Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Применение сыворотки крови кроликов при культивировании перевиваемых клеток и репродукции на них вирусов

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Применение сыворотки крови кроликов при культивировании перевиваемых клеток и репродукции на них вирусов"

На правах рукописи

004607774

БАДРУТДИНОВ НИЯЗ ВАКИФОВИЧ

ПРИМЕНЕНИЕ СЫВОРОТКИ КРОВИ КРОЛИКОВ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОК И РЕПРОДУКЦИИ НА НИХ ВИРУСОВ

06.02.02 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология 03.01.06 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 2 СЕН 2010

Казань - 2010

004607774

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный Центр токсикологической и радиационной безопасности животных» (ФГУ «ФЦТРБ - ВНИВИ»).

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

Гильмутдинов Рустам Якубович кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Гурьянов Николай Иванович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Гаффаров Харис Зарипович доктор биологических наук, профессор Дьяконов Лев Петрович Ведущая организация: Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ "ВГНКИ")

Защита состоится «2.0 » 2010 г. в (О часов на

заседании диссертационного совета Д - 220.012.01 при ФГУ «Федеральный Центр токсикологической и радиационной безопасности животных» (420075, г. Казань, Научный городок-2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ФЦТРБ -ВНИВИ» Электронный вариант автореферата и текст объявления о защите размещен на сайте организации: http://www.vnivi.ru

Автореферат разослан «¡^7* »(ЛлСИ<Х2й\йт.

Ученый секретарь диссертационного ^

совета, кандидат ветеринарных наук^ "г ~~ - В.И. Степанов

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы. Важнейшей составной частью питательных сред, содержащих факторы роста клеточных популяций, является сыворотка крови животных. Чаще всего для этой цели используют сыворотку крови крупного рогатого скота (Т.И. Дроздова и др., 1983; Л.П. Дьяконов и др., 2009 и т.д.). Из литературных источников (Е. Evege et al„ 1985; D. Jayme et al., 1988 и т.д.) следует, что лучшей является сыворотка крови плодов крупного рогатого скота, однако широкое ее использование ограничивается, прежде всего, дефицитом и высокой стоимостью.

Ограниченность применения кроличьей сыворотки в биотехнологии связана, вероятно, с первоначальным, необъективным, на наш взгляд, определением ее возможностей в этой области И.И. Подоплеловым и др. (1965). Данная биологическая добавка была оценена авторами негативно при выращивании культуры клеток CaVe. Между тем, в последние годы об использовании сыворотки крови кроликов при культивировании клеток животных тканей стали упоминать чаще и с позитивных позиций (Дьяконов Л.П., 2000; каталог-справочник «Реактивы для биохимии и исследований в области естественных наук» фирмы «Sigma-aldrich», США, 2004-2005; сайт компании «Abkam», США, www.abcam.com, 2009). Существенным преимуществом ее перед сывороткой крови крупного рогатого скота, является гетеровидовой характер по отношению к большинству возбудителей вирусных заболеваний сельскохозяйственных животных.

Исходя из вышеизложенного, нами изучены биохимический состав сыворотки крови кроликов, а также ее биологические эффекты на пролиферацию перевиваемых культур клеток и репродукцию на них вирусов.

1.2 Цель и задачи исследований. Цель работы состояла в изучении возможности применения кроличьей сыворотки в качестве биологический добавки в питательные среды при выращивания культур клеток и

репродукции на них вирусов. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Найти наиболее приемлемый метод взятия крови у кроликов на кролиководческих предприятиях в условиях производственного их убоя.

2. Получить кроличью сыворотку, достаточную по объему для проведения вирусологических и биотехнологических исследований на культурах клеток.

3. Определить вариабельность биохимического состава сыворотки крови кроликов от их половой принадлежности и сезона года.

4. Оценить ростовые свойства сыворотки крови кроликов на перевиваемых культурах клеток MDBK, ВНК-21/13-02, LEK, SPEV, Vero, при непродолжительной адаптации к данной биологической добавке в культуральных средах.

5. Установить особенности репродукции вирусов на перевиваемых культурах клеток LEK и Vero, выращенных на средах с добавлением кроличьей сыворотки.

1.3 Научная новизна работы. Впервые рассматривается возможность введения сыворотки крови кроликов в практику культивирования клеток. Дается ее физико-биохимическая характеристика в зависимости от половой принадлежности кроликов. Показаны особенности ее влияния на рост и морфологию перевиваемых культур клеток животных разных видов (SPEV -почки эмбриона свиньи, MDBK - почки эмбриона крупного рогатого скота, ВНК-21/13-02 - почки новорожденного сирийского хомячка, LEK - легкого эмбриона крупного рогатого скота, Vero - почки африканской зеленой мартышки). Впервые проведена оценка репродукции вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и парагриппа-3 (ПГ-3) крупного рогатого скота на культуре клеток LEK, а также реовируса типа 1 штамм «Lang» на линии клеток Vero, при их выращивании с использованием кроличьей сыворотки.

1.4 Практическая ценность работы. Разработана технология получения сыворотки крови кроликов в производственных условиях и

показана возможность ее применения в средах для культивирования перевиваемых клеток и репродукция на них вирусов. Кроличья сыворотка, являющаяся гетеровидовой по отношению практически ко всем культурам клеток, хранящимся в криобанке ФГУ «ФЦТРБ - ВНИВЙ», применяемая в качестве ростстимулирующего фактора, позволяет снизить вероятность вирусной контаминации культур клеток и повысить репродукцию вирусов на них.

На основе полученных данных разработана «Временная инструкция по получению и контролю качества сыворотки крови кроликов для культивирования клеток животных тканей» (2010 г).

1.5 Апробация работы. Материалы, представленные в диссертации, доложены и обсуждены на следующих научных форумах: Научно-практические конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные проблемы ветеринарии» (Казань, 2007) и «Достижения молодых ученых - в производство», посвященная 100-летию со дня рождения профессора Х.Х. Абдулина (Казань, 2008); Международные научно-практические конференции «Актуальные вопросы аграрной науки и образования», посвященная 65-летию Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2008); «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных» (Покров, 2008); «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии», к юбилею кафедры органической и биологической химии МГАВМиБ (Москва, 2008); «Современные тенденции развития ветеринарной медицины и инновационные технологии в ветеринарии и животноводстве» (Казань 2009); Московская международная научно-практическая конференция «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010).

1.6 Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 3 - в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.

1.7 Основные положения, выносимые на защиту:

- усовершенствование технологии получения сыворотки крови кроликов применительно к условиям производственного их убоя;

- зависимость биохимического состава сывороток крови кроликов от половой принадлежности и сезона года;

- пролиферативная активность перевиваемых культур клеток MDBK, ВНК-21/13-02, LEK, SPEV, Vero на среде с сывороткой крови кроликов;

- стабильная репродукция вирусов ИРТ и ПГ-3 на перевиваемой культуре клеток LEK, и высокая при репродукции реовируса на линии клеток Vero, выращенных на среде с использованием сыворотки крови кроликов.

1.8 Реализация результатов исследований. Результаты выполненных исследований используются в лаборатории культур клеток и гибридомной технологии ФГУ «ФЦГРБ - ВНИВИ» при культивировании перевиваемых линий животных клеток для изготовления вакцин.

1.9 Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 124 страницах компьютерного текста, состоит из следующих традиционных разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения, список использованной литературы. Работа содержит 14 таблиц, проиллюстрирована 22 рисунками. Список литературы включает 188 библиографических источников, в том числе 75 на иностранном языке.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в лаборатории культур клеток и гибридомной технологии ФГУ «Федеральный Центр токсикологической и радиационной безопасности животных» (ФГУ «ФЦГРБ - ВНИВИ») в течение 2006-2010 гг. Для получения сыворотки, взятие крови проводили после пореза яремных вен и сонных артерий у клинически здоровых кроликов породы «Белый великан» массой от 3,0 до 4,8 кг в ФХ «Миакро Каратау» г. Казань. Кровь брали во флаконы емкостью 250 мл, в которые наливали по 2,5 мл 5%-го

раствора NaCl. В дальнейшем, полученные образцы отстаивали в течение 24 ч, в холодильной камере при температуре +2 °С под углом 30°. Для сбора сыворотки использовали разрежающий мембранный компрессор, а для предварительной очистки ее от форменных элементов - картонные префильтры 3/400 (Германия). Затем, сыворотку замораживали по 400 мл в стеклянных флаконах емкостью 500 мл не менее 5-7 суток. Далее ее размораживали, очищали через глубинные фильтры EKS-SEITS (Германия), стерилизовали через комбинацию мембранных фильтров фирм «Millipore» (США) и «Vladisart» (г. Владимир) с диаметром пор, соответственно, 0,22 и 0,20 мкм, используя фильтродержатель фирмы «Millipore» диаметром 293 мм и нагнетающий мембранный компрессор. Фасовку производили в стеклянные флаконы по 100 мл.

Концентрацию общего белка, свободного гемоглобина и холестерина определяли наборами реактивов фирмы «ЭКОлаб», (г. Электрогорск); общих липидов - о.п. «Лахема», г. Брно и прозрачность - с помощью фотоэлектроколориметра КФК-2-УХЛ4.2, а рН - иономером И-120.

Электрофорез сывороточных белков осуществляли ..¡- на ацетатцеллюлозных фильтрах «Vladisart» тип - ФМАЦ-0,45-(80*110)-11106 с размерами пор 0,45 мкм на аппарате «Астра» (г.Уфа). Кроме того, в сыворотке крови на биохимическом анализаторе «Architect С8000» (США) определяли концентрации ферментов: аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ), креатининфосфокиназы (КФК), лактатдегидрогиназы (ЛДГ); а также глюкозы, мочевины, билирубина (общего и прямого), креатинина.

Культивировали клетки по общепринятой методике (Р. Адаме, 1983). Сыворотки крови самцов и самок кроликов добавляли в 10 %-ой концентрации в ростовую среду, а контролем служила сыворотка крови крупного рогатого скота (СККРС).

Индекс пролиферации культур клеток MDBK, LEK, SPEV, ВНК и Vero после 72-х часовой инкубации в средах с сыворотками крови самцов и самок

кроликов, оценивали общепринятым методом (Б.И. Антонов 1986). С каждой сывороткой крови проведено по 9 серий опытов.

Определение прозрачности сыворотки, контроль ее на возможное присутствие контаминантов - бактерий, микоплазм, вирусов и по ростовым свойствам проводили согласно Методическим рекомендациям по контролю качества жидкой сыворотки крови крупного рогатого скота, применяемой в медицинских и биологических целях (1982).

Вирусологические исследования проводили совместно с кандидатами вет. наук: вед. науч. сотр. В.Г. Гумеровым и ст. науч. сотр. М.А. Ефимовой. Использовали вакцинный штамм «ТК-А(ВИЭВ)-В2» вируса ИРТ, референтный штамм «ПТК-45/86» вируса ПГ-3 КРС (ВИЭВ, г. Москва), а также референтный штамм "Lang" (Великобритания) реовируса типа 1.

Репродукцию вирусов ИРТ, ПГ-3 и реовируса изучали на перевиваемых линиях клеток LEK и Vero, соответственно, при культивировании на ростовой среде с добавлением 10 % сыворотки крови кроликов, разделенной по половой принадлежности (контроль - СККРС). Серологические исследования основывались на выявлении антител к вирусам в РН и РТГА. Изучения чувствительности вирусов проводили путем титрования на культурах клеток.

Цифровой материал математически обработали на персональном компьютере общепринятыми методами вариационной статистики (Р.Х. Тукшаитов, 2001).

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Разработка технологии получения сыворотка крови кроликов

для биотехнологических целей

Получение сыворотки крови кроликов включает в себя ряд последовательных этапов: подбор животных-доноров, взятие крови, отделение сыворотки, сбор ее, предварительную очистку, замораживание не менее 5-7 суток, оттаивание и повторную очистку глубинными фильтрами,

заключительную стерилизующую фильтрацию через мембранные фильтры, контроль на стерильность и биологическую активность.

Попытки взятия крови в производственных условиях у кроликов стерильно, непосредственно из сердца (по аналогии с крупным рогатым скотом) не увенчались успехом, так как замедлялся технологический процесс их убоя. Поэтому процедуру осуществляли нестерильно после вскрытия яремных вен и сонных артерий и собирали во флаконы емкостью 250 мл с 2,5 мл раствора 5 %-го ЫаС!.

Флаконы с кровью устанавливали в холодильной камере при 2 °С под углом 30°. Сыворотку собирали из флаконов после 24-х часового отстоя. Соотношения объемов полученных крови и сыворотки представлены в таблице!.

Таблица 1 - Объемные соотношения полученного количества крови и сыворотки в зависимости от пола и массы кролика

Сезон года Пол кролика Масса тела (кг) Объем взятой крови (мл) Объем полученной сыворотки (мл)

а 3 (п=26) 3,72±0,09 115,8±4,0 55,8±1,7

и ю ? (п=26) 4,13±0,09 130,4±2,4 63,6±1,9

о 3 (П=29) 3,48±0,07** 109,2±3,1** 52,3±1,6*

ч 9 (п=26) 3,67±0,09** 10б,5±3,9** 56,1±1,9*

А X с? (п=27) 3,28±0,07** 104,8±1,7** 51,5±1,8*

о о $ (п=20) 3,37±0,12** 10б,9±2,9** 54,2±1,7*

я г 3 (п=16) 3,61±0,09н.д. 107,2±2,0** 50,8±1,5*

в т ? (п=17) 3,68±0,07* 115,0±2,5** 52,0±1,4*

Примечание: *, ** - уровни достоверности различия с СКК мужских и женских особей относительно весеннего периода года, соответственно, р <0,05 и < 0,01; н.д. - недостоверно.

Как следует из таблицы 1, масса тела кроликов, объемы взятой крови и полученной сыворотки были максимальны весной. Выход сыворотки

составлял от 45 до 50 % к объему взятой крови, что на 5-10 % больше, чем у крупного рогатого скота.

3.2 Физико-химические и биохимические свойства сыворотки крови кроликов

Нами установлены существенные различия биохимического состава кроличьей сыворотки, связанные с половой принадлежностью животных и сезоном года. Результаты исследований, отраженные в таблице 2, показывают, что оптическая плотность кроличьих сывороток, в осенне-зимний период года выше, чем у сывороток, полученных весной и летом (р<0,05).

Концентрация водородных ионов в кроличьей сыворотке выше летом и зимой (р<0,01) по сравнению с весной и осенью и сопоставимо с таковой в контрольной сыворотке. Весной и осенью кроличья сыворотка имеет почти такую же концентрацию водородных ионов, как и контрольная сыворотка. Свободный же гемоглобин в сыворотке кроликов, наоборот, имеет тенденцию к снижению от весны к зиме (р<0,05-0,01).

Общих липидов в кроличьей сыворотке в 3-4 раза больше, чем в СККРС и их концентрация возрастает в направлении от весны к зиме, независимо от пола животных (р<0,001); при этом, содержание общего холестерина в весенне-летний период года находится на уровне контроля, возрастая осенью и зимой (р<0,01).

Концентрация мочевины, как конечного продукта обмена белков, в кроличьей сыворотке в 2-2,5 раза выше, а глюкозы в 2-3 раза ниже, чем в сыворотке крови крупного рогатого скота.

Концентрация же креатинина в сыворотке крови кроликов в течение всего года не изменяется, хотя она незначительно больше у самок, чем у самцов. Его содержание в кроличьей сыворотке и СККРС совпадают.

Общего билирубина в кроличьей сыворотке весной - летом несколько меньше, чем в СККРС и величина этого показателя снижается в 3-4 раза в осенне-зимний период (р<0,001). Колебаний содержания прямого

Таблица 2 - Сезонные и половые особенности физических и биохимических показателей сыворотки крови кроликов

Показатели СККРС (контроль) (п=5) Сыворотка крови кроликов

Весна лето осень зима

(п-3) 2 (п=3) в (п=3) $ (п=3) (3 (п=3) $ (п=3) с? (п=3) $ (п=3)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Прозрачность (ед.опт.пл.) 0,23 ±0,01 0,26 ±0,01 0,28 ±0,01 0,24 ±0,01н.д. 0,19 ±0,01* 0,35 ±0,01* 0,35 ±0,01* 0,34 ±0,01* 0,32 ±0,01*

рН 7,67 ±0,02 7,73 ±0,01 7,75 ±0,01 7,97 ±0,01** 7,92 ±0,01** 7,65 ±0,02* 7,69 ±0,01* 7,96 ±0,01** 7,92 ±0,01**

Свободный гемоглобин (г/Л) 0,51 ±0,02 0,67 ±0,04 0,78 ±0,06 0,74 ±0,07* 0,78 ±0,05н.д. 0,54 ±0,03** 0,47 ±0,02** 0,52 ±0,05** 0,52 ±0,04**

Общие липиды (г/л) 2,83 ±0,16 7,80 ±0,35 7,61 ±0,65 7,98 ±0,67* 9,40 ±0,84*** 10,75 ±0,92*** 9,91 ±0,88*** 10,10 ±0,91*** 8,54 ±0,45***

Холестерин (ммоль/л) 1,35 ±0,02 1,26 ±0,01 1,26 ±0,03 1,07 ±0,01** 1,25 ±0,03н.д. 1,69 ±0,05** 1,53 ±0,04** 1,54 ±0,05** 1,43 ±0,04**

Мочевина (ммоль/л) 3,0 ±0,14 7,7 ±0,35 7,1 ±0,28 5,4 ±0,45** 5,9 ±0,33** 3,7 ±0,08*** 3,9 ±0,12*** 5,7 ±0,22** 6,0 ±0,55**

Глюкоза (ммоль/л) 14,4 ±0,34 4,5 ±0,08 4,5 ±0,09 4,7 ±0,12н.д. 4,8 ±0,18н.д. 6,5 ±0,11** 6,9 ±0,13** 7,1 ±0,21** 5,5 ±0,05**

Креатинин (мкмоль/л) 84 ±2,8 61 ±1,9 85 ±2,3 74 ±2,5* 85 ±3,1н.д. 72 ±0,9* 83 ±2,8н.д. 69 ±3,8* 72 ±1,8*

Билирубин общий (мкмоль/л) 6,3 ±0,34 4,6 ±0,28 5,5 ±0,33 5,9 ±0,34* 5,3 ±0,25* 2,6 ±0,19*** 1,8 ±0,07*** 1,8 ±0,09*** 1,8 ±0,06***

Продолжение таблицы 2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Билирубин прямой (мкмоль/л) 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,4 1,5

±0,02 ±0,04 ±0,07 ±0,01н. д. ±0,05н.д. ±0,03н.д. ±0,01н.д. ±0,01н.д. ±0,06н.д.

Ферменты (Ед/л):

КФК 355,6 304,2 434,1 757,2 724,2 2214,2 2737,8 2163,4 2009,0

±28,6 ±20,7 ±35,1 ±55,2*** ±48,5*** ±115,3*** ±128,7*** ±107,5*** ±97,4***

АлАТ 12 15 30 5,0 4,0 53 68 42 36

±0,7 ±0,8 ±1,2 ±0,3*** ±0,1*** ±1,8*** ±4,0*** ±3,2*** ±1,6*

АсАТ 36 13 30 8,0 7,0 40 31 28 24

±1,5 ±0,7 ±1,3 ±0,5** ±0,4*** ±1,8*** ±1,3н.д. ±0,8** ±0,6*

лдг 528 246 236 435 420 383 369 381 340

±32,1 ±13,1 ±11,9 ±28,7*** ±19,8*** ±17,3*** ±16,9*** ±17,1*** ±14,7***

Примечание: *, **, *** - уровни достоверности сезонных различий кроличьей сыворотки относительно весеннего периода, соответственно, р < 0,05; < 0,01; <0,001; н.д. - недостоверно.

билирубина в течение года в экспериментальной сыворотке не отмечено.

Ферментативный фон в сыворотке крови кроликов в сравнении с СККРС значительно отличается и зависит от времени года. Из исследованных 4-х ферментов в кроличьей сыворотке больше содержится КФК и ЛДГ и меньше - АлАТ и АсАТ.

Концентрация ЛДГ в кроличьей сыворотке ниже, чем в СККРС, и минимальна весной. Содержание КФК в кроличьей сыворотке возрастает особенно значительно: в летний период - в 2 раза, а в осенне-зимний - до 7 раз и не зависит от половой принадлежности животного.

Хотя АлАТ и АсАТ содержатся в кроличьей сыворотке в меньших количествах, их концентрации более зависимы от половой принадлежности кроликов и сезона года. Так, весной этих ферментов в сыворотке крови самок в 2-2,5 раза больше, чем у самцов; а в летний период содержание их снижается в 3-7 раз. В осенне-зимний период количество данных ферментов в кроличьей сыворотке вновь возрастает независимо от половой принадлежности.

Результаты исследований содержания общего белка и его фракционного состава в сыворотке крови приведены в таблице 3.

Отмечаются существенные различия в белковом составе сыворотки крови кроликов и крупного рогатого скота. В кроличьей сыворотке на долю альбуминов, которые, как известно, стимулируют пролиферацию клеток, приходится около 60 % общего белка, что почти в 2 раза больше, чем в СККРС. Содержание у-глобулинов колебалось в пределах 12,6-15,0 % от общего белка, что примерно в 3,5 раза меньше, чем в сыворотке крови крупного рогатого скота. Эта фракция, являясь источником специфических антител, ингибирует, как рост клеток, так и репродукцию вирусов на них.

Самая высокая концентрация общего белка в кроличьей сыворотке отмечена весной и снижалась в последующие сезоны года на 15-25 % (р<0,01). Такая же закономерность сезонного снижения содержания, как и у

Таблица 3 - Особенности белкового состава сыворотки крови кроликов

в зависимости от половой принадлежности и сезона года

Белковый состав СККРС (контроль) (п=5) Сыворотка крови кроликов

Весна лето осень зима

¿•(п=3) $(п=3) в (п=3) 9 (п=3) с5 (п=3) ? (п=3) с? (п=3) $ (п=3)

Общий белок (г/л), в т.ч.: 69,45 ±4,2 67,83 ±4,8 65,45 ±5,4 56,82 ±4,9** 56,98 ±2,7** 53,0 ±3,8** 51,05 ±1,8** 50,0 ±2,6** 55,0 ±1,6**

Фракционный состав белков (%)

Альбумины 31,5 ±2,3 54,6 ±3,2 57,8 ±1,3 56,4 ±3,7* 59,0 ±3,9н.д. 56,3 ±4,8н.д. 58,1 ±3,3н.д. 57,7 ±3,8* 56,7 ±4,4н.д.

3 в а- 13,5 ±0,8 13,7 ±1,2 13,8 ±0,3 12,9 ±0,4н.д. 11,0 ±0,7* 11,6 ±0,2* 10,9 ±0,5* 14,2 ±0,8н.д. 12,6 ±0,3*

к 1 О Р- 15,5 ±0,6 18,4 ±1,6 16,0 ±1,2 17,2 ±1,5н.д. 15,0 ±0,1н.д. 17,1 ±1,3н.д. 16,9 ±1,4н.д. 14,7 ±1,2* 15,8 ±1,0н.д.

Ё у- 39,5 ±1,1 13,3 ±0,3 12,6 ±0,7 13,5 ±1,2н.д. 14,9 ±1,3* 15,0 ±1,6* 14,2 ±0,8* 13,3 ±0,5н.д. 14,9 ±0,9*

Примечание: *, ** , *** - уровни достоверности сезонных различий кроличьей сыворотки относительно весеннего периода, соответственно, р < 0,05; < 0,01; <0,001; н.д. - недостоверно.

общего белка, существует и у отдельных его фракций.

Это связано с рядом объективных причин: во-первых - с рационом кроликов, который в весенний период, для усиления иммунитета, содержит больше концентратов; во-вторых — с массой тела кроликов; в-третьих - с шедовым содержанием кроликов, приводящим к снижению потребления кормов и большей теплоотдаче в осенне-зимний период.

3.3 Ростовые эффекты применения сыворотки крови кроликов при культивировании перевиваемых линий клеток

Результаты опытов по определению пролиферативной активности 5 линий перевиваемых культур клеток после 72-х часового их культивирования, представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Индекс пролиферации культур клеток в среде с добавлением

сыворотки крови кроликов

Культура клеток СККРС (контроль) скк

6. 9

MDBK (п=9) 6,2±0,3 5,12±0,3* 4,92±0,4*

ВНК-21/13-02 (п=9) 6,2±0,4 5,07±0,4* 4,41±0,3**

LEK (п=9) 6,12±0,2 6,00±0,3н.д. 5,50±0,4*

SPEV (п=9) 6,1±0,1 5,34±0,2* 5,03±0,5*

Vero (п=9) 4,7±0,3 2,73±0,3** 2,61±0,4**

Примечание: *, ** ~ уровни достоверности различия с контролем (р),

соответственно < 0,05; < 0,01;н.д.-недостоверно.

Согласно данным таблицы 4, сыворотка крови самцов кроликов при добавлении в питательную среду хорошо стимулировала рост клеток MDBK, ВПК, LEK, SPEV. При этом, она незначительно, но достоверно (р<0,05), уступала по биологической активности сыворотке крови крупного рогатого скота. Кроме того, кроличья сыворотка, полученная от самцов, стимулировала пролиферацию данных культур клеток лучше, чем сыворотка крови самок. Попытки адаптации линии клеток Vero к среде, содержащей

кроличью сыворотку, не увенчались успехом: их индекс пролиферации оказался ниже в 2 раза, чем при выращивании на среде с сывороткой крови крупного рогатого скота.

При добавлении в ростовую среду сыворотки крови кроликов образование монослоя перевиваемых культур клеток происходило, как и в контроле через 72 часа культивирования. На рисунке 1 представлены фото культуры клеток ЬЕК на средах с экспериментальной сывороткой и СККРС.

Рис. 1. Монослой перевиваемой культуры клеток ЬЕК на среде с сывороткой крови кроликов после 72 ч инкубации. Ок.7 х об. 40

Морфологические изменения в клеточном монослое, выращенном с добавлением сыворотки крови кроликов по сравнению с контролем, отсутствуют. Клетки в экспериментальной среде имели характерную эпителиоподобную форму, с четко выраженными границами, без признаков дегенерации.

3.4 Репродукция вирусов при добавлении в питательную среду сыворотки крови кроликов

Результаты нескольких последовательных пассажей вирусов ИРТ и ПГ' 3 на культуре клеток ЬЕК, выращенных на средах, содержащих сыворотки крови самцов и самок кроликов представлены в таблице 5.

КРОЛИЧЬЯ СЫВОРОТКА (САМКИ) ]

«.ц им <хгг

КОНТРОЛЬ СКЧр|,

Таблица 5 - Репродукция вирусов ИРТ и ПГ-3 на клетках ЬЕК в среде с сывороткой крови животных

Сыворотка крови животных Титры вирусов (Ig ТЦДдо/МЛ)

ИРТ ПГ-3

сккб1 (п-3) 6,25 6,25

СКК?(п=3) 6,0 5,75

СКПК (п=3) 7,0 7,0

СККРС (контроль) (11=3) 6,7 6,5

Из данных таблицы 5, следует, что при пассировании вируса ИРТ на культуре клеток LEK, выращенной с добавлением сыворотки крови кроликов, титр вируса оказался ниже контрольного на 0,45 - 0,7 ^ИЩзо/МЛ, а при выращивании вируса ПГ-3 на линии клеток LEK, культивируемой на среде, содержащий кроличью сыворотку, урожай вирусной массы был также ниже контроля на 0,25-0,75 ^ТЦД50/мл. Репродукция вирусов ИРТ и ПГ-3 на культуре клеток LEK, выращиваемой на среде с сывороткой крови самцов кроликов была интенсивнее, чем на среде с сывороткой самок, что согласуется и с пролиферацией клеток. В целом репродукция вируса ПГ-3 была ниже, чем вируса ИРТ.

При пассировании реовируса тип 1 штамм Lang на культуре клеток Vero, наиболее чувствительной к данному вирусу, нами получены диаметрально противоположные результаты по репродукции (табл. 6), чем при выращивании вирусов ИРТ и ПГ-3 на линии клеток LEK.

Несмотря на сравнительно низкую пролиферативную активность клеток Vero на среде с добавлением кроличьей сыворотки, репродукция вируса была, напротив, предельно высокой. К сожалению, данный факт интерпретировать в полной мере не удается. Кроме того, выявлено, что предельно высокую репродукцию данного вируса обеспечивала лишь, культура клеток, выращенная на среде с сывороткой крови самок.

Таблица 6 - Репродукция реовируса на клетках Vero в среде с сывороткой

крови животных

Сыворотка крови животных РГА (Vn)

СКК 3 (п=5) 4

СКК ?(п=5) 64

СКПК (контроль) (п=5) 64

СККРС (контроль) (п=5) , 32

При добавлении в питательную среду последней биологической добавки татр реовируса. на культуре клеток Vero был существенно выше, чем на клетках с кроличьей сывороткой самцов и в 2 раза превышал таковой при выращивании клеток на среде с СККРС. Принимая во внимание, то обстоятельство, что клетки Vero по паспорту выращиваются на среде с СКПК, то эту сыворотку мы ввели, также в качестве контроля, как и СККРС.

3.5 Корреляционные отношения биохимических характеристик сывороток кровд кроликов с их ростстимулирующими свойствами

При выращивании культур клеток на среде с кроличьей сывороткой положительная корреляция (р<0,05) имеет место между содержанием общего белка в сыворотке и индексом пролиферации клеток: MDBK (для самцов г •= 0,64; для самок г = 0,78), SPEVOuw самцов г = 0,78; для самок г = 0,79), ВНК 21/13-02 (для самцов г = 0,87; для самок г = 0,95), Vero (для самцов г = 0,95; для самок г = 0,43), LEK (для самцов г = 0,86; для самок г = 0,95).

При репродукции вируса ПГ-3 на культуре клеток LEK, выращенной на среде с добавлением сыворотки крови кроликов, титр его отрицательно коррелирует с содержанием у-глобулинов, (для самцов г= -0,18; г= -0,74 для самок; р<0,05).

Проведенными исследованиями, показано, что сыворотка крови кроликов может быть успешно использована в качестве биологической

добавки при выращивании культур клеток различного видового и тканевого происхождения, а применение ее в качестве гетеровидовой, по отношению к большинству перевиваемых линий клеток, используемых в вирусологии и биотехнологии, позволяет увеличить наращивание вирусной массы и снизить риск контаминации их специфическими антигенами. Для более объективной оценки возможности использования новой биологической добавки в питательные среды при выращивании клеток необходимо, на наш взгляд, увеличить количество перевиваемых линий клеток, взятых в опыты и продолжительность адаптации их к кроличьей сыворотке.

4 ВЫВОДЫ

1. Оптимизирован способ получения сыворотки крови кроликов в объемах, достаточных для проведения вирусологических и биотехнологических исследований с культурами клеток.

2. Установлено изменение биохимического состава сыворотки крови кроликов в зависимости от сезонов года. Концентрации общего белка и его фракций, а также мочевины, общего билирубина имеют тенденцию к снижению от весны к зиме, тогда как содержание большинства биологически активных веществ, в том числе, исследованных ферментов, глюкозы, общих липидов, в кроличьей сыворотке, наоборот, повышается от весеннего к зимнему периоду года.

3. Применение сыворотки крови кроликов в качестве биологической добавки в среды для выращивания перевиваемых культур клеток SPEV, MDBK, ВНК 21/13-02 и LEK обеспечивает индекс пролиферации этих клеток от 4,41 до 6,00, что, примерно, на 14 % ниже контроля.

4. Репродукция вирусов ИРТ и ПГ-3 на культуре клеток LEK незначительно (4-11 %) уступает таковой при использовании в культуральной среде СККРС.

5. Индекс пролиферации культур клеток, взятых в опыты, был выше на среде с кроличьей сывороткой крови самцов. Между тем, репродукция реовируса на перевиваемых клетках Vero при добавлении в культуральную

среду сыворотки крови самок кроликов была выше, чем при использовании как сыворотки крови самцов, так и СККРС.

6. Выявлена положительная корреляция (р<0,05) между содержанием общего белка в сыворотке крови кроликов и индексом пролиферации перевиваемых культур клеток MDBK (для самцов г = 0,64; для самок г = 0,78), SPEV(wifl самцов г = 0,78; для самок г = 0,79), ВНК 21/13-02 (для самцов г = 0,87; для самок г = 0,95), Vero (для самцов г = 0,95; для самок г = 0,43), LEK (для самцов г 0,86; для самок г =0,95).

7. Титр вируса парагриппа-3 в культуре клеток LEK, выращенной на среде с добавлением сыворотки крови кроликов, отрицательно коррелирует с содержанием у-глобулинов,(для самцов г= -0,18; т= -0,74 для самок р<0,05).

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Сыворотку крови кроликов, желательно самцов, рекомендуется использовать в качестве биологически активной добавки в питательные среды для стимуляции пролиферации клеток животного происхождения.

2. Сыворотку крови кроликов гетеровидовую относительно большинства используемых в производстве перевиваемых линий клеток, предлагается применять в качестве биологической добавки в питательные среды при репродукции вирусов на них, профилактируя, тем самым, присутствие специфических антител, и увеличивая наработку вирусной массы.

3. Разработана «Временная инструкция по получению и контролю качества сыворотки крови кроликов для культивирования клеток животных тканей» (утверждена директором ФГУ «ФЦТРБ - ВНИВИ» 17.05.2010 г).

6 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Бадругдинов Н.В. Оценка ростстимулирующей активности кроличьей сыворотки на перевиваемых культурах клеток животных I Н.В. Бадрутдинов, И.М. Ганиев, Т.Р. Тимершин // Актуальные проблемы ветеринарии: Матер, научно-практической конференции молодых ученых и специалистов. -Казань, 2007.-С. 104-105.

2. Бадрутдинов Н.В. Пролиферация культуры клеток ВНК-21 на среде содержащий кроличью сыворотку / Н.В. Бадрутдинов // Достижения молодых ученых - в производство: Матер, научно-практической конференции молодых ученых и специалистов, посвящ. 100-летию со дня рождения профессора Х.Х. Абдулина. - Казань, 2008. - С.144-145.

3. Гурьянов, Н.И. Сравнительное изучение сывороток крови разных видов животных и тканевых экстрактов плодов коров при культивировании клеток / Н.И. Гурьянов, P.P. Закиров, Н.В. Бадрутдинов, Р.Я. Гильмутдинов // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: Матер. Международной научно-практической конференции, посвящ. 65-летию Ульяновской ГСХА. -Ульяновск, 2008. - т.4. - С.31-34.

4. Гурьянов, Н.И. Зависимость биохимического состава сыворотки крови кроликов от сезона года и живой массы / Н.И. Гурьянов, И.М. Ганиев, Р.Я. Гильмутдинов, Н.В. Бадрутдинов // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасным, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных: Матер. Международной научно-практической конференции, 13-14 ноября 2008 года / ГНУ Всероссийский научно-иследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХНЛ. - Покров, 2008. - С. 151-153.

5. Гурьянов, Н.И. Биохимический состав и биологическая активность сыворотки крови кроликов / Н.И. Гурьянов, И.М. Ганиев, Р.Я. Гильмутдинов, Н.В. Бадрутдинов // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасным, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных: Матер. Международной научно-практической конференции, 13-14 ноября 2008 года / ГНУ Всероссийский научно-иследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХНЛ. - Покров, 2008. -С.149-151.

6. Гурьянов, Н.И. Преимущество использования сыворотки крови из сердца бычков для культивирования клеток / Н.И. Гурьянов, Р.Я.

Гильмутдинов, A.C. Гизатулина, И.М. Г'аниев, Н.В. Бадрутдинов, В.П. Коксин И Ветеринария, 2008. - №7,- С. 58-61.

7. Закиров, P.P. Ростсгамулирующее действие тканевых экстрактов плодов коров на культуре клеток MDBK / Р.Р. Закиров, Е.Ю. Хамзина, Н.В. Бадрутдинов, Р.Я. Гильмутдинов // Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии: Матер. Международной научно-практической конференции, к юбилею кафедры органической и биологической химии МГАВМиБ. - Москва, 2008. - С. 97.

8. Бадрутдинов Н.В. Эффект добавления кроличьей сыворотки в культуральную ростовую среду на пролиферативную активность клеток MDBK // Бадрутдинов Н.В., Гурьянов Н.И., Ганиев И М., Закиров P.P. // Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии: Матер. Международной научно-практической конференции, к юбилею кафедры органической и биологической химии МГАВМиБ. -Москва, 2008. - С. 96.

9. Ганиев, Й.М. Новые ростстимулирующие добавки в питательные среды для культивирования животных клеток / И.М Ганиев, Н.И. Гурьянов, Р.Я. Гильмутдинов, Н.В. Бадрутдинов, Р.Р. Закиров, A.A. Малев // Ветеринарный врач, 2009. - №6. - С. 30-32.

10. Гильмутдинов, Р.Я. Репродукция реовируса в культуре клеток Vero при замене в ростовой среде бычьей сыворотке крови на кроличью или экстракты тканей плодов коров / Р.Я. Гильмутдинов, P.P. Закиров, Н.В. Бадрутдинов // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им.Н.Э. Баумана. - Казань, 2009. - Т. 197. - С. 17-21.

11. Хамзина, Е.Ю. Использования отходов мясной промышленности для получения лечебно-профилактических препаратов / Е.Ю. Хамзина, И.М. Ганиев, Ю.М. Кириллова, Н.В. Бадрутдинов // Биотехнология: экология крупных городов: Матер. Московской международной научно-практической конференции. - Москва, 2010. - С. 243-244.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф.207 Тел: 272-74-59,541-76-41, 541-76-51. > Лицензия ПД №7-0215 от 01.11.2001 г Выдана Поводрсским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 11.06.2010 г. Печл. 1,0 Заказ № К-6899. ТиражЮОзкх Формат 60хМ 1/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бадрутдинов, Нияз Вакифович

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ И

СИМВИЛОВ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Сыворотка крови животных — ростстимулирующий компонент культуральных питательных сред.

1.1.1 Влияние сыворотки крови в составе питательных сред на культивируемые клетки.

1.1.2 Влияние сывороточных факторов на репродукцию вирусов в культурах клеток.

1.2 Физико-химические свойства сыворотки крови кроликов и сельскохозяйственных животных.

1.2.1 Биохимический состав.

1.2.2 Неорганические компоненты.

1.2.3 Потенциальные возможности использования сыворотки крови кроликов в биотехнологии.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1.1 МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1.2 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.2 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.2.1 Разработка технологии получения сыворотки крови кроликов для биотехнологических целей.

2.2.2 Физико-химические и биохимические свойства сыворотки крови кроликов. культивировании перевиваемых линий клеток.

2.2.4 Репродукции вирусов при добавлении в питательную среду сыворотки крови кроликов.

2.2.5 Корреляционные отношения биохимических характеристик сывороток крови кроликов с их ростстимулирующими свойствами.

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫХ

ИССЛЕДОВАНИЙ.

ВЫВОДЫ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Применение сыворотки крови кроликов при культивировании перевиваемых клеток и репродукции на них вирусов"

1.1 Актуальность темы. Важнейшей составной частью питательных сред, содержащих факторы роста клеточных популяций, является сыворотка крови животных. Чаще всего для этой цели используют сыворотку крови крупного рогатого скота (Т.И. Дроздова и др., 1983; Л.П. Дьяконов и др., 2009 и т.д.). Из литературных источников (Е. Evege et al., 1985; D. Jayme et al., 1988 и т.д.) следует, что лучшей является сыворотка крови плодов крупного рогатого скота, однако широкое ее использование ограничивается, прежде всего, дефицитом и высокой стоимостью.

Ограниченность применения кроличьей сыворотки в биотехнологии связана, вероятно, с первоначальным, необъективным, на наш взгляд, определением ее возможностей в этой области И.И. Подоплеловым и др. (1965). Данная биологическая добавка была оценена авторами негативно при выращивании культуры клеток CaVe. .Между тем, в последние годы об использовании сыворотки крови кроликов при культивировании клеток животных тканей стали упоминать чаще и с позитивных позиций (Дьяконов Л.П., 2000; каталог-справочник «Реактивы для биохимии и исследований в области естественных наук» фирмы «Sigma-aldrich», США, 2004-2005; сайт компании «Abkam», США, www.abcam.com, 2009). Существенным преимуществом ее перед сывороткой крови крупного рогатого скота, является гетеровидовой характер по отношению к большинству возбудителей вирусных заболеваний сельскохозяйственных животных.

Исходя из вышеизложенного, нами изучены биохимический состав сыворотки крови кроликов, а также ее биологические эффекты на пролиферацию перевиваемых культур клеток и репродукцию на них вирусов.

1.2 Цель и задачи исследований. Цель работы состояла в изучении возможности применения кроличьей сыворотки в качестве биологический добавки в питательные среды при выращивания культур клеток и репродукции на них вирусов. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Найти наиболее приемлемый метод взятия крови у кроликов на кролиководческих предприятиях в условиях производственного их убоя.

2. Получить кроличью сыворотку, достаточную по объему для проведения вирусологических и биотехнологических исследований на культурах клеток.

3. Определить вариабельность биохимического состава сыворотки крови кроликов от их половой принадлежности и сезона года.

4. Оценить ростовые свойства сыворотки крови кроликов на перевиваемых культурах клеток MDBK, ВНК-21/13-02, LEK, SPEV, Vero, при непродолжительной адаптации к данной биологической добавке в культуральных средах.

5. Установить особенности репродукции вирусов на перевиваемых культурах клеток LEK и Vero, выращенных на средах с добавлением кроличьей сыворотки.

1.3 Научная новизна работы. Впервые рассматривается возможность введения сыворотки крови кроликов в практику культивирования клеток. Дается ее физико-биохимическая характеристика в зависимости от половой принадлежности кроликов. Показаны особенности ее влияния на рост и морфологию перевиваемых культур клеток животных разных видов (SPEV — почки эмбриона свиньи, MDBK - почки эмбриона крупного рогатого скота, ВНК-21/13-02 - почки новорожденного сирийского хомячка, LEK - легкого эмбриона крупного рогатого скота, Vero — почки африканской зеленой мартышки). Впервые проведена оценка репродукции вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и парагриппа-3 (ПГ-3) крупного рогатого скота на культуре клеток LEK, а также реовируса типа 1 штамм «Lang» на линии клеток Vero, при их выращивании с использованием кроличьей сыворотки.

1.4 Практическая ценность работы. Разработана технология получения сыворотки крови кроликов в производственных условиях и показана возможность ее применения в средах для культивирования перевиваемых клеток и репродукция на них вирусов. Кроличья сыворотка, являющаяся гетеровидовой по отношению практически ко всем культурам клеток, хранящимся в криобанке ФГУ «ФЦТРБ - ВНИВИ», применяемая в качестве ростстимулирующего фактора, позволяет снизить вероятность вирусной контаминации культур клеток и повысить репродукцию вирусов на них.

Утверждена директором ФГУ «ФЦТРБ - ВНИВИ» «Временная инструкция по получению и контролю качества сыворотки крови кроликов для культивирования клеток животных тканей» от 17 мая 2010 г.

1.5 Апробация работы. Материалы, представленные в диссертации, доложены и обсуждены на следующих научных форумах: Научно-практические конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные проблемы ветеринарии» (Казань, 2007) и «Достижения молодых ученых - в производство», посвященная 100-летию со дня рождения профессора Х.Х. Абдулина (Казань, 2008); Международные научно-практические конференции «Актуальные вопросы аграрной науки и образования», посвященная 65-летию Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2008); «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных» (Покров, 2008); «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии», к юбилею кафедры органической и биологической химии МГАВМиБ (Москва, 2008); «Современные тенденции развития ветеринарной медицины и инновационные технологии в ветеринарии и животноводстве» (Казань 2009); Московская международная. научно-практическая конференция «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010).

1.6 Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в'том числе 3 - в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ:

- усовершенствование технологии получения сыворотки крови кроликов применительно к условиям производственного их убоя;

- зависимость биохимического состава сывороток крови кроликов от половой принадлежности и сезона года;

- пролиферативная активность перевиваемых культур клеток MDBK, ВНК-21/13-02, LEK, SPEV, Vero на среде с сывороткой крови кроликов;

- стабильная репродукция вирусов ИРТ и ПГ-3 на перевиваемой культуре клеток LEK, и высокая при репродукции реовируса на линии клеток Vero, выращенных на среде с использованием сыворотки крови кроликов.

1.8 Реализация результатов исследований. Результаты выполненных исследований используются в лаборатории культур клеток и гибридомной технологии ФГУ «ФЦТРБ - ВНИВИ» при культивировании перевиваемых линий животных клеток для изготовления вакцин.

1.9 Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 124 страницах компьютерного текста, состоит из следующих традиционных разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения, список использованной литературы. Работа содержит 14 таблиц, проиллюстрирована 22 рисунками. Список литературы включает 194 источников, в том числе 77 на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Бадрутдинов, Нияз Вакифович

ВЫВОДЫ

1. Оптимизирован способ получения сыворотки крови кроликов в объемах, достаточных для проведения вирусологических и биотехнологических исследований с культурами клеток.

2. Установлено изменение биохимического состава сыворотки крови кроликов в зависимости от сезонов года. Концентрации общего белка и его фракций, а также мочевины, общего билирубина имеют тенденцию к снижению от весны к зиме, тогда как содержание большинства биологически активных веществ, в том числе, исследованных ферментов, глюкозы, общих липидов, в кроличьей сыворотке, наоборот, повышается от весеннего к зимнему периоду года.

3. Применение сыворотки крови кроликов в качестве биологической добавки в среды для выращивания перевиваемых культур клеток SPEV, MDBK, ВНК 21/13-02 и LEK обеспечивает индекс пролиферации этих клеток от 4,41 до 6,00, что, примерно, на 14 % ниже контроля.

4. Репродукция вирусов ИРТ и ПГ-3 на культуре клеток LEK незначительно (4-11 %) уступает таковой при использовании в культуральной среде СККРС.

5. Индекс пролиферации культур клеток, взятых в опыты, был выше на среде с кроличьей сывороткой крови самцов. Между тем, репродукция реовируса на перевиваемых клетках Vero при добавлении в культуральную среду сыворотки крови самок кроликов была выше, чем при использовании как сыворотки крови самцов, так и СККРС.

6. Выявлена положительная корреляция (р<0,05) между содержанием общего белка в сыворотке крови кроликов и индексом пролиферации перевиваемых культур клеток MDBK (для самцов г = 0,64; для самок г = 0,78), 8РЕУ(для самцов г = 0,78; для самок г = 0,79), ВНК 21/13-02 (для самцов г = 0,87; для самок г = 0,95), Vero (для самцов г = 0,95; для самок г = 0,43), LEK (для самцов г = 0,86; для самок г = 0,95).

7. Титр вируса парагриппа-3 в культуре клеток ПЕК, выращенной на среде с добавлением сыворотки крови кроликов, отрицательно коррелирует с содержанием у-глобулинов,(для самцов г= -0,18; г= -0,74 для самок р<0,05).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Сыворотку крови кроликов, желательно самцов, рекомендуется использовать в качестве биологически активной добавки в питательные среды для стимуляции пролиферации клеток животного происхождения.

2. Сыворотку крови кроликов гетеровидовую относительно большинства используемых в производстве перевиваемых линий клеток, предлагается применять в качестве биологической добавки в питательные среды при репродукции вирусов на них, профилактируя, тем самым, присутствие специфических антител, и увеличивая наработку вирусной массы.

3. Разработана «Временная инструкция по получению и контролю качества сыворотки крови кроликов для культивирования клеток животных тканей» (утверждена директором ФГУ «ФЦТРБ - ВНИВИ» 17.05.2010 г).

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Бадрутдинов, Нияз Вакифович, Казань

1. Аббасов, Т.Г. Морфологические и биохимические показатели крови кроликов при отравлении дельсектом / Т.Г. Аббасов, С.Е. Шерешкова // Проблемы ветеринарной санитарии и экологии: Сб. науч. тр. — М., 2000.-т. 109.-С. 3-9.

2. Адаме, Р. Методы культуры клеток для биохимиков / Р. Адаме Пер. с англ. - М.: Мир, 1983. - 264 с.

3. Аксёнов, A.A. Коррекция функционального состояния печени у кроликов и собак с использованием транскраниальной электростимуляции / A.A. Аксёнов// Автореф. дис . канд. биол. наук. Белгород, 2009. - 10 с.

4. Андреева, М.А. Изучение возможности использования сывороток, обработанных полиэтиленгликолем, в производстве вирусных препаратов / М.А. Андреева, Г.А. Костина, И.Ф. Радаева, С.Б. Шмелева // Цитология. 1996. - т. 38. - № 2. - С. 175 - 176.

5. Арлеевский, И.П. Содержание некоторых биоэлементов в крови при атеросклерозе в эксперименте и клинике / И. П. Арлеевский // Автореф. дис . канд. мед. наук. Казань, 1966. - 15 с.

6. Афонский, С.И. Биохимия животных / С.И. Афонский 3-е изд-ие, перераб. и доп. — М.: Высшая школа, 1970. - 612 с.

7. Басова, Н.Ю. Респираторные болезни молодняка КРС инфекционной этиологии в условиях Северного Кавказа / Н.Ю. Басова // Автореф. дис. . докт. вет. наук. Краснодар, 2002. - С. 11-14.

8. Бейли, Н. Статистические методы в биологии / Н. Бейли Пер. с англ. - М.: Изд-во иностр. лит-ры, 1962. - 260 с.

9. Билирубин общий Электронный ресурс.: Медицинский портал. — Режим доступа: http://vvwvv.eurolab.ua (дата обращения 21.04.2009).

10. Бурдов, Г.Н. Вирусные инфекции КРС / Г.Н. Бурдов, Е.И. Марасиненая, Ю.Г. Крысенко // Ветеринарный врач. 2001. - № 3. - С. 38-39.

11. Волкова, О.Н. Сыворотка тюленя компонент ростовой среды для клеточных культур млекопитающих / О.Н. Волкова, С.И. Поликарпова, A.M. Седова, О.Г. Саканделидзе // Биотехнология. - 1991. - № 2. - С. 38-40.

12. Высокопоясный, А.Н. Респираторные болезни телят на Кубани / А.Н. Высокопоясный, Н.Ю. Басова, А.Г. Шахов, А.Г. Шипицын // Ветеринария. 2000. - № 12. - С. 8 - 11.

13. Вязовкина, И.В. Белковые фракции сыворотки крови крупного рогатого скота для культивирования клеток / И.В. Вязовкина, С.Х Хаертынов // Науч. тр. Казан, вет. института. 1980. - т. 136. — С. 39 -40.

14. Гаенко, Т.П. Бессывороточное культивирование генно-инженерных клеток — продуцентов ГМ КСФ. Условия культивирования и синтез ГМ - КСФ / Т.П. Гаенко, P.A. Алибаева // Биотехнология. - 1993. - № 11-12.-С. 39-41.

15. Галахарь, H.JI. Культивирование гибридом в среде, содержащей сыворотку эмбрионов овец / H.JI. Галахарь, С.Н. Дьяченко // Цитология. 1987.-т. 29.-№9.-С. 1078.

16. Ганиев, И.М. Применение комбинаций сывороток крови различных видов животных для культивирования клеток и репродукции вирусов / И.М. Ганиев // Дис. . канд. биол. наук. Казань, 2007. - 138 с.

17. Гаспарян, Г.Г. Межклеточные контакты ускоряют рост клеточных колоний в культуре клеток куриного эмбриона / Г.Г. Гаспарян, Н.К. Саркисян, A.B. Саядян, P.M. Григорян // Цитология. 1997. - т. 39. - № 7.-С. 566-570.

18. Гаффаров, Х.З. Инфекционные болезни рогатого скота хламидийной, микоплазменной и вирусной этиологии, разработка диагностических и лечебно-профилактических препаратов / Х.З. Гаффаров // Дис. . докт. вет. наук. Казань, 1986. - 455 с.

19. Герасимова, Н.И. Разработка лабораторного способа поддерживания перевиваемых культур клеток СПЭВ, GH-91, Vero / Н.И. Герасимова, С.К. Старов, В.Н. Герасимов // Ветеринарная патология. 2006. - № 4 (19).-С. 168-170.

20. Гильмутдинов, Р.Я. Влияние степени контаминаций микоплазмами культуры клеток ППЭС на электрофоретическую подвижность клеток / Р.Я. Гильмутдинов // Цитология. 1992. - т. 34. - № 9. - С. 62.

21. Гильмутдинов, Р.Я. Зависимость электрофоретической подвижности клеток от их плотности в культуре / Р.Я. Гильмутдинов // Цитология. -1996. т. 38. - № 2. - С.192 - 193.

22. Глушков, A.A. Лептоспироз животных / Лекция Москов. вет. акад. М. 1995,- 55 с.

23. Голубев, Д.Б. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии / Д.Б. Голубев, A.A. Соминина, М.Н. Медведева // Л.: Медицина, 1976. 222 с.

24. Госманов, Р.Г. Ветеринарная вирусология: Учебник / Р.Г. Госманов, Н.М. Колычев. Омск: Изд-во ОмГАУ. - 1999. - 288 с.

25. Гродненский государственный аграрный университет Электронный ресурс.: Стрептококкоз. Режим доступа: http://ggau.info/moodle/mod/resource/view.php?id=635 (дата обращения 11.06.2008).

26. Гудкова, Д.А. Зависимость пролиферации клеток линии ЗТ 6 в полностью бессывороточной среде от эпидермального фактора роста / Д.А. Гудкова, А.Б. Сорокин // Цитология. 1987. - т. 29 - № 2. - С. 1309- 1313.

27. Гуненков, В.В. Одновременное выделение вирусов параинфлюэнцы-3 и вирусной диареи при пневмоэнтерите телят / В.В. Гуненков, Ф. Кончеллотти, Б. Стилис // Проблемы молекулярной биологии и патологии. 1975. - т. 80. - С. 17.

28. Гурьянов, Н.И. Усовершенствование технологий получения сывороток крови кур, бычков, эмбрионов коров и изучение их свойств при культивировании клеток и вирусов / Н.И. Гурьянов // Автореф. дис. канд. биол. наук. Казань, 1992. - 19 с.

29. Гурьянов, Н.И. Качество сыворотки крови крупного рогатого скота / Н.И. Гурьянов // Ветеринария. 1997. - № 10. - С. 21 - 22.

30. Гурьянов, Н.И. Поиск негативного фактора, влияющего на качество сыворотки крови животных / Н.И. Гурьянов // Ветеринарная патология.- 2003. № 1 (5). - С. 98 - 99.

31. Дроздова, Т.И. Выделение, характеристика и использование ростстимулирующих белков сыворотки крови крупного рогатого скота / Т.И. Дроздова, Н.В. Бабикова, С.Г. Курумчина и др. // Цитология. -1983.-т. 25.-№9. с. 1082.

32. Дьяконов, Л.П. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии) / Под ред. проф. Л.П. Дьяконова, проф. В.И. Ситькова- М.: Компания Спутник+, 2000. 400 с.

33. Дьяконов, Л.П. Культура клеток и тканей животных / Л.П. Дьяконов, В.Ф. Глухов, A.A. Позднякова и др. // Учебно метод, пособие. -Ставрополь, 1980. - Ч. 1. - 111 с.

34. Дьяконов, Л.П. Методические рекомендации по культивированию первичных культур и субкультур из ткани легкого плодов крупного рогатого скота / Л.П. Дьяконов, Д.В. Лобунцова, Б.П. Аспинадзе — М., 1985.- 8 с.

35. Дьяконов, Л.П. Животная клетка в культуре (методы и применение в биотехнологии) / Л.П. Дьяконов М.: Спутник+, 2009. - 656 с.

36. Ефремов, Г.Г. Содержание общего белка, общих липидов и глюкозы в крови у кроликов / Г.Г. Ефремов, Г.М. Ефремова, И.О. Ефимова // Научно-произв. конф. по актуальным проблемам АПК. Казань, 2003. -Ч. 1.-С. 285-286.

37. Жумабаев, Х.Ж. Наличие антител в. сыворотке крови животных к возбудителю хламидиоза и вируса парагриппа-3 / Х.Ж. Жумабаев, Р.В. Белоусова // Вопр. вет. биологии: Сб. науч. трудов М., 1992. - С. 68.

38. Закутский Н.И. Технология выращивания вакцинного штамма ТК-А вируса инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота для изготовления инактивированной вакцины / Н.И. Закутский // Ветеринария. 1997. - № 12. - С. 23 - 25.

39. Закутский, Н.И. Разработка и совершенствование технологии изготовления инактивированной вакцины против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота / Н.И. Закутский // Автореф. дис. . докт. вет. наук. Покров, 1998. — 22 с.

40. Зенин, В.В. Зависимость пролиферации клеток ЗТ 6 от концентрации сыворотки в среде /В.В. Зенин, H.H. Никольский, В.И. Скопичева, А.Б. Сорокин // Цитология. 1982. - т. 24. - № 8. - С. 947 - 953.

41. Игудин, Л.И. Связь между составом сыворотки КРС и ее способностью стимулировать рост клеточных культур / Л.И. Игудин, С.Д. Орлов, Н.В. Кацнельсон и др. // Цитология . 1983. - т. 25. - № 10.- С. 1216-1218.

42. Инструкция о соблюдении противоэпидемического режима при взятии венозной крови в учреждениях здравоохранения г. Москвы. УТВЕРЖДЕНО Главным государственным санитарным врачом по г. Москве H.H. Филатовым 10 октября 2002 года. М., 2002.

43. Кармолиев, Р.Х. Современные биохимические методы исследования в ветеринарии и зоотехнии / Р.Х. Кармолиев М.: Колос, 1971. - 288 с.

44. Кармолиев Р.Х., Соколов, В.Д. О дифференциации белковых веществ крови крупного рогатого скота / Р.Х. Кармолиев, В.Д. Соколов // Сб.

45. Искусственно эволюционированные вирусы для генной терапии Электронный ресурс.: Интернет — журнал «Коммерческая биотехнология». Режим доступа: http://www.cbio.ru/modules/news/article.php?storyid=:1793 (дата обращения: 08.12.2007).

46. Карпуть, И.М. Влияние техногенных факторов на качество молозива и развитие болезней молодняка / И.М. Карпуть // Акт. пробл. патол. с.-х. животных: Матер. Междунар. научно практ. конф. — Минск, 2000. — С. 483-486.

47. Конки, Д. Культуры животных клеток. Методы / Д. Конки, Э. Эрба, Р. Фрелини и др. Пер. с англ. М.: Мир, 1989. - 333 с.

48. Костина, Г.А. Улучшение свойств сывороток, обработанных полиэтиленгликолем / Г.А. Костина, И.Ф. Радаева, М.А. Андреева, С.Б. Шмелева // Цитология. 1996. - т. 38. - № 2. - С. 213.

49. Красильников, А.П. Микробиологический словарь справочник / А.П. Красильников, Т.Р. Романовская - 2-е изд-ие, перераб. и доп. - Минск: Асар, 1999.-400 с.

50. Красов, В.М. Электрофоретические исследования белков крови животных / В.М. Красов Алма-Ата: Наука, 1969. - 235 с.

51. Круман, И.И. Рост культур лимфоидных клеток линии RAJI в среде, содержащей низкомолекулярные компоненты сыворотки / И.И. Круман, В.В. Архипов // Цитология. 1985. - т. 27. - № 1. - С. 99 - 103.

52. Круман, И.И. Остановка роста клеток ВНК 21 и их стабилизация в состоянии покоя под действием сывороточных фракций / И.И. Круман, Н.Ф. Остапенко, Б.К. Гаврилюк и др. // Цитология. - 1981. - т. 23. — № 8.-С. 934-943.

53. Кудрявцев, A.A. Исследования крови в ветеринарной диагностике / A.A. Кудрявцев, Л.А. Кудрявцева // М.: Государственное изд-во сельскохозяйственной литературы, 1952. 374 с.

54. Кукушкина, М.С. Изучение репродукции вирусов оспы овец и коз в перевиваемых культурах клеток / М.С. Кукушкина // Ветеринарная патология. 2006. - № 4 (19). - С. 78 - 81.

55. Куликова, К.С. // Тезисы докл. 2-ой науч. конф. МНИИВП, М., 1960. -С. 57.

56. Куриленко, А.Н. Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных / А.Н. Куриленко, В.Л. Крупальник -М.: Колос, 2000.-С. 144.

57. Ласкавый, В.Н. Культивирование и накопление онкогенных вирусов в анаэробных условиях / В.Н. Ласкавый, Л.П. Дьяконов, Г.В. Мельников // Ветеринарный врач. 2004. - № 2. - С. 32-38.

58. Лисицын, B.B. Разработка и совершенствование средств специфической профилактики ПГ-3 крупного рогатого скота / В.В. Лисицын // Автореф. дис. канд. вет. наук. 2000. - С. 10-18.

59. Малахов, А.Г. Биохимический полиморфизм белков и ферментов и его использование в диагностике заболеваний и селекции сельскохозяйственных животных / А.Г. Малахов, Т.К. Винокурова // Сб. науч. тр. Москов. вет. академ. 1973. — т. 70. - С. 5 — 8.

60. Малахов, Ю.А. Лептоспироз животных / Ю.А. Малахов // М.: Агропромиздат, 1992. 239 с.

61. Манцыгин, Ю.А. О преимуществах использования свиной сыворотки при культивировании некоторых линий клеток животных и человека / Ю.А. Манцыгин, Н.В. Святухина, С.А. Павулсоне // Цитология. 1983. -т. 25. -№ 10.-С. 1197-1201.

62. Машнин, A.B. Разработка и усовершенствование средств и методов лабораторной диагностики оспы овец и оспы коз / A.B. Машнин // Автореф. дис. канд. вет. наук. Покров, 2001 -23 с.

63. Методические рекомендации по контролю качества жидкой сыворотки крови крупного рогатого скота, применяемой в медицинских и биологических целях. М. 1982. — 25 с.

64. Миронова, Л.Л. Отечественные линии перевиваемых клеток почек теленка субстрат для биотехнологии / JI.JI. Миронова, Н.К. Преображенская, Г.С. Шитикова и др. // Биотехнология. - 1998. - № 5. -С. 25-31.

65. Мубарак, Иса. Выделение латентных аденовирусов от клинически здоровых животных / Иса Мубарак, В.В. Гуненков, К.К. Вертинская,

66. В.Н. Сюрин // Тез. Межвуз. науч. конф. по ветеринарной вирусологии -М., 1973.-Ч. 2.-С. 52.

67. Мусаева, А.К. Пролиферативные свойства культур клеток, выращенных в среде с добавлением сыворотки крови плодов овец / А.К. Мусаева, H.H. Гизитдинов, Л.П. Дьяконов // Вестн. с.-х. науки Казахстана. 1990. - т. 6. - С. 82 - 84.

68. Нариманов, A.A. Бессывороточная среда для культивирования лимфоидных клеток человека и миеломных клеток мышей / A.A. Нариманов // Биотехнология. 1991. - № 1. - С. 49 - 52.

69. Новохатский, A.C. Тканевые и клеточные культуры в вирусологии и молекулярной биологии /A.C. Новохатский // Итоги науки и техники, Вирусология М.: 1979. - т. 8. - С. 85 - 89.

70. Новохатский, A.C. Ростовые факторы сыворотки и крови. Новые возможности получение и применения / A.C. Новохатский // Цитология. 1994 - т. 36. - № 6. - С. 506.

71. Нуриев, Г.Г. Роль аутоаллергических механизмов в патогенезе микробной экземы / Г.Г. Нуриев // Автореф. дис. . канд. мед. наук. -Казань, 1966. 15 с.

72. Нуриев, Г.Г. Об изменениях некоторых физико химических и иммунных свойств сыворотки крови при хранении их в незамороженном и замороженном состоянии / Г.Г. Нуриев, С.Х. Хаертынов // Ученые записки Казан, вет. института. - 1969. - т. 105. — С. 210-216.

73. Нуриев, Г.Г. Изменение некоторых биохимических свойств сыворотки крови после замораживания и оттаивания / Г.Г. Нуриев, С.Х. Хаертынов, Э.М. Хасанова // Ученые записки Казан, гос. вет. института. 1972. - т. 112. - С. 245 - 249.

74. Общая информация о перфторане Электронный ресурс.: Биомедицинский журнал Medline.ru. Режим доступа:http://www.medline.ru/public/art/tom5/art8perfl7.html (дата обращения 23.04.2008).

75. Орлов, Ф.М. Малоизвестные заразные болезни животных / Ф.М. Орлов // 2-е изд-ие, перераб. и доп. М.: Колос, 1973. - 312 с.

76. Петрова, О.Г. Острые респираторные вирусные инфекции крупного рогатого скота в Свердловской области / О.Г. Петрова, А.Т. Татарчук, H.JI. Сапожникова и др. // Ветеринария. 2002. - № 2. - С. 11-15.

77. Плохинский, H.A. Математические методы в биологии / H.A. Плохинский // М.: МГУ, 1978. - 226 с.

78. Подоплелов, И.И. Изучение роста клеток однослойной культуры штамма CaVe на питательной среде с бычьей и кроличьей сыворотками / И.И. Подоплелов, И.А. Глинский, В.Т. Какпаков, С.П. Мунтян // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1965. - №2. - С. 118-121.

79. Подчерняева, Р.Я. Замена нативных сывороток ростстимулирующими белками при культивировании клеток млекопитающих / Р.Я. Подчерняева, E.H. Мельниченко, Э.Н. Конду // Вопр. вирусологии. — 1994. -№ 1.-С. 39-41.

80. Поликарпова, С.И. Рост клеток в культуре в средах, содержащих сыворотки отечественного производства / С.И. Поликарпова // Цитология. 1987. - т. 29. - № 9. - С. 1099 - 1100.

81. Пономарев, А.П. Электронно-микроскопическое выявление вирусов животных в неконцентрированных вируссодержащих суспензиях / А.П. Пономарев, О.Г. Андреева, Т.Н. Артомонова // Вестник РАСХН. -2002.-№2.-С. 77-77.

82. Радаева, И.Ф. Исследование свойств сывороток крови различных видов животных / И.Ф. Радаева, Г.А. Костина, С.Б. Шмелева, М.А. Андреева // Цитология. 1996. - т. 38. - № 2. - С. 244.

83. Радаева, И.Ф. Получение и применение сывороток оленей и овец для культивирования клеточных линий / И.Ф. Радаева, Г.А. Костина, О.П. Аверихин, В.В. Шапров // Биотехнология. 1990. - № 4. — С. 36 - 38.

84. Реактивы для биохимии и исследований в области естественных наук / Sigma-aldrich // 2004-2005. С. 1821.

85. Ревякина, Е.М. Иммунный ответ у животных на введение вакцины травин ВИЭВ / Е.М. Ревякина, А.Ф. Шуляк, О.В. Майджи, К.П. Юров // Ветеринария. 1998. - № 6. - С. 25 - 27.

86. Романюк, E.H. Опыт получения препарата сыворотки крови эмбрионов коров / E.H. Романюк, Г.Н. Буденая, JI.K. Шамгина и др. // Цитология. 1983. - т. 25. - № 9. - С. 1093.

87. Рубан, Е.А. Некоторые проблемы глубинного культивирования клеток животных в биореакторах / Е.А. Рубан, Б.В. Соловьев, М.А. Гунин // Тез. докл. Всерос. научно. практ. конф., посвящ. 30-летию института, 8-9 июня 2000 г. - Шелково, 2000. - С. 290.

88. Рянский, А.Л. Сравнительное исследование трипсина различных фирм, используемого для получения первичной культуры клеток / А.Л. Рянский // Тез. докл. Всерос. науч. конф., 14-15 февраля 2001 г. М., 2001.-С. 217.

89. Саяпин, В.П., Ветеринарно-санитарные и гигиенические аспекты утилизации животноводческих стоков за рубежом / В.П. Саяпин, H.A. Романенко // Обзорная информация. М., ЦИЕНТИ.- 1981. - № 6.

90. Сергеев, В.А. Репродукция и выращивание вирусов животных / В.А. Сергеев М.: Колос, 1976. - 302 с.

91. Сисягин, П.Н. Профилактика вирусных респираторных болезней телят / П.Н. Сисягин, Г.Р. Реджепова, И.В. Убитина, Г.В. Зоткин // Акт. пробл. болезней молодняка в соврем, условиях: Матер. Междунар. научно — практ. конф. — Воронеж, 2002. С. 38 — 40.

92. Сорокин, А.Б. Пролиферация и синтез ДНК в культуре клеток СНО-К1 при различной концентрации сыворотки в среде / А.Б. Сорокин // Цитология. 1981. - т. 23. - № 4. - С. 468 - 472.

93. Спиера, P.E. Биотехнология клеток животных / P.E. Спиера, Дж. Б. Гриффите Пер. с англ. - М.: ВО Агропромиздат, 1989. - С. 112-113.

94. Сюрин, В.Н. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина // Учебник. М.: Агропромиздат, 1995. — 528 с.

95. Сюрин, В.Н. Парагриппозная инфекция крупного рогатого скота / В.Н. Сюрин, В .В. Гуненков // Ветеринария. 1968. - № 6. - С. 109 - 112.

96. Сюрин, В.Н. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленка, Б.Н. Соловьев, Н.В. Фомина // М.: ВНИТИБП, 1998. С. 242-243.

97. Сюрин, В.Н. Частная ветеринарная вирусология. Справочная книга / В.Н. Сюрин, Н.В. Фомина // М.: Колос, 1979. 472с.

98. Хаертынов, С.Х. Взятие крови с целью получения сыворотки для культивирования клеток / С.Х. Хаертынов, Н.К. Мамлеева // Цитология. 1982. - № 11. - С. 66 - 67.

99. Хижняк, Л.И. Получение и изучение свойств сыворотки крови плодов овец / Л.И. Хижняк, В.Т. Ночевный // Цитология. — 1994. т. 36. - № 6. -С. 585.

100. Холод В.М. Электрофорез белков сыворотки крови крупного рогатого скота в полиакриламидном геле / В.М. Холод // Вестник сельскохозяйственных наук. 1974. - № 2. — С. 93 — 97.

101. Чечеткин, A.B. Биохимия животных / A.B. Чечеткин, И.Д. Головацкий, П.А. Калиман, В.И. Воронежский // Учебник. — М.: Высшая школа, 1982.-511 с.

102. Шаудхери, З.И. Электрофоретический профиль протеинового состава сыворотки крови молодых и взрослых верблюдов / З.И. Шаудхери, Дж. Икбел, Дж. Рашид // Российский ветеринарный журн. 2006. - № 3. — С. 23 - 24.

103. Юрков, С.Г. Универсальная роллерная технология культивирования перевиваемых клеток животных / С.Г. Юрков, А.Н. Курносов, С.А. Витина и др. // Ветеринария. 1995. - № 9. - С. 29 - 34.

104. AhameMe, F. Blood Biochemistry and Haematology of Weaner Rabbits Fed Sundried, Ensiled and Fermented Cassava Peel Based Diets / F. Ahamefule, G. Eduok, A. Usman, et al. // Pakistan J. Nutrition. 2006. -v. 5.-№3.-p. 248-253.

105. Altincl, C. Studies on the productin of a prototype sheep and goat pox vaccine in lamb testes cell culture / C. Altincl, F. Ozyoruk, F. Uyanik // Pendik Vet. Mikrob. Dergisi. 1993. - v. 24. - № 1. - p. 47 - 55.

106. Archer, R. Standardized method for bleeding rats / R. Archer, J. Riley // Lab. Animals.-1981.-v. 15. -№ l.-p. 25-28.

107. Archetti, I. Serum chemistry and hematology values in commercial rabbit: preliminary data from industrial farms in northern Italy / I. Archetti, C. Tittarelli, M. Cerioli et al. // 9th World Rabbit Congress. Italy. - 2008.-p. 1147-1151.

108. Ballard, F. Effects of Growth factors on protein turnover in cultured cells / F. Ballard // Hoppe-Beyler's Z. Physiol Chem. 1982. - v.363. - №9. - p. 977.

109. Brownline, J. Experimental production of fatal mucosal disease in cattle / J. Brownline, M. Clurke, C. Howard // Vet. Res. 1984. - v. 114. - № 22. - p. 535-536.

110. Buno, W. Effect of cortisone on growth in vitro of femur of the chick embryo / W. Buno, H. Goyena // Proc. Soc. Exp. Biol. N. Y. 1955. - v. 89. — p. 622.

111. Burke, J. Growth in retinal glial cells in vitro is affected differentially by two types of contact — mediated interactions / J. Burke // Exp. Cell Res. — 1989.-v. 180.-p. 13-19.

112. Calad de Itturi, G. Effects of prolactin and growth hormone on DNA synthesis of rat mammary carcinomas in vitro / de Itturi G. Calad, C. Welsch // Experientia (Basel). 1976. - v. 32. - p. 1045 - 1046.

113. Carpenter, C. Patent 4473647, MKI3 C12 №5/00, 1/38; A61K 35/16; C 07 G 7/00. Tissue culture medium / C. Carpenter, R. Cone (USA), 1985.

114. Chang, R. Macromolecular growth requirements of human cells in continuous culture / R. Chang, R. Pennell, W. Keller // Proc. Soc. Exp. Biol.- 1959. v. 102. — № 1. — p. 213 -217.

115. Choi, Y. The effect of serum on monolayer cell culture of mammalian articular chondrocytes // Y. Choi, G. Morris, F. Lee, L Sokoloff // Connect Tissue Res. 1980. - v. 7. - № 2. - p. 105-112.

116. Cornman, I. Selective damage to fibroblasts by deoxycorti costerone in cultures /1. Cornman // Science. 1951. - v. 113. - p. 37.

117. Davies, F. The alterations in pathogenicity and immunogenicity of a Kenya sheep and goat pox virus on serial passage in bovine foetal muscle cell cultures / F. Davies, G. Mbugwa // J. Comp. Pathol. 1985. - 1985. - v. 95.- № 4. p. 565-572.

118. Davison, P. Growth and morphology of rabbit marginal vessel endothelium in cell culture / P. Davison, K. Bensch, M. Karasek // J. Cell Biology. -1980.-v. 85.-p. 187-198.

119. Eagle, H. Aminoacid metabolism in mammalian cell cultures / H. Eagle // Proc.Nat. Sci. US. 1959. — v. 130.-№ 3373.-p. 432-437.

120. Esber, H. Variability of hormone concentration and ration in commercial sera used for tissue cultures / H. Esber, I. Payne, A. Bogden // J. Nat. Cancer Inst. 1973. - v. 50. - № 2. - p. 559 - 562.

121. Evege, E. Alternative serum substitutes for fetal bovine serum / E. Evege, C. Nash, M. Bodziak, D. Jayme // J. Nat. Cancer Inst. 1985. - v. 101. - № 5. -Part. 2. - p. 489-490.

122. Ewuola, O. Haematological and serum biochemical response of growing rabbit bucks fed dietary fumonisin B1 / O. Ewuola, G. Egbunike // African J. Biotech. 2008. - v. 7. - № 23. - p. 4304-4309.

123. Ferguson, J. Isolation and long-term culture of diploid mammalian cell lines / J. Ferguson, A. Wansbrough // Cancer Res. 1962. - v. 22. - № 5. - Part l.-p. 556-562.

124. Foley, G. Isolation and serial propagation of malignant and normal cells in semi-defined media. Origins of CCRF cell lines / G. Foley, B. Drolet, R. McCarthy // Cancer Res. 1960. - v. 20. -№ 6. - p. 930-938.

125. Gaunt, S. Cell cycle variation associated with feeder effects in cultures of Chinese hamster fibroblasts / S. Gaunt, G. Subak-Sharpe // Exp. Cell Res. -1977. -v. 109. № 2 - p. 341-348.

126. Ghram, A. Bovine herpesvirus-1 and Parainfluenza-3 virus interactions: clinical and immunological response in calves / A. Ghram, P. Reddy, J. Morrill'et al. // Canad. J. Vet. Res. 1989. - v. 53. - № 1. - p. 62-67.

127. Gospodarowicz, D. Growth factors in mammalian cell culture. / D. Gospodarowicz, J. MoranAnne // Rev. Biochem. — 1976. v. 45. — p. 531-558.

128. Hewitt, C. Normal biochemical and hematological values in New Zealand White Rabbits / C. Hewitt, D. Innes, J. Savory, M. Wills // J. Clin. Chem. -1989.-v. 35.-№8.-p. 1777-1779.

129. Holmes, R. Longterm cultivation on human cell (Chang) in chemically defined medium and effect on added peptone fraction / R. Holmes // J. Biophys. and Biochem. Cytol. 1959. - v. 6 - p. 535-536.

130. Hristev, H. Serum protein changes in rabbit after chronic administration of lead and cadmium / H. Hristev, D. Penkov, A. Hallak et al. // J. Cent. Eur. Agric. 2008. - v. 9. - p. 157 - 162.

131. Igwebuike, J. Nutrient digestibility, haematological and serum biochemical indices of rabbits fed graded levels of Acacia Albida Pods / J. Igwebuike, F. Anugwa, A. Raji et al. // ARPN J. of Agricul. and Biological Science. -2008. №4.-v. 3.-p. 33-40.

132. Jayme, D. Fetal bovine serum alternatives / D. Jayme, D. Epstein, D. Conrad //Nature. 1988. - v. 334. - № 6182. - p. 547-548.

133. Kniazeff, A. Endogenous virus contaminants in fetal bovine serum and their role in tissue culture contamination / A. Kniazeff // Acad. Inc., Press NY. -1973. p. 233-242.

134. Kricka, L. Additive-Aggravated Assays: An Authoritative Answer / L. Kricka, J. Park // Clin. Chem. 2005. - v. 51. - p. 1373.1.l

135. Kubin, G. Fectstellung der infektiösen Rhinotracheitis (IBR) des Rindes in Osterreich / G. Kubin // Wien tierarztl. Mschr. 1982. - Bd. 69. - H. 5. - s. 145 - 148.

136. Liberman, J. Purification of a serum protein requires by mammalian cell in tissue culture / J. Liberman, P. Ove // Biochemica et Biophysica. Acta. — 1957. v. 25. - № 2. - p. 449-450.

137. Lockwood, D. Insulin-dependent DNA polymerase and DNA Synthesis in mammary epithelial cells in vitro / D. Lockwood, A. Voytovich, Y. Stockdale // Proc. Nat. Acad. Sei. (Wash.). 1967. - v. 58. - p. 658 - 664.

138. Madin, S., Darby N. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1958. - v. 98. - p. 574.

139. Maurer, K. Resembling human polycystic kidney disease / Maurer K, R. Marini, J. Fox, A. Rogers // Kidney International. 2004. - v. 65. - p.482-489

140. Metzger, O. Separation on growth promoting activity from horse serum by dialysis / O. Metzger, M. Moscowitz // Proc. Nat. Acad. Sei. US. 1960. -v. 104.-p. 363 -365.

141. Miyazono, K. A platelet factor stimulating the proliferation of vascular endothelial cells. Partial purification and characterization / K. Miyazono, T. Okabe, S. Ishibashi // Exp. Cell Res. 1985. - v. 159. - № 2. - p. 487-494.

142. Molander, C. Isolation and characterization of viruses from fetal calf serum / C. Molander, A. Kniazeff, C. Boone, C. et al. // In Vitro. 1972. - v. 7. -№ 3. - p. 168-173.

143. Ока, М. A serum-free defined medium for retinal pigment epithelial cells / M. Oka, R. Landers, C. Briolges // Exp. Cell Res. 1984. - v. 154. - № 2. -p. 537-547.

144. Overell, B. Effects of hormones and their analogues upon uptake of glucose by mouse skin in vitro / B. Overell, S. Condon, W. Petrov // J. Pharm. — 1960.-v. 12.-p. 150.

145. Pathiban, M. Usefulness of BHK-21 (Razi) cell line in evolving a cell-line adapted sheep-pox virus for vaccine production / M. Pathiban, K. Kumanan, V. Padmanaban // Indian J. Anim. Sci. 1993. - v. 63. - № 5. - p. 515 -517.

146. Paul, D. 3T3 cell growth initiation and multiplication in defined medium supplemented with growth factors and hormones that replace serum / D. Paul // Horm. Defined Media: Tool Cell Biol. Berlin e. a. - 1982. - p. 7987.

147. Price, P. Relationship between in vitro growth promotion and biophysical and biochemical properties of the serum supplement / P. Price, E. Gregory // In Vitro. 1982. - v. 18. - p. 576-584.

148. Proux, K. Development of a complete ELISA using Salmonella lipopolysaccharides of various serogroups allowing to detect all infected pigs / K. Proux, C. IToudayer, F. Humbert et al. // Veter. Res. 2000. - v. 31.-№5.-p. 481 -490.

149. Puck, T. Genetics of somatic mammalian cells. Long term cultivation of enploid cells from human and animal subjects / T. Puck, S. Ciecura, A. Robinson // J. Exp. Med. - 1958. - v. 108. - № 6. - p. 945-955.

150. Rabbit Serum (sterile) Электронный ресурс.: www.abcam.com. Режим доступа: http ://www. ab cam. с om/index. html ?datasheet=7487 (дата обращения 23.04.2009).

151. Reed L. A simple method of estimating 50 % endpoints / L. Reed, H. Muench // Amer. J. Hygiene. 1938. - v. 27. - p. 493- 497.

152. Reuveny, S. Comparison of cell propagation methods for their effects on monoclonal antibody yield in fermentors / S Reuveny, D. Velez, L.Miller, J. Macmillan // J. Immunol. Methods. 1986. - v. 86. - p. 61-69.

153. Rupic, V. Proteins and fats in the serum of rabbit fed different quantities of dried olive cake / V. Rupic, J. Skrlin, S. Mulic et al. // Acta Vet. Brno. -1999.-v. 68.-p. 91-98.

154. Sato, G. Molecular growth requirements of single mammalian cell / G. Sato, H. Fischer, T. Puck // Science. 1957. - v. 126. - p. 961.

155. Sell, S. Alpha-fetoprotein / S. Sell, F. Becker // J. Nat. Cancer Inst. 1978. -v. 60.-p. 19-26.

156. Servais, L. La Belqique entname un programme d\ eradication de 1. IDR / L. Servais // Elevages belqes. 1996. - № 10. - p. 9-14.

157. Sheffield, L. Control of mammary gland fibroblast growth by insulin, growth hormone and prolactin / L. Sheffield, R. Anderson // Cell. Biol. Int. Repts.- 1986.-v. 10.-№ l.-p. 33-40.

158. Stocker, M. Density dependent inhibition of cell growth in cultures / M. Stocker, H. Rubin // Nature. - 1967. - v. 215. - p. 171 -172.

159. Straub, O. The IBR-IPV disease complex / O. Straub // Vet. Med. Rev. -1983.-v. 2. p. 119-131.

160. Taketani, Y. Epidermal growth factor stimulates cell proliferation and inhibits functional differentiation of mouse mammary epithelial cells in culture / Y. Taketani T. Oka // Endocrinology. 1983. - v. 113. - № 3. - p. 871-877.

161. Tayler, W. Feeding the baby serum and other supplements to chemically defined medium / W. Tayler // J. Nat. Cancer Inst. - 1974. - v. 53. - p. 1449-1457.

162. Tjio, J. Genetics of somatic mammalian cells. 11. Chromosomal constitution of cells in tissue culture / J. Tjio, T. Puck // J. Exp. Med. 1958. - v. 108. -№ 2. - p. 259-268.

163. Tounes, M. Influence of Pistacia Lentiscus Oil on Serum Biochemical Parameters of Domestic Rabbit Oryctolagus Cuniculus in Mercury Induced Toxicity / M. Tounes, C. Abdennour, N. Houaine // Europ. J. Sci. Res. -2008. v. 24. - № 4. - p.591-600.

164. Traian, E. Patent 80263, MRI3 A61K 35/22. Proceden de preparare a serului stimulat de cal, pentru culture celulate / E. Traian, M. Melania, M. Marin, N. Stefan (CPP), 1982.

165. Trowell, O. Intern Problems in the maintenance of mature organs in vitro / O. Trowell // CNRS. 1961. - v. 101. - p. 237.

166. Uittenbogaal, C. Growth of human malignant lymphoid cell lines in serumfree medium / C. Uittenbogaal, Y. Cantor, J. Fahey// In Vitro. 1983. - v. 19.-p. 67-72.

167. Ur, A. The blood coagulation curve of some mammals / A. Ur // Res. Vet. Sci. 1974. - v. 16. - № 2. - p. 204 - 207.

168. Usami, M. Culture of postimplantation rat embryos in rabbit serum for the identification of the growth factor in fractionated rat serum / M. Usami, S, Nakaura, K, Kawashima et al. // J. Exper. Zool. 1992. - v. 264. - № 2. -p. 214-218.

169. Van Wyk, J. Chemical properties and some biological effects of human somatomedine / J. Van Wyk, L. Underwood, R. Hintz et al. // Advances in human growth hormone research. DHEW Publ. — Baltimore. - 1973. - p. 25-45.

170. Velez, D. High Productivity in Mammalian Cell Culture // D Velez, S. Reuveny, L Miller et al. // J. Immunol. Methods. 1986. - v. 86. - p. 45.

171. Wallage, J. Repeated arteriopuncture in the rabbit: a safe and effective alternative to cardiac puncture / J. Wallage, B. Gwunne, J. Dodd, T. Davidson // Animals Technology. 1988. - v. 39. - № 2. - p. 119 - 121.

172. Westermark, B. Initiation of DNA synthesis of stationary human glia — like cells by a polypeptide fraction from human plasma containing somatomedine activity / B. Westermark, A. Wasteson, K. Uthene // Exp. Cell Res. 1975. - v. 96. - p. 58 - 62.

173. Zamansky, G. Adaptation of human diploid fibroblasts in vitro to serum from different sources / Zamansky, G., Arundel C., Nagasawa H. et al.. // J. Cell Sci. 1983. - v. 61. - p. 289-297.