Принципы создания новых форм лекарственных препаратов и биологически активных соединений солюбилизацией липосомами

Селищева, Алла Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Принципы создания новых форм лекарственных препаратов и биологически активных соединений солюбилизацией липосомами
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Принципы создания новых форм лекарственных препаратов и биологически активных соединений солюбилизацией липосомами"

На правах рукописи

Селищева Алла Анатольевна

ПРИНЦИПЫ СОЗДАНИЯ НОВЫХ ФОРМ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ СОЛЮБИЛИЗАЦИЕЙ ЛИПОСОМАМИ

03.00.23- Биотехнология

диссертации на соискание ученой доктора химических наук

Автореферат

Москва -2007

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской академии тонкой химической технологии им М В Ломоносова и в лаборатории физико-химии биомембран биологического факультета Московского государственного университета им М В Ломоносова

Научный консультант

доктор химических наук, профессор,

академик РАМН

Официальные оппоненты

доктор химических наук, профессор, член-корр РАМН

доктор химических наук, профессор

Швец Виталий Иванович

Северин Сергей Евгеньевич Левашов Андрей Вадимович

доктор химических наук, доцент Чупин Владимир Викторович

Ведущая организация

ГУ Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений

Защита диссертации состоится «22» октября 2007г в 15 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212 120 01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им М В Ломоносова по адресу 119571, Москва, пр Вернадского, д86

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им М В Ломоносова

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте ВАК РФ http//vak ed gov ru

Автореферат разослан «/У » ^/¿^¿ЯУ 2007г

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук, старший научный сотрудник ~ ,

Лютик А И

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В настоящее время с лечением туберкулеза во всем мире сложилась столь неблагополучная ситуация, что Всемирная Организация Здравоохранения объявила в 2003г туберкулез глобальной угрозой жизни человека Невысокая эффективность лечения туберкулеза обусловлена многими причинами, в том числе токсичностью многих противотуберкулезных препаратов (ПТП) Особенно выражены токсические эффекты у препарата первого ряда - рифампицина, которые вынуждают больных отказываться от его приема

Для решения проблемы лечения туберкулеза необходимы новые подходы, которые должны включать как поиск новых препаратов, так и разработку новых менее токсичных лекарственных форм ранее применяемых ПТП

В связи с тем, что микобактерия туберкулеза (Mycobactenum tuberculosis (М tuberculosis)), вызывающая это заболевание, размножается в основном внутри клеток легочной ткани (макрофагов), представлялось целесообразным использовать такие лекарственные формы, которые были бы способны направленно транспортировать ПТП внутрь этих клеток Эта задача может быть решена с помощью липосом, которые, как известно, фагоцитируются макрофагами

Наряду с этим представляется необходимым поиск новых препаратов, обладающих антибактериальной активностью, но нетоксичных для человека В качестве примера можно привести белки, секретируемые непатогенными бактериями (бактериоцины) Однако эти водорастворимые белки не проникают через мембрану макрофагов и для их внутриклеточной доставки можно использовать липосомы

Одним из положительных свойств липосом в качестве транспортирующей системы является фармакологическая активность самих фосфолипидов, из которых сформированы липосомы Известны несколько препаратов на основе фосфолипидов для лечения гепатита, цирроза, токсических поражений печени «Эссенциапе» (Германия), отечественный препарат «Фосфоглиф», препарат «Липин» (Украина) и др В литературе имеются отдельные сообщения о противовоспалительном и антиэксудативном действии фосфолипидов Перечисленные выше данные позволяют прогнозировать значительные преимущества липосомальных форм ПТП по сравнению с таблетированными, в связи с чем разработка таких форм представляется весьма актуальной Она позволит увеличить растворимость ПТП, усилить их проникновение в макрофаги и возможно, окажет дополнительные эффекты, например, снизит токсичность или увеличит время пребывания препарата в организме

Наряду с этим следует учесть, что в легких человека и животных липосомы, содержащие ПТП, целенаправленно взаимодействуют как с инфицированными макрофагами, так и с микобактериями Известно, что клеточная стенка последних содержит различные фосфолипазы, в том числе фосфолипазу С и фосфолипазу Аг В связи с этим с целью прогнозирования возможных механизмов деградации компонентов липосом при их введении в организм представлялось необходимым оценить свойства липосом после их обработки различными фосфолипазами

Основной целью работы являлась разработка научных основ создания липосомальных форм лекарственных препаратов и биологически активных соединений как способа оптимизации их свойств для повышения эффективности фармакологического действия Другой целью была оценка антибактериальной активности липосомальной формы рифампицина в отношении клеток М tuberculosis in vitro и in vivo

Научная новизна

1 Впервые обнаружено, что введение в состав липосом метаболита фосфолипидов - 1,2-диацилглицерина (ДАГ), образующегося при действии фосфолипазы С, приводит к возникновению новых свойств модельных мембран слиянию однослойных везикул (ОВ), появлению у их мембраны проницаемости для ионов кальция,

2 Установлено, что механизм этого явления сводится к нарушению бислойной структуры фосфолипидов в мембране и формированию внутримембранных частиц,

3 На примере биологической мембраны (мембраны синаптосом) впервые обнаружено, что ДАГ и образующаяся из него арахидоновая кислота могут участвовать в формировании специфических кальциевых каналов проницаемости,

4 Установлено, что ОВ способны активировать кислородный взрыв в альвеолярных макрофагах человека и что ДАГ и арахидоновая кислота усиливают этот эффект

5 Изучено взаимодействие гидрофильных белков - основного панкреатического ингибитора трипсина и соевого ингибитора типа Баумана-Бирк, обладающих противовоспалительным и противоопухолевым действием, с мультиламеллярными везикулами различного состава Показано, что в липосомах белки достигают гидрофобной области мембраны, но тем не менее проявляют ингибирующую активность Уменьшение размеров частиц комплексов под действием ионного детергента приводит к возрастанию активности ингибиторов

6 Впервые установлено, что бактериоцины, ингибирующие рост бактерий М tuberculosis в культуральной среде, в липосомальной форме способны подавлять рост М tuberculosis в макрофагах и увеличивать продолжительность жизни животных, зараженных М tuberculosis В водном растворе они не обладают такими свойствами

7 Впервые показано различие в механизме взаимодействия двух родственных антибиотиков - рифампицина и рифабутина- с модельными мембранами, поскольку при физиологических значениях рН среды рифампицин является анионом, а рифабутин - катионом

8 Доказана возможность снижения терапевтических доз рифампицина в липосомальной форме по сравнению с раствором при лечении экспериментального туберкулеза

Практическая значимость

1 Определены дозы липосом из фосфолипидов, которые обладают ранозаживляющим действием и активируют макрофаги человека, что было учтено при разработке липосомальной формы рифампицина

2 Показано, что один из бактериоцинов, подавляющий рост М tuberculosis в культуральной среде, в составе липосом способен

оказывать тот же эффект и на инфицированные макрофаги, не проявляя в то же время токсичности по отношению к ним Получен положительный результат при применении липосомальной формы бакгериоцина для лечения мышей, зараженных M tuberculosis Он свидетельствует о перспективности создания нового лекарственного препарата для лечения туберкулеза

3 Доказана высокая эффективность действия липосомальной формы рифампицина, введенной ингаляционно, при лечении мышей, зараженных M tuberculosis Это позволило снизить дозу рифампицина и тем самым нивелировать его токсические эффекты

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Введение ДАГ и арахидоновой кислоты в состав модельных мембран приводит к изменению их структурной организации, в результате чего

□ происходит уменьшение стабильности OB и индукция их слияния,

□ в мембранах появляется проницаемость для ионов кальция

2 В клетках и тканях введение этих соединений приводит к усилению эффекта липосом

□ усиливается ток кальция внутрь нервных окончаний,

□ увеличивается интенсивность кислородного взрыва фагоцитов, □ускоряется заживление операционной раны кожи морских свинок

3 Бакгериоцины в липосомальной форме ингибируют рост M tuberculosis в макрофагах мышей и на 30% увеличивают продолжительность жизни экспериментальных животных, зараженных смертельной дозой M tuberculosis

4 Характер взаимодействия рифампицина и рифабутина с отрицательно заряженными фосфолипидами определяется содержанием их ионизационных форм при физиологических значениях pH среды

5 Показано, что разработанная нами липосомальная форма рифампицина с повышенным содержанием его в водной фазе существенно снижает число клеток M tuberculosis в легких и селезенке зараженных мышей

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на У1 Конференции по биохимии липидов (С Петербург, 1994), У Национальном конгрессе болезней органов дыхания (Москва,1995), 2-ом Съезде Биохимического общества РАН (Москва, 1997), Международной Конференции «Биокатализ-98 фундаментальные и прикладные исследования» (Пущино,1998), International Symposium on Natural Origin Substances in Drug Formutation Bejing, China, 1998,У-ой Международной конференции «Наукоемкие химические технологии» (Москва,1999), Symposion on Lipids and Surfactant Dispersed Systems, Moscow, 1999, 27th International Symposium on Controlled Release of Bioactive Matenals, Paris, France. 2000, XII Int BRG Workshop on Bioencapsulation, Vitoria, Spam, 2004, 2-, 3-, 4- и 5ом Международном Конгрессе «Биотехнология состояние и перспективы развития» (Москва, 2004, 2005, 2006, 2007 гг), 7th Eur Symp on Saliva, Egmond aan Zee, Netherlands, 2005, 33-th Ann Meeting Controll Rel Society Vienna, Austria, 2006

Обьем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 345 страницах машинописного текста, содержит 112 рисунков, 54 таблиц и

состоит из введения, литературного обзора, изложения и обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы (300 наименований)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 1 монография, 1 методическое пособие, 41 статья в журналах, в том числе 7 в зарубежной печати, 20 тезисов на российских и международных конференциях Работа выполнена на кафедре биотехнологии МИТХТ им М В Ломоносова и в лаборатории физико-химии биомембран Биофака МГУ им М В Ломоносова, а также при участии ряда других организаций (ЦНИИ туберкулеза РАМН, Института биохимии им А Н Баха РАН)

Представленная работа является частью проектов по фундаментальным исследованиям и выполнена при поддержке гранта № 01-04-48466 Российского Фонда Фундаментальных исследований, гранта №3-21 НТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки» по направлению «Новейшие методы биоинженерии», фантов президента по поддержке ведущих научных школ № НШ-2329 4 и № РИ-112 001 609

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. СВОЙСТВА ЛИПОСОМ, СОДЕРЖАЩИХ ПРОДУКТЫ МЕТАБОЛИЗМА ФОСФОЛИПИДОВ И ИХ ДЕЙСТВИЕ НА ФАГОЦИТЫ И

ТКАНЬ.

Как отмечалось во введении, в настоящей работе липосомы выбраны в качестве системы доставки ПТП к микобактериям, находящимся в культуральной среде и в инфицированных макрофагах При воздействии фосфолипаз микобактерий на липосомы свойства последних могут существенно измениться Задачей начальных этапов исследования являлось изучение стабильности липосом и проницаемости для ионов кальция мембран липосом разного липидного состава при инкубации с фосфолипазами В работе использовали следующие фосфолипиды фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидилэтаноламин (ФЭ), фосфатидилинозит (ФИ), фосфатидилглицерин (ФГ), фосфатидную кислоту (ФК), выделенные из сои, и кардиолипин (КЛ) из сердца быка, фосфолипазы С из Вас сегеив различной специфичности и фосфолипазу Аг из яда змеи

1 1 Гидролиз ФХ. ФЭ и их смесей фосфолипазой С в присутствии дезоксихолата и в составе липосом Для накопления ДАГ в модельных и природных мембранах использовали их обработку фосфолипазой С из Вас сегвиэ различной специфичности Для определения оптимальных условий гидролиза фосфолипидов использовали ОВ (система фосфолипиды/вода) и смешанные мицеллы (система детергент/фосфолипиды/вода) В качестве детергента использовали дезоксихолат натрия (ДОХ)

При изучении зависимости скорости гидролиза ФЛ разных классов (ФХ, смеси ФХ ФЭ) от концентрации фосфолипида под действием фосфолипазы С установили, что в системе фосфолипиды/ вода эта зависимость имеет линейный характер (рис 1а)

а)

О 1 2

[Б], мМ

Рис 1 Скорость гидролиза фосфолипидов фосфолипазой С а) в составе ОВ 1) ФХ ФЭ (2 1), 2) ФЭ, 3) ФХ, б) в составе смешанных мицелл при определенном соотношении ДОХ фосфолипид 1) ФХ (ДОХ ФХ 1 7), 2) ФХ (ДОХ ФХ 2 8), 3) ФЭ (ДОХ ФЭ 1 7)

В системе ДОХ/ФЛ/вода изучали зависимость скорости гидролиза ФЛ от их концентрации при различных соотношениях между ФЛ и ДОХ В этих условиях при увеличении концентрации субстрата (ФЛ) увеличивалась концентрация ДОХ При этом, как показали результаты измерения методом динамического светорассеяния, размер частиц из

фосфолипидов и детергента уменьшался, а зависимость от концентрации субстрата имела необычный характер (рис 16)

Проведенные эксперименты показали, что для получения предсказуемых результатов можно использовать только систему фосфолипиды/вода

1 2 Стабильность и проницаемость для ионов кальция мембран ОВ. обработанных ФосФолипазой С и фосфолипазой А? На следующем этапе исследований изучили два свойства модельных мембран, содержащих продукт метаболизма ФИ - 1,2-ДАГ или жирные кислоты стабильность и проницаемость для ионов кальция ОВ разного липидного состава инкубировали с фосфолипазой С или фосфолипазой А2 и регистрировали во времени оба этих параметра, а также процент гидролиза фосфолипидов Кроме того, параллельно были исследованы изменения структуры мембран мультиламеллярных везикул методом 31Р-ЯМР спектроскопии

Процесс слияния липосом контролировался методом флуоресценции При смешивании содержимого водных фаз двух популяций липосом, одна из которых была нагружена ионами тербия, другая - дипиколиновой кислотой, происходило образование комплекса тербий - дипиколиновая кислота, что сопровождалось ростом интенсивности флуоресценции при 550 нм

Регистрация входа кальция во внутреннюю среду липосом проводилась по изменению характера спектра поглощения адсорбционного металлохромного индикатора арсеназо 111 по модифицированной нами методике

а) б)

Лип экстракт

Рис 2 Влияние фосфолипазы С на а) стабильность ОВ разного липидного состава, изученную методом флуоресценции и б) проницаемость мембран для ионов кальция, изученную методом спектрофотометрии (см пояснения в тексте)

Анализ липидного состава мембран при незначительных степенях гидролиза фосфолипидов проводили методом тонкослойной радиохроматографии с использованием 1-пальмитоил-2-(9,10-Н)пальмитоил-зп-глицеро-3-фосфохолина или определяя содержание фосфорсодержащих соединений методом Дитмера после экстракции их хлороформом из инкубационной среды

При действии фосфолипазы Аг интенсивность флуоресценции снижалась, что связано с нарушением целостности мембраны и выходом содержимого липосом во внешнюю среду (данные не приводятся). Аналогичное уменьшение интенсивности флуоресценции происходило в том случае, когда обработке ферментом подвергался только один тип липосом, содержащих ТЬ3+ Степень гидролиза фосфолипидов после 10 мин инкубации не превышала 1,5—2% в случае фосфолипазы С и 3% в случае фосфолипазы Аг

На рис 2 представлены результаты обработки липосом, состоящих из различных фосфолипидов, неспецифической фосфолипазой С Во всех случаях наблюдается как рост АГ/Ро, обусловленный слиянием липосом, так и увеличение оптической плотности на спектре арсеназо Такой же результат был получен и при инкубации липосом, сформированных из смеси ФИ ФХ (1 5) фосфолипазой С, специфической к ФИ (данные не приведены)

Как следует из рис 2, скорость обоих процессов увеличивалась при введении в исходную смесь «небиспойных» (ФЭ) или отрицательно заряженных фосфолипидов (КГ1) Скорость была максимальной в случае суммарного липидного экстракта синаптосом головного мозга крысы, который содержит все классы перечисленных фосфолипидов

. «о

Рис 3 Спектры 31Р-ЯМР суспензии мультиламеллярных везикул из ФХ до (а) и после обработки фосфолипазой С содержание 1,2-ДАГ в мембране 5 (б), 7,5 (в) и 10% (г)

Для изучения структуры модельной мембраны, обработанной фосфолипазой С, методом 31Р-ЯМР-спектроскопии использовали мультиламеллярные везикулы (МЛВ). В спектрах 31Р-ЯМР такой структуре соответствует сигнал с анизотропией химического сдвига около -50 м д и плечом в сторону слабого поля (рисЗ) МЛВ из фосфолипидов, образующих стабильные бислои (ФХ, ФИ), обрабатывались фосфолипазой С до степени гидролиза 10%, далее из среды инкубации удалялись водорастворимые продукты гидролиза - низкомолекулярные фосфаты На спектре смеси фосфолипидов и гидрофобных продуктов гидролиза (ДАГ) отмечали следующее изменение формы спектра на фоне широкого анизотропного сигнала появлялся узкий изотропный сигнал, которому соответствует популяция фосфолипидов, двигающихся изотропно Данные электронной микроскопии позволяют утверждать, что к этой популяции фосфолипидов относятся молекулы, формирующие внутримембранные частицы липидной природы

1 3 Проницаемость для ионов кальция природных мембран (мембран синаптосом). индуцированная ФосФолипазами С и А?. Задачей следующего этапа исследований явилось установление принципиальной возможности участия гидрофобных метаболитов фосфолипидов (ДАГ и жирных кислот) в регуляции транспорта Са2+ через биологическую мембрану В качестве исследуемой системы были выбраны изолированные нервные окончания нейронов головного мозга мышей (синаптосомы), которые сохраняют многие характеристики исходной клетки содержат медиаторы, имеют рецепторы на внешней поверхности и потенциал-чувствительные Са2+-каналы Это означает, что транспорт Са2+ внутрь синаптосом происходит по градиенту концентраций и регулируется потенциалом на мембране в условиях покоя (среда, содержащая 145 мМ NaCI, 5 мМ KCI) он незначителен, в условиях, когда трансмембранный потенциал мембран синаптосом близок к нулю (в среде 5 мМ NaCI, 145 мМ KCI) поток Са2+ внутрь синаптосом вырастает в 2-3 раза (табл 1)

Синаптосомы, выделенные из мозга крыс, инкубировались различное время в среде, содержащей 145 мМ NaCI, 5 мМ KCI, а также Са2+ и 45Са2+ После окончания инкубации аликвота инкубационной среды фильтровалась через поликарбонатные фильтры с размером пор 0,4 мкм, фильтр переносился в сцинциляцитонный флакон и определялось число имульсов за 10 мин

При добавлении в среду инкубации фосфолипазы С (1 мкг/мл), не обладающей специфичностью к разным классам фосфолипидов, наблюдается некоторое снижение накопления ионов кальция Напротив, специфичная к ФИ фосфолипаза С ускоряет Са2+ - транспорт в синаптосомы При этом накопление кальция синаптосомами не превышает уровень поступления ионов кальция при ее деполяризации, и эффект специфичной фосфолипазы С снимается верапамилом

В опытах, приведенных выше, были использованы экзогенные фосфолипазы С микробного происхождения Представлялось интересным сопоставить их действие с влиянием на кальциевый транспорт в синаптосомы одной из фракций гомогената головного мозга крыс, обладающей фосфолипазной активностью только по отношению к ФИ При инкубации синаптосом с лиофилизатом надмикросомальной

фракции головного мозга был получен эффект, аналогичный влиянию фосфолилазы С, специфичной к ФИ в среде инкубации, содержащей 145 мМ NaCI, 5 мМ KCl, уровень накопления кальция увеличивался почти вдвое и блокировался верапамилом

Полученные результаты говорят об участии в формировании каналов проницаемости только той фракции ДАГ, которая образуется при метаболизме ФИ, а также о том, что речь идет о специфических каналах проницаемости для ионов кальция, которые блокируются верапамилом Возможно, участие метаболитов липидов в формировании белковых каналов проницаемости происходит за счет изменения структуры белковой молекулы- каналоформера благодаря кратковременному образованию внутримембранных частиц в липидном бислое, окружающем белки

Добавление арахидоновой кислоты (1 10"4 М) к суспензии синаптосом оказывало такой же эффект, как и специфичная фосфолипаза С накопление Са2+ в среде покоя увеличивалось В меньших концентрациях арахидоновая кислота была неэффективна Верапамил ингибировал и действие арахидоновой кислоты

Табл.1. Влияние продуктов метаболизма и различных фосфолипаз на накопление кальция синаптосомами_

№ Добавки в среду инкубации нмоль СаГ на 1 мг белка синаптосом

КОНТРОЛЬНЫЕ ПРОБЫ

1 Инкубационная среда 1 (145 мМ №С1, 5 мМ КС!) 4,8±0,6

2 Инкубационная среда 2 (5 Мм ЫаС1, 145 мМ КС1) 15,0±1,0

3 Верапамил (0,5 мМ) в инкубационной среде 2 2,4±0,3

ОПЫТНЫЕ ПРОБЫ (инкубационная среда 1 )

4 Фосфолипаза С, специфичная к ФИ (1,2 мкг/мл) 11,6±0,6

5 То же + верапамил (0,5 мМ) 2,6±0,4

6 Фосфолипаза С, специфичная к ФИ (0,1 мкг/мл) 5,2+0,3

7 Неспецифичная фосфолипаза С (1,0 мкг/мл) 3,9±0,2

8 Неспецифичная фосфолипаза С, (0,1 мкг/мл) 4,0±0,3

9 Арахидоновая кислота (0,1 мкг/мл ) 13,6±0,6

10 То же + верапамил (0,5 мМ) 2,6±0,4

11 Линолевая кислота (0,1 мкг/мл) 3,2±0,3

12 Олеиновая кислота (0,1 мг/мл) 3,9±0,2

13 Фосфолипаза Аг (0,1 мкг/мл) 2,0±0,3

Выше на примере ОВ из фосфолипидов было показано, что жирные кислоты в больших концентрациях способны индуцировать неспецифическую проницаемость мембран для Са2+ Чтобы выяснить, насколько специфично действие арахидоновой кислоты на природные мембраны, в качестве контроля изучали действие двух других жирных кислот (линолевой и олеиновой) и фосфолипазы Аг Согласно данным, приведенным в табл1, обе кислоты в концентрации 10"4 М понижали поступление Са2+ в синаптосомы Инкубация синаптосом с фосфолипазой Аг также сопровождалась небольшим уменьшением поступления ионов кальция в синаптосомы аналогично тому, как это наблюдалось для неспецифичной фосфолипазы С Эффект фосфолипазы Аг оказался обратимым при добавлении в среда инкубации БСА, способного связывать жирные кислоты, содержание Са * повышалось до нормального уровня. Анализ состава фосфолипидов, экстрагированных из синаптосом по методу Блай и Дайера показал, что под действием выбранных концентраций фосфолипаз С и Аг гидролизуется 25-31% фосфолипидов

Известно, что модификация биологических мембран добавлением жирных кислот или обработкой фосфолипазами сопровождается изменением ряда физико-химических характеристик мембран, и нельзя исключить того, что она может привести к нарушению нативности мембраны в целом Для проверки этого предположения был измерен уровень лактатдегидрогеназы в препарате синаптосом, обработанных фосфолипазами, и не было обнаружено существенных различий между контролем и опытом, что говорит об отсутствии серьезных нарушений в структуре синаптосомальной мембраны под действием фосфолипаз

Ранее, во введении упоминалось о фармакологическом действии фосфолипидов Полученные результаты позволяют сделать предположение о повышенной эффективности действия везикул, содержащих ДАГ и арахидоновую кислоту, на клетки и ткани Для подтверждения этого предположения на следующем этапе работы исследовали действие везикул, содержащих эти соединения, на фагоциты человека и рану кожи экспериментальных животных

1 4 Влияние ДАГ-содержащих липосом на Фагоциты человека и рану кожи экспериментальных животных Задачей на данном этапе исследований явилось сравнение эффективности действия липосом из ФХ, содержащих и не содержащих ДАГ и арахидоновую кислоту, на клеточном и тканевом уровнях (на альвеолярные макрофаги и на заживление ран на коже морских свинок после операции)

14 1 Влияние липосом на развитие кислородного взрыва в альвеолярных макрофагах человека Образование в альвеолярных макрофагах первичных метаболитов активированного кислорода под действием липосом различного состава регистрировали методом хемилюминесценции (ХМ) люминола Использовали липосомы из ФХ, содержащие и не содержащие ДАГ и арахидоновую кислоту Для сравнения в липосомы вводили эфиры жирных кислот - незаряженные

гидрофобные соединения, структурно близкие ДАГ АМ выделяли из бронхоальвеолярного лаважа здоровых людей

В контроле, те в отсутствие каких-либо активаторов интенсивность ХМ люминола при инкубации с альвеолярными макрофагами равнялась 300 мУ, увеличиваясь при добавлении липосом из ФХ в течение 1-2 мин Как следует из рис 4 , липосомы из ФХ и смеси ФХ и эфиров жирных кислот индуцировали кислородный взрыв в макрофагах с одинаковой эффективностью и этот эффект зависел от их концентрации

Для оценки величины действия липосом их эффект был сопоставлен с действием на ХМ активатора протеинкиназы С миристинового эфира форбола ( МЭФ) (0 1 мкМ ) и ионофора ионов кальция А 23187 (10 мкМ) Из табл 2 видно, что оба соединения усиливали интенсивность ХМ люминола в полтора раза, также как и липосомы в наиболее эффективной концентрации Но достижение постоянного значения ХМ происходило более медленно по сравнению с липосомами - в течение 3-4 мин

мкМ С ФОСФОЛИПИДОВ

Рис 4 Интенсивность ХМ люминола при инкубации с АМ при добавлении различных концентраций липосом следующего состава 1-липосомы из ФХ, 2- липосомы из ФХ и ЭЖК, 3- липосомы из ФХ и ДАГ, 4 - липосомы из ФХ и АК

Введение арахидоновой кислоты в липосомы из ФХ усиливало эффект липосом (см табл.2 и рис 4), причем достижение максимального значения ХМ происходило значительно быстрее (0,5 мин), чем в случае липосом из ФХ Следует отметить, что действующая концентрация арахидоновой кислоты ниже, чем ККМ данного соединения, поэтому ее активирующее действие в данном случае не может быть связано с известным детергентным эффектом жирных кислот

Аналогичное действие оказывало введение в состав липосом ДАГ (см рис 4 и табл 2) Как следует из приведенных данных, все три параметра - величина активирующего эффекта липосом из ФХ, содержащих ДАГ, зависимость их действия от концентрации и скорость достижения максимального значения ХМ - аналогичны данным по липосомам, содержащим в качестве второго компонента арахидоновую кислоту

Поглощение липосом клетками является многостадийным процессом, на первой стадии которого липосомы адсорбируются на поверхности макрофагов. Далее происходит процесс слияния липосом с клеточной мембраной и активация ФИ-цикла, в ходе которого образуются вторичные мессенджеры, ДАГ и арахидоновая кислота Оба эти соединения способны активировать протеинкиназу С, что делает в свою очередь возможным активацию НАДФН-оксидазы Этот фермент запускает цепь переноса электрона, в конце которой электрон присоединяется к молекуле кислорода, образуя супероксидный радикал и другие первичные метаболиты активированного кислорода Одним из доказательств в пользу данной схемы является тот факт, что МЭФ, который как известно способен активировать протеинкиназу С, также индуцирует кислородный взрыв в АМ

Табл. 2. Зависимость интенсивности хемилюминесценции (ХМ) люминола при инкубации с альвеолярными макрофагами в отсутствие и присутствии различных активаторов.

Активаторы Характеристики хемилюминисценции

Название Концентрация, мкМ Интенсивность ХМ, (мв) Время достижения макс ХМ (мин)

1 Контроль 300 ± 20 0

2 +МЭФ 0,001 0,1 460 +30 3-4

3 + ионофор А 23187 10 455± 35 2-3

4 + липосомы из ФХ 270 455± 25 1-2

5+липосомы из ФХ + 1,2-ДАГ 270 + 5,4 630 + 136 0,5

6 + липосомы из ФХ + ЭЖК 270 + 5,4 455 + 58 1-2

7 +липосомы из ФК + АК 270 + 5,4 700 ±72 0,1-0,5

Исходя из вышеописанного процесса, усиление кислородного взрыва при введении в мембрану отдельных метаболитов фосфолипидов может быть обусловлено участием их как в процессе слияния липосом с клеткой, так и активацией протеинкиназы С

Итак, липосомы из ФХ или смеси ФХ и эфиров жирных кислот способны вызвать активацию кислородного взрыва в альвеолярных макрофагах человека, по величине сопоставимую с действием МЭФ и ионофора 27183 Введение в состав ФХ-липосом ДАГ или арахидоновой

кислоты значительно усиливало этот процесс Ранее изученные свойства модельных и биологических мембран, в состав которых введены эти соединения, позволяет сделать заключение о том, они могут действовать как на стадии связывания липосом с поверхностью макрофагов, так и активируя механизмы, задействованные в физиологическом ответе клетки, например, влияя на проницаемость мембран для ионов кальция или активируя протеинкиназу С

142 Действие ДАГ-содержащих липосом на операционную рану кожи морской свинки Завершающим этапом данного направления исследований явилось изучение действия липосом из ФХ, содержащих и не содержащих ДАГ, на ткани Для этого сравнивали действие липосом из ФХ и смеси ФХ+ДАГ на процесс заживления операционной раны кожи морских свинок

Под общим наркозом животным проводили частичную резекцию легкого В момент повреждения легкого вводили липосомы внутрилегочно, в мышцу и кожу Использовали раствор липосом из ФХ (1,3 мг/мл и 13 мг/мл), и липосомы из смеси ФХ и 1,2-ДАГ в концентрации 13 мг/мл, содержащие 2% ДАГ от содержания ФХ Липосомы получали методом экструзии через поликарбонатные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм

Характер макроскопических изменений и уменьшение раневой поверхности определяли методом планиметрии Полученные результаты приведены в табл 3 При сравнении с контролем обнаружилось, что на 7-ой день после операции липосомы из ФХ в концентрации 1,3 мг/мл не оказывали какого-либо эффекта Заметное и статистически достоверное уменьшение площади раны отмечалось только в группах, где применяли липосомы из ФХ в концентрации 13 мг/мл Однако в этом случае положительный эффект зависел от дозы при использовании липосом в дозе б мг/кг не было отмечено существенных различий между опытной и контрольной группами, при дозе 25 мг/кг веса наблюдалось уменьшение площади раны на 30 % Дальнейшее увеличение дозы до 45 мг/ кг веса не приводило к существенному повышению эффективности (см табл 3)

Сопоставление результатов, полученных на 7 день после операции при использовании липосом из ФХ и липосом из ФХ+ДАГ в концентрации 13 мг/мл, выявило большую эффективность препарата, содержащего ДАГ при его применении площадь раны уменьшилась на 55 % по сравнению с контролем Следует отметить, что действием препарата, содержащего ДАГ, отмечали уже на первый день после операции

Во введении упоминалось о лекарственных препаратах на основе фосфолипидов, механизмы фармакологического действия которых интенсивно обсуждаются в литературе По мнению большинства исследователей, основным механизмом является взаимодействие липосом с клетками системы мононуклеарных фагоцитов Результаты данного исследования прямо указывают на то, что при взаимодействии липосом с макрофагами происходит активация последних и при этом образуются активные формы кислорода

Таблица 3. Влияние липосом разного липидного состава на площадь раны на коже морской свинки.

№ Состав ФЛ Доза мг/кг Площадь раны (мм:)

1-ые сутки 7-ые сутки

1 ФХ 6 25,6±1,2 17,3±0,4

2 ФХ 25 22,3±0,8 12,5±0,3

3 ФХ 40 22,9±1,5 11,3±0,3

4 ФХ+ДАГ 25 20,6±0,9 8,0±0,2

5 Контроль - 24,2±1,4 18,2±0,4

Эти данные могут объяснить бактерицидный эффект препаратов фосфолипидов, ранее отмеченный в литературе В свою очередь это может быть одной из причин лучшего заживления операционной раны, обработанной липосомами и тогда становится ясно, почему ДАГ, более эффективно активирующий макрофаги, ускоряет заживление раны

Итак, введение в состав модельных мембран ДАГ, метаболита фосфолипидов, образующегося при активации фосфатидилинозитного цикла, приводит к изменению их структурной организации, в результате чего происходит уменьшение стабильности ОВ и индуцируется их слияние, в мембранах появляется проницаемость для ионов кальция

В клетках и тканях введение ДАГ и арахидоновой кислоты приводит к увеличению тока кальция внутрь нервных окончаний, к возрастанию интенсивности кислородного взрыва фагоцитов, при этом происходит ускорение заживления операционной раны кожи морских свинок Полученные результаты показывают, что предполагаемое воздействие бактериальных фосфолипаз на липосомы не только не уменьшает, но даже может увеличивать терапевтический эффект последних

2. КОМПЛЕКСЫ НЕМЕМБРАННЫХ ВОДОРАСТВОРИМЫХ БЕЛКОВ С ЛИЛИДНЫМИ ЭКСТРАКТАМИ И СМЕСЯМИ ФОСФОЛИПИДОВ

Известно, что заболевание туберкулезом сопровождается воспалительным процессом, при котором активируются гидролазы разных типов, в том числе протеазы Ряд лекарственных препаратов противовоспалительного действия (в том числе давно применяемый препарат «Гордокс») содержат основной панкреатический ингибитор трипсина Другой белковый ингибитор, который также обладает противовоспалительным действием, соевый ингибитор Баумана Бирк, пока проходит клинические испытания Оба белка хорошо растворимы в воде и достаточно быстро выводятся из организма Для усиления их проникновения в клетки проводят гидрофобизацию белков с помощью активных производных жирных кислот Задачами данного этапа исследований явилась гидрофобизация этих белков путем получения белок-липидных комплексов с препаратами фосфолипидов разного состава и определение ингибирующей активности данных белков в составе комплекса

2.1. Получение белок-лигщдных комплексов и определение их состава. Для исследований были выбраны два белковых ингибитора протеаз: основной панкреатический ингибитор трипсина (ВРИ) и соевый ингибитор типа Баумана-Бирк (ВВ1). Исследовали процент связывания этих белков в комплексы с фосфолипидами в различных условиях и ингибирующую активность белков в составе комплексов в отношении трипсина. В связи с тем, что фосфолипиды могут взаимодействовать не только с ингибиторами, но и с ферментом, провели аналогичные исследования для трипсина

В качестве липидного компонента были использованы различные липиды сои Грубый лилидный экстракт ЛГИ был получен экстракцией соевой муки смесью хлороформ-метанол, далее в ходе дополнительной очистки ЛП-1 водным раствором хлористого натрия удалены сапонины и таким образом получен экстракт ЛП-2, Их составы приведены на рис.5. Далее методом адсорбционной хроматографии из липидкых экстрактов сои получены индивидуальные фосфолипиды ФХ, ФЭ, ФИ и их смеси ЛП-3 - ЛП-10 ( см.табл.4).

Для препаративного получения белок-липидных комплексов была разработана специальная методика и подобраны такие соотношения белок'лилвд, при которых образовавшиеся комплексы выпадали в осадок при рН среды инкубации, равной 3,0. Осадки отделяли центрифугированием от исходных компонентов. Содержание белка в комплексах определяли модифицированным методом Лоури, а фосфолипидов - методом Дитмера по неорганическому фосфору. Копичество белка в комплексе выражали в процентах к количеству белка в среде инкубации.

100

ЛП-2

Жирные кислоты Полипептиды,белки

Сапонины,сапогенины

Фосфолипиды

ЛЛ-3

Рис.5. Состав лип идных препаратов ЛП-1 и ЛП-2 и смеси фосфолипидов ЛП-3

Табл.4. Фосфолипиды и их смеси, используемые для получения комплексов с белковыми ингибиторами

Содержание индивидуальных фосфоли-пидов, % от суммы всех фосфолипидов

ФХ ФЭ ФИ ФГ ФК л-ФХ

ЛП-1 42 20 18 13 7

ЛП-2 42 20 18 13 7

ЛП-3 42 20 18 13 7

ЛП-4 44 22 34

ЛП-5 88 5 5

ЛП-6 88 10

ЛП-7 99

ЛП-8 66 33

ЛП-9 50 50

ЛП-10 33 66

В связи с тем, что комплексы получали при рН 3,0, при расчете содержания отрицательно заряженных компонентов учитывалось рК фосфолипидов, равное 2,1 и то, что ряд фосфолипидов имеет несколько рК (ФК имеет имеет два рК, равные 2,1 и 7,2 соответственно, а рК1 и рКг молекулы КЛ равны соответственно 3,0 и 7,4)

На рис б представлена зависимость содержания исследуемых белков (масс%) в комплексах от содержания в липидных препаратах отрицательно заряженных компонентов Видно, что по мере возрастания содержания отрицательно заряженных компонентов происходит усиление связывания с ними водорастворимых белков Для всех четырех белков наибольшее содержание белка (70%) наблюдалось в комплексе с препаратом ЛП-1, содержащим наряду с фосфолипидами отрицательно заряженные сапонины и жирные кислоты

Полученные результаты однозначно говорят о существенном вкладе электростатических сил во взаимодействие, что согласуется с наиболее распространенной точкой зрения о природе сил взаимодействия водорастворимых белков с фосфолипидами Однако из рис 6 следует также, что водорастворимые белки связываются не только с заряженными липидами, но и цвиттер-ионами (ФХ или смесями ФХ ФЭ) Это означает, что, несмотря на то, что связывание водорастворимых белков с фосфолипидами определяется в основном электростатическим взаимодействием, наряду с этим присутствует и неэлектростатическая составляющая Под этим понимается вклад любых факторов, оказывающих влияние на связывание белка с липидом, например гидрофобное взаимодействие между белком и липидом, конформационные изменения молекулы белка, изменения в структурной организации фосфолипидов и т д

Связывание

Огриц зар, рН=3,0

Рис 6 Процент связывания водорастворимых белков с липидными препаратами, содержащими различные количества отрицательно заряженных компонентов

Поэтому задачей следующего этапа работы явилась оценка вклада неэлектростатической составляющей во взаимодействии ВРТ1 и ВВ1 с цвиттерионными фосфолипидами Для исследований были выбраны четыре препарата ФХ (ЛП-7) и смесь ФХ ФЭ, в которых доля ФХ и ФЭ составляла соответственно 67 33 (ПП-8), 50 50(ЛП-9) и 33 67 (ЛП-10)

Предварительно методом лазерного светорассеяния определили размер частиц, методом 31Р-ЯМР спектроскопии -структурную организацию фосфолипидов в составе мультиламеллярных везикул, а также гидрофобность поверхности частиц по коэффициенту распределения этих препаратов в системе Тритон Х-114/вода В последнем случае было проведено дополнительное исследование, которое показало, что после расслоения этой системы на фазы (воду и Тритон Х-114) насыщение водной фазы Тритоном не влияет на структуру и свойства липидных агрегатов в водной фазе

Обнаружили, что дисперсия ФХ вне зависимости от концентрации состоит из частиц размером 1,3-1,7 мкм Добавление не более 50% ФЭ ( препараты ФХ.ФЭ (67 33) и (50 50)) приводит к уменьшению размеров частиц до 0,5-0,8 мкм, в которых сохраняется бислойная упаковка фосфолипидов При дальнейшем повышении содержания ФЭ (препарат ФХ ФЭ 33 67) происходит изменение структурной организации фосфолипидов появляется изотропная фаза (данные по 31Р-ЯМР-исспедованию не приводятся)

Параллельно определили коэффициент распределения ОВ исследуемых четырех фосфолипидных смесей в системе Тритон X-114/вода

Содержание ФЭ в смеси ФХ/ФЭ, вес.%

Рис 7 Зависимость коэффициента распределения Кр для ОВ, состоящих из ФХ и ФЭ в различных соотношениях, в системе Тритон Х114/вода

Установили, что увеличение содержания ФЭ в смеси сопровождается достоверным увеличением коэффициента распределения (Кр) только в одном случае - для смеси ФХ/ФЭ (33/67) (см рис 7) Коэффициент распределения определяет стандартную свободную энергию переноса вещества из одной фазы в другую AGnepeHoo = - RTInKp, и для случая переноса из водной фазы в органическую Кр является мерой гидрофобности исследуемого вещества Таким образом, найденное увеличение Кр прямо свидетельствует о возрастании гидрофобности поверхности агрегатов при повышении в них содержания ФЭ до 67%, благодаря чему процесс перехода смеси ФХ/ФЭ (33/67) из водной фазы в органическую сопровождается выигрышем в свободной энергии системы по сравнению с другими образцами Этот результат хорошо коррелирует с уменьшением гидратации агрегатов фосфолипидов, заданной их составом и структурной организацией

Анализ содержания исследуемых белковых ингибиторов протеаз в комплексах с цвиттерионами представлен на рис 8 Видно, что для BPTI содержание белка в комплексе линейно увеличивается с увеличением содержания ФЭ во всем интервале исследуемых соотношений ФХФЭ. Для BBI эта зависимость имеет вид кривой, проходящей через максимум

Итак, несмотря на то, что оба исследуемых белка продемонстрировали одинаковую тенденцию увеличения связывания при увеличении доли отрицательно заряженных фосфолипидов в препарате, их поведение при взаимодействии с цвиттерионными фосфолипидами сильно различается

ФХ (100)

ФХ/ФЭ (67/33)

ФХ/ФЭ (50/50)

ФХ/ФЭ (33/67)

Рис 8 Связывание ВРТ1 (от соотношения ФХ ФЭ

-) и ВВ1 (— ) в комплексы в зависимости

Это говорит о различном вкладе гидрофильных и электростатических сил при образовании комплексов ВРТ1 связывается на поверхности агрегата фосфолипида в основном электростатически и уменьшение гидратации поверхности при увеличении содержания ФЭ облегчает связывание Напротив, ВВ1, несмотря на отсутствие а-спирали в молекуле и хорошую растворимость в воде, способен проникать в гидрофобную область мембраны

Поэтому увеличение жесткости мембраны при образовании изотропной фазы в случае ФХФЭ (33 67) приводит к уменьшению связывания Для подтверждения этого предположения изучили влияние ионной силы на этот процесс Результаты, приведенные в рис 9, свидетельствуют о том, что начальное увеличение ионной силы в случае ВРТ! ингибирует образование комплекса на 50% Для ВВ1, напротив, начальное увеличение ионной силы не влияет на связывание белка, но в присутствии высокой ионной силы доля связанного в комплекс белка резко возрастает, что характерно для гидрофобного взаимодействия

NaCI, M

Рис 9 Влияние ионной силы на образование комплексов из ФХ/ФЭ (50/50) и белковых ингибиторов 1 - BBI, 2 - BPTI

Для подтверждения участия гидрофобных сил в формировании комплекса с ВВ1 использовали метод флуоресценции Для оценки топологии комплексов применяли две флуоресцентные метки, одна из которых - антрацен - вводится в гидрофобную область мембран Другая -родамин В - выбрана в качестве флуоресцентной метки для белка Интенсивность флуоресценции для комплексов из МЛВ, меченных антраценом, и ВВ1, меченного родамином В, представлена на рис 10В связи с тем, что белок поглощает в той же области, что и антраценовая метка, полученные результаты были обработаны с поправкой на внутренний фильтр

Сдвиг Хмакс флуоресценции ВВ1, меченного родамином В, в коротковолновую область и увеличение интенсивности флуоресценции при образовании комплекса с ВВ1КЛ со смесями фосфолипидов различного состава свидетельствуют о переходе белка в менее полярное окружение В свою очередь, при образовании комплексов наблюдается снижение интенсивности флуоресценции антраценовой метки, расположенной ближе к концу жирнокислотной цепи Это означает также, что при взаимодействии с фосфолипидами белок погружается в гидрофобную область мембраны Эти данные подтверждают результаты, показавшие отсутствие ингибирующего воздействия ионной силы на образование комплекса с ВВ1, и говорят о существенном вкладе гидрофобных взаимодействии в образование белок-липидного комплекса для данного белка

1200

4000

800

400

500

550 600 650 350 400 450

Длина волны, нм Д"ина 80ЛНЫ- нм

Рис 10 Спектры флуоресценции А) ВВ1, меченного родамином В в отсутствие (1) и присутствии МЛВ из смеси ФХФЭ(50 50) (2) или ФХФЭ(33 67) (3), Б) антрил-ФХ в составе липосом из смеси ФХ ФЭ(50 50) (1,2) или ФХ ФЭ(33 67) (3,4) в отсутствие (1,3) и присутствии (2,4) белкового ингибитора

500

Определение белок/липидного состава комплексов, описанное выше, позволило оценить удельную ингибирующую активность белковых ингибиторов в составе комплексов

2 2 Активность трипсина и его белковых ингибиторов в составе комплексов

2 2 1 ТРИПСИН. Эстеразную активность трипсина в составе комплекса измеряли по скорости гидролиза специфического субстрата этилового эфира М-бензоил-Ьаргинина (ВАЕЕ) в диапазоне концентраций комплексов от 0,03 до 0,3 мг/мл Активность трипсина в комплексе составляла ~ 35 % по сравнению с его водным раствором В присутствии детергента (2,5 % ДОХ), солюбилизирующее действие которого приводит к существенному уменьшению размеров МЛВ, наблюдали повышение активности трипсина до 45% (данные не приводятся) 2 2 2 ВРТ1 Для определения антитриптической активности комплексов ВРТ1 измеряли скорость гидролиза специфического субстрата ВАЕЕ трипсином в присутствии комплекса ВРТ1 с различными липидными препаратами. Параллельно проводили измерения ингибирования гидролиза субстрата раствором ВРТ1 в той же концентрации, которая содержится в комплексе Определение состава полученных осаждением комплексов позволило рассчитать удельную активность ингибитора в составе комплексов, образованных в различных условиях Из рис 11 следует, что ВРТ1 проявлял минимальную активность в составе

комплексов через 1 ч после получения и при хранении в течение 7 дн При добавлении ионного детергента ДОХ (2,5%) к ВРТ1-липидным комплексам активность ингибитора во всех образцах значительно возрастала Методом электрофореза было показано, что инкубация комплексов в присутствии ДОХ не приводит к появлению свободного ингибитора в дисперсиях комплексов, т е при действии ионного детергента белок остается в его составе Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что минимальная активность ингибитора в составе комплекса не связана с его необратимой инактивацией, а вызвана, по-видимому, блокированием активного центра ингибитора Низкая активность ингибитора в составе комплекса говорит о том, что белок связывается с МЛВ фосфолипидов областью, расположенной близко к активному центру Это предположение подтверждается тем фактом, что активность ингибитора в составе комплекса восстанавливается при добавлении ДОХ, который превращает МЛВ в мицеллы В таком состоянии активный центр ингибитора доступен для трипсина

Рис 11 Антитриптическая активность BPTI-липидных комплексов, через 1 ч после получения (1), через 1 неделю (2) и 1 ч в присутствии

ДОХ(З)

2 2 3. ВВ1. Антитриптическая активность комплексов с BBI также определялась по их ингибирующему действию на скорость гидролиза ВАЕЕ трипсином Содержание белка в составе различных комплексов определяли ранее Установили (см рис 12), что активность ингибитора в комплексах, содержащих отрицательно заряженные фосфолипиды (ЛП-1 - ЛП-5) равна 25-40% , что значительно выше по сравнению с BPTI

Существенное ингибирование активности трипсина и антитриптической активности его ингибиторов позволило предположить, что при образовании комплексов происходит блокировка их активных центров агрегатами фосфолипидов Для подтверждения этого предположения изучили антитриптическую активность комплексов с BBI в присутствии ДОХ Установили, что для ЛП-1, ЛП-2, ЛП-4

антитриптическая активность возрастает в 2 - 2,5 раза и мало изменяется в случае с ЛП-3 и ЛП-5 (рис. 12). Это может быть связано с неполной фрагментацией комплексов данного липидного состава при используемой концентрации ДОХ.

100 т——

£ 40

ЛГМ ЛП-2 ЛП-3 ЛП-4 ПП-5

100

я 60

О ■

ФХ ФХ/ФЭ (100) {67/33)

ФХ/ФЭ ФХУФЭ (50/50) (33/67)

Рис. 12. Антитриптическая активность ВВ1 в составе липосом из: (А) отрицательно заряженных липидов в отсутствие и в присутствии ДОХ и Б) липидов цвиттер-ионов.

Наряду с препаратами фосфолипидов, содержащих отрицательно заряженные компоненты, было проведено исследование активности ВВ1 а составе комплексов из фосфолипидов- цвиттерионов, результаты которого представлены на рис.12 б. Видно, что в составе этих комплексов ВВ1 имел более низкий уровень активности по сравнению с комплексами, содержащими отрицательно заряженные компоненты.

Итак, снижение активности исследуемых ферментов (трипсина) и его белковых ингибиторов при связывании с фосфопитщами происходит за счет экранирования активных центров белков. При уменьшении размеров частиц комплекса под действием ДОХ доступ к активным центрам облегчается и активность возрастает.

2.3. Комплексы фосфолипидов с бактериоцинами и их антимикробная активность.

Как отмечалось выше, одно из направлений для разработки новых подходов к печению туберкупеза заключается в поиске новых препаратов, способных ингибировать рост микобактерий туберкулеза и при этом быть нетоксичными для организма человека. Ранее с этой целью сотрудники ЦНИИ туберкулеза РАМН провели анализ антибактеральной активности различных бактериоцинов - пептидов,

секретируемых клетками Lactobacillus sahvanus, Streptococcus cncetus и Enterococcus faecalis Они впервые обнаружили способность ряда бактериоцинов подавлять рост М tuberculosis H37Rv Механизм действия пептидов основан на том, что они образуют поры в бактериальной мембране, что приводит к гибели клетки бактерии Чтобы оценить токсичность бактериоцинов в отношении клеток организма животного, в частности макрофагов, измеряли уровень лактатдегидрогеназы клеток в присутствии различных бактериоцинов в диапазоне концентраций от 0,1 до 10 мкг/мл Таким образом был выбран бактериоцин, далее обозначаемый как Веп5, секретируемый Е faecalis, который наиболее эффективно ингибировал рост М tuberculosis и не вызывал повышения уровня лактатдегидрогеназы при использовании его в минимальной ингибирующей концентрации (МИКэо), равной 0 1 мкг/мл К сожалению, ими же было установлено, что этот пептид не подавляет рост М tuberculosis H37Rv в инфицированных макрофагах мышей из-за того, что водорастворимые пептиды не проникают через мембрану макрофагов

Поэтому задачей данного этапа работы явилась разработка липосомальной формы наиболее эффективного Ben5 Е faecalis Для этого использовали ту же методику, что и для белковых ингибиторов сериновых протеаз были подобраны такие соотношения белок липид, при которых при инкубации обоих компонентов происходит образование осадка После центрифугирования осадок отделяли от супернатанта, в котором находился свободный белок, диспергировали в среде инкубации микобактерий (среда Дюбо) при рН 7,4 Методом экструзии получали ОВ, в которых определяли содержание белка и фосфолипидов Для получения липосом использовали либо ФХ, либо смесь ФХ KJ1 (1 4) В первом случае связывалось 10% белка, введение КЛ в липосомы увеличивало связывание до 30%

Далее изучали действие ОВ с бактериоцином на рост М tuberculosis H37Rv in vitm и in vivo Рост микобактерий в культуре в течение 6 дней определяли по уровню включения 3Н-урацила в РНК микобактерий Этот же метод применяли для определения роста М tuberculosis H37Rv в перитонапьных макрофагах мышей Для заражения макрофагов их инкубировали с микобактериями в течение 18 ч, после чего в среду инкубации вводили либо водный раствор Веп5, либо его липосомапьную форму Контролем служил водный раствор рифампицина (1 и 0,1 мкг/мл) Полученные результаты по уровню включения 3Н-урацила в РНК микобактерий в присутствии различных добавок приведены на рис 13

Видно, что водный раствор Веп5 из Е faecalis (0,1 мкг/мл) подавлял рост М tuberculosis H37Rv (рис 13а), но никак не влиял на размножение микобактерий в макрофагах (рис13в) Косвенным подтверждением этого служат и данные по увеличенному содержанию лактатдегидрогеназы в среде инкубации инфицированных макрофагов (рис 136) В отличии от водного раствора Вег\5 его липосомальная форма обладает эффективностью не только в отношении М tuberculosis H37Rv (рис 13а), но и инфицированных макрофагов (рис 13в)

О. O

5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0

s —

1 й ©

•sí

& a

5 s

= i

я -í

s i

« s

i ■

§ Л fS

45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

ífl

íl

2 S

-Э s

О. В А. Я Я ¡S Я" к

s -f. ffj

с я s

! 2 y*

s O.

m" 1600

С 1400 Я- 1200 a. 1000 КГ 8°°

X 600

o 400 s

200 0

íl

[íl

-е- я s. S í 5

wf-

E o

o „г

8 X

a s

£ s

S <=> a

Рис 13 а) Число импульсов в минуту при включении ЗН-урацила в РНК М tuberculosis H37Rv, б) уровень активности лактатдегидрогеназы в среде инкубации нативных и инфицированных макрофагов мыши, в) число импульсов в минуту при включении 3Н-урацила в РНК М tuberculosis H37Rv в инфицированных макрофагах мыши

При этом отмечается практически нормальный уровень активности лактатдегидрогеназы в среде инфицированных макрофагов (рис.136).

Полученные результаты указывают на возможность использования липосомальной формы Веп5 как противотуберкулезного препарата tn vivo Для подтверждения этого было исследовано его действие в дозе 10 мкг привнутривенном введении на мышах, зараженных смертельной дозой М tuberculosis H37Rv (2 х 10+7 КОЕ) Для сравнения с известными ПТП использовали рифампицин в дозе 75 мкг Лечение начинали через 1 день после заражения и проводили его в течение последующих 5 дней 1 раз в день Результаты трех опытов суммированы в табл 5, из которой видно, что внутривенное введение водного раствора Веп5 не оказывало эффекта, а его липосомальная форма удлиняла срок жизни мышей на 30%

Следует отметить, что в выбранной модели эксперимента мышам вводится смертельная доза М tuberculosis В этих условиях рифампицин в данной дозе только удлиняет срок их жизни Поэтому полученное в эксперименте достоверное увеличение срока жизни зараженных животных при применении липомальной формы Веп5 говорит о перспективности дальнейших исследований с этим препаратом

Табл. 5. Влияние различных препаратов на продолжительность жизни мышей, зараженных летальной дозой М. tuberculosis H37Rv

№ Экспериментальные группы Доза препарата/ на мышь Время жизни животных после заражения (MST ± SD, дни)

1 Лечение отсутствует - 21 ±3

2 Водный раствор Веп5 10 мкг 21 ±3

3 Липосомы из ФХ КЛ (1 4) 100 мкг 21 ±2

4 Липосомальная форма Веп5 Веп5 -10 мкг ФЛ -100 мкг 28 ±3*

5 Рифампицин 75 мкг 34 ±6

*Р< 0 05 (Gohan's criterion)

Проведенные исследования наглядно демонстрируют преимущества липосомапьных форм ПТП перед их водным раствором, которые во многом обусловлены способностью липосом фагоцитироваться макрофагами и направленно транспортировать лекарство к месту локализации микобактерии

В ходе проведения экспериментов, описанных в двух предыдущих разделах работы, были получены важные результаты, касающиеся характера взаимодействия частиц из фосфолипидов, различающихся составом и структурой (мицеллы, однослойные и мультиламеллярные везикулы), с «дополнительными» компонентами

(низкомолекулярными гидрофобными соединениями, пептидами, белками) и показано влияние этих соединений на различные свойства (структурную организацию, стабильность и проницаемость) фосфолипидных мембран В некоторых случаях это приводило к повышению эффективности фармакологического действия везикул из фосфолипидов, установленной например при изучении действия ДАГ-содержащих липосом на процесс заживления операционной раны

Эти результаты позволили нам перейти к исследованию чрезвычайно важной с медицинской точки зрения проблемы использования фосфолипидов для создания новых форм препаратов для лечения туберкулеза - рифампицина и рифабутина Для получения препаратов с максимально высоким включением антибиотиков в фосфолипидные везикулы необходимо было сначала изучить их физико-химические свойства в широком интервале рН и взаимодействие с различными модельными мембранами.

ГЛАВА 3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ АНТИБИОТИКОВ РИФАМИЦИНОВОГО РЯДА С МОДЕЛЬНЫМИ

МЕМБРАНАМИ

Проблеме разработки липосомапьных форм различных ПТП посвящено большое число исследований Задачей данного этапа настоящей работы явилась разработка такого препарата, в котором бы содержание антибиотика в водной фазе значительно превышало бы его растворимость. Для решения этой задачи на первом этапе работы изучили ряд физико-химических параметров антибиотиков рифампицина и рифабутина, которые эффективно подавляют жизнеспособность возбудителя туберкулеза М tuberculosis, и их взаимодействие с модельными мембранами в различных агрегационных состояниях (мультиламеллярные везикулы и ОВ) и при разных рН среды

Другой задачей данного этапа работы являлась разработка на основе полученных результатов стабильной липосомальной формы рифампицина и оценка ее эффективности в отношении М tuberculosis in vitro и in vivo Выбор именно рифампицина в качестве субстанции связан в первую очередь с его более выраженной по сравнению с рифабутином токсичностью Не последнюю роль сыграли также низкая цена субстанции (по сравнению с рифабутином рифампицин в 10 раз дешевле) и тот факт, что рифампицин является препаратом первого ряда и широко применяется при лечении туберкулеза

31 Физико-химические характеристики рифампицина и рифабутина Рифампицин применяется как противотуберкулезный препарат более тридцати лет, и накоплен значительный материал о его свойствах и действии Напротив, рифабутин введен в медицинскую практику сравнительно недавно и о его свойствах (растворимости, константах ионизации и коэффициенте распределения) в литературе представлена очень скудная информация К сожалению, практически нет данных и о свойствах рифабутина при различных рН среды Это важно с той точки зрения, что воспалительный процесс, который присутствует при развитии туберкулеза, приводит к понижению рН ткани

В связи с этим задачей на данном этапе явилось изучение влияния рН среды на растворимость антибиотиков и на их взаимодействие с модельными мембранами Для количественной оценки такого взаимодействия использовали коэффициент распределения этих соединений в системах липосомы/вода и октанол/вода

Рифампицин и рифабутин являются полусинтетическими антибиотиками, производными рифамицина вУ Их формулы приведены на рис 14, а зависимость от рН растворимости антибиотиков и коэффициента распределения в системе октанол/вода представлена на рис 15-17

А) Б)

Рис 14 Структурные формулы рифампицина (А) и рифабутина (Б)

Рис 15 Зависимость от рН среды коэффициента распределения рифампицина в системе октанол/вода (столбики) и заряда молекулы (линия)

100-j

Рис 17 Зависимость растворимости рифабутина (•) и его коэффициента распределения в системе октанол/вода (ж) от рН среды

Как видно из этих данных, свойства обоих антибиотиков изменяются при изменении рН среды, что связано с наличием в их молекуле ряда ионизирующихся групп

Данные по определению рКа в молекулах обоих антибиотиков будут представлены ниже, а в данном разделе представлялось необходимым остановиться на сравнительном определении

коэффициентов распределения антибиотиков в двух системах октанол/вода и липосомы (ОВ)/вода при рН 6,4 Выбор данного значения обусловлен тем, что при попадании в организм человека М tuber проникает в макрофаги путем фагоцитоза и именно там, в фагосомах, происходит ее размножение Известно, что рН фагосомы равно 6,4. Таким образом, исследование свойств антибиотиков при этом рН моделирует его поведение в фагосоме Согласно полученным результатам, суммированным в табл 6, рифампицин имеет одинаковые значения Кд для обеих систем

Табл.6 Коэффициенты распределения антибиотиков в различных системах при рН 6,4 и 0,15 М NACI

№ Исследуемая система Метод Измерения РИФАМПИЦИН РИФАБУТИН

1 МЛВ из ФХ Разделение фаз 80±30 284±55

2 БОЛ В из ФХ Тушение флуоресценции метки (антрил-ФХ) Нет данных 395±75

3 Октанол/вода Разделение фаз 60±20 1580±300

4 Октанол/вода Расчет по Программе АСО/РМ 50 1900

Это говорит о том, что он одинаково хорошо проникает как в изотропную фазу октанола, так и в липосомы, которые имеют выраженную анизотропию и структуры, и свойств

Напротив, для рифабутина переход в октанол протекает легче, чем в липосомы Возможно, это происходит за счет выраженных электростатических взаимодействий с поверхностью фосфолипидного агрегата, о котором говорилось выше Для рифампицина такое взаимодействие минимально, и он сразу погружается в гидрофобную область мембраны

3 11 Определение констант ионизации Согласно литературным данным, в молекуле рифампицина присутствуют две ионизирующихся группы с рКа 7,9 и 1,7, которые были соотнесены с гидроксилом нафтола и азотом пиперидина

Такие сведения о рифабутине отсутствуют В результате собственных исследований методами спектрофотометрии и потенциометрического титрования установили, что в молекуле рифабутина присутствуют три ионизирующиеся группы, имеющие следующие рКа 1) 6,5, которую приписали ОН-нафтола, 2) 3,5 (Ы-имидазола), 3) 9,5 (Ы-пиридина)

Эти результаты позволили рассчитать содержание отдельных ионизационных форм антибиотиков (аниона, цвиттериона, катиона) в

зависимости от рН среды Оказалось, что в интервале рН 6,4-7,4 рифампицин находится в основном в виде аниона и цвиттериона, а рифабутин, напротив, в виде катиона и цвиттериона (данные не приводятся)

Различие в знаке заряда в молекулах антибиотиков должно отразиться на характере их взаимодействия с модельными мембранами, содержащими заряженные фосфолипиды Для подтверждения этого предположения изучали связывание обоих антибиотиков с липосомами (ОВ) из смеси ФХКЛ с различными содержанием КЛ Для этого ОВ, исходно содержащие один из антибиотиков, методом гель-фильтрации отделяли от свободного антибиотика, а во фракции липосом спектрофотометрически определяли его содержание На рис 18 представлен процент связывания антибиотиков с ОВ различного липидного состава Видно, что рифампицин в наибольшей степени связывается с липосомами из ФХ, а введение КЛ уменьшает связывание Для рифабутина наблюдается противоположная ситуация увеличение содержания КЛ в составе липосом увеличивает его связывание Этот результат представляется логичным, т.к часть молекул рифабутина несет положительный заряд

о о о с

с; ш

л о.

ф а

ФХ, 1=0,15 ФХКЛ (4 1), ФХКЛ (11), ФХКЛ 1=0,15 1=0,15 (1 4),1=0,15

Липидный состав липосом

Рис 18 Включение рифабутина (светлые столбики) и рифампицина (темные столбики) в липосомы из ФХ с различным содержанием КЛ Физраствор, рН среды 6,2-6,4

Для оптимизации условий, при которых достигается наибольшее включение антибиотиков в липосомы помимо варьирования фосфолипидного состава изучили влияние ионной силы и рН в интервале 6,4-7,4 Обнаружено, что увеличение ионной силы приводит к уменьшению связывания рифабутина с отрицательно заряженными липосомами (ОВ) и никак не влияет на этот процесс для рифампицина Изменение рН в этом интервале не сказывалось на степени связывания

В результате проведенных исследований были определены условия, при которых солюбилизация антибиотиков фосфолипидами

позволила значительно увеличить их содержание в водной фазе рифампицина в 5-10 раз, рифабутина - в 100 раз и перейти к разработке лекарственной формы рифампицина

3 2 Продукты превращения рифампицина в водном растворе и в липосомальной форме при разных режимах хранения К лекарственной форме препарата предъявляются два основные требования наличие специфической активности и стабильность при хранении в течение не менее года Как известно, рифампицин очень нестабильный препарат, который легко окисляется и подвергается быстрой деструкции В результате этого образуются большое число продуктов хинон рифампицина, 3-формилрифамицин Э\/, Ы-оксид рифампицина, 25-дезацетилрифампицин (см рис 19)

Рис 19 Структурные формулы а) рифампицина, б) 3-формилрифамицина ЭУ/, в) 25-дезацетилрифампицина, г) Ы-оксид рифампицина, д) хинон рифампицина или 25-дезацетилрифампицина

В связи с тем, что определение его антибактериальной активности в отношении медленно растущей микобактерии туберкулеза занимает как минимум 3 недели, вопрос о стабильности рифампицина являлся первоочередным

Табл.7. Характеристики РФ, рифамицина SV и продуктов их превращения___

№ Название Максимумы на электронном спектре (этанол), нм Rf (систе мы А/Б) Масс-спектры, m/z

1 Рифампицин 475 338 240 05 / 06 821 4 822 3 823.3

2 Хинон рифампицина 545 340 272 06 / 1 0 819 2 820 2 821 4

3 3- формилрифамицин SV 485 322 225 0 35 /04 724 4 725 3 726 3

4 Рифамицин SV 450 312 230 00 / 0 70 696 3 697 3 698 3

5 Хинон рифамицина SV 530 312 230 0 70 /1 0 6961 6971 6981

6 25-дезацетил-рифампицин 475 338 240 0 35 /05 779 3 780 3 781 3

7 Хинон 25-деза-цетилрифампицина 535 336 268 0 40 /1 0 779 2 780 1 781 6

8 N-оксид рифампицина 475 338 240 0 05 /0 1 837 4 838 4 839 5

9 Хинон N-оксида рифампицина 540 334 262 015 /1 0 -

* - масс-спектр получен при детектировании положительных ионов

Для идентификации продуктов, образующихся при хранении липосомальной формы рифампицина, сначала получили различные продукты деструкции и окисления этого антибиотика при инкубации его водного раствора (1 мг/мл) в различных условиях Компоненты реакционной смеси разделяли методом двумерной ТСХ в системах А (хлороформ метанол (91)) и Б (хлороформ этанол (1 1)) Пятна с пластинок элюировали этанолом и анализировали их методом ВЭЖХ- на колонке Hypersil C-m 250x3 мм в градиенте ацетонитрила от 55% до 80% в воде, содержащей 0 2 % трифторуксусной кислоты Наличие рифампицина и продуктов его деструкции детектировали спектрофотометрически (254 нм). Масс-спектры получали методом электроспрей-ионизации на тандемном масс-спектрометре с ионной ловушкой в режиме детектирования отрицательных ионов

В табл 7 представлены характеристики широкого круга продуктов превращения рифампицина, полученных по известным методикам и выделенных методом ТСХ Их наличие сделало возможным

идентификацию и количественное определение продуктов деструкции и окисления рифампицина в составе липосом при хранении в различных режимах

Для стабилизации рифампицина и уменьшения содержания его основного продукта окисления - хинона рифампицина, в липосомальный раствор рифампицина вводили 0,5 % аскорбиновой кислоты Этот препарат в виде раствора и в виде лиофилизированного порошка (криопротектор- мальтоза) хранили в течение года при +4° (рекомендуемый режим хранения) и при 25° С в течение 3 мес (ускоренное хранение) Состав образцов анализировали 1 раз в месяц

Обнаружено, что при хранении препарата при +25°С уменьшение содержания рифампицина только за 1 месяц составило более 10%, в то время как при +4° С доля антибиотика в первые 6 месяцев сохранялась на уровне 95% от исходного, а через год снизилась до 90% (см табл.8)

Табл. 8. Содержание рифампицина (РФ) в различных препаратах при хранении +4°С и значения МИК этих препаратов в отношении М tuberculosis H37Rv (108 клеток/мл) при различных сроках хранения.

№ Препарат Лекарст форма Содержание, мг/мл* Срок хран мес МИКрф, м кг/мл

РФ 3-ФР X-РФ

1 РФ* Р-р 1 0 0 0 0 2-20

2 Липосомы с РФ Р-р 50 0 0 0 2-20

3 Липосомы с РФ Лиофил порошок **5 0 0 0 0 2-20

4 Липосомы с РФ р-р 45 0.4 <0 1 12 12-25

5 Липосомы с РФ Лиофил порошок 50 0 <0 1 12 12-25

6 Липосомы с РФ р-р 30 1 8 <0 1 18 6-20

7 Липосомы с РФ р-р 25 22 <0 1 24 6-20

*Сокращения в табл 8 РФ-рифампицин, 3-ФР - 3-формилрифамицин SV, Х-РФ- хинон рифампицина

** Содержание рифампицина приводится для лиофилизированного порошка при диспергировании его в1 мл физиологического раствора

При этом в препарате нарастало в основном содержание 3-формилрифамицина SV, в то время как доля хинона рифампицина была незначительна и не превышала 1% Состав лиофилизированного порошка липосом с рифампицином, напротив, сохранялся неизменным через 1 год хранения

Полученные результаты говорят о том, что лекарственная форма липосомального рифампицина возможна только в виде лиофилизированного порошка, стабилизированного добавлением аскорбиновой кислоты Однако для проведения экспериментов in vitro и in

vivo можно использовать раствор липосом с рифампицином в течение полугода после его получения

3 3. Антибактериальная активность риФампицина в липосомапьной Форме в отношении М tuberculosis при различных сроках хранения препарата Эксперименты по определению антимикробной активности водного раствора рифампицина, его липосомальной формы (раствор и лиофилизированный порошок) в отношении М tuberculosis H37Rv проводили совместно с сотрудником ЦНИИ туберкулеза РАМН к м н Л П Мартыновой

Исследовалась активность препаратов, которые хранились различные сроки (до 2-х лет) при 4 °С Полученные результаты приведены в табл. 8, из которой следует, что, во-первых, нет существенной разницы между антимикробной активностью водного раствора рифампицина и его липосомальной формы Во-вторых, антимикробная активность препаратов при длительном хранении практически не изменяется Это позволяет утверждать, что продукт деструкции рифампицина 3-формилрифамицин SV обладает антимикробной активностью, близкой к рифампицину, что хорошо согласуется с литературными данными Благодаря полученным результатам о наличии антимикробной активности его липосомальной формы в течение длительного времени оказалось возможным использовать этот препарат в экспериментах irt vivo

3 4 Действие /л vivo липосом. содержащих рифампицин. в отношении М tuberculosis Данная часть исследований проведена совместно с сотрудниками отдела иммунологии ЦНИИТ РАМН к.б н И В .Бочаровой, к м н В В Мищенко, д м н Л Л Посохиным Схема эксперимента была следующей, мышей заражали внутривенным введением М tuberculosis H37Rv в ретроорбитальный синус глаза в дозе 5x105 КОЕ, лечение осуществляли через 2 недели после заражения, ежедневно, в течение 2-х месяцев, липосомальную форму рифампицина вводили ингапяционно

В эксперименте использовали 4-е группы мышей (по 10 мышей в каждой группе), первая из которых (№1) была контрольной, в этой группе зараженные М tuberculosis животные не получали лечения В группе №2 зараженных животных лечили рифампицином и изониазидом (1 1 по весу) в дозе 1,5 мг смеси на мышь, препараты вводили внутрижелудочно Чтобы оценить эффективность данной схемы лечения, в группе №3 животные получали внутрижелудочно только один изониазид (доза 750 мкг/мышь) И наконец, в опытной группе №4 зараженные животные получали и изониазид, и рифампицин, но изониазид вводился внутрижелудочно (доза 750 мкг/мышь), а рифампицин в липосомальной форме ингаляционно (доза 37,5 мкг/мышь) В отдельных экспериментах было показано, что ингаляционное введение липосом, не содержащих антибиотика, не приводит к снижению накопления микобактерий в органах зараженных животных в данной схеме эксперимента и не предотвращает летальный исход

Результаты микробиологического исследования, суммированные в табл 9, свидетельствуют о выраженности туберкулезного процесса в контрольной группе животных В легких и селезенке этих животных

накопление М tuberculosis составляло 106 и 105 КОЕ/орган соответственно

Лечение зараженных животных только одним изониазидом (группа Na3) существенно снижало число микробных тел, но не приводило к полному выздоровлению, т е болезнь принимала хроническую форму Напротив, при совместном применении и рифампицина и изониазида в виде растворов, вводимых внутрижелудочно, лечение по предложенной схеме оказалось высоко эффективным Согласно данным табл 9, в органах животных этой группы (N92) вообще не выявлено накопления М tuberculosis

Табл.9 Количество высеваемых M.tuberculosis из органов зараженных мышей через 2 месяца лечения

Препарат КОЕ / селезенка КОЕ /легкоеХ+SD

1 Контроль (3 9±0 5)х10л5 (3 9±0 5)х10л6

2 Изониазид+ рифампицин 0 0

3 Изониазид (4 3+0 6)*10л3 (4 3+0 6)*10л3

4 Изониазид +липосомы с РФ (ингаляционно) 0 0

Замена водного раствора рифампицина на его липосомальный раствор, который вводили животным ингаляционно (группа №4) в отличии от животных группы №2, дала полностью положительный результат после окончания лечения в органах животных микобактерий не обнаружено Однако следует подчеркнуть, что доза рифампицина в липосомальной форме (группа №4) была в 15 раз меньше дозы водного раствора рифампицина, вводимого внутрижелудочно (группа №2) Кроме того, согласно гистологическим данным этот препарат не обладает гепатотоксичностью и улучшает структуру легочной ткани по сравнению результатами, полученными для группы №2

Эти результаты говорят не только о повышенной эффективности действия рифампицина в липосомальной форме, но и позволяют убедиться в дополнительных терапевтических эффектах самих фосфолипидов

ВЫВОДЫ

1 Обнаружено, что физико-химические свойства модельных мембран, изученные на примере однослойных везикул, изменяются при введении в их состав метаболита фосфолипидов 1 2-диацилглицерина уменьшается стабильность липосом и их мембраны становятся проницаемыми для ионов кальция

2 Показано, что механизм этого явления обусловлен способностью 1 2-диацилглицерина модифицировать биспойную упаковку фосфолипидов

3 Установлено, что введение 1 2-диацилглицерина в биологические мембраны также приводит к формированию кальциевых каналов проницаемости, которые ингибируются верапамилом Аналогично действует арахидоновая кислота, но не другие исследованные жирные кислоты

4 Обнаружено, что введение 1 2-диацилглицерина и арахидоновой кислоты в однослойные везикулы усиливает их действие на клетки и ткани возрастает интенсивность кислородного взрыва макрофагов, увеличивается скорость заживления операционной раны кожи

5 Показано образование гидрофобных комплексов водорастворимых белков-ингибиторов протеаз (основного панкреатического ингибитора трипсина и соевого ингибитора Баумана Бирк) с мультиламеллярными везикулами не только из отрицательно заряженных фосфолипидов, но и из цвиттер-ионов

6 Установлено сохранение ингибирующей активности белков в составе комплексов, которая увеличивается в присутствии ионного детергента из-за освобождения активного центра ингибиторов, ранее блокированного в составе комплекса

7 Получена липосомапьная форма бактериоцина, которая подавляет рост М tuber H37Rv не только в культуральной среде, но и в инфицированных макрофагах Лечение этой формой бактериоцина животных, зараженных летальной дозой М tuber H37Rv, достоверно увеличивает продолжительность жизни

8 Установлено, что при физиологических условиях рифампицин и рифабутин существует в различных ионизационных формах и по-разному связываются с однослойными везикулами, содержащими отрицательно заряженные фосфолипиды

9 Включение противотуберкулезных антибиотиков в липосомы при определенных условиях позволяет увеличить содержание в водной фазе рифампицина -в 10 раз, а рифамбутина- в 100 раз

10 При изучении стабильности липосомальной формы рифампицина в виде раствора и лиофилизированного порошка при хранении обнаружено, что оба препарата сохраняют высокую антибактериальную активность в отношении М tuber H37Rv, но только один из них (лиофилизированный порошок) выдерживает хранение в течение 1 года

11 В опытах на животных, зараженных М tuber H37Rv, установлено, что разработанная нами липосомальная форма рифампицина обладает повышенной эффективностью действия по сравнению с водным раствором антибиотика и при этом не является гепатотоксичной

Публикации по теме диссертации

1 Образцов В В , Селищева А А , Козлов (О П Различный характер взаимодействия окисленного и восстановленного цитохрома с с везикулами фосфолипидов // Биохимия, 1978, т 43, в 11, с 2047-2054

2 Третьяк А Г , Селищева А А , Василенко И А, Гросхейде В , Викторов А В. Лимаренко И М Козлов Ю П Влияние фосфоинозитидов на структуру везикул//ДАН, 1979, т249, в 1, с.230-234

3 Сорокоумова Г М Василенко И А Швец В И Селищева А А, Боровягин В Л Влияние метаболитов фосфолипидов на структуру модельных мембран// Биоорганич Химия, 1983, т 8, в 9, с 1106-1111

4 Образцов В В , Селищева А А , Козлов Ю П О влиянии конформации молекулы белка на характер его взаимодействия с везикулами // Биофизика, 1983, т 26, в 3, с 412-417

5 Селищева А А , Козлов Ю П Роль ионов кальция в процессе синаптической передачи //Биол науки ,1984, в 9, с 5-21

6 Селищева А А, Брусованик В И , Неустроева Е А , Маркова Е Е Действие фосфолипаз на транспорт Са2+ в синаптосомы //ДАН, 1985, т 281, в 1, с 223-225

7 Шрагин А С Василенко И А Селищева А А, Швец В И Влияние метаболитов фосфолипидов на слияние модельных мембран // Биол Мембраны, 1985, т 2, в 8, с 789-795

8 Брусованик В И , Селищева А А , Прилипко Л Л , Козлов Ю П , Кулене В В Активация транспорта Са2+ в синаптосомы фосфолипазой С, специфичной к фосфатидилинозитам// Биохимия, 1986, т 51, в 8, с 13291333

9 Шрагин А С Селищева А А , Василенко И А, Швец В И Проницаемость и слияние мембран, продуцируемое продуктами метаболизма ФИ //ДАН, 1986, т287, в 3, с 717-720

10 Селищева А А , Козлов Ю П Метаболизм фосфолипидов и биологические мембраны, Иркутск, Изд ИГУ, 1988, 70 стр

11 Брусованик В И Селищева А А , Кравцов Г М , Козлов Ю П Сопряжение фосфоинозитольного цикла с транспортом Ca через мембрану синаптосом мозга крыс// Нейрохимия, 1988, т 7, в 3, с 357-367

12 Селищева А А , Василенко И А Воронин М В., Швец В И Особенности кинетики гидролиза фосфолипидов фосфолипазой С из Вас сег Гидролиз фосфатидилхолина в присутствии ДОХ//Биохимия, 1990, т 55, с 87-93

13 Мирошникова Т А Воронин М В Селищева А А, Василенко И А Особенности кинетики гидролиза фосфолипидов фосфолипазой С в различных агрегатных состояниях // Биохимия, 1993, т 58, в 3,с 340-347

14 Sorokoumova G М ShraginAS Vasilenko I A Selishcheva А А , Shvetz V I The effect of diacylglycerol on the structural organization of model membranes and their fusion // J Lip Res , 1994, v 4, p 255-271

15 Атруз О M Сорокоумова Г М , Селищева А А, Скрябин Г А , Биличенко Т Н , Орлов С Н Чучалин А Г Взаимодействие альвеолярных макрофагов больных и здоровых людей с липосомами // Бюлл

экспер биол мед , 1997, т 124, в 11, с 520-523

16 Атруз О М , Селищева А А .Сорокоумова Г М , Василенко И А Индукция кислородного взрыва в моноцитах крови человека // Бюлл экспер биол мед 1998, т 126, в 7, с 63-68

17 Атруз О М , Селищева А А , Сорокоумова Г.М Скрябин Г А, Василенко И А Чучалин А Г Влияние липосом различного липидного состава на развитие кислородного взрыва в моноцитах крови и альвеолярных макрофагах человека// Биол мембраны, 2000, т 17, в 5, с 510-518

18 Мартынова О М , Сорокоумова Г М , Тюрина О.П , Селищева А А, Швец В И , Ларионова Н.И Взаимодействие трипсина с мультиламеллярными везикулами из липидов сои II Биохимия, 2000, т 65, в 9, с 1240-1246

19 Мартынова О М , Тюрина О П , Селищева А А, Сорокоумова Г М , Алексеева С Г , Швец В И Отделение периферических полипептидов, содержащихся в липидных экстрактах сои, и их влияние на структурную организацию фосфолипидов//Бюлл экспер биол мед, 2000, т 129, в 2, с 159-162

20 Сорокоумова Г М , Селищева А А, Каплун А П Фосфолипиды Методы их выделения, обнаружения и изучения физико-химических свойств липидных дисперсий в воде Учебное пособие 2000 Москва Моек Академия тонкой хим технологии 70с

21 Корнилова 3 X , Селищева А А , Перельман М И Влияние липосом из фосфатидилхолина на регенерацию операционной раны легкого морской свинки//Бюлл экспер биол мед 2001, т 131, в 2, с 228-231

22 Atruz О М , Skrjabin G A .Vasilenko IА, Sorokoumova GM , Selishcheva A A Effect of liposomes of different phospholipid composition on the induction of respiratory burst in human blood monocytes and alveolar macrophages // Membr Cell Biol, 2001, v 14, N 5, p.639-649

23 Тюрина О.П , Шарф T В , Сорокоумова Г М , Швец В И., Селищева

А А , Ларионова Н И Комплексообразование основного панкреатического ингибитора протеиназ с мультиламеллярными везикулами фосфолипидов сои // Биохимия, 2001, т 66, в 3, с 419-424

24 Сорокоумова Г М Селищева А А .Алексеева С Г Шарф Т В Швец В И Тюрина О П Влияние водорастворимых немембранных белков на структурную организацию фосфолипидов // Биофизика, 2002, т 47, в 2, с 268-276

25 Баукова Н А , Алексеева С Г, Сорокоумова Г М *, Селищева А А , Мартынова О М , Рогожкина Е А , Швец В И. Белки и сапонины присутствуют в липидном препарате, полученном при экстракции соевой муки // Прикл биохим микробиол 2002, т 38, в 2, с 183-189

26 Baikina А, SharfT , Tiourina О , Ollivon М Sorokoumova G , Lanonova N Interaction of the water - soluble protein aprotinin with liposomes gelfiltration, turbidity studies and 31PNMR studies// J Lip research, 2002, v 13, n 3-4, p 213-219

27 Селищева A A , Алексеев С Б, Смирнова И П , Подборонов В М Эффективность антигерпетического действия различных лекарственных форм L-лизин-а-оксидазы // Антибиотики и химиотерапия, 2003, т 48,

в 1,с 9-13

28 Сорокоумова Г М , Селищева А А , Мапикова Н М , Минина А С , Швец В И Включение изониазида в липосомы разного липидного состава // Бюлл эксперим биол мед 2004, т 137, №1, с 24-26.

29 Минина А С , Селищева А А, Сорокоумова Г М , Мапикова Н М , Калашникова Т Н , Швец В И Включение рифампицина в многослойные и

однослойные везикулы (липосомы) разного липидного состава //Биофизика, 2004, т49, №4, с 647-679

30 Istarova Т, Semenova М, Sorokoumova G , Selishcheva А, Belyakova L, PolikaipovY, AnokhinaM Effect of pH on the interactions of sodium casemate with soy phospholipids in relation to the foaming ability of their mixtures // Food Colloids, 2004, v 19, N3,p 429-440

31 Шакина Ю H , Востриков В В , Сорокоумова Г М , Селищева А А , Швец В И Взаимодействие рифабутина с модельными мембранами// Бюлл эксперим биол мед. 2005, № 12 , с 664-667

32 Шакина Ю Н , Востриков В В Сорокоумова Г М. Селищева А А Швец В И Зависимость свойств рифабутина и его включения в липосомы от рН среды//

Антибиотики и химиотерапия 2005, т 50, N97, стр 3-7

33 Балкина А С , Селищева А А , Сорокоумова, Г М , Ларионова Н И Взаимодейс-твие нативного соевого ингибитора типа Баумана Бирк и его гидрофобизирован-ных производных с мультиламеллярными везикулами соевых фосфолипидов// Биохимия, 2006, т 71, №1, с 84-89

34 Baikina A S , Selischeva А А, Sorokoumova G М , Ollivon М , Larionova N I Encapsulation of Bowman-Birk soybean proteinase inhibitor within zwittenonic phospholipid multilamellar vesicles // J Drug Delivery Science Technol 2006, v 16, №4, p 34-39

35 Голышевская В И , Селищева А А , Мартынова Л П , Лепеха Л Н , Калашникова Т Ю, Корнилова 3 X , Ерохин В В, Розенберг О А Оценка эффективности действия липосомальной формы изониазида in vitro// Проблемы туберкулеза и болезней легких, 2006, №8, с 61-64

36 Востриков В В , Селищева А А Сорокоумова Г М , Швец В И Коэффициент распределения рифабутина и его ионизированных форм в различных системах// Биомембраны 2007, т 24, № 2, с 169-174.

37 Востриков В В , Селищева А А Сорокоумова Г М , Швец В И Определение коэффициента распределения рифабутина методом флуоресценции // Биофизика 2007 , т 52, №2, с 125-128

38 Sosunov V , Mischenko V, Eruslanov В , Svetoch Е , Shakina Y , Stern N , Majorov К , Sorokoumova G , Selishcheva A , Apt A Antimycobacterial activity of bacteriocins and their complexes with liposomes// J Antimicrob Chemother 2007, v 59 (5), p 919-925

39 Vostrikov V, Selishcheva A ,, Sorokoumova G , Shakina Y , Shvetz V I , Savel'ev О , Polshakov V Distribution Coefficient of Rifabutin in Liposome/Water System as Measured by Different Methods// Eur J Pharm Biopharm, 2007, v 68 (1), p 120-126

40 Трошкина О A , Салина E Г, Сорокоумова Г М , Капрельянц А С , Селищева А А Влияние липосом на рост и чувствительность М smegmatis к изониазиду // Прикладная биохимия и микробиология 2007,т 43, №1, с 47-52

41 Шакина Ю Н , Трошкина О А , Петрова Е Е , Салина Е Г , Сорокоумова Г М , Швец В И , Капрельянц А С , Селищева А А Чувствительность к противотубер-кулезным препаратам М smegmatis, выращенной на средах, содержащих различные углеродные субстраты // «Ж микробиол , эпидемиол иммун » 2007, в 6, с 24-28

Подписано в печать t>?- S. Формат 60x84/16 Бумага писчая Отпечатано на ризографе Уч изд листов 1 0 Тираж 120 экз Заказ № /б~

Лицензия на издательскую деятельность ИД № 03507 (per №003792) код 221

Московская государственная академия тонкой химической технологии им М В Ломоносова

Издательско-полиграфический центр 119571, г Москва, пр Вернадского, 86

Содержание диссертации, доктора химических наук, Селищева, Алла Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Часть 1.1. Свойства водных эмульсий фосфолипидов в отсутствие и присутствии различных биологически активных соединений

1.1.1.Свойства индивидуальных фосфолипидов и их смесей в водной фазе

1.1.2.Структурная организация и липидный состав биомембран

1.1.3.Современные представления о механизмах взаимодействия мембран и белков разных типов (мембранные, периферические белки, немембранные водорастворимые белки)

1.1.4. Интерфазный катализ 54 Часть 1.2. Липосомальные формы противотуберкулезных препаратов для лечения туберкулеза легких

1.2.1. Строение и свойства М. tuberculosis микобактерии и начальные этапы взаимодействия с макрофагами

1.2.2. Схема терапии туберкулеза легких и описание свойств препаратов - производных рифамицина (рифампицина и рифабутина)

1.2.3. Липосомы с противотуберкулезными препаратами для лечения заболеваний легких

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 2. Свойства модельных и биологических мембран, модифицированных фосфолипазами разных типов:

Часть 2. 1. Оптимизация условий гидролиза фосфолипидов в составе агрегатов различного строения фосфолипазами С.102.

2.1.1. Гидролиз ФХ в присутствии дезоксихолата под действием фосфолипазы С

2.1.2. Гидролиз ФЭ фосфолипазой С в присутствии дезоксихолата и в составе липосом из смеси ФХ:ФЭ 109 Часть 2.2. Свойства и структурная организация фосфолипидных мембран, обработанных фосфолипазами разных типов

2.2.1. Слияние липосом при образовании в модельных мембранах продуктов гидролиза фосфолипидов под действием фосфо-липаз А2, С и Д.

2.2.2. Проницаемость мембран липосом для ионов кальция, инициируемая продуктами гидролиза фосфолипидов под действием фосфолипаз

Часть 2.3. Проницаемость для ионов кальция биологических мембран (мембран синаптосом), индуцированная обработкой фосфолипазами разных типов

2.3.1. Накопление Са2+ в синаптосомах при их инкубации с фосфолипазами С разной специфичности.

2.3.2. Действие фосфолипазы D на транспорт ионов кальция б синаптосомы

2.3.3. Влияние фосфолипазы Аг на Са-транспорт в синаптосомы.

ГЛАВА 3. Влияние ДАГ-содержащих липосом на фагоциты и ткань легкого экспериментальных животных.

Часть 3.1. Индукция кислородного взрыва в моноцитах крови человека липосомами различного липидного состава

Часть 3.2. Влияние липосом на развитие кислородного взрыва в альвеолярных макрофагах человека

Часть 3.3. Действие ДАГ-содержащих липосом на операционную рану легкого морской свинки.

ГЛАВА 4. Белок-липидные комплексы фосфолипидов сои с сериновыми протеазами, их белковыми ингибиторами и бактериоцинами

Часть 4.1. Выбор липидных модельных систем.

4.1.1. Постановка задачи

4.1.2.Определение состава липидных экстрактов сои

4.1.3. Получение индивидуальных фосфолипидов и их смесей

Часть 4.2. Белок-липидные комплексы

4.2.1. Оптимизация условий их получения и анализ состава

4.2.2. Характеристики полученных комлексов

4.2.3. Структурная организация фосфолипидов в белок-липидных комплексах

4.2.4. Взаимодействие немембранных водорастворимых белков с фосфолипидами цвиттер-ионами

4.2.5. Активность белков в составе белок-липидных комплексов 207 Часть 4.3.Комплексы фосфолипидов с бактериоцинами и их антимикробная активность

ГЛАВА 5. Взаимодействие антибиотиков рифамицинового ряда с модельными мембранами ; получение липосомальных форм рифампицина и рифабутина. Часть 5.1. Физико-химические характеристики рифампицина и рифабутина в зависимости от рН среды (растворимость, рКа)

5.1.1.Растворимость антибиотиков в зависимости от рН среды

5.1.2. Определение рКа антибиотиков 229 Часть 5.2. Связывание антибиотиков рифамицинового ряда с модельными мембранами

5.2.1 Методы получения липосомальной формы рифампицина и рифабутина

5.2.2.Оптимизация условий включения ПТП в липосомы

5.2.3.Влияние ионной силы на включение антибиотиков в липосомы

5.2.4. Влияние природы буфера с различной ионной силой на включение антибиотиков в липосомы при рН=6,

5.2.5. Влияние рН среды на включение антибиотиков в липосомы из ФХ

Часть 5.3. Исследование механизма взаимодействия антибиотиков с модельными мембранами с помощью коэффициента распределения октанол/вода и липосомы/вода

5.3.1.Определение коэффициента распределения антибиотиков методом разделения фаз.

5.3.2. Определение Kd антибиотиков в системе

5.3.2. Определение Kd антибиотиков в системе липосомы/ вода методом флуоресценции.

5.3.3.Коэффициент распределения Kd антибиотиков в системе октанол / вода.

Часть 5.4. Стабильность рифампицина в водной фазе и в составе липосом. Антимикробная активность препаратов

5.4.1. Получение стандартов - индивидуальных продуктов деструкции и окисления рифампицина

5.4.2. Анализ продуктов деструкции и окисления водного и липосомального препаратов РФ при хранении при 25 °С

5.4.3. Продукты деструкции рифампицина в составе липосомальной формы при хранении при 4°С.

5.4.4. Лиофилизированный липосомальный препарат

5.4.5. Бактериостатическая активность липосомальной формы рифампицина при различных сроках хранения

ГЛАВА 6. Эффективность действия «пустых» липосом и липосомальных форм противотуберкулезных препаратов в отношении микобактерий

Часть 6.1. Взаимодействие «пустых» липосом с М. tuberculosis и М. avium в среде инкубации и инфицированных макрофагах мышей

Часть 6.2. Взаимодействие «пустых» липосом с М. smegmatis

Часть 6.3. Эффективность действия рифампицина в растворе и в составе липосом в отношении М. tuberculosis H37Rv и М. smegmatis

Часть 6.4. Исследование эффективности действия рифампицина в растворе и в составе липосом на модели экспериментального туберкулеза у мышей

ГЛАВА 7. Материалы и методы исследований

Часть 7.1. Используемые в работе реактивы

Часть 7.2. Методы исследования

Введение Диссертация по биологии, на тему "Принципы создания новых форм лекарственных препаратов и биологически активных соединений солюбилизацией липосомами"

В настоящее время с лечением туберкулеза во всем мире сложилась столь неблагополучная ситуация, что Всемирная Организация Здравоохранения объявила в 2003г туберкулез глобальной угрозой жизни человека. Невысокая эффективность лечения туберкулеза обусловлена многими причинами, в том числе токсичностью многих противотуберкулезных препаратов (ПТП). Особенно выражены токсические эффекты у препарата первого ряда - рифампицина, которые вынуждают больных отказываться от его приема.

В связи с тем, что микобактерия туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis (М.tuberculosis)), вызывающая это заболевание, размножается в основном внутри клеток легочной ткани (макрофагов), представлялось целесообразным использовать такие лекарственные формы, которые были бы способны направленно транспортировать ПТП внутрь этих клеток. Эта задача может быть решена с помощью липосом, которые, как известно, фагоцитируются макрофагами.

Наряду с этим представляется необходимым поиск новых препаратов, обладающих антибактериальной активностью, но нетоксичных для человека. В качестве примера можно привести белки, секретируемые непатогенными бактериями (бактериоцины). Однако эти водорастворимые белки не проникают через мембрану макрофагов и для их внутриклеточной доставки можно использовать липосомы.

Одним из положительных свойств липосом в качестве транспортирующей системы является фармакологическая активность самих фосфолипидов, из которых сформированы липосомы. Известны несколько препаратов на основе фосфолипидов для лечения гепатита, цирроза, токсических поражений печени: «Эссенциале» (Германия), отечественный препарат «Фосфоглиф», препарат «Липин» (Украина) и др. В литературе имеются отдельные сообщения о противовоспалительном и антиэксудативном действии фосфолипидов. Перечисленные выше данные позволяют прогнозировать значительные преимущества липосомальных форм ПТП по сравнению с таблетированными, в связи с чем разработка таких форм представляется весьма актуальной. Она позволит увеличить растворимость ПТП, усилить их проникновение в макрофаги и возможно, окажет дополнительные эффекты, например, снизит токсичность или увеличит время пребывания препарата в организме.

Наряду с этим следует учесть, что в легких человека и животных липосомы, содержащие ПТП, целенаправленно взаимодействуют как с инфицированными макрофагами, так и с микобактериями. Известно, что клеточная стенка последних содержит различные фосфолипазы, в том числе фосфолипазу С и фосфолипазу А2. В связи с этим с целью прогнозирования возможных механизмов деградации компонентов липосом при их введении в организм представлялось необходимым оценить свойства липосом после их обработки различными фосфолипазами.

Основной целью работы являлась разработка научных основ создания липосомальных форм лекарственных препаратов и биологически активных соединений как способа оптимизации их свойств для повышения эффективности фармакологического действия. Другой целью была оценка антибактериальной активности липосомальной формы рифампицина в отношении клеток М. tuberculosis in vitro и in vivo.

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи, которые разделялись на три группы:

1.1. Изучить закономерности гидролиза фосфолипидов в различных агрегационных состояниях фосфолипазой С.

1.2. Исследовать слияние и проницаемость для ионов кальция липосом из смесей фосфолипидов при инкубации их с фосфолипазами С разной специфичности.

1.3. Те же процессы изучить на изолированных нервных окончаниях (синаптосомах).

1.4. Оценить эффективность действия липосом, содержащих продукт гидролиза фосфолипидов - 1,2-диацилглицерин (ДАГ) - на функциональное состояние фагоцитов человека и рану кожи экспериментальных животных.

2.1. Получить комплексы белковых ингибиторов трипсина (основного панкреатического ингибитора протеаз и соевого ингибитора типа Баумана -Бирк) и оценить их ингибирующую активность в составе комплексов.

2.2. Получить белок-липидные комплексы с бактериоцинами и исследовать их антимикробную активность in vitro и in vivo в отношении m.tuber.

3.1. Изучить физико-химических свойства антибиотиков рифамицинового ряда в зависимости от рн среды; оптимизировать условия получения их липосомальных форм.

3.2. Исследовать стабильность липосом с рифампицином при хранении.

3.3. Исследовать антибактериальное действие липосом с рифампицином in vitro и in vivo в отношении М.tuberculosis.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Селищева, Алла Анатольевна

выводы

1. Обнаружено, что физико-химические свойства модельных мембран, изученные на примере однослойных везикул, изменяются при введении в их состав метаболита фосфолипидов 1.2-диацилглицерина: уменьшается стабильность липосом и их мембраны становятся проницаемыми для ионов кальция.

2. Показано, что механизм этого явления обусловлен способностью 1.2-диацилглицерина модифицировать бислойную упаковку фосфолипидов.

3. Для биологических мембран установлено, что только 1.2-диацилглицерин, образовавшийся под действием специфичной фосфолипазы С, способен формировать кальциевые каналы проницаемости, которые ингибируются верапамилом. Аналогично действует арахидоновая кислота. Неспецифичная фосфолипаза С и другие исследованные жирные кислоты такого эффекта не оказывают.

4. Обнаружено, что введение 1.2-диацилглицерина и арахидоновой кислоты в однослойные везикулы усиливает их действие на клетки и ткани: возрастает интенсивность кислородного взрыва макрофагов; увеличивается скорость заживления операционной раны кожи.

5. Показано образование гидрофобных комплексов водорастворимых белков-ингибиторов протеаз (основного панкреатического ингибитора трипсина и соевого ингибитора Баумана Бирк) с мультиламеллярными везикулами не только из отрицательно заряженных фосфолипидов, но и из цвиттер-ионов.

6. Установлено сохранение ингибирующей активности белков в составе комплексов, которая увеличивается в присутствии ионного детергента из-за освобождения активного центра ингибиторов, ранее блокированного в составе комплекса.

7. Получена липосомальная форма бактериоцина, которая подавляет рост М. tuberculosis H37Rv не только в культуральной среде, но и в инфицированных макрофагах. Лечение этой формой бактериоцина животных, зараженных летальной дозой М. tuberculosis H37Rv, достоверно увеличивает продолжительность жизни.

8. Установлено, что при физиологических условиях рифампицин и рифабутин существует в различных ионизационных формах и по-разному связываются с однослойными везикулами, содержащими отрицательно заряженные фосфолипиды.

9. Включение противотуберкулезных антибиотиков в липосомы при определенных условиях позволяет увеличить содержание в водной фазе рифампицина -в 10 раз, а рифамбутина- в 100 раз.

10. При изучении стабильности липосомальной формы рифампицина в виде раствора и лиофилизированного порошка при хранении обнаружено, что оба препарата сохраняют высокую антибактериальную активность в отношении М. tuberculosis H37Rv, но только один из них (лиофилизированный порошок) выдерживает хранение в течение 1 года.

11. В опытах на животных, зараженных М. tuberculosis H37Rv, установлено, что разработанная нами липосомальная форма рифампицина обладает повышенной эффективностью действия по сравнению с водным раствором антибиотика и при этом не является гепатотоксичной.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В завершение следует сказать, что в результате проведенных нами исследований были выявлены различия в действии на биологические мембраны фосфолипаз С различной специфичности. Это позволило предложить механизм нарушения слияния фагосом с лизосомами в макрофагах, инфицированных микобактериями.

Главные из полученных результатов относятся к двум взаимосвязанным направлениям:

1. фундаментальному, в котором рассмотрена динамика взаимодействия сложной системы: микобактерии - макрофаги - лекарственные соединения с учетом того, что микобактерии, расположенные в фагосомах макрофагов, модифицируют фосфолипидный состав фагосомальных мембран. В частности обнаружено, что ДАГ, образованный под действием бактериальной фосфолипазы С, вызывает слияние мембран, но не влияет на уровень ионов кальция. Специфичная к ФИ фосфолипаза С, которая присутствует в фагосомальной мембране, способствует как слиянию мембран, так и повышению содержания ионов кальция, без чего невозможно дальнейшее созревание фагосом.

Другой важный результат этих исследований состоит в том, что впервые обнаружено, что многие фосфолипиды вызывают изменение чувствительности микобактерий к различным противотуберкулезным препаратам, в том числе к антибиотикам, и раскрыт механизм этого явления.

2. прикладному, которое состояло в разработке новых лекарственных форм антибиотиков, обладающих активностью в отношении М.tuberculosis . Изучение широкого набора физико-химических характеристик рифампицина и рифабутина позволило не только объяснить закономерности их антимикробной активности, но и разработать липосомальные формы препаратов, в которых в несколько раз (а в случае рифабутина- в десятки раз) увеличено содержание антибиотиков в водной фазе.

В ходе изучения стабильности при хранении различных форм липосомального рифампицина установлено, что длительное хранение выдерживает только лиофилизированный порошок. Это позволит в дальнейшем перейти к практическому использованию данного препарата.

Библиография Диссертация по биологии, доктора химических наук, Селищева, Алла Анатольевна, Москва

1. Lasic D.D. The mechanism of vesicle formation. //Biochem J. 1988; v.256 (1), p. 1-11.

2. Ranck JL, Mateu L, Sadler DM, Tardieu A, Gulik-Krzywicki T, Luzzati V. Order-disorder conformational transitions of the hydrocarbon chains of lipids. // J.Mol.Biol. 1974, v. 85(2), p. 249-277.

3. Tardieu A, Luzzati V, Reman FC. Structure and polymorphism of the hydrocarbon chains of lipids: a study of lecithin-water phases// J Mol Biol. 1973; v. 75(4), p.711-33.

4. Cullis P.R., de Kruijff В. Lipid polymorphism and the functional roles of lipids in biological membranes.// Biochim Biophys Acta. 1979; v. 559(4), p. 399-420.

5. Israelachvili J.N., Mitchell D.J, Ninham B.W.J. // Chem. Soc. Faraday Trans. 1976; v. 72, p.1525-1531.

6. Israelachvili J.N., Marcelja S., Horn R.G. Physical principles of membrane organization.// Quart Rev Biophys. 1980; v. 13(2), p.121-200.

7. Mitchell D.J., Ninham B.W. // Chem. Soc., Faraday Trans. 1981; v.77, p. 601603.

8. Cevc G., Marsh D. Phospholipid Bilayers: Physical Principles and Models. Wiley-lnterscience, New York, 1987

9. Seddon J.M. Structure of the inverted hexagonal (HII) phase, and non-lamellar phase transitions of lipids. //Biochim Biophys Acta. 1990; v. 1031(1), p. 1-69

10. Small D.M. Handbook of Lipid Research. Physical Chemistry of Lipids: from Alkanes to Phospholipids. Plenum, New York, 1986; v. 4.

11. Bergenstahl B. In Food Polymers, Gels, and Colloids. (Ed. E.Dickinson). Royal Society of Chemistry, London, 1991. p. 123

12. Шипунов Ю.А. Самоорганизующиеся структуры лецитина // Успехи химии.1997; т.66 (4), с.328-351.

13. Cullis P. R., de Kruijff В. Polimorfic phase behaviour of lipid mixtures as detected by 31P-NMR // Biochim. Biophys. Acta. 1978; v. 507, p. 207-218.

14. Cullis P.R., de Kruijff B, Hope MJ, Nayar R, Schmid SL Phospholipids and membrane transport.//Can. J. Biochem. 1980; v. 58, p.1091-1100.

15. Геннис P. Биомембраны // M. "Мир", 1997. 622 с.

16. Ивков В. Г., Берестовский Г. Н. Динамическая структура липидного бислоя // М. "Наука", 1981. 290 с.

17. Perkins W. R., Dause R. В., Parente R. A., Minchey S. R., Neuman К. C., Gruner S. M., Taraschi T. F., Janoff A. S. Role of polymorphism in pulmonary surfactant// Science 1996; v. 273, p. 330-332.

18. Petrache H. I., S. Tristram-Nagle, J. F. Nagle. Fluid structure of EPC and DMPC bilayers // Chem. Phys. Lipids. 1998; v. 95 (1), p. 83-94.

19. Mcintosh Т. J.,. Simon S. A. Area per molecule and distribution of water in fully hydrated dilauroylphosphatidylethanolamine bilayers // Biochemistry 1986; v. 25 (17), p. 4948-4952.

20. Zhou Z., B. G. Sayer, D. W. Hughes, R. E. Stark and R. M. Epand. Studies of phospholipids hydration by high-resolution magic-angle spinning nuclear magnetic resonance // Biophys. J. 1999; v. 76 (1 Pt 1), p. 387-399.

21. Rand R. P., Parsegian V. A. Hydration forces between phospholipid billayers // Biochim. Biophys. Acta 1989; v. 988, p. 351-376.

22. Urich A. S., Sami M., Watts A. Hydration of DOPC bilayers by differential scanning calorimetry// Biochim. Biophys. Acta 1994; v. 1191, p. 225-230.

23. Buldt G., Gaily H.U., Seelig A., Seelig J. Neutron diffraction studies on selectively deuterated phospholipid bilayers. //Nature. 1978; v. 271 (5641), p.182-184.

24. Buldt G., Gaily H.U., Seelig A., Seelig J., Zaccai G. Neutron diffraction studies on phosphatidylcholine model membranes. I. Head group conformation// Hoppe-Seyler'sZ. Physiol. Chem., 1978; v.359, p. 1067-1072.

25. Mcintosh TJ., S.A.Simon. Area per molecule and distribution of water in fully hydrated dilauroylphosphatidylethanolamine bilayers. // Biochemistry. 1986; v.25, (17), p.4948-4952.

26. Katsaras J., K. R. Jeffrey, D. S.-C. Yang and R. M. Epand. Direct evidence for the partial dehydration of phosphatidylethanolamine bilayers and approaching the hexagonal phase // Biochemistry 1993; v. 32, p. 10700-10707.

27. Yeagle P.L., A. Sen. Hydration and the lamellar to hexagonal II phase transition of phosphatidylethanolamine II Biochemistry 1986; v. 25 (23), p. 75187522.

28. Ho C., S. J. Slater, C. D. Stubbs. Hydration and order in lipid bilayers // Biochemistry 1995; v. 34, p. 6188-6195.

29. Shalaev E.Y., Steponkus P.L. Phase diagram of 1,2-dioleylphosphatidylethanolamine (DOPE): water system at subzero temperatures and at low water contents // Biochim. Biophys. Acta 1999; v. 1419, p. 229-247.

30. Gawrisch К., V. A. Parsegian. Energetics of hexagonal-lamellar-hexagonal phase transition sequence in dioleoylphosphatidylethanolamine membranes // Biochemistry 1992; v. 31 (11), p. 2856-2864.

31. Damodaran К. V., Merz К. M. A comparison of DMPC- and DLPE-based lipid bilayers // Biophys. J. 1994; v. 66, p. 1076-1087.

32. Metcalfe J.C. 13 С NMR studies of lipids in bilayers and membranes. //Chem Phys Lipids. 1972; v.8 (4), p.333-340.

33. Grant CW, Wu SH, McConnell HM. Lateral phase separations in binary lipid mixtures: correlation between spin label and freeze-fracture electron microscopic studies.//Biochim Biophys Acta. 1974; v. 363(2), p.151-158.

34. Lee AG, Birdsall NJ, Metcalfe JC, Toon PA, Warren GB. Clusters in lipid bilayers and the interpretation of thermal effects in biological membranes.// Biochemistry. 1974; v.13(18), p.3699-3705.

35. Singer S. The molecular organization of membranes//Ann. Rev. Biochem. 1974; v. 43, p. 805-811.

36. Nicolson G. L. Transmembrane control of the receptors on normal and tumor cells. I. Cytoplasmic influence over surface components. //Biochim. Biophys. Acta. 1976; v. 457, p. 57-106.

37. Stier A, Finch SA, Bosterling B. Non-lamellar structure in rabbit liver microsomal membranes: a 31P-NMR study.// FEBS Lett. 1978; v.91(1), p.109-112.

38. Rothman JE, Tsai DK, Dawidowicz EA, Lenard J. Transbilayer phospholipid asymmetry and its maintenance in the membrane of influenza virus.// Biochemistry. 1976; v.15(11), p. 2361-2370.

39. Hirata F, Axelrod J. Phospholipid methylation and biological signal transmission. // Science. 1980; v. 209(4461), p. 1082-1090.

40. Geske F.J., Monks J., Lehman L., Fadok V.A.// The role of the macrophage in apoptosis: hunter, gatherer, and regulator.// Int. J. Hematol. 2002; v. 76(1), p.16-26.

41. Fadok V.A., Bratton DL, Rose DM, Pearson A, Ezekewitz RA, Henson PM.

42. A receptor for phosphatidylserine-specific clearance of apoptotic cells.// Nature. 2000; v. 405(6782), p. 85-90.

43. Hoffmann PR, de Cathelineau AM, Ogden CA, Leverrier Y, Bratton DL, Daleke DL, Ridley AJ, Fadok VA, Henson PM. Phosphatidylserine (PS) induces PS receptor-mediated macropinocytosis and promotes clearance of apoptotic cells.//

44. J. Cell Biol. 2001; v. 155(4), p.649-659.

45. Fadok V.A., Bratton D.L., Henson P.M. Phagocyte receptors for apoptotic cells: recognition, uptake, and consequences // J Clin Invest, 2001, v. 108 (7), p.957-962.

46. Jiang J, Serinkan BF, Tyurina YY, Borisenko GG, Mi Z, Robbins PD, Schroit AJ, Kagan VE. Peroxidation and externalization of phosphatidylserine associated with release of cytochrome с from mitochondria.// Free Radic Biol Med. 2003; v. 35(7), p. 814-825.

47. Mason R., Lewis J., Pulmonary Surfactant. In Murray J., Nadel J. (eds) Textbook of respiratory medicine.3rd ed.2000 W.B.Saunders.

48. Pickard M. R., Hawthorne J. N. //The labelling of nerve ending phospholipids in guinea-pig brain in vivo and the effect of electrical stimulation on phosphatidyl-inositol metabolism in prelabelled synaptosomes.// J Neurochem. 1978; v.30(1),p. 145-55.

49. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии. М. 1981. т. 2. гл. 17.

50. Hallcher L. М., Sherman W. R. The effects of lithium ion and other agents on the activity of myo-inositol-1 -phosphatase from bovine brain.// J .Biol. Chem. 1980; v.255(22), p. 10896-10901.

51. Berridge MJ, Downes CP, Hanley MR. Lithium amplifies agonist-dependent phosphatidylinositol responses in brain and salivary glands. // Biochem. J. 1982. v. 206, p. 587-595.

52. Downes C. P., Michell R. H. The polyphosphoinositide phosphodiesterase of erythrocyte membranes. //Biochem. J. 1981; v. 198, p. 133-140.

53. Mauco G, Dangelmaier C.A., Smith J.B. Inositol lipids, phosphatidate and diacylglycerol share stearoylarachidonoylglycerol as a common backbone in thrombin-stimulated human platelets. //Biochem. J. 1984; v. 224, p. 933-940.

54. Broekman M.J., Ward J.W., Marcus A.J. Fatty acid composition of phosphatidylinositol and phosphatide acid in stimulated platelets. Persistence of arachidonyl-stearyl structure.//J Biol Chem. 1981; v.256(16), p.8271-8274.

55. Tyson C.A., Vande Zande H., Green D.E. Phospholipids as ionophores.//J. Biol. Chem. 1976; v. 251, p. 1326-1332.

56. Green D.E., Fry M., Blonsin G. Phospholipids as the molecular instruments of ion and solute transport in biological membranes. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980; v. 77, p. 257-261.

57. Nayar R., Mayer L.D., Hope M.J., Cullis P.R. Phosphatidic acid as a calcium ionophore in large unilamellar vesicle systems. //Biochim. Biophys. Acta. 1984; v. 777, p. 343-346.

58. Farren S.B., Hope MJ., Cullis P.R. Polymorphic phase preferences of phosphatidic acid: A 31P and 2H NMR study. // Biochem. Biophys. Research Commun. 1983; v. 111, p. 675-682.

59. Mandersloot J.G., Gerritsen W.J., Leunissen-Bijvelt J., van Echteld C.J., Noordam P.C., de Gier J. Ca2+-induced changes in the barrier properties of cardiolipin/phosphatidylcholine bilayers.// Biochim. Biophys. Acta. 1981; v. 640(1), p.106-113.

60. Koter M., de Kruijff В., van Deenen L.L.Calcium-induced aggregation and fusion of mixed phosphatidylcholine-phosphatidic acid vesicles as studied by 31P NMR. //Biochim. Biophys. Acta. 1978; v. 514, p. 255-263.

61. Imai A., Ishizuka Y., Kawai K., Nozawa Y. Evidence for coupling of phosphatidic acid formation and calcium influx in thrombin-activated human platelets. // Biochem. Biophys. Research Commun. 1982; v. 108, p. 752-758.

62. Ohsako S., Deguchi T. Stimulation of phosphatidic acid of calcium influx and cyclic GMP synthesis in neuroblastoma cells.//J. Biol. Chem. 1981; v. 256 (21), p. 10945-10948.

63. Harris RA, Schmidt J,, Hitzemann RJ., Hitzemann R.J. Phosphatidate as a molecular link between depolarization and neurotransmitter release in the brain.// Science. 1981; v. 212(4500), p.1290-1291.

64. Putney J.W. Jr., Weiss S.J., Van De Walle C.M., Haddas R.A. Is phosphatidic acid a calcium ionophore under neurohumoral control? // Nature. 1980; v. 284 (5754), p.345-347.

65. Weiss S.J., McKinney J.S., Putney J.W. Jr.Regulation of phosphatidate synthesis by secretagogues in parotid acinar cells. // Biochem J. 1982 ; v.204(2), p.587-592.

66. Lapetina E.0. Platelet-activating factor stimulates the phosphatidylinositol cycle. Appearance of phosphatidic acid is associated with the release of serotonin in horse platelets.// J Biol Chem. 1982; v. 257 (13), p.7314-7317.

67. Gershengorn M. C., Geras E., Purrello VS, Rebecchi MJ. Inositol trisphosphate mediates thyrotropin-releasing hormone mobilization of nonmitochondrial calcium in rat mammotropic pituitary cells.//J. Biol. Chem. 1984; v. 259(17), p. 10675-10681.

68. Prentki M., Wollheim C.B., Lew P.D. Ca2+ homeostasis in permeabilized human neutrophils. Characterization of Ca2+-sequestering pools and the action of inositol 1,4,5-triphosphate.//J Biol Chem. 1984; v. 259(22), p. 13777-13782.

69. Joseph S.K., Williams R.J., Corkey B.E., Matschinsky F.M., Williamson J.R. myo-lnositol 1,4,5-trisphosphate. A second messenger for the hormonal mobilization of intracellular Ca2+ in liver.//J. Biol. Chem. 1984; v. 259, p. 3077-3082.

70. Streb H, Bayerdorffer E, Haase W, Irvine R.F., Schulz I. Effect of inositol-1,4,5-trisphosphate on isolated subcellular fractions of rat pancreas.// J Membr Biol. 1984; v.81(3), p.241-253.

71. Whitman M.R,. Epstein J., Cantley L. Inositol 1,4,5-trisphosphate stimulates phosphorylation of a 62,000-dalton protein in monkey fibroblast and bovine brain cell lysates.// J Biol Chem. 1984; v. 259(22), p. 13652-13655.

72. Dawson A. P., Irvine R. F. Inositol (1,4,5)trisphosphate-promoted Ca2+ release from microsomal fractions of rat liver.// Biochem. Biophys. Research Commun. 1984; v. 120, p. 858-864.

73. Prentki M„ Biden T.J., Janjic D., Irvine R.F., Berridge M.J., Wollheim C.B. Rapid mobilization of Ca2+ from rat insulinoma microsomes by inositol-1,4,5-trisphosphate.// Nature. 1984; v. 309, p. 562.-564.

74. Berridge M. J., Irvine R. F. Inositol trisphosphate, a novel second messenger in cellular signal transduction // Nature. 1984; v. 312, p. 315-321.

75. Cockcroft S., Allan D. The fatty acid composition of phosphatidylinositol, phosphatidate and 1,2-diacylglycerol in stimulated human neutrophils.// Biochem J. 1984; v. 222(2), p.557-559.

76. Bell R. L., Majerus P. W. Thrombin-induced hydrolysis of phosphatidylinositol in human platelets.//J. Biol. Chem. 1980; v. 255 (5), p. 1790-1792.

77. Rittenhouse-Simmons S. Indomethacin-induced accumulation of diglyceride in activated human platelets. The role of diglyceride lipase.// J Biol Chem. 1980; v. 255(6), p. 2259-2262.

78. Hidaka H., Asano T. Stimulation of human platelet guanylate cyclase by unsaturated fatty acid peroxides. // Proc Natl Acad Sci USA. 1977; v. 74(9), p.3657-3661.

79. Nishizuka Y., Takai l.//Protein Phosphorylation. 1981. London, p. 237.

80. Nishizuka Y. The role of protein kinase С in cell surface signal transduction and tumour promotion. // Nature. 1984; v. 308 (5961), p. 693-698.

81. Rando R. R. Young N. The stereospecific activation of protein kinase C.ll Biochem. Biophys. Research Commun. 1984; v. 122 (2), p. 818-823.

82. Rothman J. E., Lenard L. Membrane asymmetry // Science. 1977; v. 195, p. 743-752.

83. Gilmore Т., Martin G. S. Phorbol ester and diacylglycerol induce protein phosphorylation at tyrosine //Nature. 1983; v. 306 (5942), p. 487-492.

84. Kikkawa U, Takai Y, Tanaka Y, Miyake R, Nishizuka Y. Protein kinase С as a possible receptor protein of tumor-promoting phorbol esters. //J Biol Chem. 1983; v.258 (19), p.11442-11445.

85. Allan D, Michell RH. Accumulation of 1,2-diacylglycerol in the plasma membrane may lead to echinocyte transformation of erythrocytes.// Nature. 1975; v.258(5533), p.348-349.

86. Dawson RM, Irvine RF, Bray J, Quinn PJ. Long-chain unsaturated diacylglycerols cause a perturbation in the structure of phospholipid bilayers rendering them susceptible to phospholipase attack. // Biochem Biophys Res Commun. 1984; v.125(2), p.836-842.

87. Dawson RM, Hemington NL, Irvine RF. Diacylglycerol potentiates phospholipase attack upon phospholipid bilayers: possible connection with cell stimulation. //Biochem. Biophys. Research Commun. 1983; v. 117, p. 196-201.

88. Kim M.Y., Linardie C., Obeid L., Hannun Y.A. Identification of sphingomyelin turnover as an effector mechanism for the action of tumor necrosis factor alpha and interferon 111 Biol. Chem. 1991; v. 266 (1), p. 484-489.

89. Haimovitz-Fridman A., Kan C.C., Ehleiter D. Ionizing radiation acts on cellular membranes to generate ceramide and initiate apoptosis // J. Exp. Med. 1994; v. 180, p. 525-534.

90. Davis R.J., Girones N, Faucher M. Two alternative mechanismes control the interconversion of functional states of the epidermal growth factor receptor// J. Biol. Chem. 1998; v. 263 (11), p. 5373-5379.

91. Jacobs L.S., Kester M. Sphingolipids as mediators of effects of platelet-derived growth factor in vascular smooth muscle cells //Amer. J. Physiol. 1993; v. 265 (3), p. 740-747.

92. Zhang H., Buckley N.E., Gibson K., Spiegel S. Sphingosine stimulates cellular proliferation via a protein kinase C-independent pathway//J. Biol. Chem. 1990; v. 265 (1), p. 76-81.

93. Hannun Y.A., Obeid L.M. Ceramide: an intracellular signal for apoptosis // Trends Biochem. Sci. 1995; v. 20 (2), p. 73-77.

94. Ji L., Zhang G., Uematsu S. et al. Induction of apoptotic DNA fragmentation and cell death by natural ceramide // FEBS Lett. 1995; v. 358 (2), p. 211-214.

95. Okazaki Т., Bielawska A., Bell R.M., Hannun Y.A. Role of ceramide as a lipid mediatir if 1,25-dihydroxyvitamin D3-induceed HL-60 cell differentiation //J. Biol. Chem. 1990; v. 265 (26), p. 15823-15831.

96. Kolesnick R.N. Sphingomielinase action inhibits phorbol ester-induced differentiation of human promyelocytic leukemic (HL-60) cells // J. Biol. Chem. 1989; v. 264 (13), p. 7617-7623.

97. Mathias S., Dressier K.A., Kolesnick R.N. Characterization of ceramide-activated protein-kinase: stimulation by tumor necrosis factor alpha // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1991; v. 88 ( 22), p. 10009-10031.

98. Fukami K., Takenawa T. Phosphatidic acid that accumulates in platlet-derived growth factor-stimulated BalB/C 3T3 cells is a potent mitogenic signal // J. Biol. Chem. 1992; v. 267, p. 10988-10993.

99. Jarwis W.D., Kolesnick R.N, Fornari F.A. Induction of apoptotic DNA damage and cell death by activation of the sphingomyelin pathway // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1994; v. 91 (1), p.73-75.

100. Faucher M., Girones N, Hannun Y.A. et al. Regulation of the epidermal growth factor receptor phosphorilation state by sphingosine in A431 human epidermoid carcinoma cells // J. Biol. Chem. 1988; v. 263 (11), p. 5319-5327.

101. Kalyanaraman B. Nitrated lipids: a class of cell -signaling molecules // Proc.Natl. Acad. Sci. 2004; v.101 (32), p. 11527-11528.

102. Tanner M.J.A.// Isolation of integral membrane proteins and criteria for identifying carrier proteins. // Curr.Topics Membr.Transp. 1979; v. 12, p. 1-51.

103. Becker T.L., Helenius A., Simons K. Solubilization of the Semliki Forest virus membrane with sodium dodecyl sulfate.// Biochim. Biophys.Acta.1975; v. 415, p. 2935.

104. Bensadoun A., Weinstein D. Assay of proteins in the presence of interfering material.// Anal.Biochem. 1976; v.70, p. 241-250.

105. Wessel D., Flugge U.I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids// Anal.Biochem. 1984; v.138 (1), p.141-143.

106. Racker E. A new procedure for the reconstitution of biologically active phospholipid vesicles // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1973; v. 55, p. 224-228.

107. Levitzki A. Reconstitution of membrane receptor systems // Biochim. Biophys. Acta. 1985; v. 822 (1), p. 127-131.

108. Vanderkooi G, Capaldi RA. Discussion paper: a comparative study of the amino acid compositions of membrane proteins and other proteins // Ann N Y Acad Sci. 1972; v. 195, p. 135-138.

109. Wallach DF, Bieri V, Verma SP, Schmidt-Ullrich R. Modes of lipid-protein interactions in biomembranes.// Ann N Y Acad Sci. 1975; v.264, p.142-160.

110. Henderson R. Membranes and intercellular communication. Amsterdam, 1981. p. 232.

111. Ovchinnikov Y. A. Membrane active complexones. Chemistry and biological function.//FEBS Lett. 1974; v. 44(1), p. 1-21.

112. Inoue M. Cell agglutination mediated by concanavalin A and the dynamic state of the cell surface.// J Cell Sci. 1974 ; v. 14(1), p. 197-202

113. Vanderkooi G. Organisation of proteins in membranes with special reference to the cytochrome oxidase system.//Biochim. Biophys. Acta. 1974; v. 344, p. 307311.

114. Shanbhag V. P., Axelsson C. G. Hydrophobic interaction determined by partition in aqueous two-phase systems. Partition of proteins in systems containing fatty-acid esters of polyethylene glycol). // Europ. J. Biochem. 1975; v. 60, p. 17-20.

115. Brasseur, R., Pillot, Т., Lins, L., Vandekerckhove, J., and Rosseneu, M. Peptides in membranes: tipping the balance of membrane stability // Trends Biochem. Sci. 1997; v. 22, p. 167-171.

116. Van der Goot F.G., Lakey J.H., Pattus F. The molten globule intermediate for protein insertion or translocation through membranes.//Trends cell biology.1992; v.2, p.343-348.

117. Van der Goot F.G., Gonzalez-manas J.M., Lakey J.H., Pattus F. //

118. A 'molten-globule' membrane-insertion intermediate of the pore-forming domain of colicin A.// Nature. 1991; v.354 (6352), p.408-410.

119. Бычкова B.E., Птицын ОБ.// Функциональное состояние денатурированных белков: принципы моделирования и первые результаты// Цитология. 1995; т.35, с.1238-1249.

120. Schlegel R., Wade М. A synthetic peptide corresponding to the NH2 terminus of vesicular stomatitis virus glycoprotein is hY-dependent hemolysin.// J.Biol.Chem. 1984; v.259, p. 4691-4694.

121. Gething M-J., Doms R.W., York D., White J. Studies on the mechanism of membrane fusion: site-specific mutagenesis of the haemagglutinin of influenza virus.// J.Cell Biol. 1986; v.102, p.11-23.

122. Talmud P., Lins L., Brasseur R. Prediction of signal peptide functional properties: a study of the orientation and angle of insertion of yeast invertase mutants and human apolipoprotein В signal peptide varients.//Protein Eng. 1996; v.9, p.317-321.

123. Bowie J.U. Membrane proteins: a new method enters the fold// Pros.Natl.Acad Sci. 2004; v. 101 (12), p. 3995-3996

124. Epand R.M. Lipid polymorphism and protein-lipid interactions // Biochim. Biophys. Acta 1998; v. 1376, p. 353-368.

125. Caron F, Mateu L. Chain motions in lipid-water and protein-lipid-water phases: a spin-label and x-ray diffraction study. // J. Mol. Biol. 1974; v. 85, p.279-300.

126. Papahadjopoulos D, Moscarello M, Eylar EH, Isac T. Effects of proteins on thermotropic phase transitions of phospholipid membranes. // Biochim. Biophys. Acta. 1975; v. 401 (3), p. 317-335.

127. Nicholls P. Cytochrome с binding to enzymes and membranes.//Biochim Biophys Acta. 1974; v.346(3-4), p.261-310.

128. Oshima G., Nagasawa K. Binding and aggregate formation of phospholipid liposomes containing phosphatidic acid with ovalbumin. //Biochim. Biophys. Acta. 1973; v. 291 (1), p. 1-14.

129. Hammes G. G., Schullery S. E. Structure of macromolecular aggregates. II. Construction of model membranes from phospholipids and polypeptides // Biochemistry. 1970; v. 9 (13), p. 2555-2563.

130. Demel RA, London Y, Geurts van Kessel WS, Vossenberg FG, van Deenen LL The specific interaction of myelin basic protein with lipids at the air-water interface. // Biochim. Biophys. Acta. 1973; v. 311(4), p. 507-519.

131. Blaurock A. Letter: Some comments on "myelin membrane structure as revealed by x-ray diffraction" by David Harker.// Biophys J. 1973; v.13(11), p.1261-1262.

132. Gulik-Krzywicki T, Shechter E, Vittorio Luzzati, Faure M. Interactions of proteins and lipids: structure and polymorphism of protein-lipid-water phases.// Nature. 1969; v.223 (5211), p.1116-1121.

133. Bach D.Miller IR. Interaction of basic polypeptides with phospholipid monolayers // Europ. J. Biochem. 1975; v. 53, p. 265-277.

134. Letellier L, Shechter E. Correlations between structure and spectroscopic properties in membrane model system. Fluorescence and circular dichroism of the cytochrome c-cardiolipin system.// Eur. J. Biochem. 1973; v.40(2), p.507-12.

135. Chapman D, Urbina J. Biomembrane phase transitions. Studies of lipid-water systems using differential scanning calorimetry.//J Biol Chem. 1974; v. 249(8), p.2512-2521

136. Kimelberg H. K., Papahadjopoulos D. Phospholipid-protein interactions: membrane permeability correlated with monolayer "penetration".// Biochim. Biophys. Acta. 1971; v. 233, p. 805-809.

137. Kimelberg H. K., Papahadjopoulos D. Interactions of basic proteins with phospholipid membranes. Binding and changes in the sodium permeability of phosphatidylserine vesicles.//J. Biol. Chem. 1971; v. 246, p. 1142-1148.

138. Болдырев А. А.// Биологические мембраны и транспорт ионов. М.: Изд-во1. МГУ, 1985; с. 31.

139. Otnaess А.В., Little С., Stetten К., Wallin R., Johnsen S., Flengsrud R. Some characteristics of phospholipase С from Bacillus cereus //. Eur J Biochem. 1977; v. 79(2), p.459-68.

140. Van den Bosch H. Phospholipids. Eds. Hawthorne J.N, Ansell G. Amsterdam: Elsevier, 1982; p. 313-357.

141. Dennis E. A. The Enzymes. Ed. Boyer P. D. N. Y. Acad. Press, 1983; v. 16, p. 307-353.

142. Blomalaski J. S., Clark M. A The effect of sn-2 fatty acid substitution on phospholipase С enzyme activities. // Biochem J. 1987; v. 244, p. 497-502

143. Snyder W. R Bacillus cereus phospholipase C: carboxylic acid ester specificity and stereoselectivity. .//Biochim. Biophys. Acta. 1987; v. 920, p. 155-160.

144. Bugaut M., Kuksis A., Myher J. Loss of stereospecificity of phospholipases С and D upon introduction of a 2-alkyl group into rac-1,2-diacylglycero-3-phosphocholine. .//Biochim. Biophys. Acta. 1985; v. 835, p. 304-314.

145. Lombardo D., Dennis E.A. The role phospholipase A2 from cobra venom : prevention of substrate interfacial and activator effects.// J.Biol.Chem. 1985; v.260, p.16114-16121.

146. Sanders C.R., Hare B.J., Howard K.P., Prestegard J.H. Magnetically oriented phospholipids micelles as a tool for the study of membrane associated molecules.// Prog. NMR Spectrosc. 1994; v. 26, p.421-444.

147. World Health Organization. Tuberculosis: a global emergency. 1994. Report 94.177. World Health Organization, Geneva, Switzerland.

148. Riley RL, Mills CC, Nyka W, Weinstock N, Storey PB, Sultan LU, Riley MC, Wells WF. Aerial dissemination of pulmonary tuberculosis. A two-year study of contagion in a tuberculosis ward. //Am. J. Epidemiol. 1995; v. 142, p. 3-14.

149. Шубникова Е.А.Эпителиальные клетки. M., Из-во МГУ, 1996, с.162.

150. Еремеев В.В., Майоров К.Б. Взаимодействие макрофаг-микобактерия в процессе реакции микроорганизма на туберкулезную инфекцию // Проблемы туберкулеза. 2002; т.З, с.54-58.

151. Seydel, J.К., Wiese, М. Drug-Membrane Interactions: Analysis, Drug Distribution, Modeling. Weinheim: Wiley-VCH Verlag GmbH; 2002. 349 p.

152. Hong X, Hopfinger AJ. Construction, molecular modeling, and simulation of M. tuberculosis cell walls.// Biomacromolecules. 2004; v. 5(3), p. 1052-1065.

153. Morita YS, Patterson JH, Billman-Jacobe H, McConville MJ. // Biosynthesis of mycobacterial phosphatidylinositol mannosides.// Biochem J. 2004; v.378(Pt 2), p. 589597.

154. Gibson KJ, Gilleron M, Constant P, Puzo G, Nigou J, Besra GS. Identification of a novel mannose-capped lipoarabinomannan from Amycolatopsis sulphurea.// Biochem J. 2003; v. 372(Pt 3), p.821-829.

155. Gibson KJ, Gilleron M, Constant P, Puzo G, Nigou J, Besra GS. Structural and functional features of Rhodococcus ruber lipoarabinomannan.// Microbiology. 2003; v. 149(Pt 6), p.1437-1445.

156. Nigou J, Gilleron M, Rojas M, Garcia LF, Thurnher M, Puzo G. Mycobacterial lipoarabinomannans: modulators of dendritic cell function and the apoptotic response. // Microbes Infect. 2002; v. 4(9), p.945-953.

157. Indrigo J, Hunter RL Jr, Actor JK. Influence of trehalose 6,6'-dimycolate (TDM) during mycobacterial infection of bone marrow macrophages.// Microbiology. 2002; v.148(Pt 7), p.1991-1998.

158. Abulimiti A, Qiu X, Chen J, Liu Y, Chang Z. Reversible methionine sulfoxidation of Mycobacterium tuberculosis small heat shock protein Hsp16.3 and its possible role in scavenging oxidants. H Biochem Biophys Res Commun. 2003; v.305(1), p.87-93.

159. Braunstein M, Espinosa BJ, Chan J, Belisle JT, Jacobs WR Jr. SecA2 functions in the secretion of superoxide dismutase A and in the virulence of Mycobacterium tuberculosis. // Mol Microbiol. 2003; v.48(2), p.453-464.

160. Trajkovic V, Singh G, Singh B, Singh S, Sharma P. Effect of Mycobacterium tuberculosis-specific 10-kilodalton antigen on macrophage release of tumor necrosis factor alpha and nitric oxide. II Infect Immun. 2002; v.70(12), p.6558-6566.

161. Dave JA, Gey van Pittius NC, Beyers AD, Ehlers MR, Brown GD. Mycosin-1, a subtilisin-like serine protease of Mycobacterium tuberculosis, is cell wall-associated and expressed during infection of macrophages.//BMC Microbiol. 2002; v.2(1), p. 30-32.

162. Raynaud C, Guilhot C, Rauzier J, Bordat Y, Pelicic V, Manganelli R, Smith I, Gicquel B, Jackson M. Phospholipases С are involved in the virulence of Mycobacterium tuberculosis. //Mol. Microbiol. 2002; v.45(1), p.203-217.

163. Chopra P, Singh A, Koul A, Ramachandran S, Drlica K, Tyagi AK, Singh Y. Cytotoxic activity of nucleoside diphosphate kinase secreted from Mycobacterium tuberculosis. // Eur J Biochem. 2003; v.270(4), p.625-634.

164. Lopez M, Sly LM, Luu Y, Young D, Cooper H, Reiner NE. The 19-kDa Mycobacterium tuberculosis protein induces macrophage apoptosis through Toll-like receptor-2.// J Immunol. 2003; v. 170(5), p.2409-2416.

165. Zimmerli S., Edwards S., Ernst J. Selective receptor blockade during phagocytosis does not alter the survival and growth of Mycobacterium tuberculosis in human macrophages //Am. J. Cell. Mol. Biol. 1996; v. 15, p. 760-770.

166. Schlesinger L S. Macrophage phagocytosis of virulent but not attenuated strains of Mycobacterium tuberculosis is mediated by mannose receptors in addition tocomplement receptors. //J. Immunol. 1993; v. 150(7), p. 2920-2930.

167. Schlesinger L. S., Hull S., Kaufman T. Binding of the terminal mannosyl units of lipoarabinomannan from a virulent strain of Mycobacterium tuberculosis to human macrophages //J. Immunol. 1994; v. 152, p. 4070-4079.

168. Czop JK, Kay J. Isolation and characterization of beta-glucan receptors on human mononuclear phagocytes.// J Exp Med. 1991; v.173(6), p.1511-1520

169. Schlesinger L. S., Bellinger-Kawahar C., Payne N., Honvitz M. Phagocytosis of Mycobacterium tuberculosis is mediated by human monocyte complement receptors and complement component C3. // J. Immunol. 1990; v. 144, p. 477-495.

170. Raynaud C, Papavinasasundaram KG, Speight RA, Springer B, Sander P, Bottger EC, Colston MJ, Draper P. The functions of OmpATb, a pore-forming protein of Mycobacterium tuberculosis. // Mol Microbiol. 2002; v. 46(1), p.191-201.

171. Velasco-Volazquez M.A., Barrera D., Gonzalez-Arenas A., Rosales C., Agramonte-Hevia J. Macrophage-Mycobacterium tuberculosis interaction: role of complwement receptor 3//Microbial.Pathogenesis. 2003; v. 35, p. 125-131.

172. Gordon S. Alternative activation of macrophages. // Nat Rev Immunol. 2003; v.3(1), p. 23-35.

173. Clemens DL, Lee BY, Horwitz MA. The Mycobacterium tuberculosis phagosome in human macrophages is isolated from the host cell cytoplasm.// Infect Immun. 2002; v. 70(10), p.5800-5807.

174. Scott CC, Botelho RJ, Grinstein S. Phagosome maturation: a few bugs in the system. //J. Membr. Biol. 2003; v. 193(3), p. 137-152.

175. Chua J, Deretic V. Mycobacterium tuberculosis reprograms waves of phosphatidylinositol 3-phosphate on phagosomal organelles.// J. Biol. Chem. 2004; v. 279 (35), p.36982-36992.

176. Hostetter J, Steadham E, Haynes J, Bailey T, Cheville N. Phagosomal maturation and intracellular survival of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in J774 cells.// Сотр. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 2003; v. 26(4), p.269-283.

177. Перельман M. И., Корякин В. А., Протопопова H. M. Туберкулез. М.: Медицина, 1990, 304 с.

178. The Merck Index. The eleventh edition. Centennilal Edition. Rahway, N.J., USA. 1989. p.1308.

179. Машковский М.Д. //Лекарственные средства. / M.: Медицина, 1984, в 2 т.

180. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. // Справочник биохимика. / М.: Мир, 1991.

181. Wanger A., Mills К. Testing of Mycobacterium tuberculosis susceptibility to ethambutol, isoniazid, rifampin and streptomycin by using Etest // J Clin Microbiol. 1996; v.34(7), p. 1672-1676.

182. Acocella G. Clinical pharmacokinetics of rifampicin. // Clin Pharmacokinet. 1978; v.3.(2), p.108-127.

183. Peloquin C.A., Jaresko G.S., Yong C.L., Keung A.C.F., Bufpitt A.E., Jelliffe R.W. Population pharmacokinetic modeling of isoniazid, rifampin and pirazinamide // Antimicrob Agents Chemother. 1997; v.41(12), p. 2670-2679.

184. Pargal A., Rani S. Non-linear pharmacokinetics of rifampicin in healthy Asian Indian volunteers // Int J Tuberc Lung Dis. 2001; v.5 (1), p.70-79.

185. Jamis-Dow C.A., Katki A.G., Collins J.M., Klecker R.W. Rifampin and rifabutin and their metabolism by human liver esterases. // Xenobiotica. 1997; v.27(10), p.1015-1024.

186. Shishoo C.J., Shan S.A., Rathod I.S., Savale S.S., Kotecha J.S., Shan P.B. Stability of rifampicin in dissolution medium in presence of isoniazid. // Int J Pharm. 1999; v.190 (1), p.109-23.

187. Shishoo C.J., Shan S.A., Rathod I.S., Savale S.S., Vora M.J. Impaired bioavailability of rifampicin in presence of isoniazid from fixed dose combination (FDC) formulation. //Int J Pharm. 2001; v.228 (1-2), p.53-67.

188. Agrawal S., Panchagnula R. Implication of biopharmaceutics and pharmacokinetics of rifampicin in variable bioavailability from solid oral dosage forms// Biopharm. Drug Dispos.2005; v.26, p.321-334.

189. Nahata M.C., Morosco R.S., Hippie T.F. Stability of rifampin in two suspensions at room temperature. // J Clin Pharm Ther. 1994; v. 19 (4), p. 263-265.

190. Pearson S.D., Trissel L.A. Stability and compatibility of minocycline hydrochloride and rifampin in intravenous solution at various temperatures. // Am J Hosp Pharm. 1993; v.50 (4), p. 698-702.

191. Seifart H.I., Parkin D.P., Donald P.R. Stability of isoniazid, rifampin and pyrazinamide in suspensions used for the treatment of tuberculosis in children. // Pediatr Infect Dis J. 1991; v. 10 (11), p. 827-831.

192. Le Guellec C., Gaudet M.L., Lamanetre S., Breteau M. Stability of rifampin in plasma: consequences for therapeutic monitoring and pharmacokinetic studies. // Ther Drug Monit. 1997; v.19 (6), p. 669-674.

193. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России: М.: Астра Фарм Сервис, 2003, 1488 с.

194. Gaspar М. М., Neves S., Portaels F., Pedrosa J., Silva M. Т., Cruz M. E. Therapeutic efficacy of liposomal rifabutin in a Mycobacterium avium model of infection //Antimicrob Agents Chemother, 2000; v. 44 (9), p. 2424-2430.

195. Brogden R. N., Futton A. Rifabutin. A review of its antimicrobial activity, pharmacokinetic properties and therapeutic efficacy. // Drugs. 1994; v. 47( 6), p. 983-1009.

196. Цыбанёв А. А., Соколова Г. Б. Противотуберкулёзный антибиотик пролонгированного действия рифабутин. Антимикробный спектр, особенности фармакодинамики и фармакокинетики //Антибиотики и химиотерапия, 1999; т. 44, с. 30-36.

197. Floss H. G., Yu T.-W. Rifamycins mode of action, resistance, and biosynthesis II Chem. Reviews, 2005; v. 105 (2), p. 621-632.

198. Ungheri D. D. В. C., Sanfilippo A. Studies on the mechanism of action of spiropiperidyl-rifamycin on LM427 rifampicin-resistant M.tuberculosis. // Drug Exp Clin Res., 1984; v.10, p. 681-689.

199. Balon K., Riebesehl B. U., Muller B. W. Drug liposome partitioning as a tool for the prediction of human passive intestinal absorption // Pharm. Res. 1999; v. 16(6), p. 882-888.

200. Дудниченко AC., Краснопольский Ю.М. Швец В.И. Липосомальные лекарственные препараты в эксперименте и клинике. Харьков: "РА-Каравелла", 2001,114 с.

201. Каплун А.П., Ле Банг Шон, Краснопольский Ю.М., Швец В.И. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ.// Вопросы мед. химии. 1999; т. 45(1), с. 3-12.

202. Gregoriadis G. Liposomes as Drug carriers : Resent Trends and Progress. UK. 1988. J.Wiley and Sons.

203. Бригинский C.A., Зубаренко A.B., Лишко B.K. Применение липосом для коррекции респираторной гипоксии при экспериментальной пневмонии. //Бюлл. эксперим. биологии и медицины 1988; т. 10, с. 421-423.

204. Стефанов А.В., Темиров Ю.П., Краснопольский Ю.М. Споа'б одержання лтосомального препарату. Патент УкраЫи 1995; т. 56, с.54.

205. Хромов О.С. Стефанов О. В Коррещ'я за допомогою лецитинових лтосом (niniHy) порушень центрально! гемодинам1ки у LuypiB пщ час геморагчного шоку. № и 1995; т.5, с. 54-60.

206. Rosenberg О.А., Kirillov Yu. A., Danilov L.N. The lung surfactant and immune system response to intratracheal administration of " empty" liposomes. //J. Liposome Res. 1994; v.4, p. 203-212.

207. Volchkov V.A., Kirillov Ju. A., Dubrovskaja V.F.,Rosenberg О.А. II J. Liposome Research. 1998; v. 8, p. 120-121

208. Крейнес B.M., Мельникова Я.М., Марголин Я.М., Мельянцева Л.П., Гладштейн А.И., Андриасян Б.А. Противовоспалительный эффект липосом. // Вестник Академии Мед. Наук 1990; т. 6, с. 44-47.

209. Thomas D.A., Myers М.А., Wichert В., Schreier Н., Gonzalez-Rothi R.J. Acute effects of liposome aerosol inhalation on pulmonary function in healthy human volunteers //Chest, 1991; v.99, p.1268-1270.

210. Емельянова Л.Ф., Крючкова В.И., Соковнина C.B., Гумярова Г.Х., Касаткина Г.М. Липосомы при лечении детей с хронической пневмонией и муковисцидозом. //6 Национальный конгресс по болезням органов дыхания. Новосибирск, 1-4 июля 1996 .

211. Розенберг О.А., Гранов A.M., Шевченко Ю.Л., Осовских В.В., Баутин А.Е., Гаврилин С.В., Сейслиев А.А., Кириллов Ю.А., Волчков В.А. Способ лечения респираторного дистресс-синдрома взрослых. №2149016 1999 А 61 К 38.00

212. Розенберг О.А., Рюмина И.И., Дементьева Г.М., Герасимов А.Ю., Сейслиев А.А., Лошакова Л.В. Способ лечения постнатальных пневмоний у новорожденных. №2149015 1999 А 61 К 38.00

213. Масуев К.А., Лимаренко Е.А., Чучалин А.Г. Применение фосфолипидных липосом в лечении астмы //Пульмонология. 1991; т.З, с.68-69.

214. Масуев К.А., Сиротин Е.А., Лимаренко Е.А. Двойное слепое исследование эффективности фосфатидилхолиновых липосом в лечении бронхообструктивного синдрома.//Пульмонология 1993; т. 3, с. 51-55.

215. Deol P., Khullar G.K., Joshi К. Therapeutic efficacies of isoniazid and rifampin encasulated in lung-specific stealth liposomes against Mycobacterium tuberculosis infection induced in mice.// Antimicrob.Agents Chemother. 1997;v.41 (6), p.1211-1214.

216. Poste G, Kirsh R.Liposome-encapsulated macrophage activation agents and active non-specific immunotherapy of neoplastic disease.//Prog Clin Biol Res. 1982; v. 102 (pt A), p.309-319.

217. Kirsh R., Poste G. Liposome-mediated macrophage activities // Methods Enzymol. 1987; v. 149, p. 147-165.

218. Perry D.G., Martin W.J. Fluorescent liposomes as quantitative markers of phagocytosis by alveolar macrophages.//J.Immunol. Methods. 1995; v. 181, p. 269285.

219. Gabizon A. , Papahadjopoulos D. The role of surface charge and hydrophilic groups on liposome clearance in vivo. // Biochim. Biophys. Acta. 1992; v. 1103, p. 94-100.

220. Allen T.M., Austin G.A., Chonn A., Lin L., Lee K.D. Uptake of liposomes by cultured mouse bone marrow macrophages: influence of liposome composition and size // Biochim. Biophys. Acta. 1991; v.1061, p. 56-64.

221. Liu D., Mori A., Huang L. Large liposomes containing ganglioside GM1 accumulate effectively in spleen. // Biochim Biophys Acta. 1991; v. 1066(2), p. 159165.

222. Lee K.D, Hong K., Papahadjopoulos D. Recognition of liposomes by cells: in vitro binding and endocytosis mediated by specific lipid headgroups and surface charge density // Biochim. Biophys. Acta. 1992; v. 1103, p. 185-197.

223. Gonzalez-Rothi R.J., Straub L.,Cacace J.L., Schreire H. Liposomes and pulmonary alveolar macrophages: functional and morphologic interactions // Exp. Lung Res. 1991; v. 17(4), p.687-700.

224. Babior B.M. The respiratory burst of phagocytes. // J. Clin. Invest. 1984; v.73, p.599-601.

225. Sporn P.H., Marshall T.M., Peters-Golden M. Differential dependence on protein kinase С of arachidonic acid metabolism stimulated by hydrogen peroxide and by zymosan in the alveolar macrophage // Biochim. Biophys. Acta. 1990; v.1047, p.187-191.

226. Meirinhos da Cruz M.E., Constantino L.V., Gaspar de Jesus Guilherme M., Berestein-Lopez G. WO 93/23016 от 25.11.1993.

227. Johansson J., Curstedt T. Molecular structures and interactions of pulmonary surfactant components // Eur. J. Biochem. 1997; v. 244, p.675-693.

228. Мельянцева Л.П., Крейнес В.М., Шраер Т.И. Влияние продуктов перекисного окисления липидов липосом на антибактериальную активность липосом. //Антибиотики и химиотерапия. 1992; т. 37, с. 8-10.

229. Курунов Ю.Н., Каледин В.И., Попова Н.А., Пантелеева А.Г., Эффективность липосомальной формы рифампицина при лечении экспериментального туберкулеза мышей. // Проблемы туберкулеза, 1992 , №12, с.13-15.

230. Deol P., Khullar G.K., Lung specific stealth liposomes: stability, biodistribution and toxicity of liposomal antitubercular drugs in mice.// Biochim Biophys.Acta.1997; v. 1334, p.161-172.

231. Orozco L.C., Quintana F.O., Beltran R.M., de Moreno I., Wasserman M., Rodriguez G. The use rifampicin and isoniazid entrapped in liposomes for thetreatment of murine tuberculosis.// Tubercle.1986; v.67(2), p.91-97.

232. Гельперина С.Э., Гуляев A.E., Иванов A.A., Пальцев М.А., Северин Е.С, Северин С.Е. Композиция для лечения легочных инфекций. Патент России № 2185818 от 27.07.2002.// Бюлл. изобретений, полезных моделей. 2002; № 21, с.260.

233. Владимирский М.А., Ладыгина Г.А., Петюшенко P.M. Экспериментальное изучение липосомального препарата стрептомицина при туберкулезе. Липосомы, применение в биологии и медицине. М.: Наука, 1985; с. 77-82.

234. Nakhare S., Vyas S.P. Prolonged release of rifampicin from multiple w/o/w emulsion systems.//J.Microencapsul. 1995; v. 12, p. 409-415.

235. Гуревич Г.Л., Березовская Л.Н., Мануйлов К.К. Особенности фармакокинетики рифампицина, включенного в липосомы, у крыс при внутритрахеальном введении.// Антибиотики и химиотерапия.1992; т.37 (7), с.25-27.

236. Vyas S.P., Kannan М.Е., Jain S., Mishra V., Singh P. Design of liposomal aerosola for improved delivery of rifampicin to alveolar macrophages.// Intern.J. Pharmaceutics. 2004; v.269, p.37-49.

237. Kondo E., Kanai K. Mechanism of bactericidal activity of lysolecithin and its biological implication. //Jpn.J.Med.Sci.Biol. 1985; v. 38(4), p.181-194.

238. Kanai K, Kondo E. Phospholipase A2-induced antimycobacterial activity in the membrane fraction obtained from peritoneal exudate cells of guinea pigs.// Jpn J Med Sci Biol. 1980; v.33(2), p.87-101.

239. Kondo E, Kanai K. An attempt to cultivate mycobacteria in simple synthetic liquid medium containing lecithin-cholesterol liposomes.// Jpn. J. Med. Sci. Biol. 1976; v.29(3), p.109-121.

240. Lichtenberg D., Robson R., Dennis E.A Solubilization of phospholipids by detergents. Structural and kinetic aspects.//Biochim. Biophys. Acta. 1983; v. 737 (2), p. 285-304.

241. Яцимирский A.K. //Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. М.: Наука, 1987, с. 6-43.

242. Shankland W. The equilibrium and structure of lecithin-cholate mixed micelles //Chem. Phys. Lipids. 1970; v. 4, p. 109-130.

243. Mazer N.A., Benedek G.B., Carey M. C. Quasielastic light-scattering studies of aqueous biliary lipid systems. Mixed micelle formation in bile salt-lecithin solutions.// Biochemistry. 1980; v. 19(4), p.601-615.

244. Madden T.D., Cullis P.R. Stabilization of bilayer structure for unsaturated phosphatidylethanolamines by detergents. //Biochim. Biophys. Acta. 1982; v. 684, p. 149-153.

245. Small D.M., Penkett S.A., Chapman D. Studies on simple and mixed bile salt micelles by nuclear magnetic resonance spectroscopy. //Biochim. Biophys. Acta. 1969; v. 176, p. 178-179.

246. Wakelam M. J. O. Inositol phospholipid metabolism and myoblast fusion // Biochem. J.1983; v. 214, p. 77-82.

247. Weissman G., Anderson P., Serhan C. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1980; v. 77, p. 1506-1510.

248. Wilshut J., Papahadjopoulos D. Ca2+-induced fusion of phospholipid vesicles monitored by mixing of aqueous contents // Nature, 1979; v. 281, p. 690-692.

249. Sundler R., Papahadjopoulos D. Control of membrane fusion by phospholipid head groups. I. Phosphatidate/phosphatidylinositol specificity.// Biochim. Biophys. Acta, 1981; v. 649, p. 743-750.

250. Seelig J. 31P nuclear magnetic resonance and the head group structure of phospholipids in membranes// Biochim. Biophys. Acta, 1978; v. 515, p. 105-140.

251. De Kruijjf В., Morris G. A., Cullis P. R. Application of 31P-NMR saturation transfer techniques to investigate phospholipid motion and organization in model and biological membranes. // Biochim. Biophys. Acta, 1980; v. 598, p. 206-211.

252. Ekerdt R., Papahadjopoulos D. Intermembrane contact affects calcium binding to phospholipid vesicles. //Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1982; v. 79, p. 22732277.

253. Cullis P. R., Hope M. J. Effects of fusogenic agent on membrane structure of erythrocyte ghosts and the mechanism of membrane fusion.// Nature, 1978; v. 271, p. 672-674.

254. Vasilenko I., De Kruijff В., Verkleij A. J. The synthesis and use of thionphospholipids in 31P-NRM studies of lipid polymorphism.//Biochim. Biophys. Acta, 1982; v. 685, p. 144-152.

255. Okimasu E., Shiraishi N., Kobayashi S. Selective interaction of cytoskeletal proteins with liposomes. //FEBS Lett., 1982; v. 145, p. 82-86.

256. Кузьмин В.П. В кн.: Системные исследования. М.: Наука, 1978, с.26-53.

257. Cooper R. Н., Coll К. Е., Williamson J. R. Differential effects of phorbol ester on phenylephrine and vasopressin-induced Ca2+ mobilization in isolated hepatocytes//J. Biol. Chem., 1985; v. 260 (6), p. 3281-3288.

258. Lapetina E. J. Spacial isolation of protein kinase С activation in thrombin stimulated human platelets//Life Sci. , 1984; v. 3(11), p. 1011-1018.

259. Blaustein M. P., Ector A. C. Carrier-mediated sodium-dependent and calcium-dependent calcium efflux from pinched-off presynaptic nerve terminals (synaptosomes) in vitro.// Biochim. Biophys. Acta, 1976; v. 419 (2), p. 295-308.

260. Никушкин E. В., Крыжановский Г. H., Глебов Р. Н., Малолетнева О. Ю., Каплун А. П., Майсое Н. И., Ганкина Е. М., Сюткин Е. А.// Бюл. эксперим. биологии и медицины, 1983; т. 96 (9), с. 51-55.

261. Irvine R. F., Lechter A. J., Dawson R. M. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate phosphodiesterase and phosphomonoesterase activities of rat brain. Some properties and possible control mechanisms. //Biochem. J., 1984; v. 218 (1), p. 177-185.

262. Berridge M. I. Inositol trisphosphate and diacylglycerol as second messengers.//Biochem. J., 1984; v. 220 (2), p. 345-360.

263. Vishizuka Y., Takai Y. In: Protein Phosphorylation. London: Pergamon Press Ltd., 1981, p. 237-249.

264. Lapetina E. G. The production of phosphatidylinositol trisphosphate is stimulated by thrombin in human platelets //Life Sci., 1983; v. 32 (18), p. 2069-2082.

265. Holmes RP, Yoss NL Failure of phosphatidic acid to translocate Ca2+ across phosphatidylcholine membranes.//Nature. 1983; v. 305(5935), p.637-638

266. Poste G. Liposome targeting to macrophages: opportunities for treatment of infectious diseases// Biol.Cell. 1983; v. 47, p. 19-37.

267. Van Furth G.M. Large Medical Publications. Ljs Altas, 1972.

268. Wassef N.M., Alving C.R. Complement-dependent phagocytosis of liposomes by macrophages// Methods Enzymol. 1987; v. 149, p. 124-134.

269. Honda Y. ,Kataoka K., Hayashi Y., Takahashi H., Suzuki A., Akino T. Alterations of acidic phospholipids in bronchoalveolar lavage fluids of patients with pulmonary alveolar proteinosis//Clin. Chim. Acta. 1989; v.181, p.11-18.

270. Автандилов Г.Г. Медицинская морфология, M.,Медицина, 1990,стр.26.

271. Shraer T.I., Kreines V.M., Golubchikova N.A., Ustjantzeva I.M., Meljantzeva L.P., Lagunova N.T. //J.Liposome Research 1994; v.4, p.281-282.

272. Liu, D., Huang, L. Trypsin-induced lysis of lipid vesicles: effect of surface charge and lipid composition //Anal. Biochemistry 1992; v. 202 (1), p. 1-5.

273. Уголев A.M. Мембранный гидролиз и транспорт, Л.: Наука. 1986, 475 с.

274. Lasic, D.D. Liposomes: from physics to applications. Elseiver, 1993, p. 570.

275. Siegel DP, Epand RM. The mechanism of lamellar-to-inverted hexagonal phase transitions in phosphatidylethanolamine: implications for membrane fusion mechanisms.//Biophys J. 1997; v. 73(6), p. 3089-3111.

276. Potter SM, Baum JA, Teng H, Stillman RJ, Shay NF, Erdman JW Jr. Soy protein and isoflavones: their effects on blood lipids and bone density in postmenopausal women.//Am J Clin Nutr. 1998; v.68(6 Suppl), p.1375S-1379S.

277. G. Wang, S.S.Kuan, O.J.Francis, G.M.Ware, F.S.Carman. // J. Agric. Food.

278. Chem. 1990; v. 38, p. 185-190.

279. В. Gestetner, l.lshaaya, Y. Birk, A.Bondi.// Israel Journal of Chemistry. 1963; v.1, p.460-466.

280. Технология переработки жиров. Под редакцией Н.С.Арутюняна. М.:Наука, 1975.

281. J.C. Ditmer, R.L. Lester. Phosphorous determination // J.Lipid Res. 1964; v. 5 (1), p. 126-129.

282. Bardygula-Nonn LG, Kaster JL, Glonek T. Phospholipid profiling of sediments using phosphorus-31 nuclear magnetic resonance.// Lipids. 1995; v. 30(11), p. 1047-1051.

283. Ю.А. Владимиров. Фотохимия и люминесценция белков. М.,1965,с.35-65.

284. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.// Anal Biochem. 1976; v. 72, p. 248-254.

285. Rodriguez-Vico F, Martinez-Cayuela M, Garcia-Peregrin E, Ramirez H. A procedure for eliminating interferences in the Lowry method of protein determination. //Anal Biochem. 1989; v.183(2), p.275-278.

286. Гаспаров B.C., Дегтярь В.Г. Определение белков по связыванию с краской Кумасси бриллиантовый голубой G-250.11 Биохимия. 1994; т. 59, с.763-775.

287. Y. Birk, A. Bondi, В. Gestetner, I. Ishaaya A pure trypsin inhibitor from soya beans// Nature.1963; v.197, p.1089-1090.

288. W. J. Wolf, B. W. Thomas Ion-exchange chromatography of soybean saponins.//J. Chromatogr. 1971; v. 56, p. 281-293i

289. M. Shiraiwa, S. Kudo, M. Shimoyamada, K. Harada, K. Okubo // Agric. Biol. Chem. 1991; v. 55, p. 315-322.

290. Kersten GF, Spiekstra A, Beuvery EC, Crommelin DJ. On the structure of immune-stimulating saponin-lipid complexes (iscoms).//Biochim Biophys Acta. 1991; v. 1062(2), p.165-171.

291. Bhamidipati S.P., Hamilton J.A. Interactions of lyso 1-palmitoylphosphatidylcholine with phospholipids: a 13C and 31P NMR study. // Biochemistry. 1995; v. 34(16), p.5666-5677.

292. Kassel, В., Radicevic, M., Berlow, S., Peanasky, R.J., Laskowski, M.S. The basic trypsin inhibitor of bovine pancreas. An improved method of preparation and amino acid composition.//J Biol Chem. 1963; v. 238, p.3274-3279.

293. Birk, Y. The Bowman-Birk inhibitor. Trypsin- and chymotrypsin-inhibitor from soybeans//Int. J. Pept. Protein Res., 1985; v.25, p. 113-131.

294. Нейрат Г., Бэйли К. Биохимия белковых веществ. М.: Иностранная литература, 1959, с. 706.

295. Reisfeld, R.A., Lewis, U.J., and Williams, D.E. Disk electrophoresis of basic proteins and peptides on polyacrylamide gels.// Nature, 1962; v. 195, p. 281-283.

296. Swaisgood, H.E. (1982) in Applied Science. Developments in dairy chemistry. (Fox, P.F., ed), London, p. 4.

297. Oshima G. Interaction of alpha-chymotrypsin with dimyristoyl phosphatidylcholine vesicles.//J. Biochem (Tokyo). 1984; v. 95(4), p.1131-1136.

298. Klibanov AL. Использование фосфатидилинозитола как гидрофобного якоря для белков, связанных с липосомами // Бюлл. Всесоюз. Кардиол. Науч. Центра АМН. 1981; т. 4(2), с.30-34.

299. Bogdanov АА, Klibanov AL, Torchilin VP. Immobilization of alpha-chymotrypsin on sucrose stearate-palmitate containing liposomes.// FEBS Lett. 1984; v.175(1), p.178-182.

300. Weissig V, Lasch J, Klibanov AL, Torchilin VP. A new hydrophobic anchor for the attachment of proteins to liposomal membranes. // FEBS Lett. 1986; v.202(1), p.86-90.

301. Regen SL, Singh M, Samuel NK. Functionalized polymeric liposomes. Efficient immobilization of alpha chymotrypsin.// Biochem Biophys Res Commun. 1984; v. 119(2), p.646-651.

302. Koelsch R, Lasch J, Klibanov AL, Torchilin VP. Incorporation of chemically modified proteins into liposomes.// Acta Biol Med Ger. 1981; v. 40(3), p.331-335.

303. Kozlova NO, Bruskovskaya IB, Okuneva IB, Melik-Nubarov NS, Yaroslavov AA, Kabanov VA, Menger FM. Interaction of a cationic polymer with negatively charged proteoliposomes.//Biochim Biophys Acta. 2001; v.1514(1), p.139-151.

304. Kozlova NO, Bruskovskaya IB, Melik-Nubarov NS, Yaroslavov AA, Kabanov VA. Catalytic properties and conformation of hydrophobized alpha-chymotrypsinincorporated into a bilayer lipid membrane. // FEBS Lett. 1999; v. 461(3), p.141-144.

305. De Kruijff B, Cullis PR, Radda GK. Outside-inside distributions and sizes of mixed phosphatidylcholine-cholesterol vesicles.// Biochim Biophys Acta. 1976; v. 436(4), p.729-740.

306. Burnell, E.R., Cullis, P.R., de Kruijff, B. Effects of tumbling and lateral diffusion on phosphatidylcholine model membrane 31P-NMR lineshapes. //Biochim. Biophys Acta. 1980; v.603(1), p.63-69.

307. Bordier, C. Phase separation of integral membrane proteins in Triton X-114 solution.//J. Biol. Chem. 1981; v. 256, p.1604-1607.

308. Levy, D., Gulik, A., Seigneuret, M., Rigaud, J.-L. Phospholipid vesicle solubilization and reconstitution by detergents. Symmetrical analysis of the two processes using octaethylene glycol mono-n-dodecyl ether// Biochemistry, 1990; v. 29, p.9480-9488.

309. Webb, M.S., Hui, S.W., Steponkus, P.L. Dehydration-induced lamellar-to-hexagonal-ll phase transitions in DOPE/DOPC mixtures.// Biochim. Biophys. Acta, 1993, v. 1145, p. 93-104.

310. Arnold, K., Losche, A., Gawrisch, K. 31P-NMR investigations of phase separation in phosphatidylcholine/phosphatidylethanolamine mixtures.// Biochim. Biophys. Acta, 1981; v, 645, p. 143-148.

311. Lafleur, M., Bloom, M., Eikenberry, E.F., Gruner, S.M., Han, Y., Cullis, P.R. Correlation between lipid plane curvature and lipid chain order.// Biophys. J., 1996; v. 70, p. 2747-2757.

312. Rand, R.P., Fuller, N.L. Structural dimensions and their changes in a reentrant hexagonal-lamellar transition of phospholipids//Biophys. J., 1994; v. 66, p. 2127-2138.

313. Litzinger D.C., Huang L. Phosphatidylethanolamine liposomes: drug delivery, gene transfer and immunodiagnostic applications. // Biochim. Biophys. Acta, 1992; v.1113, p.201-227.

314. Wu Y.V., Sessa D.J. Conformation of Bowman-Birk inhibitor. // J. Agric. Food Chem., 1994; v. 42, p. 2136-2138.

315. Matsuzaki K. Why and how are peptide-lipid interactions utilized for self-defense? Magainins and tachyplesins as archetypes.//Biochim. Biophys. Acta, 1999; v. 1462, p. 1-10.

316. Novaira A.I., Avila V., Montich G.G., Previtali C.M. Fluorescence quenching of anthracene by indole derivatives in phospholipid bilayers. //J. Photochem. Photobiol. B: Biology, 2001; v. 60, p. 25-31.

317. De Bony J., Tocanne J.F.- Synthesis and physical properties of phosphatidylcholine labeled with 9-(2-anthryl)nonanoic acid, a new fluorescent probe.//Chem. Phys. Lipids. 1983; v. 32, p. 105-121.

318. Llakowicz J.R. Principles of fluorescence microscopy. In: Plenum Press 2-nd Ed., N.Y. 1999.

319. Дженкс, В. Катализ в химии и энзимологии, М.: Мир,1972, гл. 8.

320. Janiak MJ, Small DM, Shipley GG. Temperature and compositional dependence of the structure of hydrated dimyristoyl lecithin. //J Biol Chem. 1979; v. 254 (13), p.6068-6078.

321. Von Specht, B.U., Brendel, W. Preparation and properties of trypsin and chymotrysin coupled covalently to poly (N-vinylpyrrolidone). // Biochim. Biophys. Acta. 1977; v. 484, p. 109-114.

322. Владимиров, Ю.А., Потапенко, А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов, М.: "Высшая школа", 1989, с. 74.

323. Werner, М.Н., Wemmer, D.E. Three-dimensional structure of soybean trypsin/chymotrypsin Bowman-Birk inhibitor in solution// Biochemistry, 1992; v.31, p. 999-1010.

324. De la Maza, A., Parra, J.L. Changes in phosphatidylcholine liposomes caused by a mixture of Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate //Biochim Biophys Acta. 1996; v.1300(2), p.125-134.

325. O'Neil, M. J., Smith, A., Heckelman, P. E„ Budavari, S.: Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, & Biologicals, 13 edn. 2001. Merck Publishing Co. 2564 c.

326. Maggi N., Pasqualucci C. R., Ballotta R., Sensi P. Rifampicin: a new orally active rifamycin // Chemotherapia. 1966; v. 11 (5), p. 285-292.

327. Pasqualucci C. R., Vigevani A., Radaelli P., Maggi N. Analisi spettrofotometrica della rifampicina // Farmaco, 1969; v. 24 (1), p. 46-52.

328. Овчарова Г.Д., Нашева P.H., Димитрова Д.Б. Потенциометрический метод количественного анализа рифампицина. //Антибиотики и химиотер.1990; т.35(2), с.8-10.

329. Harvey D. Modern analytical chemistry. McGraw-Hill, 2000, 798 p.

330. M.H. Skinner, T.F.BIaschke. Clinical pharmacokinetics of rifabutin.// Clin. Pharmacokinet. 1995; v.28, p.115-125.

331. Rodrigues, C., Gameiro, P., Prieto, M., de Castro, B. Interaction of rifampicin and isoniazid with large unilamellar liposomes: spectroscopic location studies. // Biochim. Biophys. Acta. 2003; v. 1620, p. 151-159.

332. Богомолов, О.В., Каплун, А.П., Швец, В.И. Мембранные флуоресцентные зонды. // Биоорг. химия. 1984; т. 10, с. 1560-1564.

333. Dean J.A. Lange's handbook of chemistry, 15-th edition. New York: McGraw-Hill, 1999.1291 p.

334. Коронелли T.B. Липиды микобактерий и родственных микроорганизмов // М.: Издательство Московского университета, 1984; 160 с.

335. Moss, Т. DNA-protein interactions: principles and protocols, 2-nd edition. Totowa: Humana press, 2001. 639 p.

336. Parker, M.A., King, V., Howard, K.P. Nuclear magnetic resonance study of doxorubicin binding to cardiolipin containing magnetically oriented phospholipid bilayers // Biochim. Biophys. Acta. 2001; v. 1514, p. 206-216.

337. Khuller G. K., Kapur M., Sharma S., Liposome technology for drug delivery against mycobacterial infections// Curr. Pharm. Des., 2004; v. 10 (26), p.3263-3274.

338. Agarwal A., Kandpal H., Gupta H. P. Tuftsin-bearing liposomes as rifampin vehicles in treatment of tuberculosis in mice.//Antimicrob. Agents Chemother. 1994; v.38 (3), p.588-593.

339. Mohan В., Sharda N., Singh S. Evaluation of the recently reported USP gradient HPLC method for analysis of anti-tuberculosis drugs for its ability to resolve degradation products of rifampicin.//J. Pharm. Biomed. Anal. 2003; v.31 (3), p.607-612.

340. Gallo G. G., Radaelli P., //Anal. Profiles of Drug Subs. 1976; v.5, p.467-513.

341. Временная инструкция по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода "ускоренного старения при повышенной температуре" Мин. Здрав. И-42-2-82

342. Бушмакина И.М., Мартынова М.А., Конев С.В. Влияние продуктов окисления антибиотика рифампицина на состояние липидов в липосомах. // Дан.Национальной академии наук Беларуси. 2004;т.48 (5), с. 70-74.

343. Maggi N., Pallanza R, Sensi P. New derivatives of rifamycin SV // Antimicrob. Agents Chemother, 1965; v. 5, p. 765-769.)

344. Munoz-Elias E.J., McKinney J.D. M. tuberculosis isocitrate lyases 1 and 2 jointly reguired for in vivo growth and virulence // Nature Med. 2005; v.11, p.638-644.

345. Raynaud C, Guilhot C, Rauzier J, Bordat Y, Pelicic V, Manganelli R, Smith I, Gicquel B, Jackson M. Phospholipases С are involved in the virulence of Mycobacterium tuberculosis. //Mol. Microbiol. 2002; v.45 (1), p.203-17.

346. Trimble W.S., Grinstein S. ТВ or not ТВ: calcium regulation in Mycobacterial survival.// Cell. 2007; v. 130, p.12-13.

347. Рубан Е.Л. // Микробные липиды и липазы. М.: Наука. 1977.

348. Zhang Y., Heym В., Allen В., Young D. Cole S.T. The catalase-peroxidase gene and isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis. // Nature. 1992; v. 358, p. 591-593.

349. Musser J.M. Antimicrobial agent resistance in mycobacteria: molecular genetic insights. //Clin. Microbiol. Rev. 1995; v. 8, p. 496-514.

350. Li X.Z., Zhang L., Nikaido H. Efflux pump-mediated intrinsic drug resistance in Mycobacterium smegmatis. //Antimicrob. Agents Chemother. 2004; v. 48 (7), p. 2415-2423.

351. Bardou F., Raynaud C., RamosC., Laneelle M.A., Laneelle G. Mechanism of isoniazid uptake in Mycobacterium tuberculosis // Microbiology. 1998; v. 144, p. 2539-2544.

352. Zabinski R.F., Blanchard J.S Molecular mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis//J. Am. Chem. Soc. 1997; v. 119, p. 2331-2332.

353. Rozwarski D.A., Grant G.A., Barton D.H.R., Jacobs W.R.Jr, Sacch J.C. Modification of the NADH of the isoniazid target (InhA) from Mycobacterium tuberculosis ettini // Science. 1998; v. 279, p. 98-102.

354. Brennan P.J., Nikaido H The envelope of mycobacteria. // Annu. Rev. Biochem. 1995; v. 64, p. 29-63.

355. Imai Т., Kageyama Y., Tobari J. Mycobacterium smegmatis malate dehydrogenase: activation of the lipid-depleted enzyme by anionic phospholipids and phosphatidylethanolamine// Biochim. Biophys. Acta. 1995; v. 1246 (2), p. 189-196.

356. Sung N., Collins M.T. Variation of resistance of M.paratuberculosis to acid environments as a function of culture medium. // Appl. Environmental Microbiol. 2002; v.69 (11), p.6833-6840.

357. Sung N., Takayama K.,Collins M.T. Possible association of Gro ES and antigen 85 proteins with heat resistance of M. paratuberculosis //Appl. Environmental Microbiol. 2004; v.70 (3), p.1688-1697.

358. Ларионова Н.И., Гладышева И.П., Тихонова Т.В., Казанская Н.Ф. Ингибирование катепсина G и эластазы из гранулоцитов человека соевым ингибитором типа Баумана-Бирк// Биохимия, 1993; т.58, с.1437-1444.

359. Гладышева И.П., Балабушевич Н.Г., Мороз НА, Ларионова Н.И Выделение и характеристика соевого ингибитора типа Баумана-Бирк из различных источников.// Биохимия, 2000; т.65, с.238-244.

360. Hajos F. An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity. // Brain Res. 1975; v.93, p. 485-489.

361. Pozharski E.V., McWilliams L., MacDonald R.C. Relationship between turbidity of lipid vesicle suspensions and particle size. //Anal. Biochem. 2001; v. 291, p. 158162.

Информация о работе

Селищева, Алла Анатольевна
доктора химических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.23

Диссертация

Принципы создания новых форм лекарственных препаратов и биологически активных соединений солюбилизацией липосомами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы