Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: ФИЗИЧЕСКИХ И СТРУКТУРНЫХ СВОЙСТВ БЕЛКА

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: ФИЗИЧЕСКИХ И СТРУКТУРНЫХ СВОЙСТВ БЕЛКА"

АКАДЕМІЯ НАУК БССР ■■ :

ИНСТИТУТ дКСПЕРШЕНТАДІНОЯ ботішбос ■ '

штш

Наорамхрлюпм*

■■ ' ИВКОВІ маргарита николаевна

аиїмиввнив методі «дуорвсішшмдія исследования

«эически1 H структур ИЛ свойств EEUU : -< л» руооми юо» ) 1V--;. :■ ?0 -';■('Біофвзіка 03.00*02 }

г-'' ; Автореферат дяссвртаци м

квнвд учввоі отвовві жандимта ЙІОЛОГІЧвСКІХ вяук*

Мжаок, 1973 .'■

/

АКАДЕМИЯ НАУК ВССР ИНСТИТУТ ЗКСПЕПЫШГЛШЮЙ БОТАНИКИ

На правах рутошої

ИВЯОВА МАРГАРИТА НИКОЛАЕВНА

применение метод* доорвсцгаши для ИССЛВДОШНКЯ-

«ЭИЧВСКИ1 H СТРУЇП7РШІ свойств БЕШ ( на русокс* ваш» )

к

{ Eaojtaaixa 03.00.02 )

Автореферат дассертацаж ва ссщо-. хаме- учввой степвпж жаядидоа біолог» чесмх вауж;

- г-.тчсгсда

¿1ÎES

^Я' ¿K/t/gf

Ыяаск, 1973

Работа »ыпоявєна в кабораторни фиаикх фвривнткшс систем Института биологичвоков фивики Академии наук СССР

Научшй руководитель — кандидат биологически* наук ВД. БУРУГЕЙН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В.Л.КАДЕР, кандидат фивяко-иатеиатичосикх яауя К.К.ТУРОВЕРСВ

Диссертация направлена на официальный отвыв в Институт ПкнческоЙ фимки АН СССР

Автореферат разослан " // " ££441973 г.

Занята диссертации состоится на вас в да ни и Объединенного Совета по присуждению ученых степеней Института экспериментальной ботаники АН БССР " /5" " ¿ПСрЛ^і-^ 1973 г*

С диссертацией можно ов'яакоиимся в библиотеке АН БСС?

Отаывы и ваивчаник просим напрагдять по адресу: г.Нянек, уя. Академическая, 27, Институт експерименіавіной ботаники АЯ БССР, ученому секретари Совета № I

Ученый секретарь Совета № X

Бе лги преястзвлдаг с обей високомоле кулярн ив соединения» кпторие вмепт сравнительно компактную структуру,но,в то хе врэ мя, овладеют опрэделевпей структурной лабильностью - способностью к койформацяеннш взмезениям. Эти кояформашоиные изменения еграют вакнун функциональную роль,являясь физическим мвта-впзиом регуляции актив поста балка.

Для Езучепня ковформацяояяюЕ превращений макромолекулы мо гут быть ЕОИОЛМОРЭЙН классические методы иэучевия белков -В растворе,которые характеризуют ряд свойств макромолекулы на« целого: молекулярный вес.рэзчерн»содержание упорядоченных -спэралъвдо я складчатых структур. Бот почецу see более ыярокоз распространенна получают методы«которые даот информацию о до -кальках структурнчх и ({изичзскяг свойствах в отдельные участ -ках макроиалекулы; К таквм методам относятся,прежде всего,рент гезоструатурвнй авалаз,ШР,ШР к оптическая спектроскопия с во польз оса на ем спеца^ичеэклх зондов и меток,метода дв$ферееод -алъной спектроскопии,ообственаой флуоресценция белка.

Все перечисленные методы,за исключением ре втгеноетруктур-аого енэляэа в будущем.вороятво.и метода ШР,дают частвую ва формации о локализаций а свойствах кикроокружвкия в тех кля иных участках макромолекулы бедке. Метод собственной фдуорео -ценщи оо срапвоьмо о остальными методами имеет pes дополни -телжвш; пряамувдетп (высокая чувствительность,малые воздейст ■ вдя на вативвую структуру, специфичность долучаешэЗ ивформашш о мякреокружевнв ароматических еминокяслотвых остатков я др.)*

Сейчас накошен достаточно большой экспергшнтальный материал по лякпиеопектвым свойствам освоввого хромофора бея -KB - «ВДОЛЫЮГО ШИ8, что позволяет сироко использовать метод фзуорвецзнцив в ре'зенкя пекотор'к эедач, связанных со струптур-пхш состоявиен емка. Однако ^втерпретация фху&реоаентпых дав-якх остаемся яо многих случаях гячестввннсй я яе всегда одно -звачвой. В связи о этан, ты представлялось яаядим вооытаться прсвестк анваз янформатввЕости отдельных параметров фдуорео -цензов в сочетании с рлэ.';лчв5г,дя подходами (напрпмер,методом из

блротельяого ГупвБ ВЯ флуервеиевцая) .рассмотреть визшзвостъ ЯО пользования этих параметров для определения стелевз заверив -

воста переходов в бели» и проиллюстрировать комплексный анализ флуоресцентных:параметров некоторыми исследованиями ряда коя -кретвых белков.

Диссерталдя состоят аз трех глав:первая из которых посвя-иева обзор? литературы во рассматриваемый вопросам, вторая -опясана» приборов.методов всследованая а препаратов, я третзд-- анализу информативности раэлячаых флуоресцентных параметров в использованаяих в качестве меры завершенности переходов;вс-следованно туаення флуоресценции белков для определения лока -лазаиии триптофановых остатков в белке: применению основных принципов в различных подходов к исследованию векоторых конкретних белков.

ПРИБОРЫ И шжщи іЮСЛЕДОВАНИЯ, ПРЕПАРАТЫ.

Измерения спектров флуоресценции проводили ва установке с монохроматачасклы облучением. в качестве источника азлученая для возбуддевня флуоресценции образца слухала ртутная лампа сверхвысокого давленая СВД-І20А. Для вьщелевая возбувданцего монохроматического язлученая использовали монохроматор,собра»-внл по автоколлямацяоавой схеме ва реплаке диффракционной решетки. В качестве анализирующего монохроматора использовала кварцевый монохроматор СФ-4. Образцы измеряли в кварцевой ко -вате (Помещаемой г термостатаровавный держатель. Свет флуорес -цеяциа регистрировала с помощь» фотоумножителя ФЭУ-39 и реэуль тнругщий сигнал,после усиленая на ЛПУ-01,записывали не элекг -ровном самопишущем потенциометре ЭГШ-09. При обработке спект -ров флуоресценции вводили поправку на спектральную чувотвитель яость установка.

Спектры поглощения образцов измеряла на спектрофотометре СФ-4 ада садапишущах спектрофотометрах iXnicam SP-SOO я Sре core/ Діяопределеядя истинного поглощения в случае мутных растворов виосялщ поправку на светорассеяние.

. При измерения флуоресценции образцов с добавками тушите -леЯ в спектры вносили поправку ва экранировку (в случае всполъ эовавая солей HJ0}, KBrOj, КС№ а др.) и ва экранировку я ре абсорбция (в случае использования содей tJafJOs, NafJO, КБурш-

тейл,І968),

В работе исполъэоазет препараты белков: Ы. -химотриповва, химотрвпснвогенв А,трипсава,очище нв ые ыногократвой перекрив -талляэацаей;папаина,пепсина,лязоцима,очищенные фракционным вы салввавием о посдедущей гель-фодьтрацней. Без даполнятельвоК о чиста попользовали коммерческие препарата сывороточных альбуминов человека л быка,лиэоцима, £ -амилазы. Препарати шо-зина в Ф-актвяа из мышц кролвка были любезно предоставлены вам А.А.Ваэиной.актомиоэнна вз мышц кролвка С.Э.Шаолеы.фоофохреа-мнкянаэы из мышц кролика - Б,П. Четвериковой (Ивствтут бвсло -теской физики АН СССР,Пущиао) ¡триптофани л-т-ЕНК-сивтетаан — А. В, Лариным в Л.Л.Кяоелевыы (Институт молекулярной біологи АН СССР,Ыосх£а). Препарат р -лактоглобудина был получен Р.И.Кас-лаваоом (Всесоюзный Цаучно-Исследовательскяй Институт Ыаслоделяя в Спроделал,Каувас)і А - белок вируса табачной мозавкн -Л.П.Квлвничеяш> в М.Л.Христовой (Ивститут биофизики АН СССР, Пущиво). -

Необходимые препараты ивдольвых производных использовала без дополнительной очистки,а вндол очишаля возгонкой.

Различные препараты солей,«пользуемые для приготовлен«* буферных растворов и в качестве 'душителей флуореопевщв, вмели квалификации "химически чистые" яли "особо частив" ,а в ряде случаев били перекрвсталллэовавы. В качестве растворителей іс-пользовали дистиллированную влв бидистиллированнув £оду;диок -оая для УФ-спектроскопии,очищевный перегонкой;иэобутавол,вме -вдвй квалификацию "хамаческв чистый".ыочеввву (ЧШ.очв ценную перекристаллизацией из этанола.

исследование структуры и конюшационных переездов ШІК0В

А. Анализ параметров Флуоресценция бдляя выясненад критериев определенвя состояния триптофановых остатков в белке.

Основой метода флуоресценция белка является флуоресценция ароматических аминокислот в белка,паранатра {квантовый выход.

положение и форма спектра и др.) .которой определяется $»!эикд-хвмическиии свойствами окружения. Многообразие физических характеристик среда,влиявших на кз*дай из параметров флуоресценции бежка.а осойввво его триптофановях остатков .затрудняет строгий количественный анализ* Исходя-из задач анализа я литер претаци® флуоресцентных данних бия предложен ряд классяфа наций триптофэновых остатков в белке ( Конев, 1965; ,196В;Ве-

деякаяа и Бурттейн,1970). Модель трех дискретных состояний ' »риптофановых остатков в белке (Ездеикина а Бурттейя,1970), . предложенвея па основе анализа положения в формы спектра ин -дольного хромофора,вииболее полно позволяет опасшшть флуорео-ценцию трилтофавевых остатков в белках. Далее, на основе ава -доза собственных я литературных данных о величинах квантового выхода я времен жизни флуоресценции 27 различных белков была установлены оледувдве значения квантовыг выходов и времэч жиз-вв флуоресценция для кахдов из трех дискретных форм: I - остат ки, спрятанные в неоалярных участках бедка (Л» =330-332 ни, йЯ »48-50 нм, (j, в 0,11, Г « 2,1 нсев); П*- остатки,находя -щеей в ограничений« контакте'о водой ( Лн * 340-342 вы,¿Л » ■ 53-55 вы, * 0,30, Г = 4,4 ясек);*Ш - бстаткя полвостью Доступные воде с » 350-353 ЯН, лА *= 59-61 им, « 0,20, Г « 5,4 всеи); Модель позволяет относительно просто по аиа -чэяиям положения максимума ( Лн ) и пвривы (дХ ) спектров оценить вклад» в обшую флуоресценции каждой из модельных форм. Звание вкладов, в своп очередь, позволяет оценить значения некоторых средних флуоресцептвых параметров белков,ожидаемых из иодеда. *

На втом оововавии нами была проведена проверка модели в нескольких аспектах путем сравнения параметров, рассчитываемых из вкладов форм (из модели), с данными непосредственных вкспе-риневтадьвых определений. Проверка была проведена по трем ха -рахтеристикаы: I) доли флуоресценции, иэлуча емой триптофан в да на доступными водному растворителю, которую можно измерить по до ступяостЕ хрошфоров ионам - тушителям; 2) значении квантовых выходов, измеряемых независимо; я 3) значений времен жизни флу оресденцни.которые бнля взяты из литературы (Конев с сотр,1Э66

Chen et of, 1967, ictigurcrth, 1971 ). '

Для I? различии белков бнлй подучевы давние о вкладах в общий квантовий выход белка остатков триптофана .доступані ту -ват елям, WOs ■ С 5* . Поскольку модель дает вклады двух по * верхноствых форм, доступных воде и, следовательно, ИОННЫМ ту -евтелям, то сопоставлялись суммы вкладов форм П и Ш, определяв шх по значения« >„ а л Л . со значениями вкладов туш нов компоневты. Значения к вкладов, определяемых по флуоресцентным параметрам я по данным тушения флуоресценции, хорош коррели -руит {отличие ара(ч. /Оме*. ОТ 1,00 Нв ПрвВЫШвТ 0,14), ЧТО служит доводом в пользу правильности оценив вкладов различных форі.

Если для данного белка известен вклади и средние значеній квантовых выходов для казной из тридтофаняльных форм, то воз -ыохао рассчитать в величину общего ожидаемого квантового выхода флуоресценции ф ( предполагается отсутствие аефлуореоца -руюших остатков);

- - 'І -

где Qi - вклад і -той формы; - квавтовый выход остатков триптофана в £ -той форме. Сопоставление рассчитанных эначе-ний в квантовых выходов о измеренными экспериментально показало ло,что для трех белков ( f -глобулін, лізоцим я папаав при рН 4,5 ) зкеперимеагальнне значения ниже < более,чем вдвое ), а для четырех белков I актив, fi -амилаза, белов А КМ и пиру -ватки ваза ) - вше ( бодее,чеы в 2,4 раээ ) расчетных, дая остальных двух десятков белков обе системы значеней находится в хорошем количественном соотношении С различается не более, чем на 20% ). Эти данные позволяют заключить, что для большинства белков шдельвые значения квантовых выходов отдельных форм триптофана лов выбргнн очень близко к истинвнм значенаям. Однако, имеется две группы белков с весовпадавшими расчетными я экспериментальными значениями. Вероятно, белки первой группы ( ниэкиа НКПТОВЫЙ выход ) содержат некоторое число остатков, имеющих очень ниэкай выход. Такое врвдролехение выдвигалось для

пэодвмэ ( ^ehrer , 5971;Те1сЬ.Ьег$ г(а{ 1970 ) в паиалва ври

4,5-5,5 (даге£г орёте/1,$Хб!Пег 1971 ). Во второй содгрухшв белка имеют очень высокие значения квантовых выходов флуоресценция д, за исключение« аврувагкиназв, в основном, во £дуорес«0япвв имеют взлучавие остатков формы I. Возможно, что в втих балках локальное окружение тряптофанилбв более близко х углеводородному, как ато предполагалось для единственного оо -татка триптофана в РНК-азе ^ ( выход 0,4\tongusorth, 1971 ),

Аналогичные давние были и¿лучевы при сравнений расчетных я вкспвриментадьннх (литературные дойные ) значении вреыеа жизни фдуоресцевцив. Для 10 из II рэссиатреяных балков получено очень хорошее совпадение этих . .данных ( отклонение менее 10$) Долучэввые давние емэ раз показывают, чтд предполагаемая модель трех дискретных состояний триптофавовых остатков в белке в общих чертах согласуется с известными флуоресцентными свой -с^вама белка л евоеобяо описать их.

Таким обраасм, модель трех дискретных спектральных форм -одной, спрятанной в веполярнах участках белка ( форма I ) и двух поверхностных - одной, полчостье доступной воде ( форма Ш) а другов - яаходяшейся в ограниченном контакте с водой, веро ятно, иммобилизованной свяэнвэвием на поверхности макромолекулы ( форма И ), позволяет получать некоторые количественные предсказания о параметрах флуоресценции белка, а также охарактеризовать мвкроокруженпв ( полярность,жесткость,взаимодействие о аоногевныш группами белка и др.) троптофановых остатков в белке*

В'настоящее время, когда флуоресценция находят все более широкое применение не только в исследовании структуры и пове -давня белков в растворе ( Ёурштейя, 19&4, Конев, 1965, Влади -миров, \ЪЪЬ,ХопдшогЫ ; 1971, Черв^цкий, 1972 ), во и белков, включенных в такие сложные сибтеми, как мембраны, возникает необходимость анализа параметров флуоресценции для оценки степе-ва завершенности переходов в макромолекуле белка, вызывающих изменения окружения хромофоров, В связи с этим были проявили зи-ровавы некоторые из параметров флуоресценции белков,

'I. увавтовый, выход. Если в молекуле имеет место переход из

ооогоянид I в состоявво П, то степень пэрагода определяется следующим образом*.

Квантовые выход в точке перехода можно виразіть

где ¿v и - молярные коэффициенте 8котийкции в I Я П состояниях макромолекулы при хляне в один возбуждения, а я - соответствующие квантовые виходи* Если спектры поглощеввя хромофоров белка не вэменяитоя, яли возбуждается флуоресценция в язобестичесхоа точке, то язмвневяв квавтового выхода «ожег слухать ляпейнов мерой степени перехода, я последнюю мояде га-резв» как

'{К *

2. Ннтевсивность ібдуореспевияи вря дяксяробаиной дляя? волвц в промежуточном состояния ( I* ) букет равна:

г* - Г-Ъ Ьт '.; ф /-Г« , Ье г ~ і -Тг Ъх + Ъа І-Тх а+Ох

где 7*г , Гс » - значення светопропускаввя образна для каждой из форм, а я Ьа - оптвческле плотвоотв образца в начальном я конечном состояниях оря длгне волна воэбукдепкя; Для случая неизменности поглощеввя (<?г - 6а ):

* ' Хж -ь ,

а при изменении поглощеввя ( і/ ^ ь )

3. Интенсивность фдуороопеядяи в ид кс и пут ссектраї, часто используемая в литературе, ве иожат быть использована в качества меры перехода, т.к. ова не проаорцновальаа квантовому вы -ходу при изменении полуширины спектра.

4. Отношение ивгевсдвноугей Фдторесцевияк на сКловах опек-тра для двух состояний макромолекулы белка выражается довольно

сложной функцией я поэтому оказывается неудобной для расчета степени конформационного перехода.

5. роложенив максимума спектра фдуове спев иди нельзя вы -разить аналитической функцией и провести аналогичный анализ.

Анализ денатуваиионных переходовт

Параметры флуоресценции ( положение и форма спектра )можно использовать для анализа деватурацноваых переходов с точки эревия кооперативном» процесса, протекающего по механизму "все или вичего", или через промежуточные стадии. Поскольку по ложенив максимума спектра а его полуширине определяются состоянием триптофановых остатков в белке оря данных условиях,то можно определить, как должно быть связано положение максимума спектра .о его полушириной в предположения, что в растворе имеются только две крайние фарш молекул, нативнне и деватуриро -ваняые. Можно рассчитать, как будут меяятьоя параметры спектра если J* - о lit + (< + <*)15 ,

где 1м , />; и Ixi - интенсивности флуоресценции в промежуточном, вативвом а денатурированном состояниях; Q я (I-Ó) -вклады в общую интенсивность флуоресценции белка форм 1'й П. Этот тест был использован при исследовании тепловой деНатура -Пии cL - химотрипсина при рН 4,5 и денатурации мочевивой хи-мотрипсивогева А, р -лвктоглобулияа и глицеральдегид-3-фоо -фатдегндрогенаэы ( ГАВД ). На рис. I приведена зависимость АЛ (Л«) расчетная ( сплошная кривая ) и экспериментальная (точки) для денатурация химотрипсвногена А ( А ) я ГАФД ( Б )'мо-чевивой. - ' '

Эксперименты показали, что промежуточные формы отсутствуют при денатурации химотряпсииогена А, - лактоглобулвна и' eí- химотрипсвва ари рН 4,5, я отличве от процесса денатура -щи тлице,ральдегид-3-фосфзтдегидрогенаэы. Этот метод может ока« эаться крайне полезным для анализа тепловой денатурации,т.к, в этом случае анализируется только форма спектра в не учитывается квантовый выход, которые изменяется не только за счет ков -фориацновной перестройки при денатурации белка, во и из-за тем перетурвого тушения. Следует заметить, что предложенный выпе

Ряс. I. Изменение положения и формы спектров белков при денатурации (сплошные лавка - расчетные кривые; точка - экспериментальные данные ): А - хиыотрипсиноген А, мочевина от 0 до КМ; Б - ГАфД> мочевина от 0 до В М.

критерий анализа денатурецвовных процессов отражает ковформа -цаю макромолекулы С елка относительно изменения состояния трио тофановых остатков в белке, т;к. флуоресцевция отражает иэме -нения лишь в локальном окружении ароматических аминокислот;

ИССЛЕДОВАНИЕ ТУШЕНИЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ БЕЛКОВ ДНЯ ОШЕДВ-ЛЕНИЯ ЛОКАЛИЗАЦИИ ТРИПТОФАНОВЫХ ОСТАТКОВ Б БЕЛКЕ.

I* Тушение Флуоресценции андольных производных.

Одним аз методов исследования локализации триптофановых остатков в белке является метод избирательного тушеная флуоресценции ( Владимиров, 1957; Бурптейв, 1968} ¿екгег , 1967 Ь В качестве'тушителей используются вовы неорганических облей СлС£ и МаЩя др. Ионы ( Сз+, ЫО3 >, взаимодействуя о возоуждев-вым напольным кольцом, тушат флуоресценции триптофанилов по кв нетическому механизму. Это позволяет испольэвать данный метод для определения локализации тркцтофановах остатков в белке^Ддя использования этого метода в исследовании белков был выяовэп рях количествен них закономерностей на шдельных соединениях ( иадольные производные и денатурированные белка ) х сделана попытка выяснить влияние общего заряда белка а локального за—

ряда ва ковотанту тушения, хроме того билн подобравы новые ту яштелд для доследования белков.

Результат» исследования тушения флуоресценции некоторых производвых: индола различными ионными туяшт елями ( , J Of, Єг03~, VOj, Сі* ) показала, что измевевяе флуо^есдевции всех всследованнкх производных подчиняется закову Штерва-Фодшера:

о= -f=кс

ixe 9й* 9 ~ квантовые выходы флуоресценции белка без тушителя я с тутвателем, соответственно; - константа Штерна-волъ мера; С - концентрация т;штедя, В таблице X сведены давные по тутевип яндольных производных при действий ряха bosh их тушителей. Для того, чтобы сравнивать эффективность тушения производных индола о различными квантовыми выходами разными тушителями, бьш введен параметр-А :

I _ Л . &££

L " Ит и 9- где

Нтри *Н " конставты Штерна-Фольмера для свободного триптофана в воде и триптофани лов белка, соответственно; tf-rpu- Q - кван-' товые выходы триптофана и белка, соответственно. Отношение квантовых выходов три / С}. является поправкой ва время жиэ-вв возбужденного состояния, т.к. квантовый выход издольних про взводных пропорционалев времена жизни возбужденных состояний ( üadfey и Ttah, 1969; Ъе Lauder, WahC , I9?I ), Таким образом, параметр L пропорционален отношение коseiант скоростей взаимодействия возбужденного хромофора с тушителем,т.е. отао -еятелввому коэффициенту диффузии лояного тушителя К Хроиэфору* Этот параметр L является мерой доступности хромофора тушители. Как видно из результатов модельных экспериментов, эффективная веляч! ва доступности хромофоров влцольвых производных зависит of заряда в окружении хромофора, причем при увеличении ионной силы раствора эффект электростатического взаимодействия: ионных тушатедеА с заряженными группами в окружении хромофора сильно уменьшается. Повышение вязкости раствора ( индол и триптофан в 8 М мочевине ) вызывает уменьшение &ффеківввости тушения.

- Табляда 1,

Тушенке флуоресценции производных индола ионными тушителями

Производные яндола 9« 1 ! н(а (три Ри&) \ншк 11 I мцяз 1 1 1 Г

Триптамян 0,43 0,63 М7 1,67 1,51 1,60 +

Триптофан рН I - 0,044 0,86 0,97 * - " +

Гллцал-трвнтофан 0,057 0,92 1,05 - - - 0

Триптофан рН 6 0,20 Г.о 1,0 1.0 1.0 1.0 0

Кндолил-пропяоновая 0,17 0,66 0,79 ' - 0

кислота р!1 2

Иядоджл-пропионовая 0,52 0,62 0,77 0,63 0,42 0,78 -

кислота рН 8

// -ацетил-триптофан 0,28 0,79 0,76 - - - ' -

Триптофан рН 10,5 0,51 0,89 0,47 ■ - - - -

Индол 0,40 1,28 1,20 1,30 _ ■ - 0

Индол в 8 и мочевине Триптофан в 8 Ы мочевине 0,60 0,24 0,79* 0,65* -0,84* 0,55* - — - 0 0

* I » Н!ц. ( в мочевине ): %.< Нг0 )

2. Тушение Флуоресценции денатурированных белков., Изменение флуоресцвтиа жепатурлровавных 'белков при увеличения ков -цеятрааии тушителя так же, как я для производных индола,подчиняется линейному закону Штеряа-фольмера без жзмевеняя формы спектра. Эффективная доступность хромофора в таких системах ионным тушжтелям ( N0$ , зависят от общего заряда гло -

булы, а также от ёязкости белково-мочевияяого раствора (доо -тутоюсть составляет 50-605& от аффективной доступности т£япто -фана в растворе 8 М-яой мочевины.

'3. Тушение Флуоресценции ватявяых белков. Иоследовалия, проведенные на модельных системах, легля в

основу определения локализации трнлтофа новых остатков и заряда в окружения доотупнцх тушителю оотатков в бедке.

Если триптофановые остатки в белке одинаковы по доступно-ста тушителю, то ефективності тушения й будет линейно завивать от концентрации тушителя, а константы Иїгеряа-фольмера определяются графически из наклона этой прямой* В трех белках ( Ф -актив, химотрипсиногев А, глидеральдегид-3-фосфвтдегвдро ¿вваза ) из двенадцати, приведенных в таблица 2, триптофанові» остатки одинаково мало доступны (і ОД ) ионным тушителям

( ЫОл • Сі*). '

В натяввых белках имеются триптофанилн, как вэаимодейотву ицие в водой и растворенными в вей ионами, так ; и ве вэавмодей отвупциві Кояотанты тушения флуоресценции таких триптофавилов будут существенно различаться, а зависимость эффективности тушевая от концентрации тушителя С будет нелинейной, на гете рогенность трвптофаяовых остатков в балке по доступности ион -вым тушителям может указывать зависимость эффективности туше -вия ог длины водны флуоресценции, 0. ( С ). Длинноволновая компонента спектра, принадлежащая поверхностным формам триптофавовых остатков, тушится с большей эффективностью, нежели коротковолновая компонента ( б (Л*^) 0 ), Вели кон ставты различаются на порядок ¿ли более, то'константу для иа -лодостутшых остатков триптофана можно принять равной нулю. Тог да удобно пользоваться линейной функцией:

где - вклад в общий спектр флуоресценции доступвых ту -

шатели оотатков триптофана, И - константа их тушения, С -концентрация тушителя, причем Оцоі™ + Ояс^аг™» I, Построив ли-вейвый гранях Н ('¡с ), ыожво определить О^ол (2каж -до! из форм, ковбтанты их тушевня и рассчитать доступность ' : Доступность поверхностных форм триптофановых остатков может ме вятьоя в широких пределах: в эксперименте наблюдаются вариация эвачения і от 4 для триптофанилов трипсина до 0,03 для ГАФД ( Таблица 2 ), Причина таких различий кроется, в значительной ¿тепеви, в алакгростатяческих вззимодейсгвияж ионных тушителей

- и -

Таблица 2.

Параметры тушения флуоресценции ватвввы* белков аовпыма ту-шиталямн ( МОз, Сб.* ) пря Л( * 296,7 вы; К - повстаете Штерна^льмера; £ - еффехтявйая доступа ооть, опредв -ляемая по тушевав; А„; * лЛ - положевве максакума ■ полуширина раэвоотвик спектров { оттутявдеыых спектров )»

салол 1 лм АЛ I К<)(К< -1 1 Л и |дА

Ф -актин 3,8 0,13 331 48 0,26 0,07 331 45

Хямотрнпсвво- 3,1 0,16 331 48 0,0 0 -

геа А

Гквцераладегнд—1.0 -0,03 -340 - 51 -ОД -0,04 -340 -55

3-фоофатдегвд-

рогеяаэа,апо -

фермент, 1

-"-ходофермевт 0 0 - ■ - -0,14 -0,08 - 353 -59

•<-хямотрвпсяв 55 1,23 340 54 0,2 0,13 343

Фосфокреатявка- 57 3,3 342 56 - -

яаза

Трипсин 67 4,0 342 52 4,6 2,8 340 60

МиозвЯ,0,5М 22 0,62 339 55 0,17 0,05 338 55

Гриптофеввл-Т- 25 0,55 340 51 - - - -

-РНК-синтетаза

Лнзоцям 17 0,65 346 56 - - - ' -

Пепсив 29 0,80 347 60 - - - -

Паоадн.рН 7 8 0,38 345 61 2,35 1.1 350 61

Сывороточные 102 2,0 ■ - - - -

альбумин бычай

0,05 М

и заряженных груш в окружений хромофоров бедка, а также я во» иожиоы стерачаскоы ограничении доступности. Например, флуоресценция папавна ( рН 7,2 ) относительно слабо тупятся ввиоввш*

тушителем N0\ < і » 0,38 ) к сильно тушатся катяоаниы ( L ш 1,1 ), что указывает на вала чиє отрицательного заря -іенвнх'груйп в окружении трвптофввовых остатков ( таблица 2 )• Виявів заряда ва эффективность тушевая флуоресценции витратом ( UOj) было провара в о ва яизоциме в області рН от Q до 2, где Ьэвфоршция белка яе меняется.

Расчет разностных спектров флуоресценции -{ где Л>м > J»i - интенсивности флуоресценция спектра 6éjuta вез тулителя ж о тушителем, соответственно) позволяет проава -лиэировать спектральные характеристики отгуливаемых остатков х идентифицировать и по локализации. На рис. 2 приведены спектры флуоресценция папаина, kJoaiBs в актива яри [Я 7,2 без ту -кителя я о тушителем ( A0Î или Cs* ).Разностный спектр флуоресценции для актива' ( рио. IA ) ямеет те яе параиэтрн ( Аи « 331 нм, лХ « 48 вм ),'что я Спектры флуоресценции беа тушяте-ля; т.е. трийтофеяовне остатки в втом белке идентичен по локализации и все находятся во внутренних областях макромолекулы ( форма I ).

При тушении флуоресцевции миозина ( 0,5 H КС£) витратои ( 0,1 К NaNty наблюдается коротковолновый сдвиг спектра на 5 ни ( рю.2Б ),а раэноствы! опектр имеет параметры триптофа -вовых"остатков форми П ( Лм » ЗЗЭ вм, дЛ =51 вм ).Во флуо -росценоди папаина < pil ?,2 J Йсвом Cs* оттуйдвается кошоиев-та о параметрами спектра ( >и » 350 вм, л А = 61 вм ),соот -ветствующая форме Ш триптофавовых остатков, взйнюдейотьуких со свободной водой. Данные во авалиэу спектральных характеристик оттушиваемнх остатков триптофана приведены в таблице 2,

Таким образом, метод избирательного тужеяия флуоресцевции яояами неорганических солей является чувствительным методом в иоследовавяи структуры бедка. Этот метел поэголяет определять локализацию триптофевовых остатков в макромолекуле, оценить ва хжчли я зяак заряда бляэлехвоях груші в окружении хромофора, а тепе дает количественную характеристику доступности ос тот -ков ( параметр і ).

Ряс. 2. Спектры флуоресценции белков без тушителя (яря -вая I ), в присутствии туштедя < кривая 2 ) ж их разностные спектры [ кривая 3 '2 - ф - актив. рН 6, тушитель 0,05'И 1/аЫ0,; Б - миозин В 0,5 II «К, тушитель 0,1 Ы Ы'аМО^ В - на пав и, рИ 7,2, туда та ль 0,6 М

В. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ К ИССЛЕДОВАНИЮ СТРУКТУРЫ И «ИЗИЧВСКИЭС СВОЙСТВ НЕКОТОРЫХ БВДКОВ

Комплексное применение ряда основных флуоресцентных параметров лЛ ) и характеристик метода избирательного тушения флуоресценции (О (С ), & (Л), К , разностные спектры} позволило получить новую информации о структурных особенностях ос -химотриисмна» хинотрипснногена А, трипсина, шшаяна в ом вороточных альбуминов человека я быка в различных условиях.

I. Флуоресценция -хяиотрапсина,хииотрипсиногева А ^ трипсина в воде и в водно-дяокеанов юс сме?яхт

Значительное количество триптофеноьых остатков (8 осгат -

sos в хвмотрипсине я хнмотрапсиногене я 4 остатка в трилеине ) оря сравнительно нвболшвх размерах шкромояекуд (мол. вес ~ — 22 тыс.) позволяет считать, что даже небольшие структурные перестройки должны отразиться ва флуоресценции этих остатков. В связи в втиы, вам казалось,'что метод флуоресценции в комплексе о методом избирательного тушения флуоресценции может обнаружить особенности структурных изменений этих белков, рост -воренних в волно-двоксановых смесях. Белкя: o¿ -химотрипсил, трипсин, хвмотрвдевноген, - в водво-дио ксанов их растворах об -ладают веобычянм свойством. Еолн рсстворять их в смеся с ков -центрацаей даоксана больше 70Í, то ферментативная активность исчезает обратимо: удаление диокеана приводит к практически полному восстановлен!» ях исходной активности. До 4C?Í диоксава в растворе активность практически не изменяется, но в довольно Таком диапазове концентраций диоксава < 40-65? ) наблпдается веобратямая инактивация ( Мосолов с сотр.,1968 ). Для решения зада41,какие ямевно особенности структурных изменений опреде -ллют такие свойства белков, были выбравы флуоресцентные пара -метры, преяиуществавво, квантовый выход в сочетания с методом избирательного тушения. Параметр - положение максимума спектра учитывается в анализе данвых, во его интерпретация затрудните теяьва яз-эа изменения полярности смешанного растворителя«ко -торов, в своо очередь, влияет ва величину эиачеввА этого параметра. Анализ флуоресцентных параметров Сл„ , дЛ а ^ ) с ооэишй модели трех дискретных состояний'позволил сказать, что триптофавовне остатки етих белков в воде находятся преимущест-вевнэ го внутренних областях, малодоступных воде, я только в oí -химотрипеиве я трипеяве имеются остатки, расположенные ва поверхности кккромолекулы. Зависимость эффективности туше -ния флуоресценции от лавы волвы излучения О (Л ) ( дливво -валвовая компонента оттуяявмется с большей эффективностью > и нелинейность зависимости эффективности от концентраций туши -теля подтверждают гетерогенвость траптофановых остатков в -стмотрлаевна я трипсине по доступности молекулам воды и растворенным в вей ионам тушителя.

Параметры флуоресценции ( q, и Лм ) белка при 35$ кон-

- ia -

центрацвях диоксана изменяются незначительно, причем увеличение квантового выхода ве превышает увеличение квантового выхода флуоресценции модельного соединения ( глицилтриптофана ), при атом несколько увеличивается доступность остатков трипто -фава тушителю. Комплекс этих данных показывает, что при ков -цевтрациях диоксана до — 40ÍÍ еще не происходит структурных перестроек, но, возможно происходит некоторое "разбухание" мак -ромодекулы за счет увеличения сил электростатического отталкивания в менее полярном растворителе.

Значительны!! скачок выхода флуоресценции í - в 2 раза ), длинноволновый сдвиг спектра и увеличение эффективности тупа -вия при повышении концентрации диоксана до 60Í означают сущеох венные изменения в структуре макромолекул, приводящие к разрушению нативной структуры. Совершенно к другому аффекту приво -дит растворение белков в SQÍ-ном растворе диоксана: полохевие спектра флуоресценции более коротковолновое, квантовый выход меньше; чем в бонном растворе, и, кроме того, увеличивается эффективность тушения коротковолновой компоненты по сравнению с длинноволновой. На основании втих данных было выдвинуто пред положение, что при этих концентрациях диоксана происходит ив -версия структуры белка, когда гидрофобные группы экспонируются в малополярный растворитель, а полярные группы вместе о моле -пулами воды образуй ядро белковой молекулы. По-видимому, та кая конформация, благодаря своей жесткости, не допускает обмена дисульфидных связей, который мог бы привести к необратимой инактивации белка.

2. флуоресценция триптофановых остатков сывороточных альбуминов.

Сывороточные альбумины человека ( САЧ ) я быке ( САБ Содержат очень мало триптофановых остатков ( 1 остаток'в молекуле САЧ и 2 остатка в молекуле САБ ва мол.вес - 70 тис.)в от -ля чиє от рассмотренных выше белков. В данном случае флуоресцеи цня триптофанилов этих белков может дать информацию об изменениях в локальных участках структуры, а именно, в микроокружв -нии единственного остатка триптофааа в САЧ и двух остатков в

САБ. Такая информация может стать пенной, благодаря своей конкретности* Рассмотрение в анализ всей совокупности флуоресцен-тянх параметров в сочетании с методом избирательного тушения, показали, что наиболее информативными являются флуоресцентные параметры! положенио максимума спектра, его полуширина и квантовый выход. Эти данные показали, что траптофановые остатки «тих белков находятся в поверхностном слое макромолекулы и спо собвы взаимодействовать с водой. ííaтерпретация данных избара -тельного тушения флуоресценции ионами ( iVOj й C¡* ) сказа -лась довольно трудной и неоднозначной из-за сложности npoueo -сов, происходящих в макромолекуле в результате связывания сы -вороточными альбуминами ионов солей, используемых в качестве тушителей, в также ионов солей, компенсирующих ионную силу рас твора белка ( NaCt, HCi ). Тем не менее, эксперименты по ту вавхю «ояамд ( !{Q¡ , ís* ) флуоресценции CAI и САБ подтверди ли предположение о том, что остатки триптофане доступны молеку лам води, ва что указывает высокая эффективность тушения ухе при уехых. концентрациях тушителя ( при 0.01 М tfaNOi нээнтовый выход САЧ падает в ~ 2,3 раза, а'САБ - в 2 раза ). Кроме того, высокое значение доступности иовам МО] и полная недоступность иоеам Cs* единственного остатка триптофана САЧ позволили нам выдвинуть предположение, что в непосредствеНПОЯ близости от «ого остатка находятся положительно заряженные группы, а сам оотаток расположен в складке поверхности белка. Это яредпо/о -канне поздве« подтвердилось данными об аминокислотной последовательности в окрестностях триптофана ÍSwanry и К fot г ,1970).

флуоресцентвые параметры этих белков оказались весьма чувствительными к различным воздействиям. Под влиянием кислой сроды ( рП 5-3 ) сывороточные альбумивы претерпевают структурны! ,V' —Г -переход, при стом наблюдается коротковолновый сдвиг спектра ва — Юны и падение квантового выхода ва ~ 4СЙ. Эти давние позволяют однозначно заключить, что Н Г -пере ход сопровождается образованием новой гидрофобной области, в которую включается трипто^новый остаток САЧ или остатки САБ. Эт1 выводи совпадают с результатами и выводами исследований, проведенных ва сывороточном альбумине быка Черницкаи л Мажулеи

( 1970 \НаЦ'тап , N4hic/a С 1371 ),

Специфическое связывание'взобутавола в додецилсудьфате вызывает кон^срмацношше изменения сывороточных альбуминов, в результате которых остатки триптофана переходят в неполяраие области, что отражается в коротковолновой сдвиге спектра, небольшой падении i.> актового выхода а уменьшении доступности триптофавовы* остатков ионным тушителя. Связывание таких ве -цеств, как из обута нал стасилизурует белок против денатурати мочевиной, сдвигая сераддяу денвтурационного перехода о 7 U мочевины до в И. s свои оадредь, присутствие мочевины сдвигает N — F -переход и кислотное "расширение" обоих сывороточных альбуминов в сторону нетральных рН. По-видимому, ворушеная, связываемые мочевиной в могекудах, уменьшат величану крвтачв-ского положительного заряда глобулы, иреяйаеяае которого ведет к перестройкам структуры за счет отталкивания.

3. Флуоресценция и состояние остатков тряа/офава н сапаана

При исследовании влияния.рН сред» на структуру сапай па оказался гееьма информативным подход с точка зрения модели трех дискретных состояний триптофановых остатков s белках. Изменений рК среды от 10 до 7,5 приводит к изменении параметров флуоресценции бедка: спектр сдвигается от 350 ям до 347 ни, в несколько уширяется ( от 60 нм до 61 нм), а квантовый выход не меняется ( 0,16 ). Эта факты указывает їм изменение в окружения триптофшовых остатков. Разностный спектр, полученный аз спектров, измеренных яри рН 10 д 7,5, имеет отрицательную и положительную ветви, соответствующие падепи» выхода длинноволновой в росту коротковолновой компонент спектра. Такое изменение поз -можно лишь в результате конформационной перестройки, переводя-дай трнптофаяклы в менее полярное окружение. Спектр становится Кулыикомпсшентным, что приводит к росту его полуширины. Неизменность хе квантового виходе может быть объяснена дополна -тельным возгоранием флуоресценции коротковолновой фо>ыы. Анализ положеная и формы спектра, а также квантового выходе с позиций используемой нами модели показал, что при pi! 10 флуоресцируют 4 остатка триптофана, находящиеся п фэрки Ш'( наиболее

вероятна, вто остатке # ?, 69, 177, 181, расположенные полностью в частично на поверхности молекулы по данным рентген о -структурного аналвза ( Drenth etof. , 1963)}« а флуоресценция остатка триптофана * практически эаТуиева,

Прв переходе к рН 7,5 тушащий эффект снимается в остаток Л 26 ставовнтоя флуореспирумям, а остаток л 69 переходят в менее полярное или более "жесткое" окружение ( форма I ),Возможно, вто происходят в результате нейтралізадай свободного тио-лята дастеяна * 25, расположенного вблизи указанных остатков триптофана ( Ъгеп th et at, 1968 ), Прв дальнейшем эаквелении среди ( до рн 4,5 > наблюдается значительный коротковолновый сдвиг спектра ( до 340 вм с небольшим ушвреннеи спектра и падевіе квантового выхода до 0,08. Разность спектров, вэме -ренвнх при рН 7,5 х 4,5, вмает форму спектра остатков тряпто-фаияла , првнадлежащих форме Ш, Экспериментальные спектры < ж флуоресцентные, х разностные ) хорошо совпадает с расчетными, подученаада путем комбинация базисвых спектров. Наблюдаемые изменения в параметрах флуоресценция, по всей вероятности,про-хэовля за спет тушения флуоресценции остатков, находящихся в форме Ш. Кожво думать, что тушении подвергается флуоресценция остатков # 177 и 181, находящихся в ковтакте с гистидвяон ЛІ59 {breniheto^ 1968 ), который при протовврованви становится аффекте бвым тушйтелем флуоресценции ( $hin\tiky , Gofdman , 1967 ),

Таким образом, проведенный анализ показал, что само по себе изменение параметров флуоресценция не всегда означает ков -формационнуп перестройку молекулы белка, и только ах сопоставление х вспользовавие дополнительных приемов анализа ( вапри -мер, разностные спектры ) могут дать-более однозначную иифор -шцив об язіде нениях в структуре белка.

ВЫВОДЫ

I. Лроведен анализ ннформатигяоети отдельных параметров і^усресце ( квантовый выход, интенсивность, положение и

спектра ) о фаэнко-хзмическнх свойоті.а* окружения и лскэ-

лазании хромофоре триптофана в макромолекула белка. Анализ используемых параметров флуореадопцій ж тушения флуоресценция показал, ^тго ни сдай из параметров в отдельвости ае может рассматриваться как однозначный тест на конфориационвую лерестро«-ку, ж только ах комплексное рассмотрение ж сопоставлеві« о давними других методов может дать информация о ховфорыациоявых изменениях белка."

2. Исследовав а возможность использования отдельных флуоресцентних параметров в качества количественной меры степені завершенности перехода. Квантовый выход н интенсивность флуоресценции прв постоянной длине волны регястрацвв ж еффактвБ -вость, тущеняя { прв возбуждения в изобестаческой точке ) можно исполъзовать'в качестве такой меры. В то же время, также часто используемые для вналжэа фодаы кривых переходов, как интенсивность в максимуме спектра, положен я в максимума спектра либо отношение интенсивностей при двух длинах водв спектра, вообще говоря, не пропорциональны степени завершенности перехода, я график их зависимости от параметр^ воздействия жлж времени в большей или меньшей степевн искажен.

3* Специальные исследования, посвященные методике избирательного тушения флуоресценции внешними тушвтелями:

а) показали, что тушение флуоресценции модельных оястем

( нядольные производные и денатурированные белки ) подчиаяет*-¿я линейному закону Штерна-Фольмера;

б) обнаружили, что величина константы тушения Ютерва-Фолъ-мера зависит от знака заряда боковых цепей ивдольнкх производных, а также от вязкости белково-кочевинвого раствора;

в) позволили выбрать ионные тушителя ( N01 ж ) достаточно эффективно тушащие флуоресценция наследованных белков и ве влияжше на структуру в растворе;

г) определили количественные подходы в обработке ооакт ров флуоресценции белка при добавлении тушителей: определение констант тушения 11№ерва-фольмера, вкладов, положения и формы от-тушевных спектров разных форм триптофаноных остатков, юторм позволяют конкретизировать структурные особенности и изменения в макромолекуле белка.

—.¿а —

д) показали, что вклады, определяемые из параметров ту -вения флуоресценции, коррелируют с вкладами, определяемыми по флуоресцентным параметрам < положение и форма спектре ) и давяща, полученными методами' пертурбантов и избирательной ими -ческой модификации;

е) позволила определить наличие л звак заряда вблизи трип-тофаяовых остатков в белке.

4. Ороведев ряд исследований конкретных процессов я соо-тоявий балков, которые иллюстрирую общие правила применения ' флуоресцеяцир для изучения конфорыяционных состояний иэкромо-лекул:

а) при денатурации бел ов метод позволяет судить о фози -часком и структурной характере процесса, а также исследовать его кинетические особенности: идентификация промежуточных состояний, изучение стабильности белков при измененив условий внешней среды; предлагается флуоресцентный тест на протекание денатуреононного процесса по механизму "все или ничего";

б) определены флуоресцентные характеристики оі -хи мот рипси на, химоттипсивогевэ А и трипсина в натявном состоянии, при денатурации щелочью и шчевлвой; исследовано влияние органического растворителя Сдиоксана) на структуру молекул этих белков к показано, что ври '40-6КЇ диокеана разрушаются гидрофобные взаимодействия и два-три триптофанові« остатка оказываются в контакте с растворителем, а при концентрациях диокеана больше 7СК, предполагается инверсия структуры с образованием полярного ядра и неполярноА оболочки, находящейся в контакте с растворителем;

в) пенеин претерпевает конформацноннуп перестройку в районе от I от 10 до 8, в результате чего один-два из пяти трип-тофаногых остатков переходят в гидрофобную область; изменение параметров фэуоросцетшв и тушения флуоресценции в области рН от £ до 4,5 связаво не с ковформзци он н о й перестройкос молекулы белка, в о тушением флуоресцевшш двух остатков триптофана протоиирогпнлой формой гиствдвновиго остатка в молекуле белка;

г) в сывороточных альбуминах человека в быка Ы - Г- - переход при ріі 4 сопровождается лереходоь: единственного остатка

триптофана в CAI и двух остатков в САБ в гидрофобную область; флуоресцентные исследования позволили заключить, что единственные триптофавовыЯ остаток сывороточного альбушва человека ва-ходится, вероятно, в щели поливе от вдвой цеди, доступен воде и вблизи него расположены группы, несущие сильный положительный заряд.

Основные материалы диссертации опубликованы в следующих

работах:

1. М.Н.Ивкова, В.В.Мосолов, Э.А.Буритейв. Флуоресценция некоторых белков в водяо-диокеанових растворах,Мол.,биол. .2, 839.1968

2. М.Н.Ывкова, К.С.Веденквна.Изучение И — f - переходе сывороточных альбуминов флуоресцентным методом.Тез.докл. ,D Все-союз.биохям.съезда,секи.2,стр.57,1969

3. Н.Л.Ивкова, Н.С.Веденкива. Э.А.Ьуритейя, Флуоресценция тривтофановых остатков сывороточных альбумивов, Мол.биол. 5,214,1971

4. Н.С.Ьаденкика, Т.Г.Букодова, Ы.П.Ивковя, Э.А.Бураггевв, Флуоресценция я состояние остатков триптофана а папаиве. Кол. биол.,5,809,1971

5. Н.С.Веденкнна, М.Н.Ивкова, Э.А.Буротейн, Положение максимума в спектрах флуоресценции поверхностных остатков триптофана, Мол.биол.,6,467,1972

в. М.Н.Ивкова, Т.Г.Буколова, Э.А.Бурштейв, Избир&тааьвое тушение флуоресценции. Использование для определения локализации хромофора я изучения электростатического заряда в его окружении. Тез.докл. на 1У Меидунар.биофиз.конгрессе,Москва, 2,69,1972

7. Э.А.Бураггёйв, Н.С.Веденкнна, И.Н.Ивкова, Б.А.Нерынков. Структурно-спектроскопическая модель трнптофеновой фяуорес-«евции белков, Теэ.докл. на 17 Междувар.биофпз.конгрессе, Москва, 3,67,1972

8« K.A.Buratein, H.S.Vedenkitia, lí. í(. Ivtcova, Fluorescence aod Location ol' Tryptophan НевЫиез In Vioteln Ыо1 ecu lee, Jfhotocbeo. and №otobiol. 16, , •

Отдельные части работы били доложены в отражены в тезисах докладов X7I Совещания по лвшиесцвнщи, Ленинград, 1967; Г Конференции федерации Европебоках Биохимических обществ .Прага, 1968; О Биохимическое Конференции БССР,Лятв.ССР,Лит,ССР. Эст.ССР.иявск, 1968; Совещания по 7Ф-спектроскопжв аромагиче-опх групп бежа, Пувдво, 1969; УН Иеадунеродного Симпозиума со химии природных соединений, Рига, 1970; Всесоюзной конфе -рев им по спе кг роокопия биополимеров, Харьков, I97X.

B»K._fjg£r«p»» /¿еуд щ, БССР<