модели"

003449152

На правах рукописи

КУШНИРОВ ВИТАЛИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

ПРИОННЫЕ И НЕПРИОННЫЕ АМИЛОИДЫ: ИЗУЧЕНИЕ В ДРОЖЖЕВОЙ МОДЕЛИ

Специальность 03 00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2008

003449152

Работа выполнена в институте Экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса Росмедтехнологий

Научныи консультант член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Тер-Аванесян Михаил Давидович

Официальные оппоненты

академик РАН, доктор биологических наук, профессор Гвоздев Владимир Алексеевич

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Донцова Ольга Анатольевна

доктор биологических наук, профессор Фаворова Ольга Олеговна

Ведущая организация Биолого-почвенный факультет Санкт-Петербургского государственного университета

Защита состоится ^ июня 2008 года в / 2 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 501 001 76 при Московском государственном университете им MB Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы МГУ, НИИ физико-химической биологии им АН Белозерского, Лабораторный корпус "А"

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им MB Ломоносова

Автореферат разослан _5"~мая 2008 г

Ученый секретарь совета, кандидат биологических наук

Крашенинников И А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Некоторые белки человека и животных, растворимые в норме, могут иногда полимеризоваться и накапливаться в виде внутри- или внеклеточных агрегатов или бляшек, что приводит к болезни У человека известно более 30 белков, образующих такие агрегаты, называемые амилоидами Амилоидные болезни, или амилоидозы, не поддаются лечению Они широко распространены, и их встречаемость возрастает с увеличением возраста К их числу относятся, в частности, болезни Альцгеймера и Паркинсона Амилоидозы в большинстве случаев неинфекционны, за исключением прионных болезней, связанных с белком РгР

Агрегаты РгР представляют уникальный пример инфекционного агента без генетической программы в виде ДНК или РНК Прионные болезни редки, однако недавняя эпизоотия губчатой энцефалопатии коров в Великобритании нанесла многомиллиардный урон экономике, и поставила под угрозу жизни людей в связи с опасностью передачи этого заболевания человеку при употреблении в пищу говядины

Амилоиды не всегда связаны с болезнью Имеются данные, что образование амилоидов белком СРЕВ может составлять основу долговременной памяти Некоторые исследователи предполагают, что амилоидный переход каких-то белков фиксирует схемы экспрессии генов при дифференцировке клеток Образование амилоидов связано со старением, но может быть и одной из его движущих причин Амилоиды часто встречаются в клеточной стенке бактерий и грибов, в оболочке яиц насекомых и рыб Высокая механическая прочность амилоидов и их устойчивость к протеазам позволяют им хорошо защищать клетки от внешних воздействий

Более 10 лет назад прионная гипотеза была использована для объяснения необычных генетических свойств детерминантов [/"¿У^ и [1!КЕЗ\ дрожжей БассИаготусеБ сггехчиае Было предположено, что эти детерминанты отражают переход в прионную форму белков 8ир35 и иге2, соответственно Это предположение, основанное на генетических данных, нуждалось в биохимических доказательствах Получение таких доказательств для [ЯЗУ^] явилось первой частью представленной работы Следует отметить, что [РБГ] и [иЯЕЗ\ не причиняют дрожжам значительного вреда и могут считаться потенциально полезными Эти детерминанты явились первыми примерами нового явления, зависимости фенотипа от наследуемого изменения структуры белка, а не от нуклеиновой кислоты Поэтому представляло большой интерес изучить механизмы этого явления, чему посвящена оставшаяся часть работы Дрожжи оказались весьма удобны для изучения прионов благодаря простоте и скорости генетических и генно-инженерных манипуляций, удобству биохимического анализа и безопасности Это позволило нам не только охарактеризовать природу прионных детерминантов дрожжей, но и сделать выводы, касающиеся прионного и амилоидного явлений в целом

Дальнейшее развитие исследований прионов и амилоидов имеет важные общебиологические и медицинские перспективы В будущем следует ожидать обнаружения новых механизмов связанных с амилоидами у самых разных организмов Вероятна разработка способов борьбы с амилоидными и прионными

болезнями, которые пока являются неизлечимыми Данная работа, в частности, предлагает возможные стратегии лечения таких болезней

Цели и задачи исследования

Цели работы состояли в доказательстве существования прионов у дрожжей, исследовании их принципиальных свойств и использовании для анализа механизмов инфекционности амилоидов Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи

1 Показать прионные свойства белка БирЗб, установить роли его доменов в прионообразовании,

2 Выявить клеточные факторы, противодействующие поддержанию приона [/>5/+],

3 Разработать методы, позволяющие выделять и анализировать прионные агрегаты,

4 Охарактеризовать структуру прионных агрегатов,

5 Выявить роль шаперона Пэр 104 в размножении прионов дрожжей,

6 Установить молекулярные основы вариабельности свойств прионов,

7 Исследовать амилоидную полимеризацию белков с протяженными полиглута-миновыми фрагментами (модель болезни Гентингтона),

8 Установить свойства амилоидных полимеров, определяющие их фрагментацию

Научная новизна и практическая значимость работы

Работа существенна для понимания прионного и амилоидного явлений у дрожжей и значима для их понимания в целом у разных организмов В работе установлена первичная структура белка 8ир35, его доменная структура и роль доменов 8ир35 в образовании прионных частиц и формировании фенотипа [/)5/+] Впервые получены биохимические доказательства существования прионного процесса у дрожжей, полимеризации белка 8ир35 Показано, что 8ир35 в клетках обладает

свойствами, характерными для прионов он агрегирует, имеет повышенную устойчивость к действию протеаз и способен катализировать переход растворимого 8ир35 в агрегированную форму Показано, что прионный домен Эир35 эволюционно удаленного вида дрожжей РхсЫа те0шпо11са также способен к образованию приона, что указывает на консервативность прионных свойств Бир35 Предложена и доказана модель размножения прионов дрожжей, основанная на их фрагментации шапероном Пэр 104 Разработаны методы очистки и анализа прионных полимеров, в частности, определение их размера с помощью электрофореза в агарозном геле Установлена структура прионных частиц показано, что прионные агрегаты в клетках дрожжей представляют собой конгломераты из прионных полимеров и ассоциированных неприонных белков Показано, что размер полимеров БирЗб варьирует у различных вариантов приона причем меньшему размеру полимеров соответствует

большая выраженность фенотипа [Р^'/4] Данная связь была объяснена зависимостью размера полимеров и количества мономеров Бир35 от эффективности фрагментации полимеров шапероном НврЮ4 Было обнаружено, что 8ир35 может образовывать полимеры при сверхпродукции Эти полимеры возникают гораздо чаще, чем прионные полимеры 8ир35, однако гораздо хуже фрагментируются и поэтому не 2

наследуемы Такие отличия аналогичны отличиям амилоидов и прионов человека Высказана и подтверждена гипотеза, что эффективность фрагментации амилоидных полимеров шапероном ШрКМ определяется наличием в составе полимеризационного домена гидрофобных аминокислотных остатков и их экспонированностью в цитозоль Показано существование слабой полимер-фрагментирующей активности в отсутствие НврКМ Изучена зависимость полимеризационных свойств полиглутаминовых доменов от их размера, что важно для понимания механизмов развития амилоидозов, связанных с полимеризацией белков, содержащих полиглутаминовые фрагменты, например, болезни Гентингтона.

Выявлены и охарактеризованы белки, избыток которых противодействует прионной полимеризации 8ир35 Повышение синтеза таких белков является возможной стратегией лечения прионных и амилоидных болезней Разработаны методы выделения и анализа прионов и амилоидов, которые могут быть использованы при их изучении у различных организмов, включая человека

Апробация работы

Результаты работы были представлены на следующих конференциях и симпозиумах XV, XX, XXI Международных конференциях по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Гаага 1990, Прага 2001, Гетеборг 2003), конференции по трансляционным механизмам (лаборатория Колд Спринг Харбор 1995), 1-Ш конференциях по прионам дрожжей (Кентербери 2000, Сан-Франциско 2002, Кембридж 2005), Международном симпозиуме по прионным болезням и подобным процессам (Аннеси, Франция, 2000) и других международных и отечественных конференциях

Работа была официально апробирована 6 декабря 2007 г на заседании Ученого совета Института экспериментальной кардиологии РКНПК Росмедтехнологий

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 33 статьи в рецензируемых научных изданиях Список публикаций приведен в конце автореферата.

Структура диссертации

Диссертация состоит из десяти глав, включающих введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, а также заключение, выводы и список цитируемой литературы из [^Наименований Работа изложена на |5~| страницах и включает4|^рисунков и 7 таблиц

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. СВОЙСТВА АМИЛОИДОВ И ИХ РОЛЬ В ПРИРОДЕ (обзор литературы)

Глава посвящена анализу литературных данных В ней описываются свойства амилоидов, болезни, связанные с ними, и использование амилоидов в биологических механизмах Рассмотрена история изучения прионов и амилоидов, актуальность и перспективы их дальнейшего исследования

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали лабораторные штаммы дрожжей S cerevisiae Применяли стандартные методы генетики дрожжей (Sherman, 1986) Дрожжи выращивали либо на полной среде YPD либо на синтетической среде с добавлением требуемых аминокислот [/"¿У4] и другие прионы дрожжей устраняли выращиванием клеток в присутствии ЗмМ гидрохлорида гуанидина (ГуГХ)

Конструирование, выделение и анализ плазмид, ПЦР-амплификацию фрагментов ДНК производили согласно стандартным методикам (Maniatis et al, 1982, Sambrook et al, 1989) Для конструирования ДНК использовали штамм Е coli DH-5a Для экспрессии генов в дрожжах использовали интегративные, центромерные и эписомные (многокопийные) плазмиды серий Yplac (Gietz and Sugino, 1988) и pRS (Sikorski and Hieter, 1989) Для продукции и очистки белков в плазмидах серий pQE (Qiagen) или рЕТ (Novagen) конструировали гены, кодирующие требуемый белок сшитый с гексагистидиновым тэгом Плазмидами трансформировали штамм Е coli BL-21, продукцию белка инициировали добавлением в среду 0,2 мМ IPTG Белки выделяли по аффинности к хелатной смоле Talon (BD-Clontech)

Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ДСН-ПААГЭ) в присутствии додецил сульфата натрия (ДСН) проводили согласно Laemmli (1979) Перенос белков из геля на мембрану и окрашивание антителами (иммуноблотгинг) проводили согласно Towbin (1979) Электрофорез прионных полимеров в ДСН-агарозном геле и их иммуноблоттинг описаны в Гл 7

3. ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ПРИОННОЙ ГИПОТЕЗЫ ДЛЯ [PS/] 3.1. Фактор [P£/f]: история вопроса

Клетки дрожжей дикого типа способны расти в отсутствие аденина в среде и имеют белый цвет колоний При возникновении нонсенс-мутаций ade2-l (UAA) или adel-14 (UGA) клетки теряют способность расти в отсутствие аденина и накапливают красный пигмент Детерминант как и мутации в SUP35, SUP45 и некоторых

других генах, был выявлен по способности супрессировать нонсенс-мутации (Сох, 1965), то есть восстанавливать исходный фенотип Супрессия возникает вследствие ослабления терминации трансляции и увеличения вероятности прочтения терминирующих кодонов Как и супрессорные мутации, независимые изоляты [PST*] могут отличаться по эффективности нонсенс супрессии, что проявляется в белом ("сильные" {PSГ]) или розовом ("слабые" [PS?]) цвете колоний

Генетические свойства [Р$Г] необычны Для него характерен нехрочосомиый тип наследования При циюдукции (тип скрещивания, при котором клетки дрожжей обмениваются цитоплазмой, но не ядерным материалом) происходит передача [/)5'/+] между клетками, что указывает на его цнтопяазмалнческую, а не ядерную локализацию Однако попытки обнаружить соответствующую цитоплазматическую ДНК или РНК в виде вируса или плазмиды оказались безуспешны Кроме того, [А1?/1"] устойчив к мутагенам, действующим на ДНК, но исчезает при росте клеток в присутствии низких концентраций (3-5мМ) ГуГХ и может возникать вновь с низкой частотой при сверхэкспрессии гена 811Р35

Для объяснения природы [ЛУЛ] Р Викнер в 1994 г предположил, что [/'Л'/1"] отражает структурную трансформацию белка БирЗЗ, подобную прионному превращению белка РгР млекопитающих (\Vickner, 1994) Эта гипотеза лучше прочих объясняла свойства однако основывалось лишь на генетических наблюдениях

и нуждалась в биохимических доказательствах Их получение и явилось первой целью нашей работы

3.2. ¡У-домсн 8ир35 необходим и достаточен для поддержания [PSt\

Белки 8ир35(еКРЗ) и 8ир45(е11Р1) являются факторами терминации трансляции эукариот Мы секвенировали ген 511Р35 и провели его делеционный анализ Оказалось, что белок Яир35 имеет отчетливую трехдоменную структуру С-концевой домен (аминокислоты 254-685) подобен фактору элонгации трансляции еЕПА и отвечает за жизненно важную функцию 8ир35 К-концевая часть Бир35 несущественна для жизни, неконсервативна и может быть разделена на домены N (а.к 1-123) и М (а.к 124-253), существенно различающиеся по аминокислотному составу N домен 8ир35 оказался необходим для поддержания [РБГ] (Тег-Ауапеэуап а а1, 1994) В этом эксперименте [/>5'/+] передавали цитодукцией в тестируемый штамм, а оттуда в [рлГ] тестер для проверки сохранения [РЗГ\ Тестируемый штамм содержал хромосомный ген 51!Р35С и различные делеционные варианты Б1!Р35 на плазмиде, но не позволял наблюдать фенотип [РБГ] Оказалось, что в отсутствие N домена 8ир35 не

поддерживается, а его присутствие, даже отдельно от С домена 8ир35, позволяет поддерживать [РЯГ] Наличие М домена не играло роли Этот результат хотя и не позволил объяснить природу [РБ1*], но указал на ключевую роль Ы-домена 8ир35 в его существовании Следует отметить, что в этих экспериментах впервые фенотип [/>5/+] был отделен от его поддержания клетки с разделенными N и С доменами сохраняют [/>5/ь], но не проявляют супрессорного фенотипа

3.3. 8ир35 в клетках [Р5/] агрегирован и может присоединять мономеры 8ир35

Для приона человека РгР5с характерно образование крупных агрегатов растворимого в норме белка РгРс (РгиБшсг еГ а1, 1998) Мы проверили, не обладает ли таким свойством 8ир35, для чего фракционировали лизаты клеток [Р61/*] и \psi~] гель-фильтрацией или центрифугированием в градиенте плотности сахарозы Оказалось, что размер комплексов, содержащих 8ир35, в клетках намного больше, чем в

Г/мЯ (рис 3 1)

Гель-фильтрация

Свободный объем колонки

2 4 6 g

669 кДа

10 12 14

140 кДа

18 20

67 к Да

Центрифугирование

40S 60S 80S полирибосомы

i---►

3 4 5 6 7 1 8 9 10 II 12

О J1

[PS['[ [psi-]

[PSI*]

[psi-]

Рисунок 3.1. Фракционирование лизатов клеток [PSf'\ и \psi J: анализ размера комплексов, содержащих Sup3S.

Фракции анализировали ДСН-ПААГЗ с блоттингом и иммуно-окрашиванием белка Sup35. (А) Гель-фильграция на колонке Sephacryl S-300. Указаны маркеры молекулярной массы. (Б) Центрифугирование в градиенте плотности сахарозы. Указаны фракции растворимых белков (цитозоль), рибосомных субъединиц (40S, 60S), монорибосом (80S) и полирибосом. О - осадок; JI - лизат

¡- О О? н ой Рисунок 3.2. Взаимодействие белка 8ир35 нз лизатов [ТОГ4]

3 £ Е 5 и ¡/ш] с Sup35NM. N и М домены 8ир35 (5ир35ЫМ)

4 < с; _<_<(/] продуцировали в £. со//и иммобилизировали на смоле АЯ-

Ое! 10. Смолу инкубировали с лизатами [/"З/4] и [р5/~] и 8ир35>- — — — промыли. Белок 5ир35, связавшийся со смолой,

анализировали ДСН-ПААГЭ с иммуноблоттингом.

' [РБГ] " [р*г] '

Другая особенность прионов состоит в способности прионных агрегатов взаимодействовать с мономерами того же белка, что предшествует прионному превращению мономера или сопряжено с ним. Мы проверили это свойство для белка Sup35. Мономеры Sup35NM были продуцированы в Е. coli, выделены и ковалентно зафиксированы на смоле Affi-Gel (Bio-Rad). Лизаты [PSt] и [psi] были инкубированы с этой смолой и затем удалены. Дрожжевой белок Sup35 задержался на смоле только в случае [PSt] (рис. 3.2). Это означает, что агрегаты Sup35, в отличие от мономеров, способны образовывать комплексы с мономерами Sup35, закрепленными на смоле.

3.4. Прионная форма Sup35 отличается повышенной устойчивостью к протеазам

Еще одним отличием PrP с от РгР является его устойчивость к обработке протеиназой К. Мы обнаружили, что белок Sup35 в лизате [PS1/4] примерно в 4 раза более устойчив к протеиназе К, чем в лизате [psi] (рис. 3.3). Sup35 [psf] был также более чувствителен к действию собственных протеаз дрожжей. Так, он часто выявлялся в виде двойной полосы при электрофорезе (рис. 3.3, дорожка 0), что отражает отщепление N-концевого 5 кДа фрагмента, никогда не наблюдаемое для Sup35 [PSt]. Видимо, из-за деградации количество Sup35 в [PS/4"] лизатах в несколько раз выше, чем в [psi] (рис. 3.3, подпись).

Рисунок 3.3. Протеазоустойчивость белка 8ир35 в лизатах [/,5/*'| и ]. Лизаты обработали указанными количествами протеиназы К и анализировали ДСН-ПААГЭ сблоттингом и иммуноокрашиванием 5ир35. При электрофорезе нагрузка [РХГ] образцов была уменьшена в 3 раз относительно [/«/"] для получения равного сигнала в контрольной дорожке.

Надо отметить, что отличие прионной и неприонной форм 8ир35 по устойчивости к протеазам было не было столь значительным, как в случае РгРЭс. Также, в отличие от РгР8с, у прионной формы 8ир35 не было обнаружено протеазоустойчивого фрагмента.

3.5. Супрессорный фенотип [РБ?] клеток является следствием уменьшения количества растворимого 8ир35

Можно предположить, что причиной нонсенс-супрессорного фенотипа [ТО/1"] является инактивация функции 8ир35 в терминации трансляции при его агрегации. Чтобы проверить это, мы воспользовались нашим наблюдением, что штаммы [РХ/*], продуцирующие неприонизируемый белок 8ир35МС или сверхпродуцирующие шаперон ШрКМ (Глава 6) не проявляют супрессии. Анализ лизатов этих клеток выявил значительное количество 8ир35(5ир35МС) в растворимой фракции (рис. 3.4). Так, в панели Б видно одновременное наличие растворимого белка 8ир35МС и агрегированного полного Бир35. При сверхпродукции Няр104 (панель В) происходил переход некоторой доли 8ир35 из агрегированной в растворимую фракцию. Таким образом, причиной супрессорного фенотипа [-ТО*] является недостаток растворимого функционального 8ир35.

Протеиназа К:„ к„ 4 |, 2 () , „ 04 02 (мкг/мл)_______

8ир35 ---^ |/ш-]

8ир35 ^ 4Щ» -тш® шт [Р$1'

8ир35>-

Б 5ир35>-8ир35МС*"

В 8ир35>-Г 8ир35>-

сия +

Рисунок 3.4. Состояние белка 8ир35 в Дополни Супрес различных вариантах штамма 5У-Ш9.

Клеточные лизаты фракционировали центрифугированием через подушку из 30% сахарозы. Фракции анализировали ДСН-ПААГЭ с блоттингом и иммуноокрашиванием 5ир35. Штаммы содержали: (Б)-центромерную плазмиду, кодирующую 8ир35МС; (В) - многокопийную плазмиду кодирующую шаперон Шр104.

■ [Р5/+]

[Р5/4] БирЗбМС [ЛУ/+] Нзр104

3.6. вир35 агрегирует посредством своего ^'-концевого домена

Наши генетические данные (Гл. 3.1) указывали на ключевую роль N домена в поддержании [/"б-/]. Это подтверждает результат, представленный на рис. 3.4 Б: белок 8ир35МС, не имеющий N домена, не включается в прионные агрегаты. Таким образом, N домен необходим для агрегации ЭирЗб. Однако достаточен ли он для этого? Чтобы проверить это, мы создали штамм 3-5У-Н19, имеющий хромосомную делсцию в гене Л'(3~. ведущую к отсутствию аминокислот в домене 8ир35

(8ир35ДВ). Этот штамм был трансформирован многокопийными плазмидами, кодирующими Ы-концевые фрагменты 8ир35: 8ир35КМ (а.к. 1-252) и Бир35К (а.к. 1112). Неожиданно для нас, возникновение прионных агрегатов этих фрагментов в данном штамме происходило с очень высокой частотой, порядка 50%. Фенотип [Л"?/1"] в этом штамме не проявлялся. Поэтому процедура получения [ЛУ/] сводилась лишь к проверке наличия [РЯ/1] путем передачи его цитодукцией в тестерный штамм 10В-Н49. Центрифугирование лизатов показало, что все М-концевые фрагменты 8ир35 агрегируют в прионном состоянии, в то время как небольшая делеция (аминокислоты 21-67) в N домене нарушала способность 8ир35 агрегировать (рис. 3.5). Следовательно, Эир35 агрегирует посредством своего N домена. Минимальная область, способная к агрегации, составляет первые 112 аминокислот.

Sup35AB-Sup35NM-

q. о о, q. о

Рисунок 3.5. Агрегация белка 8ир35 и его делеционных вариантов в клетках [га*"]. Лизаты трансформантов штамма З^У-Ш 9 (см. текст) фракционировали центрифугированием и 8ир35ДВ анапизир0вали ДСН-ПААГЭ и иммуноблотгингом с окрашиванием 8ир35. Белок 8ир35Ы агрегирован, поскольку отсутствует в цитозоле. Эти агрегаты не 5ир35К попадают в осадок из-за малого размера 5ир351<.

3.7. Воспроизведение прионного превращения Sup35 in vitro

Принципиальным свойством прионов и амилоидов является их способность присоединять и превращать в подобие себя мономерную форму соответствующих белков. Мы попытались воспроизвести in vitro такое превращение для Sup35 (Paushkin et al., 1997b). Для этого были приготовлены лизаты [PS/] и [pif] клеток. При этом клетки [PS/4] или [psf] дополнительно продуцировали белки Sup35 укороченные с С-конца. Такие белки сохраняют свои прионные свойства, а их измененный размер позволяет отличать их от прионного полноразмерного Sup35 в ДСН-ПААГЭ и следить за их агрегацией. Прионное превращение проводили путем смешивания и инкубации лизатов [PS/] и [psf]. Затем смесь центрифугировали, чтобы определить степень агрегации белков, пришедших из [psf] лизата.

В первом эксперименте лизат [PS/] содержал Sup35, а [psf] - Sup35 и Sup35N. После смешивания лизатов растворимый белок Sup35N перешел в агрегированную фракцию через 20 минут большей частью, и через два часа почти полностью (рис. 3.6). Прионное превращение Sup35N подтвердили повышением его устойчивости к протеиназе К.

Принципиально важной задачей было показать, что превращенный Sup35 не является пассивным агрегатом, но и сам обладает превращающей активностью. Для этого, превращенный материал был выделен из смеси лизатов центрифугированием и часть осадка (примерно 1/7) использована в качестве затравки для новой реакции превращения. Вторая реакция также прошла успешно, и цикл был повторен еще два

раза (рис. 3.7). После четвертого цикла исходный прион составлял лишь -1/400 долю от общего количества агрегированного Sup35. Таким образом, была »оказана возможность неограниченного циклического прионного превращения in vitro.

Центрифугирование Обработка л л га протеиназой К

S о. о S о. о

о га ci о го з

н х <о >- х га

s го о s го о

zroo J о о 040 2.0 1004

Рисунок 3.6. Переход белка SupЗSN в агрегированную протеазоустойчявую форму в

РК „(МКГ/МЛЛ присутствии белка 8ир35|ге'+|. Клетки [гш]

продуцировали белок Бир35Ы дополнительно

--— к Sup35. Эксперимент: Лизаты [PSÎ*] и \psi~]

клеток были смешаны, инкубированы в течение 20 мин или 2 часов и подвергнуть! центрифугированию или обработке протеиназой К. Далее препараты анализировали ДСН-Г1ААГЭ и иммуноблоттингом с антителами к Sup35. [/>5/»] [/«' ! Контроль, анализ исходных [AS/*| и [psi'}

~S 35 лизатов центрифугированием, и обработка [/м/"] лизата протеиназой К после 2 часов инкубации. Прямоугольниками указана возникающая

20 мин 2 часа

Sup35N

Sup35N прионная форма белка Sup35N.

[PSP] осадок осадок осадок

Рисунок 3.7. Последовательные циклы прионного превращения Sup35. Клеточные лизаты [/^S/*] и [psi] смешивали и инкубировали в течение 2 часов, затем агрегированный Sup35 отделяли центрифугированием и смешивали с новой порцией \psi~] лизата для следующей реакции превращения.

Прионная концепция предполагает, что превращающим началом является сам белок 8ир35[га'+1, а не какие-либо иные компоненты лизатов [/>5/*]. Чтобы подтвердить это, мы очистили прионную форму белка 8ир35Д8 (а.к. 1-482) из клеток дрожжей. Клетки лизировали и фракцию агрегатов осадили центрифугированием. Осадок растворили в буфере, содержащем 2,5 М ГуГХ. При этом большинство неприонных комплексов растворилось. Прионный 8ир35 был собран центрифугированием и имел высокую степень чистоты (рис. 3.8), Этот препарат был способен превращать неприонный 8ир35 в прион с такой же эффективностью, как и неочищенный 8ир35Д8 в составе лизата. Таким образом, конвертирующим началом является собственно прионный белок ЭирЗЗ, что подтверждает одно из базовых положений прионной модели. Данный результат, на момент его публикации, являлся наиболее убедительным доказательством прионной концепции в целом.

кда Рисунок3.8. Очистка белка Sup35ASlra'+l.

_:__-__— (А) Белок Sup35AS был свсрхпродуцирован

112— ^Шшш Us 104 в штамме 1-5V-H19 (SUP35C) и перешел в

84— ^ S?^ S'> прионную форму. Лизат клеток этого штамма

4. _ (дорожка 1) центрифугировали; осадок (дорожки 2)

63— а» —- — - Suр35ДS суспендировали в присутствии 2,5М ГуГХ и снова

52— подвергли центрифугированию (осадок - дорожки

У® " Sup4 5 3). Препараты анализировали ДСН-ПААГЭ с

покраской белков Кумасси голубым или иммуно-

35— блоттингом с покраской Hsp 104, Sup35 и Sup45.

Резюме. Показано, что белок Sup35 в лизатах

отличается от нормы ([psf])

по свойствам, наиболее характерным для прионов: он агрегирует и имеет повышенную устойчивость к действию протеаз. Агрегация происходит за счет N-концевого домена Sup35. Прионное превращение Sup35 было воспроизведено in vitro. Показано, что превращающим началом является агрегированная форма Sup35.

4. СОЗДАНИЕ И СВОЙСТВА ХИМЕРНОГО [Р5Г]

Если [/55'/+] полезен для клетки, а не является "болезнью", следует ожидать консервативности прионной способности 8ир35. Чтобы определить консервативность прионных свойств ЭирЗЗ, мы решили проверить такие свойства у N домена 8ир35 из другого, эволюционно далекого, вида дрожжей - Pichia теМапоИса. Сходство структуры N доменов двух белков 8ир35 мало (36%) и определяется в основном подобием аминокислотного состава (КизЬтгоу е! а1., 1990). Мы создали гибридный белок 8ир35РЭ с N доменом из дрожжей Р. те^апоИса и областью МС из 5. сегеу1з1ае, изменив в хромосоме 5. сетеушае область, кодирующую N домен 8ир35. Прионное состояние ЗирЗэРЭ ([Р^/рз]) было получено селекцией супрессорного фенотипа при сверхпродукции 8ир35Р8 и подтверждено исчезновением этого фенотипа при росте клеток в присутствии ЗмМ ГуГХ. При этом разные изоляты [Р57*р3] отличались по эффективности нонсенс супрессии, что указывало на присутствие различных вариантов приона, аналогичных вариантам [Р$Г]. Белок 8ир35Р8 в этих изолятах также проявил свойства характерные для приона. Центрифугирование показало, что в лизатах [Р5,У+Р5] 8ир35Р8 перераспределяется во фракцию осадка по сравнению с [/«Гр8] лизатом, что характерно для лизатов [Р5/4]. Обработка протеиназой К обнаружила, что в лизатах [Р5,/1"р8] 8ир35Р8 в 4 раза более устойчив к действию протеазы, чем в |/и7РЗ] лизатах. Как некоторое отличие от отметим, что стабильность наследования [Р.?/^] во всех случаях была заметно ниже, чем у обычного [Р^/4]. Низкую стабильность [РЗ/^] также можно рассматривать, как подтверждение его прионной природы.

Резюме. Показаны прионные свойства белка 8ир35 из дрожжей Р. теЛапоНса, что указывает на распространенность прионного свойства 8ир35 у разных видов дрожжей и его возможную биологическую значимость.

5. БЕЛКИ, ПРОТИВОДЕЙСТВУЮЩИЕ ПОДДЕРЖАНИЮ ПРИОНОВ ДРОЖЖЕЙ

5.1. Шапероны семейств Hsp70 и Hsp40

Практический интерес к изучению прионов и амилоидов связан в первую очередь с тем, что они вызывают неизлечимые болезни человека и животных Это побудило нас задаться вопросом, существуют ли клеточные факторы, противодействующие поддержанию прионов'' Мы попытались найти и охарактеризовать такие факторы, предполагая, что их эффект проявится при сверхпродукции К началу нашей работы был известен один такой фактор, шаперон Hspl04 (Chernoff et al, 1995), необходимый для поддержания [PS/] (гл 6) Парадоксально, но сверхпродукция HspI04 также во многих случаях приводила к исчезновению [PS/4! Было известно о слабом влиянии на [PSt] шаперонов семейства Hsp70, Ssa и Ssb при избытке Hspl04 сверхпродукция Ssal уменьшала, а сверхпродукция Ssb 1 увеличивала частоту потери [PS/*] (Chernoff et al, 1999, Newnam et al, 1999)

Гибридный прион [PStps] оказался более чувствительным, чем [PS/], инструментом для анализа и поиска антиприонных факторов Мы проверили действие на него сверхпродукции названных шаперонов Также в анализ был взят шаперон Ydjl в связи сданными, что Ssal и Ydjl совместно помогают Hspl04 в растворении и реактивации агрегатов люциферазы, денатурированной нагреванием (Glover and Lindquist, 1998) Следует отметить, что в клетках дрожжей присутствуют четыре белка Ssa и два белка Ssb, представляющих два основных семейства шаперонов Hsp70, родственных бактериальному шаперону DnaK Несмотря на сходство, белки Ssa и Ssb функционально различны и невзаимозаменяемы Белок Ydjl принадлежит семейству Hsp40, родственному DnaJ, функциональному партнеру DnaK

Для изучения эффектов шаперонов мы трансформировали клетки с различными вариантами [PSt¡>s] и "слабым" [PSt] многокопийными плазмидами с генами шаперонов SSA1, SSB1, YDJ], HSP104, а также SSA1 и YDJ1 одновременно Колонии трансформантов во многих случаях отличались либо красным цветом, либо наличием красных секторов (рис 5 1) Красный цвет отражал потерю [PS/Vs], о чем свидетельствовало сохранение [psi] фенотипа при потере плазмид с шаперонами Сверхпродукция Ssal, Ssbl и Ydjl вызывала заметную, а иногда и частую, потерю [PS/ps] Hspl04, напротив, был активен в основном против [PS/~] (Табл 4 1)

Хотя в целом шапероны действовали более эффективно против слабых [PStр$], следует отметить значительную специфичность действия шаперонов относительно вариантов [PS/ps] Так, [PS/ps] #3 был чувствителен ко всем шаперонам кроме Hspl04, a [PS/Vs] #4 чувствителен к Hspl04, но малочувствителен к другим шаперонам [PS/ps] #1 отличался от [PS/Vs] #4 повышенной чувствительностью к Ssal и Ydj 1 Также антиприонная эффективность шаперонов не коррелировала между различными вариантами [PStPS] и [PS/], за исключением пары Ssal - Ydjl Это позволяет предположить существование трех относительно независимых механизмов, действующих на прионы, связанных с шаперонами Hspl04, Ssal/Ydj 1 и Ssbl

Рисунок 5.1. Исчезновение и \РЯГ\ при сверхпродукции шаперонов

Клетки, содержащие [РХГрэ] варианты 1-4 и слабый [РУР], трансформировали многоко-пийными плазмидами с указанными генами шаперонов и растили 6 дней на селективной среде с пониженным содержанием аденина для лучшего проявления цвета.

Таблица 5.1 Исчезновение [P,S/Ysl и \PST\ при сверхпродукции шаперонов.

[PStга], [Р5Г] Эффективность супрессии, % Сверхпродуцированные шапероны

Ssal Ydj 1 Ssal + Ydj 1 Ssbl Hspl04

#1 40,1±5,4 ± + ++ - -

#2 53,5±12,6 - - + -

#3 6,8±0,4 ++ ++ +++ +++ ±

#4 13,1±2,3 - - + ++ +

слабый [PST] 7,65+1,32 - - + ++ +++

сильный [PST] 27,98+7,20 - - - - +

Избыток шаперонов** 1,5 9 1,5 + 3 2 30

Частота потери прионов (рис. 5.1) была интерпретирована следующим образом: прион стабилен; ±, потери редки; + заметны; ++ часты; +++ (почти) полная потеря. +*, Большинство этих трансформантов не теряли [PSTps], но их рост был сильно ингибирован; в меньшинстве колоний, более заметном из-за крупного размера, происходила секторная потеря прдана. **Указан кратный избыток шаперонов относительно нормы, определённый иммуноблоттингом. Как приблизительная оценка "силы" приона, указана эффективность супрессии (сквозное прочтение ко дона UAA) в исходных штаммах.

Следует отметить, что экспрессия шаперонов подвержена жесткой саморегуляции (Stone and Craig, 1990). Например, свободный Ssal ингибирует собственный синтез, что позволяет повысить синтез при связывании Ssal денатурированными белками при стрессе, но препятствует его перепроизводству при увеличении числа копий гена SSAI. Поэтому для корректной оценки эффектов шаперонов мы определили уровни сверхпродукции шаперонов относительно нормы (Таблица 5.1). Оказалось, что лишь уровень Hspl04 возрастал пропорционально копийности плазмиды (в 30 раз). Синтез остальных шаперонов подвергся негативной коррекции. Уровень Ydj 1 возрастал в 9 раз и лишь в 3 раза в присутствии избытка Ssal; уровень Ssal возрастал лишь в 1,5 раза и Ssbl в 2 раза. Таким образом, можно предполагать, что антиприонные эффекты шаперонов были бы намного сильнее при отсутствии авторегуляции их. синтеза.

Контроль SSA1 YDJ1 SSAUYDJ1 SSB1 HSP104

[PSI*ps] #1 m ill

#2 ш Ш ЧВЙЕЙЯняЕ ■ ж

#3 Ш jmm

#4 tm шшт Щ

Слабый [PSI*] Щ ШШЖЖ

5.2. Систематический поиск факторов, препятствующих поддержанию \PStPS]

Поскольку [PS/ps] позволил обнаружить антиприонные эффекты основных шаперонных семейств, мы решили использовать его для систематического поиска антиприонных факторов у дрожжей. Для этого штамм с "сильным" \PSiKA\ был трансформирован многокопийной дрожжевой геномной библиотекой. Клетки штамма образуют колонии белого цвета. Если кодируемый плазмидой белок препятствовал поддержанию или проявлению [PSTPS], колония приобретала красный цвет, что позволяло отобрать ее для анализа. Было получено около 300 тысяч трансформантов, из которых около 500 имели красный цвет и были отобраны. Хотя используемый штамм имел высокую фенотапическую стабильность, он с небольшой частотой выщеплял красные клоны. Чтобы избавиться от трансформантов, потерявших [PSTps] спонтанно, они были скрещены с тестерным штаммом содержащим [PSTps-i]. Получающиеся при этом [PSI* Pg | диплоиды должны быть белыми в случае спонтанной потери и красными при наличии антиприонных факторов. Последних оказалось 50, и из них были выделены плазмиды. При трансформации клеток [PS/ps.j] лишь 24 плазмиды привели к образованию красных, розовых или секторных

колоний. Фрагменты хромосомы, содержащиеся на этих плазмидах, определили секвенированием концов вставок. Делеционный анализ вставок выявил следующие гены, влияющие на [PSfps]: SIS1, YNL077w. STIL SFL1, SSN8, RPP0 и SUP35. Продукт гена SUP35, белок Sup35, вызывает антисупрессию, а не потерю [PSTps], поскольку в клетках [PSTpsj Sup35 не полимеризуется, но и не препятствует полимеризации Sup35PS.

Рисунок 5.2. Эффекты сверхнродукции антиприонных факторов. Трансформанты [/"■STps] и [PS/*] клеток плазмидами, несущими указанные гены. Контроль, трансформанты вектором YEplacl95.

Ген YNL077w кодирует ранее не охарактеризованный белок семейства Hsp40 (DnaJ), который мы назвали Apjl (антиприонный DnaJ). Другие гены кодируют шаперон Sis 1 семейства Hsp40, шаперон Stil, транскрипционные факторы Sfll и Ssn8, и кислый рибосомный белок RppO,

Эффекты сверхпродукции этих белков показаны на рис. 5.2 и подробнее охарактеризованы для различных вариантов гибридного и обычного [PSF] в таблице 5.2. Частота потери приона и ослабление супрессии часто не коррелировали. Для \PSJ ps-i] только избыток Sis 1 вызывал значительное ослабление супрессии, в то время как избыток RppO вызывал наибольшую потерю приона при низкой антисупрессии.

Контроль APJ1 SIS1 YDJ1

Таблица 5.2 Эффекты антиприонных факторов в клетках [PSt\ и [PS/ps]

Вариант Эффект Сверхпродуцированные белки

[PS/] Sisl Apjl Ydjl Stil Sfll Ssn8 RppO Контроль

[PSI*,s,] Ослабление супрессии Секторная потеря ++ + + + + + + + ++ -

% потери 13 9 12 12 3 0,2 25 0,1

[«TVs 2] Ослабление супрессии Секторная потеря + + + - + + - -

% потери 10 22 5 2,2 5 2,4 oa 0

[геГ] сильный Ослабление супрессии - - - - + + - -

Секторная потеря - - - - - - - -

% потери 0,3 0,1 0,2 0 3 5 0,1 0

[AST] слабый Ослабление супрессии - - - + + + - -

Секторная потеря % потери 0,9 0,5 0,5 1,8 + 15 3 0,4 0,3

Эффекты наблюдали у трансформантов указанных клеток сверхпродуцирующих указанные белки Контроль, трансформанты пустым вектором YEplacl95 Эффективность ослабления супрессии оценивали по цвету дрожжевых штрихов на среде не содержащей аденина "Секторная потеря" отражает пропорцию красных секторов в колониях (рис 5 2) ++, сильный эффект, +, слабый эффект, -, нет эффекта

53. Механизмы антиприонных эффектов выявленных белков

Центрифугирование клеточных лизатов выявило значительный уровень растворимого Sup35PS при сверхпродукции шаперона Sisl, что объясняет ослабление супрессии при избытке Sisl Вероятной причиной эффекта является противодействие Sisl процессу полимеризации Например, этот белок мог бы связываться с растущими концами полимера и мешать присоединению мономеров Sup35PS

В отличие от ранее известных антиприонных факторов, являющихся шаперонами, белки Sfll и Ssn8 участвуют в регуляции транскрипции Sill гомологичен Hsfl, играющему ключевую роль в регуляции ответа на тепловой шок Ssn8 и Sfll взаимодействуют в регуляции экспрессии гена SUC2 (Song and Carlson, 1998)

Наиболее вероятным механизмом эффектов Ssn8 и Sfll представляется их влияние на синтез других белков, в первую очередь, шаперонов Прямое действие Ssn8 и Sfll на полимеризацию Sup35PS маловероятно хотя бы потому, что эти белки присутствуют в клетке в довольно малых количествах, как и большинство транскрипционных факторов В случае рибосомного белка RppO также можно ожидать влияние этого белка на синтез шаперонов, хотя возможно и его непосредственное взаимодействие с прионными частицами Поэтому мы решили определить влияние Ssn8, Sfll и RppO на транскрипцию генов теплового шока. Эта транскрипция контролируется двумя основными промоторными элементами, HSE и STRE В частности, Hsfl связывается с HSE, активируя транскрипцию генов теплового шока, и аналогичное свойство можно предполагать у Sfll Для проверки транскрипционных эффектов Ssn8 и Sfll мы сконструировали несколько тестовых

плазмид с геном lacZ £ сок (кодирует Р-галактозидазу) под контролем синтетических промоторов, содержащих HSE и STRE, а также промоторов генов HSP104, SSA4 и SUP35 Промотор HSP104 анализировали ввиду необходимости этого гена для поддержания прионов, SSA4 представляет пример полной зависимости экспрессии от стресса, а уровень экспрессии SUP35 важен для поддержания и проявления [ТО/] Для более полной характеристики роли генов SSN8 и SFL1 были сконструированы и включены в анализ их хромосомные делеции

Таблица 5 3 Влияние изменения дозы генов SFL1, SSN8 и RPP0 на активность промоторов HSE, STRE, SSA4, HSP104 и SUP35

Изменение дозы гена Промотор

HSE STRE SSA4 HSPI04 SUP35

Многокопийный SFLI 4,10 ±0,17 7,18 ±0,17 12,41 ± 1,31 43,1 ± 1,9 8,07 ± 0,27

Делеция SFL1 1,72 ±0,15 5,23 ± 0,32 13,13 ±1,05 21,0 ±0,2 6,17 ±0,08

Многокопийный SSN8 1,52 ±0,21 3,22 ±0,35 2,31 ± 0,61 18,0 ± 1.1 6,49 ± 0,52

Делеция SSN8 1,54 ±0,11 7,47 ± 0,24 12,72 ±1,74 26,6 ±3,0 4,75 ± 0,36

Многокопийный RPPO 3,45 ± 0,21 5,21 ±0,44 14,02 ± 2,53 24,5 ±3,1 11,58 ± 0,77

Контроль 1,41 ±0,12 4,73 ±0,51 5,16 ± 1,14 20,5 ± 0,5 6,77 ±0,13

Наиболее значительные эффекты отмечены жирным шрифтом Контроль, трансформанты вектором YEplac 195

Данные о влиянии генов SSN8, SFL1 и RPP0 на активность тестируемых промоторов приведены в Табл 5 3 Видно, что Ssn8 репрессировал промоторы STRE и SSA4, но не влиял на промоторы HSE и HSP104 Отсутствие Ssn8, наоборот, имело активационный эффект Это согласуется с литературными данными о том, что Ssn8 является негативным регулятором экспрессии гена SSA1 (Cooper et al, 1997) Избыток Sfll активировал все промоторы, но в наибольшей мере промотор HSE Такой результат можно было предполагать ввиду подобия Sfll фактору Hsfl, мишенью которого является промоторный элемент HSE

Более удивительным явилось значительное возрастание активности шаперонных промоторов HSE и SSA4 при увеличенной дозе гена RPP0 Наиболее вероятно косвенное влияние избытка рибосомного белка RppO на экспрессию шаперонов усиление экспрессии является ответом на какое-то изменение или дисбаланс трансляционного процесса. Однако возможно и прямое влияние RppO на транскрипцию Следует отметить, что RppO уникален среди рибосомных белков Большинство их являются основными (что помогает связываться с рибосомной РНК), a RppO - кислый и менее прочно связан с рибосомой Также важно, что избыток RppO двукратно увеличивал продукцию Sup35, что должно затруднять устранение [MS/ps]

Поскольку изменение дозы генов SSN8, SFL1 и RPPO влияло на экспрессию шаперонов, оно могло также вызывать устойчивость клеток к повышенной температуре Проверка показала, что клетки с избытком SFLI и RPPO, но не SSN8 могли расти при 37°С, в отличие от нетрансформированных клеток

5.5. Sfll связывается с промоторным элементом HSE

Ввиду гомологии Sfll и Hsfl и согласно данным табл. 5.3 можно было предположить, что Sfll способен связываться с промоторным элементом HSE. Чтобы подтвердить эту гипотезу, мы провели эксперименты по ДНК-белковому связыванию (gel mobility shift assay). Белок Sfll был экспрессирован в Е. coli и очищен. Были синтезированы ДНК дуплексы HSE и STRE и радиоактивно мечены Р32 с помощью ДНК полимеразы Кленова. Дуплексы ДНК инкубировали с очищенным Sfll или с дрожжевыми лизатами, а затем разделяли связавшиеся с белком и несвязавшиеся дуплексы посредством нативного электрофореза в полиакриламидном геле. Анализ показал, что белок Sfll связывался с дуплексом HSE и не связывался со STRE (рис. 5.3). В лизатах оба дуплекса связывались с белками, однако связывание HSE коррелировало с количеством Sfll в лизате, а связывание STRE - нет. Это позволяет заключить, что Sfll эффективно связывается с элементом HSE и не связывается со STRE. Также можно видеть, что в лизатах в комплекс Sfll-HSE входят дополнительные белки, что следует из его сниженной подвижности.

HSE STRE

HSE-белок

Sfll-HSEf

DM '

чистый Sfll

Таким образом, основными клеточными факторами, имеющими антиприонное действие являются шапероны. Помимо Hspl04, это шапероны семейств Hsp70 и Hsp40. Кроме этого, антиприонным действием обладали транскрипционные факторы Sfll и Ssn8, а также рибосомный белок RppO. Наиболее вероятно, их действие реализуется косвенно, через изменение уровня синтеза шаперонов.

Повышение синтеза антиприонных факторов является одной из возможных стратегий лечения амилоидных болезней человека и животных. Некоторые из найденных нами факторов уже апробированы в таком качестве. Так, в модели полиглутаминовой болезни у Drosophila melanogaster сверхпродукция шаперонов Hsp70 подавляла нейродегенерацию (Warrick et al., 1999).

Резюме. Показано, что избыток белков Ssal, Ssbl, Ydjl, Sisl, Apjl, Stil, Sfll, Ssn8 и RppO способен противодействовать прионной полимеризации Sup35. Эти белки либо являются шаперонами, либо влияют на синтез шаперонов.

--Ч "-1

^ О _ 4-

<-2 со

ё * чисты и

- — - I Sfll L

Лизаты

STRE-белок

STRE

g £ £ 1 %<t

Лизаты

Рисунок 5.3. Белок вШ связывается с элементом ЖЕ, но не с вТОЕ. ДНК

дуплексы Н8Е и 8ТЯЕ, меченные Р32, инкубировали с очищенным 5Ш или дрожжевыми лизатами. Лизаты содержали нормальное количество 8£11 (1х5И./),его избыток (тЯРЫ), или 8Ш отсутствовал (ДЗИ/)

6. МОДЕЛЬ РЕПЛИКАЦИИ ДРОЖЖЕВЫХ ПРИОНОВ: РОЛЬ IISP104 6.1. Две модели прионного превращения РгР

Для описаиия процесса превращения белка РгР° в прионную форму PrPSc были предложены две модели, гетеродимерная (Prusiner, 1991) и полимеризационная (Jarrett and Lansbury, Jr, 1993) Согласно гетеродимерной модели, белок РгР может стабильно пребывать в двух структурно различных формах, нормальной РгРс и прионной PrPSc, причем обе формы являются мономерными Спонтанный переход РгРс в PrPSc происходит крайне медленно, однако PrPSc ускоряет этот переход, катализируя преобразование молекул РгРс или их частично дестабилизированной формы (РгР1"') в PrPSc (рис 6 1) Этот автокаталитический процесс и определяет инфекционность PrPSc РгРс стабилен лишь в отсутствие PrPSc Агрегация молекул PrPSc рассматривается при этом как вторичное явление, не существенное для конформационной перестройки

г, г>с РгР'п| ------^

ггг / ргр5с ч ргр8с ргряс ргр5с

о^о——-оп-□

медленно быстро быстро

Рисунок 6.1 Гетеродимерная модель прионного превращения белка РгР^.

Прионное состояние (РгР ) характерно для мономера РгР (см текст)

В полимеризационной модели прионное превращение сводится к процессу полимеризации прионного белка. Как обычно бывает в случае полимеризации, полимер обладает способностью катализировать переход мономера в полимерную форму Лимитирующей стадией процесса является возникновение полимера, который затем быстро растет, присоединяя к себе мономеры Следует отметить, что прионные и амилоидные полимеры являются одномерными (линейными), как свидетельствуют многочисленные наблюдения их палочкообразной или нитевидной формы В отличие от цитоскелетных полимеров (актин, тубулин) укладка прионных и амилоидных белков сильно изменена в полимере и обогащена бета-структурой

6.2. Анализ моделей прионного превращения

В 1994 году, когда Р Викнер впервые провел аналогию между прионами дрожжей и животных, исследователи прионов преимущественно использовали гетеродимер-ную модель С Прузинера, а полимеризационная модель использовалась в основном при изучении амилоидов Мы тоже пытались представить репликацию прионов в гетеродимерной модели, однако обнаружили в ней существенные несоответствия В этой модели прионное состояние присуще мономеру белка Прионный мономер образует комплекс с неприонным, переводит его в прионную конформацию, и затем диссоциирует Подобный цикл невозможен без энергетических затрат, например гидролиза АТФ или ГТФ, но это не предусмотрено гетеродимерной моделью

В полимеризационной модели диссоциация не требуется1, и поэтому превращение может происходить без расхода энергии Происходит последовательное присоединение мономеров к полимеру Вследствие этого полимер имеет нитевидную форму, характерную для амилоидов Вторая слабость гетеродимерной модели связана с существованием штаммов, то есть структурных вариантов приона Достаточно трудно представить для мономера белка существование многих вариантов стабильной пространственной укладки, способных к тому же к автокаталитическому структурному превращению В амилоидных же полимерах такие варианты наблюдались Например, фибриллы Sup35, образованные in vitro, обнаруживали существенно различающуюся морфологию (Glover et al, 1997) Поэтому мы приняли полимери-зационную модель прионов как более адекватную, и это оказалось существенным для объяснения роли Hspl04 Впоследствии были опубликованы прямые свидетельства в пользу полимеризационной модели минимальная масса инфекционного агента PrPSc была определена, как 300 кДа, что примерно соответствует 10-меру PrP (Silveira et al, 2005)

63. Модель репликации дрожжевых прионов: ключевая роль Hspl04

В поддержании дрожжевых прионов особую роль играет шаперон Hspl04, необходимый для существования всех известных природных прионов дрожжей В то же время, сверхпродукция Hspl04 способна эффективно устранять [PS/4] Мы попытались объяснить этот парадокс, опираясь на известные свойства Hspl04 Этот белок занимает особое место среди шаперонов В отличие от большинства шапе-ронов, он не предохраняет белки от денатурации, и, видимо, не способен восстанавливать их нативную структуру Hspl04 необходим для разборки крупных белковых агрегатов на более мелкие комплексы, которые могут быть затем реактивированы шаперонами семейств Hsp70 и Hsp40 (Parsell et al, 1994, Glover and Lindquist, 1998)

Чтобы объяснить роль Hspl04 в репликации прионов, мы предположили, что он действует аналогичным образом на прионные полимеры (рис 6 3) Эти полимеры, однако, отличаются от неупорядоченных агрегатов двумя важными свойствами предполагаемой нитевидной формой и способностью катализировать свою дальнейшую полимеризацию При этом присоединение мономеров происходит только на концах нитей В результате, каждый разрыв нити, производимый Hspl04, создает новые активные концы и таким образом ускоряет полимеризацию Кроме того, при этом происходит увеличение количества прионных частиц, что необходимо для их стабильного наследования Следует отметить, что с точки зрения двух самых важных параметров, наследования и полимеризационной активности, размер прионного полимера не важен, если только он не опускается ниже некоторого порога Поэтому фрагментация фактически размножает прион, при том условии, что он успел достаточно вырасти за счет полимеризации Однако если фрагментирующая активность Hspl04 слишком высока, она способна нарушить поддержание приона,

1 Фрагментация полимеров описываемая далее в этой главе, аналогична диссоциации и многократно ускоряет полимеризацию но требует посторонней помощи (Hspl04) и расходования АТФ

просто растворив, разобрав его до мономеров или мелких олигомеров, неспособных инициировать полимеризацию. Таким образом, данная модель полностью объясняет парадоксальные свойства Мэр 104 в поддержании прионов.

..JO

о ° о

Sup35: О

Полимеризация

(требует только Sup35)

о о

оТо

Фрагментация

(требует Hsp104)

Hsp104

Рисунок 6.3. Модель репликации прионов дрожжей ва примере 8ир35.

Полимеры Эир35 растут в результате полимеризации и увеличиваются в числе вследствие фрагментации шапероном НэрКМ

Резюме. Предложена модель размножения прионов дрожжей, основанная на их фрагментации шапероном Нзр104.

7. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ И АНАЛИЗА ПРИОНОВ

Согласно нашей модели, прионные частицы представляют линейный полимер нековалентно связанных молекул прионного белка, фрагментированный до некоторого размера шапероном Hspl04 (Гл. 6). Чтобы доказать эту модель, требовались методы, позволяющие уверенно отделять комплексы амилоидного (прионного) типа от ассоциированных с ними молекул и от неамилоидных комплексов. Структура прионов в клетках дрожжей оставалась неизвестной, в значительной мере вследствие отсутствия методов их очистки и анализа Можно было предполагать, и мы это подтвердили в дальнейшем, что агрегаты Sup35 содержат множество дополнительных компонентов, например, полирибосомы. Именно эти комплексы, а не собственно прионные полимеры, вьмвлялись преложенным нами (Гл. 3) и широко используемым в то время ультрацентрифугированием. Другой метод, наблюдение в клетках с помощью флуоресцентного микроскопа агрегатов гибридов приона и зеленого флуоресцентного белка (Patino et al., 1996) позволял определять лишь наличие прионных частиц, но не их размеры. Наличие метода очистки прионных частиц также позволило бы выделять и идентифицировать новые прионные белки, опираясь лишь на их прионные свойства.

7.1. Подбор реагентов и условий для очистки прионных частиц

Для разработки методов анализа прионов было необходимо найти условия, при которых разрушались бы все макромолекулярные комплексы, кроме прионных полимеров. Ранее мы использовали ГуГХ в высокой концентрации для очистки

прионной формы белка 8ир35 (Гл. 3). Однако впоследствии мы обнаружили, что ГуГХ вызывает вторичную агрегацию некоторых белков клеточного лизата, что существенно снижает степень очистки. Мы проверили ряд химических соединений (мочевина, КС1, деоксихолат натрия, несколько неионных детергентов, а также лаурил саркозил и ДСН) по их способности очищать прионные агрегаты. Эксперимент проводили следующим образом. Из лизата клеток штамма 5У-Н19 [Р^/1] центрифугированием осаждали фракцию, содержащую прионные агрегаты БирЗб. Осадок растворяли в буферах, содержащих тестируемые вещества, и подвергали центрифугированию при 150000§ в течение трех часов. Полученный осадок анализировали ДСН-ПААГЭ, и таким образом выявляли вещества, обеспечивающие максимальную степень очистки 8ир35. Такими оказались сильные анионные детергенты ДСН и лаурил саркозил, намного превзошедшие остальные реагенты. В дальнейшей работе был использован ДСН, как реагент методически более распространенный. Однако саркозил также может быть использован в разработанных нами методах.

Рисунок 7.1. Полимеры 8ир35 устойчивы к действию ДСН при невысоких температурах. Фракцию агрегатов лизата клеток [Р^/] инкубировали 10 мин с 2% или 5% ДСН при указанных температурах и анализировали ДСН-ПААГЭ. Иммуноокрашивание 8ир35

По условиям задачи, искомый агент должен сохранять прионные полимеры и растворять неприонные комплексы. Мы проверили сохранность прионных полимеров 8ир35 при их обработке ДСН при различных температурах, от 10° до 100°С. Образцы анализировали ДСН-ПААГЭ без их предварительного кипячения. Полимерная форма 8ир35 обнаруживалась на границе гелей, а мономерная проходила в разделяющий гель. (рис. 7.1). В образцах, обработанных ДСН при температурах 42°С и ниже, содержание мономерной формы 8ир35 было мало и почти не зависело от температуры и концентрации ДСН. Это говорит об устойчивости прионных частиц 8ир35 в этих условиях. Использование электрофореза в агарозном геле, описанном ниже, показало, что размер прионных частиц тоже не зависит от концентрации ДСН и температуры обработки в диапазоне 10-42°С (данные не приведены).

Также необходимо было показать, что никакие другие белки, кроме самого 8ир35, не связаны с прионными полимерами в присутствии ДСН. Полимеры 8ир35 выделили используя ДСН-ПААГЭ без кипячения образцов. При этом полимеры задержались в начале "разделяющего" геля, которое отделили, кипятили в присутствии ДСН и анализировали в качестве образца новым ДСН-ПААГЭ. Окрашивание геля Кумасси показало, что Эир35 является основным, если не единственным белком в задержанной полимерной фракции (рис. 7.2). Следовательно, в присутствии ДСН полимеры 8ир35 не содержат, или содержат достаточно малое количество посторонних белков.

стает полимеры Эир35

мономеры Эир35

5% ДСН

0° 25° 37 37° 42° 50 70° 100

Рисунок 7.2. Sup35 - основной белок во фракции ДСН-устойчнвых полимеров в клетках [ДУ/4].

Высокомолекулярную фракцию лизатов клеток 5V-H19 [psi"], [PSÎ*] и [/>57*] со сверхэкспрессией гена SUP35 инкубировали сДСН при 37°С и анализировали ДСН-ПААГЭ. Верх разделяющего геля (Змм), содержащий ДСН-устойчивые комплексы, был отделен, подвергнут кипячению в ДСН-содержащем буфере для образцов и проанализирован другим ДСН-ПААГЭ. Окраска геля Кумасси голубым. Соответствие полосы белку Sup35 подтверждено иммуноблотгингом.

7.2. Электрофорез прионных частиц в ДСН-агарозном геле - разработка метода

Обработка ДСН не разрушает прионные частицы и позволяет отделить их от прочих белковых комплексов, что является принципиальной предпосылкой для корректного определения размера этих частиц. Идеальным методом для определения размера нам представлялся электрофорез, как намного более точный и менее трудоемкий, чем центрифугирование. Весьма удачным совпадением явилось то. что ДСН является стандартным и необходимым компонентом белкового электрофореза: ДСН связывается с белками и придает им отрицательный заряд, что позволяет белкам мигрировать в геле в приблизительном соответствии с их молекулярной массой.

Некоторую проблему представляло то, что полиакриламидный гель, обычно используемый для анализа белков, имеет слишком мелкие поры для прионных полимеров (рис. 7.1), даже при минимально возможной концентрации акриламида. Поэтому в качестве геля для разделения мы использовали агарозу, хотя она не обеспечивает столь хорошего разделения молекул, как полиакриламид. В качестве буфера был выбран Трис-ацетат-ЭДТА (ТАЕ), обычно используемый для разделения ДНК. В соответствии с белковой спецификой, он был дополнен 0,1% ДСН. Буфер для приготовления образцов содержал ТАЕ, 2% ДСН и p-меркаптоэтанол. Попытка использовать стандартную буферную систему Лэммли дала менее качественное разделение. Также пришлось отказаться от использования вертикальных гелей, поскольку агарозный гель не крепится к стеклу и проседает в процессе электрофореза. В качестве стандартов молекулярной массы выбрали препарат миофибрилл кролика, содержащий гигантские белки титин (примерно 4200 кДа) и небулин (740 кДа) (Wang, 1982). Перенос белков из геля на мембрану (блоттинг) также вызывал проблемы, поскольку агарозный гель в 3 раза толще акриламидного, и сплющивается при механической нагрузке. Опробовав все основные способы блотгинга, мы выбрали вакуумный, как наиболее надежный и качественный.

Для проверки метода мы сравнили белок Sup35 в штаммах 5V-H19 [PSf] и \psi\. Из результата, представленного на рис. 7.3 можно заключить, что: (а) метод позволяет отчетливо различать [pif] и [PS/4] клетки, поскольку в [psi] клетках Sup35 находится только в мономерной форме, а в [PSf ] клетках преимущественно в полимерной; (б) размер прионных полимеров составляет в данных [PS74] клетках от 700 до 4000 кДа, что соответствует присутствию от 9 до 50 молекул Sup35.

со

кДа

_230

- ■*• Sup35

— 58

•33

< Старт

кДа

< 4200

< 740

Рисунок 7.3. Сравнение белка Sup35 в ¡psi] н [/WjT] клетках. Лизаты [psi] и [PSP] вариантов 5V-H19 анализировали ДСН-агарозным электрофорезом с иммуноокрашиванием белка Sup35, M, препарат миофибрилл кролика используемый в качестве маркера молекулярного веса (блот окрашен Понсо красным).

7.3. Другие разработанные методы

Основываясь на нерастворимости прионных частиц в ДСН, мы также разработали следующие методы выделения и анализа прионных частиц (КизИтгоу е! а1., 2006):

1. Выделение прионных частиц центрифугированием лизатов в присутствии ДСН,

что может быть использовано для поиска новых прионных белков;

2. Анализ мономеров прионного белка ДСН-ПААГЭ без кипячения образцов;

3. Одновременный анализ количества мономеров и полимеров прионного белка

в ДСН-ПААГЭ, с кипячением геля в середине пробега (ЗИкипсЗша е1 а]., 2006).

Резюме. Обнаружено, что прионные полимеры отличаются от прочих клеточных белковых комплексов своей нерастворимостью в присутствии сильных ионных детергентов. Основываясь на этом, разработаны новые методы выделения и анализа прионных полимеров, в частности, электрофорез полимеров в ДСН-агарозном геле.

8. ХАРАКТЕРИСТИКА ПРИОННЫХ ПОЛИМЕРОВ И АГРЕГАТОВ 8ЦР35 8.1. Агрегаты вир35 состоят из его прионных полимеров и неприонных молекул

Поскольку мы обнаружили, что ДСН удаляет неприонные белки, связанные с полимерами 8ир35, представляло интерес сравнить размер этих полимеров и агрегатов 8ир35, наблюдаемых при центрифугировании в отсутствие ДСН. Для этого мы провели центрифугирование лизата клеток [Р5Г] в присутствии 2% ДСН и в его отсутствие, а также лизата. Сравнение профилей седиментации 8ир35 (рис. 8.1) показало, что обработка ДСН весьма существенно уменьшает размер прионных комплексов. В среднем, масса прионных агрегатов 8ир35 превосходила массу прионных полимеров в 35 раз. Столь значительная разница в размерах может быть обусловлена двумя причинами: ассоциацией полимеров 8ир35 с другими молекулами и комплексами (такими, как рибосомы), и возможностью нахождения в одном агрегате нескольких полимеров. Относительный вклад этих двух факторов трудно оценить корректно. Вероятно, он варьирует и между разными клетками, и между отдельными агрегатами. Сравнение профилей седиментации Эир35 из [РБ?] и [ряГ] лизатов (рис. 8.1) указывает, что вклад ассоциированных комплексов в массу агрегата

достаточно велик. Из Рис. 8.1 также видно, что центрифугирование различает [Р5Г] и \ряГ] лизаты гораздо менее четко, чем ДСН-агарозный форез (рис. 7.3).

ДСП

[ю/~] - «SUBI«в —

[PSI ' 1 - —«мин» ----

[PSI )+--

Рисунок 8.1. ДСН разбирает приоиные агрегаты 8ир35 до малых ДСП-устойчивых частиц. Лизаты клеток и штамма 5У-Н|9 фракциониро-

вали центрифугированием в отсутствие (-) или в

присутствии (+) ДСП. Фракции анализировали при помощи ДСН-ПААГЭ. Иммуноокрашивание Sup35

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Оса

Верх

док

8.2. Варианты \PSI*] и [PSI*отличаются по размеру полимеров Sup35

Независимые изоляты [PSI ] и гибридного нриона [Я5Гге] могут отличаться по эффективности нонсенс супрессии и по стабильности наследования. Обычно более эффективная супрессия коррелирует с повышенной стабильностью (более "сильный" вариант [PS/ ]). Принято считать, что вариация свойств прионов определяется различной структурой прионных полимеров. Это может приводить к различной скорости прионной полимеризации и разной частоте фрагментации полимеров, а, следовательно, и к различному размеру полимеров. Чтобы проверить это, мы сравнили размер полимеров Sup35 в клетках с разными вариантами f/W] и [/■>.S7 PSj (рис. 8.2). Была обнаружена значительная вариация, причем размер полимеров был обратно зависим от уровня сквозного прочтения UAA кодона. Единственным исключением оказался сильный вариант [PSI PS.i] имевший большие полимеры.

2 3 4 5 6 7 8

4: Старт

Обнаруженную корреляцию можно объяснить следующей логикой: меньший размер полимера означает их большее количество, большую общую скорость полимеризации, меньшее количество мономера 8ир35 и более эффективную супрессию.

Вариант

приона: WSSSSWSS

[PSH-] [PSI+psi

<205 Sup35

Сквозное прочтение

Рисунок 8.2. Сравнение размера прионных полимеров и уровня сквозного прочтения UAA кодона в клетках с различными вариантами [Р574"] и [.PS/ps]- Штаммы дрожжей, содержащие варианты [PSI*] и [PSI psj анализировали ДСН-агарозным электрофорезом с окрашиванием белка Sup35. Варианты приона. W - слабый, S - сильный; по дорожкам: 1 - [PSA], 2 - [PS/M, 3 [геГп],4-[Р5Гз7],5- [PSI' PS-20J, 6 - [Psrp%.-,11 - [PSPPSJ], 8 - [PSI PS.,].

8.3. Присутствие ГуГХ блокирует фрагментацию прионных полимеров

Гидрохлорид гуанидина обладает уникальной способностью эффективно устранять все известные дрожжевые прионы (Сох et al., 1988). Показано, что это связано со способностью ГуГХ специфически ингибировать активность Hspl04 (Ferreira et al., 2001). Согласно нашей модели, иигибировапие Hspl04 должно нарушить фрагментацию полимеров, что приведет к возрастанию размера полимеров. Чтобы проверить это предположение, клетки [PSf] растили в течение нескольких поколений в жидкой среде YPD, содержащей ЗмМ ГуГХ. Через каждое клеточное поколение половину объема культуры забирали для анализа и замещали равным объемом свежей среды с ГуГХ, так что плотность культуры в течение эксперимента оставалась примерно постоянной. После трех поколений в среде с ГуГХ клетки были перенесены в среду YPD без ГуГХ и их отбирали для анализа каждый час. Анализ клеточных лизатов ДСН-агарозным электрофорезом показал, что в присутствии ГуГХ средний размер полимеров Sup35 возрастал почти в 2 раза за поколение (рис. 8.3). Такой быстрый рост полимеров возможен лишь при одновременном соблюдении двух

условий: полное блокирование их фрагментации и полное включение мономеров Sup35 в полимеры. Последнее приблизительно верно для дан-ных клеток в норме и в течение двух поколений в присутствии ГуГХ. При соблюдении названных условий общее количество полимеров Sup35 в культуре не изменяется, а число клеток и количество Sup35 за удваивается поколение. Значит, среднее количество молекул Sup35 на полимер должно удвоиться. Соответствие результата этому предсказанию указывает, что ГуГХ полностью и сразу блокирует фрагментацию прионных полимеров.

<■ Старт

кДа г 4200

Е-740

Ipf^ll:'

1.0 1.9 3.9 7.1 4.5 1.3 1 1 0 12 3 12 3

Поколения на ГуГХ

Часы после ГуГХ

<-205 ^.Sup35 мономер

Размер

полимеров

Sup35

Рисунок 8.3. Влияние ГуГХ на размер полимеров 8ир35. Клетки 5У-Н19 [Р57*"] выращивали в течение 3 поколений в присутствии 3 мМ ГуГХ и затем 3 часа в отсутствие ГуГХ. Лизаты анализировали ДСН-агарозным электрофорезом с иммуноокрашиванием белка Бир35. Указан средний размер прионных полимеров Бир35 относительно исходного

8.4. Уменьшение уровня Шр104 увеличивает размер прионных полимеров

Мишенью ГуГХ является шаперон Hspl04, необходимый для поддержания [Р^] Ferreira et al., 2001). Поэтому далее мы проверили влияние уменьшения уровня Hspl04 на размер полимеров Sup35. Для этого мы заменили промотор гена HSP104 на регулируемый ТЕТ промотор (Belli et al., 1998), что позволило ингибировать синтез Hspl04 добавлением в среду 5 мкг/мл доксициклина. Однако уменьшение уровня Hspl04 не было быстрым (рис. 8.4), поскольку Hspl04 почти не деградирует и лишь разводится в клеточных делениях. Клетки отбирали через каждое поколение роста в присутствии доксициклина. Размер полимеров Sup35 возрастал постепенно, и через

<Старт

кДа •<4200

12 3 4

Поколения

6 поколений увеличился в 4 раза (рис, 8.4). Более медленный рост, чем в эксперименте с ГуГХ, можно связать с медленным уменьшением уровня Hspl04. Полученные данные подтверждают ключевую роль Hspl 04 во фрагментации прионных полимеров.

Рисунок 8.4. Уменьшение уровня шаперона Hspl04 приводит к увеличению размера полимеров Sup35. В

штамме 5V-H19 [/"¿V4] хромосомный ген HSP104 был поставлен под контроль ТЕТ промотора. Продукцию Hspl04 репрессировали добавлением в среду доксициклина в течение указанного числа поколений. Лизаты анализировали ДСП-агарозным электрофорезом с окрашиванием блота по Sup35. Указан уровень белка Hspl04 относительно нормы.

8.5. Увеличение уровня Hspl04 уменьшает размер прионных агрегатов при увеличении или сохранении размера прионных полимеров

Согласно нашим представлениям о функции Hspl04, увеличение уровня Hspl04 должно вызывать уменьшение размера агрегатов и полимеров Sup35, и увеличение количества его мономера. Мы подтвердили, что сверхпродукция Hspl04 в клетках с сильным [PSf] уменьшает размер прионных агрегатов Sup35 и увеличивает уровень его мономера (рис. 8.5).

moho _ оса Рисунок 8.5. Сверхпродукция Hspl04 уменьшает размер

меры *док прионных агрегатов Sup35. Лизаты клеток 5V-H19 [PSI*] без

> I;, (1х) или с многокопийной плазмидой (ЗОх), кодирующей

с „ .п. Hspl04, фракционировали центрифугированием в градиенте

SUP-" íispiiw _____л™,„,„--------------ПГ-U ПЛ ЛГ5.

^ mm> ** ЗОх

сахарозы. Фракции анализировали ДСН-ПААГЭ с иммуноокрашиванием Sup35.

< Старт

Однако анализ полимеров показал, что избыток Нзр104 значительно увеличивает размер полимеров 8ир35 в [ТО/4] клетках и не влияет на размер полимеров гибридного 8ир35Р8 [Р8ГР5] (рис. 8.6). Этот результат кажется парадоксальным в

рамках нашей модели. Нам представляется наиболее вероятным следующее объяснение. Полимеры 8ир35 могут различаться по степени доступности для Н8р104. Некоторые из них, находясь в комплексе с другими макромолекулами, лучше защищены от действия Н8р104. При избытке Нзр104 наименее

Рисунок 8.6. Сверхпродукция Н$р104 увеличивает размер полимеров 8ир35 и не влияет на размер полимеров 8ир35Р8. Клетки с указанными "сильными" ^205 вариантами приона имели ген Н5Р104 либо только в

^мономер хромосоме (1), либо еще и на многокопийной плазмиде (М). НзрКМ Лизаты анализировали ДСН-агарозным электрофорезом с ^ рз А ^ иммуноокрашиванием 5ир35.

защищенные полимеры будут растворены, в результате чего образуется значительное количество мономерного Sup35, наблюдаемое экспериментально В этих условиях "защищенные" полимеры будут ускоренно расти, поскольку обычно рост полимеров сдерживается недостатком мономера Sup35

Данные наблюдения показывают, что прионные полимеры и агрегаты представляют собой две относительно независимые категории их размер, а значит и количество, коррелируют не всегда. При этом количество полимеров определяет эффективность полимеризации, а число агрегатов - стабильность наследования приона.

Резюме. Установлено, что прионные агрегаты Sup35 состоят из малых полимеров Sup35 и ассоциированных неприонных молекул Показано, что Hspl04 фрагментирует полимеры Sup35 и фрагментация блокируется в присутствии ГуГХ Полимеры Sup35 в различных вариантах [PS/] различаются по размеру, что связано с разной эффективностью их фрагментации и определяет отличия в уровне мономерного Sup35 и эффективности нонсенс супрессии

9. НЕПРИОННЫЕ АМИЛОИДЫ БЕЛКА SUP35

9.1. Полимеры Sup35, возникающие при его сверхпродукции

Целью данной части работы был поиск нестандартных вариантов [PSt] и изучение их свойств Вариация свойств [/>5'/+], видимо, определяется существованием различных полимерных укладок Sup35 Мы предполагали, что не всякая допустимая т vitro полимерная укладка Sup35 может наследоваться in vivo подобно [PS/], и набор наследуемых укладок зависит от уровня синтеза Sup35 Так, сверхпродукция Sup35 в [PS/] клетках приводит к сильному ингибированию их роста, вероятно, вследствие нарушения терминации трансляции Уменьшение уровня Sup35 может приводить к утрате [PS/] [наши неопубликованные данные и теоретический расчет (Tanaka et al, 2006)] Поэтому мы предположили, что [PS-/]-подобные детерминанты, могущие существовать при сверхпродукции Sup35, будут отличаться от известных вариантов [PS/], и решили изучить их свойства, в том числе и их поведение при нормализации уровня Sup35

Кроме того, мы хотели понять причину нонсенс-супрессорного фенотипа, возникающего при сверхпродукции Sup35 (Chernoff et al, 1992) Этот эффект парадоксален, поскольку обычно супрессия связана с уменьшением функциональной активности белка Sup35 вследствие мутаций, недостаточного уровня синтеза или перехода в прионное состояние Супрессия при сверхпродукции Sup35, так же, как и возникновение [PS1/], требуют присутствия приона [Р//А соответствующего прионной форме белка Rnql Этот белок похож по аминокислотному составу на N домен Sup35, и было предположено, что полимеры Rnql способны с малой частотой инициировать прионную полимеризацию Sup35 (Derkatch et al, 2001) В отличие от [PS/], нонсенс супрессия при сверхпродукции Sup35 возникает у гораздо большей доли клеток и отличается от [PS/] по условиям, требуемым для ее поддержания

(Табл 9 1) Все это позволило предположить, что супрессия при сверхпродукции 8ир35 связана с возникновением необычных вариантов [Л?/*]

Таблица 91. Сравнение условий возникновения и поддержания [ЛУ/*] и супрессорного фенотипа при сверхпродукции (|) 8ир35.

Супрессорный фенотип при сверхпродукции Sup35 [Р5Г]

Возникновение Необходимы [PIN*]*, TSup35 Необходимы [PIN*], TSup35

Поддержание Необходимы [PIN*]*, TSup35 Несовместимо со |Sup35

Частота возникновения Очень высокая Очень низкая

*Определено в данной работе

Чтобы изучить свойства амилоидных полимеров Sup35, возникающих при его сверхпродукции, в клетки \psi~\lPIbt] ввели многокопийные плазмиды, несущие либо ген SUP35, либо SUP35NM-GFP (кодирует район NM белка Sup35, сшитый с зеленым флуоресцирующим белком) либо контрольный вектор без SUP35 Сверхпродукция Sup35 и Sup35NM-GFP не влияла на терминацию трансляции цвет колоний на среде с аденином был таким же красным, как и у контрольных трансформантов (рис 9 1) Однако на среде, не содержащей аденина, росли лишь клетки [PIhí\, сверх-продуцирующие Sup35 или Sup35NM-GFP, что указывает на супрессию нонсенс мутации adel-I4 (UGA)

Несмотря на отсутствие супрессорного фенотипа на среде с аденином, анализ лизатов клеток, сверхпродуцирующих Sup35, ДСН-агарозным электрофорезом обнаружил в них полимеры Sup35 устойчивые к ДСН (рис 9 2) Можно предполагать амилоидную природу этих полимеров, поскольку нерастворимость в ДСН при комнатной температуре является характерным свойством прионных частиц Sup35 из дрожжевых лизатов (Гл 7) и амилоидных фибрилл Sup35, полученных т vitro (Seno etal, 2000)

Обнаруженные полимеры Sup35 по размеру намного превосходили прионные полимеры Sup35 из клеток [PS1/] Это указывает на плохую фрагментацию этих полимеров и, вследствие малого количества полимеров, должно приводить к сниженной стабильности их наследования и уменьшенной эффективности полимеризации Sup35 Наличие агрегатов Sup35 было также подтверждено анализом седиментации Sup35 при центрифугировании и флуоресценцией гибридного белка Sup35NM-GFP (рис 9 3) Амилоидная природа агрегатов была подтверждена и их способностью инициировать полимеризацию Sup35 in vitro

Чтобы оценить эффективность полимеризации Sup35, мы определили количество общего и растворимого Sup35 в штамме [psí][PIN*] при сверхпродукции Sup35 и в норме Растворимый Sup35 определяли ДСН-ПААГЭ без кипячения образцов Оказалось, что количества растворимого и общего Sup35 при его сверхпродукции превышали такие количества в норме в 3 раза и 20 раз соответственно Таким образом, 15% (3/20) белка Sup35 в клетках таких трансформантов находилось в растворимой форме, а 85% - в полимерной Выявленное количество мономера Sup35

достаточно для эффективной терминации трансляции, что объясняет отсутствие супрессорного фенотипа у клеток, и что было подтверждено прямым измерением эффективности прочтения нонсенс-кодонов.

-Leu+Ade -Leu-Ade

[PIN] Сверх продукция + контроль

. Sup35

+ Sup35

+ Sup35NM-eGFP

Рисунок 9.1. Супрессия мутации айе1-14 при сверхпродукции 8ир35 в клетках [рл/ЦР/Л'+].

Клетки содержали многокопийные плазмиды, кодирующие указанные белки. Супрессорный фенотип требует [Р/Д^], сверхпродукции ЭирЗэ или Эир35МУ[-СРР и селекции на супрессию (отсутствия аденина). Клетки растили на указанных средах в течение 3 дней при 30°С.

Ч-Старт

кДа

1 2 3

•«-205 4-Sup35 ^ g мономер

Рисунок 9.2. Белок Sup35, сверхпродуцнрованныи в клетках [pvf) [PIN*] образует ДСН-нерастворимые полимеры. Лизаты следующих клеток анализировали ДСН-агарозным форезом с последующим иммуно-окрашиванием блота по Sup35. (1) [PSF]\ (2) [pjf] [PIN*]; (3)-(5), клетки, содержащие мультикопийную плазмиду YEplacl81-SUP35. Генотипы клеток: (3) [psf] [Р/ЛЛ]; (4) [psr] [piri]; (5) [pst] Arnql (делеция гена RN01 в клетках, соответствующих дорожке 3).

Возникновение прионных полимеров Sup35 зависит от присутствия приона [Р/Л^] (Derkatch et al., 1997). Мы проверили, зависят ли полимеры сверхпродуци-рованного Sup35 от Для этого в штаммах \psi'][PIN] и \psf][pin]

сверхпродуцировали Sup35 или Sup35NM-GFP. Оказалось, что только [PIN*] клетки содержали ДСН-устойчивые полимеры Sup35 (рис. 9.2) и агрегаты Sup35NM-GFP (наблюдаемые в виде зеленых светящихся точек или пятен, рис. 9.3). Следовательно, возникновение полимерного состояния Sup35 зависит от [РЖ*]. Кроме того, поддержание этих полимеров, в отличие от [PST] полимеров Sup35 также зависело от [PIN*]. Они исчезали при устранении [PIN*] делегированием гена RNQ1, что было показано ДСН-агарозным форезом (рис. 9.2) и флуоресцентной микроскопией (рис. 9.3).

Зависимость поддержания полимеров сверхпродуцированного Sup35 от [Р/Л^] допускает единственное объяснение: эти полимеры существуют за счет их постоянного и высокоэффективного возникновения de novo на матрице прионных полимеров Rnql. Размножение этих полимеров путем фрагментации шапероном Hspl04 либо не происходит, либо происходит недостаточно эффективно для их наследования в клеточных поколениях. Такая неспособность к наследованию дает основание относить эти амилоидные полимеры к неприонному типу.

Л Б В

[Р1Щ У^ \pin-] ^А àmql

Рисунок 9.3. Сверхпродуцированный белок Sup35NM-GFP образует агрегаты в [Р/ЛГ] клетках. Фотографии клеток, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа. (А, Б) Клетки [рн~] с указанным [Р/Л] статусом ([PIN*], \pin~]) были трансформированы многокопийной плазмидой YEplacl81-Sup35NM-GFP. Агрегация белка (появление светящихся точек), видна только в клетках [WA^]. (В) В клетках представленных в панели (А) была сделана делеция гена RNOL что вызвало потерю [/W]. При этом агрегация Sup35NM-GFP исчезала, о чем свидетельствует диффузное свечение.

Таким образом, мы впервые показали, что один и тот же белок (в данном случае Sup35) способен образовывать амилоидные полимеры как прионного, так и неприонного типа. При этом неприонные полимеры образуются с гораздо более высокой частотой.

9.2. Полимеры Sup35 содержат белок Rnql

Зависимость полимеризации сверхпродуцированного Sup35 от ¡PIN'' ] указывает на инициацию полимеризации Sup35 полимерами Rnql. Чтобы подтвердить эту гипотезу, мы предприняли поиск белка Rnql в составе полимеров Sup35, образующихся in vivo. Для этого нам потребовалось разработать метод аффинного выделения амилоидных полимеров Sup35 из лизатов клеток дрожжей.

Мы предположили, что гетерополимеры Rnql и Sup35 так же устойчивы к ДСН, как и гомополимеры этих белков, что впоследствии подтвердилось. Очистку полимеров проводили в два этапа: сначала выделяли ДСН-нерастворимую фракцию, используя центрифугирование (Kushnirov et al., 2006), затем из этой фракции выделяли полимеры Sup35, используя аффинную метку (тэг). Второй этап особенно критичен, поскольку разделение полимеров требует присутствия ДСН, который препятствует большинству аффинных белковых взаимодействий. Мы использовали гексагистидиновый тэг, который, по утверждению производителя (Clontech), совместим с низкими (<1%) концентрациями ДСН.

В штамме [PIN*], содержащем хромосомный аллель SUP35-C., кодирующий только С-домен Sup35, неспособный к полимеризации, были сверхпродуцированы и образовали полимеры белки Sup35NM-His6 с гексагистидиновой меткой на С-конце и Sup35NM-GFP. Sup35NM-GFP был необходим для визуального контроля выделения полимеров Sup35. В контрольных клетках продуцировали только Sup35NM-GFP. Совокупная фракция амилоидных полимеров, содержащая и полимеры Sup35, была выделена из дрожжевых лизатов путем ультрацентрифугирования в присутствии 2% ДСН. Из этого препарата выделили полимеры Sup35 путем аффинной хроматографии на хелатной смоле "Talon" в присутствии 0,1% ДСН.

Рисунок 9.4. Присутствие в полимерах Л!ир35.

Полимеры Бир35 выделили, как описано в тексте и анализировали ДСН-ПААГЭ. Белки и гибриды ЭирЗб были выявлены иммуноблоттингом с соответствующими антителами. Образцы: 1, 2: кополимеры БирЗЗНМ-Нйб И 8ир35ЫМ-ОРР (2: нагрузка 1/5); 3,4: контроль: выделение полимеров 8ир351ЧМ-СРР в отсутствие 8ир35НМ-№Зб; 5-7: исходные клеточные лизаты, последовательное 5-кратное разведение.

Чтобы определить содержание белка полимеры 8ир35 анализировали с

помощью ДСН-ПААГЭ. Иммуноблоттинг и сопутствующий расчет показали, что полимеры 8ир35 содержали примерно 1/5 от общего количества Япя1 в клетке (рис. 9.4). Высокое содержание Ктк]1 в составе полимеров 8ир35 подтверждает гипотезу прямой инициации полимеризации 8ир35 прионными полимерами Япц1 и эффективность этого процесса.

9.3. Амилоидная полимеризация 8ир35 является причиной нонсенс супрессии

В клетках [Р1Ы*~\, сверхпродуцирующих 8ир35, нонсенс кодоны прочитываются, но лишь на среде без аденина, селективной для этого. Чтобы понять причину этого явления и его возможную связь с полимерами 8ир35, мы проанализировали состояние 8ир35 в таких клетках при их росте в присутствии и в отсутствие аденина. Размер полимеров 8ир35 значительно уменьшался в отсутствие аденина, и возвращался почти к исходной величине при дальнейшем добавлении аденина в среду (рис. 9.5 А). Уменьшение размера полимеров должно приводить к росту эффективности полимеризации, уменьшению количества растворимого 8ир35 и нонсенс супрессии. Действительно, количество растворимого 8ир35 существенно уменьшалось при росте

Рисунок 9.S. Нонсенс супрессия в клетках [psf] [PIN*] сверхпродуцирующих Sup35 связана с уменьшением размера полимеров Sup35 и уменьшением количества его мономеров.

(А) Анализ размера полимеров Sup35 в ДСН-агарозном геле. Ютетки [/«f] [PIN*], сверхпродуци-рующие Sup35, выращивали на среде, селективной для поддержания плазмиды, которая содержала (1) или не содержала (2) аденин. Клетки (2) возвращали в среду, селективную для плазмиды, но содержащую аденин (3). (Б) Определение количества растворимого Sup35. Клеточные лизаты были выровнены по количеству белка, разведены, как указано, и использованы в ДСН-ПААГЭ без кипячения. (+Ade), наличие аденина в среде; (-Ade), его отсутствие. (А, Б) Белки выявлены иммуноблоттингом с окрашиванием Sup35.

1 2 3 4 5 6 7

Sup35NM-

-eGFP ■+■«•1 «►<—

Sup35NM--His,

Rnq1 -*■ ,

клеток без аденина (рис. 9.5 Б).

Б 12 3

Sup35 -

Разведение: '¿шНлвН/а 1 ш ' {'■'■<1 i/y1 Г}

Среда: +Ade -Ade

Что же вызывает изменение размера полимеров в зависимости от наличия аденина в среде1? Как мы заключили, в данных клетках происходит постоянное и эффективное возникновение новых полимеров Sup35, инициированное прионом Rnql Можно предполагать, что возникающие полимеры различаются по эффективности их фрагментации, причем общая тенденция в ряду полимеров Sup35 такова, что чем более эффективна фрагментация, тем реже возникает соответствующий полимер При росте в отсутствие аденина отбирались клетки с более фрагментируемыми полимерами, обеспечивающими более эффективную полимеризацию, меньшее количество мономерного Sup35 и ослабление терминации трансляции При возвращении клеток на среду с аденином размер полимеров возвращался к норме Это означает, что, несмотря на уменьшенный размер, большинство из полимеров, наблюдаемых в отсутствие аденина, были неласледуемы В неселективных условиях происходило их замещение более крупными полимерами, возникающими чаще

9.4. Сравнение прионных и амилоидных полимеров

Мы показали, что белок Sup35 дает полный спектр амилоидных полимеров in vivo от хорошо фрагментируемых (прионов) до почти не фрагментаруемых Эти две крайние категории отличаются по своим ключевым свойствам так же, как прионы и амилоиды человека Получение для одного белка этих двух категорий полимеров является убедительным аргументом в пользу общей природы прионов и амилоидов Сейчас сходство их природы признано большинством исследователей, однако до последнего времени оно часто оспаривалась (Prusiner et al, 1998)

Амилоиды, как и прионы, обладают способностью к автокаталитическому структурному превращению, необходимому для инфекционное™ у человека и животных Однако лишь прионы обладают инфекционностью, и четкие объяснения этому отсутствуют Почему же амилоиды неинфекционны7 Конечно, некоторые амилоиды существуют внутри клеток, и потому не способны перемещаться в качестве инфекционного агента по организму Таковы, например, амилоиды, связанные с болезнями Паркинсона и Гентингтона. Но большинство амилоидов локализуются во внеклеточном пространстве, и их распространение ограничено какими-то иными причинами В значительной мере это связано с большим размером амилоидов в сравнении с прионами Прионные полимеры PrPSc малы (Silveira et al, 2005), что указывает на их эффективную фрагментацию Это проявляется и в их пониженной склонности образовывать нерастворимые отложения, "бляшки", часто отсутствующие при болезни Крейцфельдта-Якоба. При амилоидных же болезнях всегда очевидны бляшки-отложения, что свидетельствует о большом размере и плохой фрагментации амилоидных полимеров С большим размером связаны малая подвижность и низкая растворимость этих полимеров, что является одной из причин, препятствующих их распространению Другой, и более принципиальной причиной, является то, что в отсутствие фрагментации не происходит размножения полимеров, как потенциально инфекционных частиц Эти причины характерны и для нефрагментируемых полимеров Sup35 в дрожжах и объясняют их ненаследуемость

В дрожжах мы наблюдали два механизма возникновения полимеров Sup35 размножение для полимеров с прионными свойствами, и частое возникновение de novo для ненаследуемых амилоидов Аналогичные механизмы можно предполагать и у человека Для накопления в значительных количествах полимеры должны либо размножаться и перемещаться (прионный механизм), либо эффективно возникать de novo (неинфекционные амилоиды) Амилоидные болезни обычно возникают в зрелом и старческом возрасте Они связаны со снижением способности организма удалять неправильно свернутые белки и их полимеры, вероятно, вследствие возрастного снижения активности шаперонов При высокой активности шаперонов организм невозможно инфицировать амилоидными полимерами, поскольку они удаляются быстрее, чем возникают При низкой активности шаперонов такая инфекция будет малозаметна, поскольку в организме уже возникают собственные амилоиды Таким образом, лимитирующим фактором в амилоидном механизме является активность шаперонов, а в прионном - наличие затравки, первой прионной частицы

Резюме. Показано, что прионные полимеры Rnql инициируют амилоидную полимеризацию Sup35, однако большинство возникающих полимеров не наследуются вследствие плохой фрагментации шапероном Hspl04 Такие полимеры являются причиной нонсенс супрессии в |/wfj [PIN*] клетках сверхпродуцирующих Sup35

10. СВОЙСТВА ПОЛИМЕРОВ НА ОСНОВЕ ПОЛИГЛУТАМИНА: ЧАСТОТА ФРАГМЕНТАЦИИ ОПРЕДЕЛЯЕТСЯ ГИДРОФОБНЫМИ АМИНОКИСЛОТНЫМИ ОСТАТКАМИ

10.1. Создание плазмид, кодирующих полиглутамиковые белки

В предварительных экспериментах мы обнаружили, что химерный белок, содержащий фрагмент из 66 остатков глутамина, сшитый с МС доменами Sup35, полимеризуется т vivo, но эти полимеры не поддерживаются в качестве прионов вследствие их плохой фрагментации шапероном Hspl04, подобно неприонным полимерам сверхпродуцировашгого Sup35 (Гл 9) Однако, в отличие от Sup35, у такого белка не возникало прионных вариантов Мы задались вопросом, что определяет плохую фрагментацию полимеров этого белка и частоту фрагментации в общем случае^

Принято полагать, что шапероны узнают белки по наличию экспонированных гидрофобных остатков Такие остатки обычно уложены внутрь белковой структуры, и их экспонирование является сигналом (вероятно, единственно возможным), указывающим на неправильную укладку молекулы Мы предположили, что плохое узнавание полиглутаминовых полимеров шапероном Hspl04 связано с тем, что глутамин не гидрофобен Распознавание и фрагментация были бы улучшены при добавлении в полиглутаминовый фрагмент гидрофобных аминокислотных остатков Таким остатком может быть, например, тирозин, обильно представленный в прионном домене Sup35 из разных видов дрожжей

Для проверки этого предположения мы сравнили свойства полиглутаминовых (поли(}) и полиглутамин-тирозиновых (полиОУ) полимеризационных доменов Были сконструированы две серии плазмид, кодирующих гибриды таких доменов 32

с неприонными М и С доменами белка Sup35. В каждой серии белки отличались длиной полиглутамин/тирозинового тракта и были названы nQ или nQY, где п соответствует длине тракта. Для конструирования таких плазмид была разработана специальная стратегия: области ДНК, кодирующие полиглутамин/тирозин собирали из повторяющихся олигонуклеотидных дуплексов, кодирующих QQQQQ или QQQYQ; и концевых дуплексов, содержащих начало трансляции и сайты рестрикции. Дополнительной задачей работы было изучение полимеризации полиглутаминовых белков в зависимости от длины тракта и некоторых клеточных факторов. Этот интерес связан тем, что удлинение поли(3 трактов в некоторых белках человека является причиной амилоидных болезней, например, болезни Гентингтона.

10.2. Полиглутаминовые белки способны полимеризоваться in vivo

Плазмиды, кодирующие tomhQ/QY белки, ввели в штамм [PIN*], содержащий хромосомную делецию SUP35 и ген SUP35-C на плазмиде; затем резидентную плазмиду потеряли. Некоторые трансформанты проявили супрессорный фенотип: имели розовый цвет и росли в отсутствие аденина. Это коррелировало со сниженным уровнем растворимого гибридного белка (рис. 10.1 Б, В), что подтверждает, что супрессия была следствием полимеризации iiojihQ/QY белков, а не иных причин.

(254)

(685)

полиО: MSG-(QQQQQ)m-QSQGA полиОУ: MSG-(QQQYQ)m-QSQGA

а 25 45 51 56 65 70 85 131

б шшшг

ypd red

■ . i'.. :

aaaaaaaavjifcfcí;

ююгошойт-СЮООО

(4<»lí)<ONnOoiCOIOO т-« ю ем

ааааааа>->->->->-

ю ш т- (о ш о V- О О О О О 0(00(00 п ОТ Г- CJ

Рисунок 10.1. Пслямеризацвя белков hoiihQ/QY в клетках [PIN*].

(А) Доменная структура белков i^HQ/QY-Sup35MC. (Б, В, Г) Указанные поли(УС)У белки экспрессировали в клетках [PIN*] вместо Sup35. (Б) Фенотип клеток на среде YPD и минимальной среде без аденина. Sup35MC: контроль. Более светлая окраска свидетельствует о более сильной нонсенс- супрессии (В, Г) Лизаты клеток выращенных в среде YPD анализировали электрофорезом. Блоты гелей красили антителами к Sup35NM, выявляющими белки поли<2/(ЗУ. (В) Анализ мономеров в ДСН-ПААГЭ. Образцы не кипятили, чтобы выявить только мономеры полиСУ<ЗУ белков. (Г) Анализ полимеров в ДСН-агарозном геле.

Анализ лизатов трансформантов ДСН-агарозным электрофорезом показал наличие полимеров 51Q, 46QY и белков с более длинными mwmQ/QY трактами (рис. 10.1 Г). В отличие от [PSP] полимеров Sup35, данные полимеры появлялись быстро и без селекции на супрессию. Они присутствовали в самой ранней наблюдаемой точке, через 30 поколений после трансформации. Такое время необходимо, чтобы получить из одной клетки биомассу, достаточную для анализа. Размер полимеров был значительно уменьшен у белков серии nonnQY, что указывает на лучшую фрагментацию их полимеров в сравнении с полимерами поли<3, и соответствует нашим исходным предположениям.

10.3. Влияние [PIN*] на появление и поддержание полимеров

Ранее было показано, что полимеризация (Salnikova et al., 2005) и агрегация белков полир (Meriin et al., 2002) требует наличия приона [PIN*]. В данной работе, полимеризация проявляла различную зависимость от наличия [PIN*]. В частности, [Р/А^] ускорял полимеризацию 70Q и 85Q, но не являлся необходимым для нее; в клетках [pin] полимеры отсутствовали после 30 поколений, но появлялись после 100 поколений (рис. 10.2). Зависимость появления полимеров от [PIN*] уменьшалась с удлинением поли(УС)У тракта: небольшое количество полимеров белка 131Q наблюдали в клетках [pin ] и Arnql уже через 30 поколений после трансформации. [PIN*] значительно меньше влиял на tcwhQY белки: полимеризация 50QY частично зависела, а полимеризация 76QY совсем не зависела от него (рис. 10.2).

Рисунок 10.2. Зависимость появления полимеров от ¡P/iV] статуса. Плазмиды, кодирующие белки 70Q, 85Q, 131Q, 50QY и 76 QY ввели в [PIN*], [pin ] и Arnql клетки; трансформантов растили в течение 30 или 100 (*)поколений. Клеточные лизаты анализировали ДСН-агарозным электрофорезом с покраской блота на Sup35NM. [PIN] статус: +, [PIN*]', [pin]; А, Arnql. Указаны стандарты молекулярной массы.

Интересно, что не только [PIN], но и само наличие белка Rnql облегчало появление полимеров полиС?, поскольку они появлялись быстрее в [pin], чем в Arnql клетках. Это наблюдение предполагает взаимодействие, предположительно, кополимеризацию этих белков с Rnql на начальных стадиях появления полимеров.

Появившись, полимеры 70Q и 85Q уже не зависели от [PIN*]. Устранение [PIN*] делецией RNQI в клетках, содержащих эти полимеры, не приводило к их исчезновению (рис. 10.3), что противоречило нашим предварительным данным о поведении полимеров 66Q и результатам других авторов (Meriin et al., 2002). Чтобы

разрешить противоречие, мы сравнили эффекты делеции RN01 на поддержание полимеров белков 51Q, 65Q, 70Q и 85Q. Количество полимеров, наблюдаемых после делеции RNQ1, сильно зависело от длины towihQ участка Полимеры 51Q почти полностью исчезли, а количество полимеров 70Q и 85Q почти не изменилось (рис. 10.ЗА). Таким образом, полимеры поли() белков могут поддерживаться в дрожжах в отсутствие [Р/АЛ], но лишь при длине поли(2 участка не менее 70. Независимое от [PIN ] поддержание полимеров полиО предполагает, что они фрагментируются. хотя и неэффективно. Согласно нашим исходным предположениям, их фрагментация не должна происходить, поскольку поли() не содержит гидрофобных остатков. Это противоречие можно снять предположением, что полиО вовлекает в полимеризацию

глутамин - богатые белки, которые содержат гидрофобные остатки и привлекают фрагменти-рующу ю активность. В поддержку этого предположения, мы наблюдали, что Rnql и Sup35 эффективно кополимеризуются с 70Q и 85Q-

Рисунок 10.3. Влияние делеции гена RNQI на поддержание полимеров поли<2. Указанные белки поли<3 были продуцированы в [PIN*] клетках (+) и образовали полимеры. Затем в этих клетках делетировапи ген RN01 (Д). Клеточные лизаты анализировали ДСН-агарозным электрофорезом с покраской блота на Sup35NM.

10.4. Влияние Hspl04 на поддержание полимеров

Делеция HSPI04 блокировала поддержание полимеров белков 70Q, 85Q и 13IQ (рис. 10.4), хотя небольшое количество полимеров 131Q появлялось после 100 поколений роста. Возвращение HSP104 на центромерной плазмиде pRS313-HSP104 вызывало постепенное восстановление полимеризации, причем полимеризация 85Q восстановилась быстрее, чем полимеризация 70Q. Делеция HSPI04 также нарушала полимеризацию белков поли(}У. Количество полимеров белка 76QY было сильно уменьшено через 30 поколений после делеции (рис. 10.4). Эффективная полимеризация 76QY восстанавливалась к 100-му поколению, но полимеры были значительно больше, чем в присутствии Hspl04. Существование полимеров 76QY в отсутствие Hspl04 может быть связано либо с существованием дополнительной фрагментирующей активности, либо с эффективным возникновением этих полимеров de novo. Но в последнем случае количество полимеров не зависело бы от времени, что противоречит данным рис. 10.4. Таким образом, существует слабая фрагментирую-щая активность, не связанная с HspI04, и достаточная для поддержания некоторых полимеров. Белок 120QY также полимеризовался без Hspl04, a 50QY не образовывал полимеров даже после 100 поколений (данные не приведены), что вероятно связано с малой длиной его nonnQY участка.

+_л + а + д + tí-* [pin]

51Q 65Q 70Q 85Q

Рисунок 10.4. Влинние делении гена HSP104 на полимеризацию белков 76QY, 70Q, 8SQ и 131Q.

[PIN*] клетки трансформировали плазмидами, кодирующими указанные белки В этих клетках ген HSP/04 был делегирован (АН!04), а затем введен обратно на центромерной плазмиде (+Н104). Клеточные лизаты были приготовлены на 30 или 100 (*) поколениях после трансформации и анализированы ДСН-агарозным форезом с покраской блота на Sup35NM.

10.6. Особенности полимеров на основе полиглутамина

В отличие от [PSt] полимеров Sup3S, которые появляются с очень низкой частотой и могут быть получены лишь при селекции клеток на супрессорный фенотип, полимеризация полиС^/С^У белков не требовала селекции. Легкость возникновения полимеров rox™Q/QY вероятно связана с простотой первичной структуры полиС)/0У участков. Предполагается, что в амилоидной структуре Sup35 соседние молекулы расположены как параллельные бета нити, находящиеся "в регистре" (Krishnan and Lindquist, 2005; Ross et al., 2005). Это значит, что аминокислотные остатки с одинаковыми порядковыми номерами расположены друг напротив друга. Однако ограничение по регистру, видимо, неприменимо к однородным поли(^/С)У участкам. Это должно означать большее количество возможных вариантов взаиморасположения соседних молекул и, соответственно, (1) более быстрое возникновение полимеров и (2) неточное копирование исходной амилоидной укладки и ее пластичность, то есть способность к постепенному изменению. В соответствии с этим, нам не удалось обнаружить у изученных поли(3/(ЗУ полимеров наличия стабильных вариантов, отличающихся по размеру полимеров.

10.7. Остатки тирозина улучшают фрагментацию полимеров

Присутствие тирозина в участках полиС) намного уменьшало размер соответствующих полимеров, что указывает на их улучшенную фрагментацию. На первый взгляд можно предположить, что размер полимеров должен зависеть также и от скорости полимеризации. Однако математическая модель прионной полимеризации (Tanaka et al., 2006) позволила нам сделать простой расчет, указывающий на отсутствие такой зависимости (см. Гл. 10 диссертации). Следовательно, улучшенная фрагментация nonnQY полимеров подтверждает наше исходное предположение, что гидрофобные остатки могут распознаваться шапероном Hspl04 и инициировать фрагментацию.

Следует отметить, что гидрофобные остатки обычно укладываются внутрь белковых структур, а для распознавания Hspl04 они должны быть экспонированы на их поверхности Это позволяет предполагать, что различия вариантов полимеров Sup35 по частоте фрагментации определяются разной степенью экспонирования гидрофобных остатков N домена Sup35 Это позволяет объяснить, почему большинство полимеров Sup35, инициируемых прионом [PIN*], плохо фрагментируются (Гл 9) Инициация полимеров Sup35 па матрице полимеров Rnql неспецифична, и потому не способна диктовать экспонированную укладку гидрофобных остатков N домена Sup35 Поэтому предпочтительно возникает укладка, в которой эти остатки спрятаны внутрь полимера и не распознаются Hspl04 Укладки с экспонированными гидрофобными остатками будут возникать тем реже, чем выше доля таких остатков, и это подтверждается нашими наблюдениями Таковы, например, прионные укладки Sup35, возникающие с очень малой частотой

10.9. Значимость результатов для понимания полиглутаминовых болезней

При заболеваниях человека, связанных с удлинением полиглутаминовых участков в некоторых белках, большая длина поли<3 определяет более раннее начало и более быстрое развитие болезни (Landles and Bates, 2004) Результаты данной работы проясняют причины этой зависимости Мы наблюдали, что длинные участки полиС? (>70Q), но не короткие (5IQ, 65Q) обеспечивают полимеризацию в прионном, [PIN*]-независимом режиме Это означает намного более быстрое накопление полимеров, поскольку такие амилоидные частицы размножаются путем фрагментации Кроме того, способность полимеров полир появляться без помощи других полимеров (Rnql) и скорость их появления возрастали с удлинением nonnQ участка. Для болезней человека эти свойства должны означать более раннее появление и более быстрое развитие заболевания при более длинных полиСЗ, что и наблюдается на практике

У дрожжевого Sup35, так же, как и у приона животных PrPSc, первичное возникновение приона является очень редким событием Полимеры поли(} появлялись несравнимо быстрее, чем прионные полимеры Sup35 Это предполагает, что и в человеческих клетках появление полимеров поли(2 будет ограничено не первичным появлением амилоидных частиц, а другими факторами, такими, как способность клетки противодействовать образованию амилоидов

Резюме. Выдвинута и подтверждена гипотеза о том, что способность прионных полимеров к фрагментации требует наличия гидрофобных аминокислотных остатков в полимеризационном домене Охарактеризована зависимость полимеризации белков, содержащих полиглутаминовые фрагменты, от размера этих фрагментов и наличия в них остатков тирозина

выводы

1 Получены генетические и биохимические доказательства того, что детерминант [PS/*] отражает прионное превращение белка Sup35

2 Показаны прионные свойства гибридного белка Sup35 с прионным доменом из дрожжей Р methanolica, что выявило распространенность прионного свойства Sup35 у других видов дрожжей

3 Выявлены клеточные белки, избыток которых может противодействовать поддержанию прионов дрожжей шапероны Ssal, Ssbl (семейство Hsp70), Sisl, Ydjl и Apjl (семейство Hsp40), Stil, транскрипционные факторы Sfll и Ssn8 и рибосомный белок RppO

4 Предложена и доказана модель репликации дрожжевых прионов, основанная на их фрагментации шапероном Hspl04

5 Обнаружено, что прионные полимеры отличаются от прочих клеточных высокомолекулярных комплексов своей нерастворимостью в присутствии сильных ионных детергентов Разработаны новые методы выделения и анализа прионных полимеров

6 Установлено, что прионные агрегаты Sup35 состоят из малых полимеров Sup35 и ассоциированных неприонных молекул

7 Показано, что полимеры Sup35 в различных вариантах [/'S/*] различаются по эффективности их фрагментации шапероном Hspl04, что определяет отличия в размере прионных полимеров, уровне мономерного Sup35 и эффективности нонсенс супрессии

8 Показано, что прионные полимеры Rnql способны инициировать амилоидную полимеризацию Sup35, однако большинство возникающих полимеров не наследуются вследствие плохой фрагментации шапероном Hspl04

9 Установлено, что причиной нонсенс супрессии в [pif] [PIN*] клетках сверх-продуцирующих Sup35 является образование ненаследуемых полимеров Sup35

10 Выдвинута и подтверждена гипотеза о том, что способность прионных полимеров к фрагментации требует наличия гидрофобных аминокислотных остатков в полимеризационном домене

Список статей, опубликованных по теме диссертации

1 Вишневская Л Б , Кушниров В В , Тер-Аванесян М Д Нейродегенеративные амилоидозы дрожжевая модель Молекулярная биология 2007 41 346-354

2 Kushnirov, V V , Salnikova,A В , AIexandrov,I М , and Ter-Avanesyan,M D 2007 Prion and non-prion amyloids a comparison inspired by the yeast Sup35 protein In Protein-based inheritance, Y О Chernoff, ed Landes Bioscience

3 Bagnantsev SN, Kushnirov VV, Liebman SW Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis Methods Enzymol 2006 412 33-48

4 Kushnirov VV, Alexandrov 1M, Mitkevich OV, Shkundina IS, Ter-Avanesyan MD Purification and analysis of prion and amyloid aggregates Methods 2006 39 50-55

5 Shkundina IS, Kushnirov VV, Tuite MF, Ter-Avanesyan MD The Role of the N-Terminal Ologopeptide Repeats of the Yeast Sup35 Prion Protein in Propagation and Transmission of Prion Variants Genetics 2006,172 827-835

6 Salnikova AB, Kryndushkin DS, Smirnov VN, Kushnirov VV, Ter-Avanesyan MD Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids J Biol Chem 2005 280 8808-8812

7 Крындушкин Д С , Александров И М , Кушниров В В , Тер-Аванесян М Д Дрожжи как модель для изучения прионов и амилоидов Росс Физиол Жури Им И М Сеченова 2004 90 645-657

8 Kryndushkin DS, Alexandrov IM, Ter-Avanesyan MD, Kushnirov VV Yeast [PS/4] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hspl04 J Biol Chem 2003 278 49636-49643

9 Kryndushkin DS, Smirnov VN, Ter-Avanesyan MD, Kushnirov VV Increased expression of Hsp40 chaperones, transcriptional factors, and ribosomal protein RppO can cure yeast prions J Biol Chem 2002 277 23702-23708

10 Chacinska A, Szczesniak B, Kochneva-Pervukhova NV, Kushnirov VV, Ter-Avanesyan MD, BogutaM Ssbl chaperone is a [PSt] pnon-curirig factor Curr Genet 2001 39 62-67

11 Kochneva-Pervukhova NV, Chechenova MB, Valouev IA, Kushnirov VV, Smirnov VN, Ter-Avanesyan MD [PSP] prion generation in yeast characterization of the 'strain' difference Yeast 2001 18 489-497

12 Kushnirov VV, Kryndushkin DS, Boguta M, Smirnov VN, Ter-Avanesyan MD Chaperones that cure yeast artificial [PS/4] and their pnon-specific effects Curr Biol 2000 10 1443-1446

13 KushnirovVV Rapid and reliable protein extraction from yeast Yeast 2000 16 857-860

14 Kushnirov VV, Kochneva-Pervukhova NV, Chechenova MB, Frolova NS, Ter-Avanesyan MD Prion properties of the Sup35 protein of yeast Pichia methanoltca EMBOJ 2000 19 324-331

15 Тер-Аванесян M Д, Кушниров В В Прионы инфекционные белки с генетическими свойствами Биохимия 1999 64 1382-1390

16 Kochneva-Pervukhova NV, Paushkin SV, Kushnirov VV, Cox BS, Tuite MF, Ter-Avanesyan MD Mechanism of inhibition of [PSt] prion determinant propagation by a mutation of the N-termmus of the yeast Sup35 protein EMBOJ 1998 17 5805-5810

17 Kushnirov VV, Ter-Avanesyan MD Structure and replication of yeast prions Cell 1998 94 13-16

18 Тер-Аванесян M Д, Паушкип С В , Кушниров В В, Кочнева-Первухова Н В Молекулярные механизмы "белковой наследственности" прионы дрожжей Мол Биология 1998 32 32-42

19 Paushkin SV, Kushnirov VV, Smirnov VN, Ter-Avanesyan MD In vitro propagation of the pnon-hke state of yeast Sup35 protein Science 1997 277 381-383

Дагкесаманская А Р , Кушниров В В , Паушкин С В , Тер-Аванесяи М Д Присоединение глутатион S-трансферазы к N-концу дрожжевого белка Sup35p ингибирует его прионо-подобные свойства Генетика 1997 33 610-615

Stansfield I, Kushnirov VV, Jones KM, Tuite MF A conditional-lethal translation termination defect in a sup45 mutant of the yeast Saccharomyces cerevisiae EurJBiochem 1997 245 557-563

Paushkin SV, Kushnirov VV, Smirnov VN, Ter-Avanesyan MD Interaction between yeast Sup45p (eRFl) and Sup35p (eRF3) polypeptide chain release factors implications for pnon-dependent regulation Mol Cell Biol 1997 17 2798-2805

Derkatch IL, Chernoff YO, Kushnirov VV, Inge-Vechtomov SG, Liebman SW Genesis and variability of [PST*] prion factors in Saccharomyces cerevistae Genetics 1996 144 13751386

Paushkin SV, Kushnirov VV, Smirnov VN, Ter-Avanesyan MD Propagation of the yeast prion-hke f/WP] determinant is mediated by oligomerization of the •S'WJj-encoded polypeptide chain release factor EMBOJ 1996 15 3127-3134

Stansfield I, Jones KM, Kushnirov VV, Dagkesamanskaya AR, Poznyakovski AI, Paushkin SV, Nierras CR, Cox BS, Ter-Avanesyan MD, Tuite MF The products of the SUP45 (eRFl) and SUP35 genes interact to mediate translation termination in Saccharomyces cerevisiae EMBO J 1995 14 4365-4373

Кушниров В В , Тер-Аванесян М Д, Смирнов В Н Структура и функциональное сходство дрожжевых белков Sup35 и Ure2 с прионами млекопитающих Мол Биология 1995 29 750-755

Ter-Avanesyan MD, Dagkesamanskaya AR, Kushnirov VV, Smirnov VN The SUP35 omnipotent suppressor gene is involved m the maintenance of the non-Mendelian determinant [PSP] m the yeast Saccharomyces cerevisiae Genetics 1994 137 671-676 Ter-Avanesyan MD, Kushnirov VV, Dagkesamanskaya AR, Didichenko SA, Chernoff YO, Inge-Vechtomov SG, Smirnov VN Deletion analysis of the SUP35 gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae reveals two non-overlapping functional regions in the encoded protein Mol Microbiol 1993 7 683-692

Kushnirov VV, Ter-Avanesyan MD, Didichenko SA, Smirnov VN, Chernoff YO, Derkach IL, Novikova ON, Inge-Vechtomov SG, Neistat MA, Tolstorukov II Divergence and conservation of SUP2 {SUP35) gene of yeast Pichia pinus and Saccharomyces cerevisiae Yeast 1990 6 461-472

Кушниров В В , Тер-Аванесян М Д, Дагкесаманская А Р, Чернов Ю О, Инге-Вечтомов С Г, Смирнов В Н Делеционный анализ гена SUP2 (SUP35) дрожжей Saccharomyces cerevisiae Мол Биология 1990 24 1037-1041

Кушниров В В , Тер-Аванесян М Д, Смирнов В Н , Чернов Ю О , Деркач И Л , Новикова О Н, Инге-Вечтомов С Г, Нейстат М А, Толсторуков И И Сравнительный анализ структуры генов SUP2 (SUP35) дрожжей Pichia pinus и Saccharomyces cerevisiae Мол Биология 1990 24 1024-1036

Kushnirov VV, Ter-Avanesyan MD, Telckov MV, Surguchov AP, Smirnov VN, Inge-Vechtomov SG Nucleotide sequence of the SUP2 (SUP35) gene of Saccharomyces cerevisiae Gene 1988 66 45-54

Kushnirov VV, Ter-Avanesyan MD, Surguchov AP, Smirnov VN, Inge-Vechtomov SG Localization of possible functional domains in SUP2 gene product of the yeast Saccharomyces cerevisiae FEBS Lett 1987 215 257-260

БЛАГОДАРНОСТИ

Хочу выразить глубокую благодарность Михаилу Давидовичу Тер-Аванесяну, моему научному консультанту, постоянному соавтору и руководителю Представленная работа была сделана при его активнейшем участии, как в экспериментальной, так и в литературной части Я также весьма благодарен всем моим соавторам по данной работе коллегам, аспирантам и студентам С В Паушкину, ДС Крындушкину, А Б Вишневской, ИМ Александрову, И С Шкундиной, А Р Дагкесаманской, С А Дидиченко, Н В Кочневой-Первуховой, М Б Чеченовой^^В Нарышкс^^ и Н С Фроловой Я очень благодарен А В Воротникову, который предложил маркеры массы для ДСН-агарозного электрофореза и помог их приготовить, МО Агафонову и О В Митькевич за множество полезных советов при выполнении и написании работы Я глубоко признателен проф М F Tuite (Кентербери, Великобритания) за длительное и полезное сотрудничество Работа была выполнена при щедрой многолетней поддержке фонда the Wellcome Trust (Великобритания)

Подписано в печать 30 04 2008 Формат 60x88 1/16 Объем 2 75 п л Тираж 100 экз Заказ № 719 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г Москва, Ленинские горы, д 1 Главное здание МГУ, к А-102

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Кушниров, Виталий Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. СВОЙСТВА АМИЛОИДОВ, ИХ РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ И РОЛЬ В ПРИРОДЕ (Обзор литературы).

1.1. Общие свойства амилоидных полимеров.

1.2. Роль амилоидных полимеров в природе.

1.2.1. Амилоидозы.

1.2.2. Инфекционные амилоиды (прионы).

1.2.3. Непатогенные амилоиды млекопитающих.

1.2.4. Структурные и внеклеточные амилоиды.

1.2.5. Прионы низших эукариот: генетические элементы с необычными свойствами.

1.2.5.1. Нонсенс-супрессорный детерминант [PSf ].

1.2.5.2. Детерминант [URE3]: регуляция метаболизма азота.

1.2.5.3. Детерминант [Р/Л/*]: помощь возникновению других прионов.

1.2.5.4. Белки дрожжей, способные полимеризоваться.

1.2.5.5. [S^]: транскрипционный фактор Swil.

1.2.5.6. Детерминанты [7£Р+] и [cif\.

1.2.5.7. Детерминант [Het-S] гриба P. anserina.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Прионные и неприонные амилоиды: изучение в дрожжевой модели"

Некоторые белки человека и животных, растворимые в норме, могут иногда полимеризоваться и накапливаться в виде внутри- или внеклеточных агрегатов или бляшек, что приводит к болезни. У человека известно более 30 белков, образующих такие агрегаты, называемые амилоидами. Амилоидные болезни, или амилоидозы, не поддаются лечению. Они широко распространены, и их встречаемость возрастает с увеличением возраста. К их числу относятся, в частности, болезни Альцгеймера и Паркинсона. Амилоидозы в большинстве случаев неинфекционны, за исключением прионных болезней, связанных с белком РгР.

Агрегаты РгР представляют уникальный пример инфекционного агента без генетической программы в виде ДНК или РНК. Прионные болезни редки, однако недавняя эпизоотия губчатой энцефалопатии коров в Великобритании нанесла многомиллиарный урон экономике, и поставила под угрозу жизни людей в связи с опасностью передачи этого заболевания человеку при употреблении в пищу говядины.

Амилоиды не всегда связаны с болезнью и присутствуют не только у млекопитающих. Имеются данные, что образование амилоидов белком СРЕВ может составлять основу долговременной памяти. Амилоидные полимеры белка Рше117 образуют матрицу для полимеризации предшественника меланина, защищающего клетки от ультрафиолетового излучения. Некоторые исследователи предполагают, что амилоидный переход каких-то белков фиксирует схемы экспрессии генов при дифференцировке клеток. Образование амилоидов связано со старением, но может быть и одной из его причин.

Амилоидные полимеры присутствуют во внеклеточной оболочке у многих бактерий и грибов. Они играют важную роль, обеспечивая как жесткость этой оболочки, так и желаемые адгезивные свойства поверхности микроорганизмов. Так, амилоидные полимеры белков харпинов помогают бактериям ХаШотопаз проникать в межклеточное пространство растений и вызывать гибель их клеток.

Более 10 лет назад прионная гипотеза была использована для объяснения необычных генетических свойств детерминантов [Р5/1"] и \URE3] дрожжей Басскаготусея сегеугягае. Было предположено, что эти детерминанты отражают переход в прионную форму белков БирЗб и Иге2, соответственно. Это предположение, основанное на генетических данных, нуждалось в биохимических доказательствах. Получение таких доказательств для [,Р57+] явилось первой частью представленной работы.

Следует отметить, что [РЗТ^] и [иЛЕЗ] не снижают жизнеспособность клеток дрожжей и могут считаться потенциально полезными. Эти детерминанты явились первыми примерами нового явления - зависимости фенотипа от наследуемого изменения структуры белка, а не от нуклеиновой кислоты. Поэтому представляло интерес изучить механизмы этого явления, чему посвящена оставшаяся часть работы. Дрожжи оказались весьма удобны для изучения прионов благодаря простоте и скорости генетических и генно-инженерных манипуляций, удобству биохимического анализа. Кроме того, в отличие от прионов животных, прионы дрожжей безопасныдля исследователя. Это позволило нам не только охарактеризовать природу прионных детерминантов дрожжей, но и сделать выводы, касающиеся прионного и амилоидного явлений в целом.

Дальнейшее развитие исследований прионов и амилоидов имеет важные общебиологические и медицинские перспективы. В будущем следует ожидать обнаружения новых механизмов связанных с амилоидами у самых разных организмов. Вероятна разработка способов борьбы с амилоидными и прионными болезнями, которые пока являются неизлечимыми. Одной из возможных стратегий лечения таких болезней является повышения уровня некоторых белков-шаперонов. Поиску таких белков посвящен один из разделов данной работы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Кушниров, Виталий Владимирович

выводы

1. Получены генетические и биохимические доказательства того, что детерминант [PS/] отражает прионное превращение белка Sup35.

2. Показаны прионные свойства гибридного белка Sup35 с прионным доменом из дрожжей Р. methanolica, что выявило распространенность прионного свойства Sup35 у других видов дрожжей.

3. Выявлены клеточные белки, избыток которых может противодействовать поддержанию прионов дрожжей: шапероны Ssal, Ssbl (семейство Hsp70); Sisl, Ydjl и Apjl (семейство Hsp40); Stil; транскрипционные факторы Sfll и Ssn8 и рибосомный белок RppO.

4. Предложена и доказана модель репликации дрожжевых прионов, основанная на их фрагментации шапероном Hspl04.

5. Обнаружено, что прионные полимеры отличаются от прочих клеточных высокомолекулярных комплексов своей нерастворимостью в присутствии сильных ионных детергентов. Разработаны новые методы выделения и анализа прионных полимеров.

6. Установлено, что прионные агрегаты Sup35 состоят из малых полимеров Sup35 и ассоциированных неприонных молекул.

7. Показано, что полимеры Sup35 в различных вариантах [PS/1"] различаются по эффективности их фрагментации шапероном Hspl04, что определяет отличия в размере прионных полимеров, уровне мономерного Sup35 и эффективности нонсенс супрессии.

8. Показано, что прионные полимеры Rnql способны инициировать амилоидную полимеризацию Sup35, однако большинство возникающих полимеров не наследуются вследствие плохой фрагментации шапероном Hspl04.

9. Установлено, что причиной нонсенс супрессии в \psf\ \PIN*~\ клетках сверх-продуцирующих Sup35 является образование ненаследуемых полимеров Sup35.

10. Выдвинута и подтверждена гипотеза о том, что способность прионных полимеров к фрагментации требует наличия гидрофобных аминокислотных остатков в полимеризационном домене.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе (Гл. 3) были получены биохимические доказательства того, что детерминант [PS/] является проявлением прионной формы белка Sup35. Впоследствии аналогичные доказательства были получены для детерминантов [URE3] и [PIN*] (белки Ure2 и Rnql) (Edskes et al., 1999; Sondheimer and Lindquist, 2000). Связь [PS/] с амилоидными полимерами Sup35 был подтверждена другими авторами, показавшими, что [PS/] возникает при введении в клетку путем "белковой" трансформации полимеров Sup35, полученных in vitro из белка Sup35, синтезированного в Е. coli (Tanaka et al., 2004; King and Diaz-Avalos, 2004). Поскольку данные фибриллы заведомо не содержали нуклеиновой кислоты дрожжевого происхождения, эти эксперименты можно считать полным и окончательным доказательством прионной концепции для дрожжевых прионов. Используя для инъекции полученные аналогичным образом фибриллы РгР, удалось инициировать прионное заболевание у мышей (Legname et al., 2004).

Консервативность прионных свойств Sup35 (Гл. 4) была впоследствии продемонстрирована для нескольких других видов дрожжей: Candida albicans (Chien and Weissman, 2001) Klvyveromyces lactis и Yarrowia lipolytica (Nakayashiki et al., 2001). Тем не менее, вопрос о биологической значимости [PS/] все еще является предметом дискуссий. В пользу полезной роли [PS/] говорят также наблюдения того, что [PS/] несколько изменяет устойчивость дрожжей к широкому кругу веществ и условий что дает возможность дрожжам лучше приспосабливаться к изменениям условий окружающей среды (True and Lindquist, 2000; True et al., 2004). С другой стороны, анализ 70 природных изолятов дрожжей не обнаружил у них [PS/], что было интерпретировано в пользу того, что [PS/] является болезнью (Nakayashiki et al., 2005). Ответ на данный вопрос не абсолютен и зависит от строгости определения болезни. С нашей точки зрения, потенциальная полезность [PS/] несомненна.

Дальнейшие исследования белков, противодействующих поддержанию прионов, не выявили принципиально новых категорий белков, не обнаруженых нами (Гл.5). Тем не менее, заслуживает упоминания белок Ssel (HspllO), являющийся нуклеотид-обменивающим фактором для шаперонов подсемейства Ssa. Сверхпродукция Ssel, как и его отсутствие, эффективно устраняли [URE3]

Kryndushkin and Wickner, 2007). Отсутствие Ssel существенно снижало частоту возникновения [PS/"] и могло устранять варианты [PST*], возникшие в присутствии Ssel (Fan et al., 2007; Kryndushkin and Wickner, 2007). Можно предполагать, что влияние Ssel на прионы опосредуется его влиянием на активность белков Ssa. Шаперон Sis 1 оказался весьма важен для поддержания приона [P/iV*]: уменьшение уровня Sisl приводило к увеличению размера прионных агрегатов Rnql и последующей потере [P/iV*] (Aron et al., 2007). К потере [Р/ЛЛ] приводила и делеция несущественной для жизнеспособности глицин-богатой области Sisl (Sondheimer et al., 2001; Lopez et al., 2003). Эксперименты по сверхпродукции шаперонов у дрозофил и мышей показали, что избыток Hsp70 (Chan et al., 2000; Bonini, 2002; Auluck et al., 2002; Cummings et al., 2001) или продукция Hspl04 (Vacher et al., 2005), шаперона, не имеющего аналога у животных, приводят к снижению амилоидообразования, цитотоксичности и нейродегенерации в моделях болезней Гентингтона и Паркинсона.

Фрагментация полимеров Sup35 шапероном Hspl04 (Гл. 6) была подтверждена in vitro с использованием фибрилл белка Sup35, выделенного из Е. coli, и очищенного Hspl04 (Shorter and Lindquist, 2004). Таким образом, модель репликации прионов посредством их фрагментации шапероном Hspl04 стала признанной и единственной на данный момент моделью этого процесса.

Разработанный нами метод ДСН-агарозного электрофореза для анализа амилоидных полимеров (Гл. 7) получил достаточно широкое распространение и был использован во множестве опубликованных работ. Большие перспективы имеет метод выделения амилоидов с использованием ДСН с целью идентификации составляющих их белков. Этот метод, в сочетании с масс-спектрометрической идентификацией белков, может быть применен к любым организмам для научных или диагностических целей. В частности, мы обнаружили, что мажорный белок клеточной стенки дрожжей Bgl2 образует ДСН-нерастворимые комплексы (неопубликованные данные). Поскольку амилоиды уже были выявлены в клеточной стенке грибов и бактерий (Обзор литературы, 1.2.4), амилоидная природа Bgl2 представляется весьма вероятной. Проблемой данного метода, вероятно, решаемой, является повышение чувствительности. Многие важные амилоидные белки могут присутствовать в очень низких концентрациях, например транскрипционные факторы (Du et al., 2008).

Двухуровневая структура прионных агрегатов, показанная нами для Sup35 (Гл. 8), была также продемонстрирована для прионного Rnql (Bagriantsev and Liebman, 2004).

Выявление неприонных амилоидов (Гл. 9) оказалось очень важным для понимания сходства и различия прионов и амилоидов. Подобно вершине айсберга, прионы составляют лишь небольшую, хотя и наиболее заметную часть явления. Среди амилоидных полимеров Sup35, возникающих de novo, к прионному типу принадлежит очень малая доля, однако лишь они могут эффективно размножаться и наследоваться. Полученные результаты подтвердили принципиальное сходство прионов и амилоидов, позволили проанализировать причины неинфекционности амилоидов. В развитие этой работы мы предложили гипотезу о том, что межвидовые барьеры в распространении прионов связаны в значительной мере не с отсутствием кополимеризации гетерологичных прионных белков, а с потерей прионных свойств при передаче процесса полимеризации между разными белками, как в паре Rnql-Sup35. Эксперименты по проверке этой гипотезы ведутся.

Анализ полимеризации гибридных белков с полиглутаминовыми и полиглутамин-тирозиновыми доменами (Гл. 10) поддержал нашу гипотезу о том, что частота фрагментации амилоидных полимеров определяется наличием экспонированных гидрофобных аминокислотных остатков. Эта работа явилась логическим завершением изучения роли фрагментации полимеров в их размножении и свойствах. В настоящее время мы проверяем справедливость данной гипотезы для других гидрофобных аминокислот.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Кушниров, Виталий Владимирович, Москва

1. Aigle,M. and Lacroute,F. (1975). Genetical aspects of URE3., a non-mitochondrial, cytoplasmically inherited mutation in yeast. Mol. Gen. Genet. 136, 327-335.

2. Alexandrov,I.M., Vishnevskaya,A.B., Ter-Avanesyan,M.D., and Kushnirov,V.V. (2008). Appearance and propagation of polyglutamine-based amyloids in yeast: Tyrosine residues enable polymer fragmentation. J. Biol. Chem. Epub ahead of print.

3. Alper,T., Cramp, W.A., Haig,D.A., and Clarke,M.C. (1967). Does the agent of scrapie replicate without nucleic acid? Nature 214, 764-766.

4. Alper,T., Haig,D.A., and Clarke,M.C. (1966). The exceptionally small size of the scrapie agent. Biochem. Biophys. Res. Commun. 22, 278-284.

5. Aron,R., Higurashi,T., Sahi,C., and Craig,E.A. (2007). J-protein co-chaperone Sisl required for generation of RNQ+. seeds necessary for prion propagation. EMBO J. 26, 3794-3803.

6. Auluck,P.K., Chan,H.Y., Trojanowski,J.Q., Lee,V.M., and Bonini,N.M. (2002). Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila model for Parkinson's disease. Science 295, 865-868.

7. Bagriantsev,S. and Liebman,S.W. (2004). Specificity of prion assembly in vivo. PSI+. and [M+] form separate structures in yeast. J. Biol. Chem. 279, 51042-51048.

8. Barnhart,M.M. and Chapman,M.R. (2006). Curli biogenesis and function. Annu. Rev. Microbiol. 60,131-147.

9. Belli,G., Gari,E., Aldea,M., and Herrero,E. (1998). Functional analysis of yeastessential genes using a promoter-substitution cassette and the tetracycline-regulatable dual expression system. Yeast 14, 1127-1138.

10. Berson,J.F., Theos,A.C., Harper,D.C., Tenza,D., Raposo,G., and Marks,M.S. (2003). Proprotein convertase cleavage liberates a fibrillogenic fragment of a resident glycoprotein to initiate melanosome biogenesis. J. Cell Biol. 161, 521-533.

11. Bessen,R.A. and Marsh,R.F. (1992). Biochemical and physical properties of the prion protein from two strains of the transmissible mink encephalopathy agent. J. Virol. 66, 2096-2101.

12. Bessen,R.A. and Marsh,R.F. (1994). Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy. J. Virol. 68, 78597868.

13. Bonini,N.M. (2002). Chaperoning brain degeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99 Suppl 4, 16407-16411.

14. Brachmann,A., Baxa,U., and Wickner,R.B. (2005). Prion generation in vitro: amyloid of Ure2p is infectious. EMBO J. 24, 3082-3092.

15. Bradford,M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254.

16. Bradley,M.E., Edskes,H.K., Hong,J.Y., Wickner,R.B., and Liebman,S.W. (2002). Interactions among prions and prion "strains" in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99 Suppl 4, 16392-16399.

17. Bueler,H., Fischer,M., Lang,Y., Bluethmann,H., Lipp,H.P., DeArmond,S J., Prusiner,S.B., Aguet,M., and Weissmann,C. (1992). Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature 356, 577-582.

18. Carlson,G.A., Kingsbury,D.T., Goodman,P.A., Coleman,S., Marshall,S.T., DeArmond,S., Westaway,D., and Prusiner,S.B. (1986). Linkage of prion protein and scrapie incubation time genes. Cell 46, 503-511.

19. Cesareni,G. and Murray,A.H. (1987). Plasmid vectors carrying the replication origin of filamentous phages. In Genetic Engineering: Principles and Methods, J.K.Setlow, ed. (New York: Plenum Press), pp. 135-154.

20. Chan,H.Y., Warrick,J.M., Gray-Board, Paulson,H.L., and Bonini,N.M. (2000). Mechanisms of chaperone suppression of polyglutamine disease: selectivity, synergy and modulation of protein solubility in Drosophila. Hum. Mol. Genet. 9, 2811-2820.

21. Chapman,M.R., Robinson,L.S., Pinkner,J.S., Roth,R., Heuser,J., Hammar,M., Normark,S., and Hultgren,S J. (2002). Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation. Science 295, 851-855.

22. Chernoff,Y.O., Derkach,I.L., and Inge-Vechtomov,S.G. (1993). Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of P5/.-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr. Genet. 24, 268-270.

23. Chernoff,Y.O., Inge-Vechtomov,S.G., Derkach,I.L., Ptyushkina,M.V., Tarunina,O.V., Dagkesamanskaya,A.R., and Ter-Avanesyan,M.D. (1992). Dosage-dependent translational suppression in yeast Saccharomyces cerevisiae. Yeast 8, 489-499.

24. Chernoff,Y.O., Lindquist,S.L., Ono,B., Inge-Vechtomov,S.G., and Liebman,S.W. (1995). Role of the chaperone protein Hspl04 in propagation of the yeast prion- like factor />57*. Science 268, 880-884.

25. Chernoff,Y.O., Newnam,G.P., Kumar,J., Allen,K., and Zink,A.D. (1999). Evidence for a protein mutator in yeast: role of the Hsp70-related chaperone ssb in formation, stability, and toxicity of the PSI\ prion. Mol. Cell Biol. 19, 8103-8112.

26. Cherny,I., Rockah,L., Levy-Nissenbaum,0., Gophna,U., Ron,E.Z., and Gazit,E. (2005). The formation of Escherichia coli curli amyloid fibrils is mediated by prion-like peptide repeats. J. Mol. Biol. 352, 245-252.

27. Chien,P. and Weissman,J.S. (2001). Conformational diversity in a yeast prion dictates its seeding specificity. Nature 410, 223-227.

28. Chiti,F. and Dobson,C.M. (2006). Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 333-366.

29. Christianson,T.W., Sikorski,R.S., Dante,M., Shero,J.H., and Hieter,P. (1992). Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene 110, 119-122.

30. Collin,P., Beauregard,P.B., Elagoz,A., and Rokeach,L.A. (2004). A non-chromosomal factor allows viability of Schizosaccharomyces pombe lacking the essential chaperone calnexin. J. Cell Sei. 117, 907-918.

31. Cooper,K.F., Mallory,MJ., Smith,J.B., and Strich,R. (1997). Stress and developmental regulation of the yeast C-type cyclin Ume3p (Srbl Ip/Ssn8p). EMBO J. 16, 4665-4675.

32. Coustou,V., Deleu,C., Saupe,S., and Begueret,J. (1997). The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 94, 9773-9778.

33. Coustou-Linares,V., Maddelein,M.L., Begueret,J., and Saupe,S J. (2001). In vivo aggregation of the HET-s prion protein of the fungus Podospora anserina. Mol. Microbiol. 42, 1325-1335.

34. Cox,B.S. (1965). Y, a cytoplasmic suppressor of super-suppression in yeast. Heredity 20, 505-521.

35. Cox,B.S., Tuite,M.F., and McLaughlin,C.S. (1988). The itf/. factor of yeast: a problem in inheritance. Yeast 4, 159-178.

36. Creutzfeldt,H.G. (1920). Uber eine eigenartige herdförmige Erkrankung des Zentralnervensystems. Neurol. Psychiatry 57, 1-18.

37. Cummings,CJ., Sun,Y., Opal,P., Antalffy,B., Mestril,R., Orr,H.T., Dillmann,W.H., and Zoghbi,H.Y. (2001). Over-expression of inducible HSP70 chaperone suppresses neuropathology and improves motor function in SCA1 mice. Hum. Mol. Genet. 10, 1511-1518.

38. Dagkesamanskaya,A.R. and Ter-Avanesyan,M.D. (1991). Interaction of the yeast omnipotent suppressors SUP1(STJP45) and SUP2(SUP35) with non-mendelian factors. Genetics 128, 513-520.

39. DePace,A.H. and Weissman,J.S. (2002). Origins and kinetic consequences of diversity in Sup35 yeast prion fibers. Nat. Struct. Biol. 9, 389-396.

40. Derkatch,I.L., Bradley,M.E., Hong,J.Y., and Liebman,S.W. (2001). Prions affect the appearance of other prions: the story of P/M. Cell 106, 171-182.

41. Derkatch,I.L., Bradley,M.E., Masse,S.V., Zadorsky,S.P., Polozkov,G.V., Inge-Vechtomov,S.G., and Liebman,S.W. (2000). Dependence and independence of PSf~. and [PIN*]: a two-prion system in yeast? EMBO J. 19, 1942-1952.

42. Derkatch,I.L., Bradley,M.E., Zhou,P., Chernoff,Y.O., and Liebman,S.W. (1997). Genetic and environmental factors affecting the de novo appearance of the PSI*~. prion in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 147, 507-519.

43. Derkatch,I.L., Chernoff,Y.O., Kushnirov,V.V., Inge-Vechtomov,S.G., and Liebman,S.W. (1996). Genesis and variability of PSI*. prion factors in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 144, 1375-1386.

44. Dickinson, A.G., Meikle,V.M., and Fraser,H. (1968). Identification of a gene which controls the incubation period of some strains of scrapie agent in mice. J. Comp Pathol. 78,293-299.

45. Dobson,C.M. (2001). Protein folding and its links with human disease. Biochem. Soc. Symp. 1-26.

46. Dos,R.S., Coulary-Salin,B., Forge,V., Lascu,I., Begueret,J., and Saupe,S.J. (2002). The HET-s prion protein of the filamentous fungus Podospora anserina aggregates in vitro into amyloid-like fibrils. J. Biol. Chem. 277, 5703-5706.

47. Du,Z., Park,К.W., Yu,H., Fan,Q., and Li,L. (2008). Newly identified prion linked to the chromatin-remodeling factor Swil in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Genet. 40, 460-465.

48. Edskes,H.K., Gray,V.T., and Wickner,R.B. (1999). The URE3. prion is an aggregated form of Ure2p that can be cured by overexpression of Ure2p fragments. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 96,1498-1503.

49. Инге-Вечтомов,С.Г. and Андрианова,B.M. (1970). Рецессивные cynep-супрессоры у дрожжей. Генетика б, 103-115.

50. Fan,Q., Park,К.W., Du,Z., Morano,K.A., and Li,L. (2007). The role of Ssel in the de novo formation and variant determination of the Р5У+. prion. Genetics 177, 15831593.

51. Ferreira,P.C., Ness,F., Edwards,S.R., Cox,B.S., and Tuite,M.F. (2001). The elimination of the yeast PSJT. prion by guanidine hydrochloride is the result of Hspl04 inactivation. Mol. Microbiol. 40, 1357-1369.

52. Fowler,D.M., Koulov,A.V., Balch,W.E., and Kelly,J.W. (2007). Functional amyloid-from bacteria to humans. Trends Biochem. Sci. 32, 217-224.

53. Fowler,D.M., Koulov,A.V., oiy-Jost,C., Marks,M.S., Balch,W.E., and Kelly,J.W. (2006). Functional amyloid formation within mammalian tissue. PLoS. Biol. 4, e6.

54. Fritz,J.D., Wolff,J.A., and Greaser,M.L. (1993). Partial titin cDNA sequence isolated from rabbit cardiac muscle RNA. J. Muscle Res. Cell Motil. 14, 347-350.

55. Gajdusek,D.C., Gibbs,C.J., Jr., and Alpers,M. (1966). Experimental transmission of a kuru-like syndrome to chimpanzees. Nature 209, 794-796.

56. Gari,E., Piedrafita,L., Aldea,M., and Herrero,E. (1997). A set of vectors with a tetracycline-regulatable promoter system for modulated gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 13, 837-848.

57. Gebbink,M.F., CIaessen,D., Bouma,B., Dijkhuizen,L., and Wosten,H.A. (2005). Amyloids-a functional coat for microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 3, 333-341.

58. Gerstmann,J., Straussler,E., and Sheinker,I. (1936). Uber eine eigenartige hereditar-familiare erkrankung des zerebellaren systems. Neurology 154, 736-762.

59. Gietz,R.D., Schiestl,R.H., Willems,A.R., and Woods,R.A. (1995). Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS- DNA/PEG procedure. Yeast 11, 355-360.

60. Gietz,R.D. and Sugino,A. (1988). New yeast-Escherichia coli shuttle vectors constructed with in vitro mutagenized yeast genes lacking six-base pair restriction sites. Gene 74, 527-534.

61. Glover,J.R., Kowal,A.S., Schirmer,E.C., Patino,M.M., Liu,J.J., and Lindquist,S. (1997). Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of a heritable prion-like factor of S. cerevisiae. Cell 89, 811-819.

62. Glover,J.R. and Lindquist,S. (1998). Hspl04, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins. Cell 94, 73-82.

63. Goldring,E.S., Grossman,LJ., Krupnick,D., Cryer,D.R., and Marmur,J. (1970). The petite mutation in yeast. Loss of mitochondrial deoxyribonucleic acid during induction of petites with ethidium bromide. J. Mol. Biol. 52, 323-335.

64. Griffith,J.S. (1967). Self-replication and scrapie. Nature 215, 1043-1044.

65. Hadlow,W.J. (1959). Scrapie and kuru. Lancet 11, 289-290.

66. Inoue,H., Nojima,H., and Okayama,H. (1990). High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96, 23-28.

67. Jarrett,J.T. and Lansbury,P.T., Jr. (1993). Seeding "one-dimensional crystallization" of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie? Cell 73, 10551058.

68. Jung,G. and Masison,D.C. (2001). Guanidine hydrochloride inhibits Hspl04 activity in vivo: a possible explanation for its effect in curing yeast prions. Curr. Microbiol. 43, 7-10.

69. Kascsak,RJ., Rubenstein,R., and Carp,R.I. (1991). Evidence for biological and structural diversity among scrapie strains. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 172, 139152.

70. King,C.Y. (2001). Supporting the structural basis of prion strains: induction and identification of PST. variants. J. Mol. Biol. 307, 1247-1260.

71. King,C.Y. and Diaz-Avalos,R. (2004). Protein-only transmission of three yeast prion strains. Nature 428, 319-323.

72. King,C.Y.} Tittmann,P., Gross,H., Gebert,R., Aebi,M., and Wuthrich,K. (1997). Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 94, 6618-6622.

73. Klein,M.A., Frigg,R., Flechsig,E., Raeber,A.J., Kalinke,U., Bluethmann,H., Bootz,F.} Suter,M.} Zinkernagel,R.M., and Aguzzi,A. (1997). A crucial role for B cells in neuroinvasive scrapie. Nature 390, 687-690.

74. Krishnan,R. and Lindquist,S.L. (2005). Structural insights into a yeast prion illuminate nucleation and strain diversity. Nature 435, 765-772.

75. Krobitsch,S. and Lindquist,S. (2000). Aggregation of huntingtin in yeast varies with the length of the polyglutamine expansion and the expression of chaperone proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97, 1589-1594.

76. Kryndushkin,D. and Wickner,R.B. (2007). Nucleotide exchange factors for Hsp70s are required for URE3. prion propagation in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biol. Cell 18, 2149-2154.

77. Kryndushkin,D.S., Alexandrov,I.M., Ter Avanesyan,M.D., and Kushnirov,V.V. (2003). Yeast P57+. prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hspl04. J. Biol. Chem. 278, 49636-49643.

78. Kushnirov,V.V., Alexandrov,I.M., Mitkevich,O.V., Shkundina,I.S., and Ter-Avanesyan,M.D. (2006). Purification and analysis of prion and amyloid aggregates. Methods 39, 50-55.

79. Kushnirov,V.V., Kochneva-Pervukhova,N.V., Chechenova,M.B., Frolova,N.S., and Ter Avanesyan,M.D. (2000). Prion properties of the Sup35 protein of yeast Pichia methanolica. EMBO J. 19, 324-331.

80. Kushnirov,V.V. and Ter-Avanesyan,M.D. (1998). Structure and replication of yeast prions. Cell 94, 13-16.

81. Kushnirov,V.V., Ter-Avanesyan,M.D., TeIckov,M.V., Surguchov,A.P., Smirnov,V.N., and Inge-Vechtomov,S.G. (1988). Nucleotide sequence of the SUP 2 (SUP35) gene of Saccharomyces cerevisiae. Gene 66, 45-54.

82. Kwan,A.H., Winefield,R.D., Sunde,M., Matthews,J.M., Haverkamp,R.G., Templeton,M.D., and Mackay,J.P. (2006). Structural basis for rodlet assembly in fungal hydrophobic. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 103, 3621-3626.

83. Lacroute,F. (1971). Non-Mendelian mutation allowing ureidosuccinic acid uptake in yeast. J. Bacteriol. 106, 519-522.

84. Laemmli,U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.

85. Landles,C. and Bates,G.P. (2004). Huntingtin and the molecular pathogenesis of

86. Huntington's disease. Fourth in molecular medicine review series. EMBO Rep. 5, 958963.

87. Larsen,P., Nielsen,J.L., Dueholm,M.S., Wetzel,R., Otzen,D., and Nielsen,P.H. (2007). Amyloid adhesins are abundant in natural biofilms. Environ. Microbiol. 9, 3077-3090.

88. Laue,T.M. and Rhodes,D.G. (1990). Determination of size, molecular weight, and presence of subunits. Methods Enzymol. 182, 566-587.

89. Legname,G., Baskakov,I.V., Nguyen,H.O., Riesner,D., Cohen,F.E., DeArmond,S.J., and Prusiner,S.B. (2004). Synthetic mammalian prions. Science 305, 673-676.

90. Lopez,N., Aron,R., and Craig,E. A. (2003). Specificity of class II Hsp40 Sisl in maintenance of yeast prion ft/VCM-. Mol. Biol. Cell 14, 1172-1181.

91. Luhrs,T., Ritter,C., Adrian,M., Riek-Loher,D., Bohrmann,B., Dobeli,H., Schubert,D., andRiek,R. (2005). 3D structure of Alzheimer's amyloid-beta(l-42) fibrils. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 102, 17342-17347.

92. Lundmark,K., Westermark,G.T., Nystrom,S., Murphy,C.L., Solomon,A., and Westermark,P. (2002). Transmissibility of systemic amyloidosis by a prion-like mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99, 6979-6984.

93. Maddelein,M.L., Dos,R.S., Duvezin-Caubet,S., Coulary-Salin,B., and Saupe,S.J. (2002). Amyloid aggregates of the HET-s prion protein are infectious. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99, 7402-7407.

94. Meriin,A.B., Zhang,X., He,X., Newnam,G.P., Chernoff,Y.O., and Sherman,M.Y. (2002). Huntington toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnql. J. Cell Biol. 157, 997-1004.

95. Meyer,R.K., McKinley,M.P., Bowman,K.A., Braunfeld,M.B., Barry,R.A., and Prusiner,S.B. (1986). Separation and properties of cellular and scrapie prion proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 83, 2310-2314.

96. Michelitsch,M.D. and Weissman,J.S. (2000). A census of glutamine/asparagine-rich regions: implications for their conserved function and the prediction of novel prions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97, 11910-11915.

97. Miller,J.H. (1972). Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY).

98. Moriyama,H., Edskes,H.K., and Wickner,R.B. (2000). TJRE3. prion propagation in Saccharomyces cerevisiae: requirement for chaperone Hspl04 and curing by overexpressed chaperone Ydjlp. Mol. Cell Biol. 20, 8916-8922.

99. Nakayashiki,T., Ebihara,K., Bannai,H., and Nakamura,Y. (2001). Yeast P67+. "prions" that are crosstransmissible and susceptible beyond a species barrier through a quasi-prion state. Mol. Cell 7, 1121-1130.

100. Nakayashiki,T., Kurtzman,C.P., Edskes,H.K., and Wickner,R.B. (2005). Yeast prions URE3. and [P57+] are diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 102, 10575-10580.

101. Newnam,G.P., Wegrzyn,R.D., Lindquist,S.L., and Chernoff,Y.O. (1999). Antagonistic interactions between yeast chaperones Hspl04 and Hsp70 in prion curing. Mol. Cell Biol. 19, 1325-1333.

102. Телков,M.B., Сургучев,А.П., Дагкесаманская,А.Р., and Тер-Аванесян,М.Д. (1986). Выделение хромосомного фрагмента ДНК, содержащего ген SUP2 дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Генетика 22, 17-25.

103. Oesch,B., Westaway,D., Walchli,M., McKinley,M.P., Kent,S.B., Aebersold,R., Barry,R.A., Tempst,P., Teplow,D.B., Hood,L.E., and . (1985). A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. Cell 40,135-146.

104. Oh,J., Kim,J.G., Jeon,E., Yoo,C.H., Moon,J.S., Rhee,S., and Hwang,I. (2007). Amyloidogenesis of type Ill-dependent harpins from plant pathogenic bacteria. J. Biol. Chem. 282, 13601-13609.

105. Osherovich,L.Z., Cox,B.S., Tuite,M.F., and Weissman,J.S. (2004). Dissection and design of yeast prions. PLoS. Biol. 2, E86.

106. Owen,F., Poulter,M., Lofthouse,R., Collinge,J., Crow,TJ., Risby,D., Baker,H.F., Ridley,R.M., Hsiao,K., and Prusiner,S.B. (1989). Insertion in prion protein gene in familial Creutzfeldt-Jakob disease. Lancet 1, 51-52.

107. Parsell,D.A., Kowal,A.S., Singer,M.A., and Lindquist,S. (1994). Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hspl04. Nature 372, 475-478.

108. Patino,M.M., Liu,J.J., Glover,J.R., and Lindquist,S. (1996). Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. Science 273, 622-626.

109. Pattison,I.H. (1965). Resistance of the scrapie agent to formalin. J. Comp. Pathol. 75, 159-164.

110. Paushkin,S.V., Kushnirov,V.V., Smirnov,V.N., and Ter Avanesyan,M.D. (1996). Propagation of the yeast prion-like PS/. determinant is mediated by oligomerization of the SC/P35-encoded polypeptide chain release factor. EMBO J. 15, 3127-3134.

111. Paushkin,S.V., Kushnirov,V.V., Smirnov,V.N., and Ter Avanesyan,M.D. (1997b). Interaction between yeast Sup45p (eRFl) and Sup35p (eRF3) polypeptide chain release factors: implications for prion-dependent regulation. Mol. Cell Biol. 17, 27982805.

112. Paushkin,S.V., Kushnirov,V.V., Smirnov,V.N., and Ter Avanesyan,M.D. (1997a). In vitro propagation of the prion-like state of yeast Sup35 protein. Science 277, 381-383.

113. Pawelek,J.M. and Lerner,A.B. (1978). 5,6-Dihydroxyindole is a melanin precursor showing potent cytotoxicity. Nature 276, 626-628.

114. Perutz,M.F., Finch,J.T., Berriman,J., and Lesk,A. (2002a). Amyloid fibers are water-filled nanotubes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99, 5591-5595.

115. Podrabsky,J.E„ Carpenter,J.F., and Hand,S.C. (2001). Survival of water stress in annual fish embryos: dehydration avoidance and egg envelope amyloid fibers. Am. J. Physiol Regul. Integr. Comp Physiol 280, R123-R131.

116. Pollard,T.D. and Borisy,G.G. (2003). Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell 112, 453-465.

117. Priola,S.A., Caughey,B., Race,R.E., and Chesebro,B. (1994). Heterologous PrP molecules interfere with accumulation of protease-resistant PrP in scrapie-infected murine neuroblastoma cells. J. Virol. 68, 4873-4878.

118. Prusiner,S.B. (1982). Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science 216, 136-144.

119. Prusiner,S.B. (1991). Molecular biology of prion diseases. Science 252, 1515-1522.

120. Prusiner,S.B., Scott,M.R., DeArmond,S.J., and Cohen,F.E. (1998). Prion protein biology. Cell 93, 337-348.

121. Ross,E.D., Baxa,U., and Wickner,R.B. (2004). Scrambled prion domains form prions and amyloid. Mol. Cell Biol. 24, 7206-7213.

122. Ross,E.D., Edskes,H.K., Terry,M.J., and Wickner,R.B. (2005a). Primary sequence independence for prion formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 102, 12825-12830.

123. Ross,E.D., Minton,A., and Wickner,R.B. (2005b). Prion domains: sequences, structures and interactions. Nat. Cell Biol. 7, 1039-1044.

124. Salnikova,A.B., Rryndushkin,D.S., Smirnov,V.N., Kushnirov,V.V., and Ter Avanesyan,M.D. (2005). Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids. J. Biol. Chem. 280, 8808-8812.

125. Sambrook,J., Fritsch,E.E., and Maniatis,T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press).

126. Sanger,F., Nicklen,S., and Coulson,A.R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 74, 5463-5467.

127. Santoso,A., Chien,P., Osherovich,L.Z., and Weissman,J.S. (2000). Molecular basis of a yeast prion species barrier. Cell 100, 277-288.

128. Saupe,S J. (2000). Molecular genetics of heterokaryon incompatibility in filamentous ascomycetes. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64, 489-502.

129. Sherman,F., Fink,G.R., and Hicks,J.B. (1986). Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press).

130. Shewmaker,F., Wickner,R.B., and Tycko,R. (2006). Amyloid of the prion domain of Sup35p has an in-register parallel beta-sheet structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 103, 19754-19759.

131. Shkundina,I.S., Kushnirov,V.V., Tuite,M.F., and Ter-Avanesyan,M.D. (2006). The role of the N-terminal oligopeptide repeats of the yeast sup35 prion protein in propagation and transmission of prion variants. Genetics 172, 827-835.

132. Shorter,J. and Lindquist,S. (2004). Hspl04 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers. Science 304, 1793-1797.

133. Si,K., Lindquist,S., and Kandel,E.R. (2003b). A neuronal isoform of the aplysia CPEB has prion-like properties. Cell 115, 879-891.

134. Sikorski,R.S. and Hieter,P. (1989). A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 122, 19-27.

135. Silveira,J.R., Raymond,G.J., Hughson,A.G., Race,R.E., Sim,V.L., Hayes,S.F., and Caughey,B. (2005). The most infectious prion protein particles. Nature 437, 257-261.

136. Slotta,U., Hess,S., Spiess,K., Stromer,T., Serpell,L., and Scheibel,T. (2007). Spider silk and amyloid fibrils: a structural comparison. Macromol. Biosci. 7, 183-188.

137. Smith, J.F., Knowles,T.P., Dobson,C.M., Macphee,C.E., and Welland,M.E. (2006). Characterization of the nanoscale properties of individual amyloid fibrils. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 103, 15806-15811.

138. Sondheimer,N. and Lindquist,S. (2000). Rnql: an epigenetic modifier of protein function in yeast. Mol. Cell 5, 163-172.

139. Sondheimer,N., Lopez,N., Craig,E.A., and Lindquist,S. (2001). The role of Sis 1 in the maintenance of the RNQ+. prion. EMBO J. 20, 2435-2442.

140. Song,W. and Carlson,M. (1998). Srb/mediator proteins interact functionally and physically with transcriptional repressor Sfll. EMBO J. 17, 5757-5765.

141. Stansfield,I., Akhmaloka, and Tuite,M.F. (1995a). A mutant allele of the SUP45 (SAL4) gene of Saccharomyces cerevisiae shows temperature-dependent allosuppressor and omnipotent suppressor phenotypes. Curr. Genet. 27, 417-426.

142. Stone,D.E. and Craig,E.A. (1990). Self-regulation of 70-kilodalton heat shock proteins in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol. 10, 1622-1632.

143. Stromer,T. and Serpell,L.C. (2005). Structure and morphology of the Alzheimer's amyloid fibril. Microsc. Res. Tech. 67, 210-217.

144. Tanaka,M., Chien,P., Naber,N., Cooke,R., and Weissman,J.S. (2004). Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences. Nature 428, 323328.

145. Tanaka,M., Chien,P., Yonekura,K., and Weissman,J.S. (2005). Mechanism of cross-species prion transmission: an infectious conformation compatible with two highly divergent yeast prion proteins. Cell 121,49-62.

146. Tanaka,M., Collins,S.R., Toyama,B.H., and Weissman,J.S. (2006). The physical basis of how prion conformations determine strain phenotypes. Nature 442, 585-589.

147. Tanaka,M. and Weissman,J.S. (2006). An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast. Methods Enzymol. 412, 185-200.

148. Taneja,V., Maddelein,M.L., Talarek,N., Saupe,S.J., and Liebman,S.W. (2007). A non-Q/N-rich prion domain of a foreign prion, Het-s., can propagate as a prion in yeast. Mol. Cell 27, 67-77.

149. Ter-Avanesyan,M.D., Dagkesamanskaya,A.R., Kushnirov,V.V., and Smirnov,V.N. (1994). The SUP35 omnipotent suppressor gene is involved in the maintenance of the non-Mendelian determinant P57+. in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics 137, 671-676.

150. Theos,A.C., Truschel,S.T., Raposo,G., and Marks,M.S. (2005). The Silver locus product Pmell7/gpl00/Silv/ME20: controversial in name and in function. Pigment Cell Res. 18, 322-336.

151. Towbin,H., Staehelin,T., and Gordon,J. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 76, 4350-4354.

152. True,H.L., Berlin,I., and Lindquist,S.L. (2004). Epigenetic regulation of translation reveals hidden genetic variation to produce complex traits. Nature 431, 184-187.

153. True,H.L. and Lindquist,S.L. (2000). A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature 407, 477-483.

154. Vacher,C., Garcia-Oroz,L., and Rubinsztein,D.C. (2005). Overexpression of yeast hspl04 reduces polyglutamine aggregation and prolongs survival of a transgenic mouse model of Huntington's disease. Hum. Mol. Genet. 14, 3425-3433.

155. Wang,K. (1982). Purification of titin and nebulin. Methods Enzymol. 85 Pt B, 264274.

156. Warrick,J.M., Chan,H.Y., Gray-Board, Chai,Y., Paulson,H.L., and Bonini,N.M. (1999). Suppression of polyglutamine-mediated neurodegeneration in Drosophila by the molecular chaperone HSP70. Nat. Genet. 23, 425-428.

157. Wegrzyn,R.D., Bapat,K., Newnam,G.P., Zink,A.D., and Chernoff,Y.O. (2001). Mechanism of prion loss after Hspl04 inactivation in yeast. Mol. Cell Biol. 21, 46564669.

158. Wickner,R.B. (1994). URE3. as an altered Ure2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science 264, 566-569.

159. Wickner,R.B., Taylor,K.L., Edskes,H.K., Maddelein,M.L., Moriyama,H., and Roberts,B.T. (1999). Prions in Saccharomyces and Podospora spp.: protein-based inheritance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 844-61, table.

160. Xing,Y., Nakamura,A., Chiba,T., Kogishi,K., Matsushita,T., Li,F., Guo,Z., Hosokawa,M., Mori,M., and Higuchi,K. (2001). Transmission of mouse senile amyloidosis. Lab Invest 81, 493-499.

161. Zhouravleva,G., Frolova,L., Le,G., X, Le,G.R., Inge-Vechtomov,S., Kisselev,L., and Philippe,M. (1995). Termination of translation in eukaryotes is governed by two interacting polypeptide chain release factors, eRFl and eRF3. EMBO J. 14, 40654072.

162. Zigas,V. and Gajdusek,D.C. (1957). Kuru: clinical study of a new syndrome resembling paralysis agitans in natives of the Eastern Highlands of Australian New Guinea. Med. J. Aust. 2, 745-754.1. БЛАГОДАРНОСТИ

Информация о работе

Кушниров, Виталий Владимирович
доктора биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.03

Диссертация

Прионные и неприонные амилоиды: изучение в дрожжевой модели - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы