Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Применение молекулярного моделирования для анализа данных 1 Н ЯМР-спектроскопии

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Применение молекулярного моделирования для анализа данных 1 Н ЯМР-спектроскопии"

На правах рукописи

НЕКРАСОВ Алексей Норбертович

ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ ДЛЯ АНАЛИЗА ДАННЫХ Ш ЯМР-СПЕКТРОСКОПИИ

03.00.02 - биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 1996

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН и

Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Научный консультант:

кандидат физико-математических наук

В.П. Тимофеев

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор

В.Г. Туманян

доктор физико-математических наук, профессор

В.И. Полтев

Ведущая организация: Биологический факультет

Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита состоится ¿г/7/>£>//Я1996 г. в ^ час.

на заседании специализированного совета Д 200.22.01 Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292 г. Пущино Московской области, ИТЭБ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Автореферат разослан /^сру^/с? 1996 г

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 200.22.01 кандидат биологических наук // / _ П.А. Нелипович

[Шиссс^^

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Установление пространственной структуры и динамики поведения биологически активных молекул в условиях, моделирующих природные, является важнейшей предпосылкой для проведения исследований структурно-функциональных отношений на молекулярном уровне. К наиболее эффективным методам получения такой информации относится метод спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Большой прогресс в развитии этого метода связан не только с совершенствованием экспериментальных методик и приборной базы, но и с развитием методов интерпретации экспериментальных данных, таких, как дистанционный геометрический алгоритм или метод переменной целевой функции, которые в настоящее время позволяют исследовать пространственную структуру не только пептидов, но и небольших белков. Хотя эти методы продемонстрировали свою эффективность, они предъявляют достаточно жесткие требования к используемым экспериментальным данным, к которым в первую очередь следует отнести непротиворечивость системы кросс-пиков ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО) и наличие достаточного числа межостаточных ЯЭО-контактов. К сожалению, в ряде случаев для молекул, обладающих высокой степенью подвижности, или в условиях, наиболее интересных с точки зрения исследования функции молекулы, получить экспериментальные данные нужного качества бывает очень трудно или даже невозможно. В этом случае практически единственным способом получения необходимой структурной информации остается развитие и применение таких методов интерпретации экспериментальных данных, которые позволили бы снять эти ограничения.

Цель работы. 1. Разработка новых методов анализа данных 'Н ЯМР-спектроскопии, основанных на подходах, развиваемых в

рамках метода молекулярного моделирования, и позволяющих получить пространственные структуры молекул из недостаточно информативных или неоднозначно интерпретируемых экспериментальных данных,

2. Определение полной пространственной структуры комплекса грамицидина А с цезием и исследование конформационной подвижности аминокислотных остатков, реализующейся в этой молекулярной системе.

3. Определение пространственной структуры физиологически активного пептида цикло(-01у-081Р-) в условиях, моделирующих его связывание с рецептором.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработаны методы анализа данных 'Н ЯМР-спектроскопии, позволяющие получать пространственные структуры молекул пептидной природы из недостаточно информативных или неоднозначно интерпретируемых экспериментальных данных.

Использование разработанных методов позволило получить полную пространственную структуру и исследовать подвижность боковых цепей аминокислотных остатков комплекса грамицидина А с ионами цезия, являющегося модельной системой для изучения ионной проводимости биологических мембран. Выявлен минимально необходимый набор конформаций, позволяющий объяснить совокупность структурно-противоречивых экспериментальных данных. Показано, что наблюдающаяся в исследуемой молекулярной системе подвижность боковых цепей реализуется в виде конформационных перестроек по наикратчайшим траекториям в пространстве торсионных углов Полученные результаты важны для изучения механизмов ионной проводимости биологических мембран и понимания природы молекулярной подвижности.

На основе недостаточно информативных экспериментальных данных, полученных в условиях, моделирующих связывание молекулы пептида с рецептором

(раствор БМБО), определена пространственная структура пептида цикло(-01у-081Р-), являющегося физиологически активным аналогом пептида дельта-сна. Показано, что конформация, реализующаяся в растворе ОМБО, обладает рядом интересных структурных особенностей. Выявленные структурные особенности и проведенные расчеты потенциала электростатического поля позволили высказать предположение о роли отдельных аминокислотных остатков в связывании молекулы цикло(-01у-В81Р-) с рецептором. Полученные результаты могут быть использованы для разработки новых эффективных лекарственных препаратов на основе пептида дельта-сна.

Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались на Третьем международном симпозиуме по биоорганической химии (Дагомыс, 1995г.). Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре работы в международных изданиях.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы и двух частей, в которых изложены основные результаты исследования, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах, содержит 42 таблиц и Ф рисунков. Список цитируемой литературы включает''ИО наименований.

СОДЕРЖАНИЕ ОСНОВНОЙ ЧАСТИ РАБОТЫ

Введение содержит обоснование выбора темы исследования и постановку задачи.

Глава 1 содержит обзор литературы по существующим методам построения пространственных моделей молекул пептидной природы на основе данных 'Н ЯМР-спектроскопии. В ней рассмотрены типы экспериментальных данных ЯМР-спектроскопии, используемые для исследования пространственной структуры макромолекул, и методы,

позволяющие получить пространственные модели молекул. Особое внимание обращено на реализацию этих методов в компьютерных программах, а также рассмотрены примеры их применения для исследования пространственной структуры конкретных объектов.

Глава 2 посвящена определению полной пространственной структуры комплекса природного антибиотика грамицидина А с ионами цезия (CsGA) и анализу подвижности боковых цепей входящих в него аминокислотных остатков. Известно, что грамицидин А в растворах образует димеры, представляющих собой двойные спирали различного типа, которые, как показано в последних работах (Sychev S.V. et al. J. Pept. Sei., 1996,2, 561), могут быть переведены в бислойную мембрану и формируют в ней долгоживущие ионные каналы, что указывает на сохранение ими пространственной структуры, имевшейся в растворе. Как было показано в первичном ЯМР-исследовании* (Aiseniev A.S. et al. FEBS Lett., 1985, ISO, 33), в присутствии ионов цезия в смеси хлороформ-метанол грамицидин А образует двойную антипараллельную правую спираль с шагом 7,2 остатка на виток. В этой же работе авторами была отмечена высокая степень подвижности боковых цепей аминокислотных остатков, из-за которой удалось установить только взаимную ориентацию полипептидного остова молекул грамицидина А. Для получения полной пространственной структуры был предложен и реализован метод анализа ранее полученных экспериментальных данных. Метод включал в себя:

1) анализ населенности ротамеров боковых цепей по КССВ;

2) выделение однозначно интерпретируемых кросс-пиков ЯЭО (с учетом известной пространственной организации

•Все использованные в работе экспериментальные данные были получены сотрудниками Лаборатории спектральных методов Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

полипептидного остова);

3) оценку пространственной сближенности протонов и возможность реализации однозначно интерпретируемых кросс-пиков ЯЭО в наиболее населенных конформациях СвОА;

4) анализ возможности реализации неоднозначно интерпретируемых кросс-пиков ЯЭО, позволивший выделить минимально необходимый набор конформаций;

5) уточнение наиболее вероятной конформации СвОА с применением энергетических критериев.

При оценке населенности ротамеров влияние динамического усреднения на значения КССВ моделировали в предположении существования распределения Гаусса для величин торсионных углов х- Зависимость эффективного расстояния между протонами от торсионных углов строилась

з Р , г-аВ1 Гц

О 6 10 15

ЭЛхр'

Гц

15

10

-6СР

/V ""V // ____ Л 1-й :Ч\-зор ■ •

1 /V, \| . \ч\ V• ч \\» • >

- 30° -160°

• 15

10

5 ГЦ

5 10 15

ар2 Гц

Рис. 1 Корреляционная диаграмма констант спин-спинового взаимодействия Н-С«-СЯ-Н и Н-С-СЯ-Н для Ь- и Б-аминокислотных остатков СвСА. Пунктирной линией проведены зависимости при величинах дисперсии о в функции распределения Гаусса, равных 10, 20 и 30, соответственно.

£ 5 > £ £ £

■А.

h 7.0

к С2Н W15 ЧС5Н W15 С6Н W15

С7Н W9 С4Н W15 С4Н W9

h в.О

-10.0

(Dl («-A-)

N1H W15 N1H W9 -10.5

0)1 (мл-)

Рис. 2 Фрагмент NOESY-спектра CsGA. Приведены однозначно интерпретируемые ЯЭО-контакгы с участием протонов индольных колец остатков Тгр.

с учетом эффекта динамического усреднения и согласно геометрии аминокислотных остатков, предложенных в ЕСЕРР2.

Противоречивая система кросс-пиков ЯЭО, которую невозможно согласовать с одной конформацией, и усредненные значения констант спин-спинового взаимодействия, лежащие для большинства аминокислотных остатков в диапазоне 6-8Гц (рис. 1), указывают на высокую степень подвижности боковых цепей. Анализ данных КССВ позволил оценить населенность ротамеров боковых цепей. В комплексе CsGA низки населенности (<10%) t-ротамера для Val7, g" -рсггамера Тгр11, Tip13 и g+-poTaMepa Tip15 и Leu14. Ряд остатков Tip11, Тгр15 и

Таблица

Ротамеры боковых цепей аминокислотных остатков CsGA. Анализ КССВ Н-Са-Ср-Н и ЯЭО-контактов.

остаток N ЯЭО » P(%> 2) набор ротамеров у}, у} по данным ЯЭО 3>

t g+ g~

Z-Val1 17 38 62 _ t (14) g- (10)

Z)-Leu4 0 - - - - -

D-Vai6 0 75 25 - -

Z-Val7 17 5 95 g+ (15) g'(7)

t (12) g'(7)

Z>-Val8 8 70 30 t(4) g'(4)

Z-Trp9 8 2S 28 24 t g+(6) g+g+(2)

tg" (3) g+g"(5)

Z)-Leu]0 10 22 46 22 t-(9) g+ - (5)

Z-Trp11 12 22 £2 10 g+ g+(7) g+g-(9)

tg-(5) g+g'(9)

t g+ (5) g+g+(7)

Z>-Leu12 3 22 46 22 t-(3)

Z-Trp13 5 46 8 tg+(4) g+g+(3)

D-Leu14 0 № 10 30 - -

Z-Trp« 15 25 £ 17 t g+ (10) tg"(6)

g+g"(H) g+g+(3)

g+g-(H) g-g-(4)

1) Число однозначно интерпретируемых кросс-пиков ЯЭО с участием протонов С?Н3-, С5Н3-групп, протонов индольных колец и протонов основной цепи.

2) Населенность ротамеров по торсионному углу х1-Подчеркнуты ротамеры, неразличимые по КССВ Н-Са-Ср-Н. t - соответствует величине торсионного угла х1* 180°

g- «+60° (для х2 ¿-Tip » -60° +-120°) g+ * -60° (для х2 Z-Trp * +60° + 4-120°)

3) В скобках представлено число однозначно интерпретируемых кросс-пиков ЯЭО, реализующихся в данной конформации боковой цепи. Жирным шрифтом выделены ротамеры, использованные для построения наиболее населенной конформации.

Leu14 имеют преимущественно населенные ротамеры (с населенностью >60%). Для остальных же аминокислотных остатков населенности всех ротамеров боковых цепей, по-видимому, близки (см. таблицу).

В процессе анализа NOESY-спектра комплекса CsGA удалось выделить 198 кросс-пиков с участием прогонов боковых цепей, которые можно было отнести к 337 различным парам протонов. Неоднозначность интерпретации кросс-пиков ЯЭО, кроме ранее упомянутой подвижности, усугублялась близостью или совпадением химических сдвигов целого ряда протонов. Исключив из рассмотрения заведомо пространственно удаленные протоны, удалось выявить 136 однозначно интерпретируемых кросс-пиков ЯЭО (рис. 2).

При анализе экспериментальных данных для остатков Val1, Val7 и Val8 пространственная сближенность протонов в различных конформациях оценивалась для двух вариантов стереохимического отнесения сигналов от СтН3-групп. Анализ показал, что для этих остатков Val систему кросс-пиков ЯЭО можно объяснить лишь предположив, что в структуре реализуется как минимум два ротамера по углу х1 (см. таблицу).

У остатка Leu4 химические сдвиги НР-протонов совпадают, а однозначно интерпретируемые ЯЭО-контакты с участием протонов С7Н, С81 H и С52Н-групп отсутствуют. Поэтому экспериментальные данные не позволяют сделать вывод о конформации боковой цепи этого остатка. Для Leu10 система кросс-пиков ЯЭО может быть объяснена наличием t и g+- ротамеров, тогда как оценка населенности ротамеров свидетельствует и о реализации g'-ротамера. Аналогичная ситуация наблюдается и для Leu12. ЯЭО-контакты можно объяснить только наличием t-ротамера, а экспериментально измеренные величины К.ССВ указывают на близкую по величине населенность всех трех ротамеров по углу у}. Для остатка Leu14 данные ЯЭО отсутствуют из-за совпадения химических сдвигов протонов, а преимущественно населенными

являются t- и g'-ротамеры.

Наличие большого числа кросс-пиков с участием спектрально различимых протонов индольных колец (рис. 2) существенно облегчает анализ конформаций боковых цепей остатков триптофанов и позволяет более детально рассмотреть их подвижность. Для всех боковых цепей остатков триптофанов систему кросс-пиков ЯЭО удается объяснить лишь предположив, что в растворе одновременно реализуется не менее двух конформаций боковых цепей (см. таблицу). Характерной особенностью является наличие нескольких альтернативных пар конформаций, отличающихся только величиной одного из торсионных углов у} или у}. Для остатков Тгр9 и Тгр13, величины КССВ-протонов НОСРН свидетельствуют о преимущественной реализации в растворе двух ротамеров по углу у} (t и g+) с близкими населенностями. Однако у остатка Тгр13 существенно ниже населенность минорного рсггамера g\ Для Tip9 наблюдаемые кросс-пики ЯЭО можно объяснить двумя парами конформаций: tg+, g+g+ и tg", g+g~, а для Tip13 только парой tg^g+g+Y остатков Тгр11 и Тгр15, судя по величине КССВ, должен наблюдаться преимущественно населенный (>60%) ротамер t или g+ и два минорных ротамера (t и g+для Тгр11; g* и g+для Tip15). Данные ЯЭО могут быть объяснены с помощью любой из трех различных пар ротамеров. В этом случае существенную информацию дает рассмотрение ЯЭО-контактов с участием прогонов СРН2-группы и амидных протонов i-ой (собственной) и i+1 пептидных групп. У остатков Tip11 и Тгр15 наблюдаются интенсивные и близкие по амплитуде кросс-пики ЯЭО обоих HP-протонов с Н№-протоном; Тгр11 имеет кросс-пик меньшей интенсивности одного из HP-протонов с HNi+I-протоном; у Tip15 кросс-пики с участием HNi+1-протона отсутствуют. Это позволяет выбрать величину торсионного угла х1=180° для Тгр15 и х1=60° для Тгр11. Тогда для объяснения совокупности экспериментальных данных достаточно предположить наличие

А

В

Рис. 3 Карты стерически разрешенных областей и траектории конформационных перестроек для боковых цепей остатков Тгр, расположенных в центральной части (А) и концевой части (В) правой Т1лл7Лш-спирали.

и

пары ротамеров для Тгр15 и для Тгр11. Поскольку

в спектрах ЯЭО каждому протону соответствует только один сигнал (рис. 2), очевидно, что конформации боковых цепей остатков должны быстро (по шкале времени ЯМР) переходить друг в друга. Представляет интерес анализ таких переходов для остатков триптофана, находящихся в центральном и концевом участках спирали в положениях 9 и 15 соответственно. Для построения карт стерически доступных областей проводился расчет правой 14тт7-2ш-спирали СэвА, в которой все Са-замещенные остатки, кроме рассматриваемого остатка Тгр, заменялись на остатки аланина. Таким образом моделировалось окружение Тгр остатками с высокоподвижными боковыми цепями. Шаг сканирования по углам у} и у} составлял 15°. Проведенный анализ показал, что каждой паре конформаций, объясняющих экспериментальные данные, соответствуют связанные между собой стерически разрешенные области в пространстве углов (рис. 3). Отличительной особенностью стерических условий для остатка Тгр15 является дополнительная возможность перехода между ротамерами и tg- по наикратчайшей траектории.

На рис. 4 приведена пространственная структура комплекса грамицидина А с цезием полученная после энергетического уточнения, в которой представлены наиболее

Рис. 4 Стереоизображение энергетически уточненной конформации (Ж}А.

населенные ротамеры боковых цепей (см. таблицу). В этой структуре полностью отсутствуют стерические напряжения, а длины межцепочных водородных связей лежат в интервале 1.79-2.03А.

Полученные результаты показали, что данные 'Н ЯМР-спектроскопии при детальном анализе позволяют охарактеризовать пространственную структуру подвижных полипептидов в растворе и определить минимально необходимый набор конформационных состояний, позволяющий объяснить совокупность экспериментальных данных.

Глава 3 Посвящена определению пространственной структуры цикло(-01у-В81Р-), циклического аналога пептида дельта-сна. В ряде биологических тестов он проявляет близкую и даже более высокую активность по сравнению с нативным пептидом.

Цикло(-01у-081Р-) предотвращает активность нормальных киллеров против опухолевых клеток-мишеней, улучшает показатели сократительной функции неишимизированных отделов миокарда при инфаркте. Выяснение пространственной структуры цикло(-01у-081Р-) является частью работ по созданию новых лекарственных средств пептидной природы на основе пептида дельта-сна.

В ходе структурно-функционального изучения 081Р и его аналогов (Меерсон Ф.З. и др. Кардиология, 1985, 25, 84; Кобальзон В.М. и др. Докл. АН СССР, 1984, Ж, 230) использовался ряд физико-химических методов, в том числе и ЯМР-спектроскопия. Полученные данные указывали на наличие целого ряда конформаций циклического аналога ОБ1Р в водном растворе. Было высказано предположение, что в условиях, моделирующих связывание пептида с рецептором, должна существовать преимущественно реализующаяся конформация, и для моделирования этих условий был использован органический растворитель диметилсульфоксид (БМЗО). Действительно, измеренные в этих условиях КССВ указывали,

как минимум, на существование преимущественно населенных ротамеров боковых цепей (рис. 5), что давало предпосылки к возможности определения его пространственной структуры, однако отсутствие достаточного количества данных о ЯЭО-контактах (рис. 6) не позволяло сделать это известными методами.

Был предложен и реализован метод анализа экспериментальных данных и проведены расчеты, позволившие определить пространственную структуру циклического аналога пептида дельта-сна в растворе ОМБО.

О 5 10 15

\р2 Гц

Рис. 5 Корреляционная диаграмма констант спин-спинового взаимодействия Н-С-СР'-Н и Н-О-СЯ-Н ддя аминокислотных остатков циюю(-01у-В51Р-). Белым цветом отмечены константы для Н20 (РН 7.0), серым - для ИМБО. Пунктирной линией проведены зависимости при величинах дисперсии а в функции распределения Гаусса для торсионного угла х1, равных 10, 20 и 30, соответственно.

Метод включал в себя:

1) анализ данных КССВ и ЯЭО с целью определения возможных конформаций каждого аминокислотного остатка, не противоречащих данным ЯМР-спектроскопии;

2) расчет циклических конформаций пептида, удовлетворяющих критерию замыкания полипептидного остова;

3) определение низкоэнергетических конформаций перекрывающихся фрагментов пептида;

4) совместный анализ результатов, полученных на предыдущих стадиях расчета, с целью определения низкоэнергетических циклических конформаций пептида;

5) анализ полученных пространственных структур по независимым (ранее не использовавшимся) данным ЯМР-спектроскопии.

При анализе NOESY-спектра наличие ЯЭО-контакта между На- и HNi+j-протонами указывает на возможность реализации для остатков Tip1, Ala2 и Asp5 В- или L-конформации полипептидного остова. Данные КССВ для Тгр1 и Asp5 указывают на возможность существования g+ или t-конформации боковой цепи у этих остатков. Однако ЯЭО-

ТКР» ALA2 GLÍ5 GLY4 ASP5 ALA» SER7 GLY* GLU3 GLY10

ДО*» □ о

Рис. 6 ЯЭО-конгакгы, наблюдающиеся в МОЕБУ-спекгре раствора цикло(-01у-ВБ1Р-) в БШО. Черным, серым и белым цветом представлены кросс-пики сильной, средней и слабой интенсивности. Для СР-протонов Са-замещенных аминокислотных остатков и Са-протонов остатков в1у первыми представлены протоны с большими химическими сдвигами.

контакты остатка Тгр1 с участием протонов СРН2-группы согласуются только при наличии В-конформации остова и g+-конформации боковой цепи, при этом пространственно сближенными оказываются Н^1- и HNi-nротоны. КССВ остатка Ser7 указывают на существование g--poraMepa боковой цепи, что согласуется с данными ЯЭО только в случае реализации для полипептидного остова или R-, или сближенной с ней части В-конформационной области. Для остальных аминокислотных остатков отсутствуют экспериментальные данные, позволяющие ограничить набор подлежащих рассмотрению конформаций.

Полученные данные требуют рассмотрения 9216 конформаций только полипептидного остова, что исключало возможность применения простого конформационного расчета пептида. Очевидно, что не все из них могут обеспечить стерически обязательное замыкание полипептидного остова даже при значительном дрейфе торсионных углов ср и внутри стерически разрешеных областей. Поэтому был проведен отбор сочетаний конформаций остова. Для линейного декапептида, в котором все Са-замещенные остатки аппроксимировались остатками аланина, проводилась оценка среднеквадратичного расстояния между его N- и С-концами с использованием потенциальной функции для торсионных углов <р и у, удерживающей первоначально заданные величины q> и у в стерически разрешенных областях. В процессе расчета был получен набор конформаций остова, критерий отбора из которого представлял определенную трудность. Отбор конформаций остова для дальнейшего рассмотрения был прекращен, когда в ранжированной по величине целевой функции совокупности конформаций для каждого аминокислотного остатка встретились все допустимые для него (по данным ЯМР) конформационные состояния остова. В результате были получены 34 конформации полипептидного остова, удовлетворяющие критерию замыкания цикла.

Интересно отметить, что конформационные возможности ряда аминокислотных остатков, для которых данные ЯМР допускали существование нескольких конформаций остова, существенно сократились. Наиболее конформационно вариабельными являлись фрагменты полипептидной цепи Gly^Gly4 и Ser7-Gly8.

Независимо от предыдущей стадии проводился расчет конформационных состояний пептидов, входящих в состав UHiuio(-Gly-DSIP-). Разбиение на пептиды для проведения такого расчета требует определенной осторожности, так как в случае неадекватности этого разбиения структурным особенностям пептида может быть получен неверный конечный результат. Как видно из данных КССВ, боковые цепи остатков Asp5, Ser7 (и, вероятно, Glu9), обладают несколько меньшей подвижностью. Это позволяет говорить о важной роли электростатических взаимодействий в формировании пространственной структуры пептида. Необходимость учета этого факта, а также полезность включения наиболее конформационно вариабельных участков Gly3-Gly4 и Ser7-Gly8 полностью в каждый из рассчитываемых фрагментов для обеспечения максимальной вариабельности при определении энергетически выгодных конформаций сделало необходимым следующее разбиение на перекрывающиеся фрагменты: Glu9-Gly10-Trp,-Ala2-Gly3-Gly4-Asp5

и

Asp5-Ala6-Ser7-GIy8-Glu9

Для этих фрагментов был проведен конформационный расчет, где в качестве стартового приближения рассматривались все конформации, не противоречащие данным ЯМР-спектроскопии. В результате был получен набор низкоэнергетичных конформаций для каждого из рассматриваемых фрагментов.

Совместное рассмотрение полученных низкоэнергетичных конформаций фрагментов пептида и

конформаций основной цепи, удовлетворяющих критерию замыкания остова, позволило получить три семейства конформаций полипептидного остова. Внутри каждого семейства конформации различались наборами ротамеров боковых цепей.

В качестве дополнительного критерия, позволяющего сделать выбор между этими тремя семействами конформаций, использовалась температурная зависимость А8/ДТ химических сдвигов амидных протонов. Вообще говоря, эта экспериментальная величина не часто используется при построении пространственных структур из-за ее чувствительности к ряду трудно оцениваемых структурных параметров. Однако в нашем случае только для двух остатков Тгр1 и Ala2 эта экспериментальная величина равна нулю, что может реализовываться при полном экранировании этих протонов от молекул растворителя. Эти экспериментальные данные, а также ранее не использовавшиеся значения КССВ протонов HNC°H, позволили сделать выбор лишь одного семейства конформаций. Аминокислотные остатки этого

Рис.7 Электростатический потенциал на ван дер ваальсовой поверхности nHtoio(-Gly-DSIP-).

семейства имеют следующие конформационные состояния: Bg+g+ - Тгр1; В - Ala2; L - Gly3; H - Gly4; Bg"g+ и Bg"t - Asp5; L - Ala6; Rg"g+ и Rg"t - Ser7; L - Gly8; Bg+g"g", Bg+g"g+ и Bttg+ -Glu9; В - Gly10. Все конформации этого семейства лежат в интервале энергий от -15.2 до -17.7 ккал/моль.

Для полученной результирующей конформации UH^o(-Gly-DSIP-) характерны очень специфические структурные особенности:

а) молекула имеет квазипланарную конформацию основной цепи;

б) молекула пептида может быть разделена условной плоскостью, проходящей через атомы основной цепи, на две части, одну из которых составляют ориентированные в одну сторону боковые цепи остатков Asp5, Ser7 и Glu9; вторую -остатки Trp1-Ala2-Gly3 (рис. 7), причем объемная боковая цепь остатка Тгр1 формирует внешнюю поверхность одной из частей молекулы.

Для иллюстрации этих структурных особенностей был проведен расчет потенциала электростатического поля на ван дер ваальсовой поверхности молекулы (рис. 7). Полученные результаты позволяют предположить, что такая пространственная разнесенность различных по своим физико-химическим свойствам фрагментов молекулы может быть связана с ее функциональными особенностями, и боковая цепь остатка Тгр1 формирует контактную поверхность области связывания nHioio(-Gly-DSIP-) с рецептором.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны и применены новые методы анализа данных Щ ЯМР-спектроскопии, основанные на введении различного типа стерических ограничений и позволяющие получить пространственные модели молекул из экспериментальных данных, ранее не подлежавших структурной интерпретации.

2. На основе детального анализа совокупности экспериментальных данных был получен минимально необходимый набор конформаций боковых цепей аминокислотных остатков комплекса CsGA, объясняющий противоречивую систему наблюдающихся кросс-пиков ядерного эффекта Оверхаузера.

3. Определена наиболее вероятная пространственная структура комплекса CsGA и проведено ее энергетическое уточнение.

4. Получены карты стерически доступных областей в пространстве торсионных углов у} у} для боковых цепей остатков триптофана, на основании которых исследована их подвижность. Показано, что конформационные перестройки между наиболее населенными конформациями осуществляются по наикратчайшим траекториям в пространстве торсионных углов у}у}.

5. Установлена пространственная структура 4HKJio(-Gly-DSIP-) в растворе DMSO, где, в отличие от водных растворов, реализуется преимущественно населенная конформация.

6. Показано, что установленная конформация обладает рядом структурных особенностей:

а) квазипланарностью основной цепи;

б) пространственной разнесенностью различных по своим физико-химическим свойствам аминокислотных остатков Asp5, Ser7 и Glu9 от остатка Тгр1.

7. На основании выявленных структурных особенностей и

проведенного расчета электростатического поля на ван дер

ваальсовой поверхности молекулы теоретически предсказана роль отдельных аминокислотных остатков в связывании iíHfoio(-Gly-DSIP-) с рецептором.

Основное содержание диссертации опубликовано в работах:

1. Alexei N. Nekrasov, Anatoly V. Stepanov, "Vladimir P. Timofeev / The Features of the spatial structure of the gramicidine A -ceziura complex. // FEBS Lett. (1995), v. 71, p. 35.

2. A.N. Nekrasov, V.P. Timofeev / Gramicidin A Right-Handed Double 7.2 Helix. Investigation of Spatial Structure by NMR. // Proc. 3rd International Symposium on Bioorganic Chemistry Dagomys, Russia (1995), p. 92.

3. AN. Nekrasov, I.I. Mikhaleva / Determination of Cyclo(-Gly-DSIP-) Spatial Structure. // Proc. 3rd International Symposium on Bioorganic Chemistry Dagomys, Russia (1995), p. 91.

4. Alexei N. Nekrasov, Inessa I. Mikhaleva / Cyclo(-Gly-DSIP-), a Cyclic Analog of the Delta-SIeep-Inducing Peptide: Computer Simulation of Spatial Structure Involving NMR Data. // Biochem. Mol. Biol. Intern. (1996), v. 38, p. 764.